SA516380143B1 - تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين - Google Patents
تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين Download PDFInfo
- Publication number
- SA516380143B1 SA516380143B1 SA516380143A SA516380143A SA516380143B1 SA 516380143 B1 SA516380143 B1 SA 516380143B1 SA 516380143 A SA516380143 A SA 516380143A SA 516380143 A SA516380143 A SA 516380143A SA 516380143 B1 SA516380143 B1 SA 516380143B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- sequence
- aaa
- expression
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 207
- 208000034737 hemoglobinopathy Diseases 0.000 title abstract description 38
- 208000018337 inherited hemoglobinopathy Diseases 0.000 title abstract description 8
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 164
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 134
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 133
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 122
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 59
- 102100022976 B-cell lymphoma/leukemia 11A Human genes 0.000 claims description 45
- 101000903703 Homo sapiens B-cell lymphoma/leukemia 11A Proteins 0.000 claims description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 9
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 3
- 108091033773 MiR-155 Proteins 0.000 claims description 3
- 108091055042 miR-181 stem-loop Proteins 0.000 claims description 2
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 claims description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 claims 19
- 241001093575 Alma Species 0.000 claims 5
- 241001446467 Mama Species 0.000 claims 3
- 101100298995 Arabidopsis thaliana PBC1 gene Proteins 0.000 claims 2
- 102000017914 EDNRA Human genes 0.000 claims 2
- 101150062404 EDNRA gene Proteins 0.000 claims 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 claims 2
- 238000012053 enzymatic serum creatinine assay Methods 0.000 claims 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims 2
- 238000000675 plasmon resonance energy transfer Methods 0.000 claims 2
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 claims 2
- NSYDOBYFTHLPFM-UHFFFAOYSA-N 2-(2,2-dimethyl-1,3,6,2-dioxazasilocan-6-yl)ethanol Chemical compound C[Si]1(C)OCCN(CCO)CCO1 NSYDOBYFTHLPFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl)methyl]sulfinyl}-1H-benzimidazole Chemical compound N=1C2=CC(OC)=CC=C2NC=1S(=O)CC1=NC=C(C)C(OC)=C1C SUBDBMMJDZJVOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101710179738 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101150077772 AGRP gene Proteins 0.000 claims 1
- RNIHAPSVIGPAFF-UHFFFAOYSA-N Acrylamide-acrylic acid resin Chemical compound NC(=O)C=C.OC(=O)C=C RNIHAPSVIGPAFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010048799 Acute generalised exanthematous pustulosis Diseases 0.000 claims 1
- 208000005441 Acute generalized exanthematous pustulosis Diseases 0.000 claims 1
- 108700021677 Agouti-Related Proteins 0.000 claims 1
- 102000054930 Agouti-Related Human genes 0.000 claims 1
- 241000380131 Ammophila arenaria Species 0.000 claims 1
- 241000857945 Anita Species 0.000 claims 1
- 101100309713 Arabidopsis thaliana SD129 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000878595 Arabidopsis thaliana Squalene synthase 1 Proteins 0.000 claims 1
- FOXXZZGDIAQPQI-XKNYDFJKSA-N Asp-Pro-Ser-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FOXXZZGDIAQPQI-XKNYDFJKSA-N 0.000 claims 1
- 101150004966 BRE4 gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 claims 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 claims 1
- 206010048909 Boredom Diseases 0.000 claims 1
- 102000001324 CD59 Antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108010055167 CD59 Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 101100442689 Caenorhabditis elegans hdl-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100399480 Caenorhabditis elegans lmn-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100083253 Caenorhabditis elegans pho-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100203601 Caenorhabditis elegans sor-3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100310926 Caenorhabditis elegans sra-3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 claims 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims 1
- 241001643084 Cyrtanthus elatus virus A Species 0.000 claims 1
- 102100031237 Cystatin-A Human genes 0.000 claims 1
- 101100536354 Drosophila melanogaster tant gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000008247 Echinochloa frumentacea Nutrition 0.000 claims 1
- 244000089409 Erythrina poeppigiana Species 0.000 claims 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 claims 1
- 244000301682 Heliotropium curassavicum Species 0.000 claims 1
- 235000015854 Heliotropium curassavicum Nutrition 0.000 claims 1
- 101000921786 Homo sapiens Cystatin-A Proteins 0.000 claims 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 claims 1
- 101000874141 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DDX43 Proteins 0.000 claims 1
- 101000616556 Homo sapiens SH3 domain-containing protein 19 Proteins 0.000 claims 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 claims 1
- 102100033356 Lecithin retinol acyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 101710186608 Lipoyl synthase 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101710137584 Lipoyl synthase 1, chloroplastic Proteins 0.000 claims 1
- 101710090391 Lipoyl synthase 1, mitochondrial Proteins 0.000 claims 1
- 241000407429 Maja Species 0.000 claims 1
- 241001214257 Mene Species 0.000 claims 1
- 241000353097 Molva molva Species 0.000 claims 1
- 101100380295 Mus musculus Asah1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100165729 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stk-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101000915175 Nicotiana tabacum 5-epi-aristolochene synthase Proteins 0.000 claims 1
- 240000004072 Panicum sumatrense Species 0.000 claims 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 claims 1
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 claims 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 claims 1
- 241000717965 Pepsis Species 0.000 claims 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 claims 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 claims 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 claims 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 claims 1
- 101100271190 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) ATAT gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100035724 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX43 Human genes 0.000 claims 1
- 229940125647 RAED Drugs 0.000 claims 1
- 241000269435 Rana <genus> Species 0.000 claims 1
- 235000009776 Rathbunia alamosensis Nutrition 0.000 claims 1
- 102100021782 SH3 domain-containing protein 19 Human genes 0.000 claims 1
- 241000593989 Scardinius erythrophthalmus Species 0.000 claims 1
- 241000078006 Shaka Species 0.000 claims 1
- 229940122605 Short-acting muscarinic antagonist Drugs 0.000 claims 1
- 241001302210 Sida <water flea> Species 0.000 claims 1
- 241000269400 Sirenidae Species 0.000 claims 1
- 241001575049 Sonia Species 0.000 claims 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 claims 1
- 102100028651 Tenascin-N Human genes 0.000 claims 1
- 101710087911 Tenascin-N Proteins 0.000 claims 1
- 241000718541 Tetragastris balsamifera Species 0.000 claims 1
- 229960005339 acitretin Drugs 0.000 claims 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 claims 1
- 229940060515 aleve Drugs 0.000 claims 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 claims 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims 1
- 101150061829 bre-3 gene Proteins 0.000 claims 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims 1
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000021319 infantile-onset periodic fever-panniculitis-dermatosis syndrome Diseases 0.000 claims 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 1
- 108010084957 lecithin-retinol acyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 235000015250 liver sausages Nutrition 0.000 claims 1
- 108091007420 miR‐142 Proteins 0.000 claims 1
- CDBRNDSHEYLDJV-FVGYRXGTSA-M naproxen sodium Chemical compound [Na+].C1=C([C@H](C)C([O-])=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CDBRNDSHEYLDJV-FVGYRXGTSA-M 0.000 claims 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N orlistat Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](OC(=O)[C@H](CC(C)C)NC=O)C[C@@H]1OC(=O)[C@H]1CCCCCC AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N 0.000 claims 1
- 208000012318 pareses Diseases 0.000 claims 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 claims 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 claims 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 claims 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 claims 1
- MBYLVOKEDDQJDY-UHFFFAOYSA-N tris(2-aminoethyl)amine Chemical compound NCCN(CCN)CCN MBYLVOKEDDQJDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 185
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 abstract description 50
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 29
- 108010044495 Fetal Hemoglobin Proteins 0.000 abstract description 28
- 206010043395 Thalassaemia sickle cell Diseases 0.000 abstract description 13
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 abstract 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 605
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 249
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 181
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 130
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 130
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 119
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 117
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 109
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 108
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 108
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 106
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 106
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 93
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 88
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 87
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 61
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 61
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 53
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 43
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 41
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 38
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 38
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 38
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 36
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 35
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 35
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 34
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 33
- 241000545067 Venus Species 0.000 description 33
- YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 2,5-dimethoxy-4-bromophenethylamine Chemical compound COC1=CC(CCN)=C(OC)C=C1Br YMHOBZXQZVXHBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 28
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 28
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 27
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 27
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 27
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 27
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 27
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 27
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 24
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 23
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 23
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 22
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 22
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 21
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 21
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 20
- 101100450227 Mus musculus Hbb-y gene Proteins 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 18
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 description 17
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 17
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 17
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 16
- 101000907904 Homo sapiens Endoribonuclease Dicer Proteins 0.000 description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 16
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 16
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 239000000306 component Substances 0.000 description 15
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 15
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 15
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 15
- 102100023387 Endoribonuclease Dicer Human genes 0.000 description 14
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 14
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 14
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 13
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 13
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 13
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 12
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 12
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 12
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 12
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 12
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 12
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 12
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 12
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 10
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 10
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 201000001505 hemoglobinuria Diseases 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 240000000233 Melia azedarach Species 0.000 description 8
- 108091062140 Mir-223 Proteins 0.000 description 8
- 241000713880 Spleen focus-forming virus Species 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 8
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 8
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 108091028606 miR-1 stem-loop Proteins 0.000 description 8
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 8
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 8
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 7
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 7
- 102100031788 E3 ubiquitin-protein ligase MYLIP Human genes 0.000 description 7
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 7
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 7
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 7
- 235000015076 Shorea robusta Nutrition 0.000 description 7
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 6
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 6
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 6
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 101100234002 Drosophila melanogaster Shal gene Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 244000166071 Shorea robusta Species 0.000 description 5
- 101100388071 Thermococcus sp. (strain GE8) pol gene Proteins 0.000 description 5
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 5
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 4
- 108091005886 Hemoglobin subunit gamma Proteins 0.000 description 4
- 102100038617 Hemoglobin subunit gamma-2 Human genes 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 4
- -1 Jie Substances 0.000 description 4
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 4
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 3
- 101150086355 HBG gene Proteins 0.000 description 3
- VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N Hydroxyurea Chemical compound NC(=O)NO VSNHCAURESNICA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 3
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 3
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 108091026924 Sar RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 206010051895 acute chest syndrome Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 201000006288 alpha thalassemia Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 210000004252 chorionic villi Anatomy 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 3
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 3
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 3
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 3
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 3
- 229960001330 hydroxycarbamide Drugs 0.000 description 3
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 3
- 210000004991 placental stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 3
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 2
- 108010044267 Abnormal Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102100036511 Dehydrodolichyl diphosphate synthase complex subunit DHDDS Human genes 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000594785 Hana virus Species 0.000 description 2
- 101150015950 Hbb-y gene Proteins 0.000 description 2
- 208000012925 Hemoglobin H disease Diseases 0.000 description 2
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 101100493741 Homo sapiens BCL11A gene Proteins 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241001377010 Pila Species 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 208000037062 Polyps Diseases 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 108091029810 SaRNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 206010043390 Thalassaemia alpha Diseases 0.000 description 2
- 101100117436 Thermus aquaticus polA gene Proteins 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 208000010094 Visna Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000005980 beta thalassemia Diseases 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 2
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 2
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 210000003566 hemangioblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108091028838 miR-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003836 peripheral circulation Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 201000011264 priapism Diseases 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 229940078677 sarna Drugs 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- UIYWFOZZIZEEKJ-XVFCMESISA-N 1-[(2r,3r,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound F[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 UIYWFOZZIZEEKJ-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002925 A-like Anatomy 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100152881 Arabidopsis thaliana THAL gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N Baytril Chemical compound C1CN(CC)CCN1C(C(=C1)F)=CC2=C1C(=O)C(C(O)=O)=CN2C1CC1 SPFYMRJSYKOXGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000270299 Boa Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- BKBDVQWDXWEPHJ-UHFFFAOYSA-N C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O.S(=O)(=O)(O)O.C(CCCCCCCCCCC)[Na] Chemical compound C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O.S(=O)(=O)(O)O.C(CCCCCCCCCCC)[Na] BKBDVQWDXWEPHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000909256 Caldicellulosiruptor bescii (strain ATCC BAA-1888 / DSM 6725 / Z-1320) DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000189662 Calla Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000713756 Caprine arthritis encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 208000014912 Central Nervous System Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000761389 Copa Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241001559589 Cullen Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 125000000824 D-ribofuranosyl group Chemical group [H]OC([H])([H])[C@@]1([H])OC([H])(*)[C@]([H])(O[H])[C@]1([H])O[H] 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 1
- 101150105088 Dele1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 101100435497 Drosophila melanogaster ari-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 101710181043 Endonuclease 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000031637 Erythroblastic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036566 Erythroleukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010049467 Erythropoiesis abnormal Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 1
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical group C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 208000034502 Haemoglobin C disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002375 Hand-Foot Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000713858 Harvey murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 108091005880 Hemoglobin F Proteins 0.000 description 1
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100220044 Homo sapiens CD34 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100230565 Homo sapiens HBB gene Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical class Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000252067 Megalops atlanticus Species 0.000 description 1
- 108700011325 Modifier Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000723939 Mus musculus Transcription factor HIVEP3 Proteins 0.000 description 1
- 206010028391 Musculoskeletal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 108091007494 Nucleic acid- binding domains Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical class [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 101000902592 Pyrococcus furiosus (strain ATCC 43587 / DSM 3638 / JCM 8422 / Vc1) DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 101710094523 Replication enhancer Proteins 0.000 description 1
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 101150107869 Sarg gene Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000012167 Small RNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010041662 Splinter Diseases 0.000 description 1
- 241000713675 Spumavirus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241001455617 Sula Species 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010043391 Thalassaemia beta Diseases 0.000 description 1
- 241000532784 Thelia <leafhopper> Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 230000007950 acidosis Effects 0.000 description 1
- 208000026545 acidosis disease Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000021841 acute erythroid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000004103 basophilic normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940105596 baytril Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000003632 chemoprophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000003081 coactivator Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 235000001159 dosh Nutrition 0.000 description 1
- 244000245171 dosh Species 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000002616 endonucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001667 episodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009760 functional impairment Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150026129 gpa-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150082829 gpa-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150027888 gpa-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010045676 holotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 1
- 201000004108 hypersplenism Diseases 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003601 intercostal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000003039 myelosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000007859 posttranscriptional regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 201000009225 splenic sequestration Diseases 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000462 teratogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003439 teratogenic agent Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000186 toxicological potential Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N ursodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 RUDATBOHQWOJDD-UZVSRGJWSA-N 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
تقدم النماذج هنا MicroRNAs تخليقية مصممة خصيصا تستهدف BCL11A للتعبير عن بوليمراز polymerase RNA II، وطرق استخدام لعلاج أمراض الهيموجلوبين hemoglobinopathies مثل مرض الخلية المنجلية sickle cell disease أو ثلاسيميا thalassemia بواسطة زيادة مستويات التعبير عن مستويات الهيموجلوبين الجنيني fetal hemoglobin. شكل2
Description
تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين COMPOSITIONS AND METHODS TO TREATING HEMOGLOBINOPATHIES الوصف الكامل خلفية الاختراع هذا الطلب عبارة عن طلب دولي يطالب بالمنفعة بموجب المادة 35 من قانون الولايات المتحدة 5 9ه ) للطلب الأمريكي المؤقت رقم 984247/61؛ المودع في 25 إبريل 2014؛ والطلب الأمريكي المؤقت رقم 066783/62؛ المودع في 1 أوكتوير 2014 وقد تم دمج محتوباتها كل من هذه الطلبات هنا بالإشارة إليها كمرجع. تم تنفيذ هذا الاختراع بواسطة دعم حكومي وفقا للمنحة رقم: SUOIHLI17720-03 المقدمة بواسطة المؤسسات الصحية الوطنية. تتمتع الحكومة بحقوق معينة في الاختراع. تتعلق النماذج المكشوف عنها بتركيبات وطرق لعلاج أمراض_ الهيموجلوبين .hemoglobinopathies بشكل أكثر dass تتعلق النماذج بتركيبات وطرق لزيادة هيموجلوبين 0 جنيني fetal hemoglobin في خلية cell بواسطة استبعاد انتقائي ل 801117 داخلي. أمراض الهيموجلويين» Ald مرض الخلية المنجلية/أنيميا sickle cell 38 (500) وثااسيميا ¢(THAL) thalassemia هي من بين أكثر الاضطرابات أحادية monogenic disorders (pall المنتشرة في البشر. تقريبا 75 من سكان العالم يحملون تطفر جين جلوبيين globin gene تقدر منظمة الصحة العالمية أن هناك حوالي 5 300000 طفل تتم ولادتهم كل عام مصابين باضطرابات هيموجلويين hemoglobin 65 أساسية. تم عزل مرض الخلية المنجلية إلى مجموعات من الصحراء الكبرى الإفريقية؛ الهند؛ المملكة العربية السعودية؛ ودول حوض البحر الأبيض المتوسط حيث هناك ما يصل إلى 2 من كل الأطفال يولدون بأمراض» بسبب ميزة النجاة من أمراض الملاريا malarial المنقولة بواسطة تطفر ]-جلويين منجلي لزيجوت غير متجانس heterozygous sickle globin WHO Report on Sickle-cell anaemia - A59.9. Fifty-ninth World ) (8S) 0 Health Assembly — Provisional agenda item 114: United Nations; 2006:1-
5). بسبب الهجرة التاريخية و/أو الحالية؛ كانت الزيادة في أعداد مجموعات المرضى التي يمكن أن تكون موجودة في الدول المتقدمة؛ ومضاعفات الصحة العامة لمرض الخلية المنجلية كبيرة Kauf et al., American Journal of Hematology. 2009;84:323-327; ( Amendah et al., American Journal of Preventive Medicine. 2010;38:8550-556(. في الولايات المتحدة الأمريكية؛ تم تقدير متوسط البقاء للمرضى المصابين بمرض هيموجلوبين hemoglobinopathy في 1994 بأنه يبلغ 42 سنة للرجال و48 سنة للنساء (-330:1639 ;1994 Platt et al., New England Journal of Medicine. 1644( عند نسبة جزيئية؛ كان مرض الخلية المنجلية هو المرض الأول الذي سيرتبط ببديل جزيئي (1949:110:543-548 al., Science. ]© 009ا080). يؤدي التطفر النيكلوتيدي 0 الفردي إلى تحويل حمض جلوتاميك glutamic acid إلى استبدال فالين valine عند الموضع 6 من بروتين (]-جلوبين protein 8-910510. يؤدي هذا التعديل في بلمرة الجزيء في ظروف منزوعة الأوكسجين» و"التمنجل" التالي للكرية الحمراء erythrocyte التي تؤدي بشكل مطلق إلى anemia Lu بواسطة انحلال الدم والمضاعفات الحادة ومضاعفات وعائية-نقص تروية مزمنة ودماغية ig على العديد من الأعضاء؛ شاملة الكلى kidney الدماغ brain الرئة dung (les 5 على الرغم ge أن ual الوقائية (شاملة العامل الكيماوي الوقائي chemoprophylactic agent هيدروكسي (hydroxyurea Ls التي أدت إلى تقليل منتوسط في حمل مجموعات المرضى المختارين؛ في الوقت الحالي؛ الدواء العلاجي المتاح لمرض LIAN المنجلية Ble عن زراعة خلية جذعية خيفية مكونة للدم allogeneic hematopoietic stem Hsieh et al., New England Journal of ) (HSCT) cell transplantation Electronic pre-.JiMedicine. 2009;361:2309-2317; Hsieh et 8. 20 ; «(publication June 31, 2011 ترتبط خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا لسوء الحظ بأوضاع مرض الخلية المنجلية Landy مع وجود أمراض ووفيات؛ والتي تكون جزئيا عبارة عن حمل حديد متعلق بنقل خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا أولي» مرض عائل في مقابل الطعمة؛ وجرعات عالية
من العلاج الكيماوي/الإشعاع المطلوب من أجل الزراعة الأولية للعائل» من بين أشياء أخرى. هناك علاجات جزيئية جديدة تم تطويرها. مثلاء تقوم براءة الاختراع الأمريكية رقم: 4 بوصف 801118 كمنظم أساسي لجينات جلويين globin genes أثناء التطوير.
class تقوم 801117 بتعزيز التحويل الانتقالي من التعبير عن جينات هيموجلويين جنيني fetal hemoglobin genes إلى التعبير عن تطوير جينات هيموجلويين بالغة adult hemoglobin genes أثناء التطور الجنيني. يقوم قمع ,801-117 بتقليل هذا التحويل SEY) ويحافظ بشكل أساسي على التعبير الأعلى عن جينات هيموجلوبين جنيني بعد التطور الجنيني. تقوم الكمية الأعلى من جينات هيموجلوبين جنيني الذي يتم التعبير عنه بتخفيف الأعراض المرتبطة بأمراض الهيموجلوبين المختلفة. الوصف العام للاختراع في النماذج التوضيحية المحددة؛ قام الاختراع الحالي؛ (Lida بتطوير تركيبات وطرق لتحقيق علاج جيني في خلايا مكونة للدم hematopoietic cells وخلايا كاشفة مكونة للدم hematopoietic alls precursor cells 0 كريات الدم الحمراء WAN erythrocytes الأساسية الحمراء erythroid progenitors والخلايا الجذعية الجنينية .embryonic stem cells يقدم الاختراع أيضا طرق علاج جيني محسنة لعلاج اضطرابات مرتبطة بمكونات الدم. الهدف هو استبعاد 801117 بفاعلية في خلايا مشتفة من خلايا جذعية مكونة للدم hematopoietic stem cells محولة قابلة للتطعيم. سوف يزيد النجاح عند حث /-جلويين ©—globin 5 وبالتالي تكون هناك زيادة آنية في HBF وتقليل في HBS تعتمد على التقليل الكمي نسخة 8011/8 وبروتين. وقد أشار المخترعون إلى أن shRNA 801118 في حلقة 3 . يسمح هذا المنهج ل ob 8011178 shRNA يتم تحوبله عبر معززات بوليمراز polymerase ١١ ١١ (Poll) بدلا من معززات بوليمراز WIT وهذا يسمح باستغلال مسار التخليق الحيوي microRNA لتوليد SIRNAS الذي يستهدف التعبير عن 8011178 في WA جذعية 0 مكونة للدم (HSCs) hematopoietic stem cells قابلة للتطعيم. يتم تصميم الجينات المتحورة البطيئة للتعبير عن ShRNAs التي تحاكي microRNAs أساسي (ما قبل (MIRNAs وتتم معالجتها بالتالي بواسطة المعالج معقدات Microprocessor and Dicer لتوليد RNAs متداخلة صغيرة (SIRNAS) مع متوالية مكملة ل رنا RNA مرسل ل (MRNA) BCL11A في أحد الجوانب؛ يتم توفير تركيبات وطرق تقوم باستبعاد 801117 بشكل فعال في 5 خلايا مشتقة من خلايا جذعية مكونة للدم محولة قابلة للتطعيم. في أحد النماذج؛ يقوم التقليل
الكمي لنسخة 8011178 وبقوم البروتين بحث إنتاج 7(-جلوبين cy—globin وبالتالي تقوم الزيادة الآنية في HBF والتقليل في HDS المتطفرة. في نموذج معين؛ يتم دمج ShRNA 861117 في حلقة .MIR223 في نماذج معينة؛ يتم تصميم فيروس بطيء lentivirus للتعبير عن ShRNAs تحاكي miRNAs أولية والتي تتم معالجتها بالتالي بواسطة معقدات 800 Microprocessor Dicer 5 الداخلية لتوليد SIRNAS مع متوالية مكملة ل .BCL11A mRNA بالتالي؛ .في العديد ge النماذج التوضيحية؛ يقدم الوصف dal جزثياء BCL11MicroRNA تخليقي يتضمن gia 8011178 أول» جزء حلقي» gia 8011178 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5” إلى 53 حيث gall الحلقي segment 1000 موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بأجزاء 801118 الأول Sly وحيث gia 861118 الثاني مكمل لجزء BCLIIA 0 الأول بحيث تكون أجزاء 801118 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية hairpin loop مع الجزء الحلقي الذي يكون endl الحلقي للحلقة الدبوسية الذي تم تكوينه بالتبعية. في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء shal 8011178 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات nucleotides جزءِ BCL11A 5 الأول مشتق من متوالية 80611178 ويؤدي إلى الجديلة المرسلة أثناء معالجة ShRNA إلى SIRNA مزدوج ging 861118 الثاني مكمل لجز 861118 أول؛ حيث sa 8611/8 الثاني يؤدي إلى الجديلة الموجهة التي يتم دمجها في معقد انتقائية التداخل حلا RNA (RISC) Interference Specificity Complex ل RNA (alas أو إسكات جين BCL11A في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء تحتوي shal BCLITA 0 الأول والثاني على متواليات مشتقة من متوالية .BCL11A mRNA في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح هناء يبدأ جزء 801118 الأول ب -666©0- عند الطرف 5” وينتهي ga 8011178 الثاني ب -6060- عند الطرف 3 . في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMiCroRNA التخليقي موضح هناء يتكون جزء 801118 الأول Lad من -666©0- عند الطرف 5” وينتهي ga 8011178 الثاني ب - ~GCGC عند الطرف 3” .
في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح هناء يبدأ جزء BCL11A الأول ب -GCGA- . -1016- أو -16- عند الطرف 5 sis 861118 الثاني مكمل لجز 8611/7 أول. في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMiCroRNA التخليقي موضح هناء يتكون جزء Lad JNIBCLIIA 5 من «—-TCTG- . -GCGA- أو -1©6- عند الطرف 5” . في أحد النماذج وفقا لأي من 8ل801111/10005 التخليقي موضح هناء ينتهي جزء 801118 الثاني ب -1111- عند الطرف 3 . في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح (ba يتضمن BCL11MicroRNA التخليقي متوالية نيكلوتيد sequence 0110160006 مختارة من المجموعة 0 المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:.13-1 44-25. في أحد النماذج وفقا لأي من .8ل861111/10008_التخليقي موضح هناء BCL11MicroRNA التخليقي يتضمن متوالية نيكلوتيد أو gia منها الموضح في هذا الكشف. في أحد النماذج Gy لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح (ba يتكون BCL11MicroRNA التخليقي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1» 44-25. في أحد النماذج Gy لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح (ba يتكون BCL11MicroRNA التخليقي بشكل أساسي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم 1:48 -18-10¢13 44-25. في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح هناء يتم اختيار 0 جزءِ 801118 الأول من المجموعة المكونة من CGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية بهوية رقم: 46؛ Gude من 0141© 801118 أوليجو موضحة (Wa CCAGAGGATGACGATTGTTTA (متوالية بهوية رقم: 47؛ مشتق من 8611178 00142 أوليجو موضحة هنا) TCGGAGACTCCAGACAATCGC (متوالية بهوية رقم: 48؛ Gide من E3 8611 أوليجو أو shRNA1 أو E3 موضحة (be (CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC 5 (متوالية بهوية رقم: 49؛ مشتق من ShRNA2 أو 5 موضحة TCAGGACTAGGTGCAGAATGT (lia (متوالية بهوية رقم: 50؛ Gide
من 90884 أو 811 موضحة TTCTCTTGCAACACGCACAGA «(Us (متوالية بهوية رقم: 51؛ مشتق من D8 801118 أوليجو أو ShRNA3 أو 08 موضحة (We GATCGAGTGTTGAATAATGAT (متوالية بهوية رقم: 52؛ مشتق من ShRNAS أو 0 ااه 012 موضحة CAGTACCCTGGAGAAACACAT (lia (متوالية بهوية رقم: 53؛ مشتق من ShRNAS أو 5055 موضحة هنا CACTGTCCACAGGAGAAGCCA (متوالية بهوية رقم: 54؛ Gude من shRNAT أو 50811 موضحة (ba ACAGTACCCTGGAGAAACACA (متوالية بهوية رقم: 55؛ مشتق من 801118 shRNAS XLC4 و5004 مروضحة هنا CAACAAGATGAAGAGCACCAA (متوالية بهوية رقم: 56؛ Gude من أوليجو غير مستهدفة ل 801118 موضحة هنا)؛ gcgcCGCACAGAACACTCATG 0 (متوالية بهوية رقم: 57؛ مشتق من 0114165 أوليجو موضحة GCGCTCGGAGACTCCAGACAA «(la (متوالية بهوية رقم: 58؛ مشتق من 65 أو mod sid 53 أو shRNAImod موضحة هنا)ء gegcCCTCCAGGCAGCTCAAA (متوالية بهوية رقم: 59؛ مشتق من 8565 أو ShRNA2mod موضحة هنا)؛ 6086/58 1 969010866801866 (متوالية بهوية رقم: 5 60؛ مشتق من 165 أو shRNAdmod موضحة | هنا)؛ gCGCGATCGAGTGTTGAATAA (متوالية بهوية رقم: 61؛ ide من 5001265؛ 4 أو 90811850000 موضحة هنا)؛ gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC (متوالية بهوية رقم: 62؛ مشتق من 5085650 50186000 موضحة هنا)؛ gegcCACTGTCCACAGGAGAA (متوالية بهوية رقم: 63؛ مشتق من 5081165 أو 0 9080827000 موضحة هنا)؛ GCGCTTCTCTTGCAACACGCA (متوالية بهوية رقم: 4؛ Gide من 0865 80118 أو mod 08 أو shRNA3mod موضحة هنا)ء GCGCACAGTACCCTGGAGAAA (متوالية بهوية رقم: 65؛ مشتق من 801118 «C4G5 أو mod 04 أو ShRNASmMod موضحة هنا)؛ CGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية بهوية رقم: $66 مشتق من 801118 5 01265-2 موضحة ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT 4 (la (متوالية بهوية
رقم: 67؛ مشتق من 01265-2 801118 موضحة هنا).
في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء gall الحلقي مشتق من -MicroRNA في أحد النماذج» MicroRNA عبارة عن microRNA انتقائي لمكونات الدم. .MiR-223 3 014-181 «MiR-155 ¢MiR-142 Sli
في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح microRNA la
عبارة عن 4223 01.
في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء gall الحلقي عبارة عن 010081919918989 (متوالية برقم هوية:68).
بالتالي؛ في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي جزيء حمض نووي معزول 15018160 Nucleic acid molecule يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات
0 برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25« أو BCL1IMicroRNA تخليقي موضح هنا..
بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي تركيبة تتضمن جزيء حمض نووي nucleic acid molecule واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو BCLI1IMicroRNA تخليقي موضح هنا.
بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي تركيبة تتضمن على الأقل ناقل يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-1013-1» 44-25« أو BCLT1MicroRNA تخليقي موضح هنا.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:1. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:2. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:3. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 5 لمتوالية برقم هوية:4.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:5. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:6. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:7. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:8. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:9. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:10. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:13. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:14. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:15. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:16. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح؛ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:17. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:18. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح؛ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:25.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:26. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:27. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:28. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:29. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:30. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:31. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:32. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:33. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:34. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:35. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:36. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:37. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:38.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح؛ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:39. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:40. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:41. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:42. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:43. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:44. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف Jal ناقل Vector يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:1- 5 18-10¢13« 44-25 أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي ناقل موضح؛ يتضمن الناقل Lad معزز فيروسي مكون تركيز على الطحال 53a (SFFV) spleen 10005-10001108 virus قابل للحث بتترا سيكلين «(TET) tetracycline-inducible promoter أو منطقة التحكم في موقع ]-جلويين B= globin locus control region ومعزز ]-جلويين (LCR) B-globin promoter يقدم المعزز تعبير مستهدف عن جزيء الحمض النووي فيه أو BOLT IMICroRNA التخليقي فيه. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة host cell يتضمن ناقل والذي يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1 44-25« أو BCL1IMicroRNA تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي خلية عائلة موضحة هناء الخلية العائلة عبارة عن خلية Leds جنينية embryonic stem cell 5 خلية جذعية جسماتية somatic stem cell خلية أساسية «progenitor cell خلية نخاع عظم bone marrow cell خلية Leds مكونة للدم
hematopoietic stem cell أو خلية أساسية مكونة للدم hematopoietic progenitor cell في أحد النماذج؛ يتم Jie الخلية العائلة من خاضع. في أحد النماذج؛ يتم Jie الخلية العائلة من خاضع تم تشخيص حالته أنه مصاب بمرض هيموجلوبين .hemoglobinopathy يمكن أن يتم التشخيص بواسطة أي طريقة معروفة في المجال. Sle بواسطة الفحص الجيني (genetic testing 5 بواسطة (PCR-RT وبواسطة فحص خلايا الدم .blood cytology
في أحد نماذج أي خلية عائلة موضحة هناء الخلية العائلة عبارة عن LS حمراء
.erythrocyte في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة يتضمن ناقل أو بكتريا يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات
0 برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو BCL11A microRNA تخليقي الموضح هنا.
في أحد الجوانب» يقدم الوصف الحالي خلية عائلة تتضمن فيروس يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل تتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو BCL11A microRNA تخليقي الموضح هنا.
في أحد نماذج أي فيروس أو ناقل موضح هناء الفيروس عبارة عن فيروس بطيء.
15 في أحد نماذج أي ناقل أو فيروس الموضح هناء يتم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1 (1-/11)» فيروس نقص المناعة البشري من ((HIV=-2) 2 gall فيروس التهاب المفاصل-التهاب الدماغ Geld (/6821)؛ فيروس الأنيميا المعدية للخيول «(EIAV) فيروس نقص المناعة للقطط (FIV) فيروس نقص المناعة البقري ¢(BIV) وفيروس نقص المناعة للقردة (SIV)
20 بالتالي» في أحد جوانب؛ يقدم الوصف الحالي طرق لزيادة مستويات هيموجلوبين تم التعبير عنها بواسطة خلية؛ تتضمن خطوات ملامسة خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم مع كمية فعالة من تركيبة موضحة هنا أو كمية فعالة من جزيء حمض نووي معزول موضح هنا على الأقل؛ وبالتالي تتم زيادة التعبير عن الهيموجلوبين الجنيني في الخلية؛ أو أساسهاء نسبة إلى الخلية
قبل هذا التلامس. في بعض النماذج؛ تتضمن التركيبة على الأقل ناقل واحد أو خلية تتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل تتضمن the متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة
من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو microRNA 1/8 80611 تخليقي الموضح هنا. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا توفير عينة من DAY الجذعية أو الأساسية للتلامس. في أحد النماذج؛ تتضمن due الخلايا +0034 المختارة. في أحد النماذج؛ تتضمن التركيبة خليط من متواليات نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:1- Ole .44-25 (18-1013 5 تتضمن التركيبة 5-2 من متواليات نيكلوتيد مختلفة مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1) 44-25. Ole تتضمن التركيبة متواليات برقم هوية: 34 37 39 41 و43. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي طرق لعلاج؛ أو تقليل خطر pki مرض هيموجلوبين؛ Ole مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا» في خاضع. يمكن أن تتضمن الطرق 0 استبعاد انتقائي لجين 8011178 في WAY الجذعية المكونة للدم للخاضعين أو الأفراد. هؤلاء الخاضعين معرضين لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ الاستبعاد الانتقائي لجين BCLITA في الخلايا الجذعية المكونة للدم يتضمن استخدام جزيء حمض نووي معزول يتضمن متوالية نيكلوتيد من متواليات برقم هوية:18-10013-1؛ 44-25 أو استخدام ناقل (مثلا ناقل فيروسي viral (Vector) 5 يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن أي من متالية النيكلوتيد من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو BCL11A microRNA تخليقي الموضح هنا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة cla يتضمن الاستبعاد SEY) لجين 801117 في الخلايا الجذعية المكونة للدم ملامسة الخلايا الجذعية المكونة للدم مع تركيبة تتضمن على الأقل جزيء حمض نووي معزول يتضمن متوالية النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 25- 0 44؛ أو مع تركيبة تتضمن على الأقل ناقل (مثلا ناقل فيروسي) يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن أي من متوالية نيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25« أو 861118 microRNA تخليقي الموضح هنا. في أحد النماذج؛ يتم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم قبل التلامس. في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ يتم الاستبعاد الانتقائي لجين 801117 في Wall 5 الجذعية المكونة للدم في الكائن الحي؛ في المعمل؛ أو خارج الكائن الحي. في نموذج آخرء الخلية
الأساسية المكونة للدم مستهدفة لأن الاستبعاد SEY) خاص بالسلالة الحمراء 60/030560 lineage في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ تتم ملامسة الخلايا الجذعية المكونة للدم مع أي تركيبة موضحة هنا في الكائن الحي؛ في المعمل؛ أو خارج الكائن الحي. في نموذج AT ¢ الخلية الأساسية المكونة للدم التي تتم ملامستها من السلالة الحمراء . في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ تتم ملامسة الخلايا الجذعية المكونة للدم مع أي تركيبة موضحة هنا في الكائن الحي؛ في المعمل؛ أو خارج الكائن الحي. في نماذج أخرى لأي طريقة موضحة؛ يتم الاستبعاد الانتقائي لجين 801117 في خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم بالإضافة إلى خلية جذعية 0 مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد النماذج؛ تتم ملامسة خلية Leds جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ أو خلية نخاع عظم مع التركيبة الموضحة. يتم عزل الخلية الجذعية الجنينية؛ الخلية الجذعية الجسمانية؛ الخلية الأساسية؛ أو خلية نخاع العظم قبل الملامسة. في أحد النماذج؛ تتم ملامسة الخلية الجذعية الجنينية؛ الخلية الجذعية الجسمانية؛ الخلية الأساسية؛ أو خلية نخاع العظم مع أي تركيبة موضحة هنا في الكائن الحي؛ في المعمل؛ 5 أو خارج الكائن الحي. في نماذج أخرى لأي طريقة موضحة؛ يتم جمع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الدم المحيط peripheral blood دم الحبل السري «cord blood الزغابات المشيمية chorionic all villi الأمنيوسي «amniotic fluid دم المشيمة «placental blood أو نخاع العظم .bone marrow في نماذج أخرى لأي طريقة موضحة؛ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ أو يتم جمع خلية نخاع عظم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي؛ دم المشيمة؛ أو نخاع العظم. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة: إعطاء الخاضع كمية فعالة علاجيا لواحد أو أكثر من 5 جزيء حمض نووي معزول موضحة هناء فيروس أو ناقل موضحة هناء أو خلية موضحة هناء وبالتالي علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض الهيموجلوبين في الخاضع؛ حيث cag pull الناقل
أو خلية يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25 BCL11MicroRNA i تخليقي موضح هنا. Ole يتم حقن الكمية الفعالة من واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضحة هناء فيروس أو ناقل موضحة هناء أو خلية موضحة هنا بشكل مباشر في نخاع عظم للخاضع. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف Jal طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة ملامسة مجموعة من WIA جذعية مكونة للدم في المعمل أو خارج الكائن الحي مع تركيبة موضحة هنا أو مع على الأقل واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضحة هناء فيروس أو ناقل موضحة هناء وزراعة أو إعطاء الخلايا 0 الجذعية المكونة للدم الملموسة contacted hematopoietic stem cells أو الخلايا التابعة لها إلى الخاضع. في أحد النماذج؛ تقوم الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة أو الخلايا التابعة بالتطعيم في الخاضع. في أحد النماذج؛ تتم زراعة WAY الجذعية المكونة للدم الملموسة أو الخلايا dnl لها مع بروستاجلاندين 2] 2] 00052918000 alae ffs الأكسدة 33a (NAC) N-acetyl-L-cysteine نيتسيس-ا.-ليتيسأ-١ل antioxidant طعمات 5 الخلايا الملامسة .contacted cells في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف Jal طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير عن BCLTIMicroRNA تخليقي واحد على JY موضحة هنا في خلية Leds جنينية؛ خلية Leds جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم للخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن 0 الحي أو في المعمل؛ وزراعة أو إعطاء الخلية في الخاضع. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي طريقة لزيادة مستويات الهيموجلويين الجنيني الذي يتم التعبير die بواسطة خلية؛ تتضمن الطريقة التعبير عن BCLIIMicroRNA تخليقي aly على الأقل موضحة هنا في خلية Leds جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم لخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن 5 الحي أو في المعمل أو في الكائن الحي. في أحد النماذج؛ يتم التعبير بواسطة ملامسة الخلايا مع
— 6 1 — كمية فعالة من تركيبة موضحة هنا أو كمية فعالة من على الأقل جزيء حمض نووي معزول موضح هنا . في أحد الجوانب»؛ ad الوصف الحالى طريقة لتقليل مستويات BCRLLA الذي يتم التعبير عنه بواسطة خلية؛ تتضمن الطريقة التعبير عن BCLIIMicroRNA تخليقى aly على الأقل موضحة هنا في خلية جذعية جنينية؛ خلية Leds جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع abe خلية جذعية مكونة للدم chematopoietic stem cell أو خلية أساسية مكونة للدم hematopoietic progenitor cell لخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن الحي أو في المعمل أو في الكائن الحي. في أحد النماذج؛ يتضمن التعبير خطوات ملامسة خلية Leds جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة 0 لدم مع كمية فعالة من تركيبة موضحة هنا أو كمية فعالة من على الأقل جزيء حمض نووي معزول موضح هناء بالتالي تتم زيادة التعبير عن هيموجلويين جنيني hemoglobin 1618 في الخلية؛ أو ذربتهاء نسبة إلى الخلية قبل هذه الملامسة. في بعض النماذج؛ تتضمن التركيبة ناقل واحد على الأقل أو خلية تتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25 أو BCL11IMicroRNA 5 تخليقي موضح هنا. في نموذج آخر لأي من الطرق الموضحة هناء الخلية الجذعية المكونة للدم أو الخلية الأساسية المكونة للدم التى تمت ملامستها هي من السلالة الحمراء . في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم جمع الخلية الجذعية المكونة للدم أو خلية أساسية مكونة للدم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي؛ دم 0 المشيمة؛ أو نخاع العظم. في نموذج آخر لأي من الطرق الموضحة هناء تتم معالجة الخاضع المستلم مع العلاج الكيماوي chemotherapy و/أو الإشعاع قبل زراعة الخلايا الملموسة أو المنقولة. في أحد النماذج؛ العلاج الكيماوي و/أو الإشعاع عبارة عن تقليل خلايا جذعية Lah endogenous stem cells لتسهيل تطعيم LIAN المزروعة .implanted cells في أحد الجوانب»؛ يقدم الوصف الحالي طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة sare هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة توفير خلايا جذعية مكونة للدم من الخاضع؛ ملامسة
— 7 1 — الخلايا الجذعية المكونة للدم في المعمل أو خارج الكائن الحي مع تركيبة موضحة هنا أو مع على J لأقل واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضح Lia فيروس أو ناقل موضحة هناء وزراعة أو sale] إعطاء الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة في نفس الخاضع. في أحد النماذج؛ تقوم الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة أو الخلايا التابعة بتطعيم في الخاضع.
في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم علاج WAN الجذعية المكونة للدم الملموسة؛ الخلايا الجذعية الجنينية؛ WIA جذعية جسمانية؛ خلايا أساسية؛ خلايا نخاع عظم؛ أو الخلايا التابعة له خارج الكائن الحي مع بروستاجلاندين 2 و/أو مضاد الأكسدة لا-أسيتيل-ا-سيستين لتعزيز التطعيم التالي في خاضع مستقبل.
0 خلايا عائلة من خاضع معرضين لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين أو تم تشخيصهم بمرض في أحد جوانب أي طريقة؛ مجموعة الخلايا الجذعية المكونة للدم ذاتية Lana) أو خيفية فى أحد جوانب أي طريقة؛ مجموعة الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا العائلة متمددة
5 خارج الكائن الحي في مزرعة قبل ملامسة مع تركيبة موضحة هنا أو مع على الأقل واحد أو أكثر
من جزيء حمض نووي معزول موضح هناء فيروس أو Jal موضحة هنا . فى أحد جوانب أي طريقة؛ مجموعة الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا العائلة متمددة خارج الكائن الحي في مزرعة بعد ملامسة مع تركيبة موضحة هنا أو مع على الأقل واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضح هناء فيروس أو Jal موضحة هنا . في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تمايز المجموعة التي تمت ملامستها من الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا العائلة أوليا خارج All GSN في مزرعة قبل زراعة في خاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تمدد الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة في المعمل أو خارج الكائن الحي قبل الإعطاء في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم حفظ الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة بالتجميد قبل الإعطاء في الخاضع. في جانب آخر من أي طريقة؛ يتم تمدد 5 الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة في المعمل أو خارج الكائن all ويتم حفظها بالتجميد قبل
— 8 1 — الإعطاء في الخاضع. في جانب DAT من أي طريقة؛ يتم تمدد WAY الجذعية المكونة للدم الملموسة في المعمل أو خارج الكائن الحي بعد الحفظ بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ الخاضع عبارة عن إنسان. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تشخيص الخاضع بمرض هيموجلوبين. في أحد جوانب أي طريقة؛ تتضمن الطريقة Lad اختيار خاضع مشخص بمرض هيموجلوبين أو خاضع معرضين لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في أحد جوانب أي طريقة؛ مرض الهيموجلوبين عبارة عن مرض الخلية المنجلية أو تلإسيميا. Sia أمراض ]-ثلاسيميا .B-thalassemias فى أحد جوانب الطريقة ¢ تتضمن الطريقة Lad إعطاء الخاضع علاج يتضمن أوكسيجين oxygen 0 هيدروكسي يوريا hydroxyurea حمض فوليك folic acid أو Ja دم blood transfusion في أحد الجوانب»؛ يقدم الوصف الحالي طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير في الكائن all عن BCL11MicroRNA تخليقي واحد على الأقل موضحة هنا في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم التعبير في الكائن الحي في خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد جوانب أي طريقة؛ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو الخلية الأساسية المكونة للدم ذاتية المنشاً أو خيفية في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تمدد الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية Leds جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن ال BCL11MicroRNA التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي قبل إعطاء في الخاضع. في نموذج آخرء ترجع الخلية الأساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية 5 مكونة للدم وخلية أساسية مكونة للدم إلى السلالة الحمراء .
في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم حفظ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن ال BCL11MicroRNA التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في جانب آخر من أي طريقة؛ يتم تمدد الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن اذ BCL11MicroRNA التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي ويتم حفظها بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في جانب آخر من أي طريقة؛ يتم تمدد الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن 0 اذ BCL11MicroRNA التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي بعد الحفظ بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ ال BCL1IMicroRNA التخليقي الواحد على الأقل مرتبط تشغيليا بمعزز وبتم تكوينه في ناقل للتعبير في خلية حقيقة النواة -eukaryotic cell في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم التعبير عن ال BCLIIMicroRNA التخليقي الواحد على 5 الأقل من بوليمراز RNAI في أحد جوانب أي طريقة؛ لا يتم التعبير عن اذ BCLIIMicroRNA التخليقي الواحد على الأقل من بوليمراز ااا RNA في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم اختيار المعزز من مجموعة تتكون من معزز فيروسي مكون تركيز على Jalal) معزز قابل للحث بتترا سيكلين» أو منطقة التحكم في موقع ]-جلوبين 0 ومعزز م]-جلوبين؛ أو معزز انتقائي لمكونات الدم. في أحد جوانب أي طريقة؛ الناقل عبارة عن فيروس. في أحد جوانب أي طريقة؛ الفيروس عبارة عن فيروس بطيء. في أحد جوانب أي طريقة؛ تم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس نقص المناعة البشري من «(HIV=1) human immunodeficiency virus type 1 1 gall 5 فيروس نقص المناعة البشري من human immunodeficiency virus type 2 2 soll (HIV=2) فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي caprine arthritis—
((CAEV) encephalitis virus فيروس فقر الدم المعدي في الخيول equine infectious anemia virus (/ا/اع)» فيروس نقص المناعة في القطط feline immunodeficiency (FIV) virus فيروس نقص المناعة في البقر «(BIV) bovine immune deficiency virus وفيروس نقص المناعة في القردة -(SIV) simian immunodeficiency virus
في أحد جوانب أي طريقة؛ الخاضع Ble عن حيوان؛ إنسان أو غير إنسان» وقارض أو غير قارض. Ole يمكن أن يكون الخاضع عبارة عن أي كائن ثديي؛ lie إنسان» أو غيره من الكائنات الأساسية؛ pla قارض مثل فأر أو جرذء cif خنزير غيني؛ هامستر»؛ بقرة؛ حصان؛ قطة؛ كلب؛ خروف أو ماعزء أو كائن غير ثديي Jie طائر.
في أحد جوانب أي طريقة؛ تتضمن الطريقة الحصول على عينة أو مجموعة من الخلايا 0 الجذعية الجنينية Leds LWIA embryonic stem cells جسمانية «somatic stem cells خلايا أساسية «progenitor cells خلايا نخاع عظم WIA bone marrow cells جذعية مكونة للدم hematopoietic stem cells أو خلايا أساسية مكونة للدم hematopoietic
progenitor cells من الخاضع. في أحد النماذج؛ يتم Je الخلايا الجذعية الجنينية؛ DA جذعية جسمانية؛ خلايا 5 أساسية؛ خلايا نخاع عظم؛ خلايا جذعية مكونة للدم؛ WIA أساسية مكونة للدم من الخاضع العائل» المنقولة» المزروعة (اختياريا)» والمزروعة مرة أخرى في نفس العائل» أي زريعة خلية ذاتية المنشاً. في نموذج آخرء يتم Jie الخلايا الجذعية الجنينية؛ WIA جذعية جسمانية؛ خلايا أساسية؛ خلايا plas عظم؛ خلايا Leds مكونة للدم؛ أو خلايا أساسية مكونة للدم من mile عبارة عن توافق مع النوع اتش ال ايه HLA مع عائل (مستقبل) والذي تم تشخيصه ب أو معرض لخطر 0 الإصابة بمرض هيموجلوبين. هذا التوافق في النوع لمولد ضد مانح-مستقبل معروف جيدا في المجال. تتضمن الأنواع -HLA-D 3 (HLA-C (HLA-B HLA-A HLA وهي تمثل أقل عدد من توافق مولد ضد سطح الخلية المطلوب للزراعة. ذلك أن الخلايا المنقولة مزروعة في عائل مختلف؛ أي؛ خيفية للخاضع العائل المستقبل. يمكن نقل الخلايا الجذعية الجنينية؛ WA جذعية جسمانية؛ LDA أساسية؛ WA نخاع عظم؛ خلايا جذعية مكونة للدم؛ أو خلايا أساسية مكونة للدم 5 للمانح أو الخاضع مع ناقل أو حمض نووي Nucleic acid يتضمن جزيء الحمض النووي موضحة هناء تتم زراعة WAY المنقولة المتمددة؛ ويعد ذلك تتم زراعتها في الخاضع العائل. في
أحد النماذج؛ تقوم الخلايا المزروعة transplanted cells بالتطعيم في الخاضع العائل. يمكن Lad حفظ الخلايا المنقولة بالتجميد بعد Jal والتخزين؛ أو يتم حفظها بالتجميد بعد تمدد وتخزين الخلية.
حسب الاستخدام هناء العلاج أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع يعني تخفيف عرض واحد على الأقل لمرض هيموجلوبين. في أحد الجوانب؛ يقوم الاختراع بوصف طرق علاج؛ Ole تقليل حدة أو aii مرض هيموجلويين في خاضع. في جانب OAT يمكن استخدام الطرق لتقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في pall تأجيل بدء أعراض مرض هيموجلوبين في خاضع؛ أو زيادة طول عمر خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين. في أحد الجوانب؛ يمكن أن تتضمن الطرق اختيار خاضع على أساس أنها تتضمن؛ أو معرضين shal 0 الإصابة ب مرض هيموجلويين؛ ولكنها لا تتضمن مرض هيموجلوبين؛ أو خاضع ذو مرض هيموجلويين كامن. يمكن أن يتضمن اختيار الخاضع الكشف عن أعراض مرض هيموجلوبين؛ اختبار دم «blood test اختبار جيني «genetic testing أو تسجيلات سريرية. إذا كانت نتائج الاختبار تشير إلى أن الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين؛ يمكن أن تتضمن الطرق أيضا إعطاء التركيبات الموضحة هناء وبالتالي علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في 5 الخاضع. Ole خاضع تم تشخيصه بمرض الخلية المنجلية مع نمط جيني اتش بي اس اس (HBSS 08/0158 ثلاسيمياء اتش بي اس دي 1550 أو اتش بي اس او 1550؛ و/أو اتش
بي اف HF <710 بواسطة الرحلان الكهربي .electrophoresis حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح ES حالة تتضمن وجود جزيء هيموجلوبين غير طبيعي في الدم. تتضمن أمثلة أمراض الهيموجلوبين chemoglobinopathies 0 على سبيل المثال لا الحصرء مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا. Lad تم تضمين أمراض الهيموجلويين حيث توجد Ads من مركبات هيموجلويين غير الطبيعية abnormal 5 في الدم Sb) مرض الخلية المنجلية/110-0). يتضمن مثال مثالي لهذا call على سبيل المثال لا الحصرء؛ مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا. مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا وأعراضها معروفة في المجال وقد تم توضيحها هنا أيضا بالتفصيل. يمكن تشخيص 5 الخاضعين على أنه مصاب بمرض هيموجلوبين بواسطة مقدم رعاية صحية؛ مقدم رعاية طبية؛
طبيب؛ ممرضة؛ عضو أسرة؛ أو أحد المعارف» والذي يعرفون أو يفهمون أو يقررون أو يستنتجون
أو يعتقدون؛ أو يحددون أن الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين. يتم تحديد المصطلح "مرض الخلية المنجلية" هنا بحيث يتضمن أي حالة أنيميا عرضية ll تنتج من تمنجل خلايا الدم الحمراء. تتضمن أعراض مرض الخلية المنجلية: أنيميا anemia 5 ألم؛ و/أو قصور وظيفي؛ Jie الفشل الكلوي renal failure اعتلال الشبكية retinopathy متلازمة الصدر الحادة cacute—chest syndrome نقص التروية dschemia قساح 001801507 والسكتة (stroke حسب الاستخدام هنا يشير المصطلح "مرض الخلية المنجلية" إلى ASE من المشاكل السريرية الموجودة عند مرض الخلية المنجلية» خصوصا في هللاء الخاضعين الذين هم عبارة عن زيجوتات متجانسة homozygotes لاستبدال الخلية المنجلية في 0 اتش بي اس (HDS من بين الأعراض التكوينية المشار إليها هنا باستخدام المصطلح يتم تأجيل نمو وتطوير مرض الخلية المنجلية؛ وكان هناك ميل منخفض لتطوير أعراض سيئة؛ تحديدا بسبب جرثومة الالتهاب الرئوي cpneumococcus الضعف المعلم لوظيفة الطحال؛ التصفية الوقائية الفعالة لبكتريا دوارة ccirculating bacteria مع حالات احتشاء متكررة وتدمير نهائي لنسيج الطحال tissue 5016010. أيضا يتضمن المصطلح "مرض الخلية المنجلية" السلاسل الحادة من الألم العضلي الهيكلي؛ والذي يؤثر بشكل أساسي على الفقرات القطنية؛ الجذع؛ وجسم الفخذ؛ والتي تتشابه في الآلية والحدة. في البالغين؛ sale ما تبدو هذه النويات وكأنها هجمات خفيفة أو متوسطة ذات مدة قصيرة كل أسابيع قليلة أو أشهر يقطعها نويات مؤلمة تستمرما بين 5 إلى 7 أيام والتي تتم مرة سنويا. من بين الأحداث المعروفة بأنها تبدأ هذه الكوارث Jie الحماض و نقص الأكسجين والجفاف» وكلها تقوم ببدء بلمرة داخل الخلايا ل Blood: Textbook of ( HbS ,ا200ل J.
H. Hematology, 2nd Ed., Little, Brown and Company, Boston, 1996, pages 0
544-545( . حسب _الاستخدام TV, C JV.
FREY إلى اضطراب وراثي يتميز بإنتاج معيب للهيموجلوبين. في أحد النماذج؛ يتضمن المصطلح الأنيميا الوراثية التي تتم بواسطة تطفرات تؤثر على تخليق مركبات الهيموجلويين. في نماذج أخرى؛ يتضمن المصطلح أي أنيميا عرضية ناتجة من حالات ثلاسيمية Jie الثلاسيميا الحادة أو ]-ثلاسيميا» الثلاسيميا الأساسية thalassemia +0[ الثلاسيميا المتوسطة thalassemia intermedia حالات »0-ثلاسيميا o-
مثل مرض هيموجلويين hemoglobin H disease H تنتج أمراض —B ثلاسيميا بواسطة تطفر في سلسلة ]-جلويين (B-globin chain ويمكن أن تتم في صورة كبيرة أو صغيرة. في الصورة الكبيرة ل م-ثلاسيمياء JULY) طبيعيون عند الولادة؛ ولكنهم يصابون بالأنيميا أثناء العام الأول من الحياة. تقوم الصورة الخفيفة من م-ثلاسيميا بإنتاج WIA الدم 5 الحمراء الصغيرة. يتم التسبب في حالات ألفا-ثلاسيميا بواسطة حذف جين أو جينات من سلسلة الجلويين .globin chain يقصد بعبار "خطر الإصابة بمرض" الاحتمالية النسبية حيث يصاب خاضع مرض هيموجلوبين في المستقبل مقارنة بخاضع مقارن أو مجموعة مقارنة lie) خاضع سليم أو مجموعة سليمة). lia فرد يحمل التطفر الجيني المرتبط ب مرض الخلية المنجلية؛ تطفر 8 إلى IT جين 0 8-جلوبين؛ وما إذا كان الفرد في الزيتجوت غير المتجانس أو المتجانس لهذا التطفر تزيد من خطر إصابة هذا الفرد. يقصد بالمصطلح ”للا مثبط" أن يتضمن جزيء حمض نووي nucleic acid molecule يحتوي على متوالية تكمل حمض نووي مستهدف MICrORNA Ole) مستهدف) يتوسط في تقليل مستوى أو نشاط الحمض النووي المستهدف. تتضمن الأمثلة غير المقيدة ل RNAs 5 مثبطة RNA متداخلة SIRNA shRNA رببوزيمات ribozymes أنتاجوميرات cantagomirs وأوليجو نيكلوتيدات مضادة للحس oligonucleotides 801156056. تم توضيح طرق صنع RNAS مثبطة هنا. هناك طرق إضافية لصنع RNAS مثبطة معروفة في المجال. في أحد النماذج» ال BCL11IMicroRNA الموضحة هنا عبارة عن RNA مثبطة تسبب تقليل في .mRNA BCL11A Ll حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح RNA" متداخل" إلى أي متوالية RNA أحادية الجديلة أو مزدوجة الجديلة؛ قادرة -- إما بشكل مباشر أو بشكل غير مباشر (أي؛ عند التحويل) على تثبيط أو تقليل التعبير الجيني بشكل متحكم فيه بواسطة التوسط في تداخل RNA يتضمن RNA متداخل» على سبيل المثال لا الحصر» RNA متداخل صغير RNA ('SIRNAY) دبوسي صغير (8ل4ا50'). يشير "RNA dal’ إلى التدهور الانتقائي لنسبة RNA مرسلة متوالقة مع 5 المتوالية.
حسب الاستخدام هنا يشير RNA) "shRNA" دبوسي صغير (small hairpin إلى جزيء RNA يتضمن منطقة مضادة للحس gia antisense region حلقي ومنطقة حسية region ©5605؛ Cus تتضمن المنطقة الحسية نيكلوتيدات تكميلية حيث زوج قاعدة مع المنطقة المضادة للحس لتكوين خلية جذعية مزدوجة. بعد المعالجة ما بعد التحويل؛ يتم تحويل RNA 5 دبوسي صغير في RNA صغير متداخل بواسطة Alls شق يتم التوسط فيها بواسطة الإنزيم (Dicer والذي هو عبارة عن عضو من (RNase lll dle حسب الاستخدام cla تشير العبارة "المعالجة ما بعد التحوبلية" إلى معالجة MRNA تتم بعد التحويل ويتم التوسط فيهاء lie بواسطة الإنزيمات Dicer و/أو .Drosha
يشير ”لل صغير متداخل" أو "SIRNA" حسب الاستخدام هنا إلى أي جزيء RNA 0 صغير قادر على تثبيط أو تقليل التعبير الجيني بشكل متحكم فيه بواسطة التوسط في تداخل RNA بطريقة انتقائية للمتوالية. يمكن أن يكون RNA صغيرء Mie بطول حوالي 18 إلى 21 نيكلوتيدات. يتم تكوين كل SIRNA مزدوج بواسطة جديلة موجهة وجديلة منتقلة. يقوم النيوكلياز الداخلي 2 (Ago 2) Argonaute بتحفير فك SIRNA مزدوج. بمجرد ill يتم دمج الجديلة الموجهة في معقد انتقائية التداخل (RNA أثناء إطلاق الجديلة المرسلة. يقوم معقد انتقائية التداخل غلا باستخدام الجديلة الموجهة لإيجاد ال MRNA الذي يتضمن متوالية مكملة تؤدي إلى شق
نيكلوتيدي داخلي endonucleolytic cleavage من MRNA المستهدف. الفيروسات الارتجاعية Retroviruses عبارة عن فيروسات RNA تقوم باستخدام ترانسكريبتاز عكسية reverse transcriptase أثناء دورة التكائر replication cycle الخاصة بها. يشير المصطلح "'فيروس ارتجاعي 6007/0005" إلى فيروس ارتجاعي معروف Ole) 0 الفيروسات الارتجاعية من النوع © ctype c retroviruses مثل فيروس ساركوما فأرية مولوني «(MOMSV) Moloney murine sarcoma virus فيروس ساركوما فأرية هارفي Harvey ((HaMuSV) murine sarcoma virus فيروس ورمي أمي فأري murine mammary (ug yd (MUMTV) tumor virus لوكيميا لقرد جيبون gibbon ape leukemia virus (GalV) فيروس لوكيميا قططي (FLV) feline leukemia virus فيروس سبوما Friend aug spumavirus 5 فيروس خلية جذعية فأري Murine Stem Cell Virus (MSCV) وفيروس ساركوما روس (RSV) Rous Sarcoma Virus تتضمن "الفيروسات
الارتجاعية" وفقا للاختراع أيضا فيروسات لوكيميا خلية T بشرية human T cell leukemia ؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1 و فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2 وعائلة الفيروسات البطيئة للفيروسات الارتجاعية؛ Jie فيروسات نقص المناعة البشري Human Immunodeficiency Viruses فيروس نقص المناعة البشري من gall 1؛ فيروس نقص 5 المناعة البشري من النوع 2 فيروس نقص المناعة في القردة؛ فيروس نقص المناعة في القطط فيروس نقص المناعة في الخيل؛ وغيرها من فئات الفيروسات الارتجاعية. يتم تحويل RNA الجينومي الارتجاعي retroviral genomic في دنا DNA مزدوج الجديلة بواسطة ترانسكريبتاز عكسي. هذه الصورة ال DNA مزدوجة الجديلة التي تكون الفيروس قادرة على الاندماج في كروموسوم chromosome الخلية المصابة؛ بمجرد الدمج؛ سوف تتم 0 الإشارة إليها ب 'طليعة فيروس ".PFOVIFUS تعمل طليعة الفيروس كقالب لبوليمراز RNAI وتقوم بتوجيه التعبير عن جزيء RNAS والذي يقوم بترميز البروتينات البنيوية وإنزيمات مطلوبة لإنتاج جسيمات فيروسية جديدة. في كل طرف من طليعة الفيروس توجد بنيات HIST طرفية طويلة long terminal "repeats أو LTRs’ يشير المصطلح HST طرفي طويل "(LTR) long terminal repeat 5 إلى نطاقات أزواج قاعدة موضوعة عند أطراف DNAs الفيروسية الارتجاعية؛ والتي في سياق المتوالية الطبيعية الخاصة بهاء عبارة عن تكرارات مباشرة وتحتوي على مناطق ذلا + US تقوم تكرارات طرفية طويلة بشكل عام بتوفير وظائف أساسية إلى التعبير عن الجينات الارتجاعية Sls) retroviral genes التعزيز والبدء ومعالجة نسخ gene transcripts (pall ببولي anal ly (polyadenylation عمليات تكاثر فيروسية viral replication تحتوي تكرار طرفي 0 طويل على العديد من الإشارات المنظمة شاملة عناصر تحكم تحويلية transcriptional control elements إشارات معالجة ببولي أدينيل polyadenylation signals ومتواليات مطلوية Sil ودمج الجينوم الفيروسي Lviral genome يتم تقسيم تكرار طرفي طويل الفيروسي في ثلاثة مناطق تسمى R (U3 و5لا. تحتوي المنطقة 3لا على عناصر المحسن والمعزز. المنطقة US عبارة عن المتوالية بين موقع ربط المادة البادئة والمنطقة R وتحتوي على متوالية المعالجة 5 ببولي أدينيل. يتم تجنيح المنطقة R (تكرار) بواسطة المناطق 3لا و5لا. يبدو أن ال تكرار طرفي طويل المكون من المناطق U3 »ا و5لا؛ عند كل من الأطراف 5' و3' للجينوم الفيروسي. في
أحد نماذج الاختراع؛ يتم استبدال المعزز في تكرار طرفي طويل؛ شاملة 5' تكرار طرفي طويل؛ بمعزز غير متجانس. تتضمن أمثلة المعززات غير المتجانسة التي يمكن استخدامهاء lie معزز فيروس تكوين تركيز (Jada ؛ معزز قابل للحث بتترا سيكلين» منطقة تحكم في موقع Osta ومعزز (|-جلوبين»؛ ومعزز فيروس مضخم للخلايا (CMV) cytomegalovirus
يشير المصطلح 'فيروس بطيء" إلى مجموعة (أو جنس) من الفيروسات الارتجاعية التي تؤدي إلى تطوير المرض بشكل بطيء. تتضمن الفيروسات المتضمنة في هذه المجموعة HIV (فيروس نقص المناعة البشري؛ شاملة فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1؛ و فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2)؛ العامل السببي لمتلازمة قصور مناعي بشري human acquired ¢(AIDS) immunodeficiency syndrome ميتة فيزنا «visna-maedi والتي تسبب التهاب
0 الدماغ encephalitis (فيزنا (visna أو التهاب رثوي pneumonia (ميثة (maedi في الخراف»؛ فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي caprine arthritis—encephalitis 5 والذي يسبب قصور مناعي deficiency 1017006 التهاب في المفاصل «arthritis cali دماغي encephalopathy في ماعز؛ فيروس فقر الدم المعدي في الخيول؛ والتي تسبب فقر الدم الانحلالي الناتج عن المناعة الذاتية؛ والتلف الدماغي في الخيول؛ فيروس نقص المناعة
5 في القطط lly تؤدي إلى نقص مناعي في القطط؛ فيروس نقص المناعة في البقرء والتي تؤدي إلى اعتلال العقد الليمفاوية» كثرة الليمفاويات؛ (Sg محتمل نظام عصبي مركزي في الماشية؛ وفيروس نقص المناعة في القردة؛ والتي تؤدي إلى قصور مناعي وتلف دماغي في الكائنات الأساسية الأقل من الإنسان. يتم وصف الأمراض الناتجة بواسطة هذه الفيروسات بمدة حضانة طويلة ومسار ممتد. عادة؛ تقوم الفيروسات بشكل مستتر بإصابة DAY الفردية والبلاعم؛ التي
0 تنتشر منها إلى خلايا أخرى. تقوم فيروس نقص المناعة البشري؛ فيروس نقص المناعة في القطط « و وفيروس نقص المناعة في القردة أيضا بإصابة الخلايا الليمفاوية 7؛ أي؛ خلايا 1.
يشير المصطلح 'منطقة R إلى المنطقة في تكرارات طرفية طويلة فيروسية ارتجاعية تبدأ عند بداية المجموعة الغطائية (أي؛ بداية التحويل) وتنهي مباشرة قبل بداية مسار A المتعدد. يتم تحديد المنطقة R أيضا على أنها محاطة بواسطة المناطق 3لا و5لا. تلعب المنطقة R دورا مهما
5 أثناء التحويل العكسي في السماح بنقل DNA ناشئ من طرف واحد للجينوم إلى آخر.
يشير المصطلح 'معزز/محسن "enhancer/promoter إلى جزء من DNA والتي تحتوي على متواليات قادرة على توفير كل من وظائف معزز ومحسن. مثلاء تحتوي التكرارات الطرفية الطويلة للفيروسات الارتجاعية على كل من وظائف المعزز والمحسن. يمكن أن يكون المحسن/المعزز 'داخلياء" "خارجياء" أو "غير متجانس.” المحسن/المعزز "الداخلي" عبارة عن واحد مرتبط بشكل طبيعي بجين محدد في الجينوم. يتم وضع المحسن//المعزز 'الخارجي"” أو "غير المتجانس" في اصطفاف مع جين بواسطة التعديل الجيني ol) التقنيات البيولوجية الجزيئية Cus (Molecular biological techniques .يتم توجيه تحويل هذا الجين بواسطة
المحسن/المعزز المرتبط. ما لم يتم تحديد غير ذلك؛ كل المصطلحات التقنية المستخدمة هنا لها نفس المعنى 0 المفهوم عموما بواسطة أي من ذو الخبرة العادية في المجال الذي ينتمي إليه الاختراع. تم توضيح الطرق والمواد هنا للاستخدام في الاختراع الحالي؛ يمكن أيضا استخدام طرق أخرى مناسبة ومواد معروفة في المجال. هذه المواد والطرق والأمثلة هي للتوضيح فقط ولا يقصد بها أن تكون مقيدة. تم دمج كل المنشورات وطلبات براءات الاختراع وبراءات الاختراع وغيرها من المراجع الأخرى المذكورة هنا بواسطة الإشارة إليها كليا. في dlls التضاد؛ سوف يكون الوصف الحالي؛ شاملا 5 التعريفات؛ هو الحاكم. سوف تكون هناك خواص ومزايا (AT للاختراع واضحة من الوصف
التفصيلي والأشكال ddl) ومن عناصر الحماية.
شرح مختصر للرسومات الشكل 1 عبارة عن مخطط بياني لاثنين من نماذج RNA دقيق ل 8011178 تخليقي المكشوف عنه: أوليجونيكلوتيدات .BCL11A miR2 4 BCL11A miR1 oligonucleotides يتم توليد البنية الجذعية/الحلقية stem/loop structure بواسطة المتواليات المكملة ل متواليات تستهدف /86111 (في قواعد نيكلوتيد لحالة علوية عريضة) في الأوليجونيكلوتيدات. المتواليات Al تستهدف /80111 عبارة عن ag .80111/5 oa ذلك .يتم استنساخ Lull الجذعية/الحلقية في خلفية miR-223/miR-30 (خلفية RNA دقيقة). بعد ذلك يتم استنساخ بنية Jel) mIRNA/ShRNA في قالب معزز فيروس تكوين تركيز طحالي/ منطقة تحكم
موضعي / معزز JB للحث بتترا سيكلين يحتوي على ناقل فيروسي بطيء ذات التنشيط -5617 (SIN) inactivating يحتوي على مبلغ جيني انتقالي (Venus) الشكل 2 ple عن مخطط بياني تخطيطي لطلائع فيروس لناقل فيروسي بطيء مع معززات فيروس تكوين تركيز طحالي؛ تترا سيكلين و منطقة تحكم موضعي. الشكل 3 عبارة عن صورة لاثنين من المخططات القضيبية التي تبين أن فيروس تكوين تركيز طحالي- إل 3 ا يقوم باستبعاد ,8011178 بفاعلية ويحفز التعبير عن (©-جلويين .£y—globin الشكل 4 عبارة عن صورة لاثنين من المخططات القضيبية التي تصور أن و منطقة تحكم موضعي/ تترا سيكلين- LV باستبعاد 801-1178 بفاعلية وتقوم بحث التعبير عن (8©-جلويين. الشكل 5 عبارة عن صورة لمخطط ضوئية وصور تبين أن HSC +0034 المحولة تقوم بالتمايز خارج الكائن الحي في كريات الدم الحمراء وتعبر عن HOF الشكل 6 عبارة عن صورة لمخططات تشتيت تصور CD34+ HSCs محولة ب منطقة تحكم موضعي- LV من مرضى مع مرض الخلية المنجلية المزروعة في OE ان اس جي .NSG 15 الشكل 7 She عن صورة لصورة ضوئية دقيقة وصور تبين دراسة السمية القوية ل 8011178 في التطور الليمفومي. تبين الأشكال 28-18 مراقبة وتقييم 801117 تستهدف ShRNAs في أنظمة التعبير عن Il yg pol lll ا0م. الشكل 8أ. تمثيل تخطيطي لبوليمراز pol 111) RNA ١١١ معزز UG جانب أيسر) و ShRNA 0 يعمل بواسطة بوليمراز Il) RNA ١١ ا0م؛ معزز /57]1؛ جانب أيمن) وعبوة ShRNA مدمجة في (01408)223؛ على التوالي. تم تصميم كل من عبوات التعبير في نواقل فيروسية بطيئة vectors 16017//015. تمثل المريعات المختلفة الجديلة المرسلة «passenger strand الجديلة الموجهة guide strand والبنية الحلقية loop structure كما هو مشار إليه. يتم تمثيل البنية المتراصة MIRNA223 بمريع ذو خط منقوط. تم التعبير عن متواليات shRNA المختلفة 5 التي تستهدف 8611/8 في هذه البنيتين الأساسيتين وتم تقييمها لفعالية الاستبعاد.
الشكل 8ب. المراقبة عالية الخرج للعديد من متواليات shRNA التي تستهدف العديد من المناطق في mRNA 8011178 (متواليات صورة إسوية مشتركة ب اكس ال/ ال XL/L متواليات ترميز XL فريدة و4ا1 لا-'3 من صورة XL إسوية؛ كما هو مشار إليه) لفعالية الاستبعاد باستخدام نواقل فيروسية بطيئة قائمة على ١١| ا00. تم استخدام كل من حث 7ع بواسطة QPCR وحث مبلغ mCherry بواسطة dds تصنيف منشطة بالتألق ag) FACS لحث إيبسلون-١ epsilon-y في سلالة خلية مبلغة (reporter cell line كقراءة وظيفية لاستبعاد 8061117. تم عمل مخطط للتعبير المعاير ل MRNA 7ع نسبة إلى تحكم غير مستهدف على المحور لا ومتوسط شدة التألق (MFI) mean florescence intensity للتعبير عن mCherry نسبة إلى
تحكم غير محول على المحور #. تم تعليم ال 11 ShRNAS التي تم اختبارها بواسطة دوائر.
الأشكال 8ج و8د. مقارنة فعالية استبعاد ShRNAS مختارة في أنظمة قائمة على أساس pol ١١١ واا ا00. تم تحويل خلايا حمراء فأرية (MEL) murine erythroleukemia مع ناقل LKO أو مع ناقل تعبير ال اي جي او LEGO عن ShRNAs المشار Led) وتم اختيار الخلايا المحولة Ll في وجود بيوروميسين (LKO) puromycin أو مصنفة للتعبير عن Venus (LEGO) وقد تمت الإشارة سلفا إلى MRD shRNA بواسطة )( .Sankaran et al. تم
5 توضيح مستويات بروتين 8061117 (الشكل 8ج) بواسطة مخطط مناعي مع 8]-أكتين B-actin كعينة ضابطة. تبين XL وا موضع كل شكل أيزومري ل بروتين 86111/8. (الشكل 8د) تم تحليل شدة النطاق المستخدمة باستخدام برنامج Amaged
الشكل 8ه. تم قياس حث طية لتعبير معاير عن 8-7 مقارنة بعينة ضابطة غير مستهدفة بواسطة .qPCR تم استخدام WDA حمراء فأرية محولة ب ShRNA غير مستهدف وتم ضبط
0 اتعبير إلى 1. تمثل البيانات متوسط + SD من تجربة مثالية لثلاثة من التجارب المستقلة التي تم تنفيذها في نسخ ثلاثية. * 0.05<0.؛ >***P «0.01 >**P 0.001.
الأشكال 9أ-9و عبارة عن بيانات تم جمعها من تحليل تتابع RNA صغير lly تكشف عن المعالجة التمايزية بين نسخ pol HI في مقابل pol ١١ الأشكال 19 و9ب. تم عزل RNA الكلي من خلايا حمراء فأرية محولة أو مصنفة أو
5 مختارة بواسطة بيوروميسين pUrOMYCIN الذي يعبر عن أي من 00141 أو shRNA 04. بعد
ذلك تم إخضاع RNA إلى RNA عميقة المتوالية. تم تمثيل متوالية توجيه نهائية dallas ومتوالية
جديلة منتقلة تم تحويلها من (الشكل 19( (LKO) pol Il أو (الشكل 9( من (LEGO) pol ١١ على المحور # وتم تخطيط تناظر عدد القراءات لكل مليون قراءة كليا لكل جديلة على المحور لا. الأشكال 9ج-9و. تم تخطيط متواليات الجدائل الموجهة المختلفة المعالجة J 01:41 المحولة من (الشكل 9ج) معزز !اا pol أو (الشكل 9د) معزز pol ١١ على المحور لا مع عدد القراءات الكلية التي تم تخطيطها على المحور *. يتم تخطيط متوالية أنواع الجديلة الموجهة المختلفة المعالجة من 4© محولة من (الشكل 9ه) معزز pol HI أو (الشكل 9و) معزز pol ١١ على المحور لا مع عدد القراءات الكلية على المحور *. تبين الأشكال 310-110 أن تعديل متواليات ShRNA تؤدي إلى استبعاد متزايد وتوجيه محسن في مقابل نسبة الجديلة المنتقلة. الشكل 10ا. تم تعديل shRNAs; miR1 4© بحيث يتم حذف أربعة من 5" قواعد وتمت إضافة ©6064 على الطرف 3' لإعطاء ShRNA معدل يسمى 00141 .C4G5 5 G5 الشكل 10ب. مقارنة فعالية استبعاد متواليات ShRNA معدلة وأساسية. تم تحويل خلايا حمراء فأرية مع LEGO للتعبير عن ShRNAS المشار إليها عبر معزز POI ١١ وتم تصنيف الخلايا المحولة للتعبير عن 7/80015. تم قياس مستويات بروتين 8011178 بواسطة مخطط 5 مناعي مع 8-أكتين كحمل مقارن. XL وتشير .1 إلى موضع هذه الأشكال الأيزومرية لبروتين .BCL11A الشكل 10ج. تم تحليل شدة نطاق مخطط مناعي باستخدام برنامج Image الشكل 10د. حث طية تعبير معاير مقارنة بعينة ضابطة غير مستهدفة ey بواسطة متواليات ShRNA معدلة/غير معدلة تم قياسها بواسطة (PCR تمثل البيانات متوسط + SD 20 من تجرية مثالية لثلاثة من التجارب المستقلة التي تم تنفيذها في نسخ ثلاثية تبين نتائج مشابهة. >**P (0.05>*P 0.01. تبين الأشكال 211-111 تحليل متوالية RNA لأربعة أزواج قاعدة ShRNA معدلة تبين معالجة جيدة. الشكل 111. تم عزل RNA صغير (AS من حمراء فأرية مصنف ومحول الذي يعبر عن 5 0141 معدل و5هل98 C4 معدلة وتم عمل متواليتها. تم تخطيط توزيع تردد أنواع جديلة
موجهة معالجة من 10141 معدل MIR1I-GS) و0465) محول من معزز pol ١١ على المحور لا مع نسبة القراءات لكل مليون قراءة كلية مخططة على المحور X الأشكال 11ب و11ج. تم عرض متوالية لأنواع الجديلة الموجهة المختلفة المعالجة ل 0141-5 و04-65 على المحور لا وتم توضيح تردد القراءات على المحور X 5 الشكل 112. تقوم مرشحات مراقبة ShRNA التي BOLI TAG باستخدام ناقل بي ال كيه او 0كاام. الشكل 12ب. تركيبة متوالية جديلة موجهة وتوزيع في 60ا01. مع بنيات PLKO التي دائما ما تقوم بعمل إزاحة عند الطرف 5 والتي يمكن أن تكون ناتجة عن مد متوالية T غنية عند الطرف 73 ال T's المضافة عبارة عن gia من متوالية إنهاء II ا00. هذه الإزاحة في متوالية ShRNA 7 0 ناضجة تشير إلى أنه أثناء المعالجة التي يتم التوسط فيها بواسطة Dicer يكون دور العد 3” مسيطراء بما يعني أن شق SARNA عبارة عن 2104 الذي يتم بدؤه من الطرف 3”. وهذا يؤدي إلى إزاحة 3 أو 4 زوج قاعدة عند الطرف 5" Lady في منطقة بذرة مزاحة بشكل مثالي (قواعد 7-2 من الجديلة الموجهة) وهي خاصة بالتعرف على الهدف. الشكل 13. تركيبة متوالية جديلة موجهة وتوزيع في LEGO يقوم تحليل متوالية RNA 5 صغير العميقة بالكشف عن معالجة تمايزة بين نسخ pol HI في مقابل II ا00. مع بنيات lego لم تكن هناك إزاحة عند الطرف 5" وتتم dallas الجديلة الموجهة بواسطة Dicer والذي يؤدي إلى المنتج المتوقع. بالتالي تختلف الجديلة الموجهة النهائية بين بنيات تعمل بواسطة pol ١١و pol ١١١ الشكل 14. تصميم ShRNAS جديدة لمحاكاة جدائل موجهة ناضجة تم إنتاجها في ناقل .pLKO تم تعديل كل ShRNAs بحيث يتم حذف أربعة قواعد على 5 وتمت إضافة GCGC 0 على الطرف 3 لإعطاء shRNA معدل سمى MiR1GS 365 565 ذو «B11GS 5001265؛ 5081165 50565؛ 500465. مع دمج هذه الإزاحة؛ تمت ملاحظة التحسن المميز مع 365ع؛ 0865 و0465 المتعلقة بحث استبعاد 806011174 وايبسلون-جاما .€psilon—gamma تقوم +7000 بتمثيل موضع إزاحة إطار 4-زوج قاعدة (bP) يؤدي إلى 4-قواعد مزالة من 100141 غير معدل» (E3 85؛ «D8 811؛ 50012 (أيضا المشار إليها ب 012)» 50811؛ 5055 Lad) المشار إليها ب «(AS و5004 (أيضا المشار إليها ب (C4
الشكل 14ب. تركيبة متوالية جديلة موجهة وتوزيع في LEGO معدل. تبين ShRNAS معدلة لمتوالية RNA عميقة وجود معالجة جيدة مع إزاحة 4 زوج قاعدة؛ lly تشير إلى أنه بواسطة إدخال الإزاحة كنا قادرين على محاكاة منتج نواقل PLKO بشكل مثالي. حيث تم استخدام نواقل pLKO لمراقبة ShRNAS الفعالة؛ يقوم هذا التعديل بمحاكاة متوالية توجيه المنتج الناضج
المحدد عند نقل قالب ShRNA في أساسات تعمل بواسطة Pol ١١
الشكل 15. مقارنة استبعاد 8061117 مع متواليات توجيه معدلة. مقارنة فعالية استبعاد متواليات ShRNA معدلة وأساسية. يبين مخطط وسترن التعبير عن 8611178 (الأشكال الأيزومرية Lg XL صورة علوية). تشير الدوائر الحمراء إلى Cus ShRNAS يوجد استبعاد 801118 محسن عند إدخال إزاحة 4 زوج قاعدة. الصورة السغلية: تمت مقارنة حث طية تعبير
0 7ع معاير بواسطة متواليات ShRNA معدلة/غير معدلة بتحكم غير مستهدف كما هو مقاس بواسطة qPCR
الشكل 16. مقارنة MIR تعبير مع متواليات توجيه معدلة. بشكل متوافق مع BL في فعالية استبعاد وحث إيبسلون-لاء؛ كان التعبير عن الجديلة الموجهة عاليا (والتي تؤدي إلى زيادة في فعالية الاستبعاد) عند تنفيذ مخطط نورثرن في بنيات معدلة مقارنة بتلك غير المعدلة خصوصا
5 مع E3G5 0865 و6465.
الشكل 17. فعالية استبعاد 861117 وحث (ع مع نواقل LEGO مقارنة فعالية استبعاد ShRNAS مختارة في أنظمة قائمة على أساس pLKO pol Il واا .pLEGO pol تم تحويل خلايا حمراء فأرية مع ShRNAS تمت الإشارة إليها إما في ناقل pLKO أو مع ناقل PLEGO وتم اختيارالخلايا المحولة إما في وجود بيوروميسين (PLKO) puromycin أو المصنفة للتعبير
0 عن Venus (60ا0). تم قياس مستويات بروتين 8011178 بواسطة مخطط مناعي Bae أكتين كعينة ضابطة. يتم قياس حث طية 8-7 معايرة مقارنة بعينة ضابطة غير مستهدفة بواسطة .gPCR تم استخدام خلايا حمراء فأرية محولة ب ShRNA غير مستهدف كعينات ضابطة سلبية. تمتع dal) الإطار بأثر قوي على كل من فعالية استبعاد وحث (8. تتضمن ShRNAS التي تستهدف صورة XL إسوية منفردة أثر قوي على حث gy تمثل البيانات متوسط + اس دي50 من ثلاثة تجارب مستقلة؛ تم تنفيذ كل منها في نسخ ثلاثية. * 0.05<0.
الشكل 18 يبين المعالجة المتمايزة في نواقل shRNA ١١١-ا0م ونواقل ShRNA مهيأة microRNA als. الحاوم. الأشكال 219-119 تبين مراقبة وتقييم 861-117 تستهدف ShRNAS في أنظمة التعبير عن Il yg pol lll ا0م. الشكل 19أ. التمثيل التخطيطي 1 LKO-U6-BCL11A-shRNA (جانب أيسر) و4 LEGO-SFFV-BCL11A-shRNAmIR (جانب أيمن). تم تصميم كل من عبوات التعبير في نواقل فيروسية بطيئة كما هو موضح في المواد والطرق. تمثل المريعات ذات اللون الرمادي الفاتح الجديلة الحسية؛ Jia المريعات البيضاء الجديلة المضادة للحس؛ تمثل المريعات الرمادية الداكنة البنية الحلقية وتتم الإشارة إلى البنية المتراصة MIRNA223 بواسطة خط منقوط. تم
0 توضيح البنيات الدبوسية أدناه. تم التعبير عن متواليات 50518 المختلفة التي تستهدف
801-118 في هذين الأساسين وتم التقييم من حيث فعالية الاستبعاد. الشكل 19ب. المراقبة عالية الإنتاجية لمتواليات ShRNA المتعددة التي تستهدف mRNA 801118 لفعالية استبعاد باستخدام نواقل فيروسية بطيئة قائمة على ١١١ ا00. تم استخدام كل من حث Hbb-y MRNA بواسطة qRT-PCR وحث مبلغ mCherry بواسطة
FACS 5 (كبديل لحث 7ع في سلالة خلية مبلغة) كقراءة وظيفية لاستبعاد /80111. يتم تخطيط التعبير المعاير ل Hbb-y MRNA نسبة إلى due ضابطة غير مستهدفة على المحور لا وحث طية التعبير عن mMCherry (بواسطة شدة (alll متوسط شدة التألق) نسبة إلى التحكم غير المحول على المحور #. تم أيضا اختبار أفضل ثمانية ShRNAS في الأداء من حيث الأداء من المراقبة وتمت تسميتها من 1 إلى 8.
20 الشكل 19ج. مقارنة فعالية استبعاد 5050/5 مختارة في أنظمة قائمة على أساس pol -(6لا) ١١ (SFFV), III ا0م. تم تحويل خلايا حمراء فأرية مع 6لا- das) علوية) أو مع —SFFV (الصورة السفلية) نواقل للتعبير عن ShRNAS المشار إليها وتم اختيارالخلايا المحولة إما في وجود بيوروميسين )1 (POI أو مصنفة للتعبير عن Il) Venus ا00). تم توضيح مستويات بروتين 801117 بواسطة مخطط مناعي مع ]-أكتين كعينة ضابطة. تشير XL وا
5 على يسار الصورة إلى موضع كل شكل أيزومري لبروتين 801117.
الشكل 19د. حث طية التعبير المعاير عن مقارنة Hbb-y بعينة ضابطة غير مستهدفة مقاسة بواسطة 0004. تم ضبط تعبير في خلايا حمراء فأرية محولة (غير مستهدفة NT -000 shRNA J (targeting على 1. تقوم القضبان السوداء بتمثيل التعبير النسبي بواسطة ShRNAs تعمل بواسطة معزز 6لا وتمثل القضبان البيضاء ShRNAS تعمل بواسطة معزز فيروس تكوين تركيز Jab تمثل البيانات متوسط + SD من تجربة مثالية لثلاثة تجارب مستقلة تم تنفيذها في نسخ ثلاثية. * .0.05>P تبين الأشكال 20 و20ب تحليل تتابع RNA صغير الذي يكشف المعالجة التممايزة بين تسخ pol ١١١ في مقابل pol ١١ قامت نتائج تتابع RNA صغيرة لخلايا حمراء فأرية المحولة مع SFFV-shRNAmIRs ; U6-shRNAs 1« 2 3 4« 7« أو 8. تمت محاذاة متواليات RNA 0 مع الإشارة المناظرة لمتوالية جديلة موجهة؛ مبينة عند الجزء العلوي من كل صورة بخط عريض والمتواليات الجناحية باللون الرمادي. يتم تخطيط الصور المغايرة المختلفة من الجدائل الموجهة التي تم إنتاجها من (الشكل 120( U6-shRNAs أى (الشكل 20ب) SFFV-shRNAmMIRs على المحور لا. تمت الإشارة إلى كل نسب المساهمة النسبية لكل صورة مغايرة على المحور X المحسوية بناء على العدد الكلي للقراءات التي تتوافق مع متوالية 5041/8 المرجعية. الأشكال 121-121 تبين تعديل متواليات ShRNA تؤدي إلى sal) الاستبعاد والتوجيه المحسن في مقابل نسبة جديلة منتقلة في خلايا حمراء فأرية. الشكل 21أ. تم تعديل SFFV-shRNAMIRs بواسطة حذف أول day قواعد من متوالية التوجيه وإضافة ©6066 إلى الطرف 3" shRNA) معدل) الشكل 21ب. مقارنة فعالية استبعاد متواليات ShRNAMIR معدلة وأساسية التي يتم 0 التعبير lie من معزز SFFV-pol ١١ في خلايا حمراء فأرية. تم قياس مستويات بروتين 801118 في خلايا FACS مصنفة محولة بواسطة مخطط مناعي مع 8]-أكتين كحمل مقارن. تشير XL وا على الجزءِ الأيسر من الصورة العلوية إلى موضع هذه الأشكال الأيزومرية لبروتين .BCL11A ناقل معزز ¢Plll: pol ١١١ ناقل معزز pol ١١ :1ا©؛ ناقل معزز PIIM: pol ١١ يحتوي على متواليات ShRNAMIR معدلة.
الشكل 21ج. حث طية لمقارنة Hob-y بالعينة الضابطة غير المستهدفة بواسطة متواليات ShARNAMIR غير معدلة (أعمدة بيضاء) ومعدلة (أعمدة مظللة) مقاسة بواسطة qRT- Jia .PCR البيانات متوسط + 50. © **< 0.01. الشكل 21د. قام تحليل بقعة نورثرن ل 8ل]4» كلي مستخلص من خلايا محولة مع العديد من .ShRNAMIRs 3 shRNAS تم استخدام المسابير (2001) المكملة للجدائل الموجهة والمنتقلة من المواضع 1 إلى 20 من ShRNAMIRs 3 ShRNAS لقياس وفرة RNAS صغيرة معالجة. تم استخدام مسبار مكمل ل RNA 55 كعينة ضابطة داخلية لتحديد تحميل RNA يحتوي ناقل معزز pol ١١ :11ا©؛ ناقل معزز Ji Pll: pol ١١ معزز PIM: pol ١١ على متواليات ShARNAMIR معدلة.
الشكل 121. تقوم نتائج متوالية RNA لمجموعات متجانسة من خلايا حمراء فأرية محولة تقوم بالتعبير عن ShRNAL 2« 3< 4« 7 أو 8. تمت محاذاة متواليات هذه ال RNAs مع متوالية جديلة موجهة مناظرة مبينة عند الجزءِ العلوي من كل صورة. تم عرض أنواع جديلة موجهة لمتواليات مختلفة على المحور لا والتردد بنسبة قراءات متحاذية على المحور X
تبين الأشكال 222-122 تؤدي ShRNAMIRS معدلة إلى فعالية استبعاد 861117
5 وحث جاما جلوبين gamma globin متزايدة في خلايا حمراء مشتقة من +010034 بشري.
الشكل 22أ. تم اختيار خلايا +6034 محولة مع نواقل تعبير pol Hl أو pol ١١ عن ShRNAS مختلفة مع وبدون تعديل إما في وجود بيوروميسين (POI Il) أو مصنفة للتعبير عن pol II) Venus واا pol معدلة). تم قياس التعبير عن 8011178 بواسطة مخطط مناعي مع م-أكتين 8-8000 كحمل مقارن في اليوم 11 من التمايز.
الشكل 22ب. تم تحديد حث /(-جلوبين 910510- MRNA في اليوم 18 من التمايز بواسطة 087-0014. تمثل البياناتتسبة /(-جلوبين لخرج موقع ] الكلي y) + م]-جلوبين + 7 (B-globin ل pol ١١١ (الأعمدة السوداء)؛ pol ١١ (الأعمدة البيضاء)؛ واا pol المعدلة (الأعمدة الرمادية). * م0.05>0؛ * * * م>0.001.
الشكل 22ج. تم تقييم القياس والتحليل الإحصائي لمرقمات التمايز الحمراء (0071؛ (GPA 5 والاستئصال بواسطة التدفق الخلوي. :CTRL نواقل SFFV-shRNAmMIRNT ر//اع5
الضابطة؛ نواقل pol ١١١ :|١|©؛ نواقل ¢Pll: pol ١١ نواقل PIM: pol ١١ تحتوي على متواليات ShRNAMIR معدلة. تمثل البيانات متوسط + SD من ثلاثة تجارب مستقلة. * * * م0.001>0. الشكل 22د. تم قياس هيموجلويين F لنواتج تحليل الخلية بواسطة كروماتوجراف سائل Je الأداء .في اليوم 18 من التمايز. يشير السهم إلى قمم HOF وتم توضيح نسبة HDF 5 لهيموجلويين كلي تحت الكروماتوجراف. الشكل 22ه. قامت صورة علاقة التعبير عن (-جلويين MRNA بواسطة qRT-PCR في مقابل 1107 بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء high performance liquid (HPLC) chromatography تمثل الدوائر السوداء نواقل MII ا00؛ تمثل الدوائر المفتوحة والرمادية pol ١١ أو ShRNAMIRs معدلة؛ على التوالي. تم توضيح معامل aD (22) لكل 0 البيانات. الأشكال 23-123ط تبين منع الأثر السلبي لاستبعاد 801117 على خلايا جذعية مكونة للدم في الكائن الحي بواسطة تقييد التعبير بالخلايا الحمراء .erythroid cells الشكل 123. تم تحويل ADL السلبية لخلايا نخاع العظم المعزولة من فثران B-YAC (CD45.2) خارج الكائن الحي مع نواقل LEGO التي تعبر عن 801118 تستهدف *shRNAmMIR 5 أو عينة ناقل ضابطة غير مستهدفة (SFF-ShRNAMIRNT) والمزروعة في مستقبلات Boyd تم تعريضها للإشعاع بشكل قاتل (00045.1). تمت زراعة خلايا ضابطة غير محولة كعينة ضابطة. تم تنفيذ تحليل تطعيم بعد 4 8 و12 أسبوع من الزراعة الانتقالية في الدم المحيط (PB) peripheral blood ونخاع العظم (BM) bone marrow على التوالي. (4-0 فأر لكل مجموعة) 20 الشكل 23ب. تم تحديد gia الخلايا المعدلة بالجين (خلايا (+Venus في هذه dll بعد 4» 8 و12 أسبوع الزراعة الانتقالية في الدم المحيط ونخاع العظم. الشكل 23ج. تم تنفيذ الزرائع التنافسية باستخدام 0045.1 5 CD45.2 الخلايا المانحة محولة مع النواقل المشار إليها والمزروعة في Oi زيجوت غير متجانس 6045.1/2 (لوحات علوية). بشكل بديل تم استخدام بروتين متألق أزرق (BFP) blue fluorescent protein يرمز اناقل المحايد (فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق) لتحديد لتحديد المجموعة المنافسة في CD45.1 mile في وضع مستقبل 0045.2 (الصور السفلى). تم توضيح
المخططات المنقوطة لمجموعات مخلوطة مختلفة مستخدمة للزراعة الانتقالية بعد abl ADE من التحويل. تتم الإشارة إلى الناقلين المتنافسين فوق كل صورة؛ يشير الأول إلى مجموعات 2 أو فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق محولة؛ على التوالي. الشكل 23د. تم تحليل مساهمة الخلايا المعدلة بالجين في فئران تمت إعادة تجميعها بشكل مجمع عند الأسابيع 4 و8 بعد الزراعة الانتقالية في الدم المحيط أو عند الأسبوع 12 في نخاع العظم والطحال (Spl) spleen تم توضيح المساهمة النسبية للخلايا المعدلة gene (pall modified cells محولة مع الناقلين المتنافسين. قام الناقل الأول المذكور بالتحكم في الخرج المكون للدم. تمثل كل نقطة فأر مستقبل فردي. الشكل 23ه. مقارنة مزدوجة لجزء خلية 8 من نخاع العظم في gill المحول للخلايا بين 0 نواقل تقوم باستهداف 8011178 في مقابل النواقل الضابطة SFF-ShRNAMIRNT) و فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق؛ الصورة اليسرى). بشكل مشابه؛ تم تحليل محتوى LSK في أجزاء خلية محولة transduced cell تمثل كل نقطة مستقبل فردي. تشير * و** إلى قيم <p 0.05 و0.01؛ على التوالي. الشكل 23و. تهيئة ناقل LOR-ShRNAMIR المستخدم لالتعبير SEY) عن السلالة 5 الحمراء (التفاصيل في النص). الشكل 23ز. تم تحليل حالة التعبير في الكائن الحي لناقل منطقة تحكم موضعي في العديد من السلالات المكونة للدم بعد 12 أسبوع بعد الزراعة الانتقالية. تمت معايرة نسب خلايا 65+ في كل فأر مع الخلايا الحمراء CD71+/Terl19+ (4-0). الشكل 23ح. تم تنفيذ تجربة زراعة انتقالية تنافسية كما هو موضح في ج ود باستخدام 0 نواقل التعبير منطقة تحكم موضعي أو فيروس تكوين تركيز طحالي عن .ShRNAMIR® تمثل كل نقطة مستقبل فردي. J<al 23ط. تم WA (hes الدم المحيط +6034 المنقولة مع LCR- <shRNAmIR* 3 و8 أو ناقل SFFV-GFP كاذب وتم إخضاعها لتمياز أحمر في المعمل. في اليوم 7 بعد التحويل تم تقييم نشاط المعزز لنواقل SFFV-GFP ومنطقة تحكم موضعي في 5 مجموعة ثانوية ches مختلفة. تم توضيح مخططات بيانية لتدفق تمثيلي. أعمدة الخطأ في كل الأشكال = 50. التحليل الإحصائي: الاختبار ].
الأشكال 524-124 تبين استبعاد 801117 الانتقائي للسلالة وحث جاما جلوبين بواسطة ShRNAMIRSs معدلة. الشكل 124. تم تصنيف HSPCs +0034 محولة ب LCR-shRNAMIR 3 8 أو ناقل SFFV-GFP كاذب ب FACS لمبلغ متألق تعبير وتم قياس التعبير عن 861118 بواسطة مخطط مناعي مع ]-أكتين كحمل مقارن في اليوم 11 من التمايز. الشكل 24ب. تم تحديد حث /(-جلويين MRNA في اليوم 18 من التمايز بواسطة qRT-PCR تمثل البيانات نسبة 7/(+8) جلوبين. الشكل 24ج. القياس والتحليل الإحصائي لمرقمات التمايز الحمراء erythroid (0071؛ (GpA والاستتصال بواسطة تحليل التدفق السيتومتري .flow cytometric analysis قام :CTRL 0 ناقل SFFV-GFP ضابط؛ :LCRM 50520145 معدلة المبين في الشكل 123 بالتعبير عبر معزز منطقة تحكم موضعي. تمثل البيانات متوسط + SD من ثلاثة تجارب مستقلة. الشكل 24د. تم قياس مستوى HOF لنواتج تحليل الخلية بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء .في اليوم 18 من التمايز. تشير الأسهم إلى قمم HOF وتم توضيح نسبة HOF لهيموجلوبين الكلي تحت الكروماتوجراف. الشكل 24ه. صورة علاقة حث /-جلويين بواسطة qRT-PCR في مقابل HbF بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . تشير أعمدة الخطأ إلى + 50 من ثلاثة تجارب الشكل 24و. تم تحويل نخاع العظم HSPCs +6034 مع LCR-shRNAMIR3 أو غير مستهدفة والمزروعة في فئران NSG تم تعريضها للإشعاع بشكل أقل من القتل 3=n) لكل 0 مجموعة). تم استخدام الخلايا غير المحولة كعينة ضابطة. بعد 14 أسبوع تم CD34 Wa Jie من نخاع العظم للحيوانات المزروعة وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل لمدة 14 يوم. تم تقييم التعبير عن Guglay و]-جلويين في خلايا مصنفة للتعبير عن مبلغ Venus الشكل 25 يبين التتابع العميق ل 247 من منتجات TRC ShRNA التي تمت معالجتها في daa) من سلالات الخلايا. الشكل 26 يبين حالة التعبير في الكائن الحي عن ناقل .LCR-ShRNAMIR
Jal 127 عبارة عن مخطط وسترن لخلايا shes متمايزة في المعمل مشتقة من خلايا 4+ محولة من مانحين أصحاء تبين 801117 الأشكال الأيزومرية (XL L) وم-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 801117 XL تم توضيح VON المحدد بواسطة DNA PCR تحت كل خط.
الشكل 27ب يبين قياس استبعاد BCL11A Error bars في خلايا حمراء. كانت البيانات المشتق من مخططات وسترن كما هو مبين في الشكل 127 تقوم البيانات بتلخيص ثلاثة تجارب مستقلة استخدام WA من mile واحد. (أعمدة خطأ: (SD
الشكل 27ج يبين حث جاما جلويين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة 41-0014 wie (HDF) hemoglobin cla sans بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . (أعمدة 0 خطأ: (SD الشكل 28 يبين حث جاما جلوبين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة RT-PCR كان قياس كمية حث lala جلويين في الخلايا الحمراء هو قياس استبعاد 801117 في الخلايا في الكائن الحي. أعمدة الخطاأً: SD تم توضيح البيانات من ثلاثة حيوانات مزروعة لكل مجموعة. الشكل 129 يبين مخططات وسترن التي تبين ل 861117 (صور 1 XLy أيزومرية) و]-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 81011/8-41. تمثل كل صورة (المرقمة 6-1 تحت الخط) تجرية مستقلة باستخدام خلايا من مانح واحد. الشكل 29ب يبين قياس استبعاد 8011178 في خلايا حمراء. البيانات مشتقة من مخططات وسترن المبينة في الشكل 29ا. (عمود خطأً: (SD 20 الشكل 29ج يبين حث HE الناتج بواسطة كروماتوجراف Bile عالي الأداء . (أعمدة خطأً: (SD الشكل 30 يبين المتواليات المستخدمة في كل من أساسات فيروس تكوين تركيز طحالي ومنطقة تحكم موضعي لاستبعاد 801117 في خلايا حمراء متمايزة ب +0034. الشكل 31 يبين مخططات وسترن لاستبعاد 8611178 في WA حمراء متمايزة ب .CD34+ 5
الوصف التفصيلي: يقوم الكشف الموضح هناء جزئياء على أساس تطوير نواقل علاج جيني فيروسية بطيئة تعبر انتقائيا عن shRNA تستهدف /80111 في ذرية WIA جذعية مكونة للدم hematopoietic stem cells (150). بالتالي» يتضمن الكشف طرق جديدة لتنظيم التعبير عن /(-جلويين في خلايا حمراء. بشكل أكثر Juans يمكن أن يتم تضمين هذه النشاطات في طرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين؛ شاملة مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا؛ بواسطة حث 7(-جلويين عبر تثبيط منتج جين 80111/8. في نماذج معينة؛ تم توفير نواقل علاج جيني فيروسية بطيئة تعبر انتقائيا عن shRNA تستهدف BCLIIA في ذريات خلية جذعية مكونة للدم؛ خلايا أساسية مكونة pall أو خلايا Leds أخرى مثل 0 خلايا جنينية .embryonic cells يتضمن الهيموجلوبين الناضج الطبيعي Normal adult hemoglobin أربعة بروتينات جلوبين» اثنين منها عبارة عن بروتينات alpha (a) proteins (a) Wl واثنين منها عبارة عن بروتينات بيتا beta (B) proteins (B) أثناء التطور الجنيني الثديي؛ تحديدا في pid) ¢ يقوم الجنين بإنتاج هيموجلوبين جنيني؛ والذي يتضمن اثنين من بروتينات جاما (()-جلويين gamma (y)-globin proteins 5 بدلا من اثنين من بروتينات ]-جلويين .f3 —globin proteins عند نقطة معينة أثناء التطور الجنيني؛ يتم تبديل الجلوبين الجينيني عند هذه النقطة تتبدل كريات الدم الحمراء في التبدل الجنيني من سيطرة 7-جلويين إلى سيطرة م]-جلويين. يبدأ التبديل التطوري من إنتاج هيموجلوبين جنيني مسيطر أو HBF (0272) إلى إنتاج الهيموجلويين الناضج أو HOA (0202) عند حوالي 28 إلى 34 أسبوع من الحمل ويستمر بشكل قصير بعد الولادة حتى يكون HDA 0 مسيطرا. هذا الاستبدال يؤدي إلى بشكل أساسي من استنساخ المنخفض لجينات (-جلويين والنسخ الزائد لجينات ]|-جلويين. بشكل متوسط» يحتوي دم الشخص البالغ الطبيعي فقط على حوالي 72 (HBF على الرغم من أن مستويات HBF المتبقية لها اختلاف يزيد على 20 طية في البالغين الأصحاء ))2001( 38:367-73 .(Atweh, Semin.
Hematol. تتضمن أمراض الهيموجلوبين عدد من حالات الأنيميا ذات الأصل الجيني حيث يكون 5 هناك zl) منخفض و/أو تدمير متزايد (انحلال الدم) لخلايا الدم الحمراء red blood cells
ay (RBCs) تتضمن Lad عيوب dws تؤدي إلى إنتاج مركبات الهيموجلويين hemoglobins غير الطبيعية مع قدرة ضعيفة متزامنة على الحفاظ على تركيز الأوكسيجين. تتضمن بعض هذه الاضطرابات فشل إنتاج Gustaf الطبيعي بكميات كافية؛ في حين تتضمن الأخرى الفشل في إنتاج ]-جلوبين الطبيعي كليا. تتم الإشارة بشكل عام إلى هذه الاضطرابات المرتبطة ببروتين ]-جلوبين بأمراض الهيموجلوبين. مثلاء تنتج مرض الخلية المنجلية من نقطة تطفر نقطة في جين (]-جلوبين البنيوي؛ بما يؤدي إلى إنتاج هيموجلوبين غير طبيعي (متمنجلة) (sickled) hemoglobin (105). 105 اخلايا الدم الحمراء أكثر Alia من خلايا الدم الحمراء الطبيعية وتخضع لانحلال الدم بشكل أكثر جهوزية؛ le يؤدي بالأخير إلى أنيميا Semin.
Hematol. 38(4):367-73 (2001)) anemia ,200/60)._تنتج ثلاسيميا من عيب جزئي أو كلي في التعبير عن جين م]-جلوبين Le (Boglobin gene يؤدي إلى عيب في أو غياب HbA
كان البحث عن العلاج يهدف إلى تقليل عدم توازن سلسلة جلويين في مرضى مصابين بأمراض الهيموجلوبيين على التلاعب الصيدلاني في HPF جنيني. يتم إظهار القدرة العلاجية لهذه المناهج بواسطة الملاحظات بأن هناك مجموعات معينة من المرضى ذوي عيوب Billa وأعلى 5 .من مستويات طبيعية من HOF يعانون من مسار سريري أخف للمرض أكثر من المرضى ذوي مستويات نضج طبيعية ل HDF مثلاء تتضمن مجموعة مرضى أنيميا الخلية المنجلية العرب السعوديين الذين عبروا عن 730-20 HBF مظاهر سريرية خفيفة للمرض ( Pembrey, et al., (Br.
J.
Haematol. 40: 415-429 )1978( والآن أصبح Vee تخفيف أمراض الهيموجلويين» Jie مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا؛ بواسطة إنتاج HbF زائدة ) Jane et al., Br.
J.
Haematol. 102: 415-422 (1998); Bunn, N.
Engl.
J.
Med. 328: 0
)1993( 129-131( يقوم 801117 القامع للنسخ بتمثيل هدف علاجي ل أمراض م-الهيموجلويين. تم تطبيق تداخل RNA باستخدام RNAs دبوسية (ShRNAS) قصيرة المعبر عنها بواسطة معزز pol II لتقليل التعبير عن 801117 في WA مكونة للدم. قام استبعاد 8601117 في WIA جذعية 5 مكونة للدم فأرية بإضعاف التطعيم طويل المدة. لتجنب سمية خلية جذعية مكونة للدم؛ تم قمع التعبير عن BCLIIA في خلايا shes انتقائيا عبر Lge ShRNAS بواسطة microRNA
بواسطة xe .(ShRNAMIRs) pol ١١ متواليات متوافقة مع الهدف المتطابق؛ تمت ملاحظة التقليل بشكل معلم باستخدام نواقل pol ١! بسبب فروق 5-3 Ant الجدائل الموجهة بين الأنظمة التي تقوم بالتأثير بقوة على الاستبعاد المستهدف. تم تصميم إزاحة مناظرة بمقدار 4 04 في جدائل موجهة ل ShRNAMIRS حيث يتم بشكل مدهش وغير متوقع تحسين استبعاد 8011174 وقمع (Hbb-y 5 التناظر الوظيفي لجين 7-جلويين بشري في سلالة الخلية الحمراء الفأرية. تم التعبير عن 904/2045 المعدلة بطريقة انتقائية للخلايا الحمراء لمراوغة الأثر العكسي على تطعيم خلية جذعية مكونة للدم فأري؛ وقد أدى هذا إلى استبعاد 861117 كافي ومستويات عالية من HOF في WA حمراء مشتقة من 00034 بشرية. تم تطوير استراتيجية للتصميم المنظوري ل shRNAmMIRs المشتقة من حواجز ShRNA المعبر عنها بواسطة ١١١ ا0م. تشكل هذه 0 الاستراتيجية منهج محسن لعلاج جيني في أمراض الهيموجلويين وغيرها من أمراض تتطلب سلالة انتفائية تعبر عن متواليات إسكات جيني. النواقل الفيروسية البطيئة والارتجاعية
في بعض النماذج؛ يقدم الكشف الحالي تركيبات وطرق محسنة لعلاج أمراض الهيموجلويين باستخدام نواقل توصيل جينية قائمة على أساس فيروس ارتجاعي؛ مثلاء فيروس بطيء؛ التي تحقق التعبير عالي المستوى المستديم للجينات العلاجية المنقولة في الخلايا الحمراء eythroid cells أو خلايا حمراء كاشفة .erythroid precursor cells في أحد نماذج pla) يتضمن الناقل MIRNA صناعي يتضمن متواليات مستهدفة إلى 801117 مستنسخ في الحلقة الجذعية stem loop لمتوالية 014-223 الداخلية ( Amendola et al., Mol (Ther 17:1039-52, 9 يتم توليد البنية الجذعية/الحلقية للنواقل الحالية بواسطة متواليات 0 مكملة لأوليجونيكلوتيدات oligonucleotides متواليات برقم هوية:18-1 و44-25 مكشوف عنها هنا. انظر الأشكال ١1 12 114 21أ؛ ومثال 11. تم استنساخ هذه البنية الحلقية/الجذعية مستنسخ في خلفية .MIR-223/MIR-30 بعد ذلك تم استنساخ بنية mIRNA/ShRNA الكلية في قالب جيني مع فيروس تكوين تركيز طحالي؛ تترا سيكلين» أو معزز منطقة تحكم موضعي يحتوي على ناقل ذات التنشيط. تم توضيح النواقل الفيروسية البطيئة المناسبة Why للاختراع بواسطة Pawliuk et al. (2001) Science 294:2368 and Imren et al. (2002) PNAS 5
60 التي تم دمجها هنا بالإشارة إليها كمراجع.
بالتالي» في أحد الجوانب؛ تم هنا توفير BCLIIMiCroRNA تخليقي يتضمن a 86118 أول» gia حلقي؛ وجزءه 8011178 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5" إلى 3 ؛ حيث الجزء الحلقي موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بأجزاء 8011178 الأول (Jilly وحيث Sa 801118 الثاني مكمل لجز 8011178 الأول بحيث تكون أجزاء 8061117 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية 1000 hairpin مع الجزءِ الحلقي الذي يكون gall الحلقي للحلقة الدبوسية الذي تم تكوينه بالتبعية. في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء shal 801118 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات. جز 8011178 الأول Gide من متوالية 861117 ويؤدي إلى الجديلة المرسلة أثناء معالجة ShRNA إلى SIRNA مزدوج syns BCLIIA 0 الثاني مكمل «Jol 8011178 gal حيث gia 8011/8 الثاني يؤدي إلى الجديلة الموجهة التي يتم دمجها_ في معقد انتقائية التداخل RNA تداخل RNA أو إسكات جين .BCL11A في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء shal 18 8011 الأول والثاني are مشتق من متوالية .BCL11A MRNA في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح هناء يبدأ جزء 801118 الأول ب -666©0- عند الطرف 5” وينتهي ga 8011178 الثاني ب -6060- عند الطرف 3”. في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMiCroRNA التخليقي موضح هناء يتكون جزء 801118 الأول أيضا من -606©6- عند الطرف 5 وينتهي ga 8011178 الثاني ب - 0 6066- عند الطرف 3” . في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح هناء يبدأ جزء BCL11A الأول ب -GCGA- « -1016- أو -16- عند الطرف 5 cians 8611178 الثاني مكمل لجز 8011178 أول. في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMiCroRNA التخليقي موضح هناء يتكون جزء Lad JNIBCL1IIA 5 من «—-TCTG- . -GCGA- أو -1©6- عند الطرف 5” .
في أحد النماذج وفقا لأي من 8ل801111/10005 التخليقي موضح هناء ينتهي جزء 801118 الثاني ب -1111- عند الطرف 3 . في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح (ba يتضمن BCL11MicroRNA التخليقي متوالية نيكلوتيد sequence 0110160006 مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25. في أحد النماذج Gy لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح (ba يتكون BCL11MicroRNA التخليقي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1) 44-25. في أحد النماذج ly لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح (ba يتكون BCL11MicroRNA 0 التخليقي بشكل أساسي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25. في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح هناء يتم اختيار جزه 801118 الأول من المجموعة المكونة من CGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية بهوية رقم: 46؛ Gude من 0141© 801118 أوليجو موضحة (Wa CCAGAGGATGACGATTGTTTA 5 (متوالية بهوية رقم: 47؛ مشتق من 00142 BCL11A أوليجو موضحة هنا) TCGGAGACTCCAGACAATCGC (متوالية بهوية رقم: 48؛ مشتق من 853 86118 أوليجو أو shRNAL أو 53 موضحة هنا)ء (CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC (متوالية بهوية رقم: 49؛ مشتق من ShRNA2 أو 5 موضحة TCAGGACTAGGTGCAGAATGT «(la (متوالية بهوية رقم: 50؛ مشتق 0 من ShRNA4 أو 811 موضحة TTCTCTTGCAACACGCACAGA «(ls (متوالية بهوية رقم: 51؛ مشتق من D8 801118 أوليجو أو ShRNA3 أو 08 موضحة (We GATCGAGTGTTGAATAATGAT (متوالية بهوية رقم: 52؛ مشتق من ShRNAS أو 0 اه 012 موضحة CAGTACCCTGGAGAAACACAT (lia (متوالية بهوية رقم: 3؛ مشتق من ShRNAS أو SOAS موضحة CACTGTCCACAGGAGAAGCCA «(lia 5 (توالية بهوية رقم: 54؛ Gude من shRNAT أو 50811 موضحة (ba ACAGTACCCTGGAGAAACACA (متوالية بهوية رقم: 55؛ مشتق من 861118
shRNA XLC4 و5004 موضحة هنا CAACAAGATGAAGAGCACCAA (متوالية بهوية رقم: 56؛ Gude من أوليجو غير مستهدفة ل 801118 موضحة هنا)؛ gcgcCGCACAGAACACTCATG (متوالية بهوية رقم: 57؛ مشتق من 0114165 أوليجو موضحة هنا)» GCGCTCGGAGACTCCAGACAA (متوالية بهوية رقم: 58؛ مشتق من 65 أو أوليجو E3 mod أو sh RNA1 mod موضحة (La ‘ gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAA (توالية بهوية رقم: 59؛ مشتق من 8565 أو ShRNA2mod موضحة هنا)؛ gcgcTCAGGACTAGGTGCAGA (متوالية بهوية tad) 0؛ مشتق من 165 أو shRNAdmod موضحة | هنا)؛ 900601068616111 (متوالية بهوية رقم: 61؛ مشتق من 5001265 0 01264 أو ShRNASmod موضحة هنا)؛ gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC (متوالية بهوية رقم: 62؛ مشتق من 5085650 50186000 موضحة هنا)؛ gcgcCACTGTCCACAGGAGAA (متوالية بهوية رقم: 63؛ مشتق من 5081165 أو 900 موضحة هنا)؛ 60/006078 60601101011 (متوالية بهوية رقم: 4؛ مشتق من 0865 806111 أو D8 mod أو ShRNA3mod موضحة 48(« GCGCACAGTACCCTGGAGAAA 5 (متوالية بهوية رقم: 65؛ مشتق من 801118 «C4G5 أو mod 04 أو ShRNASmMod موضحة هنا)؛ CGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية بهوية رقم: 66؛ مشتق من 80111 D12G5-2 موضحة هنا)ء 4 ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية بهوية رقم: 67؛ مشتق من DI2G5-2 8011178 موضحة هنا ). في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء gall الحلقي مشتق من -MicroRNA في أحد النماذج» MicroRNA عبارة عن microRNA انتقائي لمكونات الدم. Mi. 142حخااص .MiR-223 s miR-181 (miR-155 في أحد النماذج وفقا لأي من BCLIIMicroRNA التخليقي موضح microRNA la عبارة عن 014223. في أحد النماذج وفقا لأي من BCL1IMicroRNA التخليقي موضح هناء gall الحلقي عبارة عن 010081919918989 (متوالية برقم هوية:68).
في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي جزيء حمض نووي معزول isolated nucleic acid molecule يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة_ من متواليات برقم هوية:18-1؛ 44-25« أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا. بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي تركيبة تتضمن جزيء حمض نووي nucleic acid molecule 5 واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو BCLI1IMicroRNA تخليقي موضح هنا. بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف Jal تركيبة تتضمن على الأقل ناقل أو LAG يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات 0 برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة يتضمن ناقل أو فيروس يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25 أو BCLT1MicroRNA تخليقي موضح هنا. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة يتضمن Jil فيروس أو بكتريا يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1 44-25« أو BCL1IMicroRNA تخليقي موضح هنا. في أحد النماذج؛ الناقل عبارة عن ناقل فيروسي viral vector أو فيروس. تداخل RNA (نهلا») الذي يتم التوسط فيه بواسطة RNAS متداخلة (SIRNA) أو (MIRNA) microRNAs عبارة عن طريقة قوية من أجل تنظيم ما بعد النسخي للتعبير الجيني. 0 تتم استخدام RNAI بشكل موسع لدراسة العمليات البيولوجية في الخلايا الثديية mammalian (Kay cells أن يشكل منهج علاجي لأمراض بشرية حيث سيكون مطلويا تضمين التعبير الجيني. بشكل يعتمد على درجة التكامل بين متواليات MRNA 3 MIRNA المستهدف؛ يتم فقد التعبير الجيني بواسطة حث تدهور MRNA المتجانس أو بواسطة تخفيف الترجمة. يتم تحويل miRNAs الداخلية كنواتج استنساخ أساسية وبالتالي تتم معالجتها بواسطة RNase ١١١ a) Drosha 5 )1( لتكوين بنية حلقية جذعية. يقوم التصدير والشق النووي بواسطة Dicer بتوليد قصير ناضج جزيء مزدوج الجديلة (SIRNA) double stranded molecule التي يتم فصلها
في جدائل توجيه وأخرى منتقلة. يتم تحميل الجديلة الموجهة في معقد إسكات محفز ب RNA المعقد المؤثر الذي يتوسط في شق MRNAS المستهدفة مع الجديلة الوظيفية الموجهة التي ترتبط ببروتينات معقد انتقائية التداخل RNA (2) ويتم تدهور هذه الجديلة المرسلة [تمت مراجعتها في (3)]. يعتمد تحميل جدائل التوجيه في مقابل الجدائل المنتقلة في معقد انتقائية التداخل RNA 5 بشكل كبير على استقرار الطرف 5” ل SIRNA مع الجديلة الأقل استقرار المدمجة بشكل مفضل في معقد انتقائية التداخل RNA )4 5)؛ على الرغم من التنظيم المحدد في الخلايا الثديية غير مفهوم بشكل كامل. يحتوي الطرف 5" من الجديلة الموجهة على 'منطقة البذرة؛” وهي مهمة لتحديد الهدف (6؛ 7). الشق المضبوط بواسطة Dicer Drosha مهم من أجل توليد RNAS موجهة مع مناطق البذرة المحددة التي تتوسط في الارتباط المناسب ب MRNAS المستهدفة. تؤدي 0 المعالجة غير الدقيقة إلى الارتباط بالجزيئات البعيدة عن الهدف ولكنها تقوم بالإزاحة في مواقع الشق Lay تعدل تركيبة النيكلوتيد للأطراف المزدوجة؛ والتي يمكن أن يكون لها أثر قوي على
تحميل الجديلة في معقد انتقائية التداخل RNA (6). يتم تثبيط التعبير عن البولي ببتيدات المستهدفة المختارة من خلال استخدام عوامل تداخل RNA يقوم تداخل (RNA) RNA باستخدام مزدوجات RNA صغيرة متداخلة (SIRNA) 5 تستهدف RNA المرسل الذي يرمز البولي ببتيد المستهدف للتدهور الانتقائي. يتضمن إسكات ما بعد النسخ معتمد على SIRNA للتعبير الجيني شق جزيء RNA مرسل مستهدف عند موقع موجه بواسطة ال RNAI SIRNA عبارة عن عملية محفوظة تقييميا وبالتالي يتم التعبير عن أو إدخال RNA لمتوالية متطابقة أو مشابهة بشكل كبير لجين مستهدف يؤدي في تدهو انتقائي للمتوالية أو إسكات الجين ما بعد الانتساخي الانتقائي (PTGS) post-transcriptional gene silencing 0 لغلا مرسل (MRNA) محول من جين مستهدف Coburn, G. and Cullen, 8. hi) J.
Virology 76(18):9225 (2002))؛ وبالتالي يتم تثبيط التعبير عن الجين المستهدف. في أحد النماذج؛ ال RNA عبارة عن RNA مزدوج الجديلة .(dsRNA) double stranded RNA وقد تم توضيح هذه العملية في النباتات» (cl WU والخلايا الثديية. في الطبيعة؛ يتم بدء RNAI بواسطة إندوكلياز Dicer الانتقائي ل RNA مزدوج الجديلة ؛ Ally تقوم بتعزيز شق معالج ل RNA 25 مزدوج الجديلة طويل في شظايا مزدوجة الجديلة تسمى (SIRNAS يتم دمج SIRNAS في معقد بروتين (يسمى dad إسكات محفز ب “RNA أو (RISC يقوم بالتعرف على وشق
mRNAs المستهدفة. Lad RNAP cy Lad (Sa بواسطة إدخال جزيئات حمض نووي siRNAs Sie nucleic acid molecules تخليقي أو عوامل تداخل (RNA لتثبيط أو إسكات التعبير عن الجينات المستهدفة. حسب الاستخدام هناء يتضمن "تثبيط التعبير الجيني المستهدف" أي تقليل في نشاط التعبير أو البروتين أو مستوى الجين المستهدف أو البروتين المرمز بواسطة الجين المستهدف مقارنة بحالة حيث لا يوجد تداخل RNA تم حثه. سوف يكون التقليل بنسبة على الأقل 710؛ على الأقل 720؛ على الأقل 730؛ على الأقل 740 على الأقل 50 على الأقل 0. على INI 770 على الأقل 780 على الأقل 790؛ على الأقل 795؛ على الأقل 799 أو أكثر مقارنة بالتعبير عن جين مستهدف أو النشاط أو مستوى البروتين protein المرمز بواسطة جين مستهدف والتي تم استهدافها بواسطة عامل تداخل RNA
المصطلحات "عامل تداخل "RNA واتداخل "RNA حيث يتم استخدامها لتضمين هذه الصور من الإسكات الجيني الذي يتوسط فيه RNA مزدوجة الجديلة؛ بغض النظر عما إذا كان عامل تداخل RNA يتضمن ShRNA (miRNA (siRNA أو غيرها من جزيئات RNA مزدوجة الجديلة. يتم تحديد SIRNA كعامل RNA يعمل على تثبيط التعبير عن جين مستهدف؛ مثلاء بواسطة RNAI يمكن أيضا تخليق SIRNA كيماويا؛ ويمكن Leal] بواسطة انتساخ في المعمل؛ 5 أو (Sa إنتاجها في خلية عائلة host cell في أحد النماذج؛» SIRNA عبارة عن جزيء RNA مزدوج الجديلة ذو طول حوالي 15 إلى حوالي 40 نيكلوتيد. بشكل مفضل حوالي 15 إلى حوالي 8 نيكلوتيدات؛ بشكل أفضل حوالي 19 إلى حوالي 25 نيكلوتيد؛ ويشكل أفضل حوالي 19؛ 20 1 2 أو 23 نيكلوتيد. ويمكن أن تحتوي على جزءِ معلق 3' و/أو 5' على كل جديلة لها طول بمقدار حوالي 0 1؛ 2 3؛ 4؛ أو 5 نيكلوتيدات. يعتمد طول Glad) gall بين الجديلتين؛ 0 أيء طول gall المعلق على جديلة واحد لا تعتمد على طول gall المعلق على الجديلة الثانية. بشكل مفضل SIRNA قادر على تعزيز تداخل RNA خلال تدهور أو إسكات جيني انتقائي ما
بعد الانتساخ لل RNA مرسل المستهدف (MRNA) target messenger RNA siRNAs cua تتضمن Lad دبوس صغير (أيضا المسمى حلقة RNAS (Leds .(ShRNAS) في أحد النماذج؛ يتم تكوين SARNAS هذه من جديلة مضادة للحس قصيرة Nia) 5 حوالي 19 إلى حوالي 25 نيكلوتيد)» متبوعة بواسطة dala نيكلوتيد م1000 nucleotide بمقدار حوالي 5 إلى حوالي 9 نيكلوتيدات؛ والجديلة الحسية المناظرة. بشكل بديل؛ يمكن أن تتخطى
الجديلة الحسية بنية حلقة نيكلوتيد (Sag Nucleotide loop structure أن تتبعها الجديلة المضادة للحس. يمكن احتواء هذه ال ShRNAs في بلازميدات Glug dll plasmids الارتجاعية؛ والفيروسات البطيئة lly يتم التعبير عنها من؛ Sia معزز !اا U6 pol أو معزز
jal (انظر؛ مثلاء 9)4(:493-501 (Stewart, et al. (2003) RNA April; الذي تم دمجه
5 هنا بالإشارة إليه كمرجع). يمكن أن يكون الجين المستهدف أو متوالية عامل تداخل RNA عبارة عن جين خلوي cellular gene أو متوالية جينومية Sie (genomic sequence المتوالية 8061118. يمكن أن تكون SIRNA مناظرة بشكل pall lad المستهدف أو المتوالية الجينومية؛ أو شظية مما سبق. حسب ما هو مستخدم في هذا السياق؛ يتم تحديد المصطلح 'مناظر" على أنه مطابق بشكل أساسي؛ Jae بشكل مناسب؛ أو مشابه ل MRNA المستهدف؛ أو
0 ثشظية مما سبق؛ لتفعيل تداخل RNA للهدف. بالإضافة إلى جزيئات RNA الأصلية RNA مناسبة لتثبيط أو التداخل مع التعبير عن متوالية مستهدفة وتتضمن مشتقات ونظائر RNA بشكل مفضل؛ ال SIRNA متطابقة مع الهدف. يقوم ال SIRNA بشكل مفضل باستهداف متوالية واحدة
فقط. يمكن حجم كل من عوامل تداخل (RNA مثل SIRNAS من أجل HEY) القوية بواسطة؛
Jackson في Mic حالة التعبير. هذه الطرق معروفة للخبير في المجال وقد تم توضيحهاء Sle
Let al.
Nature Biotechnology 6:635-637, 2003 5 بالإضافة إلى dls التعبير؛ يمكن ell أن يقوم بحجز المتواليات المستهدفة القوية لمتواليات متشابهة في قواعد بيانات المتوالية لتحديد المتواليات القوية التي يمكن أن يكون لها JBI منفصلة عن الهدف. lie ريما كان عدد
5 أو ريما أقل Jie 11 من النيكلوتيدات المتجاورة؛ لهوية متوالية مناسبة لتوجيه عملية إسكات
نواتج استنساخ غير مستهدف. (IL يمكن أن يقوم أحدهم أولا بحجز ال SIRNAS المقترح
0 لتجنب الإسكات البعيد عن الهدف القوي باستخدام تحليل Liga المتوالية بواسطة أي طرق مقارنة متوالية معروفة؛ مثل بي ال ايه اس تي BLAST يتم اختيار متواليات SIRNA لزيادة استهلاك الجديلة المضادة للحس antisense strand (الموجهة) ل SIRNA في معقد انتقائية التداخل RNA ووبالتالي تقوم بزيادة قدرة معقد انتقائية التداخل RNA لاستهداف BCL11A mRNA للتدهور. يمكن تحقيق ذلك بواسطة مسح متواليات تتضمن أقل طاقة حرة للارتباط عند الطرف 5"
5 .من الجديلة المضادة للحس. تؤدي الطاقة الحرة الأقل إلى تحسين عدم لف الطرف 5” من الجديلة المضادة للحس ل SIRNA مزدوج؛ وبالتالي يتم ضمان أن الجديلة المضادة gall سوف يتم
استهلاكها بواسطة معقد انتقائية التداخل RNA وشق انتقائي للمتوالية المباشرة لذ BCLITA MRNA بشري. تحتاج جزيئات SIRNA إلى أن تكون مقيدة لهذه الجزيئات التي تحتوي على RNA فقط ولكن؛ le تتضمن أيضا نيكلوتيدات معدلة كيماويا وغير نيكلوتيدات» وتتضمن
أيضا جزيئات حيث يتم استبدال جزيء سكر ريبوزي ribose sugar molecule لجزيء سكر
sugar molecule 5 آخر أو جزيء يقوم بتنفيذ وظيفة أخرى. علاوة على ذلك؛ يمكن استخدام رابط غير طبيعي بين وحدات نيكلوتيد Jie nucleotide residues duly رابط فوسفورو ثيوات Sa phosphorothioate linkage اشتقاق جديلة RNA مع مجموعة وظيفية تفاعلية de gan مبلغة؛ Jie فلوروفور fluorophore تحديدا يتم تعديل المشتقات المفيدة عند طرف أو أطراف جديلة (RNA بشكل مثالي الطرف 3' للجديلة الحسية. Ole يمكن أن يقوم 2'-
0 هيدروكسيل 2'-hydroxyl عند الطرف 73 بالاشتقاق بشكل جاهز وانتقائي مع تشكيلة من المجموعات. تقوم نيكلوتيدات مشتقات RNA أخرى مفيدة تتضمن شقوق كربوهيدرات معدلة؛ Jie وحدات بنائية 0:2- dallas بألكيل 2'O-alkylated residues أو مشتقات رببوسيل 0-72-
ميثيل 2'-O-methyl ribosyl derivatives ومشتقات ريبوسيل 2:-0-فلورو 2-0-1100 ال2ا005. يمكن أيضا تعديل قواعد RNA أيضا. يمكن استخدام أي قاعدة معدلة
15 مفيدة لتثبيط أو تداخل مع التعبير عن متوالية مستهدفة. مثلاء قواعد مهلجنة halogenated (Sa Mie (bases دمج 5-برومو يوراسيل S-bromouracil و5-يودو يوراسيل -5 ا[10000186. يمكن أيضا معالجة القواعد بألكيل؛ Ole يمكن دمج 7-ميثيل جوانوسين -7 06 في موضع وحدات جوانوسين بنائية guanosine residue يمكن أيضا
دمج قواعد غير طبيعية تؤدي إلى تثبيط ناجح. تتضمن أفضل عمليات تعديل siRNA 2-
0 ديوكسي -2"-فلورو يوربدين 2'-deoxy—2'-fluorouridine أو نيكلوتيدات حمض نووي مقفلة (LAN) locked nucleic acid ومزدوجات RNA تحتوي .على إما فوسفو داي إستر phosphodiester أو أعداد مختلفة من روابط فوسفورو ثيوات phosphorothioate 5. هذه التعديلات معروفة للخبير في المجال وقد تم توضيحهاء Obs في Braasch et .al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003 يمكن إدخال أغلب التعديلات المفيدة
5 لجزيئات SIRNA باستخدام المركبات الكيماوبة المحددة لتكنولوجية أوليجونيكلوتيد المضادة للحس JSG .8071560156 oligonucleotide technology مفضل»؛ تتضمن التعديلات تعديل 2'-
©-ميثيل Jif 2'-O-methyl بشكل مفضل استبعاد هذا التعديل. تستبعد التعديلات أيضا بشكل مفضل تعديلات مجموعات 5'-هيدروكسيل الحرة من SIRNA تقدم الأمثلة هنا أمثلة انتقائية لعوامل تداخل Jie (RNA جزيئات ShRNA التي تقوم باستهداف mRNA 8011178 بفاعلية. غالبا ما يتم استخدام RNAS دبوسية قصيرة (ShRNAS) short hairpin تعمل بواسطة بوليمراز III (pol) Polymerase في أوضاح تجارب بيولوجية. تقوم ShRNAS بمحاكاة بنية miRNA sale البادئة بالتوسط في؛ وبالتالي تتخطى خطوة الشق الأولى التي تم التوسط فيها بواسطة Drosha يمكن أن يتم التعبير عن SARNAS بوفرة لتوفير استبعاد مناسب. مع ذلك عند حالات الإصابة ذات المضاعفة العالية (MOI) multiplicities of infection تم التبليغ عن التشبع المفرط ل آلية RNAP الداخلية في بعض الحالات التي ترتبط بالآثار السمية الخلوية cytotoxic 0 بسبب عدم انتظام miRNAs داخلية (11-9). يبدو أن هناك اثنين من مكونات microRNA التي تقوم بمعالجة؛ 000005 و8902 تقوم بتقييد سعة هذا المسارء وتقوم بالتعبير المفرط عن هذه البروتينات التي تؤدي إلى سعة استبعاد زائدة )15-12( بشكل إضافي؛ يمكن أن يقوم تنشيط الاستجابات المناعية الداخلية التي تم بدؤها بواسطة RNAs صغيرة في متوالية معينة بالإضافة إلى طريقة غير انتقائية بالتوسط في الآثار الجانبية السمية الخلوية (16؛ 5 17)؛ التي تمت مراجعتها في (18). أدت هذه الآثار إلى في aby معدل وفيات في الفتران في بعض الأنظمة الجينية المتحولة الاختبارية بشكل مبلغ كآثار جانبية مباشرة للتعبير المفرط عن .)19 14( shRNA سوف تكون هناك حاجة (RNA بالنسبة للترجمة السريرية للعلاجات القائمة على أساس هذه الفئة . polymerase Il promoters Il إلى أنظمة تعبير بديلة باستخدام معززات بوليمراز -من المعززات تسمح باستخدام العناصر المنظمة المثالية للسلالة أو التعبير الانتقائي لنوع الخلية. 0 يمكن توفير مستويات أقل من التعبير مقارنة بمعززات !اا 00 والتي يمكن أن تبين تشبع مفرط محولة عند حالات الإصابة ذات مضاعفة عالية). تتطلب WIA لآلية معالجة تم التبليغ عنها في في متواليات shRNA دمج متواليات ¢ShRNA للتعبير عن pol I مضاعفة استخدام معززات
ShRNAs البادئة الداخلية للمعالجة المناسبة. تقوم MIRNA من مواد ale محاطة مشتقة (YI داخلية (10؛ 20). حتى miRNAs متراصة تحاكي بنية MIRNA المحاطة بواسطة بنية 5 بشرية والتي تم استخدامها بشكل MIRNA-223 5 001400-30 مناطق الإحاطة مشتقة من
واسع لدمج ShRNAS ناتج عودة الارتباط الجيني للتعبير في الخلايا الثديية mammalian (cells وكان هناك العديد من الجهود لفهم وتحسين استراتيجية التعبير (21). تم توضيح ال miRNA الأخير تحديدا الفعالة عند الاستخدام كبنية متراصة للتعبير عن shRNA في خلايا
مكونة للدم وتتوسط في استبعاد MRNAS المستهدفة الأساسية كنتيجة لمعالجة فعالة ونشاط جديلة
متتقلة منخفضة في العديد من أنواع الخلية المكونة للدم المتعددة (21؛ 22).
في هذا الكشف؛ قام المخترعون باستخدام 8011178 كهدف لدراسة معالجة وتحسين ShRNAMIRS من أجل التطبيقات العلاجية الممكتة. 801117 عبارة عن هدف (ade مفعل
لإعادة تنشيط جين 7-جلوبين وبالتالي التعبير عن HDF في أغلب أمراض الهيموجلوبين». مرض
الخلية المنجلية وأمراض 8م-ثلاسيميا. يقوم التضمين المنخفض أو الحذف الجيني ل 8611178
0 بإطلاق عملية إبادة 7-جلوبين (23) ويقوم تثبيط 8011178 في السلالة الحمراء بمنع النمط الجيني مرض الخلية المنجلية والسميات العضوية في فثران معدلة Lis (24). جين Hbb-y الجنين الفأري عبارة عن نظير وظيفي لجين 7-جلويين بشري؛ وبالتالي يعمل كمكون محيط لتقييم
أثر استبعاد 801117 في WA حمراء فأرية. كما نقوم أوليا بملاحظة فعالية مخفضة بشكل معلم لاستبعاد 861117 عند التعبير عن ShRNA باستخدام نواقل قائمة على أساس pol ١١ مقارنة
5 بنواقل قائمة على أساس lI ا00. تقوم تصاميم shRNAmIR pol 115 Pol ١|! بشكل مثالي بدمج 21 متوالية متوافقة من حيث موقع القاعدة المستهدفة في الخلية الجذعية الدبوسية العكسية palindromic hairpin stem ولكن من المتوقع أن تكون نواتج استنساخ 11805011015 من
هذين النوعين من عبوات التعبير بحيث تتم معالجتها بشكل مختلف (25). تقوم نواتج استنساخ pol ١١ sShRNAMIR بالدخول في مسار معالجة RNAI قبل معالجة Cua Drosha يكون من
0 المتوقع أن تكون هناك منتجات !اا pol أقصر بعد Drosha وليتم شقها فقط عند الطرف الحلقي بواسطة Dicer بناء على متواليات RNAS صغيرة dallas مشتقة من pol ١١١ ومعززات pol ١١ لاحظنا أن هناك قوالب pol ١١١ shRNAs وقوالب جينية pol ١١ shRNAMIR التي أدت إلى ShRNAs مختلفة معالجة نسبة إلى الموضع النسبي لمتواليات مستهدفة قائمة على أساس 21 قاعدة. تقوم 001/45/ل4ا50 المعادة تصميمها بمحاكاة المتواليات الموجهة ذات الجديلة الناضجة
5 الناتجة بواسطة ShRNAS فعال مفعل بواسطة !اا pol التي أدت إلى تحسين فعالية المعالجة وتثبيط MRNA المستهدف. يؤدي دمج هذه التعديلات في تعبير ناقل ثديي انتقائي للخلايا الحمراء
إلى استبعاد ملحوظ لبروتين 861117 وإعادة حث هيموجلويين جنيني. هذه الاستراتيجية أيضا تقوم بتجنب السمية في الخلية الجذعية المكونة للدم وقطاعات سلالة خلية 8 التي تتم مصاحبتها 0- المكونة للدم التي تعبر عن .ShRNA باختصارء تبين البيانات وجود خواص مهمة ل RNA تقوم بالمعالجة نسبة إلى استخدام ShRNA في سياقات ناقل مختلفة؛ وأيضا تقدم استراتيجية لسلالة جين انتقائية باستثناء أنها تحيط بالنواتج العكسية للتعبير المنتشر. تتضمن النتائج الخاصة بنا وجود مضاعفات مهمة لتصميم ShRNAS مدمجة في MicroRNA واستخدامها في مناهج علاج جيني قائمة على أساس RNAI في أحد النماذج؛ يتم توصيل أو إعطاء عامل تداخل RNA في dela مقبول صيدلانيا So .pharmaceutically acceptable carrier إضافة lee حاملة carrier agents 0 إضافية؛ مثل ليبوسومات 00500065 إلى الحامل المقبول صيدلانيا. في نموذج AT يتم توصيل عامل تداخل RNA بواسطة Jib يرمز RNA دبوسي (shRNA) قصير أو صغير في حامل مقبول صيدلانيا إلى الخلايا في عضو بالفرد. يتم تحويل ShRNA بواسطة الخلايا بعد انتساخ في SIRNA قادرة على استهداف»؛ Sle 5801117. في أحد النماذج؛ عامل تداخل RNA عبارة عن جزيء حمض نووي يتضمن متوالية 5 النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية: 18-1( و44-25؛ أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا. في أحد النماذج؛ الناقل عبارة عن ناقل قابل للتنظيم vector ©ا1826 9018© مثل ناقل قابل للحث بواسطة تترا سيكلين. يمكن استخدام الطرق الموضحة؛ Sle في Wang et al. Proc.
Natl.
Acad.
Sci. 100: 5103-5106, using pTet-On vectors (BD BIOSCIENCES Clontech, Palo Alto, Calif.) 0 في أحد النماذج؛ يتم أخذ عوامل تداخل RNA المستخدم في الطرق الموضحة هنا بشكل نشط بواسطة خلايا في الكائن الحي بواسطة الحقن الوربدي Sie dintravenous injection الحقن الهيدروديناميكي hydrodynamic (ga cinjection استخدام الناقل» يبين الفعالية في توصيل عوامل تداخل interfering agents RNA داخل الكائن الحي. ثمة طريقة خاصة بتوصيل SIRNAS وهي عمل قسطرة وعاء التزويد 5 بالدم blood supply vessel للعضو المستهدف. يمكن Lad استخدام استراتيجيات أخرى لتوصيل عوامل تداخل (RNA مثلاء siRNAs أو shRNAs المستخدمة في طرق الاختراع؛
مثل؛ مثلاء توصيل بواسطة ناقل؛ lie بلازميد plasmid أو ناقل فيروسي؛ lie ناقل فيروسي بطيء. يمكن استخدام هذه النواقل كما هو موضح؛ Ole في Xiao-Feng Qin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188 تتضمن طرق التوصيل الأخرى توصيل عوامل تداخل (RNA مثلاء siRNAs أو ShRNAs وفقا للاختراع؛ باستخدام ببتيد أساسي basic peptide 5 بواسطة ترافق أو خلط عامل تداخل RNA مع ببتيد أساسي؛ lie شطية من ببتيد 56 تي ايه تي (TAT الخلط مع دهون كاتيونية cationic lipids أو صياغة جسيمات. (Kay توصيل عوامل تداخل mRNA Si (RNA 8011178 تقوم باستهداف SIRNAS بشكل منفردء أو في توليفة مع عوامل تداخل (Jie siRNAs Mis (gal RNA مثلا SIRNAs موجهة إلى جينات خلوية cellular genes أخرى. يمكن Lad إعطاء siRNAs 801118 0 أيضا في توليفة مع عوامل صيدلانية أخرى والتي يتم استخدامها لعلاج أو منع الأمراض أو الاضطرابات المضطرية مع ضغط مؤكسد؛ خصوصا الأمراض التنفسية؛ وبشكل أكثر تحديدا الربو 38م. يمكن الحصول على siRNA clus التخليقية؛ شاملة جزيئات ShRNA باستخدام عدد من التقنيات المعروفة للخبير في المجال. مثلاء يمكن تخليق أو إنتاج جزيء SIRNA كيماويا أو بشكل ناتج عودة الارتباط الجينيب ياستخدام طرق معروفة في المجال؛ مثل باستخدام مركبات RNA/DNA محمية بشكل مناسب وعنصر مخلق تقليدي phosphoramidites فوسوفراميديت 5
Elbashir, 5. M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, 5. is (انظرء M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188- 200; Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J. R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017; 0 (Tuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13:3191-3197 0 بشكل بديل؛ يتضمن موردو تخليق RNA المختلفين التجاريين المتاحين» على سبيل المثال لا الحصرء 006 (هامبرج؛ ألمانيا) Dharmacon Research (لافايت؛ كولو.؛ الولايات المتحدة)؛ Pierce Chemical (جزء من Science, Rockford, Ill. 061510 الولايات المتحدة)؛ Glen Research (سترلنج؛ «ill «Va المتحدة)؛ cule cadlal) ChemGenes الولايات المتحدة)؛ Cruachemy (جلاسكو؛ المملكة المتحدة). بالتالي؛ لن يكون من الصعب تخليق جزيئات SIRNA ويتم توفيرها بشكل جاهز في جودة مناسبة ل نظلمة. علاوة على ذلك؛ يمكن
التعبير عن dSRNAS كبنيات حلقية جذعية Stem loop structures مرمزة بواسطة بلازميد
Paddison, P. J. et ( الفيروسات الارتجاعية والفيروسات البطيئة «plasmid vectors نواقل al. (2002) Genes Dev. 16:948-958; McManus, M. ٠١ et al. (2002) RNA 8:842-850; Paul, C. P. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508;
Miyagishi, M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500; Sui, 6. et al. 5 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520; Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243; Lee, N. S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505; Yu, J. Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052; Zeng, Y., et al. (2002) Mol. Cell. 9:1327-1333;
Rubinson, D. A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406; Stewart, S. A., 0 قبل pollll عادة ما تتضمن هذه النواقل معزز .(et al. (2003) RNA 9:493-501 الحسية والمضادة للحس بشكل منفصل و/أو كبنيات RNA ويمكن أن تعبر عن جدائل dsRNA (ShRNA) دبوسي قصير RNA بمعالجة Dicer في خلاياء تقوم .hairpin structures دبوسية في SIRNA فعالة. يمكن اختيار المنطقة المستهدفة للجزيء SIRNA وفقا للاختراع الحالي من جين مستهدف متوالية مستهدف» Ole متوالية ترميز 8011178؛ بداية من حوالي 25 إلى 50 نيكلوتيدات؛ من حوالي 50 إلى 75 نيكلوتيد؛ أو من حوالي 75 إلى 100 نيكلوتيد بعد كودون (Sa ed أن تحتوي متواليات النيكلوتيد على كودونات بدء مناطق 5' أو 3' يو تي ار اس UTRSs وقريبة. تتضمن إحدى الطرق تصميم جزيء SIRNA وفقا للاختراع الحالي تحديد متوالية نيكلوتيد حثية 23 واختيار احتمالات مع على الأقل 25 J30 35ت J40 345 50 0 55« 760 765؛ 770 أو 15من منوعة 6/©. بشكل (ay إذا لم تكن هناك هذه المتوالية؛ يمكن مد البحث باستخدام (NA(N2T) حيث لا يمكن أن تكون عبارة عن أي نيكلوتيد. في هذه calla يمكن تحويل الطرف 3 ل SIRNA الحسية إلى تي تي 11 للسماح بتوليد تزاوج متناظر نسبة إلى تركيبة المتوالية للجزء المعلق الحسية والمضاد للحس 3". يمكن تخليق جزيء SIRNA المضاد للحس كمكمل لنيكلوتيد المواضع 1 إلى 21 من متوالية نيكلوتيد حثية 23. باستخدام 5 الأجزاء المعلقة 3' TT التناظرية_ قد يكون مفيدا ضمان أن الجسيمات الرببونيكلويروتين ribonucleoprotein particles الصغيرة المتداخلة (siRNPs) small interfering 28 تم
تكوينها مع نسب متساوية من الجسيمات الريبونيكلويروتين الصغيرة المتداخلة تقوم بشق RNA .(Elbashir et al., (2001) supra and Elbashir et al., 2001 supra) يمكن أيضا استخدام التحليل لمتوالية قواعد البيانات؛ شاملة على سبيل المثال لا الحصر «(NCBI the GenSeq; (Derwent (BLAST بالإضافة إلى شركات تخليق الأوليجو المتاحة تجاريا Jie «OLIGOENGINE® 5 ويمكن أيضا استخدامها لاختيار متواليات SIRNA في مقابل مجموعات EST لضمان أنه يتم استهداف جين فقط. تتضمن النواقل الفيروسية البطيئة وفقا للاختراع؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ فيروس نقص المناعة البشري Ole) فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2)؛ فيروس نقص المناعة في القطط؛ فيروس نقص المناعة في القردة؛ فيروس 0 تقص المناعة البقري؛ وفيروس فقر الدم المعدي في الخيول. يمكن تكوين هذه النواقل وتصميمها باستخدام تقنيات معروفة في المجال لزيادة أمانها للاستخدام في علاج ولحث العناصر التعبيرية المناسبة والجينات العلاجية؛ Jia تلك الموضحة أدناه؛ والتي ترمز SIRNAS لعلاج حالات شاملة؛ على سبيل المثال لا الحصرء أمراض الهيموجلوبين. بالنسبة للسمية القوية للفيروسات البطيئة؛ يمكن تصميم النواقل بطرق مختلفة لزيادة الأمان في تطبيقات علاج جيني. lie يمكن صنع الناقل بحيث يكون أكثر أمانا بواسطة فصل الجينات الفيروسية البطيئة الضرورية Sle) جي ايه جي 989 و بي او ال (pol على نواقل منفصلة كما هو موضح؛ Ole في براءة الاختراع الأمريكية رقم 6365150؛ وقد تم دمج محتوياتها هنا بالإشارة إليها كمراجع. بالتالي؛ يمكن تكوين فيروس ارتجاعي ناتج عودة الارتباط الجيني بجيث يتم استبدال متوالية الترميز الفيروسي الارتجاعي (env pol gag) بواسطة جين محل الاهتمام 0 والذي يكون معيب من حيث تكاثر الفيروس الارتجاعي. بعد ذلك تتم تعبئة الفيروس الارتجاعي المعيب المتكاثر في فيرويونات خلال استخدام فيروس مساعد أو سلالة خلية تعبئة packaging 86 اا08؛ بواسطة التقنيات المعيارية. يمكن العثور على بروتوكولات لإنتاج الفيروسات الارتجاعية ناتج عودة الارتباط الجيني ولحقن خلايا في المعمل أو في الكائن All مع هذه ilu dll في Protocols Current في .al et .M .F (Ausubel (Biology Molecular Sections (1989) «Associates Publishing Greene (.eds) 5 9.14-9.10 وغيرها من الكتيبات المعملية.
هناك مطلب أساسي لاستخدام فيروسات كنواقل توصيل جينية لضمان أمان استخدامهاء تحديدا Led يتعلق باحتمالية انتشار فيروس من النوع البري في مجموعة الخلية. وكان تطور سلالات خلايا packaging cell lines Laas والتي تنتج الفيروسات الارتجاعية المعيبة من حيث التكاثرء له فائدة زائدة للفيروسات الارتجاعية للعلاج الجيني؛ والفيروسات الارتجاعية المعيبة للاستخدام في نقل جين لأغراض علاج جيني (للمراجعة Miller, A. 0. (1990) Blood 1:) بالتالي» في أحد نماذج الاختراع؛ يتم استخدام سلالات خلية تعبئة لنشر النواقل (مثلا؛ نواقل فيروسية بطيئة (lentiviral vectors وفقا للاختراع لزيادة معايرة الناقل الفيروسي. باستخدام سلالات خلية تعبئة سوف يتم اعتبار طريقة آمنة لنشر الفيروس؛ حيث يقوم استخدام النظام بتقليل احتمالية أن تتم sale) التوليف لتوليد فيروس من النوع البري. علاوة على ذلك. لتقليل السمية إلى 0 خلايا تم التسبب فيها بواسطة التعبير عن بروتينات packaging proteins das يمكن استخدام أنظمة التعبئة packaging systems حيث البلازميدات التي ترمز وظائف التعبئة الخاصة
بالفيروس المنقولة بشكل انتقالي بواسطة؛ مثلا؛ المتوسطات الكيماوية. في نموذج آخرء يمكن تصنيع ناقل أكثر أمانا بواسطة استبدال متواليات فيروسية بطيئة xe lentiviral sequences متواليات فيروسية غير بطيئة .non-lentiviral sequences 5 بالتالي» يمكن أن تحتوي النواقل الفيروسية البطيئة وفقا للكشف الحالي على ga (مثلاء شق) من جين متواليات فيروسية بطيئة و/أو متواليات فيروسية غير بطيئة Sle) متواليات من الفيروسات الارتجاعية retroviruses الأخرى) طالما أنه وظيفتها لا تقل أساسيا Oe) معايرة فيروسية؛ القابلية للإصابة؛ الدمج والقدر على إضفاء مستويات عالية ومدة التعبير الجيني العلاجي). تتضمن العناصر في الناقل فيروسي؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ التي يمكن استنساخها me 0 إشارة dias تكرار طرفي (dosh مسارات بولي بورين polypurine tracts وعنصر استجابة
عكسية .(RRE) reverse response element في أحد نماذج الكشف» يتم تعديل منطقة تكرار طرفي طويل بواسطة استبدال معزز تكرار طرفي dish الفيروسي مع معزز غير متجانس. في أحد النماذج؛ يتم استبدال المعزز ل 5' تكرار طرفي طويل مع معزز غير متجانس. تتضمن أمثلة المعززات غير المتجانسة التي يمكن 5 استخدامهاء على سبيل المثال لا الحصرء فيروس تكوين تركيز طحالي Sine معزز قابلة للحث
بواسطة تترا سيكلين» منطقة تحكم في موقع |-جلويين ومعزز (|-جلوبين؛ ومعزز فيروس مضخم
للخلايا. في بعض النماذج؛ تتضمن النواقل الفيروسية البطيئة وفقا للكشف أيضا نواقل تم تعديلها للتحسين عند الأمان في استخدام النواقل Jie عوامل توصيل جين في علاج جيني. في أحد نماذج الاختراع؛ يتم تعديل منطقة تكرار طرفي ie lish 3" تكرار طرفي طويل؛ من الناقل في 3لا if المناطق (US حيث يتم تكوين ناقل ذاتي التنشيط . تساهم هذه التعديلات في زيادة أمان dal لأغراض توصيل جين. في أحد النماذج؛ يتضمن ناقل ذاتي التنشيط وفقا للاختراع Cada في 3" تكرار طرفي طويل حيث يتم استبدال oda من منطقة 3لا بعنصر عازل. يقوم العازل بمنع متواليات محسن/معزز enhancer/promoter في Jalal من التأثير على التعبير عن جين في
0 جينوم مجاورء والعكس (Sally لمنع المتواليات الجينومية genomic sequences من التأثير على التعبير عن الجينات في الناقل. في نموذج آخر وفقا للاختراع؛ يتم تعديل 3' تكرار طرفي dish بحيث يتم استبدال المنطقة Mie (US مع متوالية بولي (A) متعددة. يجب ملاحظة أن التعديلات إلى تكرارات طرفية طويلة مثل التعديلات إلى 3' تكرار طرفي طويل؛ يتم أيضا تضمين 5" تكرار طرفي dish أو كل من 3' و5" تكرارات طرفية طويلة؛ في الاختراع.
يمكن أن يكون معزز الناقل الفيروسي البطيء عبارة عن معزز مرتبط بشكل طبيعي (أي؛ حيث تتم مع خلية في الكائن الحي) أو بشكل غير طبيعي مع المنطقة 5' المحيطة لجين معين. So اشتقاق المعززات من جينومات حقيقية النواة ceukaryotic genomes الجينومات الفيروسية viral genomes أو متواليات تخليقية .synthetic sequences يمكن اختيار معززات بحيث تكون غير انتقائية (نشطة في كل الأنسجة) lia) فيروس تكوين تركيز طحالي)؛
0 الانتقائية للنسيج Mia) (منطقة تحكم موضعي)؛ المنظمة بواسطة عمليات منظمة طبيعية؛ منظمة بواسطة عقاقير مستخدمة خارجيا Ole) تترا سيكلين)» أو منظمة بواسطة الحالات الفسيولوجية الانتقائية مثل تلك المعززات التي يمكن تنشيطها أثناء استجابة طور حادة أو تلك التي يتم تنشيطها فقط في خلايا متكاثرة replicating cells تتضمن الأمثلة غير المقيدة للمعززات في الاختراع الحالي تركيز المعزز الفيروسي المكون على الطحال؛ معزز قابل للحث بتترا سيكلين» منطقة تحكم
5 في موقع ]-جلويين ومعزز (]|-جلويين؛ فيروس مضخم للخلايا Grae معزز تكرار طرفي dish ارتجاعي؛ فيروس مضخم للخلايا بالتوسط في معزز مبكر؛ معزز 51/40؛ ومعزز ربداكتاز داي
هيدرو فولات reductase promoter ©816ا007000. يمكن Lead اختيار المعزز من تلك المبينة للتعبير انتقائيا في أنواع الخلية التي يمكن أن تكون مرتبطة بظروف شاملة؛ على سبيل المثال لا الحصرء أمراض الهيموجلويين. في أحد نماذج الاختراع؛ المعزز عبارة عن خلية معينة بحيث يتم تقييد التعبير الجيني بخلايا الدم الحمراء. يتم تحقيق عملية تعبير انتقائية للكرية الحمراء باستخدام منطقة معزز ]-جلويين بشرية human (3—globin promoter region ومنطقة تحكم موضعي.
سوف يقوم الممارسون ذو الخبرة بإدراك أن اختيار المعزز للتعبير عن البولي نيكلوتيد polynucleotide محل الاهتمام على الناقل؛ القالب الجيني للحمض النووي nucleic acid 8 نيع الخلية المستهدفة؛ والأثر البيولوجي المطلوب. سوف يقوم الممارسين ذو الخبرة 0 بإدراك أيضا في اختيار المعززء أن المتغيرات يمكن أن تتضمن: تحقيق مستويات عالية من التعبير الجيني لتحقيق أثر فسيولوجي؛ الحفاظ على مستوى التعبير الجيني الأساسي؛ تحقيق التنظيم المؤقت للتعبير الجيني؛ تحقيق التعبير الانتقائي لنوع الخلية؛ تحقيق التنظيم الصيدلاني؛ الغدد الصماء 6000000©6؛ النظير الصماوي «paracrine أو الإفراز الذاتي autocrine 007 لتعبير الجيني expression 9606؛ ومنع المستويات غير المناسبة أو غير 5 المطلوية للتعبير. سوف تعتمد أي مجموعة محددة من متطلبات الاختيار على الظروف ولكن سيتم تحديدها بمجرد تحديد المتطلبات المعينة. في أحد نماذج الاختراع؛ المعزز انتقائي للخلية بحيث يتم تقييد التعبير الجيني بخلايا الدم الحمراء. يتم تحقيق التعبير الانتقائي للكرية الحمراء باستخدام
منطقة معزز (]-جلويين بشرية ومنطقة تحكم موضعي. التقنيات المعيارية الخاصة ببناء نواقل تعبير مناسبة للاستخدام في الاختراع الحالي معروفة 0 للخبير في المجال ويمكن أن تكون موجودة في هذه المنشورات مثل Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.
Cold Spring )1989( (Harbor, N.Y هناك تشكيلة من الاستراتيجيات المتاحة من أجل ريط شظايا (DNA يعتمد اختيارها على طبيعية مصطلحات شظايا DNA وحيث تؤدي اختياراتها بواسطة الخبير في المجال. يمكن استخدام نواقل علاج جيني Gene therapy vectors وفقا للاختراع الحالي؛ مثل 5 يمكن استخدام النواقل الفيروسية البطيئة السابقة؛ للتعبير عن تشكيلة من SIRNAS علاجية في
خلايا حمراء محولة. في أحد النماذج؛ ال SIRNA محل الاهتمام الذي سيتم التعبير عنه في الناقل المشتق من الجين الذي يمكن استخدامه لعلاج مرض هيموجلويين» مثل siRNA إلى BCLITA تتضمن بنيات العلاج الجيني المعينة وفقا للاختراع» على سبيل المثال لا الحصرء تلك المبينة في الشكل 2. تم توضيح النواقل الفيروسية البطيئة الموضحة هنا تخطيطيا مع جذع shRNA 5 يحتوي على متوالية تستهدف MRNA 80111/8؛ في حين تكون الحلقة انتقائية ل 3. كل منها تحتوي على مرقم فلورو كروم aig (Venus) fluorochrome marker بناؤها في أساس دلتا-3لا LEGO ذاتي التنشيط (Ferhse Lab) ألمانيا). تم استخدام استبعاد فيروس بطيء متتابع؛ حيث يتم التعبير عن ShRNA المستهدف عبر معزز فيروس تكوين تركيز طحالي الذي يتم التعبير die بقوة وبشكل مطلق؛ لتقييم وظيفية وسمية ShRNA المستهدف. تم 0 استخدام استبعاد فيروس بطيء قابل للحث؛ حيث يتم التعبير عن ShRNA عبر معزز قابل للحث بواسطة PGK تترا سيكلين» لتقييم الآثار المعتمدة على الوظيفة والجرعة والمخطط ل ShRNA المستهدف. الفيروس البطيء الانتقائي للسلالة؛ Cus يتم التعبير عن ShRNA عبر منظر منطقة تحكم موضعي لمعزز م]-جلوبين (مواقع فائقة الحساسية ل «Lab Naldini 152/3 DNA إيطاليا) عبارة عن اختيار علاج للتحقق من الأنظمة في الكائن الحي. تتضمن مناطق تكرار طرفي طويل أيضا المنطقة 3لا والمنطقة (US بالإضافة إلى منطقة >*ا. يمكن تعديل المناطق 3لا و5لا معا أو بشكل مستقل لتكوين ناقل ذاتي التنشيط؛ بالتالي زيادة أمان الناقل للاستخدام في توصيل
الجين. يمكن تعديل المناطق 3لا و5لا Lead لتتضمن عنصر عازل insulator element يمكن تنفيذ خطوة تسهيل إنتاج الجسيمات الفيروسية المعدية في الخلايا باستخدام التقنيات dpa) مثل تقنيات نمو growth techniques مزرعة الخلية المعيارية standard cell 0 016ا0ا0. عند الحاجة بواسطة الممارس ذو الخبرة؛ يمكن تحضير المحاليل المخزونة من فيروس بطيء lentiviral stock solutions باستخدام النواقل وطرق وفقا للاختراع Jal طرق تحضير المحاليل المخزونة معروفة في المجال وتم توضيحهاء ie في Y.
Soneoka et al. Nucl.
Acids Res. 23:628-633, and N.
R.
Landau et al. (1992) J. )1995( Virol. 66:5110-5113 بالطريقة التي تقوم بإنتاج محلول مخزون stock solution في 5 الاختراع الحالي؛ يتم نقل خلايا الفيروسات البطيئة (المشار Led) هنا بخلايا منتجة) مع النظام الناقل وفقا للاختراع الحالي. بعد ذلك يتم نمو الخلايا في ظروف مزرعة مزرعة خلية مناسبة؛
والجسيمات الفيروسية البطيئة المجمعة من أي من الخلايا نفسها أو من وسط الخلية كما هو موضح أعلاه. تتضمن سلالات الخلايا المنتجة؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ سلالة خلية الكلى الجنينية البشرية 293؛ خلايا الأدمة للخيول (NBL-6 وسلالة الخلايا الصعترية الجنينية للكلاب .Cf2TH 5 يمكن تنفيذ خطوة جمع الجسيمات الفيروسية المعدية infectious virus particles باستخدام التقنيات التقليدية. Ole يمكن جمع الجسيمات المعدية بواسطة تحليل الخلية؛ أو جمع المادة الطافية supernatant لخلية المزرعة cell culture كما هو معروف في المجال. اختيارياء (Say تنقية جسيمات الفيروس المجمعة collected virus particles تقنيات التنقية المناسبة معروفة جيدا للخبراء في المجال.
Kay, العثور على طرق تتعلق باستخدام نواقل فيروسية في علاج جيني؛ مثلا؛ في (Sa 10
M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):1385-1425; Ferry, N. and Heard, J.
M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, .ا et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule,
P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. 5. (1992)
Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; 15
Brody, 5. .ا and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90- 101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172;
Smith—Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; .and Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-38 Sa 20 إعطاء النواقل الفيروسية الارتجاعية (Retroviral vectors شاملة النواقل الفيروسية البطيئة dlentiviral vectors كما هو موضح أعلاه أو WIA تحتوي عليهاء في الكائن الحي إلى الخاضعين بواسطة أي مسار مناسب؛ كما هو معروف في المجال. يشير المصطلح 'إعطاء" إلى مسار إدخال ناقل مصاغ في الجسم. مثلاء يمكن أن يكون الإعطاء عبر الأوعية أو الشريان الوريد أو العضل أو موضعيا أو فمياء أو بواسطة مسدس جيني أو أداة ترذيذ فوقية. 5 بالتالي؛ يمكن أن يكون الإعطاء مباشرا إلى النسيج المستهدف أو من خلال التوصيل الجهازي. يمكن توجيع عملية الإعطاء بالحقن إلى نخاع العظم. يمكن أن يتضمن الإعطاء المباشر إلى
النسيج المستهدف الحقن بإبرة؛ الترذيذ الفوقي؛ الرحلان الكهربي electroporation أو المسدس الجيني .gene gun انظر؛ Sli براءة الاختراع الدولية رقم18759/93 ؛ والتي تم دمجها هنا بالإشارة إليها كمراجع. بشكل بديل» يمكن إعطاء النواقل الفيروسية الارتجاعية وفقا للاختراع خارج الكائن الحي أو في المعمل إلى WIA أو أنسجة باستخدام تقنيات الإصابة المعيارية المعروفة جيدا في المجال. في أحد النماذج» يمكن تحويل النواقل الفيروسية الارتجاعية وفقا للاختراع في خلايا Able LAY dlls الجذعية الجنينية embryonic stem cells خلايا Leds جسمانية؛ أو خلايا أساسية. تتضمن أمثلة الخلايا العائلة الأساسية التي يمكن تحويلها بواسطة النواقل الفيروسية الارتجاعية وفقا للاختراع مواد كاشفة precursors لكريات الدم الحمراء erythrocytes وخلايا 0 جذعية مكونة للدم. في نموذج آخرء الخلية العائلة عبارة عن erythrocyte ches LS يمكن استخدام خلايا محولة Alle كطريقة تحقيق التعبير SEY) عن الخلايا الحمراء للجين محل الاهتمام في علاج أمراض الهيموجلوبين. يقوم جاتب AT من الاختراع بالحفاظ على تركيبات صيدلانية للنواقل الفيروسية البطيئة وفقا للاختراع. في أحد النماذج» تتضمن التركيبة ناقل فيروسي بطيء بكمية فعالة LES Ladle لعلاج أو تقليل خطر الإصابة ب (مثلا تخفيف أعراض مرض هيموجلوبين) وحامل مقبول صيدلانيا. يشير المصطلح LS فعالة علاجيا" إلى كمية (lad عند جرعات ولمدد مطلوية من الوقت؛ لتحقيق الأثر العلاجي المطلوب؛ Jie علاج أو الوقاية من Als هيموجلوبين مرضية. يمكن أن تكون الكمية الفعالة العلاجيا للناقل الفيروسي البطيء وفقا لعوامل مثل الحالة المرضية والسن وجنس ووزن الأفراد» وقدرة الناقل الفيروسي البطيء على إثارة استجابة مطلوية في الفرد. 0 يمكن تعديل أنظمة الجرعة لتوفير الاستجابة العلاجية المطلقة. أيضا تم وزن كمية فعالة علاجيا أيضا حيث يكون هناك في آثار سمية أو ضارة للناقل الفيروسي البطيء بواسطة الآثار المقيدة علاجيا. يمكن تقييم السمية القوية للنواقل الفيروسية البطيئة وفقا للاختراع باستخدام فحوص قائمة على أساس الخلية أو نماذج حيوان معروفة في المجال ويمكن اختيار مضمن فعال علاجيا والذي لا يبين سمية مميزة. في نموذج مفضل؛ الكمية الفعالة Ladle لناقل فيروسي بطيء مناسبة لعلاج 5 مرض هيموجلوبين.
يمكن تحضير المحاليل المعقمة القابلة للحقن بواسطة دمج ناقل فيروسي بطيء lentiviral vector بالكمية المطلوية في مذيب مناسب مع واحد أو توليفة من المكونات المذكورة coded كما هو مطلوب؛ متبوعا بواسطة التعقيم المرشحة. بشكل ale يتم تحضير مشتتات بواسطة دمج المكون النشط في ناقل معقم sterile vehicle والتي تحتوي على وسط تشتيت أساسي basic dispersion mediu 5 والمكونات الأخرى المطلوية من تلك المذكورة أعلاه. في حالة المساحيق المعقمة sterile powders لتحضير المحاليل المعقمة القابلة للحقن sterile dnjectable solutions تتضمن الطرق المحضرة للتحضير هي التجفيف بالتفريغ والتجفيف بالتجميد والتي تؤدي إلى مسحوق من المكون النشط بالإضافة إلى أي مكون إضافي مطلوب من
محلول معقم مرشح sterile—filtered solution سلفا مما سبق. 10 سوف تتم ملاحظة أن قيم الجرعة يمكن أن تختلف مع حدة الحالة التي سيتم تخفيفها. سوف يتم أيضا فهم أن هناك أي خاضع معين»؛ يمكن تعديل أنظمة الجرعات الانتقائية على مدار الوقت وفقا لحاجة الفرد والحكم المهني لإعطاء الشخص أو الإشارة على إعطاء التركيبات؛ Oly نطاقات الجرعة المذكورة هنا مثالية فقط ولا يقصد بها تقييد منظور أو ممارسات التركيبة المطلوب حمايتها. في أحد النماذج؛ تتفاوت الجرعة من 108-103 جسيم فيروسي viral particles | 50 كجم وزن. في نماذج (gil تتفاوت الجرعة من 105-103 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن؛ 106-104 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن» 107-105 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن» 103- 108 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن٠ في أحد النماذج؛ الجرعة is حوالي 104 جسيم فيروسي /
0 كجم وزن. يمكن أن تختلف كمية الناقل الفيروسي في التركيبة وفقا لعوامل مثل الحالة المرضية والسن 0 والنوع ووزن الفرد. يمكن تعديل أنظمة الجرعة لتوفير الاستجابة العلاجية المطلقة. Ole يمكن إعطاء daly فردية؛ يمكن إعطاء الجرعات المقسمة المتعددة على مدار الوقت أو يمكن تقليل أو زيادة الجرعة نسبيا كما هو مشار إليه بواسطة الضرورات التي تحتمها الحالة العلاجية. سوف يكون من المفيد خصوصا صياغة تركيبات حقن في وحدة جرعة لسهولة الإعطاء وتجانس الجرعة. تشير صورة وحدة الجرعة حسب الاستخدام هنا إلى وحدات تقوم بالإفراز ماديا بشكل مناسب 5 كجرعات متجانسة للخاضعين الثديين الذين يتم علاجهم؛ تحتوي كل وحدة على كمية محددة سلفا من مكون نشط محسوب بأنه يؤدي إلى الأثر العلاجي المطلوب مرتبط بالحامل الصيدلاني
— 4 6 — المطلوب . تم ذكر صورة وحدة الجرعة وفقا للاختراع بواسطة JS يعتمد مباشر على 0 الخواص الفريدة للمكون النشط والأثر العلاجي الذي سيتم تحقيقه؛ و(ب) القيود الخاصة بالمجال لتحضير المركب Jie حساسية المركب الفعال في الأفراد. مع ذلك؛ بالنسبة لأي duane Alla يمكن تحديد 'كمية فعالة" مناسبة بواسطة أي من ذو الخبرة العادية في المجال باستخدام التجارب الروتينية asd يشير الاختراع الحالي؛ في نماذج معينة؛ إلى خلايا معدلة جينيا للتعبير عن البولي ببتيدات العلاجية 5 RNAS مثبطة مذكورة هناء للاستخدام في علاج أمراض الهيموجلوبين. حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح "مصمم جينيا" أو "معدل جينيا" إلى إضافة؛ حذف؛ أو تعديل المادة الجينية في الخلية. يتم استخدام المصطلحات؛ WA" معدلة genetically modified Lia LA" "ccells 0 معدلة cells 00001060" وء "خلايا موجهة “redirected cells بالتبادل. فى نماذج معينة؛ تم تعديل الخلايا المحولة مع نواقل مذكورة هنا جينيا. حسب ١ لاستخدام هناء يشير المصطلح "علاج جيني" إلى إدخال مادة جينية خارجية extra genetic material في صورة DNA أو RNA في المادة الجينية الكلية في خلية التي تستخلص أو تصحح أو تعدل فسيولوجيا الخلية لتوفير الناتج العلاجي المطلوب. في العديد من النماذج؛ يتم تحويل الخلايا المعدلة جينيا المذكورة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي مع نواقل lad للاختراع؛ وتم التمدد اختياريا خارج الكائن الحي ٠. بعد ذلك يتم إعطاء تتضمن WAY المناسبة هنا للتحويل والإعطاء في طرق العلاج الجيني المذكورة هناء على سبيل المثال لا الحصر خلايا جذعية؛ WIA أساسية؛ وخلايا متمايزة. في النماذج المعينة؛ 0 الخلايا المحولة عبارة عن الخلايا الجذعية الجنينية؛ نخاع العظم DA جذعية؛ WA جذعية من الحبل السري » خلايا جذعية من المشيمة؛ WDA جذعية وسيطة؛ WIA جذعية مكونة للدم « Wa حمراء أساسية؛ وخلايا حمراء. تؤدي الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى خلايا أساسية مكونة للدم Hematopoietic (HPCs) stem cells قادرة على توليد المخزون الكامل لخلايا الدم على مدار حياة الكاثن. 5 يشير المصطلح "خلية جذعية مكونة للدم" أو "156" إلى WIA جذعية متعددة النقطة التي تنتج عن كل أنواع الدم بالكائن» شاملة السلالات النقوية Mie) أحادية الخلية monocytes والبلاعم
neutrophils «lds sully macrophages والخلايا الصبغية basophils الخلايا اليوزينية ceosinophils كريات الدم الحمراء» الخلايا المنواة الكبيرة Flall/megakaryocytes (platelets الخلايا المتغضنة «(dendritic cells والسلالات الليمفاوية lymphoid lineages Sly) خلايا 1 خلايا 8؛ خلايا (NK وغيرها من في المجال (انظر Fei, R., etal. براءة الاختراع الأمريكية رقم ¢5635387 (McGlave, et al. براءة الاختراع الأمريكية رقم 4 .اه sel, «Simmons, P., et الاختراع الأمريكية رقم 5677136؛ (Tsukamoto, et al. براءة الاختراع الأمريكية رقم 5750397؛ «Schwartz, et al. براءة الاختراع الأمريكية رقم 5759793؛ et al. ,510أن016؛ براءة الاختراع LN) رقم (Tsukamoto, et 21. 9 براءة الاختراع الأمريكية رقم 5716827). عند الزراعة في 0 حيتوات أو بشر تعرضوا للإشعاع بشكل Jil يمكن أن تقوم الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا الأساسية بإعادة تجميع الخلايا الحمراء»؛ نيوروفيل-بلعم «neutrophil-macrophage خلية منواة كبيرة Megakaryocyte ومجموعة خلية ليمفاوية مكونة تلدم lymphoid hematopoietic cell .pool في بعض النماذج؛ الخلايا المحولة transduced cells عبارة عن خلايا جذعية مكونة لدم و/أو خلايا أساسية معزولة من نخاع العظم» دم الحبل السري cumbilical cord blood أو الدورة الدموية المحيطة peripheral circulation في نماذج معينة؛ الخلايا المحولة عبارة عن خلايا جذعية مكونة للدم معزولة من نخاع العظم» دم الحبل السري؛ أو الدورة الدموية المحيطة. في أحد النماذج؛ الخلايا المكونة للدم عبارة عن خلايا +06034. في أحد التماذج؛ الخلايا المكونة للدم عبارة عن shes WIA أساسية erythroid .progenitor cells 0 في أحد النماذج؛ الخلايا المكونة للدم عبارة عن WIA حمراء . يمكن أن تكون الخلايا وفقا للاختراع ذاتية المنشاً/خيفية (SY) أو غير ذاتية Land) pe’) ذاتية؛" Ole خيفية allogeneic مسانج syngeneic أو غيروي 6أ600986106). يشير لذاتية المنشاء” حسب الاستخدام هناء إلى خلايا من نفس الخاضع. يشير "خيفية؛” حسب الاستخدام 5 هناء إلى خلايا من نفس النوع والتي تختلف جينيا إلى الخلية محل المقارنة. يشير 'مسانج" حسب الاستخدام cls إلى خلايا خاضع مختلف متطابقة جينيا مع الخلية محل المقارنة. يشير "غيروي؛"
حسب الاستخدام هناء إلى خلايا مختلفة عن الخلية محل المقارنة. في النماذج المفضلة؛ الخلايا وفقا للاختراع خيفية. يشير "خلية معزولة" إلى خلية تم الحصول عليها من نسيج في الكائن الحي أو عضو وخالي بشكل أساسي من المصفوفة خارج الخلية. تتضمن الأمثلة التوضيحية على خلايا معدلة جينيا المناسبة من أجل علاجات قائمة على أساس الخلية المذكورة هناء على سبيل المثال لا الحصر: الخلايا الجذعية الجنينية؛ نخاع العظم خلايا جذعية bone marrow stem cells خلايا جذعية من الحبل السري umbilical cord WIA stem cells جذعية مشيمية Leds LA placental stem cells لحمية متوسطية Leds LIA «mesenchymal stem cells مكونة DIA all أساسية مكونة للدم؛ خلايا أساسية نقوية cmyeloid progenitors الخلايا الأساسية الحمراء»؛ وغيرها من الخلايا الحمراء . في النماذج المفضلة؛ تتضمن الخلايا المناسبة لعلاجات قائمة على أساس الخلية المذكورة هناء على سبيل المثال لا الحصر: خلايا جذعية مكونة للدم أو خلايا أساسية progenitor WIA (cells سليفة أرومية حمراء WAN cproerythroblasts الصبغية الحمراء الأرومية (basophilic erythroblasts الخلايا حمراء متعددة الألوان polychromatic cerythroblasts الخلايا الحمراء الحساسة للتلون corthochromatic erythroblasts كريات 5 الدم الحمراء متعددة الألوان polychromatic erythrocytes وكريات الدم الحمراء» أو أي توليفة مما سبق. طرق dle أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين يقدم الاختراع الحالي تركيبات محسنة وطرق لزيادة إنتاج HOF في خلية؛ بواسطة إعطاء نواقل تثبط التعبير عن /86111. تبين البيانات أن تثبيط 801117 يؤدي إلى زيادة التعبير من جينات y جلويين genes 0510ا7-9. كما هو موضح (lis أحد أهداف الاختراع الحالي هو توفير تركيبات وطرق لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني في خلية. في بعض ial) الخلية Sle عن خلية جذعية جنينية؛ خلية Leds جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية Leds مكونة للدم؛ خلية أساسية مكونة للدم أو ذرية مما سبق. بالتالي؛ يقدم أحد جوانب الاختراع طرق لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني الذي يتم 5 التعبير عنه بواسطة خلية؛ يتضمن خطوات ملامسة خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم» خلية جذعية مكونة للدم» أو مكونة للدم مع كمية فعالة من تركيبة
تتضمن على الأقل فيروس أو JU يتضمن جزيء حمض نووي موضح هناء بالتالي يتم تقليل التعبير عن 801117 وتتم زيادة التعبير عن هيموجلوبين جنيني في الخلية؛ أو ذريتهاء نسبة إلى الخلية قبل هذه الملامسة. في أحد النماذج؛ يقوم الناقل أو فيروس بالتعبير عن عامل تداخل RNA والذي هو عبارة عن BCL11IMicroRNA والذي يثبط /80111؛ وبالتالي تقليل التعبير عن .BCL11A فيما يتعلق بملامسة خلية مع مثبط ل 80111/4؛ تشير "زيادة مستويات الهيموجلويين الجنيني” في خلية إلى أن HBF على الأقل 75 أعلى في مجموعات معالجة BCLIIA Li أكثر منها في عينة مقارنة؛ مجموعة مقارنة؛ حيث لا يوجد مثبط /86111. يفضل أن تكون نسبة التعبير عن HDF في مجموعة Laie 8011178 معالجة على الأقل 710 أعلى؛ على الأقل 0 720 أعلى؛ على الأقل 730 (lel على الأقل 740 أعلى؛ على الأقل 750 del على الأقل 0 أعلى»؛ على الأقل 770 (lel على الأقل 780 أعلى؛ على الأقل 790 أعلى؛ على الأقل 1-طية (lel على الأقل 2-طية clef على الأقل 5-طية أعلى؛ على الأقل 10 طية أعلى؛ على الأقل 100 طية «lef على الأقل 1000-طية (del أو أكثر من مجموعة معالجة مقارنة ذات حجم قابل للمقارنة وظروف زراعة. يتم استخدام المصطلح "مجموعة معالجة "alae هنا 5 لوصف مجموعة من خلايا التي تمت معالجتها بأوساط متطابقة؛ حث فيروسي؛ متواليات حمض نووي nucleic acid sequences درجة shall اقتران» حجم وعاء؛ درجة حموضة؛ إلخ.؛ باستثناء أوليجونيكلوتيد Oligonucleotide غير مستهدف. في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة (ls يشتبه في الخاضع أن يكون لديه؛ أو يوجد Gh أو مصاب بمرض هيموجلوبين؛ Sle مرض الخلية المنجلية أو ثلاسيميا. سوف تتضمن مخارات الممارس العادي أن يتعرف الخاضع الذي al أو معرض sare Glas hal يمكن أن يكون الخاضعين هم هؤلاء الذين خضعوا لتشكيلة من العلاجات الإضافية. بالتالي؛ lie يمكن أن يكون الخاضعين هم هؤلاء اللذي تم علاجهم بأوكسيجين؛ هيدروكسي يوريا hydroxyurea حمض فوليك (folic acid أو نقل دم. تتضمن طرق توصيل عوامل تداخل (RNA مثلاء SIRNA أو نواقل تحتوي على عامل تداخل (RNA إلى الخلايا المستهدفة؛ Ole كريات الدم الحمراء أو غيرها من WIA المستهدفة
المطلوية؛ للاستهلاك حقن تركيبة تحتوي على عامل تداخل (RNA interference agent مثلاء SIRNA أو بشكل مباشر ملامسة الخلية؛ مثلاء كرية حمراء»؛ مع تركيبة تتضمن عامل تداخل SIRNA Jie (RNA في نموذج آخرء عامل تداخل lie (RNA يمكن حقن siRNA بشكل مباشر في أي وعاء دموي Jie blood vessel الوريد vein أو الشريان artery أو شعيرات وريد venule أو شعيرات شريان arteriole عبرء مثلاء الحقن الهيدروديناميكي أو القسطرة. يمكن أن يكون الإعطاء بواسطة حقن فردي أو بواسطة اثنين أو أكثر من عمليات الحقن. يتم توصيل عامل تداخل RNA في dela مقبول صيدلانيا. يمكن استخدام واحد أو أكثر من عامل
BCLI1A واحد فقط يستهدف SIRNA آنيا. في أحد النماذج المفضلة؛ يتم استخدام RNA Jal بما يقيد قوة الآثار الجانبية (RNA بشري. في أحد النماذج؛ يتم استهداف خلايا معينة مع تداخل RNA Jalal 0 الناتج بواسطة الاستهداف غير الانتقائي لتداخل RNA يمكن أن تقوم الطريقة باستخدام؛ lia معقد أو جزيء دمج يتضمن شق استهداف خلية وشق ربط تداخل RNA يتم استخدامها لتوصيل تداخل RNA بفاعلية في الخلايا. Sle بروتين دمج fusion protein جسم مضاد-بروتامين antibody-protamine عند الخلط ب «sIRNA وترتبط ب SIRNA وتقوم SIRNA dua انتقائيا في خلايا التعبير عن age ضد antigen تم التعرف عليه بواسطة 5 الجسم المضاد Le antibody يؤدي إلى إسكات التعبير الجيني فقط في هذه الخلايا التي تعبر عن مولد الضد. شق ربط SIRNA أو جزيء حث تداخل RNA عبارة عن بروتين أو نطاق ربط حمض نووي أو شظية من بروتين» وبتم دمج شق الربط ga من الشق المستهدف. يمكن أن يكون موقع الشق المستهدف Ll في شق كريوكسيل carboxyl-terminal أو طرف أمينو للبنية @amino-terminal end أو في وسط بروتين الدمج. يمكن أن تكون آلية التوصيل الفيروسية التي 0 تتم التوسط فيها أيضا لتوصيل SIRNAS إلى خلايا في المعمل وفي الكائن all كما هو موضح في (20)10(:1006 Xia, H. et al. (2002) Nat Biotechnol يمكن أيضا استخدام آليات توصيل delivery mechanism يتم التوسط فيها بواسطة بلازميد- أو فيروس 1 ShRNA لتوصيل ShRNAS بخلايا في المعمل وفي الكائن all كما هو موضح في Rubinson, D. A., et al. ((2003) Nat. Genet. 33:401-406) and Stewart, 5. A., et al. RNA 9:493-501) 5 )2003((. يمكن إدخال عوامل تداخل (RNA مثلا siRNAs أو ShRNAS مع مكونات تقوم بتنفي واحد أو أكثر من النشاطات التالية: وتقوم بتحسين استهلاك
عوامل تداخل SIRNA Oe (RNA بواسطة الخلية؛ مثلاء الخلايا الليمفاوية أو غيرها من الخلاياء تقوم بتثبيط تصلب الجدائل الفردية أو تثبيت الجدائل الفردية أو تسهيل التوصيل إلى الخلية المستهدفة وتقوم بزيادة تثبيط الجين المستهدف؛ lie 861117. سوف تكون جرعة عامل تداخل RNA المعين بكمية لازمة لتنفيذ تداخل lie (RNA إسكات جيني ما بعد الترجمة؛ للجين المستهدف المعين؛ وبالتالي يؤدي إلى تثبيط التعبير الجيني المستهدف أو نشاط تثبيط أو مستوى البروتين المرمز بواسطة الجين المستهدف. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم تلامس LAY الجذعية الجنينية؛ خلية Leds جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم خارج الكائن الحي أو في المعمل. في نموذج معين؛ الخلية التي تتم ملامستها عبارة عن خلية من 0 السلالة الحمراء. في أحد النماذج؛ تقوم التركيبة بتثبيط التعبير عن BCLI1A في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية plas عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم معزولة من الخاضع قبل ملامسة مع التركيبة الموضحة هنا أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:1- 5 18-10:13,؛ 44-25؛ أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن BCL1IMicroRNA تخليقي موضح هنا. تتضمن خلايا الدم الناضجة Mature blood cells دورة حياة متناهية ويجب أن يتم استبدالها بشكل مستمر خلال الحياة. يتم إنتاج خلايا الدم بواسطة تكاثر وتمايز المجموعة الصغيرة متعددة القدرة لخلايا جذعية مكونة للدم التي تتضمن أيضا القدرة على استكمال نفسها بواسطة 0 التجديد الذاتي. خلايا جذعية مكونة للدم متعددة alll عبارة عن خلايا أساسية ذاتية التجديد تتطور من WIA أرومية متوسطة وعائية .mesodermal hemangioblast cells خلايا جذعية مكونة للدم عبارة عن خلايا الدم blood cells تنتج كل خلايا الدم الأخرى؛ التي تتضمن كل WDA الدم المتمايزة من السلالات الحمراء» الليمفاوية والنقوية. WA جذعية مكونة للدم موضوعة في نخاع العظم mali) الدم المحيط» ودم الحبل السري. أثناء «lal تتطور ذريات خلية جذعية مكونة للدم خلال العديد من مراحل نضج وسيطة؛ بما يولد WDA أساسية مكونة للدم متعددة القدرة وخلايا أساسية مكونة للدم مرتبطة
DLL قبل الوصول إلى النضج. نخاع العظم عبارة عن الموقع الأغلب لتكون الدم في البشر و6 تحت الظروف الطبيعية؛ فقط أعداد صغيرة من WA جذعية مكونة للدم وخلايا أساسية مكونة للدم يمكن أن تكون موجودة في الدم المحيط. العلاج بسيتوكينات cytokines (تحديدا عامل مستعمرة تحفز colony-stimulating factor الخلايا الحبيبية «(G-CSF granulocyte يمكن أن تقوم العقاقير النقوية القامعة myelosuppressive drugs المستخدمة في علاج السرطان ccancer والمركبات التي تعيق التفاعل بين خلايا مكونة للدم وخلايا نخاع العظم اللحمية بنقل أعدد كبيرة من الخلايا الجذعية والخلايا الأساسية في الدورة الدموية. يتم استخدام "خلية أساسية مكونة للدم "Hematopoietic progenitor cell كمصطلح هناء والذي يشير إلى خلايا من رابط خلية جذعية مكونة للدم hematopoietic stem cell lineage 0 والتي تنتج كل أنواع خلايا الدم شاملة السلالات النقوية (أحاديات الخلية monocytes والبلاعم؛ النيوروفيلات؛ LIAN الصبغية؛ الخلايا اليوزينية؛ كريات الدم الحمراء؛ الخلايا المنواة الكبيرة/الصفائح؛ الخلايا المتغضنة)؛ والسلالات الليمفاوية (TLR) خلايا 8؛ خلايا >الا). يشير المصطلح 'خلية من السلالة الحمراء" إلى أن الخلية الملامسة عبارة عن خلية تخضع لتكوين الدم بحيث عند التمايز النهائي تقوم بتكوين كرية حمراء أو خلية دم حمراء. تنتمي هذه الخلايا إلى واحد 5 .من ثلاثة سلالات؛ الحمراء» الليمفاوية؛ والنقوية؛ الناتجة من خلايا نخاع العظم أساسية مكونة للدم. عند التعرض لعوامل النمو الانتقائي وغيرها من مكونات البيئة الدقيقة المكونة للدم يمكن أن تنضج الخلايا الأساسية المكونة للدم خلال سلسلة من أنواع التمايز الخلوي الوسيطة؛ كل وسائط السلالة الحمراء» في خلايا الدم الحمراء. JEL تتضمن WIA "السلالة الحمراء؛” Cus يتم استخدام المصطلح هناء WIA أساسية مكونة للدم؛ الأرومات المضرجة crubriblasts السليفات 0 المضرجة prorubricytes الخلايا الأرومية الحمراء erythroblasts الخلايا الحمراء السوية اللون metarubricytes ؛ الخلايا الشبكية reticulocytes وكريات الدم الحمراء. في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة (La تتضمن الخلية الأساسية المكونة للدم على الأقل واحد من مرقمات سطح الخلية cell surface marker التي هي من بين خواص WA الأساسية المكونة للدم: C-5 «CD38lo/~ (Thyl/CD90+ 6059+ (CD34+ 5 +0/060117. بشكل مفضل؛ تتضمن الخلايا الأساسية المكونة للدم العديد من هذه المرقمات .markers
في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة (lia تتضمن WAY الأساسية المكونة للدم من ADL) الحمراء خواص مرقم سطح الخلية من السلالة الحمراء: Ter119 5 CD71 في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة (bs تتضمن خلية جذعية مكونة للدم على الأقل واحد من خواص مرقم سطح الخلية من WA أساسية مكونة للدم: +0034 +0059؛
.C—kit/CD117+ 5 «CD38lo/- Thy1/CD90+ 5 ال خلايا جذعية مكونة للدم؛ المشابهة للخلايا الأساسية المكونة للدم؛ قادرة على تكاثر وإنتاج المزيد من WAY الأساسية التي تتضمن القدرة على توليد عدد كبير من خلايا أمهات يمكن بدورها أن تنتج WIA ذرية متمايزة أو غير قابلة للتمايز. يمكن حث خلايا الذرية للتكاثر وإنتاج ذرية يمكن أن تتمايز بالتالي في واحد أو أكثر من أنواع الخلية الناضجة «mature cell بينما 0 أيضا تتضمن واحد أو أكثر من الخلايا ذات القدرة على التطور الأبوي. يشير المصطلح "خلية جذعية stem cell بعد ذلك إلى خلية لها قدرة أو قوة؛ في ظروف dime للتمايز مع النمط الجيني المتخصص أو المتمايز؛ ووالتي تتضمن القدرة؛ في ظروف معينة؛ على التكاثر بدون التمايز بشكل أساسي. في أحد النماذج؛ يشير المصطلح خلية سلف أو خلية جذعية إلى خلية أم dle والتي تم تخصيص أبناؤها (ذرية)؛ غالبا ما تختلف الاتجاهات؛ بواسطة التمايزء lie 5 بواسطة الحصول على خواص فردية كاملة؛ كما يتم في الاختلاف التقدمي للخلايا الجنينية والأنسجة. التمايز الخلوي عبارة عن عملية معقدة تتم بشكل مثالي خلال العديد من أجزاء الخلية. يمكن أن تعمل الخلية المتمايزة derive من خلية متعددة القدرة lly تشتق هي نفسها من خلايا متعددة القدرة؛ وما إلى ذلك. بينما يمكن اعتبار كل هذه الخلايا متعددة القدرة LIA جذعية؛ يمكن أن يختلف نطاق أنواع الخلايا إلى بشكل يتم اعتباره. تتضمن بعض الخلايا المتمايزة أيضا القدرة 0 على إنتاج خلايا ذات قدرة تطور أكبر. يمكن أن تكون هذه القدرة طبيعية أو يمكن حثها صناعيا عند العلاج العديد من العوامل. في العديد من الحالات البيولوجية؛ WAY الجذعية أيضا 'متعددة القدرة” لأنها يمكن أن تنتج ذرية أكثر من من نوع خلية واحد مميزء ولكنها غير مطلوبة من أجل "التجذع.” التجديد الذاتي هو الجزء التقليدي الآخر من تعريف الخلية الجذعية؛ وسوف يكون من الضروري استخدامها في هذه الوثيقة. نظرياء يمكن أن يتم التجديد الذاتي بواسطة إما اثنين من الأليات الأساسية. يمكن أن يتم تقسيم الخلايا الجذعية بشكل غير متناظر؛ مع بنت واحدة تتمتع الحالة الجذعية والبنت الأخرى التي تعبر عن بعض وظيفة ونمط جيني معين آخر. بشكل بديل؛
يمكن أن تقوم بعض الخلايا الجذعية في مجموعة بالتقسيم بشكل مناظر في اثنين من الأجزاء الجذعية؛ بالتالي يتم الحفاظ على بعض الخلايا الجذعية في المجموعة (JSS بينما يمكن أن تقوم بعض الخلايا الأخرى في المجموعة إلى إنتاج ذرية متمايزة فقط. بشكل عام؛ تتضمن "لخلايا "Haul! نمط جيني خلوي أكثر بدائية (أي؛ موجود عند خطوة أولى على طول مسار تطور أو تقدم بدلا من خلية متمايزة كليا). (lle تتضمن الخلايا الأساسية أيضا قوة مميزة أو تكاثر عالي Las يمكن أن تنتج الخلايا الأساسية العديد من أنواع الخلية المميزة المتمايزة أو نوع خلية فردي متمايز؛ La يعتمد على مسار التطور وعلى بيئة يتم فيها تطور وتمايز الخلايا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم جمع الخلية الجذعية المكونة للدم أو خلية أساسية مكونة للدم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي camniotic fluid 0 دم المشيمة (placental blood أو نخاع العظم. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ أو يتم جمع خلية نخاع عظم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي؛ دم المشيمة؛ أو نخاع العظم. أصبحت خلايا الدم المحيط الأساسية Peripheral blood progenitor cells (PBPC) 5 هي المصدر المفضل لخلايا أساسية مكونة للدم من أجل الزراعة الانتقالية الخيفية وذاتية Lana) بسبب السهولة التقنية للجمع ووقت أقصر مطلوب للتطعيم. (Ladi تم استخدام عامل حث stimulating factor مستعمرة-خلية (G-CSF) granulocyte—colony duns _لحث المزيد من خلايا الدم المحيط الأساسية وإطلاق خلايا أساسية مكونة للدم من نخاع العظم. على الرغم من نجاح الأنظمة التي تستخدم عامل حث مستعمرة-خلية حبيبية عادة في جمع أعداد مناسبة من WIA الدم المحيط الأساسية من مانحين أصحاء؛ سوف تقوم نسبة 710-75 بنقل خلايا جذعية بشكل ضعيف ويمكن أن تتطلب الفصاد المتعدد كبير الحجم أو جمع نخاع العظم. في بعض نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم اختيار الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية Leds مكونة للدم لمرقم سطح +0034 قبل الملامسة. lL 25 في أحد نماذج أي طريقة موضحة (Ld تتم ملامسة خلية جذعية جنينية معزولة (CD34+ خلية Leds جسمانية معزولة +0034؛ خلية أساسية معزولة +0034؛ خلية نخاع
عظم معزولة +0034؛ خلية أساسية مكونة للدم معزولة (CD34+ أو HSC +6034 معزولة بالتركيبة الموضحة هنا أو تتم الملامسة مع الفيروس أو الناقل الذي يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25 أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن BCL1IMicroRNA تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم حفظ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم بالتجميد قبل أي ملامسة مع التركيبة الموضحة هنا أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25؛ أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن BCLIIMicroRNA 0 تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة ls تتم الملامسة في المعمل؛ خارج الكائن الحي أو في الكائن الحي. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم تكرار الملامسة مرة على الأقل. ذلك أن؛ بعد الملامسة الأولى الأولية للخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع 5 عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم مع التركيبة الموضحة هنا أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن BOLIIMicroRNA تخليقي موضح هناء يتم غسل الخلية؛ وبعد ذلك تتم ملامسة الخلية المغسولة لمدة ثانية مع التركيبة الموضحة هنا أو تتم ملامستها مع الفيروس أو 0 ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25( أو تتم ملامستها مع الفيروس أو ناقل التعبير عن BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا. في نماذج أخرى» يتم تكرار الملامسة مرتين على الأقل بعد الملامسة الأولى الأولية. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء بعد الملامسة؛ يتم حفظ خلية جذعية جنينية؛ خلية 5 جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية Leds
مكونة للدم التي تمت ملامستها بالتجميد قبل الاستخدام؛ Ole التمدد خارج الكائن الحي و/أو الزراعة في الخاضع. في أحد pila أي طريقة موضحة هناء بعد الملامسة؛ تتم زراعة خلية Leds جنينية؛ خلية Leds جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم الملموسة المتمددة خارج الكائن all قبل الاستخدام؛ lie الحفظ بالتجميد؛ و/أو زراعة/تطعيم في خاضع. في أحد pila أي طريقة موضحة ls بعد الملامسة؛ يتم تمايز خلية Leds جنينية؛ خلية Leds جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم التي تمت ملامستها في مزرعة خارج الكائن all قبل الاستخدام» Sie الحفظ 0 بالتجميد» و/أو زراعة/تطعيم في خاضع. في سياق نشوءٍ الخلية؛ الصفة 'متمايزة؛” أو "lad هي صفة نسبية. "الخلية المتمايزة” عبارة عن خلية تطورت أيضا في مسار التطور بدلا من الخلية التي تمت مقارنتها بها. بالتالي؛ يمكن تمايز DAY الجذعية إلى سلالة خلايا كاشفة مقيدة (مثل خلية أساسية مكونة للدم (hematopoietic progenitor cell والتي بدورها تتمايز في أنواع أخرى من الخلايا الكاشفة 5 الخلايا الكاشفة أيضا في المسار (مثل خلايا كاشفة حمراء erthyrocyte precursor )؛ ang ذلك إلى خلية متمايزة نهائية الطورء مثل خلية حمراء؛ lly تلعب دور وصفي في نوع نسيج معين؛ (Sarg أو يمكن ألا تتضمن القدرة على التكاثر أيضا. في أحد النماذج؛ مثبط التعبير عن 801117 sie عن عامل تداخل RNA انتقائي ل «BCL11A أو ناقل يرمز عامل التداخل RNA الانتقائي ل 8011174. في نموذج واحد معين؛ 0 يتضمن عامل تداخل RNA واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25 يمكن أن يكون "الحمض "(gail الموضح هناء عبارة عن RNA أو DNA ويمكن أن يكون أحادي أو ثنائي الجديلة؛ ويمكن اختياره؛ مثلاء من مجموعة شاملة: حمض نووي يرمز بروتين محل الاهتمام؛ أوليجونيكلوتيداتء نظائر حمض نووي Mie «nucleic acid analogues 5 ببتيد-حمض نووي peptide-nucleic acid (8لا)؛_ببتيد-حمض نووي شبه مكمل «(Pc—-PNA) pseudo-complementary وحمض نووي مقفول locked nucleic acid
L(LNA) تتضمن متواليات الحمض النووي هذه؛ Ole على سبيل المثال لا الحصرء بروتينات ترمز متوالية حمض نووي؛ Die التي تعمل كمواد قمع نسخية؛ جزيئات مضادة للحس؛ ريبوزيمات؛ متواليات حمض نووي تثبيطية صغيرة؛ مثلا على سبيل المثال لا الحصر ShRNAI (RNAI «siRNA نمل" عنم «(MiRNA) وأوليجونيكلوتيدات مضادة للحس. حسب ما هو مكشوف عنه هناء أحد أهداف الاختراع الحالي هو توفير طريقة لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني في خاضع. بالتالي؛ يقدم أحد جوانب الاختراع الحالي طريقة لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني في خاضع محتاج له؛ تتضمن الطريقة خطوة ملامسة خلية أساسية مكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم في الخاضع مع كمية فعالة من تركيبة تتضمن مثبط ل (BCLTTA بالتالي تتم زيادة التعبير 0 عن (HBF نسبة إلى تعبير قبل هذه الملامسة. في أحد النماذج؛ مثبط ل BCLITA عبارة عن عامل تداخل RNA يتضمن واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25 أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا. فيما يتعلق بملامسة خلية في خاضع مع مثبط ل (BCLITA تشير 'زيادة مستويات HbF في خاضع' إلى أن HDF في الخاضع تبلغ على الأقل 75 أعلى في مجموعات معالجة ب مثبط BCLIIA 5 من مجموعة مقارنة أو قابلة للمقارنة؛ حيث لا يوجد مثبط /86111. يفضل أن يبلغ التعبير عن هيموجلوبين جنيني في مثبط ,801117 لمعالجة خاضع على الأقل 710 lel على الأقل 720 أعلى؛ على الأقل 730 أعلى؛ على الأقل 740 (ef على الأقل 750 Jel على الأقل 760 أعلى؛ على الأقل 770 أعلى؛ على الأقل 780 (lef على الأقل 790 Jel على الأقل 1-طية ef على الأقل 2-طية oof على الأقل 5-طية أعلى؛ على الأقل 10 Lh 0 أعلى؛ على الأقل 100 طية clef على الأقل 1000-طية أعلى؛ أو أكثر من معالجة خاضع مقارن قابل للمقارنة. يتم استخدام المصطلح dalled’ خاضع مقارن قابل للمقارنة" هنا لوصف خاضع تمت معالجته بشكل انتقائي؛ باستثناء إضافة أوليجونيكلوتيد oligonucleotide غير مستهدف. do dull أحد النماذج؛ تم تشخيص الخاضع بمرض هيموجلويين. في نموذج OA 5 مرض الهيموجلويين عبارة عن مرض الخلية المنجلية. حسب الاستخدام هناء يمكن أن يكون مرض الخلية المنجلية عبارة عن الخلية المنجلية (badd مرض هيموجلويين © منجلي -5606
hemoglobin C disease (1050)؛ Wy بلاس ثالاسيميا منجلية -15ام-5618 sickle «(HbS/B+) thalassaemia أو ثلاسيميا Gy منجلية صفرية sickle beta-zero- (HPS/BO) thalassaemia في نموذج (dante AT مرض الهيموجلوبين عبارة عن ثلاسيميا. يقوم العلاج وفقا للاختراع الحالي بتخفيف واحد أو أكثر من الأعراض المرتبطة بالاضطراب بواسطة زيادة كمية الهيموجلويين الجنيني في الفرد. تتضمن الأعراض المرتبطة بشكل ie بمرض الهيموجلوبين؛ chad! lie نقص أكسجة الأنسجة tissue hypoxia قصور عضوي organ dysfunction قيم هيماتوكريت غير طبيعية abnormal hematocrit (values كريات حمراء غير فعالة ae dneffective erythropoiesis الخلايا الشبكية غير الطبيعي abnormal reticulocyte (كرية (shes حمل حديد غير طبيعي؛ وجود أرومات 0 حديدية حلقية ring sideroblasts تضخم الطحال splenomegaly تضخم الكبد hepatomegaly تدفق ضعيف للدم المحيط dmpaired peripheral blood flow ضيق التنفس dyspnea انحلال الدم المتسارع hemolysis 00168580 اليرقان jaundice أزمة ألم فقر الدم canemic pain crises متلازمة الصدر الحادة «acute chest syndrome عزل الطحال «splenic sequestration قساح «priapism السكتة 68ا500؛ متلازمة الكف- القدم «hand-foot syndrome 5 والألم مثل الذبحة الصدرية .angina pectoris في أحد النماذج؛ يتم اعتبار الخلية الأساسية المكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم خارج الكائن الحي أو في المعمل؛ ويتم إعطاء الخلية أو ذريتها إلى الخاضع. في نموذج آخرء Lal الأساسية المكونة للدم عبارة عن خلية من السلالة الحمراء . في أحد النماذج؛ يتم اعتبار الخلية الأساسية المكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم مع 0 تركيبة تتضمن مثبط ل 801117 وحامل أو مخفف مقبول صيدلانيا. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء التركيبة بواسطة حقن؛ تسريب؛ التقطير؛ أو ابتلاع. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء التركيبة بواسطة الحقن المباشر في نخاع العظم. في أحد النماذج Wy لأي طريقة موضحة؛ يتم استخدام طريقة العلاج الجيني لعلاج؛ الوقاية (Ge أو تخفيف مرض هيموجلويين مختار من المجموعة المكونة من: مرض هيموجلوبين hemoglobin © disease © 5 هيموجلويين مرض الخلية المنجلية؛ الخلية المنجلية أنيميا (sickle cell anemia أنيميا وراثية Lands hereditary anemia 0-ثلاسيميا B-
8 الثلاسيميا الأساسية؛ ثلاسيميا متوسطة؛ 0-ثلاسيميا؛ ومرض هيموجلويين H .hemoglobin H disease في العديد من النماذج وفقا لأي طريقة موضحة» يتم إعطاء النواقل الفيروسية الارتجاعية بواسطة الحقن المباشر إلى خلية؛ نسيج؛ أو عضو خاضع في حاجة إلى علاج جيني؛ في الكائن الحي. في العديد من النماذج الأخرى وفقا لأي طريقة موضحة؛ يتم تحويل الخلايا في المعمل أو خارج الكائن الحي مع نواقل وفقا للاختراع؛ ويتم التمدد اختياريا خارج الكائن الحي. بعد ذلك يتم إعطاء الخلايا المحولة إلى خاضع في حاجة لعلاج جيني. يتضمن "الخاضع؛" حسب الاستخدام هناء أي حيوان Cow عرض مرض أحادي الجين أو dls يمكن علاجها بنواقل العلاج الجيني (gene therapy vectors علاجات قائمة على أساس 0 الخلية؛ وطرق مكشوف عنها هنا. في النماذج المفضلة؛ يتضمن الخاضع أي حيوان يبين عرض مرض أو اضطراب أو حالة للنظام المكون للدم؛ Ole مرض هيموجلوبين؛ (Sa علاجه بنواقل العلاج الجيني؛ علاجات قائمة على أساس lal وطرق مذكورة La يتضمن الخاضعون المناسبون (مثلاء المرضى) حيوانات المعامل Jie) فأرء pa أرنب؛ أو خنزير غيني)؛ حيوانات المزرعة؛ والحيوانات الأليفة أو الحيوانات المنزلية (مثل قطة أو كلب). كائنات رئيسية غير الإنسان 5 وء بشكل مفضل؛ مرضى بشر. يتضمن الخاضعون المثاليين حيوانات تبين تظهر كميات منحرفة (كميات أقل أو أعلى من خاضع "طبيعي" أو '"صحي) لواحد أو أكثر من النشاطات الفسيولوجية التي يمكن تضمينها بواسطة علاج جيني. في أحد النماذج» حسب الاستخدام هنا يتضمن "علاج” أو 'دواء؛' أي أثر مفيد أو مطلوب على الأعراض أو المرض أو الحالة المرضية ويمكن أن يتضمن عمليات تقليل في واحد أو أكثر 0 من المرقمات القابلة للقياس من المرض أو الحالية التي يتم علاجها. في نموذج (Sac AT أن يتضمن العلاج اختياريا إما تقليل أو تخفيف في أعراض مرض أو حالة أو تأجيل تقدم المرض أو الحالة. لا يحتاج Dall بالضروري إلى أن يشير إلى استئصال كامل أو علاج للمرض أو الحالة أو أعراض مرتبطة بها. في أحد النماذج؛ حسب الاستخدام هناء تشير "الوقاية من" والكلمات المشابهة مثل "التي 5 تمت الوقاية منهاء' إلخ.؛ إلى منهج للوقاية من أو تثبيط أو تقليل احتمالية حدوث أو إعادة حدوث مرض أو حالة. في نموذج آخرء؛ يشير المصطلح إلى تأجيل بدء أو sale] حدوث مرض أو حالة
أو تأجيل في حدوث أو انتكاس مرض أو حالة. في نموذج آخرء؛ حسب الاستخدام هناء "الوقاية" وما شابهها من كلمات تتضمن تقليل شدة وأثر وأعراض و/أو حمل مرض أو حالة قبل بدء أو
إعادة حدوث المرض أو الحالة. في أحد النماذج وفقا لأي طريقة موضحة؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار خاضع محتاج _للعلاج الجيني الموضح. Ole يتم اختيار خاضع يبين أعراض مرض هيموجلويين من المجموعة المكونة من مرض هيموجلوبين ©؛ هيموجلوبين مرض الخلية المنجلية؛ الخلية المنجلية أنيميا؛ أنيميا وراثية؛ ثلاسيميا؛ م-ثلاسيمياء الثلاسيميا الأساسية؛ ثلاسيميا متوسطية؛ »-ثلاسيمياء ومرض هيموجلويين LH بشكل بديل؛ يحمل الخاضع تطفر جيني مرتبط بمرض هيموجلويين؛ تطفر جيني موضح هنا. Ole تشخيث خاضع مرض الخلية المنجلية بنمط جيني (HPSS ثلاسيميا بيتا
0 منجلية صفرية ثلاسيمياء (HOSD أو 11550 و/أو مع HOF >710 بواسطة الرحلان الكهربي.
في العديد من النماذج وفقا لأي طريقة موضحة؛ يتم إعطاء خاضع محتاج لعلاج جيني مجموعة من خلايا تتضمن كمية فعالة من خلايا معدلة جينيا مذكورة هنا. ذلك أن خلايا معدلة Lia تعبر واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25 أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا.
حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح "كمية' إلى " كمية فعالة' أو 'كمية Malic من فيروس أو علاج بخلية محولة لتحقيق نتيجة وقائية أو علاجية مفيدة أو مطلوبة شاملة النتائج السريرية.
يشير المصطلح "كمية فعالة وقائيا” إلى كمية من فيروس أو خلية علاجية محولة فعالة لتحقيق النتيجة الوقائية المطلوية. بشكل مثالي وليس ضروري»؛ Cus يتم استخدام جرعة وقائية؛ في
0 الخاضعين قبل أو عند مرحلة مبكرة من المرض» تكون الكمية الفعالة وقائيا أقل من الكمية الفعالة علاجيا.
يمكن أن يختلف المصطلح "كمية فعالة "ladle من فيروس أو خلية علاجية محولة وفقا algal مثل حالة المرض أو السن أو الجنس أو وزن call وقدرة الخلايا الجذعية والأساسية على الحصول على استجابة مطلوية في الفرد. الكمية الفعالة علاجيا أيضا عبارة عن كمية حيث يتم
5 التفوق على الآثار السمية أو الخطرة للفيروس الخلايا العلاجية المحولة بواسطة الآثار المفيدة علاجيا. يتضمن المصطلح "كمية فعالة علاجيا" كمية فعالة ل "علاج" خاضع Ni) مريض).
في أحد النماذج؛ يقدم الاختراع الحالي طريقة توفير خلية محولة إلى خاضع يتضمن إعطاء؛ lie بالحقن؛ واحد أو أكثر من خلايا محولة مع ناقل مذكور هنا في الخاضع. في أحد النماذج, الناقل عبارة عن ناقل يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25 أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا.
في نموذج معين»؛ تم توفير طريقة للوقاية من؛ تخفيف؛ أو علاج مرض هيموجلوبين في خاضع. تتضمن الطريقة إعطاء مجموعة من خلايا تتضمن خلايا مكونة للدم محولة مع ناقل مذكور هنا. في أحد النماذج؛ الناقل عبارة عن ناقل يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25 أو BCL1IMicroRNA تخليقي موضح هنا.
في النماذج المعينة؛ تتضمن مجموعة من خلايا تم إعطاؤها إلى خاضع A جذعية 0 مكونة للدم أو خلايا أساسية» WA سليفة أرومية LIAN cohen الصبغية الحمراء الأرومية؛ الخلايا الأرومية الحمراء متعددة التضرج؛ LAY الحمراء الحساسة للتلون» كريات الدم الحمراء متعددة الألوان» وكريات الدم الحمراء» أو أي توليفة مما سبق؛ (gly نسبة منها يمكن أن تكون معدلة جينيا بواسطة النواقل المذكورة هنا. في أحد النماذج؛ الناقل هو ذلك الذي يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25 أو BCL11MicroRNA 5 تخليقي موضح هنا. يمكن إعطاء WAY المعدلة جينيا كجزء من زريعة نخاع العظم أو دم الحبل السري في فرد خضع أو لديه علاج نخاع العظم قابل للحت. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء خلايا معدلة جينيا المذكورة هنا في زريعة نخاع العظم إلى فرد خضع لعلاج بنخاع العظم قابل للحت الكيماوي أو الإشعاعي. في أحد النماذج؛ يتم توصيل جرعة من خلايا معدلة جينيا إلى خاضع وريديا. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء خلايا معدلة جينيا مكونة للدم وريديا إلى خاضع. في النماذج المعينة؛ يتلقى المرضى جرعة من خلايا معدلة جينياء Ole خلايا جذعية مكونة للدم؛ بمقدار حوالي 1 * 105 خلايا/كجم؛ حوالي 5 X 105 خلايا/كجم؛ حوالي 1 X 106 خلايا/كجم» حوالي 2 X 106 خلايا/كجم»؛ حوالي 3 Xx 106 خلايا/كجم» حوالي 4 x 106 5 خلايا/كجم» حوالي 5 X 106 خلايا/كجم» حوالي 6 X 106 خلايا/كجم» حوالي 7 x 106 خلايا/كجم» حوالي 8 X 106 خلايا/كجم»؛ حوالي 9 X 106 خلايا/كجم» حوالي 1 x 107
خلايا/كجم»؛ حوالي 5 x 107 خلايا/كجم؛ حوالي 1 Xx 108 خلايا/كجم؛ أو أكثر في جرعة وربدية واحدة. في النماذج المعينة؛ يتلقى المرضى جرعة من WIS معدلة Ole clin خلايا جذعية مكونة للدم؛ بمقدار على الأقل 1 x 105 خلايا/كجم»؛ على الأقل 5 x 105 خلايا/كجم؛ على الأقل 1 x 106 خلايا/كجم؛ على الأقل 2 x 106 خلايا/كجم» على الأقل 3 x 106 خلايا/كجم؛ على الأقل 4 x 106 خلايا/كجم» على الأقل 5 X 106 خلايا/كجم؛ على الأقل X6 6 خلايا/كجم» على الأقل 7 x 106 خلايا/كجم» على الأقل 8 x 106 خلايا/كجم» على الأقل 9 xX 106 خلايا/كجم»؛ على الأقل 1 x 107 خلايا/كجم»؛ على الأقل 5 x 107 خلايا/كجم؛ على الأقل 1 x 108 خلايا/كجم؛ أو أكثر في جرعة وربدية واحدة. في نموذج إضافي؛ يتلقى المرضى جرعة من خلايا معدلة hin مثلا؛ خلايا جذعية 0 مكونة للدم؛ بمقدار حوالي 1 X 105 خلايا/كجم إلى حوالي 1 Xx 108 خلايا/كجم؛ حوالي 1 X 6 خلايا/كجم إلى حوالي 1 x 108 خلايا/كجم؛ حوالي 1 * 106 خلايا/كجم إلى X 9 Joa 6 خلايا/كجم» حوالي 2 X 106 خلايا/كجم إلى حوالي 8 * 106 خلايا/كجم» حوالي 2 X 6 خلايا/كجم إلى حوالي 8 * 106 خلايا/كجم؛ حوالي 2 X 106 خلايا/كجم إلى حوالي X5 6 خلايا/كجم» حوالي 3 X 106 خلايا/كجم إلى حوالي 5 * 106 خلايا/كجم» حوالي 3 X 5 106 خلايا/كجم إلى حوالي 4 X 108 خلايا/كجم» أو أي جرعة متداخلة بمقدار خلايا/كجم. في العديد من النماذج؛ تقدم الطرق وفقا للاختراع علاج جيني أكثر صلابة وأمانا من الطرق الموجودة وتتضمن إعطاء مجموعة جرعة من خلايا تتضمن حوالي 75 خلايا محولة؛ حوالي 710 خلايا محولة؛ حوالي 715 WIA محولة؛ حوالي 720 خلايا محولة؛ حوالي 725 خلايا محولة؛ حوالي 730 WA محولة؛ حوالي 735 خلايا محولة؛ حوالي 740 WIA محولة؛ 0 حوالي 745 خلايا محولة؛ أو حوالي 750 WIA محولة؛ إلى خاضع. في أحد النماذج؛ يقدم الاختراع WA معدلة clin مثل خلية جذعية؛ مثلاء خلية جذعية مكونة للدم؛ مع القدرة على التمدد أو زيادة مجموعة من الخلايا الحمراء. في نماذج معينة؛ يتم تحويل خلايا جذعية مكونة للدم مع ناقل وفقا للاختراع ويتم الإعطاء إلى فرد محتاج لعلاج لمرض هيموجلوبين. الخلايا الجذعية المكونة للدم هي أصل WAN الحمراء وبالتالي؛ فهي مفضلة. في 5 أحد النماذج الناقل عبارة عن ناقل يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25« أو BCL11MicroRNA تخليقي موضح هنا.
حسب الاستخدام هناء المصطلح 'مقبول صيدلانياء” والاختلافات النحوية منهاء حيث تشير
إلى تركيبات؛ مواد حاملة؛ مخففات وعوامل كاشفة؛ يتم استخدامها بالتبادل وتمثر المواد القادرة
على إعطاء خاضع بدون إنتاج آثار فسيولوجية غير مطلوية مثل الغثيان nausea والدوخة
وحدم الارتياح بالمعدة gastric upset وما إذا ذلك. يجب على كل dela أن يكون
phd 5 أيضا من حيث التوافق مع المكونات الأخرى للصيغة. سوف يقوم dela مقبول صيدلانيا
بتعزيز إنتاج استجابة مناعية إلى عامل يتم خلطه به؛ ما لم يكن هذا غير مطلوب. سوف يتم فهم
تحضير تركيبة صيدلانية تحتوي على مكونات مذابة أو مشتتة فيها في المجال ولا تحتاج إلى أن
تكون مقيدة على صيغة. تحتوي الصيغة الصيدلانية على مركب وفقا للاختراع في توليفة مع واحد
أو أكثر من مكونات مقبولة صيدلانيا. يمكن أن يكون الحامل في صورة مخفف صلب أو شبه
0 صلب أو سائلة أو كريم أو كبسولة. بشكل مثالي يتم تحضير هذه التركيبات لتكون قابلة للحقن أو
سوائل محاليل أو معلقات؛ مع ذلك؛ يمكن تحضير الصور الصلبة المناسبة من أجل المحلول أو
المعلقات في صورة سائلة قبل الاستخدام. يمكن استحلاب المستحضر أو تقديمه كتركيبة ليبوسوم
liposome composition يمكن خلط المكون النشط مع سوائغات مقبولة صيدلانيا ومتوافقة مع
المكون النشط وبكميات مناسبة للاستخدام في الطرق العلاجية الموضحة هنا. تتضمن السواغات
5 المناسبة؛ lie الماء أو المحلول الملحي أو دكستروز dextrose أو جليسرول glycerol أو
إيثانول ethanol أو ما شابه وتوليفات مما سبق. علاوة على ذلك؛ عند الحاجة؛ يمكن أن تحتوي
التركيبة على كميات أقل من المواد المضافة Jie عوامل الترطيب أو الاستحلاب wetting or
cemulsifying agents عوامل تنظيم buffering agents درجة الحموضة وما شابه والتي
تعزز فعالية المكون النشط. يمكن أن تتضمن التركيبة العلاجية وفقا للاختراع الحالي أملاح مقبولة
0 صيدلانيا من المكونات الخاصة بها. تتضمن الأملاح المقبولة صيدلانيا أملاح الإضافة الحمضية
(المكونة مع مجموعات الأمينو الحرة free amino groups للبولي ببتيد (polypeptide الذي
يتم تكوينه في أحماض غير عضوية lie (Jie inorganic acids أحماض هيدروكلوريك أو
فوسفوريك hydrochloric or phosphoric acids أو هذه الأحماض غير العضوية Jie
أسيتيك acetic أو طرطريك tartaric أو ماندليك imandelic وما شابه. يمكن Lad اشتقاق
5 الأملاح المكونة مع مجموعات الكريوكسيل carboxyl الحرة أيضا من مواد قاعدية غير عضوية
Sle «Jie inorganic bases مركبات هيدروكسيد hydroxides الصوديوم sodium أو
— 8 2 —
البوتاسيوم potassium أو الأمونيوم ammonium أو الكالسيوم calcium أو الحديديك ferric وهذه القواعد العضوية Jie أيزو بروييل أمين 100/180106م150 lp ميثيل أمين trimethylamine 2-إيثيل sue إيثاتول ethanol 807100ا/1©-2» هيستيدين histidine بروكيين procaine وما شابه. المواد الحاملة التى يمكن تحملها فسيولوجيا معروفة فى المجال. تتضمن المواد الحاملة السائلة liquid carriers المناسبة محاليل مائية معقمة لا تحتوي على مواد بالإضافة إلى المكونات النشطة والماء أو تحتوي على sale منظمة buffer مثل فوسفات صوديوم sodium phosphate عند ded درجة حموضة فسيولوجية؛ أو محلول ملحي فسيولوجي أو كلاهماء مثل محلول ملحي منظم بفوسفات .phosphate-buffered saline أيضاء يمكن أن تحتوي المواد الحاملة الماثية aqueous carriers ما يزيد على ملح منظم «aly buffer salt 0 بالإضافة إلى أملاح مثل مركبات كلوريد صوديوم وبوتاسيوم sodium and potassium 5م دكستروز Js «dextrose إيثيلين جليسرول polyethylene glycol وغيرها من نواتج الإذابة. يمكن أن تحتوي التركيبات السائلة أيضا أطوار سائلة بالإضافة إلى وباستبعاد الماء. يفضل بشكل مثالى للأطوار السائلة الإضافية أن تتضمن جليسرين glycerin أو زيوت نباتية Jie زبت بذر القطن؛ ومستحلبات ماء-زيت. سوف تعتمد كمية عامل نشط active agent مستخدمة 5 في الاختراع والتي سوف تكون فعالة في علاج اضطراب أو حالة معينة على طبيعة الاضطراب أو dll ويمكن تحديدها بواسطة التقنيات السريرية المعيارية. تتضمن العبارة dela’ أو مخفف مقبول صيدلانيا" متوسطات من مادة مقبولة صيدلانياء تركيبة أو موجه؛ مثل سائل أو مادة ملء (abil مخفف «diluent سواغ excipient مذيب أو مادة تغليف «encapsulating material متضمنة في حمل أو نقل عوامل الخاضع من عضو واحد أو ei من الجسم إلى عضو AT
0 أو جزءٍ من الجسم. في أحد نماذج أي طريقة الموضح؛ حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح oF إعطاؤه" إلى وضع hie ل 801117 في خاضع بواسطة طريقة أو مسار يؤدي إلى تموضع جزئي على الأقل للمتبط عند موقع مطلوب. يمكن إعطاء عامل يثبط 86011178 بواسطة أي مسار مناسب يؤدي إلى علاج فعال في الخاضع؛ أي » يؤدي إعطاء إلى توصيل موضع مطلوب في الخاضع 5 حيث يتم توصيل جزءِ على الأقل من التركيبة التي تم توصيلهاء أي؛ عامل واحد على الأقل؛ والتي تثبط 80111/4؛ نشط في الموقع المطلوب لمدة من الوقت. تعتمد sae نشاط bial على عمر
النصف في الكائن الحي بعد الإعطاء إلى خاضع؛ ويمكن أن تكون قصيرة بمقدار ساعات قليلة؛ Ole على الأقل 1 ساعة؛ على الأقل ساعتين» على الأقل 3 ساعات؛ على الأقل 4 ساعات؛ على الأقل 5 ساعات؛ على الأقل 6 ساعات؛ على الأقل 8 ساعات؛ على الأقل 10 ساعات؛ على الأقل 12 dele على الأقل 18 ساعة؛ على الأقل 24 ساعة؛ إلى عدة calf إلى ما يصل إلى عدة سنوات. تتضمن أوضاع الإعطاء حقن؛ تسريب؛ التقطير؛ أو ابتلاع. يتضمن ال Copa’ بدون cad الحقن والتسربب الوريدي أو عبر العضل أو في الوريد أو عبر داخل القراب Jala «intrathecal البطيني Jala cintraventricular المحفظة Jala cintracapsular الحجاج Jala cintraorbital القلب cntracardiac الأدمة Jala cintradermal الصفاق 1180811100768١ عبر الرغامى ctranstracheal تحت الجلد (subcutaneous تحت البشرة Jala ¢subcuticular 0 المفصل cintraarticular داخل المحفظة الفرعية sub capsular تحت العنكبوتية subarachnoid داخل النخاع cintraspinal داخل الدماغ ؛ داخل العمود الفقري spinal 17180616010 و داخل القص .intrasternal في أحد op Sail) تتضمن التركيبة الموضحة هناء أو الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون_ من متواليات برقم هوية:1- 5 18-1013( 44-25؛ أو الفيروس أو ناقل التعبير عن alas BCLIIMicroRNA موضح هناء يتم حقنه في نخاع العظم. في أحد النماذج؛ تتم ملامسة الخلية الأساسية المكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم من خاضع يحتاج إلى علاج مع تركيبة تثبط التعبير عن /86111. في نماذج أخرى؛ تتضمن التركيبة فيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من 0 مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10013-1؛ 44-25؛ أو فيروس أو ناقل التعبير عن 8ل4ا801111/1000 تخليقي موضح هنا. الخاضع الذي يحتاج إلى علاج عبارة عن مشخص بمرض هيموجلويين مثل مرض الخلية المنجلية أو ثلاسيميا. يقصد ب 'يثبط التعبير عن 86111/8" أن كمية تعبير عن /806111 أقل بمقدار على الأقل 75 في مجموعات معالجة Lia /80111؛ من مجموعة قارنة قابلة للمقارنة؛ حيث لا 5 ييوجد مثبط 806111/8. يفضل أن تكون نسبة التعبير عن 801118 في مجموعة Lie dallas 801118 على الأقل 710 أقل؛ على الأقل 720 أقل؛ على الأقل 730 أقل؛ على الأقل
0 أقل.؛ على الأقل 750 أقل» على الأقل 760 أقل» على الأقل 770 (Jil على الأقل 780 Jd على الأقل 790 JE على الأقل 1-طية oda على الأقل 2-طية odd على الأقل 5-طية (Jd على الأقل 10 طية أقل» على الأقل 100 طية أقل» على الأقل 1000-طية أقل؛ أو أكثر من مجموعة معالجة مقارنة حيث لا تتم إضافة مثبط BCLI11A 5 في أحد النماذج؛ الحمض النووي عبارة عن عامل تداخل RNA انتقائي ل BCLITA أو ناقل يرمز عامل تداخل RNA في أحد النماذج؛ عامل تداخل RNA يتضمن واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25. كمثال على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة إعطاء الخاضع تركيبة تتضمن خلايا معدلة تتضمن ناقل يحمل متوالية حمض
0 نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و44-25؛ أو BCL11MicroRNA موضحة هنا. في أحد النماذج» تتضمن الطريقة أيضا تحديد خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة أيضا اختيار الخاضع المحدد المصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين.
كمثال آخر على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة الخطوات التالية: نقل الخلايا الجذعية المكونة للدم وخلايا أساسية مكونة للدم في خاضع؛ جمع وتجميع الدم المحيط من الخاضع الاختيار الإيجابي لخلايا +0034 من الدم المحيط» تحويل وإصابة خلايا 0034+ المختارة في المعمل مع ناقل يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و44-25؛ أو
BCL11MicroRNA 0 موضحة هنا؛ غسل خلايا +CD34 المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا إلى الخاضع. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا تحديد خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة أيضا التمدد في مزرعة +CD34 WIA المحولة المغسولة المختارة في
5 المعمل قبل إعطاء الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة أيضا متمايزة في مزرعة خلايا 4+ المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل إعطاء الخاضع.
كمثال آخر على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة الخطوات التالية: نقل الخلايا الجذعية المكونة للدم وخلايا أساسية مكونة للدم في مانح خاضع؛ وجمع الدم المحيط من المانح الخاضع؛ والاختيار الايجابي لخلايا CD34+ من الدم المحيط» ونقل أو إصابة +CD34 WA المختارة في المعمل مع ناقل يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و44-25؛ أو BCLIIMicroRNA موضحة هنا؛ وغسل +CD34 WA المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا في خاضع مستقبل. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار مستقبل خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة La التمدد في مزرعة +CD34 WIA المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل الإعطاء إلى 0 المستقبل الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة Lad متمايزة في مزرعة +CD34 WA
المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل الإعطاء إلى المستقبل الخاضع. كمثال آخر على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة الخطوات التالية: وجمع الدم من نخاع العظم لخاضع, والاختيار الإيجابي لخلايا +0034 من نخاع العظم الدم؛ ونقل أو إصابة خلايا 0034+ المختارة في المعمل مع Jib 5 يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-3 ,44-25« أو BCL11MicroRNA موضحة هنا؛ ويتم غسل خلايا +CD34 المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا في الخاضع. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة Lad تحديد خاضع مصاب بمرض هيموجلويين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة 0 بمرض هيموجلوبين. في نموذج «AT تتضمن الطريقة Load التمدد في مزرعة خلايا +CD34 المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل إعطاء الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة Lad متمايزة في مزرعة خلايا +CD34 المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل إعطاء
الخاضع . كمثال على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ 5 تتضمن الطريقة الخطوات التالية: جمع الدم من نخاع العظم mild خاضع, الاختيار الإيجابي لخلايا +0034 من نخاع العظم الدم؛ ونقل أو إصابة الخلايا +CD34 المختارة في المعمل مع
ناقل يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 ,44-25 أو BCL11MicroRNA موضحة هنا؛ Jue خلايا +CD34 المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا في مستقبل خاضع. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا تحديد مستقبل خاضع مصاب بمرض هيموجلويين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار مستقبل خاضع مصاب بمرض هيموجلويين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في نموذج AT تتضمن الطريقة Lad التمدد في مزرعة +CD34 WDA المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل الإعطاء إلى المستقبل الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة Lad متمايزة في مزرعة +CD34 WIA المغسولة المحولة المختارة
في المعمل قبل الإعطاء إلى المستقبل الخاضع.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا خلية معدلة تتضمن متوالية حمض نووي nucleic acid sequence مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1. 18-13 44-25( أو BCL11MicroRNA موضحة هنا.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا خلية مصممة كانت محولة أو منقولة مع ناقل يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13
5 44-255 أو BCL1IMicroRNA موضحة هنا. في أحد النماذج؛ الناقل Ble عن فيروس
بطيء.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في cali تتضمن الطريقة إعطاء خلية مصممة محولة أو منقولة مع ناقل يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13
0 و44-25؛ أو BCL1IMicroRNA موضحة هنا. في أحد النماذج؛ الناقل Ble عن فيروس
بطيء.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة إعطاء خلية مصممة يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 44-255 أو
BCL11MicroRNA 5 موضحة هنا.
في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية Leds جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد النماذج, الخلية المصممة عبارة عن خلية المتمايزة من خلية Leds جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية متمايزة في السلالة الحمراء erythroid lineage في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية متمايزة في كرية حمراء . في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية +CD34 10 يمكن تحديد الاختراع الحالي في أي فقرة تالية. BCL11MicroRNA ]1[ تخليقي يتضمن oa «Js 801118 a حلقي؛ gag 8078 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5" إلى 3 ؛ حيث الجزءِ الحلقي موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بأجزاء 801118 الأول Sly وحيث gia 861118 الثاني مكمل لجزء 801118 الأول بحيث تكون أجزاء 8011178 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية مع 5 الجزء الحلقي الذي يكون الجزء الحلقي للحلقة الدبوسية الذي تم تكوينه بالتبعية. BCL11MicroRNA ]2[ التخليقي وفقا للفقرة 1 حيث أجزاء 8611178 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات. BCL11MicroRNA ]3[ التخليقي وفقا للفقرة 1 أو 2 حيث يحتوي oa 8011178 الأول على متوالية مشتقة من متوالية .BCL11A MRNA BCL11MicroRNA ]4[ 0 التخليقي وفقا لأي من فقرات 3-1 gia Cum 8011178 الأول مكمل لجزء 8011178 الثاني. BCL1IMicroRNA ]5[ التخليقي وفقا لأي من فقرات 4-1؛ cus يبدأ ga 801118 الأول ب -6060- عند الطرف 5” ga gins 801117 الثاني ب ~GCGC- عند الطرف 3 BCL1IMicroRNA [6] 5 التخليقي وفقا لأي من فقرات 5-1 حيث يتم اختيار جزء 86118 الأول من المجموعة المكونة من CGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية
بهوية رقم: 46؛ مشتق من 41نم 80111 أوليجو موضحة (W CCAGAGGATGACGATTGTTTA (متوالية بهوية رقم: 47؛ مشتق من 00182 801118 أوليجو موضحة TCGGAGACTCCAGACAATCGC «(la (متوالية بهوية رقم: 48؛ مشتق من BCLIIA E3 أوليجو أو ShRNAL أو 53 موضحة هنا)ء CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC 5 (متوالية بهوية رقم: 49؛ مشتق من ShRNA2 أو BS موضحة هنا)؛ TCAGGACTAGGTGCAGAATGT (متوالية بهوية رقم: 50؛ مشتق من 90884 أو 811 موضحة TTCTCTTGCAACACGCACAGA «(Us (متوالية بهوية رقم: 51؛ مشتق من D8 801118 أوليجو أو ShRNA3 أو 08 موضحة (We GATCGAGTGTTGAATAATGAT (متوالية بهوية رقم: 52؛ مشتق من ShRNAS أو 0 01250 اه 012 موضحة هنا)» CAGTACCCTGGAGAAACACAT (متوالية بهوية رقم: 3؛ مشتق من ShRNAS أو SOAS موضحة فنا CACTGTCCACAGGAGAAGCCA (متوالية بهوية رقم: 54؛ Gude من shRNAT أو 50811 موضحة (ba ACAGTACCCTGGAGAAACACA (متوالية بهوية رقم: 55؛ مشتق من 801118 shRNAS XLC4 و5004 مروضحة هنا CAACAAGATGAAGAGCACCAA (متوالية بهوية رقم: 56؛ مشتق من أوليجو غير مستهدفة ل 80111 موضحة (Wa 969006080860803 (متوالية diggs رقم: 57؛ مشتق من 001165 أوليجو موضحة GCGCTCGGAGACTCCAGACAA «(la (متوالية بهوية رقم: 58؛ مشتق من 65 أو mod sid 53 أو shRNAImod موضحة هنا)ء gegcCCTCCAGGCAGCTCAAA (متوالية بهوية رقم: 59؛ مشتق من 8565 أو ShRNA2mod 0 موضحة هنا)؛ 6068 1 969010866801866 (متوالية بهوية رقم: 60 مشتق من 165 أو shRNAdmod موضحة | هنا)؛ gCGCGATCGAGTGTTGAATAA (متوالية بهوية رقم: 61؛ ide من 5001265؛ 4 أو 90811850000 موضحة هنا)؛ gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC (متوالية بهوية رقم: 62؛ مشتق من 5085650 50186000 موضحة هنا)؛ gcgcCACTGTCCACAGGAGAA 5 (متوالية بهوية رقم: 63؛ مشتق من 5081165 أو 900/8700 موضحة هنا)؛ GCGCTTCTCTTGCAACACGCA (متوالية بهوية رقم:
4؛ مشتق من 0865 806111 أو D8 mod أو ShRNA3mod موضحة 48(« GCGCACAGTACCCTGGAGAAA (توالية بهوية رقم: 65؛ مشتق من 801118 «C4G5 أو mod 04 أو ShRNASmMod موضحة هنا)؛ CGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية بهوية رقم: 66؛ مشتق من 80111 01265-2 موضحة هنا)ء 5 ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT (متوالية بهوية رقم: 67؛ مشتق من DI2G5-2 8011178 موضحة هنا ). BCL1IMicroRNA . ]7[ التخليقي وفقا لأي من فقرات 6-1؛ حيث gall الحلقي مشتق من .microRNA BCL11MicroRNA ]8[ التخليقي وفقا للفقرة 7 حيث She MicroRNA عن microRNA 0 انتقائي لمكونات الدم. BCL11MicroRNA ]9[ التخليقي وفقا للفقرة 8( MicroRNA Cua عبارة عن -MiR223 BCL11MicroRNA ]10[ التخليقي Wy للفقرة 9 حيث gall الحلقي Ble عن .ctccatgtggtagag BCL11MicroRNA ]11[ التخليقي وفقا لأي من فقرات 1- 10( حيث MICTORNA يتضمن 5 مقتوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و25- 44
[12] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير في الكائن الحي عن BCLIIMicroRNA تخليقي واحد على الأقل وفقا لأي من فقرات 11-1 في الخاضع. 0 ]13[ الطريقة فقرة 12( حيث يتم التعبير في الكائن الحي في خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم في الخاضع.
[14] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير عن BCLIIMicroRNA تخليقي واحد على الأقل Wy لأي من فقرات 11-1 في خلية 5 جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛
أو خلية أساسية مكونة للدم للخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن الحي؛ وزراعة الخلية في الخاضع.
[15] طريقة sab) مستويات الهيموجلويين الجنيني الذي يتم التعبير die بواسطة خلية تتضمن التعبير عن BCL1IMicroRNA تخليقي واحد على الأقل وفقا لأي من فقرات 11-1 في خلية؛ حيث الخلية عبارة عن خلية Leds جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع (phe خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. ]16[ الطريقة Wy لأي من فقرات 15-12« cus اذ 8ل801111/100 التخليقي الواحد على الأقل مرتبط تشغيليا بمعزز alg تكوينه في ناقل للتعبير في خلية حقيقة النواة eukaryotic .cell 10 ]17[ الطريقة وفقا لأي من فقرات 16-12( حيث يتم التعبير عن اذ BCL11MicroRNA التخليقي الواحد على الأقل من بوليمراز RNA [18] الطريقة وفقا لأي من فقرات 17-12؛ حيث لا يتم التعبير عن ال BCL11MicroRNA التخليقي الواحد على الأقل من بوليمراز RNA [19] الطريقة فقرة 18؛ حيث يتم اختيار المعزز من مجموعة تتكون من معزز فيروسي مكون 5 تركيز على الطحال»؛ معزز قابل للحث بتترا سيكلين؛ أو منطقة التحكم في موقع ]-جلوبين و معزز (|-جلوبين.
[20] الطريقة وفقا لأي من فقرات 19-16( حيث الناقل Ble عن فيروس.
[21] الطريقة فقرة 20؛ حيث الفيروس عبارة عن فيروس بطيء.
[22] الطريقة فقرة 21( حيث تم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس 0 نقص المناعة البشري من النوع 1؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2؛ فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي؛ فيروس فقر الدم المعدي في الخيول؛ فيروس نقص المناعة في caked فيروس نقص المناعة في البقرء وفيروس نقص المناعة في القردة.
[23] جزيء حمض نووي معزول isolated nucleic acid molecule يتضمن متوالية النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية: 10-1 18-13 و44-25. 5 ]24[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 1.
]25[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 2.
[26] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 3. ]27[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 4. ]28[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 5. ]29[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 6. ]30[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 7.
[31] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 8. 5 [32] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 9. ]33[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 10.
[34] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 13.
[35] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 14. ]36[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 15. 5 [37] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 16.
]38[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا Ball 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 17. ]39[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 18.
[40] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 25.
[41] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 26. ]42[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 27.
[43] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 28. ]44[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 29. 5 [45] جزيء الحمض النووي المعزول Bal Wy 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 30.
[46] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 31. ]47[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 33. ]48[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 34. ]49[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 35. [SO] 5 جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 36.
]51[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 37.
[52] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( Cus يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 38.
[53] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 39. ]54[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 40.
[55] جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( Cus يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:41. ]56[ جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 42. [ST] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 43. 5 [58] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 44.
[59] ناقل يتضمن جزيء الحمض النووي المعزول Wy للفقرة 23.
[60] الناقل وفقا pall 59 حيث يتضمن الناقل أيضا معزز فيروسي مكون تركيز على Jindal معزز قابل للحث بتترا سيكلين؛ أو منطقة التحكم في موقع ]-جلويين ومعزز ]-جلوبين. 0 [61] خلية عائلة يتضمن الناقل وفقا للفقرة 59 أو 60.
[62] الخلية Wy للفقرة 61؛ حيث الخلية عبارة عن خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم.
[63] الخلية وفقا spill 61( حيث الخلية عبارة عن كرية حمراء.
[64] بكتريا يتضمن جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23. 5 [65] فيروس يتضمن جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23.
[66] الفيروس Wy للفقرة 65؛ Cua الفيروس عبارة عن فيروس بطيء.
]67[ الفيروس Wy للفقرة 66« حيث تم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2؛ فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي؛ فيروس فقر الدم المعدي في الخيول؛ فيروس نقص المناعة في القطط» فيروس نقص المناعة في البقرء وفيروس نقص المناعة في القردة.
[68] تركيبة تتضمن جزيء حمض نووي معزول وفقا لأي من فقرات 58-1( ناقل وفقا للفقرات 59 أو 60 خلية عائلة وفقا لأي من فقرات 63-61؛ أو فيروس وفقا لأي من فقرات 67-65.
[69] تركيبة تتضمن ناقل وفقا للفقرات 59 أو 60 خلية عائلة وفقا لأي من فقرات 63-61؛ أو فيروس وفقا لأي من فقرات 67-65.
[70] التركيبة وفقا للفقرة 68 أو 69؛ يتضمن أيضا dala أو مخفف مقبول صيدلانيا. 0 [71] تركيبة Wy لأي من فقرات 70-68 للاستخدام في العلاج أو لتقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع.
[72] تركيبة وفقا لأي من فقرات 70-68 للاستخدام في تصنيع دواء في علاج أو لتقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع.
[73] تركيبة وفقا لأي من فقرات 70-68 للاستخدام في زيادة مستويات الهيموجلويين الجنيني 5 الذي يتم التعبير die بواسطة خلية.
[74] التركيبة وفقا للفقرة 73 حيث الخلية عبارة عن خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم.
[75] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبيين في خاضع؛ تتضمن الطريقة: إعطاء الخاضع كمية فعالة Ladle من جزيء حمض نووي معزول Why لأي من فقرات 58-1؛ 0 تقل وفقا للفقرات 59 أو 60؛ خلية عائلة وفقا لأي من فقرات 63-61؛ أو فيروس Wy لأي من فقرات 67-65 إلى الخاضع؛ وبالتالي علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض الهيموجلوبين في الخاضع. ]76[ طريقة de أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبيين في خاضع؛ تتضمن الطريقة: إعطاء الخاضع كمية فعالة علاجيا لتركيبة وفقا لأي من فقرات 74-68 في الخاضع؛ وبالتالي 5 علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض الهيموجلويين في الخاضع.
[77] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة زيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني الذي يتم التعبير die بواسطة خلية في الخاضع.
[78] الطريقة Wy لأي من فقرات 77-75 تتضمن الطريقة أيضا اختيار خاضع Glas بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين.
[79] الطريقة وفقا لعنصر الحماية 78 حيث مرض الهيموجلويين Ble عن مرض الخلية المنجلية أو ثلاسيميا.
[80] الطريقة وفقا لأي من فقرات 80-75؛ تتضمن الطريقة Lad إعطاء الخاضع le يتضمن أوكسيجين OXYgen هيدروكسي يوريا chydroxyurea حمض فوليك؛ أو نقل دم. يتم أيضا توضيح الاختراع في الأمثلة Cus (All لا تقيد منظور الاختراع الموضح في 0 عناصر الحماية. الأمثلة المواد والطرق سوف تكون ظروف تفاعل PCR المثالية كما يلي: 1* محلول منظم تفاعل (يتكون من MgCl, عند 1.5 مل مولار؛ 3.0 مل مولار؛ 4.5 مل مولار (تركيز نهائي))؛ 0.2 مل مولار 5 من كل من Su 25 «dTTP 3 dGTP «dCTP (dATP مول من كل sale بادئة ¢primer 50 نانوجم من قالب DNA template 710-3 (حجم/حجم) DMSO لصهر البنية (وهذا اختياريا) بحجم كلي 100 ميكرولتر. ما يلي هي الظروف المثالية للتفاعل أو الضبط على الدورة الحرارية لتفاعل PCR 2°94 ل 5-3 دقيقة؛ أثناء هذا الوقت تمت إضافة 1وحدة من بوليمراز DNA أو تم ضبط التفاعل على 0 ثج بعد ذلك تم وضع أنابيب في ماكينة PCR عندما تصل إلى 094م؛ المتبوعة بواسطة 25 دورة من L294 لمدة 1 دقيقة؛ 260م لمدة دقيقة؛ و70”م لمدة دقيقة؛ وانتهاء مع 04 لحين استخدام عينات PCR مثال 1 تصنيع MIRS تخليقية
تم تكوين ثلاثة 00145 تخليقية مختلفة؛ اثنين منها تستهدف 801117 عند مواقع مختلفة والثالثة غير مستهدفة لتعمل كعينة ضابطة. تم إدخال كل من هذه ال 70145 في تعبير متتالي عن ناقل» ناقل تترا سيكلين قابل للحث؛ وناقل انتقائي للسلالة الحمراء -erythroid specific vector تم صنع MIRS بواسطة تصلب أوليجونيكلوتيدات مكملة؛ والتي تتضمن 4 زوج قاعدة 5" تتداخل بشكل مناظر للطرف المتلصق الأيسر بواسطة تقييد الهضم مع ا855. أوليجو 00141 :BCL11A حي ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT TctecatgtggtagagAATCCATGAGTG TTCTGTGCGAG 0 (متوالية برقم هوية:1) مضادة للحس CGCACTCGCACAGAACACTCATGGATTctctaccacatggagAATCCATGAGT GTTCTGTGCGA (متوالية برقم هوية:2) أوليجوهات 00142 :BCL11A = ACGCTCCAGAGGATGACGATTGTTTActccatgtggtagagTAAACAATCGTC ATCCTCTGGag (متوالية برقم هوية:3) مضادة للحس CGCACctCCAGAGGATGACGATTGTTTActctaccacatggagTAAACAATCGTC ATCCTCTGGa (متوالية برقم هوية:4) أوليجوهات غير مستهدفة: حسمي
ACGCTCAACAAGATGAAGAGCACCAActccatgtggtagagTTGGTGCTCTTC ATCTTGTTGAG (متوالية برقم هوية:11) مضادة للحس CGCACTCAACAAGATGAAGAGCACCAActctaccacatggagTTGGTGCTCTT CATCTTGTTGA 5 (متوالية برقم هوية:12) تم تمسيخ أزواج أوليجونيكلوتيد وبعد ذلك تمت sale) التصليب (بالنسبة لقالب جيني أوليجو Oligo cassette في بروتوكول ال ام - بي سي ار (LM-PCR ويعد ذلك تمت تنقية قالب جيني باستخدام Heal تركيز الطرد المركزي الدقيق. في الوقت المتوسطء تم بلغ بلازميد (MiR223)0.6.pBKS مع 8051 وتمت التنقية بواسطة التشغيل على جل جل أجاروز (بدون 0 علاج بفوسفاتاز قلوي (alkaline phosphatase بعد ذلك تم ارتباط كل قالب جيني أوليجو في بنيات 0.6.0845 المبلوعة وتم التحويل في بكتيريا منافسة (51013). تم التقاط مستنسخات البكتريا Bacterial clones وتم تحضيرها بشكل مصغر لتحضير معزولة نواقل. بعد ذلك تم تتابع miRs التخليقية باستخدام مواد بادئة primers متوالية 0014223 FOR ومتوالية 0014223 REV باستخدام DMSO لصهر البنية. متوالية 0014223 TAAGCTTGATATCGAATTCCFOR (متوالية برقم هوية:19) متوالية GCTCTAGAACTAGTGGATCCREY miR223 (متوالية برقم هوية:20) مثال 2 تصنيع نواقل MIR متتالية تم استنساخ كل 0016 في أساس 660-17/2ا فيروسي بطيء بحيث يتم تحريك التعبير 0 عن Venus—miR بواسطة معزز فيروس تكوين تركيز طحالي التالي. تعديل Venus cDNA سوف يتم تكبير Venus cDNA عبر PCR لإضافة موقع قيد Nael إلى الطرف 5" (بالإضافة إلى الحفاظ على متوالية Kozak جيدة متتالية) وموقع Notl إلى الطرف 3" . TTgeeggcATGGTGAGCAAGGGCGAGG FOR Nael Venus (متوالية برقم 21:98(
— 8 9 — TAgeggecgc TTACTTGTACAGCTCGTCC REV Notl Venus (متوالية برقم هوية:22) تم انتهاء منتجات PCR على جل أجاروز aay ذلك تمت التنقية. كان منتج PCR المنقى عبارة عن مستنسخ تي ايه TA في ناقل (INVITROGEN™) TOPO 2.1 PCR باستخدام طقم استنساخ TA تم التقاط مستنسخات بكتيرية DNA محضر. باستخدام تحليل هضم القيد؛ تم اختيار المستنسخات التي أ) تحتوي على منتج Venus PCR (هضم (ECORI وب) تحتوي على المستنسخ في توجيه Cus لم تتم إضافة Notl بعد ذلك إلى موقع Notl في رابط متعدد (أي؛ بحيث لا يقوم ابتلاع Notl بتخطي شظية (PCR ولكن بدلا من ذلك فقط يتم توليد سلالات الناقل). بعد ذلك تم تتابع هذه المستنسخات باستخدام مواد بادئة 13/اأمامي وعكسي.
إدخال متواليات 0014 في بلازميد Venus-PCR 2.1 TOPO تم هضم بلازميد Venus-PCR 2.1 TOPO مع (Notl تمت المعالجة بفوسفاتاز قلوي من أمعاء بقرية؛ aay ذلك تم التشغيل على جل أجاروز وتمت التنقية. تم استتصال بنيات MIR التخليقية من بلازميد O.6.pBKS بواسطة هضم مزدوج مع Notl و0500)/1؛ بعد التنقية بواسطة استخلاص جل أجاروز. تم ربط ولائج MIR المهتضمة في بلازميد Venus-PCR 2.1 TOPO وتم استخدام
5 منتج الريط لتحويل بكتريا منافسة (51013). تم التقاط المستنسخات البكتيرية الفردية وتم التحضير. يتم اختيار البلازميدات التي تحتوي على وليجة MIR تدخل في التوجيه الصحيح (أي؛ تؤدي إلى الشظية الكاملة عند الهضم مع .(Nael y Notl
إدخال قالب جيني Venus-miR في LeGO-V2 تم Ql Jian الجيني Venus-miR من PCR 2.1 TOPO بواسطة هضم مزدوج مع Notl و ا86ل8؛ متبوعة بواسطة
0 علاج مع شظية Klenow كبيرة بالجزء المعلق إلى 14011 مسنن. تمت تنقية هذا القالب الجيني بواسطة استخلاص جل أجاروز. تم هضم LeGO-V2 أو LeGO G2 مع «EcoRI y BamHI all أطلقت cDNA 0 +605/66/. تمت dallas سلالة هذا بشظية Klenow كبيرة لقطع الأجزاء المعلقة BamHI, ECORI متبوعا بواسطة تنقية الناقل بواسطة الرحلان الكهربي لجل أجاروز .agarose gel تم ربط قالب جيني Venus-miR المنقى وناقل 16860 معاء وتم
5 استخدام المنتج لتحويل البكتيريا المحولة. تم التقاط المستنسخات البكتيرية الفردية وتم تحضير
DNA تم اختيار المستنسخات التي تحتوي على الوليجة في الإتجاه الصحيح وتم نموها واستخدامها في مستحضرات قوية لتصنيع مواد طافية فيروسية viral supernatant مثال 3 تصنيع نواقل MIR انتقائية للسلالة الحمراء تم إلحاق إشارة معالجة ببولي أدينيل polyadenylation signal بالقوالب الجينية Venus-miR المصنع الموضح أعلاه. تم إدخال القوالب الجينية 1/90115-0014-بولي A الناتجة في التوجيه المضاد للحس في ناقل فيروسي بطيء014/41-1153-1152-8 -جلوبين SEY) للسلالة الحمراء المقدم بواسطة .Guilianna Ferrari تعديل إشارة معالجة BGH ببولي أدنيل. تم juss إشارة BGH بولي A عبر PCR 0 للحفاظ على تقييد PSpOMI موقع عند الطرف 5” وتتم إضافة المواقع Notl s Nael إلى الطرف 3 CGCTCGAGCATGCATCTAGAGG FOR PspOMI BGHpA (متوالية برقم هوية:23) :REV Notl/Nael BGHpA TTgcggeegecggcCGCGCTTAATGCGCCGCTACAG 15 (متوالية برقم هوية:24) تم استتفاد منتجات PCR على جل أجاروز ويعد ذلك تمت التنقية. تم استنساخ منتج PCR المنقى TA في ناقل (INVITROGEN™) PCR 2.1 TOPO باستخدام طقم استنساخ 18 . تم التقاط مستنسخات بكتيرية وتم تحضير DNA باستخدام تحليل هضم cal) تم اختيار 0 المستنسخات تحتوي على منتج BGHPA PCR (هضم ECORI و/أو PspOMI/Notl هضم مزدوج). تم Jie هذه المستنسخات باستخدام مواد بادئة 13/اأمامي وعكسي. قامت عملية إدخال متوالية 86108 في بلازميدات 2.1 Venus-miR-PCR TOPO المحضرة الموضحة أعلاه. تم استئصال قالب جيني 8610/8 من PCR 2.1 TOPO بواسطة هضم مع PSPOMI وا08ل! بعد ذلك تمت تنثقية الوليجة بواسطة استخلاص جل أجاروز. 5 تم هضم بنيات Venus-miR-PCR 2.1 TOPO المصنعة في الخطوة ب2 أعلاه مع Notl وبالتالي تمت المعالجة بفوسفاتاز قلوي من أمعاء بقرية. تمت تنقية ناقل Venus-miR-PCR
Venus— في ناقل BGHPA بواسطة الاستنفاد على جل أجاروز. تم ربط وليجة 2.1 TOPO competent _وتم استخدام المنتج لتحويل البكتيريا المكافئة MIR-PCR 2.1 TOPO
8 (3ا0ا5). سوف يتم التقاط وتحضير المستنسخات البكتيرية الفردية. تم اختيار
البلازميدات التي تحتوي على متوالية وليجة 86110860 في التوجيه الصحيح (تؤدي إلى وليجة
كلية عند الهضم مع ا8186). تم استتصال إدخال قالب جيني Venus-miR-BGHpA في pRRL-HS3- su
152-8)-جلوبين. تم استئصال القالب الجيني Venus-miR-BGHpAs من 2.1 PCR
TOPO بواسطة هضم مع .2186١ تمت تنقية هذه الولائج بواسطة الرحلان الكهربي لجل أجاروز.
تم هضم ناقل (uglapRRL-HS3-HS2-B مع ECORV ومعالجة بفوسفاتاز قلوي من أمعاء 0 بقرية. تمت تنقية الناقل بواسطة الرحلان الكهربي لجل أجاروز agarose gel
pRRL-HS3- في Venus-miR-BGHpAs تم ريط القالب الجيني electrophoresis
152-8)-جلويين ومنتج الربط المستخدم لتحويل البكتريا المنافسة. تم التقاط المستنسخات
البكتيرية الفردية وتم تحضيرها. تم نمو بلازميدات تحتوي على قالب جيني Venus-miR-
5م861 في التوجيه الصحيح في ناقل 0|4/41-1153-1152-8-جلوبين globin وصولا إلى 5 أقصى تحضير بحيث يمكن نموها لتحضير أقصى ليتم استخدامها لتوليد المادة الطافية الفيروسية
البطيئة.
مثال 4
تم تنفيذ تجارب خلية تداخل RNA في المعمل كما يلي.
تم تحويل خلايا لوكيميا حمراء فأرية تم الإبقاء عليها في مزرعة في اى ام دي ام IMDM
0 مع اف سي اس FCS على فيبرونيكتين fibronectin مع shRNA = NT) SFFV-LVs
مخلوط ShRNA=MIR-2 مستهدف) عند تعدد الإصابة-2 ومصنفة لتألق Venus كانت
النقطة الزمنية للتحليل بعد التحويل هي اليوم 7. كانت الخلايا >795 Venus إيجابي و106 تم
جمع الخلايا وتم استخلاص (RNA تم الحصول على CDNA بواسطة انتساخ عكسي وتم تنفيذ
qPCR في الوقت الفعلي ل 801117 وأ5م©-جاما جلوبين MRNAs مع Gapdh كمسخة 5 عينة ضابطة داخلية (الشكل 3). تم استخدام منحنى معياري لقياس التعبير.
تداخل RNA تجارب في الكائن الحي في LO
تمت زراعة mile Boj مشتق HSCs LSK المزروعة في فثران CST [BLO بعد تحويل تشتيت عائلة على تجرية السابقة على فيبرونيكتين مع NT=shRNA) SFFV-LVs مخلوط MIR-I=shRNA مستهدف) عند تعدد الإصابةج2. كانت جرعة WAL غير المحقونة 0 خلايا لكل فأر. تم نقع إيجابي WBC عند 4 شهور (220) وتم صنع نخاع العظم المصنف لتألق Venus بعد بقعة حيوية (220-7) (الشكل 3). تم تنفيذ استخلاص RNA و0004 كما هو موضح أعلاه. مثال 5 LCR-LV تم تحويل خلايا لوكيميا حمراء فأرية محفوظة في مزرعة IMDM مع FCS على 0 فيبرونيكتين مع NT=shRNA) LCR-LVs مخلوط 2ل4ا50-ا-0014_مستهدف)_عند تعدد الإصابة-2 وتعدد الإصابة<100 وتم التصنيف من حيث تألق Venus كانت النقطة الزمنية للتحليل بعد التحويل هي اليوم 7. كانت الخلايا >795 Venus إيجابي و106 تم جمع الخلايا وتم استخلاص (RNA تم الحصول على CDNA بواسطة انتساخ عكسي وتم تنفيذ GPCR في الوقت الفعلي ل 801117 وأ5م8-جاما جلوبين MRNAS مع 68000 كمسخة عينة ضابطة 5 داخلية (الشكل 4). تم استخدام طريقة منحني معياري لقياس تعبير. TET-LV تم تحويل خلايا لوكيميا حمراء فأرية محفوظة في مزرعة في FCS على فيبرونيكتين مع NT=shRNA) TET-LVs مخلوط (Caius MIR-I=shRNA عند تعدد الإصابة-2 ومصنفة من حيث تألق Venus بعد التعرض ل دوكسي سيكلين عند تركيزات متمايزة. كانت 0 النقطة الزمنية للتحليل بعد التحويل هي اليوم 7. كانت Venus 795> WAN إيجابي و106 تم جمع الخلايا وتم استخلاص (RNA تم الحصول على CDNA بواسطة انتساخ عكسي وتم تنفيذ gPCR في الوقت الفعلي ل ا05م©-جاما جلوبين MRNA مع 68000 كمسخة عينة ضابطة داخلية (الشكل 4). تم استخدام طريقة منحني معياري لقياس تعبير. مثال 6 تم تجزيء الدم المحيط Peripheral blood المشتق من مريض HSC CD34+ SOD يدور من مادة فصادة تم التخلص منها (تقريبا 200 cde 106 من Wa +00034). تم تحويل
الخلايا ب NT=shRNA) SFFV-LVs مخلوط ShRNA=mMiR-1 _مستهدف) de تعدد
الإصابة-2 على فيبرونيكتين ومتمايزة كما هو معدل من Nat Biotech ( .Giarratana et al
5. تم تحليل الخلايا من حيث حيازة المرقمات السطحية الحمراء النضجية erythroid
«GPA) surface markers 0071) بواسطة التدفق الخلوي. تقوم LIAN الحمراء بالتتابع بالحصول على خلية أرومية shes ومورفولوجيا خلية shes وتعبر عنن Venus Gl تم جمع
الخلايا عند مرحلة التمايز الطرفي وتم استخلاص RNA وتم تنفيذ تحليل PCR لتقييم حث
جاما-جلويين MRNA بواسطة SFFV-IV 04-1 مقارنة بعينة ضابطة (غير مستهدفة)
مخلوطة (الشكل 5).
مثال 7
10 تم تجزيء الدم المحيط لمربيض مرض الخلية المنجلية مشتق من خلايا +0034 تدور في خلية جذعية مكونة للدم من sale فصادة متخلص Lie (تقريبا 200 «Je 106 خلايا +0034). تم تحويل الخلايا ب NT=shRNA) LCR-LVs مخلوط ShRNA=mMIR-1 مستهدف) عند تعدد الإصابة-2 على فيبرونيكتين وتم الحقن عند 30000 خلايا/حيوان في Laps NSG gh للإشعاع دون مستوى القتل بدون تصنيف سابق. وتم نزيف الحيوانات عند الأسبوع الرابع من
5 الحقن وتم تثبيت خلايا الدم الحمراء وتم الثقب. تم تنفيذ بقعة HOF وتم تحديد LCR-LV-mMIiR— 1 حيوان مع إنسان مستويات HBF عند 710 (الشكل 6). مثال 8
تم تحويل دم الحبل السري المشتق +6034 إنسان خلايا جذعية مكونة للدم محولة على فيبرونيكتين مع NT=shRNA) SFFV-LVs مخلوط MIR-I=ShRNA مستهدف) عند تعدد
0 الإصابة-2 ومصنفة من حيث تألق Venus تم أيضا تصور الخلايا أيضا بواسطة ميكروسكوب تألق fluorescent microscopy على لحمة .MS-5 تم تمايز الخلايا على طول المسار 8 الليمفاوي الخلوي بواسطة طرق معدلة من et al 00ا. all) 2009). تم تحليل الخلايا أسبوعايا من لأأجل الحصول على مرقمات السطح الليمفاوية الخلوية الناضجة 8 وفقد مرقمات خلية سلف مناعية لتحديد كتلة في التمايز الناتج بواسطة استبعاد 861117 عبر SSFFV-L مقابل تم
5 جمع الخلايا عند نقاط che soul وتم استخلاص RNA لتحقق من استبعاد BCL11A MRNA بواسطة استهداف shRNA عبر SFFV-LV-mIiR-1 (الشكل 7).
مثال 9
تحسين ناقل بوليمراز RNA ١| فيروسي بطيء يقوم بتشغيل MicroRNA مدمج ل ShRNAs
بمعالجة محسنة واستبعاد 801117 فعال لحث هيموجلويين جنيني في WA حمراء . تم استخدام تقنية تداخل (RNAI) RNA باستخدام RNAS دبوسية قصيرة (ShRNAS) 5 الذي يتم التعبير die عبر معززات pol HIE بشكل واسع لتضمين التعبير الجيني في تشكيلة من أنواع الخلايا الثديية. لتحقيق الاستهداف الانتقائي للسلالة (MRNAS سوف تكون هناك حاجة للتعبير عن 50485 عبر معززات pol ١١ بما يتطلب دمج ShRNA في متواليات uasll (ShRNAMIR) dual microRNA والمعالجة. cba لتحقيق استبعاد نسخة 8010 من عامل في خلايا مكونة call والتي لها تطبيق تحويلي مباشر في أمراض 0 الهيموجلوبين» قمنا بمقارنة فعالية تضمين MRNA عبر pol Il في مقابل نواقل فيروسية بطيئة قائمة على أساس !ا pol يمكن أن تمثل إبادة البروتين 861-117 هدف ade لمرض الخلية المنجلية وأمراض م-ثلاسيميا؛ كما تبين أن الاستبعاد يحث التعبير عن جين اتش بي جي HBG الجنيني ((-جلوبين) بشكل مطلق Le يؤدي إلى تحسين مستويات التترامر الهيموجلوبين الجنيني HDF) 0272). في «jl 801117 عبارة عن قامع أساسي ل جين Hbb-y فأري يمثل نظير HBG 5 فأري. يبين المخترعون ما يصل ! لى 1000-100 طية Jil في حث Hbb-y بسبب الفعالية المخفضة لاستبعاد 801117 باستخدام ShRNAMIR في مقابل أساسات ناقل shRNA التي تتوسط فيها !اا pol لفهم الأساس الجزيئي لهذه الفروق؛ قام المخترعون بتنفيذ تحليل متوالية RNA صغيرة لخلايا محولة بواسطة العديد من أزواج .ShRNA-ShRNAMIR وقد بين المخترعون أن SARNAS الذي يتم التعبير die عبر 6لا معزز PO! I يؤدي إلى متواليات جديلة 0 موجهة تختلف بمقدار إزاحة 4 زوج قاعدة مقارنة بمتوالية حديلة موجهة ناضجة تعمل بواسطة pol .(ShRNAMIR) ١ وقد أبدى تتابع RNA أن تمدد مركبات يوريدين التي تعوض الجزءٍ من إشارة إنهاء ااا pol محول ومتضمن عند الطرف 3 من ShRNA الناضج في أساس ناقل pol ١١١ يرتبط غياب هذه المتواليات الإضافية بإزاحة مناظرظة في شق موقع dicer وبالتالي تولد ShRNA ناضج مختلف مع متوالية بذرية بديلة تؤثر على فعالية جين مستهدف على استبعاد في نواقل قائمة على أساس ١١ ا00. علاوة على ذلك؛ كل من الوفرة المطلقة ونسبة التوجيه إلى الجديلة المنتقلة مختلفة بشكل مميز في خلايا محولة مع أي من نواقل قائمة على أساس pol ١١ أو pol
lI يقوم دمج إزاحة بمقدار 4 زوج قاعدة في الجديلة الموجهة ل ShRNAMIR بمعالجة متوالية جديلة موجهة ناضجة مطابقة لمتوالية SARNA تعمل بواسطة 6لا (Sh—RNAs وفعالية استبعاد محسنة ل 801117 بواسطة 170-50 عند مستوى بروتين وتم الارتباط ب 300-100-طية من حث Hbboy في خلايا لوكيميا حمراء فأرية. وقد اكتشف المخترعون وجود استراتيجية معدلة من أجل التثميم المنظوري لأساسات ناقل ShRNAMIR لتحقيق التنظيم الانتقائية للسلالة للجينات المستهدفة. مثال 10 تحسين ShRNAS مدمج ب MIRNA لاستبعاد 801117 انتقائي للسلالة وحث هيموجلويين .٠ المواد وطرق 0 تصميم ومراقبة ShRNAS تم الحصول على نواقل فيروسية بطيئة تعمل بمعزز UG (080م-!!! (POI يعبر عن 80111 مختلف تستهدف mRNA/shRNAs 5801112 من the Broad Institute (MA (Cambridge) يتضمن pol lll-puro مرقم اختيار بيوروميسين | puromycin selection marker يعمل بواسطة معزز .hPGK أكثر من 100 ShRNAs تستهدف إما كل 5 من صور SLXL فقط صورة XL ومنطقة UTR’3 في خلايا حمراء فأرية في صورة 96 عين باستخدام طبق Qiagen Turbocapture ومع تفاعل Tagman qRT-PCR مضاعف يقيس .Hbb-y 3 Gapdh بناء بنيات shRNAmMIR تم تكوين نواقل ShRNAMIR بواسطة استنساخ متواليات /ل5040_مع_متواليات 0 014223 محيطة في ناقل LeGO-V2 فيروسي بطيء يحتوي على مبلغ فيروس تكوين تركيز طحالي يعمل ب Venus (28). تم تخليق متواليات ShRNAMIR مع حلقة 1014223 بواسطة (NJ) genscript USA Inc. الولايات المتحدة) وتم استنساخ 5014/01/45 الناتج في الأساس pol ١١ بعد أن تقوم Venus بترميز متوالية باستخدام المواقع Xbal و8800111. تم ذكر كل متواليات ShRNAS في الشكل 21ا. تم تصميم die ضابطة غير مستهدفة متوالية ShRNA 5 وتمت تسمتيها SFFV-shRNAMIRNT أو NT في صورة قصيرة. ناقل SFFV-GFP لا
يحتوي على أي قالب ShRNA وتم استخدام التعبير عن GFP عبر معزز SFFV كعينة ضابطة مزورة (33). إنتاج ومعايرة الفيروس تم توليد مواد طافية من ناقل فيروسي بطيء بواسطة النقل المشترك 10 ميكروجم من نواقل نقل فيروسية بطيئة؛ 10 ميكرو جم من ا989-00؛ 5 ميكرو جم من 167 و2 ميكرو جم من في اس في جي 751/6 بلازميدات تعبئة في خلايا HEK293T في طبق مزرعة بطول 10 سم باستخدام عامل كاشف فوسفات كالسيوم calcium phosphate reagent (INVITROGEN™) تم جمع المواد الطافية Supernatants عند 24 ساعة و48 ساعة بعد الإصابة؛ وتم الترشيح من خلال الطرد المركزي عند 23000 لفة/دقيقة لمدة ساعتين في جهاز 0 طرد مركزي90-ا270 Beckmann باستخدام عبوات هزازة 28-//51. لتحديد المعيار؛ تمت إصابة خلايا 101/1373 بالفيروس في وجود بولي برين (8 ميكروجم/مل) وتم التحليل لمدة 48 ساعة بعد التحويل بواسطة FACS للتعبير عن Venus (بعد بنيات (pol II أو بواسطة اختيار بيوروميسين (1 ملجم/مل؛ بنيات (Pol ١١١ مزرعة خلية تم الحفاظ على خلايا 313 2931 وخلايا حمراء فأرية في وسط Eagle's معدل ب DULBECCO’s أو وسط RPMI مكمل ب 710 من مصل dae جنيني fetal calf serum 2 بينسيلين-ستريبتوميسين Wee Je 25 penicillin—streptomycin من جلوتامين Je glutamine التوالي. مزرعة التمايز الأحمر في المعمل تم الحصول على مخزونات مجمدة Frozen stocks من خلايا +0034 بشرية أساسية من الدم المحيط المثقول لمانحين أصحاء ) Center of Excellence in Molecular Hematology at Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle or the (Flow Core at Boston Children’s Hospital وفقا لبروتوكول معتمد بواسطة BCH Institutional Review Board بروتوكول التمايز الأحمر المستخدم قائم على أساس بروتوكول 5 ثلاثي الأطوار من (48). تمت WAY del) في وسط التمايز الأحمر | erythroid (EDM) differentiation medium بناء على DULBECCO’s Lug) IMDM معدل ب
(CELLGRO®) «(Iscove مكمل بجلوتامين مستقرء 330 ميكرو جم/مل من هولو- إنسان ترانسفيرين (SIGMA®) 10 ميكرو جم/مل من إنسولين بشري ناتج sage الارتباط الجيني ((SIGMA®) recombinant human insulin 2 وحدة مركزة/مل Choay هيبارين heparin (SIGMA®) و75 بلازما مذيب/ فيروس منظف معطل (0/5). أثناء الطور الأول من التمدد (الأيام 0 إلى 7( تمت زراعة خلايا 0034+ في وسط التمايز الأحمر في وجود 6-10 مولار من هيدروكورتيزون (HC) hydrocortisone (©/ا6ا100:)5 نانوجم/مل R&D ( SCF 57515) 5 نانوجم/مل «(R&D SYSTEMS™) IL-3 ) و3 وحدة مركزة/مل Epo (©81/6811). في اليوم 4؛ تمت إعادة تعليق الخلايا في وسط التمايز الأحمر يحتوي على (SCF 3حااء Epo و هيدروكورتيزون. في الطور الثاني (الأيام 7 إلى 11)؛ تمت ale) تعليق 0 الخلايا في وسط التمايز الأحمر مكمل ب اس سي اف SCF و اي بي او EPO الطور الثالث (اليوم 11 إلى اليوم 18)؛ تمت زراعة الخلايا في وسط التمايز الأحمر مكمل مع EPO فقط. تم
الحفاظ على المزارع عند 37"م في 75 002 في الهواء.
تحويل والتدفق الخلوي لمزرعة في المعمل تم تحويل خلايا shes فأرية و 0034+ مع نواقل فيروسية بطيئة التعبير عن -6لا shRNA 5 أو SFFV-shRNAmIR في وجود بولي برين )8 ميكروجم/مل) SIGMA-) dually (ALDRICH® Corp.
St.
Louis, MO, US لخلايا حمراء فأرية و10 ميرومولار بروستاجلاندين E2 prostaglandin و2ميكروجم/مل بولي dually polybrene (py لخلايا CD34+ تم طردها مركزيا قبل ساعتين عند )4283482000( عند درجة حرارة الغرفة. تم تصنيف الخلايا الحية إما للتعبير عن Venus (نواقل (pol ١١ بعدد 48 ساعة من التحويل 0 باستخدام (BD BIOSCIENCES®) BD FACS Aria Il أو خلايا تم اختيارها في وجود بيوروميسين puromycin )1 ملجم/مل» بنيات (pol ١١١ بالنسبة لتحليل FACS TAAD (INVITROGEN™) 23 تم تضمينه كمرقم خلية ميت. تم تعليم الخلايا +0034 مع ألوفيكوكيانين (APC) Allophycocyanin فيكويريثرين (PE) phycoerythrin وأجسام مضادة مترافقة مع PE-Cyanine7 تم استخدام الأجسام المضادة alias 60235 (جليكوفورين (APC-anti-CD71 (PE- (A 25 أى DRAQ-5 anti-CD71- PE-Cyanine7 (كلها
(EBIOSCIENCE® للتنميط الجيني. تم تنفيذ عمليات التحليل على مقياس تدفق خلوي LSR- (BECTON DICKINSON®) II باستخدام برامج Diva أو FloJoX (1 فاخا قاع .)١١ تجارب العزل» التحويل والتدفق الخلوي لفأر الزراعة الانتقالية تم WDA Jie نخاع عظم فأرية سالبة بواسطة كشف عظم الفخذ والورك والساق من Pepcb/BoyJ) 0045.1 Boyd 5 010168-ال86.5) وفثئران 86 0045.2 (ل6/ا0578) متبوعة بواسطة نضوب نسبي باستخدام طقم استنفاد خلية فأرية نسبي «Miltenyi,Biotec Inc.) سان دييجو» الولايات المتحدة). تمت زراعة الخلايا بكثافة 106*1-0.2 خلايا/مل في 100 نانوجم/مل 00560 20 ناتوجم/مل «Hill Rocky (PEPROTECH® both ) mIL-3 الولايات المتحدة)» 100 نانوجم/مل hFI3-L 1005 نانوجم/مل hTPO (كل من (Portsmouth «CELLGENIX® 0 _الولايات المتحدة) في وسط STEMSPAN™ SFEM (CA Vancouver (STEMCELL © Technologies) بعد 24 ساعة من الحث الأولي لخلايا تم التحويل بكثافة 106«*1 خلايا/مل عند تعدد الإصابة بمقدار 40 وتمت الزراعة في مستقبلات تم تشعيعها بشكل قاتل (GYAHT) جرعة منفصلة) بعد ثلاثة أيام من العزل. بالنسبة لتجارب إعادة التجميع التنافسية؛ تم خلط كميات متساوية من الخلايا من مجموعة تحويل مختلفة قبل الزراعة الانتقالية في 2 أو مستقبلات إيجابية مزدوجة 0045.1/0045.2 زيجوتية غير متجانسة )0.4 - 106*1 لكل حيوان). تم تحويل خلطات الخلية عبر التدفق الخلوي لتأكيد المساهمات الممكنة لكل من أجزاء الخلايا المنافسة؛ وتم التنظيم عند الحاجة. تم تنفيذ تحليل الدم المحيطء نخاع العظم والطحال عند العديد من النقاط الزمنية باستخدام الأجسام المضادة المتالية: «CD71 «CD3 00118 8220 «CD45.2 «CD45.1 162119 وصبغة حيوية يمكن حلها 4780ا1100]©. تم استبعاد التحليل من السلالة الحمراء. تم تنفيذ عمليات التحليل على مقياس تدفق خلوي LSR-II أو (BECTON DICKINSON®) LSRFortessa وبرنامج .(Treestar™) FloJoX i Diva تم تنفيذ عمليات تحليل البيانات والإحصاءات باستخدام .PRISM® 5 GRAPHPAD , (MICROSOFT®) Excel بالنسبة للزراعة الانتقالية لخلايا hCD34 ~10 تم تشعيع فثران NSG إناث عمر أسبوع (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) (-/-NOD/LtSz-scid lI2rg) 5 ب 2.7Gy
متوبعة بواسطة حقن -106 خلية لكل حيوان ثلاثة أيام بعد العزل. تمت تغذية فتران التي تم تعريضها 4233 مكمل BAYTRIL® بماء لمدة 14 يوم. استخلاص qRT-PCR § RNA تم استخلاص AS RNA من خلايا حمراء فأرية ف اليوم ال 7 بعد تصنيف/ بعد اختيار مع بيوروميسين puromycin أو بشكل حديث DIA مصنفة في اليوم 18 من التمايز الأحمر من خلايا +CD34 باستخدام طقم QIAGEN® RNA Plus دقيق (CA Valencia) تم توليد CDNA باستخدام مواد بادئة هكسامر عشوائية random hexamer primers ومستنسخ فائق (CA (Carlsbad (INVITROGEN ™)superscript Ill II تم تنفيذ PCR كمي باستخدام خليط SYBR® Green PCR رئيسي «®APPLIED BIOSYSTEMS) (UK Warrington 0 مع فأر Hbb-y ذو إنترون ممتد ومواد بادئة Hbb-y) Gapdh أمامي نحطم 1 وذ 6661 0600161 -١ :3ن عكسي 5= 3-GAAGCAGAGGACAAGTTCCCA (متوالية بهوية رقم:69)) Gapdh) أمامي 5= 0 0800008 |-3' (تولية بهوية رقم:70)») عكسي 5- "3-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA (متوالية بهوية رقم:71)) وإنسان HBB (HBG GAPDH 5 مواد بادئة HBG) أمامي 088666005 68101 6/1 3-7-1 (متوالية digg )72:08( عكسي 5'— "3-TCAGTGGTATCTGGAGGACA (متوالية بهوية رقم:73)) HBB) أمامي "3-"-CTGAGGAGAAGTCTGCCGTTAS (متوالية بهوية ,74:4( عكسي "3-"-AGCATCAGGAGTGGACAGATS (متوالية بهوية رقم:75)) GAPDH أمامي 5’- 6638166 32-20000600161 (متوالية بهوية رقم:76)؛ عكسي 5’— “3-TTCAGCTCAGGGATGACCTT (متوالية بهوية رقم:77)). كانت ظروف التكبير :PCR 2°95 لمدة 10 دقائق؛ متبوعا بواسطة 40 دورة من 15 ثانية عند 95"م و1 دقيقة عند 60تم. تم تنفيذ qPCRs على آلة 7500 «®APPLIED BIOSYSTEMS) ABI® (CA (City Foster تم استخدام منحنى معياري باستخدام مخففات مسلسلة ل CDNAS لتحديد فعالية التكبير لكل تفاعل. تمت معايرة التعبير عن Hbb-y و/-جلويين ب GAPDH كعينة 5 ضابطة داخلية؛ والتعبير الجيني النسبي (طريقة (AACE لتحليل بيانات (PCR شاملة تصحيح فعاليات التكبير المتمايزة.
تحليل da نورثرن Northern blot analysis تم تصنيف WIA حمراء فأرية محولة مع SFFV-shRNAmIRs y U6-shRNAs وتم تجميعها بعد اختيار مزرعة بيوروميسين لليوم 7. تم JSRNA Jie باستخدام 1 مل من عامل TRIZOL® كاشف ((AMBION®) وتمت إذابة 15 ميكروجم على 715 جل أكربلاميد gel 5 80/1800106. تم تحديد الأحجام المستنسخة الصغيرة باستخدام Decade Ladder (©ل80اراط (TX Austin تم تقل RNA إلى HYBOND™-XL le (" الاللاك+ ا عارالط (NJ «Piscataway و01055/10660-/الا. .تم التهيجين الأولي للمخططات باستخدام أوليجو (Tx (Austin AAMBION®) UltraHyb عند 35 “م والتي يتم baja مع أوليجونيكلوتيدات oligonucleotides معلمة ب P-32-y )4 بولي نيكلوتيد كيناز (NJ (Piscataway (AMERSHAM™ ¢polynucleotide kinase 0 عند 37 "م لمدة ساعة؛ وتم الغسل في 2* سيترات صوديوم؛ 70.1 سلفات دوديسيل صوديوم sodium citrate عند 35-0 ”0 وتم التعرض للغشاء. كانت متواليات مسبار للكشف عن MIRNA كما يلي: CGGAGACTCCAGACAATCGC 5 shRNAI .3" (توالية بهوية رقم:78)؛ CTCCAGGCAGCTCAAAGATC °5 shRNA2 3' (توالية بهوية رقم:79)؛ TCTCTTGCAACACGCACAGA °5 shRNA3 5 3 (متوالية بهوية رقم:60)؛ CAGGACTAGGTGCAGAATGT 5 shRNA4 3 (متوالية بهوية رقم:61)؛ ATCGAGTGTTGAATAATGAT 5 «shRNAS 3" (متوالية بهرية رقم:62)؛ خلا 65 GTACCCTGGAGAAACACAT 5 3 (متوالية dis رقم:63)؛ shRNAT 5 ACTGTCCACAGGAGAAGCCA .3 (توالية بهوية رقم:64)؛ قحاانكطى 5 CAGTACCCTGGAGAAACACA 0 3“ (متوالية بهوية رقم:65). تحليل مخطط وسترن تم تحليل خلايا حمراء فأرية محولة وخلايا +0034 في محلول تحليل منظم 555لا (RIPA) buffer مع بروتياز (ROCHE®) protease ومثبطات فوسفاتاز phosphatase CRUZ BIOTECHNOLGY) inhibitors /1ل5/1©)؛_بيبستاتين pepstatin وليويبتين (SIGMA) leupeptin 25 تم _تقدير_نواتج تحليل بروتين بواسطة فحص BCA (ign (SCIENTIFIC THERMO) تم تعليق 25ميكرو جم من بروتين في 72 من محلول منظم
Laemmli وتم Mall وتم التحميل على 78 505-بولي -جل أكريلاميد polyacrylamide gel وبالتالي تم النقل إلى غشاء بولي فينيليدين فلوريد (PVDF) Polyvinylidene fluoride (MILLIPORE®) بعد التكتل في PBS مع 70.1 10010100-7 و75 من لبن Gla غير دهني nonfat dry milk تمت حضانة غشاء بولي فينيليدين فلوريد مع جسم مضاد فأري أحادي النسيلة 1 861118 (ABCAM®) أو فأر 8]-2801-أكتين (©5161/8). تم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ب HRP IgG مضاد لفأر (خلية (SIGNALING® للكشف بواسطة التوهج الكيماوي Peroxide X20 3 Reagent LUMIGLO® X20 (خلية .(SIGNALING® تحليل كروماتوجراف سائل عالي الأداء تم تحضير حلالات دموية Hemolysates من WIA في اليوم 18 من التمايز باستخدام 0 التحليل التناضحي في الماء وثلاثة من دورات الذوبان والتجميد. وتم تنفيذ Day هيموجلوبين كهربي Hemoglobin electrophoresis مع أسيتات سيليلوز cellulose acetate وكروماتوجراف سائل عالي الأداء مع نواتج التحليل» في المعامل السريرية ل Brigham and Women’s Hospital باستخدام معايير معايرة سريريا لمركبات الهيموجلويين البشرية human .hemoglobins 15 تتابع وتحليل RNA تم استخلاص RNAs صغيرة من 106X6 خلايا حمراء فأرية باستخدام طقم عزل (INVITROGEN™) miRNA mirVana وفقا لتعليمات المصنع وبتم إرسالها من أجل تتابع RNA العميق باستخدام ILLUMINA® ١115602000 تم استخدام مخطط PERL ذاتي التطور لإزالة المتوالية المهيأة؛ وتم استخدام 0125-19 RNAS صغيرة أيضا للتحليل. تم استخدام برنامج BOWTIE 0 (الذي تم الحصول عليه من على الموقع الألكتروني عند صافي مدة الاتصال الحيوي بالمصدر) للمحاذاة؛ وتم السماح بنسبة عدم توافق تبلغ 1. تمت معايرة مستويات التعبير عن RNAS صغيرة إلى مليون من إجمالي قراءات كل مجموعة للمقارنة بين العينات المختلفة. بالنسبة للتجرية مع 250 ShRNAs TRC في 4 سلالات خلية؛ تم تحضير فيروس بطيء بواسطة Broad Institute باستخدام بروتوكول تحضير فيروس Je الإنتاجية وتمت إصابة الخلايا عند 5 تعدد الإصابة عالي مع ShRNA منفرد لكل عين في أطباق سعة 96 عين (يتم الحصول على البروتوكولات من المواقع الإلكترونية ل «Broad Institute at Cambridge, MA الولايات
المتحدة؛ عند مصادر RNA العامة تحت اسم "بيوروميسين 617/ا0017017") تمت إضافة عند اليوم 1 بعد الإصابة وتم تحليل الخلايا في TRIZOL® عند اليوم الرابع بعد الإصابة. تم نقع كل نواتج التحليل لكل سلالة خلية؛ متبوعة بواسطة استخلاص RNA كلي وتحضير مجموعة RNA صغير (49). تم تلخيص قراءات ©8ل/1/الا1ااء والتي انهارات إلى قراءات فريدة (>0117) مع عدات؛ وتم التخطيط إلى تعبير تي ارسي TRC عن ناقل متواليات ShRNA التي لا تسمح بأي عدم توافق. تم حساب عمليات توزيع متوالية ShRNA الناضجة لكل ShRNA قبل تحديد متوسط عبر .ShRNAs التحليل الاحصائي تم استخدام حزمة برامج 5.0 GRAPHPAD PRISM® من أجل التحليل الإحصائي. يتم التعبير عن النتائج التي يتم التعبير عنها كمعيار انحراف متوسط + standard deviation (50). تم تقييم التميز الإحصائي بواسطة الاختبار ]. النتائج فعالية استبعاد 801117 المنخفضة بواسطة ShRNAS المدمجة في بنية متراصة MicroRNA (ShRNAMIR) مقارنة بحلقات ShRNA بسيطة الجذع لتحديد shRNAS المرشحة التي تتوسط في استبعاد 801117 الفعال؛ تم فحص مجموعة فيروسية بطيئة من 118 ShRNAS تستهدف ترميز متواليات ل mRNA 861118 محفوظة بين البشر والفئران في WIA حمراء فأرية. تم التعبير عن SARNAS من معزز 6لا قائم على أساس pol NI (الشكل 119 الصورة اليسرى) في الأساس LKO الفيروسي البطيء )26( يحتوي على مقاومة لجين بيوروميسين من أجل اختيار ما aw ب LKO-U6-BCL11A- shRNAMIR 0 (فيما يلي 8ل6-9050لا). تم تحويل خلايا حمراء فأرية؛ خلية مستخدمة بشكل شائع لدراسة تنظيم جين جلوبين» مع الفيروس البطيء نواقل التعبير عن ShRNAs عند تعدد الإصابة بمقدار 2. يعمل التعبير المعاير لفأر Hbb—y Mma جنيني؛ ly تعمل كنظير وظيفي لجين (-جلوبين بشري )27( يقدم قراءة غير مباشرة لاستبعاد 8011178 (الشكل 19ب؛ المحور لا). كقراءة ثانية؛ تمت مراقبة منقوع ShRNA أيضا استخدام سلالة خلية مبلغة حمراء فأرية تحمل 5 تضمين mCherry عند الموقع Bauer) Hbb-y .0 غير منشورة). تم تحليل حث مبلغ متألق بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 19ب؛ المحور *#). تم استنساخ ثمانية 5050085 (المعلمة
والمسماة shRNAT خلال 8 في الشكل 19ب) التي تم حثها Hbb-y بشكل مناسب flies التعبير عن mCherry في WIA حمراء فأرية في 00100054108223 بشري (014-223) التي تحيط بها وحلقة متواليات لتكوين MicroRNAs تخليقية (ShRNAMIR) مع قيام الهدف بتطوير نواقل التعبير الانتقائية للسلالة لاستبعاد 861-117. للتحليل الأولي؛ تم دمج هذا القالب الجيني في ناقل PLEGO فيروسي بطيء (28) (الشكل19أ؛ الصورة اليمنى) في المنطقة 3 غير das ial ل Venus مبلغ متألق تحت سيطرة معزز/محسن فيروس تكوين التركيز الطحالي القوي والمطلق الذي يتم التعبير عنه المسمى LEGO-SFFV-BCL11A-ShRNAMIR (المشار إليه Las يني .(SFFV-shRNAmMIR تمت مقارنة فعالية استبعاد ShRNAS التي تضمنت نفس متواليات التوافق مع الهدف ذات ال 21-قاعدة بشكل مباشر؛ ولكن في سياق عبوات التعبير U6-shRNAs i) pol ١ااو pol lll في مقابل (.SFFV-shRNAmMIRs في خلايا ches فأرية باستخدام ShRNA غير مستهدفة بكونها عينة ضابطة سلبية. تم الكشف عن بروتين 8011178 بواسطة مخطط مناعي في نواتج تحليل الخلية من حمراء فأرية-خلايا Algae عند تعدد الإصابة بمقدار 2 (الشكل 19ج). كان استبعاد 861-117 أقل كفائة بشكل مستديم في WIA التعبير عن SFFV-shRNAMIR مقارنة 5 ب U6-shRNAs (الشكل 19ج). لتأكيد التميز الوظيفي لهذا الفرق؛ قام المخترعون بقياس مستويات حث Hbb—y MRNA بواسطة 087-0085 (الشكل 19د) في مجموعات متجانسة لخلايا محولة تم الحصول عليها إما بواسطة اختيار بيوروميسين أو بواسطة خلية تصنيف منشطة بالتألق (FACS) كانت فعالية استبعاد SFFV-shRNAMIRS المنخفضة مقارنة ب -6لا ki) shRNAs الشكل 19ج) المبينة في حث Hbb-y الأقل كفاءة بواسطة SFFV- shRNAmMIRs 0 (الشكل 19د) والفروق في حث Hbb-y أكثر وضوحا من الفروق في استبعاد .BCL11A U6-ShRNAS 3 SFFV-shRNAMIR Lass عن متواليات الجديلة الموجهة الناضجة المختلفة لفهم الأساس المولاري لهذه cg dl) تم تنفيذ تتابع RNAS صغيرة من WIA محولة مع العديد من U6-ShRNAS ونظائر مناظرة من (SFFV-ShRNAMIR سوف يتم افتراض أن 5 الفروق المميزة في حث Hbb-y بسبب فرق إنتاج الجدائل الموجهة الناضجة من نواتج استنساخ مميزة تحتوي على ShRNA والتي يتم إنتاجها من سياقات pol ١١ وااا ا00. July تم تقييم
متواليات الجديلة الموجهة المعالجة من كل من سياقات SFFV-shRNAMIR 3 U6-shRNAs (الشكل 120 وب). تتناظر ال RNAS الموجهة الموجودة بوفرة lly يتم إنتاجها ناضجة من SFFV-shRNAmMIRs بشكل كبيير مع المتوالية الناضجة المتوقعة في سيليكو silico (الشكل 0ب). على العكس» أسفر أغلب U6-ShRNAs عن متواليات جديلة موجهة ناضجة تتوافق مع
منتج Dicer المتوقع الذي يتكون من 7122-7 من الطرف 3" من مستنسخ pol Hl شاملة ناتج مد بمقدار 5-3 nt المشتق من إشارة إنهاء !اا ا00؛ ولكنها تحتاج إلى عدد مناظر من النيكلوتيدات الخاصة بالمتوالية المتوافقة مع الهدف لمتوالية عند الطرف 5”. تمت ملاحظة وجود
توزيع مشابه للمنتجات المعالجة في عملية فحص كبيرة بمقدار 247 من U6—ShRNAS المختلفة
في سلالات الخلايا Jurkat (MCF7 (A549 و0937 حيث تتضمن متوالية الجديلة الموجهة
0 المسيطرة متوسط طول بمقدار 0122 مع طرف 5 يبدأ من 4 قواعد من متوالية الحلقة الثابتة. تم تنفيذ التتابع العميق ل 247 من منتجات TRC ShRNA التي تمت معالجتها في سلالات الخلايا الأريعة هذه (الشكل 25). تشير النتائج إلى أن جديلة موجهة الناضجة المسيطرة ag عند الموضع
4 من متوالية مضادة للحس من SARNA وتتضمن أريعة من الوحدات البنائية U=3 الطرفية.
كانت المعالجة متوافقة بشكل عام بين سلالات الخلايا وبين العديد من متواليات ShRNA
5 المختلفة. وقد وجد أن وزن متوسط قراءة التردد لكل متوالية ناضجة بشكل متساوي عبر 85ل على الرغم من أن بعض ShRNAS التي تم توليدها >1000-طية وكانت بعض القراءات أكثر من غيرها. قامت هذه الطبيعة شبه الكمية لتتابع ال RNA الصغير؛ بسبب ميول
ليجاز RNA القوية أثناء تحضير المجموعة؛ بجعل المقارنات مستحيلة بين مستويات التعبير أو المعالجة النسبية؛ ولكنها تميل بشكل ثابت عبر سلالات ShRNAs ; LIAN التي تبين هوية
0 جديلة موجهة مسيطرة. تم أيضا الكشف عن قراءات الجديلة الحسية (<730 لكل ShRNA بشكل متوسط)؛ حيث الأغلبية الواسعة منها Tas ب '66' وتمتد بمقدار 0420 في متوالية الجديلة الحسية.
هذه المتواليات الناضجة تتوافق بالضبط بشكل متوافق مع منتج Dicer لمستنسخ hU6 shRNA الأساسي؛ دون dala إلى بدء خطوة معالجة .Drosha/DCGRS باعتبار ما سبق؛ تشير هذه النتائج إلى أخمية اعتبار حالات المعالجة التي تنتج متواليات ناضجة من نواتج استنساخ pol ١١
shRNA 3 shRNAmMIR 5 الا pol عند نقل متواليات ShRNA بين النواقل. تمت ملاحظة هذا التوزيع المتشابه جدا للمتواليات الناضجة لأنواع الخلية الأربعة التي تمت دراستها حيث يتم تعميم
أنماط المعالجة عبر مختلف السياقات الخلوية. تساهم هذه الفروق في متوالية الجديلة الموجهة الناضجة الناتجة في !اا pol في مقابل نواقل قائمة على أساس pol Il بشكل أساسي في التخفيض المتحكم فيه ل BCL11A الملحوظ مع U6-ShRNAS مقارنة SFFV-shRNAmMIRs تشير هذه البيانات إلى أن التحويلات المتوقعة بين نواقل pol II واا pol ممكنة بواسطة اعتبار شق Drosha 5 و0166 ل pol Il sShRNAs مقارنة بشق Dicer ل .pol ١١١ shRNAs
يؤدي تعديل متواليات ShRNA في ناقل قائم على أساس pol Il إلى فعالية استبعاد محسنة بناء على هذه النتائج؛ افترض المخترعون أن استخدام المتوالية الناضجة المتوقعة من نواقل shRNA pol ||١ عند نقل متواليات في SFFV-shRNAMIR سوف يؤدي إلى فعالية استبعاد محسنة. بالتالي» تحتوي مجموعة من SFFV-shRNAMIRS على إزاحة 4-نيكلوتيد في 0 الطرف 5 لمتوالية الجديلة الموجهة (الشكل 21). عند الطرف 3" تمت إضافة نيكلوتيدات 06 لتحقيق أعلى ثبات حراري ديناميكي عند الطرف 3-” في ال SIRNA المزدوج والذي يجب أن يعزز تحميل معقد انتقائية التداخل RNA بشكل مفضل للجديلة الموجهة. تم تقييم أثر عمليات التعديل على فعالية استبعاد وتم تقييم حث Hbb-y في خلايا حمراء فأرية بواسطة مخطط مناعي (RT-PCR على التوالي. تمت ملاحظة فعالية الاستبعاد المحسنة لبروتين 861117 مع 1ج ادهل90-/51؛ 3 و8 (الشكل 21ب). قام الاستبعاد المحسن المرتبط بحث نواتج استنساخ Hbb-y زائدة بمقدار 200 إلى 400 طية (الشكل 21ج). لم تبين SFFV- shRNAMIRs الأخرى زيادة يمكن ملاحظتها في فعالية الاستبعاد. لفهم الآلية الكامنة shy الفعالية المحسنة ل SFFV-shRNAMIRSs 1< 3 و8 المعدلة تم تحليل وفرة الجديلة الموجهة والجديلة المنتقلة ل RNAs صغيرة ونسبها بواسطة بقعة نورثرن. أولاء تمت ملاحظة وفرة أكبر 0 لجديلة الموجهة ل pol II في مقابل نواقل pol ١! في كل الحالات. علاوة على ذلك؛ تحديدا بالنسبة ل SFFV-shRNAmMIiRs 1 و3 وجد أن هناك نسب وفرة أكبر وتوجيه أكبر للجديلة المنتقلة في مقابل ShRNAMIRS غير المعدلة؛ بينما لم تتأثر هذه المتغيرات الخاصة ب SFFV- shRNAS (الشكل 21د). تم تنفيذ عملية تتابع عميقة ل RNAS صغيرة لتقييم أثر التعديل على متواليات الجديلة الموجهة ولريطها بالتغيرات الملحوظة في استبعاد ,/80111. بشكل عام؛ قامت 5 المتواليات الناتجة التي تمت معالجتها بتوضيح إزاحة بمقدار 4 nt التي تمت إضافتهاء بما يؤدي إلى جديلة موجهة مع مناطق البذرة المشابهة لمتواليات تم الحصول عليها من pol Ill shRNASs
الذي يتم التعبير عنه في أساس ©0»اا. بالنسبة ل SFFV-shRNAMIRs 1« 3 و8؛ وقد وجد أن هناك متوالية مسيطرة فردية موجودة؛ والتي تتضاد مع الفعالية الأقل SFFV-shRNAMIRs التي أوضحت توزيع أوسع للمتواليات. أثر تعديل shRNAMIR على استبعاد 861117 وحث /(-جلوبين في خلايا حمراء أساسية مشتقة من +0034 بشري كان لعملية sale) تنشيط الجلويين الجنيين مع استبعاد 8061117 قدرة علاجية لعلاج مرض الخلية المنجلية و]-ثلاسيميا. لتقييم أثر SFFV-ShRNAMIR معدل على فعالية استبعاد 801118 وحث /-جلوبين والتعبير عن HOF في WIA بشرية أساسية؛ تم تحويل الدم المحيط المنقولة بواسطة HSPCs (MPB) G-CSF +6034 من متطوعين أصحاء مع نواقل التعبير 0 عن dae SFFV-shRNAmMIR; SFFV-shRNAmIR (U6-shRNAs ويعد ذلك يتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر. بعد 11 يوم في مزرعة؛ تم تحديد مستويات 801117 عبر مخطط وسترن (الشكل 22)). بشكل متوافق مع النتائج في خلايا حمراء djl تمت ملاحظة الاستبعاد المحسن مع SFFV-shRNAMIRs 1< 3؛ و8؛ معدلة والتي تؤدي أيضا لزيادة حث نواتج استنساخ (-جلوبين (الشكل 22ب). تم تقييم Alla التمايز الأحمر في اليوم 18 من المزرعة 5 بواسطة تحليل التدفق السيتومتري للتعبير السطحي ل 6071 و8/م6 والاستئصال. لم تتم ملاحظة فروق كبيرة بين SFFV-ShRNAMIRS وعينات ناقل ضابطة محولة (الشكل 22ج). على العكس؛ أدت U6-ShRNAS إلى تأجيل طفيف في الحصول على مرقمات التمايز في الأطوار الأخيرة من النضج؛ والتي يمكن أن تشير إلى السمية بسبب التعبير المفرط عن ShRNA الذي تم التوسط فيه بواسطة معزز 6لا-. تم ast ملاحظات خاصة بحث (-جلويين MRNA بواسطة 0 بروتينات HOF زائدة بواسطة كروماتوجراف عالي الأداء. أدت ال SARNAMIRS معدلة الثلاثة التي تم اختبارها إلى sab خرج HOF مقارنة ب SFFV-shRNAMIRs غير معدلة Jal) 2)؛ حيث بين 750-40 من الهيموجلوبين الكلي في الخلايا الحمراء كان يوجد HDF كانت هذه العلاقة بين بروتين (-جلويين HBF 3 MRNA عالية )0.96=12(¢ بما يدعم صدق نواتج التحليل هذه (الشكل 22ه). باختصارء أوضح المخترعون أن ShRNAS المدمجة في بنية MIRNA متراصة والذي يتم التعبير die عبر معززات pol ١| تتم معالجتها لإعطاء SIRNAS ناضجة مختلفة في خلايا
محولة مقارنة ب SIRNA الذي يتم التعبير die من معزز 6لا. تمت إزاحة المتوالية المتوافقة مع الهدف في ShRNA ناضجة مشتقة من بنية معزز !اا pol بشكل غير متجانس عند الطرف 3" بمقدار 5-3 Nt وهذا الفرق مرتبط بفروق كبيرة في فعالية استبعاد المستنسخ المستهدف. في حالة 801118؛ الهدف العلاجي المحتمل؛ أدى هذا إلى فروق كبيرة في إعادة تنسيط التعبير عن (- جلوبين. cps هذه البيانات أهمية تحسين التصميم عند نقل متواليات i 4 shRNA
Pol ١١ متراصة للسماح بالتعبير الذي يتوسط فيه MicroRNA يقوم استبعاد 861-117 المطلق في WA جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية hematopoietic (HSPCs) stem and progenitor cells بإضعاف عملية إعادة التكوين المكونة للدم ويمكن أن يتم إحاطتها بواسطة استهداف التعبير عن ShRNAMIR إلى الخلايا الحمراء . 10 تم تقييم أثر التعبير عن SFFV-shRNAMIR في الكائن الحي في نموذج فأر لتحويل وزراعة خلية جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية. تم تحويل WIA جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية السلبية للسلالة (lin) Lineage-negative من نخاع عظم B=YAC ly تعبر عن ail 0045.2 لسطح الخلية ally تم تحويلها خارج الكائن all مع نواقل SFFV- shRNAmIR أو non-targeting a ناقل (SFFV-shRNAmMIRNT) وتمت الزراعة في 5 فتران Boyd 6045.1 مستقبلة تم قتلها بالإشعاع. تمت زراعة WAY غير المحولة في مجموعة ضابطة. تحمل hid 77/80 -] موقع (]-جلوبين بشري كجين متحول يتم تنظيمها بشكل مطور في بيئة Ally lal تبين تعبير متمايز لجينات الجنينية وجينات ]-جلوبين البالغة. لأغراض التحقق ولمقارنة أفضل مع البيانات المنشورة سلفا تم استخدام ShRNA الموضحة lus (23» 27« 29( (المسمى هنا (ShRNAMIR® المدمجة في متواليات MIRNA223 المحيطة. في الأسابيع 4 8 0 و12 بعد الزراعة dV) تم تحديد تطعيم الخلية المانحة بناء على خيمرة 0045.1 و0045.2 (الشكل 123( كان تطعيم الخلية المائحة بعد النمط المتوقع مع تطعيم شبه كامل في الدم المحيط ونخاع العظم بعد 8 أسابيع. مع ذلك؛ بشكل غير متوقع؛ تدهور gia الخلايا المعدلة بالجين بحدة مع الوقت (الشكل 23ب). على الرغم من معدلات التحويل الأولية بمقدار -1740 باستخدام ناقل استبعاد 861-117؛ كان الجين الذي يقوم بالترقيم عند الأسبوع 12 فقط بمقدار 2- Li 23 5 من خلايا 0045 المشتقة WS من المانح. كان التعبير المفرط عن SFFV- ShRNAMIR NT مرتبط Wiad بالتطعيم المخفض للخلايا المعدلة بالجين ولكنها بمقدار أقل؛ بما
يشير إلى وجود سمية انتفائية لكل من المتوالية وسمية غير انتقائية في LIA جذعية مكونة للدم LDA, الأساسية التي تقوم بالتطعيم. يشير توقيت فقد الخلايا المائحة التعبير عن ShRNAS إلى
وجود أثر على الأجزاء الأكثر بدائية من الخلية الجذعية المكونة للدم. لفحص الأثر السلبي بشكل أكبر على عملية إعادة تكوين الدم؛ تم تنفيذ تجارب إعادة تكوين كمية مقارنة (الشكل 523-223( تم تحويل خلايا من حيوانات مانحة 6045.1 (BoyJ) عديمة السلالة (BING) CD45.2 مع عدة نواقل تعبير عن SFFV-shRNAMIRS في مقابل SARNAMIRNT (BCL11A أو فقط بروتين أزرق متألق مبلغ تحت سيطر معزز فيروس تكوين تركيز طحالي الذي يتم التعبير عنه بشكل مطلق (فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق). تمت زراعة الخلايا في حيوانات 0045.1/0045.2 المسانجة؛ بما يسمح بتعريف كل 0 من المجموعات المائحة والخلايا المستقبلة. في التجارب التي تم فيها استخدام ناقل فيروس تكوين تركيز Mak - بروتين متألق أزرق» تمت زراعة خلايا dail 6045.1 في حيوانات 0045.2 وتم تحديد المجموعات المحولة من الخلية المانحة وتمت المقارنة بناء على التألق. قبل الزراعة dalam) تم خلط أعداد متساوية من WA المجموعات المحولة مع نواقل متنافسة. تم تحليل النسبة النهائية للخلايا المعدلة بالجين التي تم الحصول عليها مع النواقل في المجموعة المزروعة 5 عبر التدفق الخلوي lly أكدت على التحويل المقارن الذي يتفاوت من 770-55 (الشكل 22ج). تم تقييم مساهمة الخلايا المعدلة بالجين في الحيوانات المزروعة في الدم المحيط؛ نخاع العظم والطحال في الأسابيع 4 8 و12 بعد الزراعة الانتقالية (الشكل 23د) وقد تم اعتبار الفروق المنخفضة في نسب الخلايا المحولة المدمجة لهذا التحليل. في كل الحالات وفي كل النقاط الزمنية؛ تم التفوق على الخلايا المحولة بنواقل تستهدف BCLITA بواسطة خلايا محولة ب غير 0 مستهدفة أو ناقل فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق؛ بما يشير إلى عيب انتقائي عند alesis) /86111. لم تتم ملاحظة فروق كبيرة في Bale) تكوين خلايا مكونة للدم مقارنة بنسبة المجموعة المزروعة أوليا عند تنافس اثنين من النواقل التي تقوم باستهداف 801117 في مقابل بعضها البعض. بشكل متوافق مع النتائج في الشكل 23ب؛ كان لهذا التعبير المفرط عن Lad ShRNAMIRNT أثر سلبي على إعادة تكوين ad) حيث تم التفوق على هذه المجموعة 5 بواسطة WIA محولة بواسطة ناقل pal) عن فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق فقط وليس التعبير عن ShRNA قام المخترعون بتنفيذ تحليل أكثر تفصيلا للخلية الليمفاوية 8
olay خلية جذعية مكونة للدم أكثر بدائية في gall المحول لخلايا نخاع العظم (الشكل 23ه).
كما هو متوقع من الدراسات السابقة فقد sul غياب خلايا 8 في فتران /80111-/- )30
1) وقد تم تقليل عدد خلايا 8 إيجابية ل 8220 عند استبعاد ,/86111. على الرغم من عدم الوصول إلى قيمة ملحوظة؛ كان هناك ميل تجاه فقد المزيد من c—kit+ Sca—1+ lin LIA
(LSK) 5 أكثر بدائية تتضمن sha تطعيم خلية جذعية مكونة للدم.
يمكن أن يقوم استبعاد 801117 الانتقائي للمكونات الحمراء بالتغلب على الأثر السلبي
لاستبعاد BCLITIA على WIA جذعية مكونة للدم وخلايا 8؛ بينما يتم الحفاظ على الأثر العلاجي لحث /-جلوبين في الخلايا الحمراء. لتوجيه الاستبعاد انتقائيا إلى خلايا حمراء؛ تم توليد
JAG فيروسي بطيء حيث يتم التعبير عن قالب جيني ShRNAMIR والمبلغ Venus المتألق
0 تحت سيطرة معزز أقل قريب من ]-جلوبين مرتبط بمواقع عالية الشدة 2 و3 HS2) و153) من منطقة التحكم في alse م-جلويين (32) (الشكل 523( المسماة LV-LCR-BCOL11A- ShRNAMIR (المسماة .(LCR-ShRNAMIR تم تقييم Alls التعبير عن الجينات المتحولة لمبلغ في مجموعات الخلية المكونة للدم المطعمة في الكائن الحي أولا في Ob مزروعة مع
خلية جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية محول (الشكل 23ز والشكل 26). في الشكل 26؛ تم
5 تحويل WAY عديمة السلالة باستخدام ناقل LOR-ShRNAMIR وتم التطعيم في فئران مستقبلة مقتولة بالإشعاع. بعد مرور 12 أسبوع تم تحديد الخلايا المائحة وأنواع الخلية المختلفة المكونة للدم باستخدام مرقمات السطح. والتي أوضحت وجوتد تبويب تمثيلي وبقع تكرارية تبين التعبير عن 5 في السلالات المختلفة. تشير الأعداد في البقع إلى نسبة الخلايا الإيجابية ل venus ومتوسط شدة التألق. تم تنظيم التعبير عن الجين المتحول بشكل دقيق؛ بدون تعبير يمكن الكشف
0 عنه في أجزاء LSK وخلية 8؛ ومستويات منخفضة جدا من التعبير في خلايا 1 ومستويات منخفضة من التعبير في WAY النقوية في بعض الحيوانات. على العكس؛ تمت زيادة التعبير الجيني المتحول بشكل متحكم فيه بقوة أثناء التمايز الأحمر؛ بداية من ~CDT71+/Terl19 Wa
تمثل الخلايا الأساسية الحمراء والخلايا الأرومية الحمراء المعززة وصعودا في الطور الإيجابي المزدوج «CDT71+/Terl19+ بما يمثل الخلايا الصبغية الحمراء الأرومية. أثناء المراحل الأخيرة
25 من نضج المكونات الحمراء؛ shag كبير من +CDT71-/Terll9 WA يمثل الخلايا الشبكية
وكريات الدم الحمراء الناضجة الذي يتم التعبير عنها في المبلغ بنسبة مشابهة مقارنة بخلايا .CD71+/Ter119+ بعد ذلك؛ لتحديد ما إذا كان استخدام ناقل منطقة تحكم موضعي يتغلب على عيب إعادة التكوين الملحوظ عند التعبير المفرط عن SFFV- shRNAMIR تم تنفيذ تجرية الزراعة الانتقالية تنافسية باستخدام LCR-ShRNAMIR و SFFV-shRNAMIR (الشكل 23ح). حيث ناقل منطقة تحكم موضعي صامت نسخيا في خلايا =n يتم إخضاع قسامة من خلايا للزراعة الانتقالية مستخدمة إلى التمايز الأحمر في المعمل ونسبة خلايا 7/805+ المقاسة في مجموعة CD71+/Terl 19+ النسخية والمستخدمة من أجل معايرة فيروس تكوين تركيز طحالي في مقابل خلايا منطقة تحكم موضعي- محولة. تمت مقارنة التعبير عن Venus في الحيوانات المزروعة 0 في خلايا حمراء» حيث كانت هي المجموعات التي تسمح بالتعبير عن كلا النواقل بشكل متساوي. وقد أبدى sale] بناء الفئران المزروعة سيطرة واشحة للخلايا المشتقة من خلية جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية المحولة مع ناقل منطقة تحكم موضعي؛ بما يشير إلى سمية أقل في خلايا جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية المرتبطة بالسلالة التي تعبر انتقائيا عن السلالة الحمراء ل LCR-shRNAmMIR (الشكل 23ح). باختصارء تبين هذه البيانات أن الأثر العكسي لاستبعاد 5 801118 على تطعيم/وظيفة خلية جذعية مكونة للدم يمكن التغلب عليها بواسطة التعبير عن miRNA الانتقائية للمكونات الحمراء . يؤدي استبعاد 801117 الانتقائي للمكونات الحمراء الذي يتوسط فيه ناقل منطقة تحكم موضعي باستخدام ShRNAMIRS معدلة إلى مستويات عالية من HDF في خلايا حمراء بشرية human erythroid cells لاختبار فعالية استبعاد BCLITA الانتقائي للمكونات الحمراء الذي يتوسط فيه ناقل منطقة تحكم موضعي في نظام اختباري بشري؛ تم تحويل الخلايا +0034 مع ShRNAMIRs معدلة 3 أو 8 تحتوي على نواقل LCR-shRNAMIR (الشكل 23و). وقد أكد المخترعون Vol على حالة التعبير للعديد من نواقل (LCR-shRNA*) LCR-shRNAMIR LCRShRNAMIR3 و8) في خلايا بشرية أثناء التمايز الأحمر في المعمل لخلايا بشرية 0008 5 +0034. تم تقييم التعبير عن VENUS بواسطة نواقل منطقة تحكم موضعي وناقل ضابط يعمل بواسطة فيروس تكوين تركيز طحالي بدون قالب shRNAMIR جيني (SFFV-GFP) )33(
عند مراحل مختلفة من نضج المكونات الحمراء؛ كما هو محدد بواسطة تبقيع CD71 وم (الشكل 23ط). بشكل متوافق مع النتائج في خلايا فأر مبينة في الشكل 223 تمت ملاحظة مستويات منخفضة من التعبير في خلايا ~GpA[-CDT1 shes غير ناضجة. كان هناك زيادة متحكم فيها قوية للتعبير في خلايا إيجابية ل +6071 فردية مع أعلى مستوى للتعبير الجيني
المتحول في خلايا مزدوجة إيجابية لذ 8/م6/+0071+ ST نضجا. كما هو متوقع؛ قامت SFFV-GFP الضابطة بتشغيل التعبير المتتالي عالي المستوى في كل المجموعات الفرعية. بعد بروتوكول التمايز الموضح سلفاء تم قياس مستويات بروتين 801117 في اليوم 11 من المزرعة
وتمت المقارنة بالتواقل الضابطة غير المستهدفة والزائفة SFFV-; LCR-shRNAMIRNT) (GFP تمت ملاحظة التقليل الكبير في 80611178 في WAY التي تعبر عن ShRNAMIR
0 معدل مقارنة بالخلايا التي تعبر عن الناقل غير المستهدف والناقل الضابط control vector ) اس اي (SEW sibs (الشكل 124( شكلت جاما MRNA Sula 40 و770 من مركبات جلوبين
شبيهة ب ] في WA مشتقة من خلايا CD34+ محولة مع نواقل التعبير عن shRNAMIR3
و8؛ على التوالي (الشكل 24ب). لم تتم ملاحظة فروق في نمو الخلية بين WA محولة مع LCR-shRNAMIRSs أو النواقل الضابطة. كان التمايز الأحمر غير ملحوظ؛ عند تقييمه بواسطة
5 اتعبير السطحي عن 0071؛ GPA وبواسطة الاستتصال من العينات الضابطة (الشكل 24ج)؛ بما يشير إلى عدم وجود أثر سلبي لاستبعاد BOLITA عند التعبير SEY) للسلالة ل .BCLI1A shRNAmIRs تمت ملاحظة العلاقة القوية بين مستويات MRNA (slay HBF 5 (QRT-PCR) كما هو مقيم بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء (الشكل 24د).
تساهم HDF في 735 7555 من الهيموجلوبين الكلي في خلايا محولة مع LOR-
(LCR-shRNAMIRS 5 sShRNAMIR3 0 التي تمثل مستويات مقارنة مع التعبير الذي يتوسط فيه معزز فيروس تكوين تركيز طحالي (الشكل 22د والشكل 24ه). pal للتوضيح من أجل
إثبات fae أن الاستبعاد الذي يتوسط فيه LCR-ShRNAMIR يسمح بالتطعيم المناسب لخلايا cing hCD34+ /-جلوبين» نك تمفيذ الزراعة الانتقالية ل HSPCs +0034 محولة مشتقة من
نخاع العظم مع LCR-ShRNAMIR3 أو نواقل غير مستهدفة في NSG (yd تم تعريضها
25 لمستويات إشعاع غير قاتلة. بسبب التطور الضعيف في WAY الحمراء البشرية في نموذج الطعمة هذاء تم HSPCs Jie +0034 من نخاع العظم للحيوانات المزروعة بعد 14 أسبوع بعد
الزراعة الانتقالية وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. تم تخصيب خلايا Venus بواسطة خلية تصنيف منشطة بالتألق وتم تحديد التعبير عن 7- و[]-جلوبين بواسطة RT-PCR (الشكل 24و). بشكل متوافق مع البيانات السابقة؛ كان خرج ea 7(-جلوبين من موقع (]|-جلويين الكلي 744.9 + 75.5 بالنسبة للخلايا المحولة مع (LCR-ShRNAMIR3 مقارنة ب-9/ + 70.5 في المجموعتين الضابطتين المكونتين من LCR-ShRNAMIRNT خلايا محولة أو غير محولة.
وقد تم استخدام ShRNAS بشكل موسع لتحليل الوظائف الجينية في الدراسات البيولوجية؛ وكانت هناك زيادة مهمة في استخدام RNAI للأغراض العلاجية. تمثل 861117 هدف علاجي مشوق لتضمين قائم على أساس RNAI 8611178 عبارة عن وسيلة قمع التعبير عن 7(-جلوبين Jilly 0 تعمل كمضمن أساسي لتحويل الهيموجلويين الجنيني إلى هيموجلوبين ناضج في الخلايا الحمراء. بشكل cage ارتبط المستويات العالية من الهيموجلويين الجنيني مع أنماط جينية مرضية أخف في مرض الخلية المنجلية وأمراض م-ثلاسيميا وتم تفعيل الاستبعاد SEY) للسلالة ل 861118 كاستراتيجية علاج في نماذج مرض الخلية المنجلية. في الدراسات المشار إليها هناء كان هدفنا هو تطوير ناقل يمكن استخدامه سريريا sale تنشيط التعبير عن هيموجلوبين جنيني 5 بواسطة قمع يتوسط فيه RNAI ل 806111/8. باستخدام ShRNA مهياً ب MIRNA يحتوي على ناقل فيروسي بطيء محسن (ShRNAMIR) الذي يتم التعبير die من معزز pol ١١ انتقائي للسلالة الحمراء قام المخترعون بتحقيق مستويات HOF بمقدار >750 من الهيموجلوبين الكلي في الخلايا الأولية الحمراء المشتقة من HSPCs +6034 محولة. يحتمل أن يكون هذا المستوى العالي من حث HDF فعال سريريا وقابل للمقارنة بشكل مفضل مع النواقل المذكورة سلفا (23؛ 0 27 29) باستخدام عبوات التعبير تعمل بواسطة !اا pol والتي تحتاج إلى انتقائية للسلالة وقد
تمت الإشارة حالة الأمان للنواقل الفيروسية البطيئة ذاتي التنشيط هنا. يمكن الحصول على علاج ل مرض الخلية المنجلية مع زراعة خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا. تعتمد هذه النتائج المفضلة في مرض الخلية المنجلية بشكل كبير على إتاحية أقارب مانحين متوافقين. كانت هناك نسبة أقل من 710 من مرضى مرض الخلية المنجلية لهم مانحين 5 محتملين لديهم توافق (34). يقدم العلاج الجيني لأمراض الهيموجلوبين الميزة الواضحة الخاصة باستبعاد خطر جي في اتش دي GVHD باستخدام خلايا ذاتية المنشاً. يهدف المدى الطويل لهذه
الدراسة_ على تضمين تبديل هيموجلويين؛ بما يؤدي إلى الحث الداخلي والفسيولوجي ل HBF الوقائي وقمع تمنجل الجلويين. يفترض المخترعون أن هذا التلاعب المزدوج للتعبير سوف يكون له أكثر أثر علاجي فعال على الوقاية من السميات في مرض الخلية المنجلية شاملة انحلال الدم وتلف العضو الطرفي للمتطفرء وبلمرة الهيموجلوبين. لإدراك الهدف من الفائدة العلاجية؛ يجب أن يقوم استبعاد BCLITA الفعال وحث HBF على أساس الخلية والأعداد المناسبة من الجين المعدل طويل العمر خلية جذعية مكونة للدم بالتطعيم لخيمرة جزء الخلية الحمراء لتخفيف النمط الجيني للمرض. بالتالي عملية تحسين استبعاد 801117 والحفاظ على قدرة sale] التكوين ل HSCP محولة المبينة هنا مهمة من أجل النجاح dish المدى للعلاج الجيني في مرض الخلية المنجلية. فيما يتعلق بالنقطة الثانية؛ يعتقد المخترعون أن هذا يمكن تحقيقه dlls حيث أبدت 0 اليانات السابقة من الزرائع الخيفية الناتجة عن خيمرة مخلوطة أن هناك خيمرة مخلوطة بنسبة 0 من الجزءٍ النقوي مرتبطة بخيمرة الخلية الحمراء بالدم المحيط بمقدار 7100-80 (35). هذا الانحراف في كتلة الخلية الحمراء بعد التطعيم غالبا ما تكون ناتجة عن النجاة المحسنة للخلايا الحمراء الطبيعية مقارنة بالخلايا المنجلية. وقد تم الحصول على هذا المستوى الملحوظ من الخلايا النقوية طويلة العمر قابلا للحصول عليه في تجارب بشرية باستخدام ناقل فيروسي بطيء (36-
5 38) شاملا ©8]-ثلاسيميا (39). غالبا ما يتم استخدام ShRNAS تعمل بواسطة Pol Il بشكل أكثر legs في أنظمة الناقل للتأثير على الاستبعاد الجيني بواسطة (RNA ولكن هذه النواقل تتوسط في التعبير المطلق الذي يمكن أن يرتبط بكل من السمية غير الانتقائية من مستويات التعبير العالية والسميات غير الانتقائية للمتوالية في أنواع معينة من الخلية. وهنا يبين المخترعون أن استبعاد 801117 في 0 خلايا جذعية مكونة للدم يقوم بإضعاف تطعيم هذه LIAN في أوضاع الزراعة وتطور الخلية 8 في الكائن الحي. على الرغم من أنه لم يتم التبليغ عن ظاخرة التقليل في التطعيم في غياب (BCL11A هذه البيانات المشار إليها هنا تتوافق مع التعبير المعروف عن 8011178 في خلايا جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية سابقة الذكر ومع تقرير (gine خلية جذعية مكونة للدم المخفض بمقدار 2 طية في فئران عند الحذف الجيني ل 8611178 )31 40« 41). يمكن أن 5 يكون هذا الأثر السلبي لاستبعاد 861-117 على تطعيم خلايا جذعية مكونة للدم أكثر وضوحا في الفحوص المشار إليها هنا بسبب الضغط الانتقائي الزائد الموجود في هذه الأوضاع الاختبارية.
تقدم الأرقام المحددة ل خلايا جذعية مكونة للدم بشكل عام بعد إجراء مزرعة خارج الكائن الحي وتحويل هذه الخلايا والتنافس مع WA جذعية مكونة للدم مقارنة مستخدمة في الفحوص المستخدمة التي يمكن أن تحسن الكشف عن السمية عند مستوى خلية جذعية مكونة للدم. في السلالة الحمراء يمكن التخلص من BCLIIA (24). في البيانات المشار إليها (La قام استخدام اناقل الانتقائي ADL الحمراء منطقة تحكم موضعي؛ تحتوي على متواليات منظمة مشتقة من موقع م]-جلويين (32؛ 42) بالتغلب على الآثار السلبية لاستبعاد 8611178 على تطعيم خلية جذعية مكونة للدم. أبدى ناقل منطقة تحكم موضعي وجود درجة عالية من تأمين السلالة في التعبير عن 801117 التي تستهدف .ShRNAMIR علاوة على ذلك؛ وقد تم توضيح هذه البنية لتقليل خطر التنشيط الانتقالي للجينات الخلوية المجاورة عند الاستخدام للتعبير عن جينات متحولة 0 أخرى )43( هناك ميزة مهمة للترجمة_السريرية. بالتالي؛ يبدو الاستهداف النسخي ل ShRNAMIRs مهما في dlls ل /80111؛ بما يؤكد على أهمية تطوير نواقل استبعاد قائمة على أساس pol ١١ فعالة. وهذا المنهج يتخطى الأثر السلبي لاستبعاد 861117 على خلايا جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية وأيضا تطور الخلية الليمفاوية (30؛ 31)؛ وبتجنب السمية المتعلقة بالتعبير المفرط عن ShRNA (9؛ 11؛ 19) ويحسن حالة الأمان للنظام الناقل؛ بينما يتم
5 الحفاظ على الفعالية العلاجية. يتطلب استخدام معززات اا pol للتعبير عن shRNA دمج SARNA في متواليات microRNA حيث أغلب متواليات ShRNA الفعالة المتحقق منها سلفا مشتقة من نواتج التحليل التي تم تنفيذها باستخدام معززات !اا pol وأغلب أنظمة الاستبعاد المتاحة بناء على معززات pol lll يكون تحويل متواليات ShRNA في تهيئة اا ا0م مهما. على الرغم من البحث الملحوظ في 0 هذه المنطقة؛ هناك نقص في الإرشادات الخاصة بتحويل متواليات ShRNA المشتقة من نواقل فعالة قائمة على أساس pol ١١١ إلى نواقل ShRNAMIR قائمة على أساس ١١ ا0م. هنا وبمقارنة نتائج RNA التي تقوم بالمعالجة من WAY المحولة بكلا نوعي النواقل بالتوازي مع تأكيد المخترعين على أن منتجات RNA صغير المختلفة يتم توليدها نسبة إلى متواليات المستهدفة المتوافقة الناتجة عن فعالية مخفضة ملحوظة للإستبعاد المستهدف عبر نواقل قائمة على أساس daly) pol II 5 المتواليات الموجهة ذات الجديلة الناضجة التي يتم إنتاجها من أنظمة POI ١١ مقابل pol ١|١ تحتوي على متواليات متطابقة مع MRNA مستهدف بشكل عام بواسطة 5-3 nt
نسبة إلى بعضها البعض. تؤدي إضافة 5-3 من الوحدات البنائية لا من إشارة إنهاء ١١١ ا0م إلى الطرف 3” لمستنسخ ShRNA إلى إزاحة مناظرة لموقع شق Dicer بما يثبت الدور الأساسي لدور عد عند الطرف 3-”لشق Dicer (44؛ 45). تتمتع إزاحة الجديلة الموجهة في III ا00 في مقابل pol ١! أثر كبير على فعالية lia) حيث يتم تعديل منطقة البذرة والخواص الحرارية الديناميكية وهوية النيكلوتيد الطرفية لتغييرات RNA صغير مزدوجة؛ July تؤثر على دمج جديلة موجهة في معقد معقد انتقائية التداخل RNA -مؤثر (4؛ 5؛ 46؛ 47). أدت عملية sale) تصميم 000145ل50]40 إلى محاكاة المتواليات الموجهة ذات الجديلة الناضجة التي يتم إنتاجها بواسطة ShRNAS تعمل بواسطة pol HI إلى تحسين في معالجة واستبعاد MRNA المستهدفة. وهذا المنهج يجب أن يكون قادرا على تطوير نواقل تستهدف جينات أخرى باستخدام معزنات pol dl 0 شاملة عبوات التعبير الأخرى الانتقائية للسلالة. باختصارء تبين البيانات وجود خواص مهمة لمعالجة RNA نسبة إلى استخدام ShRNA في سياقات ناقل مختلفة؛ وأيضا توفر استراتيجية لاستبعاد جيني انتقائي للسلالة والذي يتغلب على التوابع العكسية للتعبير المنتشر. تتضمن النتائج وجود Jl مهم ل ShRNAS مدمج ب microRNA وتطبيقها في مناهج علاج جيني قائمة على أساس RNAI 15 مثال 11 دراسات فعالية لتحويل BCL11A shRNAMIR في خلايا dale +0034 بشرية صحيحة. (ha 801118 القامعة للنسخ هدف علاجي لأمراض 8م-الهيموجلوبين. أدى القمع sly) ل 801117 في خلايا حمراء عبر Lge SARNAS بواسطة MicroRNA بواسطة pol (ShRNAMIRS) ١١ إلى استبعاد 8011178 فعال في كل من خلايا فأرية وخلايا بشرية. قام 0 التعبير عن 5080080145 معدل بطريقة انتقائية للخلايا الحمراء بالتغلب على الآثار العكسية على تطعيم خلية جذعية مكونة للدم فأري وتطوير خلية 8 (انظر المثال 10 أعلاه) وأدت إلى استبعاد 801117 فعالة ومستويات عالية من HOF في خلايا حمراء مشتقة أساسية من CD34 بشرية Ag خلايا حمراء بشرية متمايزة في المعمل بعد WIA +0034 معدل بالتطعيم الكامل في طعمات فأرية. وقد أبدى المخترعون أيضا حث HPF فعال في خلايا shes مشتقة من خلايا 5 0034 محولة تم الحصول عليها من مانح مع مرض الخلية المنجلية.
في سلسلة من التجارب؛ تم تحويل 0034 منقول ب 605 من مانحين أصحاء مع ناقل التعبير عن ShRNA غير مستهدف (LCR-NT) أو BMS11-D12G5 وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. :shRNA BCL11A D12G5-2 حسي ACGCTCGCACAGAACACTCATGGAT TctccatgtggtagagAATCCATGAGTG 5 TGTGCGAG TTC (متوالية بهوية )43:43( مضادة للحس CGCACTCGCACAGAACACTCATGGAT TctctaccacatggagAATCCATGAGT CTGTGCGA GTT (متوالية بهوية )44:03( gle 127 Jal 10 عن مخطط وسترن shes WIAD متمايزة في المعمل مشتقة من خلايا 4 محولة تبين 861117 الأشكال الأيزومرية (XL gL) و8]-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 861117 XL الشكل 27ب يبين قياس استبعاد 8061117 في خلايا حمراء. البيانات مشتقة من مخططات وسترن كما هو مبين في الشكل 27أ. تلخص البيانات ثلاثة تجارب مستقلة استخدام WA من mile واحد. (أعمدة خطأ: (SD 15 الشكل 27ج يبين حث جاما جلوبين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة RT-PCR وهيموجلوبين (HOF) مقيم بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . مثال 12 قياس استبعاد 801117 في خلايا حمراء . تمت دراسة تطعيم خلايا +CD34 محولة في NSG gl معيبة (Lelie شاملة فعالية 0 الاستبعاد في الكائن all للتعبير عن /86111. تم تحويل CD34 بشري مع LOR-NT أو BMS11-D8GS5 وتم الحقن في فتئران NSG مستقبلة تم تعريضها للإشعاع دون قتل. تم عزل نخاع العظم +6034 بعد 14 أسبوع وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. الشكل 28 يبين حث جاما جلويين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة RT-qPCR مثال 13 استبعاد 8011178 وحث هيموجلوبين جنيني في خلايا حمراء مشتقة من خلايا CD34 محولة من خلية المنجلية لمريض.
تم عزل نخاع العظم 01034 معزولة من مريض ب مرض الخلية المنجلية تلقى علاج HU وكانت له قيمة أساسية عالية (HBF J تم تحويل الخلايا مع LOCR-NT أو LCR-D12G5 وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل.
تمت دراسة استبعاد 8011178 في خلايا (ange من الخلية المنجلية. تم Jie نخاع
العظم 6034 معزولة من الخلية المنجلية لمريض وتم تحويل الخلايا مع LCR-NT أو -05ا WAY) 01265-2 غير المحولة المستخدمة كعينة مقارنة إضافية) وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. يبين الشكل 129 مخططات وسترن تبين 1 8611178 (صور ا وال أيزومرية) وم]-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 11-/81011. كل صورة (مرقمة ب 6-1 تحت الخط) تمثل تجرية مستقلة باستخدام WIA من mile واحد. الشكل 29ب يبين
0 قياس استبعاد 801117 في خلايا حمراء. تبين البيانات المشتقة من مخططات وسترن المبينة في Jal) 29أ. يبين الشكل 29ج حث HF ناتج بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . كان هذا المريض يتلقى علاج هيدروكسي محتسب لمستوى عالي من Hb ٠ مثال 14 نموذج على بروتوكول العلاج
5 التقييم الأولي
سوف يخضع المرضى لعمل معياري deh) نخاع العظم ذاتي المنشاً انتقاليا وفقا لإرشادات معروفة؛ ويعد ذلك سوف يخضعون لاثنين من عمليات جمع نخاع العظم عند مدة لا تقل عن 4 أسابيع ally يمكن استخدامها لنخاع العظم (لا يقل عن 2 x 106 خلايا +0034/كجم) ولمجموعة من نخاع العظم ذاتي المنشاً للنقل الجيني (هدف بمقدار 5 x 106
خلايا 01034+/كجم مع ما لا يقل عن 4 (p2S/CD34+ WIA 106 Xx جمع طعم دعم ذاتية المنشأ
سوف يتم جمع الخلايا المكونة للدم من المريض سلفا قبل العلاج؛ لتكون بمثابة إجراء أخير طعمة (Tae يجب ألا تكون هناك عملية استخلاص لمكونات الدم لمدة 6 أسابيع بعد حقن خلايا تم تعديلها جينياء أو في حالة فشل WAY المعدلة في تلبية معايير الإطلاق. سوف يتم
جمع نخاع العظم (ما يصل إلى 20 سم مكعب/كجم) من المريض تحت تخدر عام من القمم الخلفية الحرقفية على كلا الجانبية بواسطة العديد من الثقوب عند مالا يقل عن 4 أسابيع قبل
العلاج الجيني. سوف يتم تجميد gla من نخاع العظم الذي يحتوي على 2 x 106 من خلايا +00034/كجم ويتم تخزينها غير معدلة في أبخرة نيتروجين سائلة liquid nitrogen vapors )2°162 2180-5( وفقا لإجراءات سريرية معيارية لجمع نخاع العظم ذاتي المنشاً autologous 6 لتكوين طعمة الدعم. سوف يتم اختيار بقية خلايا +0034 (الموضحة أدناه) والمستخدمة للجين المعدل (الموضح أدناه). جمع نخاع العظم سوف يتم استخدام بقية نخاع العظم المجمع أولا بشكل فائض عن الحاجة لدعم النخاع مع مجموعة نخاع العظم الثانية لنقل الجين. سوف تتم عملية الجمع الثانية في مدة لا تقل عن 4 أسابيع بعد عملية الجمع الأولى (الموضحة أعلاه). بالنسبة للمجموعة (All سوف يتم جمع نخاع 0 العظم من المريض تحت تخدير كامل من القمم الخلقية الحرقفية على كلا الموقعين بواسطة العديد من الثقوب. سوف تصل كمية النخاع المجمعة إلى 20 مل/كجم من وزن الجسم. وهذا سوف يعطي عدد WA منواة أكبر من -4 X 108 خلايا/كجم. وهذا بدوره يجب أن يعطي جرعة خلية 4+ أكبر من 4 X 106 خلايا/كجم بعد اختيار خلية +CD34 لن يتلقى الخاضعين الذين تم منهم جمع عدد +0034 المقدر > 4 X 106 خلايا/كجم 5 أي علاج. بعد مدة لا تقل عن 6 أسابيع؛ إذا كان الخاضع يود في البقاء في الدراسة؛ يمكن أن يتم جمع نخاع منه مرة أخرى. إذا كان الخاضع لا يرغب في الجمع مرة أخرى؛ سوف يتم سحبه من الدراسة. سوف يستمر الخاضعين المنسحبين من الدراسة قبل إعطاء خلايا +CD34 محولة في الحصول على رعاية طبية طبيعية (رعاية دعمية و/أو خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا خيفية). لن 0 “يتم تنفيذ تقييمات الفعالية والأمان من حيث الانسحاب ولن يتم جمع بيانات لهم في قاعدة البيانات. عزل خلية +CD34 وإثارتها أوليا وتحويلها dan خلية 61034+. للسماح بوقت مناسبة من أجل تصفية عوامل التهيئة وتقليل وقت التحفيز الأولي والزراعة؛ سوف يتم حمل نخاع العظم طوال الليل. سوف يتم تنفيذ كل خطوات التصنيع في & Connell Families Cell Manipulation Core Facility 5 لاااع4ا7© عند ١ -ا0ا. سوف يكون نخاع العظم خاليا من الخلايا الحمراء بواسطة الطرد المركزي تدريجي الشدة. سوف يتم اختيار
خلايا +0034 بشكل إيجابي من WIA نخاع العظم أحادية النواة bone marrow mononuclear cells باستخدام العامل الكاشف وأداة .CliNIMACS تم أخذ عينات ضوابط الجودة (QC) Quality control لتقييم النقاء والتعقيم. سوف تتم معالجة الخلايا المنقاة فورا من أجل التحفيز الأولي والتحويل. الحث الأولي والتحويل 1 CD34+
سوف يتم تنفيذ التحويل على واحد من أو كلا المجموعتين. سوف يتم تحويل الخلايا في فائض دعم النخاع المستهدف من المجموعة الأولى وبتم تجميده للاستخدام المستقبلي. سوف يتم استخدام المجموعة الثانية لنقل جين كليا وسوف يتم دمج المنتج المحول من المجموعة الثانية مع الخلايا الذائبة المحولة من المجموعة الأولى بعد التهيئة.
يتم بذر خلايا +0034 المنقاة في أكياس مزرعة مغلقة بكثافة 1-0.5 x 106/مل في وسط خالي من المصل مكمل بعوامل نمو (TPO (FLT3L (SCF (IL-3) وتم وضعها على حاضن عند 2°37( 75 002. بعد 30-24 ساعة؛ يتم جمع الخلايا وعدها. تتضمن اختبارات ضوابط الجودة الإضافية فحص خلية حيوية؛ ووحدة تكوين مستعمرة Colony Forming Unit (CFU) يتم نقل الخلايا إلى كيس مزرعة جديد وتتم تهيئتها بالمادة الطافية الفيروسية البطيئة
Wlentiviral supernatant 5 بالنسبة لهذه الدورة الأولى من التحويل؛ تتم حضانة الخلايا لمدة 24-8 ساعات. بعد ذلك يتم جمع الخلايا وعدها ونقلها إلى كيس cds مع المادة الطافية الفيروسية البطيئة لدورة ثانية من التحويل. الجمع النهائي والصياغة
بعد الدورة الثانية من التحويل»؛ يتم جمع (WA يتم الغسل في بلازما لأايت plasmalyte
0 وتتم إعادة التعليق في الصيغة النهائية (HSAZ1 (PLASMALYTE) بحجم 100-50 مل. سوف يتم دمج كل الخلايا المتاحة بعد إزالة عينات ضوابط الجودة في المريض. يتضمن عدد QC (dS حيوية؛ التعقيم على مادة Jue طافية «wash supernatant ميكويلازما «Mycoplasma إندوتوكسين Endotoxin على المادة الطافية والنمط الجيني؛ وحدة تكوين مستعمرة ¢ RCL (عينات مأخوذة ومحفوظة)؛ تحليل الإدخال وعدد نسخ ناقل متوسطة بواسطة
DAY) 9008 5 المزروعة). يتم أخذ عينة لبقعة Gram من المنتج فورا قبل التوصيل إلى المريض.
اختبار ما قبل sale) التسريب إلى الخاضع يتم جمع العينات أثناء dey نهاية الإجراء لعدد وحيوية الخلايا (استبعاد زرقة التريبان trypan أو ما يعادلها)؛ التعقيم» الميوكويلازما؛ فعالية التحويل (عدد نسخ الناقل vector copy «(number بقعة «Gram إندوتوكسين واختبار (ROL من بين ما سبق سوف تكون قياسات حيوية الخلية؛ التعقيم (في lee 72 ساعات)؛ بقعة Gram وإندوتوكسين متاحة قبل التسريب. إذا كانت المزارع الميكروبيولوجية تكشف عن التلوث البكتيري الانتقالي» بواسطة بقعة 0 أو مزرعة إيجابية عند 72 ساعة؛ سوف يقوم طاقم عمل Cell Manipulation Core Facility بملامسة Pl يقرر المدير الطبي المساعد والطبيب المقيم ما إذا كان سيتم تسريب مجموعة الدعم أو تسريب المنتج مع تغطية بالمضاد الحيوي. إذا تم تسريب مجموعة cae all سوف يتم سحب الخاضع من البروتوكول. إذا كانت حيوية الخلية <770؛ يكون اختبار التعقيم إيجابي؛ أو إندوتوكسين > 5 لا/كجم/ساعة؛ لن تتم إعادة (WAN سوف يتم تسريب مجموعة الدعم وسوف يتم تسريب الخاضع من البروتوكول. إذا كان عدد WAN الحية من كلا المجموعتين/عمليات التحويل أكبر من أو يساوي 4 X 6 خلايا +0034/كجم عند طرف التحويل؛ سوف يتم تسريب الخلايا. إذا كانت الخلية الحية 5 من كلا المجموعتين /عمليتي التحويل أقل من 4 Wa 106 x +0034/كجم عند طرف التحويل» لن يتم تسريب الخلايا وسوف يتم تسريب مجموعة الدعم بعد 48 ساعة. نظام تهيئة الخاضع سوف يتلقى الخاضعون تهيئة نقوية الجذ مع بوسولفان Busulfan )~4 ملجم/كجم وربديا يومياء المعدلة للوزن؛ (المحددة على مدار 3 ساعات مرة يوميا) الذي يتم إعطاؤه في الأيام -4 0 إلى -2؛ قبل تسريب WAN المحولة. سوف تتم التهيئة المتزامنة مع التنقية وتحويل خلايا نخاع العظم. سوف يتم سحب مستويات بوسولفان على كل عمليات الإعطاء في الأيام ADA وسوف يتم استخدام المستويات في الأيام 1 و2 لتعديل المنطقة تحت المنحنى المستهدف. تسريب الخلايا المحولة سوف يتم تسريب الخلايا وريديا على مدار 45-30 دقيقة بعد التميه الأولي المعياري 5 ونعادة المعالجة Gy للإرشادات المعيارية لوحدة زراعة الخلية الجذعية المكونة للدم انتقاليا بمستشفى بوسطن. تتطلب هذه المعايير أن يكون المريض تحت ماقبة قلبية مستمرة وتنفسية
وتشبع بأوكسيجين خلال التسريب ولمدة 30 دقيقة بعد ذلك. سوف يتم قياس الإشارات الحيوية ping تسجيلها أولياء بعد 15 دقيقة من التسريب؛ كل ساعة من التسريب تسريب؛ ونهاية التسريب. سوف تظل ار ان لل مع المريض لمدة أول 5 دقائق من التسريب. إذا كان هناك اثنين من المنتجات التي تم إعطاؤها؛ سوف يتم إعطاء المنتج الثاني المحول بدون تأجيل الأول.
سوف يتم فهم أنه إذا تم شرح الاختراع Lad يتعلق بالوصف المفصل Del من المقصود أن يقوم الوصف السابق بشرح وعدم تقييد منظور الاختراع؛ والتي يتم تحديدها بواسطة منظور عناصر الحماية الملحقة. هناك جوانب أخرى ومزايا وتعديلات متضمنة في منظور عناصر الحماية التالية.
0 المراجع Lee, Y. et al., The nuclear RNase lll Drosha initiates microRNA 1. processing.
Nature 425, 415-419 (2003). Ha, M. and Kim, V.
N., Regulation of microRNA biogenesis.
Nature 2. reviews.
Molecular cell biology 15, 509-524 (2014). Winter, J. et al., Many roads to maturity: microRNA biogenesis 3. 15 pathways and their regulation.
Nature cell biology 11, 228-234 (2009). Khvorova, A. et al., Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand 4. bias.
Cell 115, 209-216 (2003). Schwarz, D.
S. et al., Asymmetry in the assembly of the RNAI 5. enzyme complex.
Cell 115, 199-208 (2003). 0 Lai, E.
C., Micro RNAs are complementary to 3' UTR sequence 6. motifs that mediate negative post-transcriptional regulation.
Nature genetics 30, 363-364 (2002). Lewis, B.
P. et al., Prediction of mammalian microRNA targets.
Cell 7. 5 .)2003( 787-798 ,115
Park, J. E. et al., Dicer recognizes the 5' end of RNA for efficient 8. and accurate processing. Nature 475, 201-205 (2011).
Grimm, D. et al., Fatality in mice due to oversaturation of cellular 9. microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441, 537-541 (2006).
McBride, J. .ا et al., Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated 10. 5 toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAI.
Proc Natl Acad Sci U S A 105, 5868-5873 (2008).
Khan, A. A. et al., Transfection of small RNAs globally perturbs 11. gene regulation by endogenous microRNAs. Nat Biotechnol 27, 549-555 (2009). 0
Yi, R. et al., Overexpression of exportin 5 enhances RNA 12. interference mediated by short hairpin RNAs and microRNAs. RNA 11, 220-226 (2005).
Borner, K. et al., Robust RNAi enhancement via human Argonaute- 13. 2 overexpression from plasmids, viral vectors and cell lines. Nucleic Acids 15
Res 41, e199 (2013).
Grimm, D. et al., Argonaute proteins are key determinants of RNAI 14. efficacy, toxicity, and persistence in the adult mouse liver. The Journal of clinical investigation 120, 3106-3119 (2010).
Diederichs, S. and Haber, D. A., Dual role for argonautes in 15. 20 microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell 131, 1097-1108 (2007).
Persengiev, 5. P. et al., Nonspecific, concentration—-dependent 16. stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA 10, 12-18 (2004). 25
Fish, R. J. and Kruithof, E. K., Short-term cytotoxic effects and 17. long-term instability of RNAI delivered using lentiviral vectors. BMC Mol
Biol 5, 9 (2004).
Jackson, A. .ا and Linsley, P. S., Recognizing and avoiding siRNA 18. off-target effects for target identification and therapeutic application. Nat 5
Rev Drug Discov 9, 57-67 (2010).
Martin, J. N. et al., Lethal toxicity caused by expression of shRNA 19. in the mouse striatum: implications for therapeutic design. Gene Ther 18, 666-673 (2011).
Zeng, Y. et al., Both natural and designed micro RNAs can inhibit 20. 10 the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells.
Molecular cell 9, 1327-1333 (2002).
Fellmann, C. et al., An optimized microRNA backbone for effective 21. single-copy RNAi. Cell Rep 5, 1704-1713 (2013).
Amendola, M. et al., Regulated and multiple miRNA and siRNA 22. 15 delivery into primary cells by a lentiviral platform. Mol Ther 17, 1039- 1052 (2009).
Sankaran, V. G. et al., Human fetal hemoglobin expression is 23. regulated by the developmental stage-specific repressor 8011
Science (New York, N.Y 322, 1839-1842 (2008). 0
Xu, J. et al., Correction of sickle cell disease in adult mice by 24. interference with fetal hemoglobin silencing. Science 334, 993-996 (2011).
Cullen, B. R., Derivation and function of small interfering RNAs and 25. microRNAs. Virus Res 102, 3-9 (2004). 25
Moffat, J. et al., A lentiviral RNAI library for human and mouse 26. genes applied to an arrayed viral high—content screen. Cell 124, 1283- 1298 (2006).
Xu, J. et al., Transcriptional silencing of {gamma}-globin by 27.
BCL11A involves long-range interactions and cooperation with SOX6. 5
Genes Dev 24, 783-798 (2010).
Weber, K. et al., Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped 28. with novel drug-selectable fluorescent proteins: new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther 17, 511-520 (2010).
Wilber, A. et al., Therapeutic levels of fetal hemoglobin in erythroid 29. 10 progeny of beta-thalassemic CD34+ cells after lentiviral vector-mediated gene transfer. Blood 117, 2817-2826 (2011).
Liu, P. et .اه BCL11A is essential for normal lymphoid 30. development. Nat Immunol 4, 525-532 (2003).
Yu, Y. et al., BCL11A is essential for lymphoid development and 31. 15 negatively regulates p53. J Exp Med 209, 2467-2483 (2012).
Miccio, A. et al., In vivo selection of genetically modified 32. erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta- thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 105, 10547-10552 (2008). 0
Demaison, C. et al., High-level transduction and gene expression 33. in hematopoietic repopulating cells using a human immunodeficiency [correction of imunodeficiency] virus type 1-based lentiviral vector containing an internal spleen focus forming virus promoter. Hum Gene
Ther 13, 803-813 (2002). 5
Hansbury, E. N. et al., Bone marrow transplant options and 34. preferences in a sickle cell anemia cohort on chronic transfusions. Pediatr
Blood Cancer 58, 611-615 (2012).
Andreani, M. et al., Quantitatively different red cell nucleated cell 35. chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed 5 chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica 96, 128-133 (2011).
Cartier, N. et al., Hematopoietic stem cell gene therapy with a 36. lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science (New York,
N.Y 326, 818-823 (2009). 10
Biffi, A. et al., Lentiviral Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy 37.
Benefits Metachromatic Leukodystrophy. Science (New York, N.Y, (2013).
Aiuti, A. et al., Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in 38. patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science 341, 1233151 (2013). 5
Cavazzana-Calvo, M. et al., Transfusion independence and 39.
HMGA?2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia.
Nature 467, 318-322 (2010).
Wu, X. et al., BCL11A controls FIt3 expression in early 40. hematopoietic progenitors and is required for pDC development in vivo. 20
PLoS One 8, e64800 (2013).
Ippolito, 6. C. et al., Dendritic cell fate is determined by BCL11A. 41.
Proc Natl Acad Sci ل 5 A 111, E998-1006 (2014).
Roselli, E. A. et al., Correction of beta-thalassemia major by gene 42. transfer in haematopoietic progenitors of pediatric patients. EMBO Mol 25
Med 2, 315-328 (2010).
Zychlinski, D. et al., Physiological promoters reduce the genotoxic 43. risk of integrating gene vectors. Mol Ther 16, 718-725 (2008).
Zhang, H. et al., Single processing center models for human Dicer 44. and bacterial RNase III. Cell 118, 57-68 (2004).
Vermeulen, A. et al., The contributions of dsRNA structure to Dicer 45. 5 specificity and efficiency. RNA 11, 674-682 (2005).
Chiang, H. R. et al., Mammalian microRNAs: experimental 46. evaluation of novel and previously annotated genes. Genes Dev 24, 992- 1009 (2010).
Frank, F. et al., Structural basis for 5'-nucleotide base-specific 47. 10 recognition of guide RNA by human AGO2. Nature 465, 818-822 (2010).
Giarratana, M. C. et al., Proof of principle for transfusion of in vitro— 48. generated red blood cells. Blood 118, 5071-5079 (2011).
Grimson, A. et al., Early origins and evolution of microRNAs and 49.
Piwi-interacting RNAs in animals. Nature 455, 1193-1197 (2008). 5 التخليقية MIR قائمة أوليجونيكلوتيدات :BCL11A 00141 أوليجوهات حصي ACGCTCGCACAGAACACTCATGGAT TcteccatgtggtagagAATCCATGAGTG 0 (متوالية برقم هوية:1) TTCTGTGCGag مضادة للحس
CGCACtCGCACAGAACACTCATGGATT TctctaccacatggagAATCCATGAGTG (متوالية برقم هوية:2) 1101616068 5 :BCL11A 00142 أوليجوهات
حسي ACGCTCCAGAGGATGACGATTGTTTActccatgtggtagagTAAACAATCGTC ATCCTCTGGag (متوالية برقم هوية:3) مضادة للحس CGCACtCCAGAGGATGACGATTGTTTActctaccacatggagTAAACAATCGTC ATCCTCTGGa (متوالية برقم هوية:4) 3 801118 أوليجوة: 0 حسي ACGCTTCGGAGACTCCAGACAATCGCctccatgtggtagagGCGATTGTCTG GAGTCTCCGAag (متوالية برقم هوية:3) مضادة للحس CGCACtTCGGAGACTCCAGACAATCGCctctaccacatggagGCGATTGTCTG 5 GAGTCTCCGAa (متوالية برقم هوية:6) BCL11A 8 أوليجوة: حسي ACGCTTTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagagTCTGTGCGTGTT GCAAGAGAAag 20 (متوالية برقم هوية:7) مضادة للحس CGCACtTTCTCTTGCAACACGCACAGActctaccacatggagTCTGTGCGTGTT GCAAGAGAAa (متوالية برقم هوية:8) 5 ووليجوهات BCL11A XLC4 أر :C4 حسي
ACGCTACAGTACCCTGGAGAAACACActccatgtggtagagTGTGTTTCTCCA GGGTACTGTag (متوالية برقم هوية:9) مضادة للحس CGCACtACAGTACCCTGGAGAAACACActctaccacatggagTGTGTTTCTCCA 5 838 (متوالية برقم هوية:10) أوليجوهات غير مستهدفة: حصي ACGCTCAACAAGATGAAGAGCACCAActccatgtggtagagTTGGTGCTCTTC 0 810116119 (متوالية برقم هوية:11) مضادة للحس CGCACctCAACAAGATGAAGAGCACCAActctaccacatggagTTGGTGCTCTTC ATCTTGTTGa 5 (متوالية برقم هوية:12) 365 801118 أو أوليجوهات :E3 mod (نسخة معدلة) حسي ACGCTGCGCTCGGAGACTCCAGACAActccatgtggtagagTTGTCTGGAGT CTCCGAGCGCag (متوالية برقم 13:49( مضاد للحس CGCActGCGCTCGGAGACTCCAGACAActctaccacatggagTTGTCTGGAGT CTCCGAGCGC #(متوالية برقم هوية:14) أوليجوهات 0865 BCL11A أو :D8 mod (نسخة معدلة) حصي ACGCTGCGCTTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAA 5 9 (متوالية برقم هوية:15)
مضاد للحس CGCACctGCGCTTCTCTTGCAACACGCActctaccacatggagTGCGTGTTGCA AGAGAAGCGC #(متوالية برقم هوية:16) أوليجوهات 241-0465 :BCL11A (نسخة معدلة) حسي
ACGCTGCGCACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGT برقم هوية:17) Ll) ACTGTGCGCag مضاد للحس
CGCACctGCGCACAGTACCCTGGAGAAActctaccacatggagTTTCTCCAGGG 0 (متوالية برقم هوية:18) TACTGTGCGCa miR1
CGCACAGAACACTCATGGATT TctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTG (متوالية برقم هوية:25) TGCG (E3 أو shRNAL)
TCGGAGACTCCAGACAATCGCctccatgtggtagagGCGATTGTCTGGAGTCT (متوالية برقم هوية:26) CCGA shRNA2) 0 أو 85 ( CCTCCAGGCAGCTCAAAGATCctccatgtggtagagGATCTTTGAGCTGCCTG 0 (متوالية برقم هوية:27) shRNA3) أو (D8 TTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagagTCTGTGCGTGTTGCAAG 5 AGAA (متوالية برقم هوية:25)
shRNA4) أو (B11 TCAGGACTAGGTGCAGAATGTctccatgtggtagagACATTCTGCACCTAGTC 68 01 (متوالية برقم هوية:29) shRNA3) 5 أو 50D12 أو (D12 GATCGAGTGTTGAATAATGATctccatgtggtagagATCATTATTCAACACTCG ATC (متوالية برقم هوية:30) 6shRNA) أو S50A5 أو (AS CAGTACCCTGGAGAAACACATctccatgtggtagagATGTGTTTCTCCAGGGT ACTG 0 (متوالية برقم هوية:31) shRNAT) أو (50B11 CACTGTCCACAGGAGAAGCCActccatgtggtagagTGGCTTCTCCTGTGGAC AGTG (متوالية برقم هوية:32) shRNAGS) أو (50C4 ACAGTACCCTGGAGAAACACACctccatgtggtagagTGTGTTTCTCCAGGGTA 5 CTGT (متوالية برقم هوية:33) 0141 gcgcCGCACAGAACACTCATGctccatgtggtagagCATGAGTGTTCTGTGCGg 6 (متوالية برقم هوية:34)
shRNA1mod) أو (E3G5 gcgc TCGGAGACTCCAGACAActccatgtggtagagTTGTCTGGAGTCTCCGAg 6 (متوالية برقم هوية:35)
shRNA2mod) أو (B5G5 gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAActccatgtggtagagTTTGAGCTGCCTGGAGGY 6 (متوالية برقم هوية:36) shRNA3mod) 5 أو (D8G5 gcgc TTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAAGAGAAge 6 (متوالية برقم هوية:37) shRNA4mod) أو (B11G5 gcgcTCAGGACTAGGTGCAGActccatgtggtagagTCTGCACCTAGTCCTGAg 0 6 (متوالية برقم هوية:38) shRNAS5mod) أو 005 أو (D12G5 gcgcGATCGAGTGTTGAATAActccatgtggtagagTTATTCAACACTCGATCge 15 96 (متوالية برقم هوية:39) shRNAGmod) أو (50A5G5 gcgcCAGTACCCTGGAGAAACC tccatgtggtagagGTTTCTCCAGGGTACTGg 6 (متوالية برقم هوية:40)
shRNA7mod) أو (50B11G5 gcgcCACTGTCCACAGGAGAActccatgtggtagagTTCTCCTGTGGACAGT Gg 6 (متوالية برقم هوية:41)
(C4G5 أو 006465 أو shRNA8mod) gcgcACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGTACTGTge (متوالية برقم هوية:42) 6 حسي :(ShRNA BCL11A D12G5-2)
ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT TctccatgtggtagagAATCCATGAGTG 5 (43:58) (متوالية بهوية TTCTGTGCGAG مضادة للحس :(ShRNA BCL11A D12G5-2)
CGCACTCGCACAGAACACTCATGGATT TctctaccacatggagAATCCATGAGT (44:53) (متوالية بهوية GTTCTGTGCGA -5 10
CCGGCGCACAGAACACTCATGGATTCTCGAGAATCCATGAGTGTTCTG
(80:8) (متوالية بهوية 3-16061111 "CGCTCGCACAGAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGT (87:08) '(متوالية بهوية 3-8616 10161606 5 5 "CGCTGCGCCGCACAGAACACTCATGctccatgtggtagagCATGAGTGTTCT بهوية رقم:85) llgia)’3-GTGCGGCGCAGTG -5
CCGGACAGTACCCTGGAGAAACACACTCGAGTGTGTTTCTCCAGGGTA 20 (89:08) (متوالية بهوية 3-01611111 -5
CGCTACAGTACCCTGGAGAAACACACctccatgtggtagagTGTGTTTCTCCAG (90:8) "(متوالية بهوية 3-AGTG GGTACTGT
’CGCTGCGCACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGT (91:48, (متوالية بهوية 3-ACTGTGCGCAGTG 5
CCGGTTCTCTTGCAACACGCACAGACTCGAGTCTGTGCGTGTTGCAAG 5 (92:48) '(متوالية بهوية 3-AGAATTTTT 5 ’CGCTTTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagag TCTGTGCGTGTTG (93:48) '(متوالية بهوية 3-CAAGAGAAAGTG 5 0 ’CGCTGCGCTTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAA (94:48, '(متوالية بهوية 3-GAGAAGCGCAGTG 5
CCGGGATCGAGTGTTGAATAATGATCTCGAGATCATTATTCAACACTCG
(95:48) (متوالية بهوية 3-ATCTTTTT 5 ”-5
CGCTGATCGAGTGTTGAATAATGATctccatgtggtagagATCATTATTCAACA (96:4) بهوية ls)’ 3-8616 CTCGATC 5 ’CGCTGCGCGATCGAGTGTTGAATAActccatgtggtagagTTATTCAACACTC 0 (97:48) '(متوالية بهوية 3-GATCGCGCAGTG
I
قائمة التتابع: ل القواعد الاقل بالخط المائل- حلقة shRNA "ب" ShRNA قواعد الحالة العليا بالخط السميك- متوالية استهداف ALL 3801 لتكوين ب" القواعد الموضوع تحتها خط-نهايات استنساخ(تخليقي) 2 استبعاد تكويني (تقييم سمي ووظيفي) 'و حس او مضاض للحس از" اوليجونيكلوتيدات 1 miR 501118 0 "جح (توالية برقم هوية:1) اط (متوالية برقم هوية:2) يي" (متوالية برقم هوية:3) كك (متوالية برقم هوية:4) ل" اوليجونيكلوتيدات 2 miR 501118
و استبعاد ان استبعاد حثي (تقييم الجرعة والوظيفة) 'س" -- امتبعاد خطي انتقائي (اختيار علاجي) 2 في الكائن الحي : LSK-HSC مزروعة مستنبتة اف" في المعمل : خلايا اللوكيميا الارومية الحمراء لفأز اص" 7 جلولين لفأر 3 نخاع عظم مفصل Venus -8220 2 الحث 20 مرة اش" التعبير عن MRNA نسبة الى Gapdh 0 ات" التعبير عن 801118 نسبة الى Gapdh انث" تقوم LV-SFFV باستبعاد 3801118بفاعلية وتثير التعبير عن 47-جلويولين 4 تقوم LOR/TET-LV باستبعاد 3801118بفاعلية وتثير التعبير عن 47-جلوبولين :TET-LV ik اعتماد على جرعة إثارة دوكسي سيكلين LCR-LV a", : آثار نقل MOI أعلى 5 "1" حث 150 طية 'ب1" خث 5 طيات Ig! التعبير عن جلويين mRNA نسبة الى Gapdh "1a 7 جلولين "1" نقطة زمنية (يوم) و1" اليوم "Ty عدد الخلايا Le التعبير عن جلويين معيار ب Gapdh "LW تتمايز ©0034+115 المنقولة خارج الكائن الحي في الخلايا الأرومية الحمراء وتعبير عن Hbf 25 ي1" تمدد خلايا CD34+BM (موجه-متبرع طبيعي) 'ك 1" 1 SSFV-LV
منقولة إلى SCD من مرضى لديهم CD34+HSCs بنقل LCR-LV قامت "1J
NSG
LCR-LV NT "1
LCR-LV mir-1 "1
HbF س1" 5
SSFV-LV mir-1 "Ig
SFFV-LV NT "1 "لص 1" فحص قدرة السمية لدور 801118 في تطوير ليمفوي
Gapdh التعبير عن 004118801118 نسبة الى "14 مرة MS=5 100 بواسطة فينوس على فنصما١ 01034115 "1 10 ش1" - موجه حلقة lo "ث1" ناقل
RNA Pol ١١ استنساخ "1
RNA Pol lll ذ1" استنساخ 0 5
ShRNAs في مقابل shRNAs مهيا" ب RNA دقيق "1x"
PLKO باستخدام موحه ShRNA تستهدف مراقبة Bell 1A "2
QPCR adhe "2
GAPDH نسبة الى ACtE-Y 2
XL/L-d sie (n=70) د2' 20
Lan )CDSXL=35) "2a"
Laain)3UTRXL=13) "24 مراقبة05م- "27 الى تلك غير المحولة) LuwmCherry MFI) "27
RNA Pol lI ط2" 25
RNA Pol ١١ "24
24" استبعاد A 80111 وحث E-Y في اساسات 1160مو60ا 2J شدة نطاق نسبية م2 غير مستهدف 2" 801118 س2" أكتين ع2 pLKO Lego "2 XL/L 2a XL 23 0 ,2 حث GAPDH/ ai 6-١7 SD 2 + متوسط mIR1 pLKO "2 ا ث2" C4 pLKO miR-1 LEGO "2 ذ2' C4 LEGO mIR-1 pLKO 2a mIR1 "3 C4G5 "3 LEGO "3" 0465 LEGO 38 20 0141-65 "3a قراءات 3 متوالية توجيه Passenger KB) 3g متالية برقم هوية: 5 - طذ' مرشحات من /80111 يستهدف مراقبة ShRNA باستخدام موجه PLKO 'ي3" .| تركيب وتوزيع متوالية جديلة موجهة في PLKO
ك3 جديلة توجيه تركيب وتوزيع متوالية جديلة موجهة في LEGO م3 تصميم ShRNAS جديدة لتقليد الجدائل الموجهة الناضجة التي تم إنتاجها في موجه pLKO ا تركيب وتوزيع متوالية جديلة موجهة في LEGO معدلة أس 3 معدل "3g" مستهدف LM "34 3" مقارنة استبعاد 8061117 بواسطة متواليات توجيه معدلة PLKO 33 0 موجدم- 3" 60 اموجه ا- 3 توجيه ات3" مقارنة التعبير عن MIR بواسطة متوالية توجيه معدلة ث3" NT P-pLKO 315 L-pLEGO 33 LM-pLEGOJae "3 RNA 41 XLD12 "4 XLB11 "4" 20 43" كما XLC4 "4a 44" الصورة الأيزومرية XLJL 'ز 4" الصورة الأيزومرية XL 5 "ح4 الجديلة الموجهة 4%" جدلية ناقلة للارسال s rRNA 5 "4 4" المرجع
MODLEGO "40 و المعالجة المتمايزة في نواقل SARNA ا(١-اا0م ونواقل SNRNA مهيأة بواسطة pol-Il microRNA 5 po AY
Pol lll shRNA "44
Pol ١١ shRNA 2 'ف4" | ACTIN 0 ص4" مرقبة FACS (حث طية (mCherry MFI 3 حسي mir223 "4 5 sachbb-y "4 ( ACt Hbb-y نسبة الى qPCR ) Gapdh مراقبة eh
Pol ١١١ "4 اث 15
Pol ١١ 4
Term "43
SFFV "4
LEGO-SFFV-BCL11A-shRNA 5
LKO-U6-BCL11A-shRNA "5 20 pol ll نسخ قائم على اساس بوليمراز "Sz
Bs U5 shRNA Sa pol ١١ نسخ قائم على اساس بوليمراز "Sy ناقل إرسال "53 25 shRNAmIR ‘Se!
shRNAmiRmod "54"
Pol ١١ M ي5' نسبي ١100-7 "Sal
POI Il معدل بالنسبة لنسخ قائم على اساس بوليمراز "SJ
Pol II Mod لم5 5
HBF "5
HBF (HPLC) "Su النسبة من المجموعة الكلية Sg جلويين (MRNA (qPCR "5
PIIM "Sua 10
PBw4 "58
PBwS '5)
BMw12 "SU غير محول "Sd مزروعة انتقاليا WIA ث5" 15 مائع 5 "5 نمائع نسبة 5 "5
BFP "Soa" cd45,2 "61"
Venus "6 20
CD45 "oz" غير مستهدف Bellla استهداف "6. في نخاع العظم Venus + +CD45 نسبة خلايا 8 من "62" oa Venus + من خلايا /10-81ا في LSK "و6" نسبة التعبير النسبي '6y 25
LSK "oz"
خلايا "6k" خلايا حبيبية 6
SFFV-shRNAmMIR .LCR-shRNAmIR vs "6 sinLTR 'ل6" HS3 لم6" 5 52 أن6' pA س6" cPPT "0g"
RRE "6
LCR-BCL11AshRNAmMIR "60" 10 #«جلويين 63 'ر6' العدد نسبي
GpA "6
LCR-shRNAmMIiRNT "6 *CR-shRNAmMIR '6&’ 15
LCR-shRNAmMIRSY "oF"
LCR-shRNAmMIR3 '6Y —-CD71-/GpA "6a -CD71+/GpA 7 جلويين MRNA ب7" 20 +CD71+/GpA "Tz! نسبة المجموعة الكلية UT
SFFV-GFP ry
LCR-shRNAmMIR "Ts ctrl "Ty 5 untrans ie
Jurkat aN
MCF 74
All "7 اك AS 7ل م7 (لجديلة غير المنطقية) الطرف 5
ShRNA تردد قراءة متوسط لكل 70
CD3 "To
CD11b Te! ssc Td
TER ص7" 0 shes 'ق7” خلايا 'ر7 خلايا نقوية -8/7 خلايا MT
CD 45- مبوب على TS
CD 45- pe مبوب على TE 5 rel. BCL11A/B-ACTIN ve
VCN "Ty
B-ACT "7 )- /جلوبين 7 8
HPLC(HBF) 8 20
D12G5-2 و8" 86و جلوبين "84 محول "8a" duced "8
BCL11A/B-ACTIN. sus 83 25
Se! استبعاد 801117 بواسطة متواليات في كل من الاساسات SFFV و ALCOR WIA حمراء متمايزة بواسطة CD34 LEGO-SFFV-shRNAMIR EIN ي 8" LV-LCR-shRNAmIR cd71 8g 5
Claims (1)
1. حمض نووي رببوزي دقيق (MicroRNA) micro-Ribonucleic acid لجزء 501118 تخليقي يتضمن: 1 جزء BCL11A أول؛ جزء حلقي tloop segment و ب) ga 301118 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5" إلى 53 حيث الجزء الحلقي loop segment موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بجزئي 301118 الأول والثاني؛ و حيث gi 301118 الأول fan مع -©006- عند الطرف 5 وينتهي gia 301118 الثاني مع —GOGC- عند الطرف 3 و حيث جزءِ 301118 الأول مكمل لجز 301118 الثاني بحيث يكون (Sa 301118 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية hairpin loop مع الجزءِ الحلفي loop segment الذي يكون 0 النجزء الحلقي Joop segment للحلقة الدبوسية hairpin loop الذي تم تكوينه بالتبعية.
2. الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجزء BCL11A التخليقي ly لعنصر الحماية 1؛ حيث جزئي 8011178 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات
.nucleotides 15
3. الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجزء 501.118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1 Cua يحتوي جزءِ 301.118 الأول على متوالية مشتقة من متوالية الحمض النووي الريبوزي المرسل (mRNA) Messenger Ribonucleic acid لجن .BCL11A 20 4. الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجزء 501118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1 حيث gia dai 301118 الأول على متوالية نيوكليوتيد nucleotide تم توضيحها أعلاه في أي واحدة من المتواليات بهويات أرقام: 57( 58 59 60 61 ¢62 63؛ 564 65.
5. الحمض النووي الرببوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجز 301118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1 حيث gia dai 301118 الأول على متوالية نيوكليوتيد nucleotide تم توضيحها أعلاه في المتوالية بهوية رقم 61.
6. الحمض النووي الرربوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجز BCL11A التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث أن الجزء الحلفي loop segment مشتق من الحمض النووي الريبوزي الميكروي -micro-Ribonucleic acid
7. الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجن 80118 التخليقي Lai, 0 لعنصر الحماية 1؛ حيث أن الجزء الحلفي loop segment مشتق من الحمض النووي الريبوزي الميكروي micro-Ribonucleic acid المختار من المجموعة المكونة من «miR-155 «miR-142: miR-181 و0116-223.
6. الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجن 80118 التخليقي وفقاً 5 لعنصر الحماية 1؛ حيث أن الجزء الحلفي loop segment مشتق من الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid الذي تم اختياره من 011-223.
9. الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجن 80118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل الجزءِ الحلقي Toop segment على متوالية بولى نيوكليوتيد polynucleotide ~~ 0 تم توضيحها أعلاه في المتوالية بهوية رقم: 68.
0. الحمض النووي الرربوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجن BCL11A التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل الحمض النووي الريبوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid الأول على متوالية بولي نيوكليوتيد polynucleotide تم توضيحها أعلاه في أي واحدة من المتواليات بهويات أرقام: 34 35 36 37 38 39« 40 41 و 42
1. الحمض النووي الرربوزي الدقيق micro-Ribonucleic acid لجن BCL11A التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل الحمض النووي الريبوزي الميكروي micro-Ribonucleic acid
الأول على متوالية بولي نيوكليوتيد polynucleotide تم توضيحها أعلاه في المتوالية بهوية رقم: 39
2. تركيبة تشضتمل على حمض نووي رببوزي دقيق micro-Ribonucleic acid لجزءِ BCL11A تخليقي وفقاً لأي من عناصر الحماية من 3-1 و10-4.
3. تركيبة صيدلانية pharmaceutical composition تشضتمل على حمض نووي رببوزي دقيق yal micro-Ribonucleic acid 501,118 التخليقي وفقاً لأي من عناصر الحماية من 3-1 4 10-4 ومادة حاملة مقبولة صيدلأنياً pharmaceutically acceptable carrier أو مادة مخففة
.diluent 0
CS اع ed ; : El a" A CR RRR REE rE ل ا RA AR ORR ا حي wn AAR AORN Ch A ري RRP NNR امي
. E RS 5 hE : Nop y a . B . we “en A ON I SRNR tS SR CBR ER TORR لاح اح ل د ا ا نت امج اا ل ام TR اجا لايق اا ب 8 5 0 1 1 اع اح wie Sa ww > 8 شل ّ ل 5 3 * i 8 اج الم ناض مم ل isang} i مج م مما ا a لح EE Wo 53 3 i | i 6 اجات RR SNE لد a a] 1 | ممم م ممح 0 موه ع الا ات وس و ا BT SERRE ب ال 3 \ 3 ] 5 PR امسج الج جا اق ل ا ٍ | gross : ا دا I ا أ«_دد د د اد اساي د شكل ؟* N L A
ال ايع 4 4 3 8 بن كر RE Ea Ea pS SI Rody SPR RY 1 pe] ا ¥ . الا ٍ 01 ب ® N EIS) i i 5% 1 = ht FN { FY 1 SA 3 i N 1 i i 1 ميدي § is i ton H i Boca H i ¥ i Sa 1 i i 3 Load SH I EE BER 2 i foun {Eis pho 1 Esha ¥ Bee i Sens 3 Yo MWe bE i EEE en Bis 8 : 1 bs Ss | Esa م BEN» ب .££ i OEE wow 8 {EE 5 شن ١ ami * Tem Aad 1 0 Esa { مسد لمش pe ذا RISERS on | Ns ا RoE Eo SER SEE Jo ++ esa لضي Sans PEENES SREER FE ? SIRENS fo 1 0 Bene Rn مسح RRS 0 k Joo NI 0 ل مبا a Ea Ham i ON }+ Lah SE fn 0 eens es 3 ns JR Rn NER 0 ا تيش gas +f Sa rr en {Essie 0 mama التي | FB د آل ا el EE Be EEE a. JL on
AR... RR... 0 RHE. = : »3 Gey ا > 8 Ry = Re an a pre ~ a ead a Rg > & BS) PRs ال SEE دل ي[التتط oe Shad اجن any ى ص Ray
LIENS Ee 8 لهي EEE ee) 0 HY Ta ) \ 5 1 وج !ْ
- a. hic N NNT RIN 1 1 : \ H N 0 3 ANN 1 إْ od ع Kod 1 1# “1 1 1 1 ْ ' N 8 ا 0 اجات لي 1 را lag ew 1 ,/ / 8 ال لحت -- ؟: / ا إٍْ RFS محا اج 1 : 0 i 5S ny i 8 3 3 N god i OER N : 1 i $ Vieng PL ض 0 + ani [EY i i BR 8 1 1 0 3 1 ا Ro 0 ب pad حي ذا Co 1 = } . o ِ 0 بويع لين i B i. 1d i Saas Said de (BE sy vet 4 ا 2X 0 bea Yad a 1 1 fo a ) & 19, > 1 1
1 . TERROR veel LE u § Ee i YR ~ wm حي i 8 Se & A H EEE JR ps hy 2 rd rr بع الا حم 5 ا Vd 0 gs ee ل 8 a id : wy Re | Ba frog & {i . = Ea = NE » NE on BB fog بس" ال« 1 EERE Sa Bl fa 1 BEER BEB RS 0 ' 0 i + i ae 2 ا الم BG ايا ا a3 ا 2 ا Se i H aa 3 pny 88 I RoR ل a 2 8 y : ل 1 1 iB +3 1 i aie H Sane ae Sa ا ؟: ا 2 ل ا H nig IEE BE ا 2 RE WN 2 H * Rn H DRL CBE GREE 8 LF Pan i Saas So A RADE RR on RRR PR H 8 SERA ١ ل Nae A KOR ERE FRE ei Baa ل ل لل ب Gar ل ا مش SEE : ب , ّ 3 RS 7 FORE... SSSR a o - 0 8 + Frome Pr v i * oe لء_ 0 a BN Sr Wp AS >< ص ل ١ 3 Frisia Frum : ممع ١ الم تيج J PRR § 0 ig 3
8# 0 Be sy متي يا الم 0 my كد جو حي 8 By نا Ny $ Ty 2 تيد YY و73 5؟ة لوجخ ) nn : : - Nth ol #8 mas Eee لاع اكد Wo wl JR DB ARR NS 3 8 WN WN TRESR ® he oo 3 0 ا N iH RR 7 *“ fad 1 i : 2 اا الت تت RR Ee EER 0 ا 0 “8 8 2 ey : 1 3 : { “ly 1 RI 3 LE : JERI 0 N 0 hE fo : 5 Gln : 8 3 ا i &
Gob. gE : PR at أ ما 8 N bE a H EE Ned EAGER لقي ed Er ات Fra i Pia } Pg SR : ا 0 ٍ & H NEE PERRET N TH Sr السك لمتكي متت ات ل م لاي ؟ H Ag 8 SSE ; ; . : امير ا ا موسو و امات ¥ > 5 المت 5 7 الا EE 3 #4 نّ Mx RE REY “5 1 اي ا ا مك § aR SIRE ERR ae £3 ge aaa. i ms ل ل i be Tha sy wd Sa 0 ا 2 ا ا ل لا ااا ا ae & \ A ل ا a ا RRR RR A IN IN 88 RRS RRA NR كد an 8: i Sa 3 8 Sas Rs NC ¥3 Soa 3 A i EE 2 EET 0 0 0 سس » ا ا لا ال الا REE 0 ل a Es EE EN ty aaa iE Ga ANE NOON -: NBN 7B SRE SEE 3 Na aba POE. LEER © = aaa 5 3 8 RT كل :
EX ji TS الس ا es nn TRAIN nny 5 IF م 03 لجست ا ال ا A : ل امج ب ان ا ا ا ا ل SE Nod XRT EE RENE H “ : ل N 3 : EE اا ا ee a 5 0 fo 8 ان لق ا ات خا ا لل Sg E Ni hi % so ا NE ik OR A a a Ne NE 1 BS N 0 fod اانا تا Le إٍْ Wk FEE 3 EER Na Sy BER i = RN : 8 ا a ; NEE BE OR ا Aen : لاد زا اد م ا PE : : ا TEE Re IE win § Si Ce الخال 7 ل الاو لا جيه ا ا Teed 7 BET ER 7 ١١١١ 1 Ey : i Be ie. a Lo eR NT 1 SESE : اس 3d 3 2 ا 2 : H NE i : Auge el 10 ضح i : 0 8 1 7 ل اا مار ا ا 3 te a 3 E 8 Wd : ES ل<<_<“_ Sav Na ah EET a Sl si eae 38 NN TEL SORE RT TER nae : NEY Ie 8 Sana BEES EET : : x 3 SE FLAT a Na ا RES CIN : 8 RN 25.08 BE 4 ا 4 ل 7 : 8 0 : hod RI ONE NG LE : ا : : ا 3 : He NE SRW 5 : CARR : FR JUS ا EX 8 الات EEE IAA + RR ee be i ee AE 0 ااا ا TEER ا ال اه ال ا ا ا ات ا ا ا« د ايد ا ل ا ال 7 المي
اصن ً ب
ٍْ - 8 : - اموس i ا Hr Te ١ ب سد 1 ا "TR \ . : ا ا ال } : NR NN Sani i Es ا BES re a Cn A )\ ل LL
LL ee a Aa ND N N gy ا i) “رو i ,/ “oy ا - ننه ا ال سيط و ل ا JE PET SE seve ااا ا لات )م bE ا« #010« | نم ا ان | ال ْ ْ 0 ا ل ال ”ع ان ان ا ا Lp Nam Pn Miata acannses 3 اموا را جات احم سد ل 8 A اا جحت ا جا & & ا بحت > aa TRE ER "
٠ شل
كبا الو ين % rs s 8 5 o tw www ow www www. جر كحضن 1 مجه حا اللي اجنم 1 الم نا امد RAN المع م i يذ May TR TE TR NUR RR FR Bway FEAR TER FAA TEAR SRA Ut Sve: ee ee امسا EE NE he) J 8 > ب ) A <1 a
oo. es 0 7 ,5 ب ب تت ب متي ا ب ا لين a “re Pe Ree proms tty 8 ل م ay PRET ع 3# ايا لخدتت ام الول أ اا 0 ow جا Ser a NER we RY سس Ris: SH SOY XT A sd i} TY BRE uy IE [STI | al Emin ; "% 0 Na ER SOE ENCE IEEE mmm SR مهمه هده _ ضفن الج > لمر ااا ot امسا £ Fa نر اموا a, x بي ا ع ب ا ااا او ا ادل لاج م م اك م اا سح ا م جا ERS اتا ROH اا متت ا الا ااا اا ا By ذا وض LP د با اه hd 0 ¥ Sn £ ey ١ 8 1 سي bX md لوحم WF اس ١ 5 ٍ 3 شكل A
=yir 3 1 : . رج : © Led iid 0 st SF £2 3 : u : 3 te : _ E a اب رح : آ £0 em : xy : Wa om ANS J Rpt 8 لج : i ب" 8 ££ ع x ww sed SE & } x 0 ب اديه wy Roe ) عه 00 | اط SR ام رت 0 | ار أ ال ا ie des 1 ع REE تعن : 5 ا ا ماق 1 a 3 oo RISES SOME ا hess 3 EF ie اليم 0 ا اذ ا ا الام الا ال اا ا | ل 1 “Ka 3 Fo I ا I ¥ 1 1 BA Mig I درا LL i اي pti Wg x. IT ig xa Te Yon
STS... در را د ار ل HE بترن ie ا مي خخ Sha pe
EL. ااا Se gr Cds a ae ETE FEF TTY fF ee dF EW ¥ 8 wo 1 Ln RE STERN i i REE RS RE se RCE a aE a Sanh aan i od aa a ا اا ا ا ا ابر TR mT اا اا ايا ER ااا ا ا AR الا تت pens | يي سسا ل ل aay BE لس سسستسسساا EA: Bid ww Wg XC EES Ix Wat EW Te Vid في ؟ 8 3 DE الب و SN ال 3 1 : ور ا § 0 0 Foy VU. MN 8 7 5 ld . نوع ا 4 a LE : oe ! 2 ب A "
3 i. ذا أ دالا id oo a me H EE i 8 = | 3 N 0" FE LE: 38 | 3 : ا لاجد EE iE ااي Nx I FEHB ا ذا N bi 0 RAE: Ek: BE: BE: N A 3 IE BE: PIE <4 bi IE: BE: ENE RE ER . : ان 4 3 E: BE: EE: ٠ hE لخاد ا ب EE NE IE N EEE SE EE EE BE OIE IE Be § Ei i BE: EN EY yo Rh Rc ERR اب ا اا FRE RRR. ag Ry 3 X Bs > Ba 2 FARE A EE © شي & Tog WE Fa ¥ ; 1 Fe Si شكل
١و vy البو ١ ١ 1 3 fl 1 د ع i > مج اميه وا واو i EY دوك 5 Sy ات ¥ ا 3 0 3 1 : i I | 1 1 i RS IE ا RIN H H ’ © i 1 8 3 H i 8 SEINE (BIE } H H IEE 8 BY 3} Ya ot Hel By : NSLE RIN ERE Eid لي PEE NE اي« yd #8 REE IR 1 ب ايه oe اي شيا اللاي الي الا تي ce REARS Se عد Save Sa 30 Fa اله ا ah ل CN . CN NR م R, 3 اا ااام ا ا ER ES مضع ® 8 X ae 3 ا 3 pry Rad ب ON of JE Es & A £3 Eo FEC لوا ااي eR See FR STIFF ES AA شكل
Foewa a Spe? le x pee لباة Sipe 3 8% 3 ; GR mn Rn ft 8 ٠ i" ¥ on gree Sve] يتم اما pg ees TTT : : 1 ¥ & : 3 t إ ل ع يغ rt 4 1 1 8 يا fi 1 - 1 : 1 1 F. ] Feoaoad 1 ٌ i ْ | 10 و 0". i ولك nd i ++ 'ِ 1 i : i أ 1+ : 3 1 1 : ا 2 Paw e 5d 1 ا لت 1 5 3 1 !ِ ] ]1 8 إْ 1 1 1 متسس ا 1 1 السب الع سر وا شتت ل وات تهنا سا 0 I... WO H Vet He ; بر 4 7 Le wid Sam
ا ف أ العا رو ا 8 ب : يبلا ا اج ا ie 1 CEE EA NE IN TTS اوري ارا حت اج EE AA A RA A RR RR Sent ns sn - ا ا rn : ل 3 ال ااا a a; الل ل ل ا a A A SAY Re a 9 ED pt TY = SU لا EEE EL AD لات ا REA ا وج ا ل اح ل ل ل و CUNEO IN, بو ا بي ل ل ل ا الي ل مش مج ل ل ا ل . ا ER ا CRNA VERE REE Re به جا ا ا ل Xe جناي Sa FREE A Ea Ye Co 3 = Seder RUE Y sh & a8 RR So + 2 ال i ee 3 ِ 3 a fog, & vs RY د Ce ER و AE TE ا PRY Sob 77000776 لاج AAT لي 5 RE pS Tat Sg SNS ERE 1 047 ل الاق اسست Sr المت لت لت ااا تتا BR £3 1 ا TT RN 3 اسك ا ااا ات ا Re اا ال ل ال ل ل ل وا ل ا Fa : : 3 3 Comm اا ا م : حي اد م ات تت سر ا اي § الخ ااا ما تا 8 8 ووم و موا مايخ SENN ان : حي ES Yas er Res 0 : سي ال 1 ES Shan od ‘ 15 0 شكل يلي مفو * 3 agg
4: ولب ارا 3 جا يش ؟* “4 “3 « ol & Bh NS eh A BS NC VR ايكيا hd A بقار ry رم اخ rag - we نا اليو وا اه الا جد نا ا 4 i ! EER CE EATER SCARE EERE اله AATCC ATGANTOETUTRTROG : Th a ل ا ما ل ارت لاا واي 0 مإ a en BE Fa psn AARFCAPCAG 700106 GUS x : SRA EA لا A A ل Maia itera PLITGTE 1 : “Eat 3UL EA SANE BUTE ALA RA Lines tn SARAATTRCTOOAGHH AUTRE GOS 0 م يا ل ف اس ا ل عات ااه اس د ب خأ 4 A a كلس ah : ye FF ED Dg Yo NT الا اا of ¥ FL MRCS نج أ أل ل SEAR SI CR ER AE ان ا ل لل mae FAS ede م IN NA NR nN $ RRR RN : ا الل ND LL YL” .- Toe i 1 مكل 1
A ES ® 7 I م١ RCE ا I Aa SE : ٍ ض Fak A Ll ا 1 م | Loge 1 1 1 : I SE EAA AEA EAC OE انان لول لطت الاي اا <١ ١ شكل م +* ا Ras w fav EN at Food le hes IE ; Yo veal ty baad - JFL TONE NE REA I 1 1 مك كي كي م كرك كو كي ا نو و الاي ا لي د٠١ شكل
PEERY Sey BE ا I LENG: | RY H ب" we i: Fide § x wR 3 H { بلا H : H LEON 8 ١ 3 ang, oe H يب 3 Fae و H / 000 . 3 N i H الداع Foy H i 0 ion § i § % AER § ~ 3 : N 5 Ed end i Re 0 H i
: I. 1 Fos i i 3 : H i A AL SRS وي الوا ريق اللا vi ¥ & BT سن © FEN ل ا > ا SE wy a Nae ا 3 3 TR TAEDA NR TR ااا ام رجه أ وى جا را اال تي و ا FH SONA 3 تساي Ba ا 4 1 8 6 : 0 San ا ااا لا : 1 ا Re: 3 BR : RS : ® 0 اتا اس لاا ام لت ااا ااا : 3 و ات اتا ل ا اا ERENT : Arena ¥ AR EIR اتا TERI SRR SERS 1: ص ny SEEEEEEEERL <<دٍوددددد. CERES 0" ay Saw wan Welw لل تيه Rial 0 Fg حر الا goes Sods Bra بيرع feed | + خش eS 1 £1 TR Yo WY in EE 3 k : J ل oH اشوا HE Yo jo oS “ey <> Ld y oy 8 د 3 £7
WIRE و مومه ته من جاه رعوه مم ممعم © TE ايا وخا ورا اه فوا ميف افا ل« 85 ا ل حت سا ا ا ا ا ا © Tg ا ال ا اس ف ww Tp” ل الاي لت ا Lota ال ا اع باجا w» Ye” FER GATOEASTITTRANTASTART SOTERA STFA TDATTATTOABCEOTONESS w Te ¢ SRG همهت اعت اط Ls Lia saa مت و DACRE ا بذ بورع CRGEAICOTEGRGEARIBERTO SUR THR ا El i TA ei Se] + “rp” a7 ATEETAQROTRSRGASRRCATRCTRCA NTE Assy TOYEITICINORGERTACYRY ww Fe"
i 4 0 ji A
3 الال LIS ب وى ha من بيد الا ا ل تت ا يوون يوني ميونت ووو ووو مووي لمشت IR ER مسسشستسششييسيا الما لو ع ااا snd 4 : 0 لح جحت سحي اح حا : a اما اا ما 2 iy vcd : : i لح جح : PRA SE i] R H ا ا a CR aaa IE : : 3 ا ا BS H : لومي TANT SETS TRARY. 8 : : تيبي امت مسي PoE بيجي CARER, CNET mee : : H ا ال المج ا ا ا ee © FEI USI NENG. ew : : : H ال aaa Poi [Ea ٠ | : ; Pee © 1 : 1 0! 0 a : : : BS : FRAN = 5 8 8 هه الي مج 1 A 1 2 ou oe pS a ES ht oF hie a te pares = ~ اي TRAY الا [ed RY SL HE BERR EN Sg ee ااال EA RNR ا eves. © : 1 اد مس ل SETTERS مص مص SPY FETE اللاي 3 YN ا ا ا ا : : لحي I ie : اسه ججح اا لاا 1 : : : احج لما : 8 rT RS : 08 p ١ : : i ; : : لمم RO ست م لما : : : وا الوم جد لو ل (00[00 EA a EE aa : : : : : المي BE i : : ع اللي 1000010 سيا لخ ا سا : : : المت لج د EE نهذ ا تت سس : : : : ال لح ا : : REY wo لاا SEI SR ا رس FL BE AR : : : الحو ا ة ae Ge > 8 i pS BS ho MN se EER > ES Ey 4: = R Td CE es nn FERN ا مت مسقي RN ااا ا ا i لجو A AA a مات مل سحأ : Sa دسج سس للح اح تت الل ا ا RRNA ١ 8 للد بذج جر و ا 1 : النسسحسب IE ا a mss: : H بجت : : ١ ata جد ا sessassses : 2 ارد ست م ا ا ا : : TER OR] wees a : : FRNA RRA eee : : : : ; i : الم لحا : : : لسسع TOR SE ا RRR. ee : : : i اا : : : سر اماج اس اه ااا : : : : لحا وي جد الج ا : : : AIAN ANN 1 ee IE : يس الت ا جر : : 00 ا ا ا اا FU: تا SOU JUROR اف الس سسا et NEN SN SU: سا ا ل pe Ya a Ly PRN > : Woo شر اد SER تم د مح ا EE SRR و ا RRM! : الم يتات ضحت الت ام : : تالكا احا ل ل nn : ال اا اا 8 : : ا ا ب ¥ A : المهجهههها fad? TL ee ERRNO TTI : : :لمر ال ااا سا a x Se * posses : د جحي ا : الجججههر YE وم اا CRNA ٠ : اموب ANT ا ا ANN y - 1 Raa RRS SEE
Yd LIE oy 8 8 رن بي اجفا تة ملكي ا الا ا ا ل اا ل د ل ل اج جاح اح تج جا ا Nee H نمطي مود الام سسسب امجح حت ا ١ وموم الم سج ال ا ١١١ و اللبوسييا احم امج اج جا FE NATIT — © © © اج ل a 0:0 لصحيب لح ل ال 1010/0707 7 الل FIER ا ا ONAN a : : : f الست _ سج سس احج ee 3 متخت ص تح « : : 0:00:00 اذ بي تالح اس جحت د م : : 2 MIEN الس : : : n Sadho nna WF Pod Beare امم WE SEE SE ARTIC ا نهر Bl H 3 ا ا AR SE: : : E H تم HT.
RB : : : 2 تجح وم ياج حص يح : : : : n KY FO a BN CO SS SE SE SO EO STENT] مال ل الت ا ا ان ا انا د اس أب ل ممح “ra “rt ال
مدي x د
ل ل ا PY ROR اح ا سا نيديد دوحج حجر الب اس لح رن ليست سمي سم سمي UE جما لم لج امج ال : ب Sa الي ات جه nee : 1 : FEI ا Ree © : : جب جما : E :© سس الل اا a = : : : : : : هيو TERR IIR TRAN TE : : : م اللا ل ا : : : : يوا 7 الما RUNS CAN 8 : : : : : : ع 7 SRE : : : و Ne : : : الم د ا : : : اتاد مج يه ا ل ARERR RANA : : 8 BN er : : : : : : : ا I CT een ا سإ سس ا : : : fretting BREE
ل : : : : م Ya ع + اه الال i و ~ 4 * FS اي تت الي ايع
Ta ١ Se A TEAS اماك
اا ARN وج ا er le Ee ROE سس ممسسمسجججو ١ وال ا ل لا RR He ا ب م aE : : : الوه وو eee RE ححا الح حت قا : 1 لا حاتت ا لتم المج 7 NERY Bs ? 0 ا اجووووو و ووو وار ااا لا : : : : دحج الو ا يسبيب ١ لج م ال ين eeataaaeand OER RR i : ; : مس : : : ا 5 : LN. Ne I B : : ا : ويد ا لح يت الس : : : 8 © الج تج لش : A جح مح جح 8 : : 8 الج سح امي : : الم ...المحم اتا م لم IRIAN EE BE CREE er A AR SAA BRE COE 8 5 3 Rist 3 ّ i . جيني حب لبد يجيا لجيج جد اج لان أووو دجم وومجوجيجيمبا ١ ا ححا حا اح اها الجمجدد تدحت جحدد دحت RR لت حك الدع حال ا ا ا See ٠ كارت ا Jere الج اج ا ees. : جح الا م الس سا . FY ARREARS a 8 0 سس اج ري دجا ات جح اج لج ا شيل : % سمه دج التي الح نبب 7 : لوم لدت ا ا ا EU Re i: BS a Re fret “3 3 4 3 ب 3 + ُ = NESE A يام ا ات عن لمعت EL ECAR TOT Pi ges. T 8 Fe” 85 اع المع ا ب ع رع اا عت وج وات لتم لض ل “re
BEY. pose ايه لد ومع RL ا اح Pn TTT RROD RE Seg. TY Fe a 805 الات يي IACMR ee Oa و ل اانا CAS Agog. TY Te 7 ل ا لي ال ل ل ل ل ل ل 8خ Ln a نيل ماك الي Ran اج لي CL SUE و عات ا ااا 82 “نج TRE .مين كه مت > و ا اك IAT ARR اهموي SETAC B10 Ye” او ع ران ا ع ل ودع رع با تدع التاق البو" 1% pee عم ةادا ا م ام مهاه الل احم هاج 0 SOASGY ra يي الم و و خم ا ل خا كت ل ب اله هلا مودي SOS49Y Ie شكل
خاي ب" ad 33 اخ Spm. “ral wp» vu wy oT La EER الا ERTS 0 مس jt ا RAEN ETA PRE RR ENA ١ ”ممم الأ IS IR ا حك aii sessensenaanasasscaansan oof احج ل ا : الود سي ال د ا سأ ا : : لطا :7 RT ae © © HE مد : : SRURATRTWDISNRN CL aang : : 1 & ااي ا تا : : : : نيا ا SRNR NRA : 100 ال لست تج TAR pith 8 : : BE CRA TORR SN 400: : : : : : ا الح لجس سس To ل NERS CI سم : : : لج م ل 700001007 1[ اي ل حصا : 8 : AE ل RB 3 : : : ملاسم تتا : ّ : : CAN ساسا سسا : : - ووم حي ججح ا : : : الجا امي vol : 0007 متسس تسح الس ال ا FRE RPE SNE: OO ا ا الج ve ال الم 8 i de dog iN RA "OR Ks Pads ome A ! ا ل فر Spe op Fad) : 3 9 1 Ca JE ل ؟ 5 a a sere bg امت AR بيه 0 RRR RARITIES ا | ارسيو سدم سوس وميه ١١ الاحد جد مت الجا ل ALS i : ألم ذه تح حت جا ا ل : 3 : لببيييها لاحم حي الاج RB : : اوها :الاج اوجح ار جا 1 : RRR Eo i p جلا لح BS : : ا NETTING ¥ : : : : AREA REE : 2 : بها 7 الحا ا سا : : TROBE § H I : 3 : 7010 ااا R : B : ا الاي ا ا ل suena od : : : : [Raa عكتلا[ i SANG : Hi يو يه : : : : | Settee FRR : : : : ES : K : 1 8 ّ الججااي ابا ااا : : va H I الج NN EE ا ب مم ا ا و ا اا ديا الا يت لاا i 6 3 ا > الس سح بم 20ح بلج 40ح سق لخت seg ap م بر ‘a ا 4 بيجي Gy if ا : se ER 3 pe ¥ > ل Le aR احا ARR A Bet FR rn AAA ANA ل ال لح HE ANITA a : بطي TERRESTRES الدم»ممم»مه»ممهه ممم ممم | SONNE RINNE RY, : ل 1 ee ال 1 Ea RAED BN ana © :الماح ااا د : : Labi aE : : ادجو ووجوجوة i : CRIMEAN] : مسي ORAS حا اس : : توعدو w : ; : ; Tl ا ل ل : مجم لجار تالت جما : : : : Ee a : اا ال ص ‘ : ; : لخد ا pi : vasa dw : : : : #ة الت CNR ETE ISOS ORO ee be : سسا مس سا لس ا 0 i “ : اال لجح جل جل ا «# 2و ل اله da اتات t t] ® Pg om 5 ضر اتا : مادا مر دج ا ا ال : ممهو مم وموم مو وموم ووو | 77ت SETTER : ١ anna : الام ا وات ا تح ١ : : البممسسسسسسس ألا اح ا eee— : : : 1 اللي سس : : : : الوح DEANE RAN RY teas 5: : : : 0571 الج جا جا ا SN a CJ 8 : : : ا ا ا TE Ee HB : : : ا ل foo ET I TE AN I SU hy am Ra FE اله de الست he ا ا # 5 زم شك pro ry & {
أجل ليجات Yi جما KLAN ( معدت دع« #31 oa 83 رح بت HY PORE GRE) خم TC. اج << لحب < ! oR يما AR RU MRL .م 0 بير 0 الح ججح حر اا اجو هوم مج وج ا أي ا يت ا ا ااي وه اج ا ما او ا ل 1 ht J ا : احج ل :الل :وول A اوبحي الجاع لمجو ...اذا 0 RR تلن الا اله الم لا الا oe 20007 انها المتتلاده EL a قد كن" ا ل ا ل ل LEE ات ين سي لمحت الم سد ا ااا من سي جم الم ل ل BE Eg, 30 Age HY امو ا آل امو قي Ye ون اي ¥ Te ب a aT + ا لاس E v8 » ho A was, A de RR ARE ٍ رج ين الا A الب اط : a ; 8 ¥ ايج EY 4 bed | a ب ETS ne j ص :3< We ® ppd BE aE إْ ا Sa امه المت 5 3 لوو * إٍْ ل ا 00 01 مما | 1 إن ا ا الجخ EE - == Bi Ni i الو RN} Ey اد ل 1 § + 2 ME Tie | Vigil + 2 ¥ RS BE ا [RE pas oy ا Sx TY 8 EAL. .ا 4 Em Rice RR يم $y a ate Er Pe] 3 . LE BN رع فرق ر قرتبالرقيتقيترقيقيامقيم الك واد لقو ارا الا كرا a A الو ا ا لكين لكاي الي ون تي روي لكين اج تك وال اا لمجي اف A ال ا NEE At د اندر ا اا د حا ال م في ال ل عن الاي LES WES Fe SR اتاد جرد ونا ا + + ا ا
ا hy War dR sega 1 : : ا vi حر Ou Ad Yh 2: Pf A LTR RL Behind, LEE Sig ا ل ا SA J ARENA HARA الجا ا ey ا ley ال ا EE a a of Le الله « ال اد بأ ا ع 8 88 no RE a: RT ER A 8 بجح لح RR NRE. 3 no 0 جح SE al TT Ga a RR 12 اد ا ا es 50° ا 2 Ml المع سس جا الع اا م ¥ ” SF RES ES ey 5 4 ا << ا 8 8 خخ 1 # ما ا RS Sg كل aa SE .. LION ا 0 ERK NR TT NENT EE الس ا aR hi - - = an م ame ee Gee Lew thal MW . Se pe 8 ا La — NE IMT SOE ال aa ال ا feo BREIL ل ليع ve i Lg 3 5 8 شكا Ne
Pag & p ad wy HH ال ال Be oO & شي Fp ان ا : oF & ا ا Ben, FEF FFE F Cx RIE CHEESE TE JE عي pon Bn & ا & & oF 4 ص اج ل : $ 3 كل eT $e on rx 2 FSF AE ew 1 سيدا ب ER ما كن a. لجرك ال ل i 0 nn in H : | مب as ا EE ui EE Yi it a Er . 2: لاا : or الست المبجي بجح جيجه جججيلة ال مم A ES & Pg oo ra 3 b ا ba] x2 . E b 3 8 1 ly i مسد SE ., Ais ل ا اال حجر مع بحن LE SE #8 Bhs nf no a على IE AJC, SE SE al ET A لان ماق ER Ro ا اق k 8 Fy HF ad ا ا 1 ب المي ان ا 88 ل ا 8 : لي قلي م FF @ FE Gee @ a2 a $B SY SM SFR :+ ا Toga RES fo a 2 Ra ul Ea EE F&F Fd EE Re SER als 0 3 a يلجتلا ل SE ST Rh Nn ORE Nn NL N a YET Gg we wm لحا PEER ERT a N ١ ry Ry TRUER SN FREER 0 9 3 = 4 ww : ل اا Ea ow waa REE ge pe ad Figen oy » 8 ® : ¥ ® ب SERRE NE TR ji & لأا
3 2 غ ب A Wa ga i BN SI SE ae H 1 E 3 I Sr A ER H 2. ل By ل ا i A i ay ve 1 يح wee ا 8 ب >" ممم 8 بع لوك عي H I EE EE A EA Ee 3 Ege Poy ا ا H £ a a 8 GLI, eu 0 3 i BR ER MR RR BO ROE Cp SE LN H ha BLE © > 8 be tn BS EER H iA a Tn TAR TU 3 I RS H 1 . ل H PEN مسد مد ممم مهمه ممم مجه ممم FE TR RE ae N RENN اا § HN ل مب سي اوور 3 اا اج od ia 1 م ا 1 Rr ا ا لأس H N Cag H ا ل ل H مح اه ERE EE DA H HN AIR SS SES لات اا H #ج تحت 77 H fw «i H A Te EE Lowe wi i i وج م م الج واي و يت 8 نا § H TENET ES H FS SERIE TE A : N SE i H جات جو ود ماح م اج الم تح 8 ae} حي حي RR A bo eT AT A AE AY H N SEL TN SRR ER Rr ERE A H to Ae Sh Hy FE EE AFIS RETEST SET: | لقي [ERE 8 ا H AARNE RESCH HN AN AA NAAR RRA لوحي ورد م عي و TS لالد توتو H AAG ERRTTY § FE } تت ال i 0 ل 8 we FEE Ae N 7 § § يت SEE ESTE AN ¥ \ ل SA HN N { ا TRO يا ا د ما أجلي Pos ل 0 i ا SRR REE i FER A ااي ا د لاا i H لي لا At at § ER ne ERR { EE EE NOE BERR { 1 ايج لومي ا حا يل جا ع يحي a i i اج متم اتح ا اجات تيع bo RR ES i اتا ا ا HN { ا Er ل ا ا ل ال ا A ee 8 LNA 1 ا 1 1 ال ل RE TA H ا اتا 0 8 La Hy EE SR BR oe H i TETRA TARTU TINE 8 AR AA AAA A AA AAA AAR AAA تن ا AAA ل ا متاح لس ا 1 ل خخ PYVGRBUTR § St ali ف RR CREE SY SERIES So 1 gy 8 nT ; IE: si 1 8 i Bay عيب : لج لوجي ججحب جد وات لمج و مج SRE ب ا ل ل مس الج ARRAN va: eee ا لاا لا ا ات ل EE ee ب" ب Sg § a EY SiR * NL م ا ار Cs a “يا الخ LE ow aS eS Ea wa oY Re ا - Ce p REY SR psa Re 1 و سحن تا ey Joan لد ST TU Rn iSite Fb : REO C02 J J SFE SE CRIN FO Gee. oN Se ae ov م fore cw Team ا اا fee ANRC ا الات ات SR ب ال ااا TENE SERS NRHN SRR ل = 0 . 7: 0" 0 0 -ٍ بن + ليون 2 cn SER لاا ال SESE oR TAN EE wed RR SE ssl Bg Aad Ta fom EY EA EAA AAA LA AA SAAR RASA NR pF Wg CRETE ٠ FEE ا تج YA 13 y Psy : 8 Foe ا اال ا ا ey ال نا ا 8« ل : 3 ا SR NN seas SEER 3 SRA 3 ; 4 1 8 aa aaa ا 3 0 1 1 10 a ف CPE SE يها ) wi THA ال Sa Nt اال B « +4 ا اي 8 8 0 ل 1 ال اام ow ال 7 ) RENE PRET دين ا fs FA EY الي اللهداع اله“ “hu ار د دا عد د ب ا ل 1 الاي« WY خخ يه 4 ؟ ؟ ٍ "م + 8 امي + F FE الوا Ee A 3 3 3 =F 3 poss Ea Wp, WE ERS EE A il كر ب" Ri LE Ss N MRA a.
EL A BA ee me 1 Li اج عع ا ا ل اا ا اماه الت اا الاج Re Ree ا ا ا ا ا ني ل 0 EL FR ERR Er ON ORRee Said الج مين + 8 اا ii i Ba RE اسح تت RE LR fa *# i 5 ai : 1 wp م 8 a ليبا rg امال Yoon لاي 3 ® Hk ; PE R k EN) Tog Yasw sd 8 ا Hd 5 ار ا ل 8 ّ = a cB 3 © اميه TO J : hE . 3 DEAR :T BF © LEE: : k : : 8 4 1 8 0 3 5 + 8 2 م Indlill لي SO = 3 كل ام د 3% #3 د ذا 13 1 FFE WN k I ا 8 x i - = wR K ا EE EEE 53 BE بخ ا لا لب EE EE » ا ا ند Bi is RS a FS FS dH FSS EE CCR RR aR الج الجن الج CE اجن الي أ ري أ ا أي FF HHS FF RS 0 q 1 شا ee
«: Ed اجرخ 1 we a BES ب ig TR ١ 1 امم ل ل ب ا FP ال ا ل RR A RRR لومي SEE Sh AR HE 0: BE re aa : ال م BT A : ; 3 الت ا التي ماح ا اننا BH : AAAS RAN TY § 3 i i CY الم لا مح 1 0 3 NS 3 LANTERN AND ern ty : يسيب اتح : i : TT je. ١ i i i 0 ا o N H 3 ال EE py ¥ 3 اي تا لت wee i H : اتات ا تع ST: i د i TINTING we ١ 0 ٌ : BE EE SI 3 i : اليد الي ويج سيا i i : الست ا ا we | i H i يا يح جه مج مجح 1 : £ : ER EN الت 0 i H i سس RS SS ka) So i BN i : د تم اا ال We H x 3 3 3 2 ب RK a Fan NAY NE, ac - 3 a بل ا الحا الج لح : B : : IRCA, [3 ENR JE JRE OC اج BNI eh SOR 3 BN Ke 3 [EET Rh: SOE : 8 بج ا سد أي وا 3 Xe Ta Ty Fa تف مح 8 Xo ao Fu 7 بن اناد od ol Regan: اج مم I مض ا ا ¥ 5 0 SY عه ‘ 8 8 د ا جا جح م ا RR AS اا RENE EN BE الا ال ١ wa AIAN SAMA ال ممص جد أجسجوي a et at an TEE ARRAN INRIA Cr ee. : امس مش تحرس 5 R od FR Rall: ° 5 : : وج يج تس Me — © الل ا ات ا RRR : H ىج ويح "I TR SS SINNOTT RRR : 8 Pherae Lo 0000010000100 SYN Ret اي رمسا م ال ٍ : ال 1 : : : 8: ال : ; TR i TT TE I RAR AN RNR re المج i : E ات sma FR i : § : 1 i لو a woot SEE BEE SE المي © ١ 1 1001010 1 تح ادها | Desens i ; : اا امي تح SE TE SE FATA لاك حا Devete ١ H : i RNC PY 100100 Pog ا ادن ا اح ا اس eden RAEN wl : tS k b 3 ا ا ميد المت ل د ا 0 8 : ل foc لجا صر دك we xe oa «ج SEAT hw Rove AR We لجاع و لديا 7 v مو + معي ا امس اا 8 i RN i LT ARRREN Be اا aE A AE IE الاج ا ااا . تيه و م RAIN ا ka 8 : : H , لم7 حي مما اج الم : 5 8 ا 4 ال i : H NV اجو مح 2 5 = 5 : الج ااي ») ووو الل سح عا ee ١ : : الجا ا rn اوج 8 : 8 ار — : : : اا SE AAR اا Cb 3 : 8 ام 5 : 5 : H CE I wel : Cod Re # : : : : سسا الع حت سن SE SONNE SE ا« تسيإ إ'_ تس ا : : اسم الات ا تا Y 8 : i ا ot ا : : : : يبا ا ب جل : : i حب RANE “ا : : : : POMBE INE RES »n v : : i Te sy 8 3 : : : ل TE YL 3 : i TREN : ; : : : FARR ts Es A Finns dss معاي اا CR RONDA SE CN : : 3 i : Td عا ابطر EE مخ م» كد Be امسق wg PA *! > An A ٠٠١ شكل 1 * {eet
pd ا REY 3 ا لايع كا الوك Ts 53 المج الم . 0 ارح لتر ARR تت ااا اا لا الا : : ١ : ل ال i الحا ا لدت اح سج التو VARA A الد ل ال د حت IS Ns: 3 ادر ا ا ا 8 0 ٍ 3 المج ايت i 8 STREP XE § i الل ال تست سمح ARATE Wee H H H جا لحت لمي 3 3 Aa الت اسلجم Jae i i ال دا ا ا ا 8 i i . § الح دكا الاج i i ¢ بدا ال ا ا ا i 1 لس الما ااا i i i ل ل ل ا i i السبسسسة الح ل ات H i THREES 2 : : i 0 سا MERTENS hw i i i DSTIICEANITRIOONR 2 : i : الست ميات H i 3 عا عم بناج ا H 3 3 i ونيا حا > BEN ph SHERRIE. 8 i i EE SL SI عل 3 8 AORN, we H H i Hast H 3 sage las ’ 5 ا امسا د لح ل ل ا ا ان ارجأ ١ 8 ا EE Ra ا ا 5 البمت ببسيس سب للستت ل د اس AW + H b3 3 i 8 اح ججح عي مج جوع oh a i H 3 3 ما ATITIPEINTARGIATNR, سي RRS SAT a vn H 8 3 i ب لاد نت ا لا ا السو :اح H H i : واكم ل ا ا : 3 5 ب 3 os جه ١ SNA i : ; المج سي ال تح ا الاي bd 3 H 3 با ا ا ارا لاا : A VT NE Fee) : i اا ANE i § i i ايا تست بجاح سمس DO a : ¢ i H H § i § لني سج ا تان i § : لشي الست تك ا H i H : § المت ته ARIST PRETEND Jose i H H TERE i i 1 : و اميد يدجي SANS ITO TRARY RR : i i i i Beaks SOUR SET SUITE SUN : ال ات ا ري ARERR NR ENR Teva by 3 be : CEN Co we. me 0 ik 5 ERAN مقر SE SY wa ا أ ااا تا ع ان م TR oo } Te Ng } ب 3 * در ل ges X* BRIER Ys i NE YE RRR A a Mi H الو لعا SR سمش EE SONIA ST DR CEE BEE i السس سيم امتح حت الف Uren. اتا ا اا ديت كا RO H : : الم i : FETTER 1 © سيا FIRE RGR H i : بي RETREAT.
H i : ATER REECE SRI : 8 8 مح عض 3 i ty : اجر 0 RR RS py i H : RT inane : 3 8 : لبي ال ل ل ا H ; : ا vii: i i i : EE جما IE i i : RE RU : 1 i ات مه لح i : : الا Re Rh ا : 3 AN : i ل H 3 : 3 تيه رح دا ا د i 3 : : SIRS ا الا ل ل تاج م 0 تت ل م امم الست سس 2 ٍ ل . ل ٍ 3 BER is Tog ا مشر x £ A & Hay امار Hd YS ¥ ٠ ؟ Saad
N Hay BY
H i. - ا ل امه 0 i Wien pes اليد ؟ Boa تا He Set a, EFS fad ن Fi EE TAR ا ro he 1 ا ا مزه يي wl ny ARE da Fo DO: Ee LARIAT AGRT BR CATIA RRO > 9 9 لضا لحك اا ل EDR 8 ا ONIN N WwW XO NE ed "ْ ER RINE 3 i ل مو ا 38 الما Np RT RE د ا ha aden م a REN REY جا SRE م -" TAG با Esse Vo EE NR EE SRR RRR 0 i & ES 8 A Co i Ne AEE FER 3 SEE : 8 BER STRAINERS, pe : Sh i a | He Se wi ل أ أ ان EBERT H CPE ee ESE tht Ce ; J TITTY 1 pe Emme RN SE RR HE RE FRYER FRR RT J 1 ا Eu FE SE SE i i pes fen FIRE TERENCE TE TN N SE go NE bE ا SH ER et SE ا ا Ta a اح د A ا ل ا ام ا ا ا اق :المح اا ؟: RAS ليه ناا an i 8 عب § ا اتن ل ا ا ا ع 3 i =" لكر حي ال لس ا اج مال مح المح 3 one ١ ات A موت و LR يا الا ا ا ا ا ات لا لح ad
8.58 ا ترات oe اا ا سا ا ا ااا ال ا الما حر ا DR A ال re PRES A RR Sid AS f SER تجوت وه وتو Re Te 1 ل اا LR HY EE USNR OORT A اج IE 0 ا الي ل TUE ال ا ا ا ان تا لح و ا ا ممعي ا م ام SRE ERY 3 LEE 0 A اتوت EN امام لمم مم ا حر ا 0 dus SNe Pras PETITE L Sone rot bei TH a = CHEATERS REN Fo تام ا ا ie لاا ايا امك RA ا ما الح ا شتا 1 3 > ESE REE ا ا a LE HE. ير لع اح ال ون لبلا “a ow aw ES ER RAR DRE RY ا v dni i i: 2 Real لل ا اغية Sage تت اق SE الاق ا ما REE ERT RR 1 E fe LE GN CEVA Soran fas mene اااي لما الي لشم لا ا Md My TE 3 5 ا NER انحا م اجات ah TRE با مدن الا با لبا k RRR eT ات تم Ne NERA RE اتش Aer AR RRR Ea ال LORE a Los RE ES AE FEE RAR LR RR عا : : يو اا GENER الس اتات ا ann : EN NEE El dreamed aa ane ta SRR RE FREER SER الجا . RES | اا ا ا و Inna Tr ECE RG RENEE RE RE SE Fornarina HERES REGIE REC اتح ايب TERR JR: RAS \ = Ry او لوعي مدعت حتت ا i i RRA EE TET NRE ERR Re NE SC SOL حي SNR PE سي الا : SIREN Rs pits Farben pe RATTAN REN RARE سس 1 A. NL ل لل تت beet ال TRONICTRIRRNANTERES ¥ Fea مد Reon FRAT SN he RAC SIE Vp et ّ . 0 ال حمست 8 دي k REE ل RE ا i. NEE EWE ER ERE SR eyes : م سسا Sai : Ey 5 + DR ل م وج يه و وج و ا ل ل ال Ss SH SEERA EN 31 0 LS 1 x Shige XK @ 3 Gd F RY 8 ER * BW 5 SRE ERE : SHARE لا لش RENAE she BREAN ب ال اا i لضا اي ضاي SRR ٠ ا اتوت 0 يي جو جه ع )؟آاأل[(88 SE برضي اتات تلض ااا rE FS SA قالطو الجاع ens. ا sHENES ee oF x ES wa ak 8 مسي #5 NE 8 88 Pe PRANAB, | ب OPS 2 vy 1 3 ال رو اااي مت لاج ل 0 ل Fo الي k 0 RR 8 NAN RAPES يخ لبخت i ا ا اج 1 ال اح وشح جا لح وو ا ألا الا ست ا ا BANE nN وا 5 لل «سووو« Rd BRANES BRR REN E NAR RE حا JR A اي 994 RA RE ay Se ا Hi BS Ba RE 2 ER RR 3 1 ا x a yg _y 3 : Ferber I ا ل الت ل ٍ " Rb irae Betis Lom Ky RRA) ER 2 ER BL RO SET : ا ين Gof PE REAR AAAI ال جح a ل er ee الجديييتتيييي ال ae | sa a a a a ag 5 3 sts ———— ETRE TIN 0500000: | 2 iy es ANNAN 5 Sg 3 1 كا : عيب 5 i
3 CIE SE 2 . لخ جع ا ب bead 0 ET A ١ 0 هن | Rat IE Eee :
“od” Yd 0 ا ا ل SE ERE ER SEs: ia WN R'E iN IF IB
3 | I ٍْ | it IR IB IB IB IB NET RIE iN Ii HNN IR IR ER FT a a a بي عي A aL & 221 شكا بو 8 by ل ا ب ol 0 ا re rh RET اخ Act RNA لاز للها تلا SHINS لل SRN mRNA SUA SATE ANNE Sana الا HAGE SAAN BAY laa wy gn DPSS em-———— 3 ا ا 1 ا LL Na LL En oC gee Gre Be 8 Had ON ا ا ام ا ات اد ا اا or ااا Weel لا WI 2 LL] ل ee 8 ااا SERA TEETER ETE... SERIE he د؟١ مكل -
“a pe A ELTA Bar.
ME Cs st Ty ALEVE المج لاا تا ااا RE A IR جد ل لاا اناي ااا ا TRO لدي IR اا 8: A © 0 EA ماي ال م حا Na CR CD 2 ا ANAT AE سح ا ا لا ا مجع مح ا H ددا الا I نسدد مسمس سوم : REG SR Rr A VIE wiv sss nr Sa SE الت لد ححا تن ل ان 8 : 2 5 لاا اج لصتا 5 ¥ 2 8 م مح Ea aa: : : :اس اماه مج اجاج احج ا H H : H § RR al sa ١ H : 3 PAIN RARE ® 8 3 : H i DESTINO * 3 H : i RE _ ESE الإ : 0:0: |: 0340 4 ا NERS * 3 H : H حت ا i i i Bi ; i 8 ست الم لح ا ا TW 3 H : 3 ا RENCE ERRATA § H H § ; i i EE ty 8 8 : جد اجا ا اي Hy Hy H 3 : 1 HS PENSE Ra iia alate 3 K 3 H Ce, Np cad nL 3 Ie 8 : 3 ¥ TE Ben den B nnd FOTIA 1007 FI ; i 8 SRI TONE 8 8 ee 5 ب v a - ey RB MN kl Forde ringed Nod 3 3 + a RRR H 3 8 3 : 8 8: لان معي AE الي 6 , 5 £5 انه » بارع ص SO ل ب Xs i of SX a 0 i ian Rd a FR : 3 STIRS NN عد ياج دجا 1 Kg 1 0 : ل كا ات ل ات ا ل ا aka: sar تيب سيم Mt ل i RHA WIT PRCT TALE, ١ اسح سيم سس i FEATS A NN AN H ALTRI NIKO RAVAN, اميس يست سي i i تا تاج RR اليج ببست لجيجب § ARTISAN RR Ferrrosoodeeretoodovernt i i H ماسح لت جاع مم Dinca : HN 3 المت له جات رع م ا ana, i 3 3 RAT MIRE ا i 3 H H الا الات اما را ادا RRR ¥ H H 3 FURRIERS w—— : 5 i ot fo : 8 5 الم اممتجيية لمك اح ال 8 i Bi i جحي ان Chron ام : § 8 : ادي ا اد الجا ا ee يُّ bd i : H H RR REA RS نر 3 : 3 3 H PERERA الود حلم ا Ny 8 : : By حت ا A SR ا 3 3 3 + 3 الل الس لح حت H : H H اد ال ا ا ص E i i i اسمس مت د ل ا CO US SU SUS SU RVI a ا ae) RASA 2: 4 : { PS EPC ماسر Th ux + جا ا د سب م لذ Re We RE م اود Car أت N 5 هه ™ 13 SEAS CE hha I TR RRR FY الم RR ا RR 8 : : BR سس سم اتاج ا تا ارات > ١ اسح تسج حا oat: مضي ومسي coset ا ال ا ا الت 0 : £ الست سي Se. : ٌ : عا الاج ا ص : 8 : i لتك اا اا الا bh) H i ps : اواج تاناعم لع ا اي i : : 1 ب الم ححا ا ا : : i : ل هوا 0 المت و اوتا اي H : 8 ا 0 i i i § REAR TI i i : H SIREN RNR 8 : : i : امح يع سج د ا ¥ H H : : AES مما ARAL 3 H 8 : : اا الل SRS SR H 3 : H ARR ا By : i : د SON ا ا Sag MAR RY 3 3 : 8 الا ا ل i i i : RSE SE RI ERs SIN § Fi : § ا CREO ROTEL hela SO SN ON. جاجتحا انا rer 4 H i : 3 STREET Tag on a eR PR REN EA SUITE.
TUS Se 3 3 2 ا * اا ا J, aby ا BK gh BE EAA المج ا ا اس توج لام مع 0 * 3 مق جع( SE PR شكل ليه
BU SE aa الح الب ART. دي ay : TH SES ب" شح حك اس مسج اس ل اذا اك 8 8 NE Fata Rta Shon SHEE ae RoR yo EL # pen By = EJ WN ER مسح مجم ¥ MERTEN a LE 0 7 NE : 8 ل a Ss a SEAN Sa Noo FRE Ean 0 8 Nes: SL VoNE a STEEN us Se Na aE اد لعا سد wy a Eee 38S aan RA a 3 WN Es o SUNT TT ا ل ل x so » 8 ف es NG ال ل 0 ا ص ا أ يتنا تايبا امت ع دا ١ ا EA connie 3 a ع ل ايا a 3 RR sR a] م % م ع ا ; se Gi = YE] wat ب الل 3 د جك الما 8 & : + أ 0 pa FE TI 5 اال الي واي 8 gr: ® Ci ES 1 + = ie ; 3 8 2 Ra ¥ + 3 NK 8 : 3 ty #3 Fa ay Ri 3 8 ol & 0 3 5 اي ااا ال ٍ ال HRS i Fay ba i yr BE 5 i ا 8 1 i BUR & 53 3 § NEE 0% ا & د 4 753 Ny 8 HN BURR & REE 8 الا Fe HY gi BYR OB NEY : § 3 wl Fig NE LB Sd FE WE FH RUE Nia Aid SE, HEE ENE NE 53 RELL LE 3.2 # NIE NE SEN ES. > 3 CR Ra NE Tey ذا ل 3 2 NE JR 3 1 د : مد EX Sk ل ER 3 Li, of 3 3 ا ادسج لعا AE 8 1 88 Ses § Tis SE 8 5 ا ادي عسي ديدي الحا ال SORE T/A NR Aud 3 oF OF الا CT Et] & 8 i ب تيت جا NES SEs Faas Fae APP AONE أ ايل EB ا الى ا ال @ غم ال ل الا & af SRT : مودي اليا ا دي ل لج مج اق ىج ى yy SUT SRT اي EN FFE ال oF ; ¥ 8 8 اتويت Ags ل مس >“ : a EWE EE wma _ : OUD A محا Hye Xow & SE SER مستي Yd CR 0 i GE RE SRN ؟ HE f va الس HEE 8 by px HN 8 ky i A : 5 BS + 5 3 i Macy 8 ا 0 i fn ل 2 ؟ 4 food : * FEN SE 0 42 3 ; i : a $0 5 لب ا 0 ag EE 8 ب : 3 ks A H ل ا الو ‘A 8 i = © : 1 ونا حم ا اا لاا IR { ep ® ال اا امو ا ااا 5 3 مل Saw.) د ECE FH لا ae FY 0} oa . ! PRT i nd HE HI Ls eT Sy EE tid ok ال NS § 8# ل ES iy ow 3 BS ع Wn ed 3 a 2 Lo 3 Tyo ¥ = 5 H RR NTE Ue 7ض i ¥ Hy = 1. 8 #*# خخ 8 YEE ال ا { } 9 pd = 8 : الخ 5 § : a Nd Bd HS a Be ES By NS : 0 15 J ii EF ءا Sw, © 8 Ll EN i CR hat LER & Ff Rasa Sat En RE J ا i : ل a مما lied 0. ا سا دالا : 3 Cea Ta Dinan SER ا ؟ EN موي ER sae a : ؟ Er بيد ERR امجح 1 اج a Rds WES لات جو SER ¥ SE iF IC EE SEE RICE.
SI EW ا 1 1د 13 لق Re iS IE: I يي © 8 1 Sow ؟ ل - % 8 Waa 8 الا ال ...نذا © i ES H 3 a Et) 8 i RS a BR be LW 8 i RS = EY 3 ih I J .ا 3 ل 8 8 BN 4 TRAC 5 pa 3 A 8 Fea SRG SF LE سب طاسب احج اي 7 لاملا كه ا RISER ia I المح
SEE LA EE J
a. ا — AY Wa LW + : \ = a \ = \ a 3 8, a" St ا تس 0 ا تس Bh 83 و د ا لذ | ان NONE EEE = ا ١ انا 0 UN " د he Ex an 17 wa am ا © ا \ خخ 3 40# AEE BE EB EE a ا BY. nb Nl NN L \ - \ اد 0 5 #7 ا NEE 0 1د ايا الى ” ا أل اي صر Bh soy & 9 sa a . حور شكل ry اا ا ا الما ان اا 8 ان sy . ا اق ات * و A rf . “05” «#رع* 5 لس ال | اس * “op” oy “op « م ا ل سسا حول ع 8 = ها صف 86 ب i fh (3 {a دي وا شكل Yr
Se ايد fad 2k : : v3” i shRNAY الا لفقل shRNAY shRNAZ shiRN FR اماج ليا الى اير اي 5 ESE IN ا shRNAS | shRNA 1# 3 4 ET, 3 Ie fu x i i 8 Nil 1 = en ا سسا Re لالد ا الا م ل اا لل ال ات 3 7 3 Am ات SE داج NER ا الام الل تيع TE a SETS od Su k Na 8 > JR ال ىا ااا 3 ete: ماي اا ا ااا لا : ا NEA RE tk ser wy ETRE Se TA) NENA TERRY SEX ال ال NR 8 ا EER ا ل الح ل RRS ا Ra o03 ABE SER IRONT SRR 2 RSE RT : 1 bd 0 ahaa > اح اتا a و ا EN ا 8 FOREN ea NN ERIE re serena I EE i gL ¢ i SNE i AE \ NN fam NN NN AR ARNE EEN SOR THER Sa I الا it I ل Tr ا الى لت ا[ الا ا الأ 70 ل ل المع بجو جا اع 2 07 انها RETA ا الا حت To NT Te Me ل lL د THREE Sl hi i a A ) N rE Ri 3 EI B q Ys 3 nd 0 ِ ا الل 0 i كح ام Sut f shRNA J chRNA Cn pet Eia8) fF shiRNAR 3 اج اي ب لني ا ين > : اام ا نس ري FE Se A gE EE A. 1-5 NN sere Ped geet الب ا مسا م ل ل ا I ا RE 3 RE a orate ald 3 EI ب 1 i . 3 A Eri i 3 NN Re : Fa ER J & م ا J.
NN Sa : اال اع ا 0 ٍ EY PRCT FRC SE ممه iL NN LL 1 TARE : 3 Roi ال ا« ER ee ed i NS الخ doo iN CET es FO موسج و دب امج الي الا لاحي ا اه ا 3 Fon ا is ايا 1 NUR SA BT SEER ER RR aa Ff Sl الت ا الل ااا ا Ea EE ل ال ل الا 600 ا اه ا ل ل Sa : i جا اا TRE ال أب EA 8 8 الما SEER : EEN + oy Fe Ye 5 abe BE التي ست ولي ا 2 الو Way 2 1 33 a¥ كا & CERNE ما
NE ا ا 4 خا > يي ا »> ا يريت ا بن بج OW وج ع 5 ® & 3 ee 0 p * ا ْ : p 0 8 Yam ¥ > ا «#اج 2؟ #« : & & FT & 1 a By <= HE 3 fay T B be NE & pd RE # i Ye we Fw Tow 8 م ان ا موق *% *¥ : Bl Fe & {os اع i aa d N 8 الحا اي ©: 8 pS . 3 Bw 88 £3 Y Beet Td wee ay 8 ا يي ® 8 en م aoa 3 8 ا الي by cd YY EY جد 1 8 ل ia = bs <>*+* د لد ؟ FEE # احج : < » RE. by WE 3 تت 2 8 ماح ا المع Voge BOW x 3} POR ae {Sem N * * 1 ل 8 ا الم مد NRW N X RE 5 8 . wv i fo EAR الس اه ا Ea ا ا ا ا ا ا ا ا تن تتا ا ا Ee : ? 3 8 5 by £34 Foie { 3 : Yt Toa © :* ْ : 3 2 3 i HS 3 i i 8 8 الا H H 8 H N 3 3 HS H 3 3 BS 8 ج 5 i ¥ H HS 8 2 HR N H سك NN Sede ean Seder التاق de الع ا أ Se Se the hota Se de Warde الل عت لت ل ا ا ل J, م ع ع حي الاج حت كرت تح اه تح رت ل ا ge ERIN اه RR TRE و حا الو ا الود الا ا لاح هن الوا ماي ام ات دا ال لا مار ل اي ع ليك So FUR aa Past 8 LTTE XY شكل Yas 3 ge ped 33 roe SED BE wey 8 > ٍ 8 i «1 i * : Ax 4 8 > i sa® 0 1 Tr 1 8 8 ج ا ججججيع جم 8 8 م k 8 يي {a 3} > a E ¥ ; RE FES J ب i Bi ER i # NER EVE 1 50% # Ea ١ 1 8 . ل "- soning we. "> i + * hd k RR الل بين 8 a 3 اين 3 1 8 : pe FE J x3 i I TY REE : الل 8 co gan البو anal RR Fg i i «<١ od مس ف Fw ] a BEX i 1 دع Ve . 1 wade * j Aged امد د ل ل صخر hue يي بحي المع EE ١ ات واي Ta 1a Cas لي Rog ا ALYY شكل
ة 0" NR سيسم ببسيس سيبس , ¥en SY شكل J I 18 8 ب ١ ؛* ee \ 0 ٍْ SEE ET 8 بك يا x تتح حم حت يب] AAR ا \ ~ NS 0 = م با اا مستت يي اتا 363 ال Yi N X N “ge EAA a EA aa a i a Fo son k PERE] * ال == b SEE NTR ee ع ع الع _ SEE = Gh an ev ANE aN yw ELE ) ع م : 35 0 لت شكل بدي
Sam. ow XR Are Shy ل ار فنا Wi دولا
الم" ال الت ا م١
1 مستت wi . ved RE] :
—— XH : ERE ا لأ لسوت نات Ss ملل يأ : Ni i : he 8 0 + SER a 8 = wf Fo 0" 8 : اا EE aS
0 ال —— اا ١
do a EE % ie NY ; +< 1 + خض( 1 8 : Raa م
stop x 5 SRT “3 \ TE م ست الاي ا 5 : > ل" 8 ا 5 Pei 0 يا EE IE Sn اي AN NEE = f —-—
قا Cr لسكا تي ل oo ETE DE IRL سنا" ندا ا ان
Gin 3 SNE 4 “3 8 ا ا 73 8 a U3 3 تيع RN لج حي IE ل SA Wy ْ (SE £1 NE BE SW eed aaa Ey ps nasi prs Ry El BEIM لد RON § aga? Sar 5 0 تاليا #إتتتت - 1_0 ا 1 8 : 8 Ped SR i WAR A 0 ب ay : SN (IE ER LL 3 تا ا تسسا ةا EAN ل اا ET الجاع الات 7! eed TV Tera
9045 \ 97 ادن 53 ا - ل
fig ا SER EE 2 8 الس ا سح i 8 ع 3" الس ا CANNED | I oa ol الا ااا WE لت WE
IR 0 N . 5 5 2 = > 5 ٍ ب م ٍ = = BS 3 ِ
« ARC a > ١
3 م Tags Lat + 0 BY شكل
يب tas i & م« 8 k a .: ol a Ey AN FF SSF } 3 . & ص & & PN Fa \ = ل ب a 3 \ 8 oo 8 ا Ti : ل es 1 0 wor BE الس« اس * 0 N ا تدع : \ \ اس ل اه : \ \ سين CRE و اللتتاحاا Pp pe $e NR : ٍ كي اخ الى لايل ب 0 & WF oF eg OF 8 : حمق SEF 3 = 3 ht fh H i ' لقع wd by 0 wget 1 i TS Khel j B] h ل J Wao ox NTE A 4 i ha : 7 3 El * ْ كيد ا« لل ال و fees H i ER : Fa مس الا sa EE. المج ا د ا سرد و ١ AOR ميا ما الي PTT IE ا ل م لين تت WY Hae EA داس ل تجو Sg
48 أ الي ب 4 1 به 1 ا v . i i 1 8 i i { i : i N 5 8 i ES 2 ¥ i 0 i 1 i HB 3 2 2 i i Eo i § i 13 i Say ¥ #4 i i 0 i i} i 1 ل yd $5 oar dd Wo ل SAR حالاحتةة » WE لي I. N SRE see, Dey Be 0 0 0 E:T XY ERE. : wr Yeh BV es 0 3 3 N a \ i تيد 1 دا \ 8 1 ج ٍِ . \ HEE $ A ne NEN N TR 3 HN 3 N NN NN NR 8 i 1 8 الا صقر ANNE DN 8 8 Ny g . ERR Ts > 8 ES E NE 8 ® 8 pl = RAE, 5 0 i 3 0 ROE بح : ا i اي اد ال 3 ف FEE 2 4 hy 3 AE 5 $3 3 Es 3 i i PEN 13 BR 8 TERY 13 + + 8 REIN i £3 5 FIRS RE 8 bh! UN أ Ta BRL iH EN i SNE mE EL HR wa id . سج ل ل J amie ea مس Wo ا G5 as Bhs 80 8 0 ل bog AE vy Has 3 LEN Bete te Bre 3 . Bre 4+ الا ] | ٍْ 8 va “AN “(> مب ا دن | اط rs re اكه ل ل ا ل ل Toke Tr WE Tere he We ون كن ا TEE... ااا + لس -- Deas ١ ل | ER ف EE EET a ae ااا« لصي 0 السمنتسح> NORE ا السفي* ا te شكل pa ih EE قم“ So yy" pi ng ال ge اح > 1 Lh Le Pa La ا | ال ايو« د ان | alli ul Wa TE i ae TEE ا Ped : مي EE TE SC 0 ا 0 Lak FETE الال اي الل زوع " ب هيد 0 La av ب ١ ape ال وت الو يت ا ولا Sed yet ١ 5# 1 [f= Ce 4 8 : i 4 : 38# Wale IR BET اع 0 ERIN: ir اسيم يجا I اح HN 7 BS) pe ال لح مدير 1 ا ل اا ب 1 va Cv Vo ] انبا 7 Wa HI سس ع يع مسو ا I 3 اا ا LN ET 1 EE افق 0 0 لال 4 \ ; SS : . : qT \¥ i | + Adis { iy لجن سو موسا 8 F 8 FER 3 od CET ال ا rae » زا i : & iy i BG i A ! & ad iN Goa ag \ ا } : a 3 ال UES “a” : YY % شكز Nl
يي ليا ا
vy Yun A 8 8 Ao pss تيا ا« عع
TTT 3 \ wy . امسسة
pyr TE - 0 نجه 0 oil | I"
al | EE We 0 . i — 5 . 1 . Bh § | . sale Yo Ni . HET 3 0 حي Spt ا * نا لاا ged د ااا Th
LE أن
IN RY I ا
MEE | ا صقري
hg “ae” wp حرج ap"
TARY
و : 2 اج | T Be 3 88 3 Be © . ل : BN : ES ل ءا “يلا 0 : : NN ؟ 0 0 N a YN NY لا لاصف .! > PA x» LE A 2 aka Shy” “yy YA شكل
i or 013 ا اا ا لأا اا اال مل i — مو 1 oe Lotsa RR TY on A 3 باب RC جر * Bh 3 BB pate متكت جه جحي جحت ري لل ع و 1 0 Bh i ا : :. 3 جا 3 LER I Bah SE 2% ال ات 8 wr 1 انك وو ا لمش ...4 NN م © I LAAN اليل = ا ند INE LR Va no TT a "0 ¥ ل ا ا rN 2 LEN صقر ا 008 ا اا ORYAYE تيبو" hha LT RIAN to. شكلةٌ ١
WwW ed Ag ETRE 1 ا ]متت > ججح حت جع وا مستت مد ا را نما جد دن مج جو لمج لمج حي جا جر نين جحو جيرا ا اد لح اه رن د لكك« ا ل FEES REA A A A RR TE TGS SN BRA LER Bu ست كيه 1 ست ع ا ل ا ل لا ل ri ات PET Ton deine لإ ا ب TTT HEE ل HR TE ا ب RE PLR SUT LT an eddie o 4 اح ا TCR aT مو a مشر 1 3 PEPPER RRR HRS الا ا ا اا ا معدي ل مد 8 لك بم ةا نجنا اكد لماعت للد ا ا eae TN FA TON TRAIT RTT بر ري Adige 1 ا ؟ ٠ شكل راطم ا م 0 a كن كنآ أل a م اج الج ادك ارح اليد الاك الح ال ل : es ed الا Ll ام لات سس ااا ا ل سو ا ا ب حي Ag } nd 3 ا 3 H SS RR RN sina - : : : FF FS & & & Ee & م ا الما ماق ةك Ag : - LRAT
لاله الهيلة السعودية الملضية الفكرية ا Sued Authority for intallentual Property RE .¥ + \ ا 0 § 8 Ss o + < م SNE اج > عي كي الج TE I UN BE Ca a ةا ww جيثة > Ld Ed H Ed - 2 Ld وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها of سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. Ad صادرة عن + ب ب ٠. ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > فهذا ص ب 101١ .| لريا 1*١ v= ؛ المملكة | لعربية | لسعودية SAIP@SAIP.GOV.SA
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461984247P | 2014-04-25 | 2014-04-25 | |
US201462066783P | 2014-10-21 | 2014-10-21 | |
PCT/US2015/027527 WO2015164750A2 (en) | 2014-04-25 | 2015-04-24 | Compositions and methods to treating hemoglobinopathies |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SA516380143B1 true SA516380143B1 (ar) | 2020-05-14 |
Family
ID=54333430
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SA516380143A SA516380143B1 (ar) | 2014-04-25 | 2016-10-25 | تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US10287588B2 (ar) |
EP (2) | EP3598984B1 (ar) |
JP (2) | JP6514717B2 (ar) |
KR (1) | KR102390629B1 (ar) |
CN (2) | CN106794260B (ar) |
AU (1) | AU2015249381B2 (ar) |
BR (1) | BR112016024565A2 (ar) |
CA (1) | CA2946309C (ar) |
DK (1) | DK3134130T3 (ar) |
ES (1) | ES2744186T3 (ar) |
IL (1) | IL248469B (ar) |
MX (1) | MX2016013832A (ar) |
RU (1) | RU2707540C2 (ar) |
SA (1) | SA516380143B1 (ar) |
SG (2) | SG10201809290SA (ar) |
WO (1) | WO2015164750A2 (ar) |
ZA (1) | ZA201607540B (ar) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK2925864T3 (en) | 2012-11-27 | 2019-02-11 | Childrens Medical Ct Corp | DIRECTIONAL TARGETING OF DISTANT BCL11A CONTROLS FOR FETAL HEMOGLOBIN REINUCTION |
CA2946309C (en) | 2014-04-25 | 2021-11-09 | Michael MILSOM | Synthetic bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies |
WO2016182917A1 (en) | 2015-05-08 | 2016-11-17 | Children's Medical Center Corporation | Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction |
CA3009727A1 (en) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Novartis Ag | Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
WO2017156015A2 (en) * | 2016-03-07 | 2017-09-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Micrornas and methods of their use |
EP3526319A4 (en) | 2016-10-14 | 2020-07-29 | Children's Medical Center Corporation | METHOD AND COMPOSITIONS AND FOR TREATING DISEASES AND DISORDERS OF THE CENTRAL VENTILATION SYSTEM |
AU2018210853B2 (en) | 2017-01-17 | 2023-09-28 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for treating lysosomal storage diseases and disorders |
WO2018136434A1 (en) | 2017-01-17 | 2018-07-26 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for diagnosing and treating peroxisomal diseases |
TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
WO2018183692A1 (en) * | 2017-03-29 | 2018-10-04 | Bluebird Bio, Inc. | Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies |
US11261441B2 (en) * | 2017-03-29 | 2022-03-01 | Bluebird Bio, Inc. | Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies |
US11788087B2 (en) | 2017-05-25 | 2023-10-17 | The Children's Medical Center Corporation | BCL11A guide delivery |
WO2018220211A1 (en) * | 2017-06-02 | 2018-12-06 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Viral vector combining gene therapy and genome editing approaches for gene therapy of genetic disorders |
US10648728B2 (en) | 2017-09-29 | 2020-05-12 | Nxp Usa, Inc. | Multifunctional radio frequency systems and methods for UV sterilization, air purification, and defrost operations |
CN109722415B (zh) * | 2017-10-27 | 2021-01-26 | 博雅辑因(北京)生物科技有限公司 | 一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培养方法 |
BR112020011255A2 (pt) * | 2017-12-05 | 2020-11-24 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | células-tronco e progenitoras hematopoiéticas cd34+ humanas modificadas por crispr-cas9 e usos das mesmas |
WO2019213013A1 (en) * | 2018-05-02 | 2019-11-07 | The Children's Medical Center Corporation | Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies |
EP3942046A1 (en) * | 2019-03-22 | 2022-01-26 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Bifunctional vectors allowing bcl11a silencing and expression of an anti-sickling hbb and uses thereof for gene therapy of b- hemoglobinopathies |
WO2021067613A1 (en) * | 2019-10-01 | 2021-04-08 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis |
KR20230023612A (ko) | 2020-04-02 | 2023-02-17 | 마이레큘, 인크. | 조작된 올리고뉴클레오티드를 사용한 표적화된 억제 |
US20240279657A1 (en) * | 2021-06-16 | 2024-08-22 | Duke University | Compositions and methods for the prevention and treatment of hemoglobinopathies |
CN114990164B (zh) * | 2022-06-16 | 2023-12-05 | 北京大学 | 中介体复合物亚基抑制剂及其应用 |
Family Cites Families (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5061620A (en) | 1990-03-30 | 1991-10-29 | Systemix, Inc. | Human hematopoietic stem cell |
US5635387A (en) | 1990-04-23 | 1997-06-03 | Cellpro, Inc. | Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors |
AU671450B2 (en) | 1992-03-20 | 1996-08-29 | Baylor College Of Medicine | A DNA transporter system and method of use |
US5460964A (en) | 1992-04-03 | 1995-10-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for culturing hematopoietic cells |
US5409813A (en) | 1993-09-30 | 1995-04-25 | Systemix, Inc. | Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations |
US5677136A (en) | 1994-11-14 | 1997-10-14 | Systemix, Inc. | Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof |
US5928638A (en) | 1996-06-17 | 1999-07-27 | Systemix, Inc. | Methods for gene transfer |
US8101349B2 (en) * | 1997-12-23 | 2012-01-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells and their methods of use II |
FR2777909B1 (fr) | 1998-04-24 | 2002-08-02 | Pasteur Institut | Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex |
EP1076715B1 (en) | 1998-05-13 | 2007-07-18 | Genetix Pharmaceuticals Inc. | Lentiviral packaging cells |
CZ308053B6 (cs) | 2000-12-01 | 2019-11-27 | Max Planck Gesellschaft | Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití |
DK2284266T3 (da) | 2002-11-14 | 2014-01-13 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53 |
ES2348868T3 (es) | 2002-12-13 | 2010-12-16 | Genetix Pharmaceuticals Inc. | Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica. |
KR20070085113A (ko) | 2004-05-11 | 2007-08-27 | 가부시키가이샤 알파젠 | Rna간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 이용한유전자발현억제 방법 |
EP2479285B1 (en) * | 2006-01-05 | 2014-05-14 | The Ohio State University Research Foundation | MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers |
US20080051431A1 (en) | 2006-05-26 | 2008-02-28 | Dominique Verhelle | Methods and compositions using immunomodulatory compounds in combination therapy |
US9051391B2 (en) | 2007-06-11 | 2015-06-09 | Takara Bio Inc. | Method for expression of specific gene |
GB0713183D0 (en) | 2007-07-06 | 2007-08-15 | King S College London | Method |
WO2010030963A2 (en) | 2008-09-15 | 2010-03-18 | Children's Medical Center Corporation | Modulation of bcl11a for treatment of hemoglobinopathies |
US20110294114A1 (en) | 2009-12-04 | 2011-12-01 | Cincinnati Children's Hospital Medical Center | Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells |
EP2509418A4 (en) | 2009-12-08 | 2013-03-20 | Hemaquest Pharmaceuticals Inc | METHODS AND REGIMES AT LOW DOSE FOR TREATING RED GLOBULAR DISORDERS |
EP3502254A1 (en) | 2010-04-23 | 2019-06-26 | Cold Spring Harbor Laboratory | Novel structurally designed shrnas |
GB201012420D0 (en) * | 2010-07-23 | 2010-09-08 | Univ Erasmus Medical Ct | Foetal heamoglobin inhibitor |
WO2012073047A2 (en) | 2010-12-03 | 2012-06-07 | Genome Research Limited | Compositions and methods |
EP2648763A4 (en) * | 2010-12-10 | 2014-05-14 | Alnylam Pharmaceuticals Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR EXPRESSION INHIBITION OF GENES KLF-1 AND BCL11A |
WO2012170911A2 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Bluebird Bio, Inc. | Gene therapy vectors for adrenoleukodystrophy and adrenomyeloneuropathy |
KR102011532B1 (ko) | 2011-09-30 | 2019-08-16 | 블루버드 바이오, 인코포레이티드. | 개선된 바이러스 형질도입을 위한 화합물 |
ES2641840T3 (es) | 2012-02-24 | 2017-11-14 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Composiciones y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías |
US10174315B2 (en) | 2012-05-16 | 2019-01-08 | The General Hospital Corporation | Compositions and methods for modulating hemoglobin gene family expression |
DK2800811T3 (en) | 2012-05-25 | 2017-07-17 | Univ Vienna | METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION |
DK2925864T3 (en) | 2012-11-27 | 2019-02-11 | Childrens Medical Ct Corp | DIRECTIONAL TARGETING OF DISTANT BCL11A CONTROLS FOR FETAL HEMOGLOBIN REINUCTION |
KR20150105633A (ko) | 2012-12-12 | 2015-09-17 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작 |
WO2014093965A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Case Western Reserve University | Genomic rna packaging enhancer element |
CN116083487A (zh) | 2013-05-15 | 2023-05-09 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于治疗遗传病状的方法和组合物 |
WO2015065964A1 (en) | 2013-10-28 | 2015-05-07 | The Broad Institute Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof |
PL3492593T3 (pl) | 2013-11-13 | 2022-04-19 | Children's Medical Center Corporation | Regulacja ekspresji genów, w której pośredniczą nukleazy |
EP3981876A1 (en) | 2014-03-26 | 2022-04-13 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
SG10201809379UA (en) | 2014-04-25 | 2018-11-29 | Bluebird Bio Inc | Mnd promoter chimeric antigen receptors |
EP3134434A4 (en) | 2014-04-25 | 2017-10-25 | Bluebird Bio, Inc. | Kappa/lambda chimeric antigen receptors |
CA2946309C (en) | 2014-04-25 | 2021-11-09 | Michael MILSOM | Synthetic bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies |
EP3160980B1 (en) | 2014-05-28 | 2020-05-20 | The Regents of the University of California | HYBRID tRNA/pre-miRNA MOLECULES AND METHODS OF USE |
SG11201704727WA (en) | 2014-12-12 | 2017-07-28 | Bluebird Bio Inc | Bcma chimeric antigen receptors |
WO2016182893A1 (en) | 2015-05-08 | 2016-11-17 | Teh Broad Institute Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof |
EP3294879A4 (en) | 2015-05-14 | 2019-02-20 | University of Southern California | OPTIMIZED GENETIZATION WITH A RECOMBINANT ENDONUCLEASE SYSTEM |
CN108136014A (zh) | 2015-08-31 | 2018-06-08 | 蓝鸟生物公司 | 抗唾液酸tn嵌合抗原受体 |
GB201522243D0 (en) | 2015-12-16 | 2016-01-27 | Ucl Business Plc | Treatment |
EP3414321B8 (en) | 2016-02-12 | 2023-05-03 | bluebird bio, Inc. | Vcn enhancer compositions and methods of using the same |
WO2017173092A1 (en) | 2016-03-31 | 2017-10-05 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome editing in zygotes |
US11788087B2 (en) | 2017-05-25 | 2023-10-17 | The Children's Medical Center Corporation | BCL11A guide delivery |
-
2015
- 2015-04-24 CA CA2946309A patent/CA2946309C/en active Active
- 2015-04-24 DK DK15783357.5T patent/DK3134130T3/da active
- 2015-04-24 KR KR1020167032986A patent/KR102390629B1/ko active IP Right Grant
- 2015-04-24 WO PCT/US2015/027527 patent/WO2015164750A2/en active Application Filing
- 2015-04-24 CN CN201580034344.7A patent/CN106794260B/zh active Active
- 2015-04-24 JP JP2016564251A patent/JP6514717B2/ja active Active
- 2015-04-24 MX MX2016013832A patent/MX2016013832A/es active IP Right Grant
- 2015-04-24 BR BR112016024565-2A patent/BR112016024565A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-04-24 SG SG10201809290SA patent/SG10201809290SA/en unknown
- 2015-04-24 CN CN202110147261.6A patent/CN112852812A/zh active Pending
- 2015-04-24 RU RU2016145964A patent/RU2707540C2/ru active
- 2015-04-24 US US15/306,527 patent/US10287588B2/en active Active
- 2015-04-24 AU AU2015249381A patent/AU2015249381B2/en active Active
- 2015-04-24 SG SG11201608482UA patent/SG11201608482UA/en unknown
- 2015-04-24 ES ES15783357T patent/ES2744186T3/es active Active
- 2015-04-24 EP EP19179502.0A patent/EP3598984B1/en active Active
- 2015-04-24 EP EP15783357.5A patent/EP3134130B1/en active Active
-
2016
- 2016-10-25 IL IL248469A patent/IL248469B/en active IP Right Grant
- 2016-10-25 SA SA516380143A patent/SA516380143B1/ar unknown
- 2016-11-01 ZA ZA2016/07540A patent/ZA201607540B/en unknown
-
2019
- 2019-03-27 US US16/366,900 patent/US10662429B2/en active Active
- 2019-04-12 JP JP2019076242A patent/JP6713073B2/ja active Active
-
2020
- 2020-04-06 US US16/841,259 patent/US11124794B2/en active Active
-
2021
- 2021-08-17 US US17/404,576 patent/US11739329B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SA516380143B1 (ar) | تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين | |
KR101793615B1 (ko) | 유전자 벡터 | |
BR112020018364A2 (pt) | Sistemas e métodos para o tratamento de hemoglobinopatias | |
EP3088526B1 (en) | Use of mirna-214 inhibitor in inhibiting regulatory t cells | |
Johansson et al. | Hematopoietic stem cell–targeted neonatal gene therapy reverses lethally progressive osteopetrosis in oc/oc mice | |
CN102438631A (zh) | 抗hiv干细胞及其用途 | |
US11566226B2 (en) | Natural killer cells | |
US20210085707A1 (en) | Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies | |
WO2014200557A1 (en) | Method of increasing the amount of fetal hemoglobin in a cell and/or mammal | |
US20150283164A1 (en) | Treatment of Myelodysplastic Syndrome by Inhibition of NR2F2 | |
WO2023081003A1 (en) | Constructs comprising tandem microrna-adapted short hairpin rna (shmir) for increasing fetal hemoglobin | |
NZ726792B2 (en) | Compositions and methods to treating hemoglobinopathies | |
Wang | Alternatively Spliced CSF3R in Human Health and Disease | |
EP3301175A1 (en) | Means and methods for mobilizing hematopoietic stem cells (hscs) |