CN111067868B - 一种载药囊泡 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种载药囊泡，包含肿瘤细胞来源的囊泡和包裹于所述囊泡中的治疗药，其中所述肿瘤细胞来源的囊泡为凋亡的肿瘤细胞释放的囊泡且囊泡中包裹大量尿苷二磷酸葡萄糖，所述治疗药为作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药。本发明的载药囊泡获得了更加稳定高效的杀肿瘤效果，能更好的由于肿瘤疾病的治疗。

Description

一种载药囊泡
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种载药囊泡，其制备方法和应用。
背景技术
细胞是由细胞膜包裹细胞内容物构成，其球状结构通过细胞内被称为细胞骨架的蛋白纤维丝所形成的向心牵拉力得以维持。在受到外源性或内源性刺激之后，细胞骨架会重排，导致细胞膜局部受力不均匀，细胞质内的物质被细胞膜包裹以囊泡的形式释放到细胞外部。这种直径为0.1-1μm的特殊亚细胞结构称为细胞囊泡。
中性粒细胞是白细胞中数目最多的免疫细胞，占循环白细胞的50％-70％，是免疫系统的第一道防线。通过激活并募集机体的免疫细胞来进行恶性肿瘤的治疗是广大科研工作者致力于研究的课题。
尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)是已知的具有中性粒细胞趋化活性的一种糖代谢中间产物。已有研究表明，包裹化疗药物的囊泡可通过UDPG途径募集中性粒细胞，赋予中性粒细胞抗肿瘤特性，并且载药囊泡募集中性粒细胞的能力与囊泡内UDPG含量呈正相关性。葡萄糖磷酸变位酶1(phosphoglucomutase 1,PGM1)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UDP-glucose pyrophosphorylase 2,UGPase2)是细胞合成UDPG过程中的关键酶，PGM1催化葡萄糖-6-磷酸向葡萄糖-1-磷酸转化，UGPase2催化UTP和葡萄糖-1-磷酸生成UDPG和焦磷酸。利用基因工程技术提高细胞内PGM1和UGPase2表达水平能促进细胞UDPG的生成，从而提高细胞分泌的囊泡内UDPG含量，进而载药囊泡募集中性粒细胞的能力得到提高，抗肿瘤活性得到加强。
包裹化疗药物的囊泡不仅可以直接杀伤肿瘤细胞，还可通过募集中性粒细胞至肿瘤细胞周围，诱发中性粒细胞抗肿瘤。由于载药囊泡对中性粒细胞的趋化能力和囊泡所包裹的UDPG含量正相关，产囊泡的细胞内UDPG含量就显得至关重要。
UDPG是细胞糖代谢的中间产物，其浓度不仅和细胞种类有关，还和细胞所处的状态，细胞内部糖代谢相关酶系的活性有关。细胞内UDPG含量往往较低，限制了载药囊泡对中性粒细胞的趋化作用。
发明内容
本发明的目的是通过基因工程技术获得中性粒细胞趋化能力增强的载药囊泡，该载药囊泡用于肿瘤疾病的治疗，能募集大量中性粒细胞到肿瘤周围杀伤肿瘤细胞，获得更好的治疗效果。
本发明提供了一种加强肿瘤细胞来源的载药囊泡对中性粒细胞的趋化效应的方法，并将基因改造的肿瘤细胞制备的载药囊泡用于肿瘤疾病的治疗。具体而言，该方法通过向肿瘤细胞转入葡萄糖磷酸变位酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因，促进肿瘤细胞内尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的合成。合成的UDPG在细胞质内富集，由该基因改造的肿瘤细胞制备载药囊泡，则载药囊泡能包裹大量UDPG。而UDPG是已知的具有中性粒细胞趋化活性的小分子化合物，当载药囊泡携带UDPG到达肿瘤细胞并释放UDPG,则会在肿瘤细胞周围募集大量中性粒细胞。载药囊泡携带的甲氨蝶呤等化疗药物对肿瘤细胞的杀伤与中性粒细胞对肿瘤的杀伤起协同作用，共同杀伤肿瘤细胞。
根据本发明的一方面，提供一种载药囊泡，包含肿瘤细胞来源的囊泡和包裹于所述囊泡中的治疗药，其中所述肿瘤细胞来源的囊泡为凋亡的肿瘤细胞释放的囊泡且囊泡中包裹大量尿苷二磷酸葡萄糖，所述治疗药为作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药。
本发明所述的载药囊泡，其中所述肿瘤细胞来源的囊泡通过下述方法制备：
1)通过向肿瘤细胞转入葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，促进肿瘤细胞内合成尿苷二磷酸葡萄糖，合成的尿苷二磷酸葡萄糖在细胞质内富集，获得含有大量尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞；
2)诱导所述含有大量尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞凋亡，并将肿瘤治疗药包裹于凋亡的囊泡中，制备所述肿瘤细胞来源的囊泡。
本发明所述的载药囊泡，作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药可以是任何被临床使用的对治疗肿瘤有效的药物，包括但不限于各种化疗剂、生物制剂、某些中药制剂等。在本发明的一个优选实施方案中，其中所述的肿瘤治疗药为化疗药。
所述化疗药根据治疗的需要，可以为本发明申请日以前和\或以后被临床应用的化疗药，也可以是本发明申请日以前和\或以后被临床应用的化疗药中的有效成分(可以不含有或不完全含有药物辅料)，即，制备本发明的药物时，可以使用治疗肿瘤的临床用药组成中的有效成分，也可以直接使用已经临床应用于肿瘤治疗的各种商购药。所以，本发明中所涉及的药物剂量，均应理解为该药物的有效成分量。具体化疗药可以是临床上用于治疗各类肿瘤的化疗药，如：肺癌、白血病、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌或胶质瘤等的化疗药，可以是单一化疗药或多种化疗药联合。选自治疗肺癌、结肠癌、卵巢癌、白血病、胃癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和胶质瘤肿瘤的化疗药中的一种或几种。
更具体地，所述化疗药选自甲氨蝶呤、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、多柔吡星、吡柔比星、紫衫醇、羟基喜树碱、长春新碱、安西他滨、卡铂和顺铂。
更优选的是，所述的化疗药为甲氨蝶呤。
本发明所述的载药囊泡，其中制备所述肿瘤细胞来源的囊泡的方法中，所述步骤2)包括：
2a)向步骤1)获得的获得含有大量尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞施用作为有效成分的化疗药使之凋亡，收集凋亡的肿瘤细胞所释放的包药囊泡，获得所述载药囊泡；或者
2b)使用紫外线照射步骤1)获得的含有大量尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞，促进肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的肿瘤治疗药进行孵育，使所述肿瘤治疗药被细胞囊泡包裹，获得所述载药囊泡；或者
2c)使用紫外线照射步骤1)获得的含有大量尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞后立即加入作为有效成分的化疗药物，促使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的包药囊泡，获得所述载药囊泡。
根据本发明的另一方面，提供一种制备中性粒细胞趋化能力增强的载药囊泡的方法，包括下述步骤：
i)通过向肿瘤细胞转入葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，促进肿瘤细胞内尿苷二磷酸葡萄糖的合成，合成的尿苷二磷酸葡萄糖在细胞质内富集，获得含有大量尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞；
ii)诱导所述含有大量尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞凋亡，并将肿瘤治疗药包裹于凋亡的囊泡中，制备中性粒细胞趋化能力增强的载药囊泡。
在上述方法中，其中所述步骤i)包括：
ia)根据葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因序列设计引物，以反转录得到的cDNA为模板，分别通过PCR扩增所述葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，构建重组质粒；
ib)用所述重组质粒转染肿瘤细胞。
本发明也提供所述的载药囊泡在制备治疗肿瘤药物中的用途。可以将本发明的载药囊泡单独或添加药学上或生理学上可接受的各种辅料和/或载体制备成药物组合物和其他形式的药物制剂，用于制备治疗肿瘤的药物。
有益效果：本发明通过向肿瘤细胞转染PGM1及UGPase2基因，使肿瘤细胞能稳定高效的合成UDPG。由这些肿瘤细胞制备的载药囊泡募集中性粒细胞的能力得到加强，载药囊泡获得了更加稳定高效的杀肿瘤效果，能更好的由于肿瘤疾病的治疗。
附图说明
图1.不同细胞内UDPG含量
图2.反转录PCR扩增PGM1和UGPase2基因
泳道1：DL2000 DNA ladder maker,泳道2：PGM1基因PCR扩增产物，泳道3：UGPase2基因PCR扩增产物。
图3.瞬时转染PGM1和UGPase2基因后细胞及囊泡内UDPG含量变化
图4.PGM1-UGPase2/H22细胞囊泡体外趋化中性粒细胞
图5.PGM1-UGPase2/H22细胞囊泡体外杀伤H22肿瘤细胞
图6.H22肝癌小鼠生存期试验
图7.PGM1-UGPase2/A549细胞株及其囊泡UDPG含量
图8.PGM1-UGPase2/A549细胞囊泡趋化中性粒细胞
图9.PGM1-UGPase2/A549细胞甲氨蝶呤囊泡体外杀伤A549肿瘤细胞
具体实施方式
材料来源
肿瘤细胞：小鼠肝癌细胞H22、人卵巢癌细胞A2780、人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺癌细胞系A549、人胃癌细胞系SNU1、人肝癌细胞系HepG2、人膀胱癌细胞系T24、人胶质瘤细胞系U251、人白血病细胞系K562、人结肠癌Caco2、以及人早幼粒急性白血病细胞HL60均可从美国ATCC或中国典型物保藏中心CCTCC购买。
质粒：pcDNA3.1/Hygromycin(+)和pcDNA3.3-TOPO均购自ThermoFisher公司。
药物：注射用氨甲喋呤购自江苏恒瑞医药，批号：170113AG.
实验动物：BALB/c小鼠24只，购自武汉大学医学实验动物中心。
实施例1构建重组质粒
1、实验材料和仪器
人卵巢癌细胞A2780等肿瘤细胞均购自ATCC或CCTCC；pcDNA3.1/Hygromycin(+)和pcDNA3.3-TOPO质粒均购自ThermoFisher公司；Trizol总RNA提取试剂、BeyoRTⅢcDNA第一链合成试剂盒：购自碧云天生物；Trans5αChemically Competent Cell、TransStartFastPfu DNA Polymerase：购自北京全式金生物；GenBuilder Cloning kit：购自南京金斯瑞生物；限制性内切酶NheI和NotI：均购自NEB公司；无内毒素质粒小提试剂盒：购自天根生物；UDPG：购自Merck公司；高效液相色谱仪：Thermo公司，Ultimate3000型；PCR仪：BIOER公司，LifeTouch型。
2、实验步骤
(1)HPLC法检测细胞内UDPG含量：
流动相：0.125M KH2PO4-乙腈(60：40)，用磷酸调节pH值至3.60。
固定相：Thermo Hypersil GOLD Amino 250*4.6mm,5μm色谱柱。
仪器方法：泵流速：1mL/min；检测波长：262nm；柱温：30℃；进样量：20μL；
样品前处理：细胞/囊泡浓悬液加入三倍体积的甲醇，涡旋振荡20s，超声波碎2min，室温静置10min，10000g离心10min，取上清溶液过滤后作为检测样品。
(2)设计并合成PCR引物：根据NCBI网站上PGM1(GenBank:M83088.1)和UGPase2(GenBank:BC000173.2)基因序列设计引物如下，引物委托擎科生物进行合成。
Pgm1f:actatagggagacccaagctgggccgccaccatggtgaagatcgtgacag(SEQ ID NO.1)
Pgm1r:acgggccctctagactcgagcttaggtgatgacagtgggtgc(SEQ ID NO.2)
Ugp2f:ctatagggagacccaagctgggccgccaccatgtcgagatttgtacaag(SEQ ID NO.3)
Ugp2r:acgggccctctagactcgagcttagtggtccaagatgcgaag(SEQ ID NO.4)
(3)扩增目的基因：用Trizol总RNA提取试剂盒提取肿瘤细胞的RNA，以提取的RNA为模板，加入反转录试剂盒自带的Oligo(dT)18和M-MLV反转录酶混匀进行反转录，42℃孵育60min，之后80℃孵育10min结束反应，获得cDNA。以反转录得到的cDNA为模板，加入dNTP和TransStart FastPfu DNA Polymerase混匀配制PCR反应体系，PCR扩增获得目的基因。
(4)基因重组获得重组质粒：质粒pcDNA3.1/Hygromycin(+)和pcDNA3.3-TOPO用限制性内切酶NheI和NotI进行双酶切。酶切后的载体分别与PCR产物混匀，加入GenBuilderCloning kit自带的重组酶，于50℃水浴15min进行重组。分别将重组液以热激法转化Trans5α感受态细胞，涂布氨苄抗性的LB培养皿。16-24h后挑取单克隆，单克隆转移到氨苄抗性的LB液体培养基进行过夜培养，分别用质粒提取试剂盒抽提质粒，即得到重组质粒PGM/pcDNA3.1和UGPase/pcDNA3.3。
3、实验结果
通过HPLC检测发现，HL60细胞内UDPG含量较高(图1)，故可以其PGM1和UGPase2基因作为PCR模板。提取其RNA，反转录PCR扩增出PGM1和UGPase2基因(图2)，构建重组质粒PGM/pcDNA3.1和UGPase/pcDNA3.3。
PCR扩增获得的PGM1基因序列：
atggtgaagatcgtgacagttaagacccaggcgtaccaggaccagaagccgggcacgagcgggctgcggaagcgggtgaaggtgttccagagcagcgccaactacgcggagaacttcatccagagtatcatctccaccgtggagccggcgcagcggcaggaggccacgctggtggtgggcggggacggccggttctacatgaaggaggccatccagctcatcgctcgcatcgctgccgccaacgggatcggtcgcttggttatcggacagaatggaatcctctccacccctgctgtatcctgcatcattagaaaaatcaaagccattggtgggatcattctgacagccagtcacaacccagggggccccaatggagattttggaatcaaattcaatatttctaatggaggtcctgctccagaagcaataactgataaaattttccaaatcagcaagacaattgaagaatatgcagtttgccctgacctgaaagtagaccttggtgttctgggaaagcagcagtttgacttggaaaataagttcaaacccttcacagtggaaattgtggattcggtagaagcttatgctacaatgctgagaagcatctttgatttcagtgcactgaaagaactactttctgggccaaaccgactgaagatctgtattgatgctatgcatggagttgtgggaccgtatgtaaagaagatcctctgtgaagaactcggtgcccctgcgaactcggcagttaactgcgttcctctggaggactttggaggccaccaccctgaccccaacctcacctatgcagctgacctggtggagaccatgaagtcaggagagcatgattttggggctgcctttgatggagatggggatcgaaacatgattctgggcaagcatgggttctttgtgaacccttcagactctgtggctgtcattgctgccaacatcttcagcattccgtatttccagcagactggggtccgcggctttgcacggagcatgcccacgagtggtgctctggaccgggtggctagtgctacaaagattgctttgtatgagaccccaactggctggaagttttttgggaatttgatggacgcgagcaaactgtccctttgtggggaggagagcttcgggaccggttctgaccacatccgtgagaaagatggactgtgggctgtccttgcctggctctccatcctagccacccgcaagcagagtgtggaggacattctcaaagatcattggcaaaagcatggccggaatttcttcaccaggtatgattacgaggaggtggaagctgagggcgcaaacaaaatgatgaaggacttggaggccctgatgtttgatcgctcctttgtggggaagcagttctcagcaaatgacaaagtttacactgtggagaaggccgataactttgaatacagcgacccagtggatggaagcatttcaagaaatcagggcttgcgcctcattttcacagatggttctcgaatcgtcttccgactgagcggcactgggagtgccggggccaccattcggctgtacatcgatagctatgagaaggacgttgccaagattaaccaggacccccaggtcatgttggccccccttatttccattgctctgaaagtgtcccagctgcaggagaggacgggacgcactgcacccactgtcatcacctaa(SEQ ID NO.5)
PCR扩增获得的UGPase2基因序列：
atgtcgagatttgtacaagatcttagcaaagcaatgtctcaagatggtgcttctcagttccaagaagtcattcggcaagagctagaattatctgtgaagaaggaactagaaaaaatactcaccacagcatcatcacatgaatttgagcacaccaaaaaagacctggatggatttcggaagctatttcatagatttttgcaagaaaaggggccttctgtggattggggaaaaatccagagaccccctgaagattcgattcaaccctatgaaaagataaaggccaggggcttgcctgataatatatcttccgtgttgaacaaactagtggtggtgaaactcaatggtggtttgggaaccagcatgggctgcaaaggccctaaaagtctgattggtgtgaggaatgagaatacctttctggatctgactgttcagcaaattgaacatttgaataaaacctacaatacagatgttcctcttgttttaatgaactcttttaacacggatgaagataccaaaaaaatactacagaagtacaatcattgtcgtgtgaaaatctacactttcaatcaaagcaggtacccgaggattaataaagaatctttacttcctgtagcaaaggacgtgtcttactcaggggaaaatacagaagcttggtaccctccaggtcatggtgatatttacgccagtttctacaactctggattgcttgatacctttataggagaaggcaaagagtatatttttgtgtctaacatagataatctgggtgccacagtggatctgtatattcttaatcatctaatgaacccacccaatggaaaacgctgtgaatttgtcatggaagtcacaaataaaacacgtgcagatgtaaagggcgggacactcactcaatatgaaggcaaactgagactggtggaaattgctcaagtgccaaaagcacatgtagacgagttcaagtctgtatcaaagttcaaaatatttaatacaaacaacctatggatttctcttgcagcagttaaaagactgcaggagcaaaatgccattgacatggaaatcattgtgaatgcaaagactttggatggaggcctgaatgtcattcaattagaaactgcagtaggggctgccatcaaaagttttgagaattctctaggtattaatgtgccaaggagccgttttctgcctgtcaaaaccacatcagatctcttgctggtgatgtcaaacctctatagtcttaatgcaggatctctgacaatgagtgaaaagcgggaatttcctacagtgcccttggttaaattaggcagttcttttacgaaggttcaagattatctaagaagatttgaaagtataccagatatgcttgaattggatcacctcacagtttcaggagatgtgacatttggaaaaaatgtttcattaaagggaacggttatcatcattgcaaatcatggtgacagaattgatatcccacctggagcagtattagagaacaagattgtgtctggaaaccttcgcatcttggaccactaa(SEQ ID NO.6)实施例2重组质粒转染小鼠肝癌细胞H22
1、实验材料和仪器
Lipofectamine 3000转染试剂盒、RPMI1640培养基：均购自ThermoFisher公司；小鼠肝癌细胞H22来源同实施例1；生物安全柜：ThermoFisher公司，1300A2型。
2、实验步骤
将重组质粒PGM/pcDNA3.1和UGPase/pcDNA3.3按摩尔比1:1与lipofectamine3000转染试剂混匀，孵育15min后转染小鼠肝癌细胞H22。转染72小时后1000rpm离心8min收集细胞。细胞重悬到RPMI1640无血清培养基，使其细胞浓度达到1×107cells/mL，共17mL。进行紫外照射1h，之后添加化疗药甲氨蝶呤使其在培养液中的药物浓度达到1mg/mL，培养箱内孵育18-20h。逐级离心得到PGM1-UGPase2/H22细胞来源的甲氨蝶呤囊泡。逐级离心流程为：1500rpm离心8min，丢弃沉淀；5000rpm离心8min，丢弃沉淀；14000g离心1min，丢弃沉淀；14000g离心1h，使用生理盐水重悬沉淀，悬液即为所需囊泡。
3、实验结果
HPLC法检测转染后H22细胞内UDPG水平，以及其囊泡内UDPG水平。以H22细胞及其囊泡为对照，检测结果显示PGM1-UGPase2/H22细胞制备的囊泡内UDPG含量明显提高，是对照的3.75倍(图3)。
实施例3中性粒细胞transwell体外趋化实验
1、实验材料和仪器
Transwell小室：购自Corning公司；倒置显微镜：莱卡公司，DMIL-PH2型。
2、实验步骤
Transwell小室上室加入小鼠骨髓分离的中性粒细胞和无血清培养基，下室分别加入转染和未转染PGM1及UGPase2基因的细胞分泌的囊泡，孵育1h，收集下室中性粒细胞进行计数。
3、实验结果
结果显示转染PGM1及UGPase2基因后，囊泡趋化中性粒细胞的能力明显提高，PGM1-UGPase2/H22细胞囊泡组趋化中性粒细胞的数量是对照组的2.42倍(图4)。
实施例4体外小鼠肝癌细胞H22杀伤实验
1、实验材料和仪器
小鼠肝癌细胞H22来源同实施例1；RPMI1640培养基：购自ThermoFisher公司；Annexin V-FITC及PI染料、Annexin V结合缓冲液：购自Merck公司；生物安全柜：ThermoFisher公司，1300A2型。流式细胞计数仪：购自BD公司，FACSCantoⅡ型。
2、实验步骤
检测转染PGM1及UGPase2基因的细胞制备的甲氨蝶呤囊泡对H22细胞的杀伤作用，以未做转染的H22细胞产的甲氨蝶呤囊泡为对照(甲氨蝶呤囊泡制备方法参照实施例2)。分别取两组甲氨蝶呤囊泡与5×104个H22细胞在24孔板中共培养24h，PBS对照组只在相应的孔中添加同等数量的H22细胞。培养24h后，将孔中所有液体收集到流式管中，用500μL PBS洗涤，洗涤悬液也加入对应流式管，500g离心5min。弃去上清，加入100μL Annexin Vbinding buffer，再分别加入1.5μL Annexin V-FITC和1.2μL PI染料，混匀后室温孵育15min。孵育结束后每管加入200μL Annexin V binding buffer，混匀后用流式细胞仪检测凋亡率。
3、实验结果
结果表明转染PGM1及UGPase2基因的细胞制备的甲氨蝶呤囊泡体外肿瘤细胞杀伤作用更强，H22细胞凋亡率由12.5％提高到20.2％(图5)。
实施例5H22肝癌小鼠生存期试验
1、实验材料
BALB/c小鼠：购自武汉大学医学实验动物中心；甲氨蝶呤：购自江苏恒瑞医药；氯化钠注射液：购自科伦药业；G418和Hygromycin均购自Merck公司；Lipofectamine 3000转染试剂购自ThermoFisher公司。
2、实验步骤24只BALB/c小鼠平均分成4组，每组6只。第0天腹腔接种H22细胞，按5×104细胞/只进行接种。从第3天开始腹腔给药，连续给药5天，之后统计4组小鼠的生存期。
表1.小鼠给药情况
Figure BDA0002328613310000101
3、实验结果
对4组小鼠生存期由长到短进行排序，H22转染细胞甲氨蝶呤囊泡组＞H22细胞甲氨蝶呤囊泡组＞甲氨蝶呤组＞生理盐水组。表明转染PGM1及UGPase2基因的细胞产生的甲氨蝶呤囊泡能显著延长H22肝癌小鼠生存期(图6)。
实施例6表达PGM1及UGPase2的稳定细胞株
1、实验材料
人肺癌细胞系A549细胞来源同实施例1；胎牛血清：购自四季青公司；RPMI1640培养基：购自ThermoFisher公司。
2、实验步骤
(1)建立PGM1-UGPase2/A549稳定细胞株：将重组质粒PGM/pcDNA3.1和UGPase/pcDNA3.3按摩尔比1:1与转染试剂Lipofectamine3000混匀，孵育15min后转染人肺癌细胞系A549细胞。转染后24小时对细胞计数，按0.5个细胞/孔接种到96孔板，加入含10％血清的1640培养基及终浓度分别为400μg/mL的G418和200μg/mL的Hygromycin进行筛选。2周后对单克隆细胞株进行扩大培养和建库，获得PGM1-UGPase2/A549稳定细胞株。
(2)中性粒细胞transwell体外趋化：在transwell小室上室加入人外周血分离的中性粒细胞和无血清培养基，下室分别加入A549细胞或PGM1-UGPase2/A549稳定细胞株制备的囊泡，孵育1h，收集下室中性粒细胞进行计数。
3、实验结果
(1)UDPG含量检测：HPLC检测PGM1-UGPase2/A549稳定细胞株及其囊泡UDPG含量，检测结果表明PGM1-UGPase2/A549稳定细胞株制备的囊泡UDPG含量达到6.04μg/106cells，为对照的15.21倍(图7)。
(2)中性粒细胞趋化：结果表明PGM1-UGPase2/A549细胞囊泡趋化中性粒细胞数量是对照组的2.81倍(图8)。
实施例7体外人肺癌细胞A549杀伤实验
1、实验材料和仪器
A549来源同实施例1；其余材料和仪器信息见实施例4。
2、实验步骤
检测PGM1-UGPase2/A549稳定细胞株制备的甲氨蝶呤囊泡对A549肿瘤细胞的杀伤作用，以A549细胞制备的甲氨蝶呤囊泡为对照(甲氨蝶呤囊泡制备方法参照实施例2)。分别取两组甲氨蝶呤囊泡与5×104个A549细胞在24孔板中共培养24h，PBS对照组只在相应的孔中添加同等数量的A549细胞。培养24h后，将孔中所有液体收集到流式管中，用500μL PBS洗涤，洗涤悬液也加入对应流式管，500g离心5min。弃去上清，加入100μL Annexin V bindingbuffer，再分别加入1.5μL Annexin V-FITC和1.2μL PI染料，混匀后室温孵育15min。孵育结束后每管加入200μL Annexin V binding buffer，混匀后用流式细胞仪检测凋亡率。
3、实验结果
两组载药囊泡诱导A549肺癌细胞的凋亡率分别为15.1％和26.7％，结果表明PGM1-UGPase2/A549稳定细胞株制备的甲氨蝶呤囊泡体外肿瘤细胞杀伤作用更强(图9)。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北盛齐安生物科技股份有限公司
<120> 一种载药囊泡
<130> HB1907-19P122723
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
actataggga gacccaagct gggccgccac catggtgaag atcgtgacag 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgggccctc tagactcgag cttaggtgat gacagtgggt gc 42
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctatagggag acccaagctg ggccgccacc atgtcgagat ttgtacaag 49
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgggccctc tagactcgag cttagtggtc caagatgcga ag 42
<210> 5
<211> 1689
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggtgaaga tcgtgacagt taagacccag gcgtaccagg accagaagcc gggcacgagc 60
gggctgcgga agcgggtgaa ggtgttccag agcagcgcca actacgcgga gaacttcatc 120
cagagtatca tctccaccgt ggagccggcg cagcggcagg aggccacgct ggtggtgggc 180
ggggacggcc ggttctacat gaaggaggcc atccagctca tcgctcgcat cgctgccgcc 240
aacgggatcg gtcgcttggt tatcggacag aatggaatcc tctccacccc tgctgtatcc 300
tgcatcatta gaaaaatcaa agccattggt gggatcattc tgacagccag tcacaaccca 360
gggggcccca atggagattt tggaatcaaa ttcaatattt ctaatggagg tcctgctcca 420
gaagcaataa ctgataaaat tttccaaatc agcaagacaa ttgaagaata tgcagtttgc 480
cctgacctga aagtagacct tggtgttctg ggaaagcagc agtttgactt ggaaaataag 540
ttcaaaccct tcacagtgga aattgtggat tcggtagaag cttatgctac aatgctgaga 600
agcatctttg atttcagtgc actgaaagaa ctactttctg ggccaaaccg actgaagatc 660
tgtattgatg ctatgcatgg agttgtggga ccgtatgtaa agaagatcct ctgtgaagaa 720
ctcggtgccc ctgcgaactc ggcagttaac tgcgttcctc tggaggactt tggaggccac 780
caccctgacc ccaacctcac ctatgcagct gacctggtgg agaccatgaa gtcaggagag 840
catgattttg gggctgcctt tgatggagat ggggatcgaa acatgattct gggcaagcat 900
gggttctttg tgaacccttc agactctgtg gctgtcattg ctgccaacat cttcagcatt 960
ccgtatttcc agcagactgg ggtccgcggc tttgcacgga gcatgcccac gagtggtgct 1020
ctggaccggg tggctagtgc tacaaagatt gctttgtatg agaccccaac tggctggaag 1080
ttttttggga atttgatgga cgcgagcaaa ctgtcccttt gtggggagga gagcttcggg 1140
accggttctg accacatccg tgagaaagat ggactgtggg ctgtccttgc ctggctctcc 1200
atcctagcca cccgcaagca gagtgtggag gacattctca aagatcattg gcaaaagcat 1260
ggccggaatt tcttcaccag gtatgattac gaggaggtgg aagctgaggg cgcaaacaaa 1320
atgatgaagg acttggaggc cctgatgttt gatcgctcct ttgtggggaa gcagttctca 1380
gcaaatgaca aagtttacac tgtggagaag gccgataact ttgaatacag cgacccagtg 1440
gatggaagca tttcaagaaa tcagggcttg cgcctcattt tcacagatgg ttctcgaatc 1500
gtcttccgac tgagcggcac tgggagtgcc ggggccacca ttcggctgta catcgatagc 1560
tatgagaagg acgttgccaa gattaaccag gacccccagg tcatgttggc cccccttatt 1620
tccattgctc tgaaagtgtc ccagctgcag gagaggacgg gacgcactgc acccactgtc 1680
atcacctaa 1689
<210> 6
<211> 1527
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgtcgagat ttgtacaaga tcttagcaaa gcaatgtctc aagatggtgc ttctcagttc 60
caagaagtca ttcggcaaga gctagaatta tctgtgaaga aggaactaga aaaaatactc 120
accacagcat catcacatga atttgagcac accaaaaaag acctggatgg atttcggaag 180
ctatttcata gatttttgca agaaaagggg ccttctgtgg attggggaaa aatccagaga 240
ccccctgaag attcgattca accctatgaa aagataaagg ccaggggctt gcctgataat 300
atatcttccg tgttgaacaa actagtggtg gtgaaactca atggtggttt gggaaccagc 360
atgggctgca aaggccctaa aagtctgatt ggtgtgagga atgagaatac ctttctggat 420
ctgactgttc agcaaattga acatttgaat aaaacctaca atacagatgt tcctcttgtt 480
ttaatgaact cttttaacac ggatgaagat accaaaaaaa tactacagaa gtacaatcat 540
tgtcgtgtga aaatctacac tttcaatcaa agcaggtacc cgaggattaa taaagaatct 600
ttacttcctg tagcaaagga cgtgtcttac tcaggggaaa atacagaagc ttggtaccct 660
ccaggtcatg gtgatattta cgccagtttc tacaactctg gattgcttga tacctttata 720
ggagaaggca aagagtatat ttttgtgtct aacatagata atctgggtgc cacagtggat 780
ctgtatattc ttaatcatct aatgaaccca cccaatggaa aacgctgtga atttgtcatg 840
gaagtcacaa ataaaacacg tgcagatgta aagggcggga cactcactca atatgaaggc 900
aaactgagac tggtggaaat tgctcaagtg ccaaaagcac atgtagacga gttcaagtct 960
gtatcaaagt tcaaaatatt taatacaaac aacctatgga tttctcttgc agcagttaaa 1020
agactgcagg agcaaaatgc cattgacatg gaaatcattg tgaatgcaaa gactttggat 1080
ggaggcctga atgtcattca attagaaact gcagtagggg ctgccatcaa aagttttgag 1140
aattctctag gtattaatgt gccaaggagc cgttttctgc ctgtcaaaac cacatcagat 1200
ctcttgctgg tgatgtcaaa cctctatagt cttaatgcag gatctctgac aatgagtgaa 1260
aagcgggaat ttcctacagt gcccttggtt aaattaggca gttcttttac gaaggttcaa 1320
gattatctaa gaagatttga aagtatacca gatatgcttg aattggatca cctcacagtt 1380
tcaggagatg tgacatttgg aaaaaatgtt tcattaaagg gaacggttat catcattgca 1440
aatcatggtg acagaattga tatcccacct ggagcagtat tagagaacaa gattgtgtct 1500
ggaaaccttc gcatcttgga ccactaa 1527

Claims (5)

1.一种载药囊泡，包含肿瘤细胞来源的囊泡和包裹于所述囊泡中的作为治疗肿瘤有效成分的肿瘤治疗药，其中所述肿瘤细胞来源的囊泡为凋亡的肿瘤细胞释放的囊泡且囊泡中包裹富集的尿苷二磷酸葡萄糖，所述肿瘤治疗药为甲氨蝶呤；
所述肿瘤细胞来源的囊泡通过下述方法制备：
1)通过向肿瘤细胞转入葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，促进肿瘤细胞内合成尿苷二磷酸葡萄糖，合成的尿苷二磷酸葡萄糖在细胞质内富集，获得含有富集的尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞；
2)诱导所述含有富集的尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞凋亡，并将肿瘤治疗药包裹于凋亡的囊泡中，制备所述肿瘤细胞来源的囊泡。
2.权利要求1所述的载药囊泡，其中所述步骤2)包括：
2a)向步骤1)获得的含有富集的尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞施用作为有效成分的肿瘤治疗药使之凋亡，收集凋亡的肿瘤细胞所释放的包药囊泡，获得所述载药囊泡；或者
2b)使用紫外线照射步骤1)获得的含有富集的尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞，促进肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的细胞囊泡，然后将所述细胞囊泡与作为有效成分的肿瘤治疗药进行孵育，使所述肿瘤治疗药被细胞囊泡包裹，获得所述载药囊泡；或者
2c)使用紫外线照射步骤1)获得的含有富集的尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞后立即加入作为有效成分的肿瘤治疗药，促使肿瘤细胞凋亡，收集凋亡肿瘤细胞所释放的包药囊泡，获得所述载药囊泡。
3.一种制备权利要求1所述的载药囊泡的方法，包括下述步骤：
i)通过向肿瘤细胞转入葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，促进肿瘤细胞内尿苷二磷酸葡萄糖的合成，合成的尿苷二磷酸葡萄糖在细胞质内富集，获得含有富集的尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞；
ii)诱导所述含有富集的尿苷二磷酸葡萄糖的肿瘤细胞凋亡，并将肿瘤治疗药包裹于凋亡的囊泡中，制备中性粒细胞趋化能力增强的载药囊泡；
其中所述肿瘤治疗药为甲氨蝶呤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述步骤i)包括：
ia)根据葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因序列设计引物，以反转录得到的cDNA为模板，分别通过PCR扩增所述葡萄糖磷酸变位酶基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，构建重组质粒；
ib)用所述重组质粒转染肿瘤细胞。
5.权利要求1所述的载药囊泡在制备治疗肿瘤药物中的用途。
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