CN105456277B - 灵芝三萜酸活性部位在制备降血脂保健品和药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝三萜酸活性部位在制备降血脂保健品和药物中的应用，活性部位的制备方法包括：将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，干粉在水中加入复合酶酶解，经灭酶、冷却、抽滤，得到酶解液；将酶解液加入石油醚萃取除脂，再加入乙酸乙酯萃取，得灵芝乙酸乙酯提取物；将灵芝乙酸乙酯提取物先碱化，再水洗至中性，得到碱化水层，然后将碱化水层酸化，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸；将粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用氯仿和甲醇系统梯度洗脱，经薄层色谱检识、过滤、蒸干，即得灵芝三萜酸活性部位。本发明的灵芝三萜酸活性部位通过复合酶酶解，再经萃取、分离等步骤即可得到，具有明显的降血脂作用，可用于制备降血脂保健品和药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种灵芝三萜酸活性部位在制备降血脂保健品和药物中的应用。
背景技术
随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，高脂血症发病率逐年升高，并且呈年轻化趋势。研究资料表明，高脂血症是动脉粥样硬化的病理基础，由此引发高血压、脑卒中、冠心病和心肌梗塞等一系列危害人类健康的心脑血管疾病，同时也是促进糖耐量异常、糖尿病及其它重要脏器病变的危险因素之一。现代医学认为，血脂异常是指血中脂质的量和质的异常，主要表现为血浆或血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)三者升高和/或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低。
目前虽有许多化学药物可降低人体血清胆固醇，但都具有不同程度毒副作用，如胃肠道反应、肝、肾损伤等，大多数降脂西药可使血脂更集中于肝脏代谢，使得脂质更加堆积在肝脏而加重肝细胞脂肪变化和肝功能损伤，因此患者在治疗过程中降脂护肝难两全。另外，多数合成药物为单一靶点作用机制，在治疗病因复杂的高脂血症方面难以达到满意的效果。因此，从天然药用植物中分离提取具有新型、高效、低毒的生物活性成分，用于相关疾病预防和治疗，已成为近年来世界各国医药界关注和研究的热点。
灵芝为多孔菌科赤芝[Ganoderma lucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst.]或紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd]的干燥子实体，其性平；味甘，温。归心、肝、脾经，自古就有“仙草”、“瑞草”之称，药用价值极高，是我国珍贵的菌藻类药材。我国人民把它作为药用已有2000多年的历史，周朝古籍《列子》一书中就有“朽壤之上，有菌者芝”；明朝大医药学家李时珍在《本草纲目》中就将灵芝列为上品，归到菜部，并卓有远见地告示灵芝是一种不可多得的药食兼用珍品。其子实体、孢子粉、菌丝体均可入药。然而，直到近三十年，科学界才开始关注研究灵芝的药效成分和药理作用。在灵芝的多种化学成分中，灵芝多糖和三萜类化合物是其主要功效成分，《中国药典》中以灵芝多糖的含量来评价灵芝的质量；在日本等国家则以灵芝三萜酸的含量作为鉴定灵芝制品质量的标准。
现代药理学关于灵芝降血脂作用的研究报道并不多见。Li等评价了灵芝多糖对STZ致糖尿病大鼠的降糖作用，其中高剂量灵芝多糖(150mg/kg)可以显著降低糖尿病大鼠的血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，同时提高高密度脂蛋白胆固醇含量(HDL-C)，认为灵芝多糖可作为糖尿病合并动脉粥样硬化或高血脂症的潜在药物(Li Fenglin，Zhang Yiming，Zhong Zhijian.Antihyperglycemic effect ofganoderma lucidum polysaccharides on streptozotocin-induced diabetic mice[J].International journal of molecular sciences,2011,12(9):6135-6145)；然而Hikino等通过饲喂糖尿病小鼠灵芝聚糖Ganideran B发现，Ganideran B可以降低糖尿病小鼠肝总糖原的含量，却不影响血清和肝中TC和TG的含量(Hikino H,Ishiyama M,Suzuki Y,etal.Mechanisms of hypoglycemic activity of ganoderan B:a glycan of Ganodermalucidum fruit bodies[J].Planta medica,1989,55(5):423-428)。Lee等分离得到羊毛脂烷型三萜T-butyl lucidenate B，可以显著抑制3T3-L1细胞中TG的含量和GPDH活性，线性降低PPARγ,C/EBPα,and SREBP-1c的表达(Lee Iksoo Kim,Hongjin Youn,Uijung Kim,etal.Effect of lanostane triterpenes from the fruiting bodies of Ganodermalucidum on adipocyte differentiation in 3T3-L1cells[J].Planta medica,2010,76(14):1558-1563)。
尽管灵芝作为我国珍贵的菌藻类药材应用历史悠久，但至今关于灵芝三萜酸在高血脂实验动物在体模型中的研究未见报道。建立人类疾病的动物模型，运用科学的方法，通过研究模型动物从而找出发病的原因及机理，以预防和治疗相关疾病，而适用的动物模型是研究的关键因素之一。目前高脂血症常使用的实验动物种类有大鼠、小鼠、长爪沙鼠、鹌鹑等。本发明中所使用的模型动物为长爪沙鼠，长爪沙鼠是我国特有实验动物，广泛应用于心脑血管疾病的研究。运用长爪沙鼠动物模型的优点和进步是：长爪沙鼠经高脂饲料饲养1周后即可形成高胆固醇血症(单纯性脂肪肝，LDL升高，HDL升的少)，2-3周形成NASH(非酒精性脂肪性肝炎，TC与LDL升高，LDL升高，HDL开始回落)，4周即可形成高TG及高TC混合型(NASH向肝纤维化过渡，部分早期纤维化，LDL可以稳定地高到第六周到第12周)，12～16周出现中重度肝纤维化，部分出现肝硬化，12周LDL，HDL开始降低，具有成模速度快、死亡率低的优点；且该模型以LDL-C升高为主，血清游离胆固醇含量约占总含量30％左右，与人类NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)的基本病变特征极为相似。基于文献(李巍,石巧娟,郭红刚,等.动态分析沙鼠非酒精性脂肪肝病形成及生化影响[J].中国比较医学杂志,2011,21(8):44-50)所述的长爪沙鼠NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)动物模型，发明人经过大量的实验研究，发现灵芝三萜酸经过纯化精制，具有非常显著的降血脂作用。
发明内容
本发明提供了一种灵芝三萜酸活性部位在制备降血脂保健品和药物中的应用，灵芝三萜酸活性部位通过复合酶酶解，再经萃取、分离等步骤即可得到，可用于制备降血脂保健食品和药物。
一种灵芝三萜酸活性部位在制备降血脂保健品和药物中的应用，该灵芝三萜酸活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，干粉在水中加入复合酶酶解，经灭酶、冷却、抽滤，得到酶解液；
(2)将步骤(1)中得到的酶解液加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得灵芝乙酸乙酯提取物；
(3)将步骤(2)制备的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，先碱化至pH 9～10，再水洗至中性，得到碱化水层，然后将碱化水层酸化至pH 2～3，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸；
(4)将步骤(3)制备的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用氯仿和甲醇系统梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱检识、过滤、蒸干，即得灵芝三萜酸活性部位。
本发明中，通过复合酶的酶解以及各提取步骤的配合，能更加充分、全面地提取灵芝中三萜酸类的化合物，灵芝三萜酸活性部位具有明显的降血脂作用。
以下作为本发明的优选技术方案：
步骤(1)中，将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，包括：先取灵芝子实体药材，55℃～75℃干燥，粉碎，过80～120目筛得干粉；进一步优选，包括：先取灵芝子实体药材，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉。
所述的复合酶，由以下重量百分含量的组分组成：
中性蛋白酶 5％～95％；
纤维素酶 2.5％～48％；
果胶酶 2.5％～48％。
进一步优选，所述的复合酶，由以下重量百分含量的组分组成：
中性蛋白酶 30％～80％；
纤维素酶 10％～35％；
果胶酶 10％～35％。
植物细胞壁的主要成分是果胶和纤维素，复合酶中的果胶酶可以酶解其中的果胶，纤维素酶酶解其中的纤维素，使植物细胞中的有效成分释放，中性蛋白酶可对其中的蛋白质等大分子物质进行澄清处理，从而提高有效成分的得率。复合酶的使用可以缩短灵芝三萜酸的提取时间并提高其得率，同时能更加充分、全面地提取灵芝中三萜酸类的化合物，灵芝三萜酸活性部位具有明显的降血脂作用。
所述的复合酶的加入量为干粉质量的1.0％～5.0％。
所述的水与干粉的料液比为10mL～30mL：1g，进一步优选为20mL：1g。
所述的酶解条件为：温度35～70℃、pH3.5～7、酶解时间4.5～8h，进一步优选，温度40～60℃、pH4～6、酶解时间5～7h。
步骤(3)中，灵芝乙酸乙酯提取物先碱化，将其中的三萜酸成盐，溶解于水中，然后用乙酸乙酯萃取去除碱性、中性杂质；继而将碱化水洗液酸化使成盐的三萜酸释放，用乙酸乙酯继续萃取得到纯化的三萜酸成分。碱化、酸化的作用是纯化三萜酸，主要去除其中的中性三萜。
步骤(4)中，所述的氯仿和甲醇系统中氯仿与甲醇的体积比为1～10︰1。进一步优选，所述的氯仿和甲醇系统中氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，上述洗脱液中含有较多的三萜酸类的化合物。
本发明中，得到的灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为5％至70％，其三萜酸的含量采用分光光度计测定。
本发明制备方法得到的灵芝三萜酸活性部位，具有显著的降血脂作用，可用于制备降血脂保健食品和药物。
为了检测灵芝三萜酸活性部位的降血脂效果，将本发明所得的灵芝三萜酸活性部位配置成30～150mg/ml药液，用于长爪沙鼠NAFLD模型中，分别观察样品在不同剂量下对实验动物血清胆固醇、总甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量的影响。结果表明灵芝三萜酸活性部位具有显著的降血脂活性，可用于制备降血脂的保健品或药物。
本发明的灵芝三萜酸活性部位可以作为活性成分与药学上可接受的辅料组成药物组合物。
灵芝三萜酸活性部位可单独或几种部位组合，进一步与辅料组合，剂型包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂等。
本发明灵芝三萜酸活性部位的载体和赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，例如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。
灵芝三萜酸活性部位具有明显的降血脂作用，可以显著降低重度高血脂沙鼠甘油三酯、胆固醇水平，同时降低LDL-C水平；另外灵芝三萜酸活性部位110mg/kg还可以升高血脂长爪沙鼠的HDL-C水平，表明灵芝三萜酸活性部位具有良好的降血脂作用，具有开发的潜力。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其中灵芝三萜酸的含量和纯度大幅提升。现有的方法多用氯仿、乙酸乙酯等试剂对灵芝子实体干粉或醇提物直接萃取，其中混杂了大量的脂肪酸、中性三萜等杂质。
本发明的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，对灵芝三萜酸的提取工艺进行了优化，在提取前和提取后分别采用酶法和层析法对灵芝三萜酸和其活性部位进行了预处理和精制，一方面能够更加充分、全面地提取灵芝中三萜酸类的化合物，另一方面能够提高灵芝三萜酸的得率，其工艺简单、得率高；设备简单，适合工业生产。
本发明的灵芝三萜酸活性部位，通过长爪沙鼠NAFLD模型的研究，结果显示其具有明显的降血脂作用，可用于制备降血脂保健品和药物，有利于市场化推广利用，具备广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1(灵芝三萜酸活性部位的制备)
(1)取灵芝子实体药材(浙江五养堂药业有限公司)，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉；干粉按料液比1g︰20mL加入蒸馏水，在温度50℃、pH5.5条件下，加入相对于干粉的质量3.0％的复合酶。复合酶，由重量百分含量50％中性蛋白酶、25％纤维素酶以及25％果胶酶组成，酶解时间为6h，灭酶，冷却，抽滤，得到酶解液，备用；
(2)取上述步骤(1)制备得到的酶解液，加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得乙酸乙酯提取物；
(3)取上述步骤(2)制备得到的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，碱化至pH9.5，水洗至中性，碱化水层酸化至pH 2.5，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸，备用；
(4)取上述步骤(3)制备得到的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用体积比为1～10︰1的氯仿和甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，薄层色谱检识、过滤、蒸干即为灵芝三萜酸活性部位。
实施例1制备的灵芝三萜酸活性部位中，采用分光光度计测定，灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为65％。
实施例2(灵芝三萜酸活性部位的制备)
(1)取灵芝子实体药材(浙江五养堂药业有限公司)，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉；干粉按料液比1g︰15mL加入蒸馏水，在温度40℃、pH4.0条件下，加入相对于干粉的质量2.0％的复合酶，复合酶，由重量百分含量30％中性蛋白酶、35％纤维素酶以及35％果胶酶组成，酶解时间为5h，灭酶，冷却，抽滤，得到酶解液，备用；
(2)取上述步骤(1)制备得到的酶解液，加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得乙酸乙酯提取物；
(3)取上述步骤(2)制备得到的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，碱化至pH 9，水洗至中性，碱化水层酸化至pH 2，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸，备用；
(4)取上述步骤(3)制备得到的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用体积比为1～10︰1的氯仿和甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，薄层色谱检识、过滤、蒸干即为灵芝三萜酸活性部位。
实施例2制备的灵芝三萜酸活性部位中，采用分光光度计测定，灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为45％。
实施例3(灵芝三萜酸活性部位的制备)
(1)取灵芝子实体药材(浙江五养堂药业有限公司)，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉；干粉按料液比1g︰25mL加入蒸馏水，在温度60℃、pH6.0条件下，加入相对于干粉的质量4.0％的复合酶，复合酶，由重量百分含量80％中性蛋白酶、10％纤维素酶以及10％果胶酶组成，酶解时间为7h，灭酶，冷却，抽滤，得到酶解液，备用；
(2)取上述步骤(1)制备得到的酶解液，加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得乙酸乙酯提取物；
(3)取上述步骤(2)制备得到的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，碱化至pH 10，水洗至中性，碱化水层酸化至pH 3，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸，备用；
(4)取上述步骤(3)制备得到的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用体积比为1～10︰1的氯仿和甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，薄层色谱检识、过滤、蒸干即为灵芝三萜酸活性部位。
实施例3制备的灵芝三萜酸活性部位中，采用分光光度计测定，灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为55％。
实施例4(灵芝三萜酸活性部位对长爪沙鼠血脂的影响)
1、实验材料和方法
1.1实验药物
灵芝购于浙江五养堂药业有限公司；本发明实施例1制备得到的灵芝三萜酸活性部位。
1.2实验动物：实验选用普通级雄性长爪沙鼠48只，体重50-70g，单一雄性，浙江省医学科学院实验动物中心提供，实验动物生产证许可证号：SYXK(浙)2008-0114；饲养于浙江省医学科学院实验动物中心SPF级动物房，实验条件保持温度为20-26℃，相对湿度为40％-70％，光照-黑暗循环为12h：12h，自由饮水摄食。
1.3高脂饲料：基础饲料80.5％、胆固醇2％、蛋黄粉10％、猪油7％、胆盐0.5％(李巍,石巧娟,郭红刚,等.动态分析沙鼠非酒精性脂肪肝病形成及生化影响[J].中国比较医学杂志,2011,21(8):44-50)
1.4实验方法
编号，随机分为5组，即正常对照组，高脂模型组，灵芝三萜酸高、中，低三个剂量组，每组10只。给予普通饲料，自由饮水，适应性饲养1周。第二周起，除正常对照组继续给予普通饲料外，其余4组喂食高脂饲料。经连续2周喂养后，可初步形成NASH模型。为观察灵芝三萜酸活性部位的治疗作用，本实验在建模后，再给予药物干预治疗。于高脂饲料喂食14d后，灵芝三萜酸各个剂量组分别按150、110、70、30mg/kg·bw灌胃给予(其中，低剂量相当于成人临床的等效剂量)，连续给药2周，每天1次；同时，正常对照组和高脂模型组给予等体积生理盐水灌胃。
1.5主要仪器和试剂
动物天平、电子天平、低速离心机、意大利Autolab全自动生化仪(PM4000)、恒温水浴锅、手术器械。测定TC、TG、DLD-C、HDL-C试剂盒均有南京建成生物工程研究所提供。
1.6实验数据统计:实验所得数据均为数值变量资料。所有数据均经SPSS统计软件进行方差分析。方差齐用方差分析，方差不齐用轶和检验。
2、结果
2.1对长爪沙鼠体重的影响：由表1可见，在整个实验过程中，各组动物生长活动正常，实验药物各个剂量组动物体重与高脂对照组、空白对照组相比较，无显著性差异(p＞0.05)。
表1
| 组别 | 动物数 | 初始体重(g) | 中期体重(g) | 末期体重(g) |
| 空白对照组 | 10 | 51.09±2.76 | 59.87±5.11 | 66.23±3.72 |
| 模型对照组 | 10 | 49.21±5.17 | 62.10±6.18 | 67.28±2.76 |
| 灵芝三萜酸30mg/kg | 10 | 53.17±3.23 | 58.99±1.66 | 71.22±2.49 |
| 灵芝三萜酸70mg/kg | 10 | 51.33±3.96 | 61.22±2.84 | 68.58±3.47 |
| 灵芝三萜酸110mg/kg | 10 | 52.87±6.92 | 60.38±3.27 | 73.12±5.81 |
| 灵芝三萜酸150mg/kg | 10 | 50.37±4.63 | 58.99±1.20 | 69.43±2.17 |
2.2灵芝三萜酸活性成分对高血脂长爪沙鼠血脂含量的影响：
表2为灵芝三萜酸活性成分对高血脂长爪沙鼠血脂含量的影响。灌胃给药2周后，空白组、模型组和各个剂量灵芝三萜酸活性成分组沙鼠采血进行血液生化指标的检测，测定其中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。数据结果显示，与模型组比较，灵芝三萜酸活性成分30、70、150mg/kg剂量均能显著降低高血脂长爪沙鼠血清TC的含量，而110mg/kg剂量对血清胆固醇的影响较小；同时灵芝三萜酸活性成分30、70、110、150mg/kg能线性降低沙鼠TG含量，其中70、110、150mg/kg剂量组与模型对照组相比具有显著性差异；此外，灵芝三萜酸活性成分30、70、150mg/kg剂量能降低沙鼠LDL-C的含量，这一结果与灵芝三萜酸活性成分降低TC含量的趋势一致。值得一提的是，灵芝三萜酸活性成分110mg/kg在灌胃给药2周后，显著升高了高血脂沙鼠的HDL-C水平，说明灵芝三萜酸活性成分可以降低由高血脂引发的动脉粥样硬化和冠状动脉心脏病的风险。
表2
a：p＜0.05，与空白对照组相比；b：p＜0.05，与模型组相比
3、实验结果：
本实验表明，经口给予高血脂沙鼠不同剂量的灵芝三萜酸活性成分，30、70、150mg/kg剂量组能显著降低沙鼠血液TC和LDL-C含量水平(p＜0.05)，同时70、110和150mg/kg剂量组能线性并显著降低TG含量水平(p＜0.05)，与高脂对照组相比较，均有统计学意义。另外，灵芝三萜酸活性成分110mg/kg在灌胃给药2周后，可以显著升高高血脂沙鼠的HDL-C水平，有增加肝脏胆固醇逆转运的倾向。实验结果提示，灵芝三萜酸活性成分具有显著的降血脂功能。
实施例5(滴丸的制备)
分别称取400g聚乙二醇4000，在水浴上融化，再加入灵芝三萜酸活性部位500g干燥粉末，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中(温度±4℃)，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得灵芝三萜酸滴丸1000粒。
实施例6(胶囊剂的制备)
灵芝三萜酸活性部位干燥粉末1000g，与药用淀粉500g混合均匀，烘干，按每粒0.45g制成胶囊。
实施例7(片剂的制备)
灵芝三萜酸活性部位干燥粉末1000g，淀粉500g，混合均匀，用适量乙醇制粒，经整粒机整粒，压片，每片0.35g。
实施例8(颗粒剂的制备)
灵芝三萜酸活性部位干燥粉末1500g，淀粉1000g，糖粉400g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。
Claims (1)
1.一种灵芝三萜酸活性部位在制备降血脂保健品和药物中的应用，其特征在于，所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，干粉在水中加入复合酶酶解，经灭酶、冷却、抽滤，得到酶解液；
将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，包括：先取灵芝子实体药材，55℃～75℃干燥，粉碎，过80～120目筛得干粉；
所述的复合酶，由以下重量百分含量的组分组成：
中性蛋白酶 30％～80％；
纤维素酶 10％～35％；
果胶酶 10％～35％；
所述的复合酶的加入量为干粉质量的1.0％～5.0％；
所述的水与干粉的料液比为10mL～30mL：1g；
所述的酶解条件为：温度35～70℃、pH3.5～7、酶解时间4.5～8h；
(2)将步骤(1)中得到的酶解液加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得灵芝乙酸乙酯提取物；
(3)将步骤(2)制备的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，先碱化至pH 9～10，再水洗至中性，得到碱化水层，然后将碱化水层酸化至pH 2～3，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸；
(4)将步骤(3)制备的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用氯仿和甲醇系统梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱检识、过滤、蒸干，即得灵芝三萜酸活性部位；
所述的氯仿和甲醇系统中氯仿与甲醇的体积比为1～10︰1。
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