CN106139148A - 一种肿瘤化疗药物制剂组合 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肿瘤化疗药物制剂组合，其包括用于对肿瘤细胞进行增敏的源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡制剂，和用于治疗所述肿瘤的化疗药制剂。本发明提供的肿瘤化疗药物制剂组合以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡制剂作为肿瘤细胞的增敏剂，联合用于治疗所述肿瘤的化疗药物制剂，可以使化疗药物更多的进入到肿瘤细胞，从而达到在一定程度上逆转肿瘤细胞耐药特性，增强杀伤肿瘤细胞的效果。

Description

一种肿瘤化疗药物制剂组合
技术领域
本发明涉及一种肿瘤化疗药物制剂组合，尤其涉及一种包括用于对肿瘤细胞进行增敏的细胞囊泡和化疗药的肿瘤化疗药物制剂组合。
背景技术
目前临床上应用最多的是利用化学药物来消灭肿瘤细胞，然而多数化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时,对正常人体细胞也有较大损伤,产生毒副反应,从而使化疗不能顺利进行,严重影响了疗效，并且多次使用化疗药物可以使肿瘤细胞特别是其中具有细胞干性的这部分肿瘤细胞产生较强的耐药性，进而使化疗药物失去其对肿瘤细胞的杀伤作用，寻找到能够增加肿瘤对化疗药物敏感性的化疗增敏剂,使化疗药物能更大程度的提高疗效并减少毒副反应,降低肿瘤细胞耐药性，是治疗恶性肿瘤急需解决的问题。
恶性肿瘤患者经过多次化疗后，往往会产生多药耐药性。肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种药物具有耐药性的同时，对其他结构不同，作用靶点不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。多药耐药性是导致肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗急需解决的难题之一。肿瘤MDR的产生机制并非单一存在，而是多种机制联合作用的结果：首先，MDR的产生与药物在细胞内的积蓄减少有关，而细胞内药物的外排主要依靠P-gp介导的泵类结构，化疗及相关治疗可激活P-gp的功能，致使细胞内药物积蓄减少，从而产生了肿瘤的MDR。而多药耐药相关基因所合成的MDR转录蛋白，通过多种机制，影响药物在细胞内的分部，降低了药物与肿瘤细胞DNA的亲和性，使药物在细胞内外的浓度梯度和pH梯度改变，促进了药物的外排，从而也产生了肿瘤的多药耐药。同时，谷胱甘肽(GSH)的存在除直接灭活了药物活性外，还可以通过竞争抑制作用保护肿瘤细胞的DNA免受抗癌药物的攻击，进而产生了多药耐药。人体内拓扑异构酶I和II的变异也直接影响了药物与肿瘤细胞DNA的结合，产生耐药。而蛋白激酶C则通过5种不同的机制调节药物在细胞内外的分布，减少细胞内部的药物积 蓄，从而产生了耐药。凋亡基因P53促进了MRP的表达，而产生了肿瘤的多药耐药，bcl-2通过抑制各种细胞因子而避免肿瘤细胞的坏死。CD95则降低了耐药细胞与抗癌药物的亲和性，介导了肿瘤MDR。
如何来抑制肿瘤细胞多药耐药的产生已成为抗肿瘤研究的热点问题。实验证明，许多化合物或药物具有体外逆转MDR的作用，但大多由于毒副作用很大，在临床没有应用价值。所以作为临床应用的MDR逆转剂的药物，至今尚未开发成功。近年来，特异性提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性的增敏剂成为人们寻求逆转MDR机制的新方向。人们期望这类药物本身对人体没有毒副作用，但可以使化疗药物在常规用量甚至低于常规用量的情况，对肿瘤细胞特别是多药耐药性肿瘤细胞产生强效杀伤作用，从而达到控制肿瘤的效果。
发明内容
本发明提供了一种肿瘤化疗药物制剂组合，以源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡制剂作为肿瘤细胞的增敏剂，联合使用用于治疗所述肿瘤的化疗药制剂，可以使化疗药物更多的进入到肿瘤细胞，从而达到在一定程度上逆转肿瘤细胞耐药特性，增强杀伤肿瘤细胞的效果。
本发明提供的一种肿瘤化疗药物制剂组合，其包括用于对肿瘤细胞进行增敏的源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡制剂，和用于治疗所述肿瘤的化疗药制剂。
在本申请的方案中，所述细胞囊泡制剂和化疗药制剂，二者作为整体称作本发明的肿瘤化疗药物制剂组合，该肿瘤化疗药物制剂组合在施用过程中，细胞囊泡制剂用于对肿瘤细胞进行增敏，化疗药制剂用于杀伤经所述细胞囊泡制剂增敏后的肿瘤细胞。
作为本领域的基础知识，细胞是由细胞膜包裹细胞内容物构成，而细胞膜是由磷脂双分子层中间镶嵌蛋白质分子所组成，其球状结构则通过细胞内被称为细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的向心牵拉力得以维持。当细胞受到外来信号(例如：化疗药或紫外线等)刺激发生凋亡时，细胞骨架附着细胞膜部位的部分蛋白纤维丝断裂或失去附着，向心牵拉力突然消失，使得局部细胞膜结构在外向拉力作用下，向外膨胀、突出并包裹细胞内容物以囊泡形式 释放到细胞外的介于细胞和分子之间的亚层次结构中，其大小基本界于100-1000纳米(nm)，即本发明所述的“细胞囊泡(microparticles,简称Mps或Mp)”。
本发明的具体方案中，使用紫外线诱导肿瘤细胞凋亡，对于细胞囊泡的收集可使用超速离心机在低温条件下或室温条件下进行分离。可也以采用过滤方法收集细胞囊泡。通过离心机收集细胞囊泡的条件，例如，在低温条件下(4℃左右)，以100-100000g的离心力收集细胞囊泡。进一步的，可以在小于14000g的离心力下去除细胞及碎片，将获得的上清液在14000g离心1小时，收集获得的沉淀即为细胞囊泡。通过过滤方法收集细胞囊泡的条件，例如：将凋亡肿瘤细胞液以1×109/L的浓度过滤，滤膜材质为聚丙烯，滤膜孔径为10微米。将过滤后得到的上清液以14000g的离心力离心1小时，收集获得的沉淀即为细胞囊泡。对于所收集到的细胞囊泡，可以按照常规方法制成细胞囊泡制剂，尤其是注射制剂，例如，将收集到的细胞囊泡用生理盐水悬浮后制成注射液。
本发明所述诱导肿瘤细胞凋亡，可以按照本领域技术人员公知的判断标准，例如观察肿瘤细胞缩小、变暗，即可认为其已经凋亡。
在本发明提供的方案中，在使所述肿瘤细胞凋亡之前还包括对肿瘤细胞进行培养。所述肿瘤细胞包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌或直肠癌的细胞。上述细胞的培养方法可采用本领域常规的培养方法进行培养。
在本发明的一个具体实施方式中，所述肿瘤化疗药物制剂组合中所包含的化疗药制剂为含有治疗提供所述细胞囊泡的肿瘤的有效成分的化疗药。所包含的化疗药也可以是已经在临床上使用的药物，可以是注射制剂，或口服制剂，例如片剂、粉剂、颗粒剂等。例如所述化疗药可以是治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌或直肠癌的化疗药中的一种或多种。
本发明的所述肿瘤化疗药物制剂组合中的细胞囊泡制剂和化疗药制剂均可以为单位制剂。所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，如一单位(针)针剂等。患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。例如，在制备药物 的过程中，一般认为成人体重为50-70kg，可以最初可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如，可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见，也可参考(黄继汉等，“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，《中国临床药理学与治疗学》,2004Sep；9(9):1069-1072)来确定。在本发明的实施方式中，可以使用按照人和小鼠的体表面积折算系数0.0026来换算人和小鼠的剂量。
更进一步的，根据申请人针对小鼠的实验，针对人的细胞囊泡单位制剂中可以包括5×107-10×107个细胞囊泡，所述化疗药单位制剂可以包含10-500mg化疗药。
进一步的，所述化疗药为盐酸多柔比星、甲氨蝶呤、顺铂、5-氟尿嘧啶、或羟喜树碱。
更进一步的，所述化疗药单位制剂中含有盐酸多柔比星的量可以为10-50mg。
进一步的，所述化疗药单位制剂中含有顺铂的量可以为20-60mg。
进一步的，所述化疗药单位制剂中含有甲氨蝶呤的量可以为10-50mg。
进一步的，所述化疗药单位制剂中含有5-氟尿嘧啶的量可以为0.1-0.5g。
进一步的，所述化疗药单位制剂中含有羟喜树碱的量可以为10-30mg。
本发明提供的肿瘤化疗药物制剂组合的给药方式为：先对肿瘤细胞施用细胞囊泡单位制剂进行增敏，然后对经所述细胞囊泡增敏后的肿瘤细胞施用化疗药单位制剂。
本发明还提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，包括患有肿瘤的个体或具有肿瘤发生趋势的个体施用肿瘤化疗药物制剂组合的过程。具体过程为先对肿瘤细胞施用源自凋亡的所述肿瘤细胞的细胞囊泡制剂进行增敏，然后对经所述细胞囊泡制剂增敏后的肿瘤细胞施用化疗药制剂，并且细胞囊泡与肿瘤细胞的数量比例为1：3-5。
根据本发明的方案，可以根据需要控制肿瘤化疗药物制剂组合中的化疗药的量，方便对不同阶段的肿瘤患者的给药。所述化疗药的量可以根据所选择的药物的性质、提供细胞囊泡的肿瘤种类，以及所要治疗的肿瘤患者的患病阶段，通过适当摸索而确定。
本申请人在之前的研究中发现，单独的细胞囊泡对肿瘤细胞没有杀伤作 用，只有在细胞囊泡包裹化疗药形成微颗粒之后才具有对肿瘤细胞的杀伤作用，以及通过“连锁反应”，即包裹了化疗药的微颗粒杀伤了先进入的肿瘤细胞后，被杀伤而凋亡的肿瘤细胞继续形成新的囊泡而包裹化疗药，对其他肿瘤细胞进行持续给药直至药效全部发挥，来减少化疗药的使用剂量。
然而上述研究关注的是如何减少化疗药使用量的问题，并没有就如何解决化疗药施用过程中出现的肿瘤细胞的多药耐药性研究。而且以上研究中强调的是同时对肿瘤细胞施用细胞囊泡与化疗药，并且细胞囊泡要包裹化疗药才能实现对肿瘤细胞的杀伤。
而在本申请的方案中，申请人针对现有技术中存在的耐药性的问题，出乎意料的发现，先将细胞囊泡以特定剂量施用给肿瘤细胞，细胞囊泡能发挥类似于增敏剂的作用，再对肿瘤细胞施用特定剂量的化疗药，能实现肿瘤细胞摄取更多的化疗药物，同时在一定程度上逆转肿瘤细胞耐药特性，增强杀伤肿瘤细胞的效果。
本发明方案具有以下效果：
1、本发明的肿瘤化疗药物制剂组合，联合使用源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡制剂，以及用于治疗所述肿瘤的化疗药物制剂，可以使化疗药物更多的进入到肿瘤细胞，从而达到在一定程度上逆转肿瘤细胞耐药特性，增强杀伤肿瘤细胞的效果。
2、通过对患者施用所述肿瘤化疗药物制剂组合在实现对肿瘤细胞的有效杀伤的同时降低治疗过程对机体的毒副作用。
3、肿瘤细胞具有无限增殖的特性，培养方法成熟，根据本发明记载的方案可从肿瘤细胞获得大量的细胞囊泡，进而获得本发明的肿瘤化疗药物制剂组合，成本小，操作简单。
附图说明
图1：显示了电镜下观察到的肿瘤细胞经过凋亡处理后产生的细胞囊泡的图。
图2：本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对人乳腺癌细胞外排多柔比星药物情况的影响。
图3：本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对MCF-7、MCF-7/TRC和 ADR/MCF-7三种细胞摄取多柔比星药物的影响。
图4A-4B：本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对多药耐药蛋白P-gp表达的影响。
图5：本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对多种肿瘤细胞具有杀伤作用。
图6：本发明的肿瘤化疗药物制剂组合体内对肺癌肿瘤细胞的杀伤作用。
图7A-7B：本发明的肿瘤化疗药物制剂组合体内对膀胱癌肿瘤细胞的杀伤作用。
具体实施方式
下述实施例中使用的各种肿瘤细胞、药物及实验动物：
小鼠肝癌细胞系H22(BALB/c遗传背景)、小鼠肺癌细胞系Lewis(C57BL/6遗传背景)、小鼠结肠癌细胞系CT-26、人乳腺癌细胞系MCF-7、人乳腺癌阿霉素耐药株(人乳腺癌盐酸多柔比星耐药株)ADR/MCF-7、人肺癌细胞系A549，人卵巢癌细胞系A2780，人肝癌细胞系HepG2，人胃癌细胞系AGS,人直肠癌细胞系SW1116，小鼠膀胱癌细胞系MB49，均可从中国典型物保藏中心CCTCC购买。
C57BL/6小鼠，BALB/c小鼠，购自武汉大学医学实验动物中心，周龄在5-6周，体重16克左右。
实施例1细胞囊泡的制备
1)实验材料和试剂
H22小鼠肝癌细胞为商购获得，紫外线装置为常规生物安全柜所有，透射电镜为JEM1010(JEOL,日本)，滤膜品牌为PALL(Part No:J100047050)。
2)实验步骤
在RPMI-1640细胞培养液中培养H22小鼠肝癌细胞，使细胞量达到2×107/ml；将H22小鼠肝癌细胞进行紫外线照射60分钟；
在紫外线照射后的18小时，显微镜下观察H22小鼠肝癌细胞出现凋亡现象。通过离心收集上述凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡，包括：先以1300rpm和5000rpm转速各离心10分钟，之后以14000g的离心力离心1分钟，以除去细胞及碎片，取离心后的上清再以14000g的离心力离心1小时，收集获得 的沉淀得到来自H22小鼠肝癌细胞凋亡所产生的囊泡。或者，将凋亡肿瘤细胞液以1×109/L的浓度过滤，滤膜的孔径为10微米，将过滤后得到的上清液以14000g的离心力离心1小时，收集获得的沉淀即为细胞囊泡。过滤法与离心法相比，能够获得更多数量的囊泡及更高的纯度。
3)实验结果
将收集到的细胞囊泡使用1ml的0.9％(g/ml)的生理盐水进行重悬后在透射电镜JEM1010下观察，从图1可以看出，细胞囊泡的粒径范围大多数是在100-1000nm之间，成囊腔状。
实施例2本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对人乳腺癌细胞对多柔比星药物的外排情况的影响。
1)实验材料和试剂
人乳腺癌细胞系MCF-7，盐酸多柔比星药物为商购获得，紫外线装置为常规生物安全柜所有，双光子共聚焦显微镜。
2)实验步骤
在RPMI Medium1640细胞培养液中培养人乳腺癌细胞系MCF-7，使细胞量达到2×107/ml；将人乳腺癌细胞系MCF-7进行紫外线照射60分钟；在紫外线照射后的18小时，显微镜下观察人乳腺癌细胞系MCF-7出现凋亡现象；离心或过滤收集上述凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡，方法同实施例1；
将正常培养的1×105个人乳腺癌细胞MCF-7种在共聚焦皿中，再将以上制备的人乳腺癌细胞系MCF-7来源的细胞囊泡5×105个加入到该共聚焦皿中，与MCF-7共孵育12小时，作为实验组(即MCF-7细胞+MPs)；将未添加细胞囊泡的1×105个人乳腺癌细胞MCF-7作为对照组(即MCF-7细胞)。
将实验组和对照组的细胞分别用PBS洗一次，再加入含有多柔比星药物的培养基，该培养基中含有1μg/ml的多柔比星药物，4小时后4％多聚甲醛固定20分钟，双光子共聚焦显微镜下观察实验组及对照组人乳腺癌细胞MCF-7对多柔比星药物的外排情况。
3)实验结果
图2显示了实验组及对照组MCF-7人乳腺癌细胞对多柔比星药物的外排情况的观察结果。未与细胞囊泡共孵育的对照组MCF-7人乳腺癌细胞将大量 药物排出到细胞膜外，细胞核内药物含量不高；与细胞囊泡共孵育过的实验组MCF-7人乳腺癌细胞外排的药物很少，药物大量聚集在细胞核内。
实施例3本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对MCF-7、MCF-7/TRC和ADR/MCF-7三种细胞摄取盐酸多柔比星药物的影响
1)实验材料和试剂
人乳腺癌细胞系MCF-7，具有耐药性的肿瘤再生细胞MCF-7/TRC(tumour-repopulating cancer cell)，人乳腺癌盐酸多柔比星耐药株ADR/MCF-7，培养用的三维纤维蛋白胶，盐酸多柔比星药物，溶酶体膜蛋白lamp-2抗体，FITC荧光二抗，细胞核染料DAPI为商购获得，紫外线装置为常规生物安全柜所有，双光子共聚焦显微镜。
2)实验步骤
按照实施例2方法获得人乳腺癌细胞系MCF-7来源的细胞囊泡；
将5000个MCF-7人乳腺癌细胞种在三维纤维蛋白胶中，培养5天形成干细胞样克隆团，这些细胞被称为肿瘤再生细胞，即MCF-7/TRC。MCF-7/TRC具有肿瘤干细胞特性，对多种疗药物(如顺铂，甲氨蝶呤，5-FU，盐酸多柔比星等)有耐药性。
将1×105个人乳腺癌细胞MCF-7，肿瘤再生细胞MCF-7/TRC，人乳腺癌盐酸多柔比星耐药细胞ADR/MCF-7分别种在共聚焦皿中，将制备的人乳腺癌细胞系MCF-7来源的细胞囊泡分别加入到含有上述三种细胞的培养皿中，数量为5×105个/皿，孵育12小时，作为实验组；
将未添加细胞囊泡的人乳腺癌细胞MCF-7，肿瘤再生细胞MCF-7/TRC，人乳腺癌盐酸多柔比星耐药株ADR/MCF-7作为对照组。
将实验组和对照组的MCF-7、MCF-7/TRC和ADR/MCF-7细胞分别PBS洗一次，再加入盐酸多柔比星药物的培养基，该培养基中含有1μg/ml盐酸多柔比星药物，4小时后4％多聚甲醛固定30分钟，免疫荧光染色lamp-2和DAPI，双光子共聚焦显微镜下观察实验组MCF-7，MCF-TRC和ADR/MCF-7细胞(即MCF-7，MCF-7TRCs，ADR/MCF-7)及对照组MCF-7，MCF-TRC和ADR/MCF-7细胞(即MCF-7+MPs，TRC+MPs，ADR/MCF-7+MPs)对多柔比星药物的摄取情况。
3)实验结果
图3显示了实验组及对照组MCF-7、MCF-7/TRC和ADR/MCF-7对多柔比星药物的摄取情况。图3中LAMP-2指的是用溶酶体相关膜蛋白2抗体标记后的细胞照片，Doxo指的施用盐酸多柔比星后的细胞照片，DAPI指的是用DNA染色的细胞核染色试剂染色后的细胞照片，共聚焦(confocal)指的是将以上三个图重叠之后的图片。可以看出，镜下观察对照组MCF-7细胞，细胞核内药物含量不高；而与细胞囊泡共孵育过的实验组MCF-7细胞核内多柔比星含量明显增加。镜下观察对照组MCF-7/TRC和ADR/MCF-7细胞核内药物含量比MCF-7核内更少，而与细胞囊泡共孵育过的实验组MCF-7/TRC和ADR/MCF-7细胞核内药物含量明显增加。此结果说明经细胞囊泡处理可以提高耐药性的肿瘤再生细胞MCF-7/TRC和盐酸多柔比星耐药株ADR/MCF-7对药物的摄取。
实施例4本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对多药耐药蛋白P-gp表达的影响
实验材料和试剂
人乳腺癌细胞系MCF-7，人乳腺癌盐酸多柔比星耐药株ADR/MCF-7，人P-gp抗体均可商购获得，P-gprealtime PCR引物通过上海生工公司合成。
1)实验步骤
按照实施例2方法获得人乳腺癌细胞系MCF-7来源的细胞囊泡；
将1×107个肿瘤细胞来源的细胞囊泡加入到含有2×106个ADR/MCF-7培养皿中，孵育12小时，作为实验组；将未添加细胞囊泡的MCF-7和ADR/MCF-7细胞作为对照组。
收集对照组ADR/MCF-7细胞(即ADR/MCF-7细胞)、实验组ADR/MCF-7细胞(即ADR/MCF-7细胞+Mps)、以及对照组的MCF-7细胞(即MCF-7细胞)。
将三组细胞分别提取RNA后再经反转录获得cDNA，realtime PCR方法检测三组细胞P-gp的表达情况。
引物序列为：F：CCATCATTGCAATAGCAGGA
R：TTCAGTAGCGATCTTCCCAG
PCR条件为：95℃3分钟预变性，然后按95℃15秒，60℃30秒，共40个循环。
定量方法：Sybr green(荧光染料掺入法)，结果见图4A。
另将同样处理的三组细胞制备western blot蛋白样品，western blot方法检测三组细胞P-gp蛋白表达情况，结果见图4B。
2)实验结果
从图4A-4B可以看出，无论是基因水平还是蛋白水平，经细胞囊泡处理的实验组ADR/MCF-7细胞的多药耐药蛋白P-gp的表达水平均低于对照组ADR/MCF-7细胞。对照组的MCF-7细胞本身低表达P-gp。
实施例5本发明的肿瘤化疗药物制剂组合体外对肿瘤细胞的杀伤作用
1)实验材料和试剂
小鼠肝癌细胞系H22(BALB/c遗传背景)、小鼠肺癌细胞系Lewis(C57BL/6遗传背景)、小鼠结肠癌细胞系CT-26、人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺癌细胞系A549、人卵巢癌细胞系A2780、人肝癌细胞系HepG2、人胃癌细胞系AGS和人直肠癌细胞系SW1116；化疗药物为顺铂(Cisplatin，CDDP)、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)、盐酸多柔比星(Doxorubicin，Dox)均可商购获得。
2)实验步骤
在RPMI Medium1640细胞培养液中分别培养上述各种肿瘤细胞；将各种肿瘤细胞分别种在24孔板中，5×104个/孔。按照实施例1所述方法制备各肿瘤细胞来源的细胞囊泡，将获得的细胞囊泡加入到与提供所述细胞囊泡的肿瘤细胞相同种类的肿瘤细胞中，囊泡与肿瘤细胞的比例为1：5，孵育12小时，作为实验组；将未添加细胞囊泡的5×104个/孔的各种肿瘤细胞作为对照组；
将实验组和对照组的细胞分别PBS洗一次，再分别加入含有各种不同浓度化疗药物的培养基:1μg/ml的CDDP、0.5μg/ml的MTX、5μg/ml的5-Fu、1μg/ml的Dox培养基。
24小时或36小时后通过染色AnnexinV和PI检测各组肿瘤细胞的凋亡情况。
3)实验结果
图5显示了本发明的肿瘤化疗药物制剂组合对照组和实验组(H22、Lewis、CT-26、MCF-7、A549、A2780、HepG2、AGS、SW1116)杀伤作用。与化疗药物直接杀伤肿瘤细胞的对照组相比，经细胞囊泡处理的实验组肿瘤细胞凋亡率更高，说明本发明的肿瘤化疗药物制剂组合可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从而杀伤更多的肿瘤细胞。
实施例6本发明的肿瘤化疗药物制剂组合体内对肺癌肿瘤细胞的杀伤作用
1)实验材料和试剂
C57BL/6小鼠，雌性，5-6周龄；小鼠肺癌细胞系Lewis(C57BL/6遗传背景)；甲氨蝶呤(MTX)均可商购获得。
2)实验步骤：
在DMEM细胞培养液中培养上述小鼠肺癌细胞系Lewis，将Lewis细胞用PBS稀释成细胞悬液，计数并稀释1×106个/300ul，对30只C57小鼠尾静脉注射300ul细胞悬液，48h后进行分组给药；
将这些肺部成瘤的小鼠随机分成三组，空白组即对照组，药物组和囊泡组：
对照组每48h注射生理盐水，共10次；
药物组(即MTX)每48h注射10ug甲氨蝶呤，共5次；
囊泡组(即MPs+MTX)24h时注射2×106个细胞囊泡，48h时注射10ug甲氨蝶呤，共10次,其中，所述细胞囊泡按照实施例1所述方法制备和收集，收集后细胞囊泡沉淀用0.9％(g/ml)生理盐水悬浮后制成注射液。
给药结束后第三天杀小鼠，取肺观察。
3)实验结果
图6显示了利用小鼠肺癌细胞Lewis构建肺部成瘤，经MTX和MPs+MTX两种不同方式治疗后肺部成瘤情况。先用MPs处理24小时后再注射MTX明显好于单独用MTX的治疗效果。
实施例7本发明的肿瘤化疗药物制剂组合体内对膀胱癌肿瘤细胞的杀伤作用
1)实验材料和试剂
小鼠膀胱癌细胞系MB49，多聚赖氨酸，盐酸多柔比星(Dox)，羟喜树碱(HCPT)，6～8周龄雌性C57小鼠均可商购获得。
实验步骤：
小鼠原位膀胱癌模型建立：
小鼠膀胱癌细胞采用10％FBS 1640基础培养基培养至对数培养期，采用胰酶消化后用PBS重悬成107个/mL的细胞悬液。将C57小鼠麻醉后采用静脉留置针往小鼠膀胱内灌注入100uL 0.1mg/mL多聚赖氨酸溶液预处理20min，之后将多聚赖氨酸溶液排出后，往膀胱内灌注入100uL细胞悬液，并且保持1h后排出。
包裹有化疗药的细胞囊泡的制备：对1ml的1×107小鼠膀胱癌细胞施用100uL化疗药(Dox或HCPT)(1mg/mL)；在施用化疗药后的48小时，先以1300rpm和5000rpm转速各离心10分钟，之后以14000g的离心力离心1分钟，以除去细胞及碎片，取离心后的上清再以14000g的离心力离心1小时，收集获得的沉淀得到包裹有化疗药的细胞囊泡。收集后细胞囊泡沉淀用0.9％(g/ml)生理盐水悬浮后制成注射液。
细胞囊泡的制备：按照实施例1所述方法制备和收集，收集后细胞囊泡沉淀用0.9％(g/ml)生理盐水悬浮后制成注射液。
药物试验1：
小鼠分组，每组8只。对照组(Ctr)：是指接种膀胱癌细胞但未进行治疗的小鼠；Dox组：只施用盐酸多柔比星药物的组；Dox-Mps组：为包裹了盐酸多柔比星药物的MPs；Mps+Dox组：先用MPs处理再用盐酸多柔比星处理；正常组：指的是正常小鼠组。
在第0天，将除了正常组以外的其他组的小鼠接种肿瘤细胞并按照上述方法构建小鼠原位膀胱癌模型。
第2天Mps+Dox组每只膀胱癌小鼠膀胱灌注106个细胞囊泡，并保持一 个小时后排出。Dox组小鼠在第2天不灌注细胞囊泡。Dox-Mps组在第2天膀胱灌注106个包裹有化疗药的细胞囊泡。
在第3天对Dox组和Mps+Dox组膀胱灌注100uL盐酸多柔比星溶液(1mg/mL)，并保持一小时后排出。Dox-Mps组不做处理。
第4和5天重复第2,3天步骤。
在第12天，将小鼠处死，并收取膀胱结果分析。
对照组整个过程只给生理盐水。
药物试验2：分组和实验过程同药物试验1，除了将药物换成100uL羟喜树碱(HCPT)(1mg/mL)。
2)实验结果
由图7A和7B可以看出，对小鼠施用包裹有化疗药物的MPs治疗效果和只施用Dox或HCPT无明显差异，但两者都不如经细胞囊泡处理后再施用Dox或HCPT的治疗效果，因为包裹有化疗药的细胞囊泡的治疗效果受限于包裹进细胞囊泡的化疗药浓度，对于需要高浓度才具有杀伤效果的药物来说，如果要提高杀伤效果，必须通过增加细胞囊泡数量来达到目的，这样治疗的成本会大幅度增高，过高的细胞囊泡数量也会增加对人体的副作用，出于降低治疗成本、降低细胞囊泡对人体的副作用的目的，在给小鼠施用等数量细胞囊泡的情况下，本发明的先通过细胞囊泡致敏再给化疗药的方案能获得更好的效果。

Claims (8)

1.一种肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，包括用于对肿瘤细胞进行增敏的源自凋亡肿瘤细胞的细胞囊泡制剂，和用于治疗所述肿瘤的化疗药制剂。
2.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，所述化疗药制剂包括治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌或直肠癌的化疗药中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，由所述细胞囊泡的粒度为100～1000纳米。
4.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，所述肿瘤化疗药物制剂组合中的细胞囊泡制剂和化疗药制剂均为单位制剂。
5.根据权利要求4所述的肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，所述细胞囊泡单位制剂中包括5×107-10×107个细胞囊泡，所述化疗药单位制剂中含有10-500mg化疗药。
6.根据权利要求1所述的肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，所述细胞囊泡通过以下步骤获得：使用紫外线照射肿瘤细胞，使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡。
7.根据权利要求6所述的肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，在使肿瘤细胞凋亡之前还包括对肿瘤细胞进行培养。
8.根据权利要求6所述的肿瘤化疗药物制剂组合，其特征在于，收集细胞囊泡的方法为通过离心机收集细胞囊泡，或通过过滤收集细胞囊泡。
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