CN106581090A - 一种杨梅素提取物、包含其的药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种杨梅素提取物，通过包括以下步骤的提取方法制备：(1)将杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物粉碎，脱脂后溶解于甲醇水溶液并在微波、超声波萃取，得到萃取液；(2)将步骤(1)得到的萃取液减压浓缩，得到浓缩液，减压抽滤，经三氯甲烷萃取，收集萃取液，冷冻干燥并粉碎；(3)将步骤(2)得到的粉末溶解于石油醚后通过硅胶柱，纯化，收集含有杨梅素的洗脱液，浓缩，得到杨梅素粗品；(4)将步骤(3)得到的杨梅素粗品加入体积比为50‑75％的甲醇水溶液中，加热至75‑80℃至完全溶解，搅拌，后降温静置，结晶，抽滤，干燥，即得；本发明杨梅素提取物可以长期服用起到良好的预防或治疗肿瘤转移的效果，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域。具体而言，本发明涉及从植物中提取得到的杨梅素提取物、包含其的药物组合物及其在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移所引起的疾病或用于抑制肿瘤细胞迁移的药物、保健品或食品补充剂中的用途。
背景技术
国际癌症研究中心(IARC)最新报告，全球癌症患者以年均3％-5％的速度递增，癌症已成为全球最大的公共卫生问题。据世界卫生组织报告估计，全球80％左右的肿瘤患者死于手术、放化疗后的复发转移，2015年美国癌症协会的数据显示，肿瘤转移后患者总体的5年生存率远小于原发癌的生存率，恶性肿瘤的可怕性在于它具有极强的侵袭性、转移性，尤其发生复发转移后，死亡率非常之高。
肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，也是大部分肿瘤患者死亡的主要原因。目前，外科手术与放化疗结合的治疗方式能够在大部分肿瘤的原发位点对其进行有效的控制，这些常规治疗方法确实能够消灭部分肉眼可见的癌细胞，但是，外科手术只能切除实体肿瘤，而对血液、淋巴液中的癌细胞则无能为力，因此为癌症复发、肿瘤转移埋下了隐患。特别是，年纪大、身体状态差的中晚期患者根本经受不起外科手术的创伤；而放、化疗杀伤力看似强大，但毒副作用也大，严重破坏免疫、造血系统，为残存癌细胞转移或复发创造条件，故而大部分的肿瘤转移灶是无法通过外科手术治愈的，化学治疗、激素治疗和放射治疗能够在一定程度上提高肿瘤转移病人存活率，但是转移灶的出现往往意味着全身性、系统性、致死性疾病的发生。
肿瘤侵袭转移是一个连续的、渐进的、动态的过程，其基本过程为：原发性肿瘤细胞大量增殖及肿瘤周围和内部新生血管迅速生长；少数肿瘤细胞从原发病灶脱落后侵入血管、淋巴管中，并在循环系统中随血液、淋巴流迁移到另一部位；肿瘤细胞与毛细血管壁发生黏附，穿出血管后形成微小转移灶；癌细胞增殖，形成继发性的转移肿瘤。
近年来，虽然肿瘤转移机制方面的研究在一定程度上有所进展和突破，但是，本领域尚缺乏令人满意的、有效抑制肿瘤转移的方法和药物。
因此，研究出安全、有效的抗肿瘤转移新药具有重要的实践意义，近年来，天然产物或中药抗肿瘤转移作用的研究已成为新热点。
黄酮类化合物是植物性食品中广泛存在的一类膳食健康因子，有抗癌、防癌等多重生物学功效，其作用机理可能与黄酮类化合物的促氧化作用有关。杨梅素是一种含多羟基的黄酮醇苷元化合物，多存在于水果、茶叶、药用植物和红酒中，尤其是存在于杨梅植株及其果实中，作为一种很好的天然活性成分而备受关注，除了抗氧化作用外，杨梅素还具有抗炎、镇痛、降血糖和保肝等多种功效。近年来，人们发现杨梅素也具有抗肿瘤作用，但目前为止未见有将杨梅素作为抑制肿瘤转移的药物的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种杨梅素提取物。
本发明的另一个目的为提供所述杨梅素提取物的提取方法。
本发明的又一个目的为提供包含所述杨梅素提取物的药物组合物。
本发明的又一个目的为提供所述杨梅素提取物在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移所引起的疾病或用于抑制肿瘤细胞迁移的药物、保健品或食品补充剂中的用途；
上述技术方案通过以下实现：
本发明提供一种杨梅素提取物，所述杨梅素提取物通过包括以下步骤的提取方法制备：
(1)将杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物粉碎，脱脂后溶解于甲醇水溶液并在微波功率300-400W、超声波功率300-400W下萃取，得到萃取液；
(2)将步骤(1)得到的萃取液减压浓缩，得到浓缩液，减压抽滤，经三氯甲烷萃取，收集萃取液，真空干燥并粉碎；
(3)将步骤(2)得到的粉末溶解于石油醚后通过硅胶柱纯化，收集含有杨梅素的洗脱液，浓缩，得到杨梅素粗品；
(4)将步骤(3)得到的杨梅素粗品加入甲醇水溶液中，加热至75-80℃至完全溶解，搅拌，后降温静置，析晶，抽滤，干燥，即得。
优选地，所述杨梅素提取物的提取方法的所述步骤(1)中，将杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物粉碎至80-120目；
优选地，所述步骤(1)中的脱脂为：将杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物粉末溶于石油醚中，70-90℃下脱脂1-3小时，优选为80℃下脱脂2小时；后离心分离，去除上清液，真空干燥并粉碎至80-100目；
优选地，所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物与石油醚的比例为1g:10-20mL；
优选地，所述离心分离为3000-6000rpm下离心5-20min；
优选地，所述真空干燥在温度50-70℃、真空度为-0.07～0.09MPa下进行；
优选地，所述步骤(1)中的萃取为：将脱脂后的粉末溶于甲醇水溶液中浸泡，后在微波功率300-400W、超声波功率300-400W下，在60-80℃下萃取3-5次，每次萃取时间为5-20min；
优选地，所述植物与甲醇水溶液的重量比是1：5-15；
优选地，所述甲醇水溶液中所述甲醇与水的体积比为1：1-3。
优选地，所述杨梅素提取物的提取方法中所述步骤(2)为：将步骤(1)得到的萃取液在-0.07～0.09MPa、50-70℃下减压浓缩得到浓缩液，在压力-0.06MPa、室温下减压抽滤，经三氯甲烷在45-60℃下回流2-6h进行萃取，收集萃取液，真空干燥，并粉碎；
优选地，所述步骤(2)中所述浓缩液的密度为1.2-1.6mg/ml；
优选地，所述步骤(2)中所述三氯甲烷与步骤(1)所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物的重量比为5-10：1；
优选地，所述步骤(2)中所述萃取步骤在索式提取器中进行；
优选地，所述步骤(2)中所述真空干燥的压力为-0.07～0.09MPa；
优选地，所述步骤(2)中所述真空干燥的温度为20-50℃。
优选地，所述杨梅素提取物的提取方法的步骤(3)中所述石油醚与步骤(1)所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物的比例为3.6-7.2mL:1g；
优选地，所述步骤(3)中所述硅胶的粒度是200-300目；
优选地，所述步骤(3)中所述纯化为：先用弱极性洗脱剂洗脱，再用强极性洗脱剂洗脱；
优选地，所述弱极性洗脱剂包含石油醚和环己烷；
优选地，所述石油醚和环己烷的体积比为2：1；
优选地，所述强极性洗脱剂包含乙酸乙酯和甲醇；
优选地，所述乙酸乙酯和甲醇的体积比为8：1；
优选地，所述步骤(3)中所述浓缩是在压力-0.08MPa、温度40℃下进行。
优选地，所述杨梅素提取物的提取方法的步骤(4)中所述甲醇水溶液中的所述甲醇与水的体积比为1～3：1；
优选地，所述步骤(4)中所述杨梅素粗品与甲醇水溶液的重量比为1：15～20；
优选地，所述步骤(4)中所述搅拌时间为40-60min；
优选地，所述步骤(4)中降温至0-5℃；
优选地，所述步骤(4)中所述静置8-12h；
优选地，所述步骤(4)中所述抽滤是在-0.06MPa、室温下进行；
优选地，所述步骤(4)中所述干燥是在真空度-0.07～0.09MPa、60-80℃下干燥；
优选地，所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物选自杨梅果、杨梅叶，黄豆、黑豆或茶中的一种或多种。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明所述杨梅素提取物；
优选地，所述药物组合物的剂型为口服制剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、喷雾剂、洗剂、栓剂、滴丸剂、合剂、擦剂、贴剂、膜剂、纸型剂、混悬剂、酊剂、干糖浆剂、泡腾片、硬膏剂、软膏剂、糖浆剂、乳剂、散剂、缓释、控释制剂、靶向制剂；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明所述杨梅素提取物或本发明所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移或用于抑制肿瘤细胞迁移的药物、保健品或食品补充剂中的用途；
优选地，所述肿瘤包括：乳腺癌脑转移肿瘤、高转移前列腺癌、可转移黑色素瘤；
优选地，所述肿瘤细胞包括：乳腺癌脑转移细胞、乳腺癌细胞、高转移前列腺癌细胞、可转移黑色素瘤细胞、神经母瘤细胞。
本发明所述杨梅素提取物或本发明所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移或用于抑制肿瘤细胞迁移的药物、保健品或食品补充剂中，所述抑制肿瘤细胞迁移的方法为：所述肿瘤细胞在杨梅素提取物存在下进行培养或者与杨梅素提取物接触，从而抑制肿瘤细胞的迁移。
本发明的主要优点在于：
(1)杨梅素提取物是天然植物性食物的天然成分，对人无毒无害；
(2)患者不仅可以经配伍使用杨梅素提取物制剂，强化传统放、化疗法的疗效，缓解副作用，还可以长期服用起到良好的预防或治疗效果，具有广阔的临床应用前景。
(3)本发明运用超声波-微波联合提取的方法进行多次萃取得到植物成分的提取物，不仅提高了杨梅素的提取产率，而且节约了提取时间，为杨梅素大规模的提取创造了有利的条件，特别是最大限度的保证了杨梅素的生物活性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示杨梅素对人乳腺癌脑转移细胞株的抑制作用；
图2显示杨梅素抑制人乳腺癌脑转移细胞株的运动能力；
图3显示杨梅素抑制人乳腺癌脑转移细胞株的迁移能力；
图4显示杨梅素抑制人乳腺癌脑转移细胞株的侵袭能力；
图5显示杨梅素在体外对制人高转移前列腺癌细胞株的抑制作用；
图6显示杨梅素抑制制人高转移前列腺癌细胞株的运动能力；
图7显示杨梅素抑制制人高转移前列腺癌细胞株的迁移能力；
图8显示杨梅素抑制人高转移前列腺癌细胞株的侵袭能力；
图9显示杨梅素在体外对人可转移黑色素瘤细胞株的抑制作用；
图10显示杨梅素抑制人可转移黑色素瘤细胞株的运动能力；
图11显示杨梅素抑制人可转移黑色素瘤细胞株的迁移能力；
图12显示杨梅素抑制人可转移黑色素瘤细胞株的侵袭能力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均可自常规生化试剂商店或药品经营企业购买得到。
实施例1：本发明所述杨梅素提取物的制备
1、原料与设备
黑豆(产于黑龙江)、乙醇、石油醚、甲醇、三氯甲烷、硅胶；
真空干燥箱、离心机、研钵、筛分仪、微波超声联用仪、旋转蒸发仪、真空泵、真空冷冻干燥箱；
2、提取方法(以黑豆皮为例)
2.1、将黑豆浸泡去皮，清洗，干燥，再粉碎与筛分，得到80-100目黑豆粉，准确称取10g黑豆皮粉末，将黑豆皮粉末溶于150mL石油醚中，80℃下回流脱脂2小时；然后在5000rpm、25℃下离心10min，去除上清液，在60℃、真空度为-0.07MPa条件下真空干燥并粉碎至80-100目；
2.2、将脱脂完的黑豆皮低温烘干，溶解于90mL体积比为75％的甲醇水溶液，并在微波功率300-400W、超声波功率300-400W下提取15min，提取温度为70℃；
2.3、将提取液合并，然后在-0.07MPa、60℃下减压浓缩得到浓缩液，在压力-0.06MPa、室温下减压抽滤，用50mL三氯甲烷萃取，收集萃取液，在压力为-0.06MPa，温度为20℃条件下真空干燥并粉碎；
2.4、硅胶经烘干预处理后干法装入层析柱(2.0cm×50cm)中，压紧。将上述步骤中得到的粉末溶解于20mL石油醚中，加到柱上方，然后先用弱极性洗脱剂洗脱，然后再用强极性洗脱剂洗脱。取样，TLC跟踪检测,进行分段收集，浓缩得到粗制杨梅素；
2.5、将得到的杨梅素粗品加入20mL体积比为75％的甲醇水溶液中，加热至75-80℃至完全溶解，搅拌，后降温静置过夜，结晶，在-0.06MPa条件下减压抽滤，在真空度-0.07MPa、70℃下真空干燥，即得杨梅素纯品。
2.6、根据上述提取流程，提取方法及工艺条件的筛选具体见表1：
表1：提取方法筛选
| 提取工艺 | 微波提取 | 超声提取 | 微波-超声联合提取 |
| 相对收率(％) | 65±5 | 30±12 | 85±10 |
从筛选数据可见：仅用微波提取的相对收率比超声提取的收率高近一倍，而用微波-超声联合提取的相对收率比单独提取高，所以采用微波-超声联合提取的方法进行杨梅素的提取。
实施例2：本发明所述杨梅素提取物的制备
1、试剂与原料
杨梅树叶(产于浙江)，乙醇，石油醚，甲醇，三氯甲烷，硅胶；真空干燥箱，离心机，研钵，筛分仪，微波超声联用仪，旋转蒸发仪，真空泵，真空冷冻干燥箱；
2、提取方法(以杨梅叶为例)
2.1、将杨梅叶粉碎与筛分，得到80-100目杨梅叶粉，准确称取10g杨梅树叶粉末，将杨梅叶粉末溶于150mL石油醚中，80℃下回流脱脂2小时；然后在5000rpm，25℃下离心10min，去除上清液，在60℃、真空度为-0.07MPa条件下真空干燥并粉碎至80-100目；
2.2、将脱脂完的杨梅树叶低温烘干，溶解于90mL体积比为75％甲醇水溶液并在微波功率300-400W、超声波功率300-400W下提取15min，提取温度为70℃；
2.3、将提取液合并，在-0.07MPa、60℃下进行减压浓缩，得到浓缩液，在压力-0.06MPa、室温下减压抽滤，用50mL三氯甲烷萃取，收集萃取液，在压力为-0.06MPa，温度为20℃条件下真空干燥，并粉碎；
2.4、硅胶经烘干预处理后干法装入层析柱(2.0cm×50cm)中,压紧。将步骤2.3中得到的粉末溶解于20mL石油醚中,加到柱上方，先用弱极性洗脱剂洗脱，然后再用强极性洗脱剂洗脱。取样，TLC跟踪检测，进行分段收集，浓缩得到粗制杨梅素；
2.5、将得到的杨梅素粗品加入20mL体积比为75％的甲醇水溶液中，加热至75-80℃至完全溶解，搅拌，后降温静置过夜，结晶，在-0.06MPa条件下减压抽滤，在真空度-0.07MPa、70℃下真空干燥，即得杨梅素纯品。
2.6、根据上述提取流程，提取方法及工艺条件的筛选具体见表2；
表2：提取方法筛选
| 提取工艺 | 微波提取 | 超声提取 | 微波-超声联合提取 |
| 相对收率(％) | 72±5 | 37±8 | 90±3 |
从筛选数据可见：仅用微波提取的相对收率比超声提取的收率高近一倍，而用微波-超声联合提取的相对收率比单独提取高，所以采用微波-超声联合提取的方法进行杨梅素的提取。
实施例3：杨梅素提取物对人乳腺癌脑转移细胞株(BCBM)的体外生长抑制试验、转
移抑制试验和侵袭抑制试验
1、材料与方法
1.1、试剂和原料
6孔板，Transwell小室(孔径8μm)，1640基础培养基，1640完全培养基(含10％胎牛血清)，0.25％胰酶，青-链霉素，Giemsa's Stain，MTT(5mg/mL)；人乳腺癌脑转移细胞株(BCBM)。
2、方法
2.1、杨梅素提取物对人乳腺癌脑转移细胞株的体外生长抑制试验(MTT法)
收集对数期BCBM细胞，调整细胞悬液浓度至8×104个/mL，每孔加入100μL铺板使待测细胞密度为8000个/孔接种于96孔板中。5％CO2，37℃下孵育，至细胞贴壁，加入浓度梯度杨梅素，每孔100μL，药物终浓度为0μM，2.5μM，5μM，10μM，20μM，40μM，同时设置阴性对照孔(每孔加培养基100μL)和调零孔(只含培养基)。
5％CO2，37℃下孵育24h后，每孔加入10μL MTT溶液，继续培养4h。离心分离后吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速震10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。按下述公式计算细胞生长抑制率∶存活率＝(试验孔-调零孔)/(阴性孔-调零孔)，作用效果见图1。
2.2、杨梅素提取物对人乳腺癌脑转移细胞株的迁移抑制试验(Wound-healing法)
收集对数期BCBM细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，用10μL枪头在板内做一条笔直的划痕，划痕完毕后，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药,使药物的最终浓度为0μM，2.5μM，5μM，10μM。
在37℃下、5％CO2培养箱中继续培养24h，于OlympusIX51倒置显微镜下观察划痕愈合的程度并拍照，作用效果见图2。
2.3杨梅素提取物对人乳腺癌脑转移细胞株的迁移抑制试验(Transwell法)
收集对数期BCBM细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药(0、2.5、5、10μM)，药物作用12h后，胰酶消化细胞，用不含血清的1640培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/mL。取人乳腺癌脑转移细胞悬液100μL，加入Transwell小室。24孔板下室分别加入600μL含10％FBS的1640培养基。细胞于5％CO2，37℃下常规培养24h。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗3遍后，置于甲醇中固定20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，置于Giemsa染色液中染色20min，于OlympusIX51倒置显微镜下观察迁移的程度并拍照，取5个不同的视野计数，按下述公式计算细胞迁移抑制率：迁移率＝试验孔/对照孔。作用效果见图3。
2.4杨梅素提取物对人乳腺癌脑转移细胞珠的侵袭抑制试验
收集对数期BCBM细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药(0、2.5、5、10μM)，药物作用12h后，胰酶消化细胞，用不含血清的1640培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/mL。取人乳腺癌脑转移细胞悬液100μL，加入Transwell小室(提前用Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃下、5％CO2培养箱中30min使Matrigel聚合成凝胶。)24孔板下室分别加入600μL含10％FBS的1640培养基。细胞于5％CO2，37℃下常规培养24h。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗3遍后，置于甲醇中固定20min，用棉签轻轻擦掉上层未侵袭细胞，置于Giemsa染色液中染色20min，于OlympusIX51倒置显微镜下观察迁移的程度并拍照，取5个不同的视野计数，按下述公式计算细胞迁移抑制率：迁移率＝试验孔/对照孔。作用效果见图4。
3、试验结果
肿瘤细胞体外生长抑制试验结果表明，杨梅素提取物在所选低浓度范围2.5-10μM时，对肿瘤细胞无直接的抑制作用；在Wound-healing实验中，由图2可以看出，在未经药物处理的对照组，24h后有大量的细胞迁徙至划痕处；而经杨梅素提取物处理过的试验组，不论是5μM组还是10μM组，其中人乳腺癌脑转移细胞的运动能力都受到明显的抑制，处理后24h迁移入划痕区的细胞明显少于对照组；在Transwell迁移与入侵实验中，进一步证明了杨梅素提取物可以抑制人乳腺癌脑转移肿瘤细胞的迁移与入侵。
实施例4：杨梅素提取物对人高转移前列腺癌细胞株的体外生长抑制试验、转移抑
制试验和侵袭抑制试验
1、材料与方法
1.1、试剂和原料
6孔板，Transwell小室(孔径8μm)，1640基础培养基，1640完全培养基(含10％胎牛血清)，0.25％胰酶，青-链霉素，Giemsa's Stain，MTT(5mg/mL)；人前列腺癌高转移细胞株(PC-3M-IE8)。
2、方法
2.1、杨梅素提取物对人高转移前列腺癌细胞株的体外生长抑制试验(MTT法)
收集对数期PC-3M-IE8细胞，调整细胞悬液浓度至6×104个/mL，每孔加入100μL铺板使待测细胞密度为6000个/孔接种于96孔板中。5％CO2，37℃下孵育，至细胞贴壁，加入浓度梯度杨梅素，每孔100μL，药物终浓度为0μM，2.5μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM同时设置阴性对照孔(每孔加培养基100μL)和调零孔(只含培养基)。
5％CO2，37℃下孵育24h后，每孔加入10μL MTT溶液，继续培养4h。离心分离后吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速震10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。按下述公式计算细胞生长抑制率∶存活率＝(试验孔-调零孔)/(阴性孔-调零孔)，作用效果见图5。
2.2、杨梅素提取物对人高转移前列腺癌细胞株的迁移抑制试验(Wound-healing法)
收集对数期PC-3M-IE8细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，用10μL枪头在板内做一条笔直的划痕，划痕完毕后，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药,使药物的最终浓度为0μM，2.5μM，5μM，10μM。
在37℃下、5％CO2培养箱中继续培养24h，于OlympusIX51倒置显微镜下观察划痕愈合的程度并拍照，作用效果见图6。
2.3杨梅素提取物对人高转移前列腺癌细胞株的迁移抑制试验(Transwell法)
收集对数期的PC-3M-IE8细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药(0、2.5、5、10μM)，药物作用12h后，胰酶消化细胞，用不含血清的1640培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/mL。取人前列腺癌高转移细胞悬液100μL，加入Transwell小室。24孔板下室分别加入600μL含10％FBS的1640培养基。细胞于5％CO2，37℃下常规培养24h。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗3遍后，置于甲醇中固定20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，置于Giemsa染色液中染色20min，于OlympusIX51倒置显微镜下观察迁移的程度并拍照，取5个不同的视野计数，按下述公式计算细胞迁移抑制率：迁移率＝试验孔/对照孔。作用效果见图7。
2.4杨梅素提取物对人高转移前列腺癌细胞株的侵袭抑制试验
收集对数期PC-3M-IE8细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药(0、2.5、5、10μM)，药物作用12h后，胰酶消化细胞，用不含血清的1640培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/mL。取人前列腺癌高转移细胞悬液100μL，加入Transwell小室(提前用Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃下、5％CO2培养箱中30min使Matrigel聚合成凝胶。)24孔板下室分别加入600μL含10％FBS的1640培养基。细胞于5％CO2，37℃下常规培养24h。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗3遍后，置于甲醇中固定20min，用棉签轻轻擦掉上层未侵袭细胞，置于Giemsa染色液中染色20min，于OlympusIX51倒置显微镜下观察迁移的程度并拍照，取5个不同的视野计数，按下述公式计算细胞迁移抑制率：迁移率＝试验孔/对照孔。作用效果见图4。
3、试验结果
肿瘤细胞体外生长抑制试验结果表明，杨梅素提取物在所选低浓度范围2.5～10μM时，对肿瘤细胞无直接的抑制作用；在Wound-healing实验中，由图6可以看出，在未经药物处理的对照组，24h后有大量的细胞迁徙至划痕处；而经杨梅素提取物处理过的试验组，不论是5μM组还是10μM组，其中人前列腺癌高转移细胞的运动能力都受到明显的抑制，处理后24h迁移入划痕区的细胞明显少于对照组；在Transwell迁移与入侵实验中，进一步证明了杨梅素提取物可以抑制人高转移前列腺癌的迁移与入侵。
实施例5：杨梅素提取物对人可转移黑色素瘤细胞株的体外生长抑制试验、转移抑
制试验和侵袭抑制试验
1、材料与方法
1.1、试剂和原料
6孔板，Transwell小室(孔径8μm)，1640基础培养基，1640完全培养基(含10％胎牛血清)，0.25％胰酶，青-链霉素，Giemsa's Stain，MTT(5mg/mL)；人黑色素瘤可转移细胞株(WM983a)。
2、方法
2.1、杨梅素提取物对人黑色素瘤可转移细胞株的体外生长抑制试验(MTT法)
收集对数期WM983a细胞，调整细胞悬液浓度至6×104个/mL，每孔加入100μL铺板使待测细胞密度为6000个/孔接种于96孔板中。5％CO2，37℃下孵育，至细胞贴壁，加入浓度梯度杨梅素，每孔100μL，药物终浓度为0μM，2.5μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM同时设置阴性对照孔(每孔加培养基100μL)和调零孔(只含培养基)。
5％CO2，37℃下孵育24h后，每孔加入10μL MTT溶液，继续培养4h。离心分离后吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速震10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。按下述公式计算细胞生长抑制率∶存活率＝(试验孔-调零孔)/(阴性孔-调零孔)，作用效果见附图9。
2.2、杨梅素提取物对人可转移黑色素瘤细胞株的迁移抑制试验(Wound-healing法)
收集对数期WM983a细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，用10μL枪头在板内做一条笔直的划痕，划痕完毕后，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药,使药物的最终浓度为0μM，2.5μM，5μM，10μM。
在37℃下、5％CO2培养箱中继续培养24h，于OlympusIX51倒置显微镜下观察划痕愈合的程度并拍照，作用效果见图10。
2.3杨梅素提取物对人可转移黑色素瘤细胞株的迁移抑制试验(Transwell法)
收集对数期WM983a细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药(0、2.5、5、10μM)，药物作用12h后，胰酶消化细胞，用不含血清的1640培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/mL。取人前列腺癌高转移细胞悬液100μL，加入Transwell小室。24孔板下室分别加入600μL含10％FBS的1640培养基。细胞于5％CO2，37℃下常规培养24h。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗3遍后，置于甲醇中固定20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，置于Giemsa染色液中染色20min，于OlympusIX51倒置显微镜下观察迁移的程度并拍照，取5个不同的视野计数，按下述公式计算细胞迁移抑制率：迁移率＝试验孔/对照孔。作用效果见图11。
2.4杨梅素提取物对人可转移黑色素瘤细胞株的侵袭抑制试验
收集对数期WM983a细胞，调整细胞悬液浓度至2.5×105个/mL，每孔加入2mL铺板使待测细胞密度为5×105个/孔接种于6孔板中，置于37℃下、5％CO2培养箱中培养，待细胞生长至融合80％的状态，吸出培养液，加入适量PBS清洗3遍，每孔加入无血清1640并加药(0、2.5、5、10μM)，药物作用12h后，胰酶消化细胞，用不含血清的1640培养基重悬，并调整细胞密度至5×105/mL。取人前列腺癌高转移细胞悬液100μL，加入Transwell小室(提前用Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃下、5％CO2培养箱中30min使Matrigel聚合成凝胶。)24孔板下室分别加入600μL含10％FBS的1640培养基。细胞于5％CO2，37℃下常规培养24h。
取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗3遍后，置于甲醇中固定20min，用棉签轻轻擦掉上层未侵袭细胞，置于Giemsa染色液中染色20min，于OlympusIX51倒置显微镜下观察迁移的程度并拍照，取5个不同的视野计数，按下述公式计算细胞迁移抑制率：迁移率＝试验孔/对照孔。作用效果见附图12。
3、试验结果
肿瘤细胞体外生长抑制试验结果表明，杨梅素提取物在所选低浓度范围2.5～10μM时，对肿瘤细胞无直接的抑制作用；在Wound-healing实验中，由图10可以看出，在未经药物处理的对照组，24h后有大量的细胞迁徙至划痕处；而经杨梅素提取物处理过的试验组，不论是5μM组还是10μM组，其中人前列腺癌高转移细胞的运动能力都受到明显的抑制，处理后24h迁移入划痕区的细胞明显少于对照组；在Transwell迁移与入侵实验中，进一步证明了杨梅素提取物可以抑制人可转移黑色素瘤的迁移与入侵。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (8)
1.一种杨梅素提取物，其特征在于，所述杨梅素提取物通过包括以下步骤的提取方法制备：
(1)将杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物粉碎，脱脂后溶解于甲醇水溶液并在微波功率300-400W、超声波功率300-400W下萃取，得到萃取液；
(2)将步骤(1)得到的萃取液减压浓缩，得到浓缩液，减压抽滤，经三氯甲烷萃取，收集萃取液，真空干燥并粉碎；
(3)将步骤(2)得到的粉末溶解于石油醚后通过硅胶柱纯化，收集含有杨梅素的洗脱液，浓缩，得到杨梅素粗品；
(4)将步骤(3)得到的杨梅素粗品加入甲醇水溶液中，加热至75-80℃至完全溶解，搅拌，后降温静置，析晶，抽滤，干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述杨梅素提取物的提取方法的所述步骤(1)中，将杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物粉碎至80-120目；
优选地，所述步骤(1)中的脱脂为：将杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物粉末溶于石油醚中，70-90℃下脱脂1-3小时，优选为80℃下脱脂2小时；后离心分离，去除上清液，真空干燥并粉碎至80-100目；
优选地，所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物与石油醚的比例为1g:10-20mL；
优选地，所述离心分离为3000-6000rpm下离心5-20min；
优选地，所述真空干燥在温度50-70℃、真空度为-0.07～0.09MPa下进行；
优选地，所述步骤(1)中的萃取为：将脱脂后的粉末溶于甲醇水溶液中浸泡，后在微波功率300-400W、超声波功率300-400W下，在60-80℃下萃取3-5次，每次萃取时间为5-20min；
优选地，所述植物与甲醇水溶液的重量比是1：5-15；
优选地，所述甲醇水溶液中所述甲醇与水的体积比为1：1-3。
3.根据权利要求1或2所述的提取物，其特征在于，所述杨梅素提取物的提取方法中所述步骤(2)为：将步骤(1)得到的萃取液在-0.07～0.09MPa、50-70℃下减压浓缩得到浓缩液，在压力-0.06MPa、室温下减压抽滤，经三氯甲烷在45-60℃下回流2-6h进行萃取，收集萃取液，真空干燥，并粉碎；
优选地，所述步骤(2)中所述浓缩液的密度为1.2-1.6mg/ml；
优选地，所述步骤(2)中所述三氯甲烷与步骤(1)所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物的重量比为5-10：1；
优选地，所述步骤(2)中所述萃取步骤在索式提取器中进行；
优选地，所述步骤(2)中所述真空干燥的压力为-0.07～0.09MPa；
优选地，所述步骤(2)中所述真空干燥的温度为20-50℃。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的提取物，其特征在于，所述杨梅素提取物的提取方法的步骤(3)中所述石油醚与步骤(1)所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物的比例为3.6-7.2mL:1g；
优选地，所述步骤(3)中所述硅胶的粒度是200-300目；
优选地，所述步骤(3)中所述纯化为：先用弱极性洗脱剂洗脱，再用强极性洗脱剂洗脱；
优选地，所述弱极性洗脱剂包含石油醚和环己烷；
优选地，所述石油醚和环己烷的体积比为2：1；
优选地，所述强极性洗脱剂包含乙酸乙酯和甲醇；
优选地，所述乙酸乙酯和甲醇的体积比为8：1；
优选地，所述步骤(3)中所述浓缩是在压力-0.08MPa、温度40℃下进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的提取物，其特征在于，所述杨梅素提取物的提取方法的步骤(4)中所述甲醇水溶液中的所述甲醇与水的体积比为1～3：1；
优选地，所述步骤(4)中所述杨梅素粗品与甲醇水溶液的重量比为1：15～20；
优选地，所述步骤(4)中所述搅拌时间为40-60min；
优选地，所述步骤(4)中降温至0-5℃；
优选地，所述步骤(4)中所述静置8-12h；
优选地，所述步骤(4)中所述抽滤是在-0.06MPa、室温下进行；
优选地，所述步骤(4)中所述干燥是在真空度-0.07～0.09MPa、60-80℃下干燥。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的提取物，其特征在于，所述杨梅科、葡萄科、豆科或山茶科的植物选自杨梅果、杨梅叶，黄豆、黑豆或茶中的一种或多种。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含根据权利要求1至6中任一项所述的杨梅素提取物；
优选地，所述药物组合物的剂型为口服制剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、喷雾剂、洗剂、栓剂、滴丸剂、合剂、擦剂、贴剂、膜剂、纸型剂、混悬剂、酊剂、干糖浆剂、泡腾片、硬膏剂、软膏剂、糖浆剂、乳剂、散剂、缓释、控释制剂、靶向制剂；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的杨梅素提取物或根据权利要求7所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤转移或用于抑制肿瘤细胞迁移的药物、保健品或食品补充剂中的用途；
优选地，所述肿瘤细胞包括：乳腺癌脑转移细胞、乳腺癌细胞、高转移前列腺癌细胞、可转移黑色素瘤细胞、神经母瘤细胞；
优选地，所述抑制肿瘤细胞迁移的方法为：所述肿瘤细胞在杨梅素提取物存在下进行培养或者与杨梅素提取物接触，从而抑制肿瘤细胞的迁移。
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| GR01 | Patent grant | ||
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