CN104940178A - 治疗高脂血症、动脉粥样硬化的药物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗高脂血症、动脉粥样硬化的药物及其制备方法和应用，该药物按照重量份计算，是以何首乌游离蒽醌类衍生物中的活性成分大黄素80～100份、芦荟大黄素4～6份为原料制成。本发明开发了何首乌游离蒽醌类衍生物的新应用，使作为传统老药的何首乌及其活性成分的研究具有了广阔的应用前景和药用价值。而且本发明以何首乌游离蒽醌类衍生物中筛分的活性成分大黄素、芦荟大黄素为原料制备的药物在治疗高脂血症及AS方面疗效显著，具有良好的应用前景。

Description

治疗高脂血症、动脉粥样硬化的药物及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种治疗高脂血症及动脉粥样硬化的药物及其制备方法以及何首乌游离蒽醌类衍生物在制备治疗高脂血症及动脉粥样硬化药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

高脂血症(Hyperlipidemia)与动脉粥样硬化(AS)密切相关，是引起心脑血管病变的重要原因之一。随着人民生活水平的不断提高，饮食结构的改变，我国高脂血症的发生率呈逐年上升趋势，因此，防治高脂血症一直是医学领域的重要课题之一。降脂治疗可减轻或避免AS的发生，从而降低冠心病和脑卒中的发病率。目前虽多种西药有降脂作用，但长期应用多有不良反应。何首乌(Fallopia multifloraHarald)作为一味药用历史悠久的中药材，在抗衰老、抗菌、增强机体免疫功能、促进血细胞的新生和发育等方面有明显药理作用，但在治疗高脂血症与动脉粥样硬化方面的相关报道和研究较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种可有效治疗高脂血症、动脉粥样硬化的新药物及其制备方法，同时提供何首乌游离蒽醌类衍生物在治疗高脂血症、动脉粥样硬化方面的新应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种治疗高脂血症、动脉粥样硬化的药物，该药物按照重量份计算，是以何首乌游离蒽醌类衍生物中的活性成分大黄素80～100份、芦荟大黄素4～6份为原料制成。

上述的治疗高脂血症、动脉粥样硬化的药物，优选方案，按照重量份计算，是以何首乌游离蒽醌类衍生物中的活性成分大黄素80份、芦荟大黄素4份为原料制成。

前述治疗高脂血症、动脉粥样硬化药物制备方法，包括以下步骤：

1)何首乌炮制：取生何首乌饮片适量，置非铁质容器内，按照16:1的重量比加入黑豆汁拌匀，焖润8小时，再将其置非铁质蒸锅中隔水蒸制48小时，拌回蒸液，取出间隙性置于60℃晒干，得制首乌，备用；

2)游离蒽醌提取：制首乌粉碎成粗粉，加乙醇回流提取三次，每次1h，减压回收乙醇，浓缩液加入1：1稀盐酸溶液分散，三氯甲烷萃取至无色，减压回收三氯甲烷，减压干燥，得醇浸膏备用；

3)大黄素、芦荟大黄素的提取：用8％盐酸溶液分散醇浸膏，用CH3CL2萃取，得CH3CL2层；CH3CL2提取液用5％NaHCO3萃取，得碱液层与CH3CL2液层；碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得黄色针状结晶即大黄酸；CH3CL2液层用5％Na3CO3溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得橙色大针状结晶即大黄素；CH3CL2液层用0.5％NaOH溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，CH3CL2层加入5％NaOH萃取，得水层，将水层用HCL酸化，再加入热的异戊醇溶液，得异戊醇液层与不容物，取异戊醇液层，浓缩蒸干，得棕黑色固体，再用CH3CL2重结晶，即得芦荟大黄素；去不容物用热吡啶溶解，得吡啶液，浓缩，得大黄素甲醚；

4)将大黄素和芦荟大黄素按处方混匀，然后按照常规制剂工艺制成临床上常见的药物制剂。

上述治疗高脂血症、动脉粥样硬化药物的制备方法中，所述的药物制剂为口服制剂，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或口服液。

本发明还涉及何首乌游离蒽醌类衍生物在制备治疗高脂血症、动脉粥样硬化药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明开发了何首乌游离蒽醌类衍生物的新应用，使作为传统老药的何首乌及其活性成分的研究具有了广阔的应用前景和药用价值。而且本发明以何首乌游离蒽醌类衍生物中筛分的活性成分大黄素、芦荟大黄素为原料制备的药物在治疗高脂血症及动脉粥样硬化方面疗效显著，具有良好的应用前景。

何首乌主要含有蒽醌类衍生物、多糖、二苯乙烯苷类化合物、磷脂类化合物及多种微量元素等多种化学成分，其中游离蒽醌类衍生物有大黄素(Emodin)，芦荟大黄素(aloe-emodin)、大黄酸(rhein)、大黄酚(rhubarb)、大黄素甲醚(emodin methyl ether)等活性成分，以上哪几种活性成分的联合在治疗高脂血症及动脉粥样硬化方面发挥着重要作用，目前尚不清楚。因此从何首乌游离蒽醌类衍生物繁多的成分中准确寻找到治疗高脂血症的成分作用靶点及最佳有效组分成为本发明重点解决的问题。

为验证本发明的效果，申请人进行了何首乌游离蒽醌类衍生物中最佳有效组分配方的筛选及药效学实验，经筛选得到的最佳有效组分从在体的动物实验中均得到验证，有效筛选出了何首乌游离蒽醌类衍生物中最佳有效组分配方的活性及药效，能够更多的寻找到何首乌游离蒽醌及组分配比降血脂和抗动脉粥样硬化物质基础及作用靶点，更有力的保障了其治疗高脂血症及动脉粥样硬化的功能，同时也为临床应用中药有效成分研究治疗疾病提供新思路和方法。

本发明所用的试剂有大黄酸，大黄素，芦荟大黄素，何首乌总蒽醌，均由贵阳中医学院炮制实验室提供。何首乌游离蒽醌类衍生物中大黄酸、大黄素、芦荟大黄素三种组分作为考察因素，共设计8种组分配比方案，完成均匀设计试验实验，经过高脂动物模型的建立，给药组动物按均匀设计表配伍进行灌胃，治疗4周后，股静脉采血，检测血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量作为筛选指标，采用SPSS 17.0软件包进行逐步回归分析，获得回归方程，得出最佳有效组分配方。何首乌游离蒽醌类衍生物中有效组分配方药效学验证实验，再次运用高脂饮食饲料饲养加高脂乳剂灌胃4周的方法诱导大鼠高脂血症动物模型，将筛选出的“有效组分配方”与何首乌游离蒽醌对高脂血症大鼠血脂水平作用进行比较，并设立血脂平作为对照药，以验证筛选出的“有效组分”的药效。根据实验结果，并采用加权评分法进行综合评分，并根据评分进行逐步回归分析。得回归方程:y＝54.63+0.061A-0.158B+2.314C，优选配方为：大黄素0.8g/kg，芦荟大黄素0.04g/kg。

1.实验材料

1.1动物：SD大鼠130只，SPF级，雌雄各半，体质量(200±10)g，购自中国人民解放军第三军医大学实验动物中心，合格证号:SCXK(渝)2012-0003。

1.2主要药物及试剂

丙硫氧嘧啶片(丙赛优)：上海朝晖有限公司，批号1304F17

吐温-80：重庆川江化学试剂厂

胆固醇：北京索莱宝(solarbio)科技有限公司，批号121B102

脱氧胆酸钠：北京索莱宝(solarbio)科技有限公司，批号322A022猪油：自制

大黄酸，大黄素，芦荟大黄素，何首乌总蒽醌，均由贵阳中医学院炮制实验室提供。

β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol biotechnology Grade):Amresco公司，批号0482

琼脂糖：BIOWEST公司，批号111860、

RNA染料(GelRedTM10，000×in water)：BIOTIUM公司，批号4100350×Tea buffer：康为世纪生物科技有限公司，批号00912G

ELISA试剂盒(HMG-CoA、ACAT2、CETP、CYP7A1、ATGL、PHTA)：康为世纪生物科技有限公司，批号20130879

超纯RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit)：康为世纪生物有限公司，批号00021303

HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(HiFi-MMLV cDNA Kit)：康为世纪生物有限公司，批号

2×Taq MasterMix(含染料)：康为世纪生物有限公司，批号1912L

DM500：康为世纪生物有限公司，批号00021304

无水乙醇分析纯：国药集团化学试剂厂

2试验方法

2.1高脂乳剂及高脂饲料的制备

2.1.1高脂乳剂：①猪油200g，磁力搅拌器加热至100℃，加胆固醇80g、丙赛优8g充分研磨搅匀，再加入200ml吐温80，制成油相。②同时，另一烧杯中加入640ml蒸馏水和160ml丙二醇电路加热至60℃，再加脱氧胆酸钠16g搅拌至充分溶解，制成水相。③将水相加入油相，混匀制成乳剂。

2.1.2高脂饲料：用1.5％胆固醇、0.5％脱氧胆酸钠、3％白糖、0.2％丙硫氧嘧啶、10％猪油、5％蛋黄、79.8％基础饲料均匀混合制作高脂饲料。

2.2均匀设计实验方案

用以何首乌游离蒽醌衍生物大黄酸、大黄素、芦荟大黄素三种组分作为考察因素，每个因素各设8个水平，按均匀设计表U8(85)及其使用表进行安排，共得8种组分配比方案，将购买到的五种单体依据方案进行配制，得到实验用药物，其具体配伍见表1。

表1

2.3有效组分配方筛选实验

大鼠80只，设对照组、模型组、均匀设计配方8组，共10组，每组各8只。除空白对照组外，其余各组均给予高脂饮食饲料饲养加高脂乳剂(10ml/kg)灌胃4周，进行高脂血症模型的建立，在第四周随机抽取10只大鼠眼眶取血，检测血清TC、TG、HDL-C、LDL—C含量，确定造模成功后，开始给药。各给药组按均匀设计表配伍用药(表1)，各组药物均用0.5％吐温-80配制成相应浓度的混悬液，以10ml/kg大鼠体质量进行灌胃给药。治疗4周后，以2％戊巴比妥钠按2ml/kg剂量腹腔注射麻醉，股静脉采血，4℃过夜，离心分离血清，送由贵阳中医学院第一附属医院检测血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量作为筛选指标，采用SPSS 17.0软件包进行逐步回归分析，获得回归方程，得出最佳有效组分配方。

2.4有效组分配方药效学验证实验

再次运用高脂饮食饲料饲养加高脂乳剂灌胃4周的方法诱导大鼠高脂血症动物模型，将筛选出的“有效组分配方”与何首乌游离蒽醌对高脂血症大鼠血脂水平作用进行比较，并设立血脂平作为对照药，以验证筛选出的“有效组分”的药效。

SD大鼠50只，体质量(200±10)g，自造模之日起，按计算机随机数字表，将大鼠分为正常组10只、造模组40只，造模第4周末，将造模大鼠随机分为模型组、最优配比组、蒽醌组及阳性对照组，每组10只。药物组按10ml/kg分别灌胃给药4周，正常组、模型组给予相应量的饮用水灌胃。末次给药后，禁食不禁水12h，以2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，股静脉采血，并取肝组织标本。

2.5样品的收集和指标检测

①采集的样本血液静置1h后，4℃，3000转/s离心15min，分离上层血清。送由贵阳中医学院第一附属医院检验科检测血清TG、TC、HDL-C和LDL-C。

②肝组织匀浆，用ELISA试剂盒检测以下指标：HMG-CoA、ACAT2、CETP、CYP7A1、ATGL、PHTA。

③提取肝组织mRNA，RT-PCR测定HMG-CoA(3-羟-3-甲戊二酰辅酶还原酶)、CYP7A1(7-α羟化酶)、Cat K(组织蛋白酶K)、Cat S(组织蛋白酶S)的表达。

④肝脏右叶进行病理学观察。

2.5.1 HMG-CoA、ACAT2(乙酰辅酶A乙酰转移酶2)、CETP(胆固醇酯转运蛋白)、CYP7A1、ATGL(甘油三酯脂肪酶)、PHTA(脂解酶)的ELISA法测定。

样本的处理：用预冷的生理盐水清洗组织后，称取0.1g肝组织，加入1ml预冷的生理盐水，在冰上充分研磨。5000rpm离心15分钟后取上清，并按10:1的比例加入平衡液(BALANCE SOLUTION)，样本处理完成。加样：依照说明书要求分别在酶标板各孔中加入相应量的标准品、生理盐水和样品。再次以说明书要求加入酶标记溶液(除空白对照孔)，用封板膜封板后，置孵育箱中37℃孵育反应1h。

洗板：用稀释过的洗涤液充分清洗酶标板5次，每次洗涤后均用吸水纸彻底拍干。

显色：各孔加显色剂，37℃避光反应15min，加终止液，终止反应。酶标仪检测450nm处各孔OD值。

设检测到的标准品OD值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，用ElisaCalc回归/拟合方程计算程序-v2.0获得logistiic曲线拟合(四参数)标准曲线和方程式，再将样本OD值代入方程，最终获得肝组织中HMG-CoA、ACAT2、CETP、CYP7A1、ATGL、PHTA的浓度。

2.5.2 RT-PCR测定肝组织中HMGCoA、CYP7A1、CatK及CatS mRNA的表达

RNA的提取：根据超纯RNA提取试剂盒说明要求提取肝组织总RNA，酶标仪测定其260nm和280nm的OD值。OD2680/OD280在1.8与2.0之间认为纯度符合要求，RNA浓度＝OD260×40×稀释倍数。

RNA逆转录：

反应体系：总体积20μl

dNTP Mix，2.5mM Each4.0μl

Primer Mix2.0μl

RNA Template5.0μl

5×RT Buffer4.0μl

DTT，0.1M2.0μl

HiFi-MMLV，200U/μl1.0μl

RNase-Free Water2.0μl

反应条件：42℃孵育45min，70℃孵育15min，离心收集cDNA至管底，置于冰上冷却。

引物

PCR反应体系和条件

2×Taq MasterMix 25μl

Forward Primer，10μM 2μl

Reverse Primer，10μM 2μl

Tamplate DNA 2μl

RNase-Free Water 19μl

反应条件：预变性94℃2分钟，变性94℃30s，退火56.5℃30s，延伸72℃30s，共34个循环，终延伸72℃2min，以2％琼脂糖凝胶电泳呈像分析。

2.5.3病理组织学检查

实验结束后，进行标本采集，取大鼠肝右叶、用4％多聚甲醛固定，常规石蜡切片，切片厚度约为7um。HE染色基本步骤，进行如下操作：(1)脱蜡水化：二甲苯Ⅰ5分钟；二甲苯Ⅱ10分钟；无水乙醇ⅠⅡ，95％乙醇，80％乙醇，各3分钟；⑤蒸馏水洗1分钟。

(2)染色：①苏木精15分钟左右；②自来水洗3s左右；③75％盐酸乙醇分化3次每次3s，

蒸馏水洗；氨水返蓝30s，水洗10s；伊红8分钟，蒸馏水洗3s。

(3)脱水透明和封固：①95％乙醇2分钟；③无水乙醇ⅠⅡ各5分钟；⑥二甲苯一分钟Ⅰ Ⅱ Ⅲ各5分钟；中性树胶封固。

2.5统计学方法

数据均采用SPSS 17.0软件包进行统计分析。计量资料以x±s表示，进行方差分析和组间两两比较。均匀设计实验采用逐步回归分析。为尽量客观反映各个因素水平对血脂四项指标的影响，拟采用综合加权评分法，即以一个综合指标(overall desirability，OD)[11]将各个指标综合考察。TG(A)和TC(B)和LDL-C(C)越低越好，HDL-C(D)越高越好，TC为主要考察指标，分别付与ABCD系数，即OD＝[0.2×(1-Ai/Amax)+0.4×(1-Bi/Bmax)+0.2×(1-Ci/Cmax)+0.2×Di/Dmax]×100，以综合指标进行直观分析和评价。

3结果

3.1蒽醌有效组分的筛选：实验结果显示，模型组肝组织TG、TC和LDL-C含量与正常组比较均有统计学意义(P<0.01)，提示模型制备成功，均匀设计试验的实验模型基础良好。在高脂血症模型成功基础上，检测各组血脂相关指标，采用加权评分法进行综合评分，并根据评分进行逐步回归分析(表2)。得回归方程：

y＝54.63+0.061A-0.158B+2.314C，优选配方为大黄素0.8g/kg，芦荟大黄素0.04g/kg。

表2

与模型组比较*P<0.05，**P<0.01

3.2有效组分复方药效验证实验

3.2.1优选配方对大鼠血脂水平的影响

如表3所示，模型组血清TG含量明显高于对照组(P<0.01)与模型组相比血脂平、蒽醌组(P<0.01)、优选配方组(P<0.05)血清TG含量明显降低；模型组相比对照组，血清TC含量明显升高(P<0.01)，优选配方组血清TC含量虽低于模型组(P<0.05)但仍高于正常组(P<0.01)；血清HDL-C含量，模型组与对照组虽无显著性差异，但优选配方组明显高于模型组(P<0.05)和对照组(P<0.01)；模型组血清LDL-C含量明显高于对照组(P<0.01)，而优选配方组血清LDL-C含量低于模型组(P<0.05)，而高于正常组(P<0.01)。实验结果提示，高脂血症模型复制成功，且蒽醌优选组分配方有降低血脂的作用。

表3

与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与优选配方组比较#P<0.05，##P<0.01

3.2.2优选配方对高脂血症大鼠肝组织CYP7A1、ATGL含量的影响

模型组CYP7A1含量与其他四组有明显著差异(P<0.01)；模型组ATGL含量低于对照组和蒽醌组(P<0.01)，优选配方组ATGL低于对照组(P<0.01)，见表4。

表4

与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与优选配方组比较#P<0.05，##P<0.01

3.2.3优选配方对高脂血症大鼠肝组织CETP、ACAT含量的影响

与对照组相比，模型组肝组织CETP含量明显升高(P<0.05)，优选配方组较模型组和蒽醌组则明显降低(P<0.01)；模型组肝组织ACAT含量与对照组无显著性差异，但明显高于蒽醌组和优选配方组(P<0.01)，优选配方组ACAT含量低于对照组(P<0.01)和阳性对照组(P<0.05)，结果见表5。

表5

与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与优选配方组比较#P<0.05，##P<0.01

3.2.4优选配方对高脂血症大鼠肝组织HMGCoA、PHTA含量的影响

模型组较对照组肝组织HMGCoA含量明显升高(P<0.01)，而优选配方组HMGCoA含量明显低于模型组和蒽醌组(P<0.05)；模型组肝组织PHTA含量与对照组相比有显著差异(P<0.05)，与模型组相比，蒽醌组(P<0.05)与优选配方组(P<0.01)PHTA含量均有所降低；

表6

与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与优选配方组比较#P<0.05，##P<0.01

3.2.5优选配方对高脂血症大鼠肝组织HMGCoA、CYP7A1、CatK、CatSmRNA表达的影响

PCR结果显示，与模型组相比，蒽醌组、阳性对照组(P<0.01)和优选配方组(P<0.05)肝组织HMGCoAmRNA表达减弱；模型组肝组织CYP7A1mRNA较对照组表达增(P<0.01)，优选配方组肝组织CYP7A1mRNA表达水平明显低于模型组、蒽醌组和阳性对照组；

表7

与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与优选配方组比较#P<0.05，##P<0.01

3.2.6优选配方对高脂血症大鼠肝脏病理学的影响

正常组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞整齐排列，放射状，可见正常肝窦和细胞核结构。模型组大鼠肝细胞胞质中可见脂肪滴空泡，部分细胞有脂肪变性发生肿大，细胞核偏离正常位置，可见少量炎细胞浸润和不同程度坏死。蒽醌组、优选组分组、阳性对照组大鼠的肝细胞脂肪变程度均较模型组病理片有明显好转，同样倍数镜检显示，肝细胞体积缩小，脂肪空泡和脂滴数量显著减少，细胞核基本处于正常位置。

4.细胞常规培养

将兔主动脉平滑肌细胞细胞购买于中科院上海细胞库(CCC-SMC-1)培养于10％胎牛血清、1％双抗及高糖型DMEM培养液，静置于37℃，5％CO²饱和湿度条件下二氧化碳培养箱中培养。传代：细胞生长至近80-90％时，收集细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，离心后弃上清，重悬细胞，进行传代。取增殖旺盛，生长状态良好的细胞用于实验。

5.配制药物

称取大黄素2.7mg各溶解在1mlDMSO中，使之成为1mmol/L原液，其中DMSO占培养基中的终浓度不超过1％，0.22μL的微孔滤膜过滤后，分装于无菌的EP管中。实验时加入新鲜DMEM高糖培养基中配成所需的浓度方可。标记后将其储存在-20℃冰箱中保存备用。

6.兔主动脉平滑肌细胞药物处理

取对数生长期细胞进行实验，弃培养基，PBS冲洗2遍，0.25％胰蛋白酶消化，1％胎牛血清高糖DMEM培养液重悬细胞，调整细胞至实验要求密度，分别接种于无菌96孔培养板(2-3×10⁴个/mL，每孔100μL)，同步24h去除培养液，换入含不同浓度药物的条件培养液进行实验，实验分组为大黄素与大黄酸0.05、0.1、0.15、0.2、2.5mmol·L^-1组，共5组，并设正常对照组。

7.MTT法检测大黄素对兔主动脉平滑肌细胞生长的增殖抑制作用。

取对数生长期细胞进行实验，弃培养液，PBS洗两遍，0.25％胰酶消化，离心去除消化液，用含10％胎牛血清DMEM培养液重悬细胞，调整细胞浓度，使成2-3×10⁴/mL。分别接种于无菌96孔培养板，将细胞悬液按每孔100μL接种于无菌96孔板中，待细胞贴壁后，(同步24h后)去除全培养液，用37℃预热的PBS洗涤一次，加入稀释于培养液的不同浓度的药物刺激细胞。实验分5个实验组每组设5个复孔，大黄素0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mmol·L^-1组，对照组为培养基空白组，分别培养12、24、48h后各取出1块培养板，加入MTT溶液(5mg·mL^-1)20μL，37℃继续培养4h以上，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μL DMSO，室温振荡10min，于酶标仪490nm波长处测定各孔光密度(OD值)，以下式计算抑制率。实验重复三次。

将所得实验结果带入IC50统计软件进行统计，计算大黄素抑制CCC-SMC-1细胞增殖的IC50；各组组间比较使用单因素方差分析。

实验结果为：由表8可知，经不同浓度的大黄素作用后，CCC-SMC-1细胞的生长速度明显减慢，细胞增殖能力受到不同程度的抑制。结果表明：大黄素在0.01-0.25mmol·L^-1范围内对CCC-SMC-1细胞均有抑制作用。CCC-SMC-1细胞增殖抑制率随着大黄素浓度的增加明显增高，与此同时，同一浓度下，药物作用时间越长，细胞增殖抑制率越高。即大黄素对CCC-SMC-1细胞增殖抑制作用在一定程度上呈剂量-效应关系和时间-效应关系。由表9可知，大黄素作用于CCC-SMC-1细胞24h后，半数抑制浓度(50％inhibitoryconcentration，IC50)为0.10mmol·L^-1。

表8大黄素对CCC-SMC-1细胞的增殖抑制率(n＝3)

^▲P＜0.05，与正常组相比

表9大黄素对CCC-SMC-1细胞的IC50(n＝6)

8.倒置显微镜下观察不同浓度大黄素对CCC-SMC-1细胞形态的影响

取对数生长期的CCC-SMC-1细胞，0.25％胰蛋白酶消化，5％胎牛血清高糖DMEM培养基重悬，制成细胞悬液，以5×106/mL的密度接种于无菌的细胞培养瓶中，静置于37℃，5％CO2饱和湿度条件下二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞同步。随机按大黄素0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mmol·L^-1刺激细胞，同时设立正常对照组(加等体积的无血清培养基)，继续培养24h，药物作用24h后在倒置相差显微镜下观察细胞，相机拍照记录并保存。

细胞形态学观察结果显示：正常组细胞为长梭形或椭圆行，排列紧密，形态大小相似且均匀，细胞胞膜完整，生长状态良好。经大黄素作用24h以后，兔主动脉平滑肌细胞生长密度随着药物浓度增加而开始下降，细胞排列逐渐稀疏，形状开始出现不规则，细胞表面出现发泡现象，破裂细胞和细胞碎片增多，漂离的死细胞增多，细胞完整形态少见，且少有贴壁。表明大黄素能够抑制兔主动脉平滑肌细胞的增殖。

9.PCR检测CCC-SMC-1细胞中Cat K、Cat D mRNA的表达

9.1取对数生长期的CCC-SMC-1细胞，胰酶消化，5％胎牛血清高糖DMEM培养基重悬，制成细胞悬液，以5×106/mL的密度接种于无菌培养瓶中，37℃，5％CO2饱和湿度条件下二氧化碳培养箱中培养24h，使细胞同步。随机按大黄素0.05、0.1、0.15、0.2、2.5mmol·L^-1不同剂量作用于细胞，同时设立正常对照组(加等体积的无血清培养基)，继续培养24h，药物作用24h后收获细胞。

9.2兔主动脉平滑肌细胞中总RNA的提取

①将收获的细胞离心得到细胞沉淀后，弃掉上清液，以每5×106/mL细胞加入600μL Buffer RL，反复均匀吹打几次，使细胞充分裂解。②待细胞充分裂解后，室温放置约5min左右，使蛋白核酸复合物完全分离。

③12000rpm，离心2-5min，取上清液进行下一步操作。

④加入1倍体积(600μL)的70％乙醇(事先用无RNase水配制好，以方便使用)，反复吹打几次至完全混匀。

⑤将四步骤所得的溶液全部加入到已装入收集管(Collection Tube 2mL)的吸附柱(Spin Column RM)中，倘若一次不能将全部所得溶液加入吸附柱中，可分两次分别转入，12000rpm，离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

⑥向吸附柱中加入700μL Buffer RW1，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

⑦向吸附柱中加入500μL Buffer RW2(使用前要检查其是否加入无水乙醇)，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

⑧向吸附柱中加入500μL Buffer RW2，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

⑨12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放置室温下数分钟，以确保其彻底晾干。

⑩将吸附柱置于一个新的RNase离心管(Collection Tube 1.5mL)中，向吸附柱的中间部位悬空加入30-50μL RNase-Free Water，室温静置1min，12000rpm，离心1min，收集RNA溶液，做好标记，包括内容物的名称、提取时间等信息，放于-80℃冰箱保存备用，以防止其降解。

9.3RNA纯化(RNA样品的纯度鉴定)

①取加1μLRNA样品到加到测样板中；

②在酶标仪上分别测定其260nm和280nm的OD值；

③测定A260nm/A280nm的比值在1.6-2.2范围内比较理想；

④根据A260的值估算RNA样品母液的浓度RNA浓度＝A260×40μg·ml^-1×稀释倍数。

9.4逆转录操作步骤

①将RNA模板、Prime Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-FreeWater溶解并分别置于冰上备用。

②配置反应体系，总体积为20μL：(注意在冰上配置)

③在涡旋震荡仪上混合均匀，短暂离心，使管壁上的溶液能尽量全部收集到管底。

④在PCR仪上42℃孵育30-50分钟，70℃孵育15分钟。反应结束后，短暂离心，在放置于冰上待其冷却。

⑤逆转录产物可直接用于PCR反应，也可放于-20℃冰箱长期保存。9.5PCR反应体系

9.6PCR反应条件

循环次数为：25-35个

9.7结果检测：反应全部结束后，取5μl的PCR产物置于0.2g/L琼脂糖凝胶上电泳，采用化学发光凝胶成像系统软件对图像进行分析，得出结果。

9.8引物：从基因库(GenBank)查出相关引物序列，由上海工生生物工程公司合成(表10)。

表10引物序列

9.9结果分析(相对定量法)

①各组相对表达量为各组目的基因体积与内参照基因体积的比值来表示。公式为：相对定量＝目的基因的表达/内参基因的表达

②均数±标准差

9.10统计处理：结果以均数±标准差表示，采用SPSS18.0统计软件单因素方差进行统计分析，P＜0.05表示有统计学意义。

实验结果：与正常组细胞中组织蛋白D的表达相比，大黄素剂量在0.05、0.1、0.15mmol·L^-1浓度药物处理的细胞Cat D mRNA的相对表达量均显著升高(P＜0.05)，尤其是大黄素剂量为0.15mmol·L^-1时其相对表达量达到最高峰值；与正常组细胞中组织蛋白K的表达相比，大黄素剂量在0.05、0.1、0.15mmol·L^-1浓度处理的细胞中Cat K mRNA的相对表达量均升高(P＜0.05)，且在大黄素剂量为0.1mmol·L^-1时其相对表达量达到峰值。

表11PCR检测不同浓度大黄素对CCC-SMC-1细胞中cat D、catK mRNA表达的影响(n＝4)

^▲P＜0.05，与正常组相比

本发明对何首乌的炮制工艺进行了研究，通过单因素考察及正交实验设计对何首乌黑豆汁拌蒸工艺的辅料用量、焖润时间、蒸制时间进行了研究，最终确定其最佳炮制工艺技术参数，即取生何首乌饮片适量，置非铁质容器内，加入适量黑豆汁拌匀(每160g何首乌用黑豆10g)，焖润8小时后，再将其置非铁质蒸锅中隔水蒸制48小时，拌回蒸液，取出间隙性置于60℃晒干。而且经实验发现，何首乌中游离蒽醌类成分的含量与蒸制时间的长短有着密切关系，实验结果表明，炮制时间在24h～48h内，游离蒽醌类成分的含量随炮制时间增加而增加；再者，其外观质量也随炮制时间不同而有所变化，蒸制48h，其颜色乌黑发亮，外观质量好；蒸制36小时，其颜色稍淡，无光泽；蒸制24h，其颜色暗淡不均，且断面偶有未完全蒸透的情况。综合各方面因素，再重点考虑指标成分含量和饮片外观质量，最终选择炮制工艺为：何首乌黑豆用量比16:1，常温焖润8小时，蒸制48小时。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

实施例1。配方：大黄素80g、芦荟大黄素4g。

制备方法：1)何首乌炮制：取生何首乌饮片适量，置非铁质容器内，按照16:1的重量比加入适量黑豆汁拌匀(每160g何首乌用黑豆10g)，焖润8小时后，再将其置非铁质蒸锅中隔水蒸制48小时，拌回蒸液，取出间隙性置于60℃晒干，得制首乌,贮藏待用。

2)游离蒽醌提取：制首乌粉碎成粗粉，加乙醇回流提取三次，每次1h，减压回收乙醇，浓缩液加入1：1稀盐酸溶液分散，三氯甲烷萃取至无色，减压回收三氯甲烷，减压干燥，得醇浸膏，备用。

3)大黄素、芦荟大黄素的提取：用8％盐酸溶液分散醇浸膏，用CH3CL2萃取，得CH3CL2层；CH3CL2提取液用5％NaHCO3萃取，得碱液层与CH3CL2液层；碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得黄色针状结晶即大黄酸；CH3CL2液层用5％Na3CO3溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得橙色大针状结晶即大黄素；CH3CL2液层用0.5％NaOH溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，CH3CL2层加入5％NaOH萃取，得水层，将水层用HCL酸化，再加入热的异戊醇溶液，得异戊醇液层与不容物，取异戊醇液层，浓缩蒸干，得棕黑色固体，再用CH3CL2重结晶，即得芦荟大黄素；去不容物用热吡啶溶解，得吡啶液，浓缩，得大黄素甲醚。

4)称取大黄素80g、芦荟大黄素4g，粉碎成细粉，干燥，按照常规制剂工艺加入适量辅料制成片剂1000片。

用法用量：口服，每次1片，每日2次。

实施例2。配方：大黄素100g、芦荟大黄素6g。

制备方法：1)何首乌炮制：取生何首乌饮片适量，置非铁质容器内，按照16:1的重量比加入适量黑豆汁拌匀(每160g何首乌用黑豆10g)，焖润8小时后，再将其置非铁质蒸锅中隔水蒸制48小时，拌回蒸液，取出间隙性置于60℃晒干，得制首乌,贮藏待用；

2)游离蒽醌提取：制首乌粉碎成粗粉，加乙醇回流提取三次，每次1h，减压回收乙醇，浓缩液加入1：1稀盐酸溶液分散，三氯甲烷萃取至无色，减压回收三氯甲烷，减压干燥，得醇浸膏，备用；

3)大黄素、芦荟大黄素的提取：用8％盐酸溶液分散醇浸膏，用CH3CL2萃取，得CH3CL2层；CH3CL2提取液用5％NaHCO3萃取，得碱液层与CH3CL2液层；碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得黄色针状结晶即大黄酸；CH3CL2液层用5％Na3CO3溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得橙色大针状结晶即大黄素；CH3CL2液层用0.5％NaOH溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，CH3CL2层加入5％NaOH萃取，得水层，将水层用HCL酸化，再加入热的异戊醇溶液，得异戊醇液层与不容物，取异戊醇液层，浓缩蒸干，得棕黑色固体，再用CH3CL2重结晶，即得芦荟大黄素；去不容物用热吡啶溶解，得吡啶液，浓缩，得大黄素甲醚。

4)称取大黄素100g、芦荟大黄素6g，粉碎成细粉，充分混合均匀，按照常规制剂工艺加入适量辅料制成胶囊剂1000粒。

用法用量：口服，每次服用1粒，每日2次。

实施例3。配方：大黄素70g、芦荟大黄素3g。

制备方法：1)何首乌炮制：取生何首乌饮片适量，置非铁质容器内，按照16:1的重量比加入适量黑豆汁拌匀(每160g何首乌用黑豆10g)，焖润8小时后，再将其置非铁质蒸锅中隔水蒸制48小时，拌回蒸液，取出间隙性置于60℃晒干，得制首乌,贮藏待用；

2)游离蒽醌提取：制首乌粉碎成粗粉，加乙醇回流提取三次，每次1h，减压回收乙醇，浓缩液加入1：1稀盐酸溶液分散，三氯甲烷萃取至无色，减压回收三氯甲烷，减压干燥，得醇浸膏，备用；

3)大黄素、芦荟大黄素的提取：用8％盐酸溶液分散醇浸膏，用CH3CL2萃取，得CH3CL2层；CH3CL2提取液用5％NaHCO3萃取，得碱液层与CH3CL2液层；碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得黄色针状结晶即大黄酸；CH3CL2液层用5％Na3CO3溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得橙色大针状结晶即大黄素；CH3CL2液层用0.5％NaOH溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，CH3CL2层加入5％NaOH萃取，得水层，将水层用HCL酸化，再加入热的异戊醇溶液，得异戊醇液层与不容物，取异戊醇液层，浓缩蒸干，得棕黑色固体，再用CH3CL2重结晶，即得芦荟大黄素；去不容物用热吡啶溶解，得吡啶液，浓缩，得大黄素甲醚。

4)称取大黄素70g、芦荟大黄素3g，粉碎成细粉，充分混合均匀，然后按照常规制剂工艺加入适量辅料制成颗粒剂1000粒，即得。

用法用量：口服，每次服用1粒，每日2次。

Claims (5)

1.治疗高脂血症、动脉粥样硬化的药物，其特征在于：按照重量份计算，是以何首乌游离蒽醌类衍生物中的活性成分大黄素70～100份、芦荟大黄素3～6份为原料制成。

2.根据权利要求1所述的治疗高脂血症、动脉粥样硬化的药物，其特征在于：按照重量份计算，各原料的用量为大黄素80份、芦荟大黄素4份。

3.如权利要求1或2所述治疗高脂血症、动脉粥样硬化药物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，

1)何首乌炮制：取生何首乌饮片适量，置非铁质容器内，按照16:1的重量比加入黑豆汁拌匀，焖润8小时，再将其置非铁质蒸锅中隔水蒸制48小时，拌回蒸液，取出间隙性置于60℃晒干，得制首乌，备用；

2)游离蒽醌提取：制首乌粉碎成粗粉，加乙醇回流提取三次，每次1h，减压回收乙醇，浓缩液加入1：1稀盐酸溶液分散，三氯甲烷萃取至无色，减压回收三氯甲烷，减压干燥，得醇浸膏，备用；

3)大黄素、芦荟大黄素的提取：用8％盐酸溶液分散醇浸膏，用CH3CL2萃取，得CH3CL2层；CH3CL2提取液用5％NaHCO3萃取，得碱液层与CH3CL2液层；碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得黄色针状结晶即大黄酸；CH3CL2液层用5％Na3CO3溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，碱液层酸化后获得沉淀物，重结晶后得橙色大针状结晶即大黄素；CH3CL2液层用0.5％NaOH溶液萃取，得碱液层与CH3CL2液层，CH3CL2层加入5％NaOH萃取，得水层，将水层用HCL酸化，再加入热的异戊醇溶液，得异戊醇液层与不容物，取异戊醇液层，浓缩蒸干，得棕黑色固体，再用CH3CL2重结晶，即得芦荟大黄素；去不容物用热吡啶溶解，得吡啶液，浓缩，得大黄素甲醚；

4)将大黄素和芦荟大黄素按处方混匀，按照常规制剂工艺制成临床上常见的药物制剂。

4.根据权利要求3所述的治疗高脂血症、动脉粥样硬化药物的制备方法，其特征在于：所述的药物制剂为口服制剂，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂或口服液。

5.何首乌游离蒽醌类衍生物在制备治疗高脂血症、动脉粥样硬化药物中的应用。