CN102429951B - 一种地锦草的黄酮和皂甙提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种地锦草的黄酮和皂甙提取物及其用途，其特征是：提取物是以地锦草为原料分别经柱层析和纯化制备而成的。经药理试验证明，可用于小鼠宫颈癌（U14）和其他癌症的治疗，它具有明显抑制肿瘤细胞生长、改善胸腺器官和促进免疫器官生长的作用，作用持久且毒性低。本发明为宫颈癌及其他癌症的治疗提供了一种非合成药物，其功能明确、作用持久、毒副作用小，拓宽了中药地锦草治疗疾病的范围。

Description

一种地锦草的黄酮和皂甙提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种地锦草的黄酮和皂甙提取物及其用途，属于纯中草药制剂及应用领域。

背景技术

宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二位最常见的恶性肿瘤，严重威胁妇女的健康和生命。估计每年宫颈癌新发病例数达50万，其中79%在发展中国家，宫颈癌在发展中国家占妇女癌症的24%。我国是宫颈癌的高发国家，每年新发宫颈癌病例平均为13.15万（1984年WHO资料），70年代我国每年死亡宫颈癌为9.98/10万，90年代初为3.25/10万。特别是近年来年轻宫颈癌患者有明显上升趋势，发病以每年2～3%的速度增长。宫颈癌与其他肿瘤的不同之处就在于它是一种感染性疾病，是可以预防和治愈的疾病；而且它的发生和发展具有相对鲜明的阶段性，是一个连续发展的过程，即由宫颈非典型增生（轻—中—重）—原位癌—早期浸润癌—浸润癌的一系列病理变化。一般认为，从宫颈上皮内瘤样病变发展到浸润癌一般需要10年的时间，这10年的时间给我们提供了发现它，治疗它，并逆转它向恶性病变发展的机会。

目前我国常用的西药有4000多种，其中大多数是仿制国外的产品，由于知识产权问题，仿制工作将受到限制，而自己研制新药，每种西药投资需13亿美元，研制期6～8年，人力、物力、财力及时间的消耗极大，在近期不可能发明创造足够的西药来满足我国防治疾病的需要。再加上西药固有的一些欠缺，如毒副反应严重，药源性疾患日益增多，疗效不够理想，药价昂贵等，使人们更多地寄希望于天然植物药，积极开展天然产物研究与新抗癌药开发。天然植物因其毒副作用小，易于被患者所接受等特点，在抗肿瘤药物中占有重要地位。从天然植物中寻找抗肿瘤药物或放射增敏和防治放疗反应药物，以提高治疗效果，正日益成为人们注目的焦点。

地锦草（Euphorbia humifusa Willd）的干燥全草，是中医、维医常用药材，应用广泛。其化学成分主要有黄酮、三萜、香豆素、羽扇豆醇、甾醇、鞣质及酚酸类等化合物，是一种药用价值很高的植物。地锦草具有清热解毒、凉血等功效，主要用于治疗各种皮肤病、瘙痒、痢疾、炎、咳血、吐血、便血、崩漏、外伤出血、湿热黄疸、汁不通、痈肿疔疮及跌打肿痛等疾病。但有关地锦草黄酮和皂甙口服治疗宫颈癌和其他癌症的研究国内外未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以作为一种非合成的药物用于临床宫颈癌及其他癌症患者免疫力低下的治疗的地锦草黄酮和皂甙提取物及其用途。

本发明的地锦草黄酮和皂甙提取物是以地锦草为原料分别经柱层析和纯化制备而成的。

上述提取物能够分别制成胶囊剂、散剂、颗粒剂或片剂在临床应用。

在制成的胶囊剂、散剂、颗粒剂或片剂可加入适量淀粉或其它辅料作为添加剂。

所述地锦草黄酮和皂甙提取物主要含有地锦草黄酮和皂甙成分，通过药理及动物试验证明上述提取物具有抗宫颈癌及其他癌症、调节患者机体免疫力等新的医药作用，所以其用途是用于癌症治疗以及促进免疫器官生长，特别是用于宫颈癌的治疗。

地锦草中黄酮和皂甙提取物的制备：

（1）脱脂：将地锦草全干草按1g：10ml比例加入石油醚浸泡12h，滤出石油醚，重复三次后，晾干地锦草。

（2）提取：地锦草药材与75%（v/ v）酒精按料液比1g：10ml比例于60~70℃加热回流2小时，提取三次，合并提取液，经50℃减压浓缩，得地锦草粗提物浸膏。

（3）黄酮和皂甙粗提物的制备：将步骤（2）所得产物黄酮以1：1比例（体积比）加入乙酸乙酯；皂甙以1：1比例（体积比）加入正丁醇；分别萃取，得地锦草黄酮和皂甙粗提物。

（4）黄酮和皂甙的精制：将步骤（3）所得草黄酮和皂甙粗提物分别过D101大孔树脂和硅胶（200-300）柱层析硅胶层析柱，合并流分，减压浓缩，活性炭脱色，真空干燥。分别得到纯化的黄酮和皂甙。

本发明的有益效果：本发明通过多项试验证明地锦草黄酮和皂甙提取物分别具有抗宫颈癌及其他癌症、改善患者免疫功能等功效。本发明为宫颈癌及其他癌症的治疗提供一种非合成药物，其功能明确、作用持久、毒副作用小，拓宽了中药地锦草治疗疾病的范围。

附图说明

图1为实施例中生理盐水阴性对照组肿瘤组织病理切片图；

图2为实施例中地锦草黄酮高剂量处理组肿瘤组织病理切片图；

图3为实施例中地锦草皂甙高剂量处理组肿瘤组织病理切片图；

图4为实施例中地锦草黄酮高剂量处理组荷瘤小鼠肝脏组织病理切片图；

图5为实施例中地锦草黄酮高剂量处理组荷瘤小鼠肾脏组织病理切片图；

图6为实施例中地锦草皂甙高剂量处理组荷瘤小鼠肝脏组织病理切片图；

图7为实施例中地锦草皂甙高剂量处理组荷瘤小鼠肾脏组织病理切片图。

具体实施方式

实施例：

药效实验例：以小鼠U14宫颈癌为例，对小鼠U14宫颈癌的抑制作用及对其免疫器官影响的试验进行阐述。

试验通过对本发明的药物进行药理学研究，观察其对荷U14宫颈癌小鼠的肿瘤抑制作用，对荷瘤小鼠胸腺、脾脏发育的影响及对肝脏、肾脏病理的影响。

1试验材料：

1.1动物和细胞株

昆明种小鼠（合格证号：SCXK（军）2007-004），体重18～22 g，购自军事医学科学院动物研究所。自由饮用自来水，清洁级动物饲养房，温湿度适宜，光照8～10 h/d。小鼠宫颈癌U14细胞株引自中国医学科学院药物研究所，在小鼠腹腔中进行传代。

1.2地锦草和试剂

地锦草，购自秦皇岛同仁堂药店，并经中医专家和《中国常用中草药》、《中国常用中草药彩色图谱》对照鉴定为地锦草；苏木精、伊红购于美国Santa Cruz生物试剂公司；环磷酰胺（CTX）由江苏恒瑞医药公司生产。

2试验方法

2.1小鼠荷宫颈癌U14实体瘤模型的建立

建模前小鼠禁食不禁水12 h。在无菌条件下，吸取在昆明种小鼠体内传代7～10 d的U14肿瘤细胞，生理盐水调整细胞密度为5×10⁶ cell/mL,于小鼠右左前肢腋窝皮下接种0.2 mL，接种成功率100%。

2.2地锦草黄酮和皂甙的制备

（1）脱脂：将地锦草全干草按1g：10ml比例加入石油醚浸泡12小时，滤出石油醚，重复三次后，晾干地锦草。

（2）提取：地锦草药材与75%（v/ v）酒精按料液比1g：10ml比例于60~70℃加热回流2小时，提取三次，合并提取液，经50℃减压浓缩，得地锦草粗提物浸膏。

（3）黄酮和皂甙粗提物的制备：将（2）所得产物以1：1(体积比)比例分别加入乙酸乙酯和正丁醇萃取，得地锦草黄酮和皂甙粗提物。

（4）黄酮和皂甙的精制：将（3）所得乙酸乙酯和正丁醇洗脱液过D101大孔树脂和硅胶（200-300）柱层析硅胶层析柱，合并流分，减压浓缩，活性炭脱色，真空干燥。

2.3试验分组

建模后将小鼠随机分为4组，每组10只，分别为：阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（CTX，25mg/kg）和地锦草黄酮低剂量（50-150mg/kg）、高剂量(160-250mg/kg)处理组。阳性对照组动物给药方式为腹腔注射，阴性对照组和地锦草黄酮低、高剂量处理组动物给药方式为灌胃。所有动物模型每日给药1次，连续给药15d，试验期间所有小鼠均自由进食进水。

2.4肿瘤抑制率的测定

停药次日乙醚麻醉状态下脱颈处死各组小鼠，剖取瘤块肉眼观察并用电子天平进行称重，计算肿瘤抑制率。

肿瘤抑制率(%)＝[(对照组平均瘤重－给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100

2.5对免疫器官重量的影响

将麻醉小鼠进行断颈处死，无菌条件下迅速解剖其胸腺和脾脏组织，称重。依据下列公式计算小鼠胸腺、脾脏指数：

胸（脾）腺指数（mg/10g）＝胸（脾）腺重量／去瘤体重×10

2.6地锦草黄酮和皂甙对小鼠肿瘤组织形态结构的影响

无菌条件下，迅速剥离出肿瘤组织，肉眼观察。迅速将肿瘤组织一部分(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)迅速置于中性缓冲福尔马林溶液中进行固定，石蜡包埋后，组织切片机切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下进行病理学观察。

2.7药物处理小鼠肝脏、肾脏病理切片观察  

荷实体瘤小鼠停药次日脱颈处死小鼠，剖取地锦草高剂量组小鼠的肝、肾组织用中性缓冲福尔马林固定，梯度酒精脱水，透明，浸蜡后石蜡包埋，制作病理切片。

2.8小鼠急性毒性试验  

根据预试验结果，发现无法测定小鼠口服地锦草黄酮和皂甙的LD₅₀，故改作最大耐受量试验。方法如下：取小鼠20只，雌雄各半。试验前禁食(不禁水)12 h，10只进行小鼠急性经口毒理试验，每日采用最大浓度最大体积一次性灌胃给药，连续观察7天，记录小鼠的行为、活动、摄食量、体重和死亡情况。

3本发明的试验结果：

3.1地锦草黄酮和皂甙对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

结果如表1所示，分别用地锦草黄酮和低、高剂量处理及CTX处理均可以减轻肿瘤组织重量，分别为2.22±0.50 g、1.61±0.45 g和1.43±0.34 g，与阴性对照组3.36±0.76 g相比,地锦草黄酮高剂量处理组和CTX处理组均达到差异显著(P<0.01)，地锦草黄酮低、高剂量和CTX处理组肿瘤抑制率分别为33.91、52.08和57.45%。如表2所示，通过地锦草皂甙低、高剂量处理及CTX处理后均可以减轻肿瘤组织重量，分别为2.09±0.34 g、1.51±0.38 g和1.43±0.34 g，与阴性对照组3.36±0.76 g相比,地锦草皂甙高剂量处理组和CTX处理组均达到差异显著(P<0.01)，地锦草皂甙低、高剂量和CTX处理组肿瘤抑制率分别为37.79%、55.06%和57.45%。

表1 地锦草黄酮处理对荷瘤小鼠体重和瘤体重量的影响(                                                

±S.D., n＝10)

注：与阴性对照组相比， ^* P<0.01

表2 地锦草皂甙处理对荷瘤小鼠体重和瘤体重量的影响(

±S.D., n＝10)

注：与阴性对照组相比， ^* P<0.01

3.2地锦草黄酮和皂甙对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响

各组小鼠进行药物处理15 d后，无菌条件下迅速解剖出其胸腺、脾脏组织，电子天平称重，试验结果见表3。与阴性对照组组比较，地锦草黄酮和皂甙低剂量组胸腺重量显著增加(P<0.05)，而CTX组小鼠胸腺指数却有所减小；与CTX阳性对照组相比，地锦草黄酮低、高剂量组的胸腺指数则有所增加，其中低剂量处理组与CTX组差异显著(P<0.05)，地锦草皂甙低、高剂量组的胸腺指数也有所增加，其中高剂量处理组与CTX组差异显著(P<0.05)对于荷瘤小鼠脾脏组织，其脾脏指数与阴性对照组相比，地锦草黄酮低虽有一定程度的增加，但差异均未达显著水平(P>0.05)，而CTX组则使其脾脏指数减小(P>0.05)。结果提示，CTX处理会抑制胸腺、脾脏组织的发育，而地锦草黄酮和皂甙对胸腺组织和脾脏组织发育有一定的促进作用。

表3 地锦草黄酮处理对荷瘤小鼠胸腺、脾脏重量的影响(

±S.D., n＝10)

注：与CTX对照组相比，^# P<0.05。

表4 地锦草皂甙处理对荷瘤小鼠胸腺、脾脏重量的影响(

±S.D., n＝10)

注：与CTX对照组相比，^* P<0.05。

3.3地锦草黄酮和皂甙对小鼠肿瘤组织形态的影响

荷瘤小鼠肿瘤切片除生理盐水阴性对照组外，地锦草黄酮、皂甙高剂量组和CTX阳性对照组肿瘤细胞数明显减少，并且抑制了肿瘤细胞的恶性表现，如出现异型性、核浆比降低，并可见肿瘤细胞呈单层分布，表现出细胞凋亡和坏死现象如核浓缩、碎裂和消失，参见附图1、2、3。

3.4荷瘤小鼠肝脏、肾脏病理切片观察结果

地锦草黄酮和皂甙高剂量组荷瘤小鼠肝、肾外观色泽质地均正常，无病理学改变。肝脏病理切片镜检可见中央静脉及肝小叶，肝细胞排列紧凑、整齐，肝细胞在中央静脉周围辐射状散开；肾脏肾细胞排列紧密，结构清楚，肾小球、肾小管明显可见，无显著毒性反应，参见附图,4、5、6、7。

3.5小鼠急性毒性试验结果

对小鼠以地锦草黄酮和皂甙最大浓度最大体积进行灌胃给药，连续处理7 天，发现小鼠毛色光滑，活动、饮食、粪便色泽与质地均正常，一周内无死亡及其它异常现象发生。处死后进行尸检，各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)经肉眼观察未见明显异常改变。

试验过程中地锦草黄酮和皂甙低、高剂量处理组小鼠在采食量及活跃程度均优于阴性对照组。肿瘤治疗停止三周后，肿瘤没有复发，治疗组小鼠肿瘤逐渐消失，这些结果首次证实地锦草黄酮和皂甙对宫颈癌和其他癌症都具有显著抑制作用。

Claims (4)

1.一种地锦草的黄酮和皂甙提取物，其特征是：该提取物是以地锦草为原料分别经柱层析和纯化制备而成的；其制备方法为：（1）脱脂：将地锦草全干草按1g：10ml比例加入石油醚浸泡12h，滤出石油醚，重复三次后，晾干地锦草；（2）提取：地锦草药材与75%（v/ v）酒精按料液比1g：10ml比例于60~70℃加热回流2小时，提取三次，合并提取液，经50℃减压浓缩，得地锦草粗提物浸膏；（3）黄酮和皂甙粗提物的制备：将步骤（2）所得产物黄酮以1：1比例（体积比）加入乙酸乙酯；皂甙以1：1比例（体积比）加入正丁醇；分别萃取，得地锦草黄酮和皂甙粗提物；（4）黄酮和皂甙的精制：将步骤（3）所得草黄酮和皂甙粗提物分别过D101大孔树脂和硅胶（200-300）柱层析硅胶层析柱，合并流分，减压浓缩，活性炭脱色，真空干燥，分别得到纯化的黄酮和皂甙。

2.根据权利要求1所述的地锦草的黄酮和皂甙提取物，其特征是：上述提取物能够制成胶囊剂、散剂、颗粒剂或片剂中的一种。

3.根据权利要求1所述的地锦草的黄酮和皂甙提取物的用途，其特征是：作为制备癌症治疗以及促进免疫器官生长药物的应用。

4.根据权利要求3所述的地锦草的黄酮和皂甙提取物的用途，其特征是：作为制备宫颈癌治疗药物的应用。

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