SA516380143B1 - تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين - Google Patents

تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين Download PDF

Info

Publication number
SA516380143B1
SA516380143B1 SA516380143A SA516380143A SA516380143B1 SA 516380143 B1 SA516380143 B1 SA 516380143B1 SA 516380143 A SA516380143 A SA 516380143A SA 516380143 A SA516380143 A SA 516380143A SA 516380143 B1 SA516380143 B1 SA 516380143B1
Authority
SA
Saudi Arabia
Prior art keywords
cells
cell
sequence
aaa
expression
Prior art date
Application number
SA516380143A
Other languages
English (en)
Inventor
ريشارد جريجورى
مايكل ميلسون
ديفيد ايه ويليامز
Original Assignee
ذا شيلدرينس ميديكال سينتير كوربورشن
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ذا شيلدرينس ميديكال سينتير كوربورشن filed Critical ذا شيلدرينس ميديكال سينتير كوربورشن
Publication of SA516380143B1 publication Critical patent/SA516380143B1/ar

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

تقدم النماذج هنا MicroRNAs تخليقية مصممة خصيصا تستهدف BCL11A للتعبير عن بوليمراز polymerase RNA II، وطرق استخدام لعلاج أمراض الهيموجلوبين hemoglobinopathies مثل مرض الخلية المنجلية sickle cell disease أو ثلاسيميا thalassemia بواسطة زيادة مستويات التعبير عن مستويات الهيموجلوبين الجنيني fetal hemoglobin. شكل2

Description

تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين ‎COMPOSITIONS AND METHODS TO‏ ‎TREATING HEMOGLOBINOPATHIES‏ الوصف الكامل خلفية الاختراع هذا الطلب عبارة عن طلب دولي يطالب بالمنفعة بموجب المادة 35 من قانون الولايات المتحدة 5 9ه ) للطلب الأمريكي المؤقت رقم 984247/61؛ المودع في 25 إبريل 2014؛ والطلب الأمريكي المؤقت رقم 066783/62؛ المودع في 1 أوكتوير 2014 وقد تم دمج محتوباتها كل من هذه الطلبات هنا بالإشارة إليها كمرجع. تم تنفيذ هذا الاختراع بواسطة دعم حكومي وفقا للمنحة رقم: ‎SUOIHLI17720-03‏ ‏المقدمة بواسطة المؤسسات الصحية الوطنية. تتمتع الحكومة بحقوق معينة في الاختراع. تتعلق النماذج المكشوف عنها بتركيبات وطرق لعلاج أمراض_ الهيموجلوبين ‎.hemoglobinopathies‏ بشكل أكثر ‎dass‏ تتعلق النماذج بتركيبات وطرق لزيادة هيموجلوبين 0 جنيني ‎fetal hemoglobin‏ في خلية ‎cell‏ بواسطة استبعاد انتقائي ل 801117 داخلي. أمراض الهيموجلويين» ‎Ald‏ مرض الخلية المنجلية/أنيميا ‎sickle cell‏ 38 (500) وثااسيميا ‎¢(THAL) thalassemia‏ هي من بين أكثر الاضطرابات أحادية ‎monogenic disorders (pall‏ المنتشرة في البشر. تقريبا 75 من سكان العالم يحملون تطفر جين جلوبيين ‎globin gene‏ تقدر منظمة الصحة العالمية أن هناك حوالي 5 300000 طفل تتم ولادتهم كل عام مصابين باضطرابات هيموجلويين ‎hemoglobin‏ ‏65 أساسية. تم عزل مرض الخلية المنجلية إلى مجموعات من الصحراء الكبرى الإفريقية؛ الهند؛ المملكة العربية السعودية؛ ودول حوض البحر الأبيض المتوسط حيث هناك ما يصل إلى 2 من كل الأطفال يولدون بأمراض» بسبب ميزة النجاة من أمراض الملاريا ‎malarial‏ المنقولة بواسطة تطفر ]-جلويين منجلي لزيجوت غير متجانس ‎heterozygous sickle globin‏ ‎WHO Report on Sickle-cell anaemia - A59.9. Fifty-ninth World ) (8S) 0‏ ‎Health Assembly — Provisional agenda item 114: United Nations; 2006:1-‏
5). بسبب الهجرة التاريخية و/أو الحالية؛ كانت الزيادة في أعداد مجموعات المرضى التي يمكن أن تكون موجودة في الدول المتقدمة؛ ومضاعفات الصحة العامة لمرض الخلية المنجلية كبيرة ‎Kauf et al., American Journal of Hematology. 2009;84:323-327; (‏ ‎Amendah et al., American Journal of Preventive Medicine.‏ 2010;38:8550-556(. في الولايات المتحدة الأمريكية؛ تم تقدير متوسط البقاء للمرضى المصابين بمرض هيموجلوبين ‎hemoglobinopathy‏ في 1994 بأنه يبلغ 42 سنة للرجال و48 سنة للنساء (-330:1639 ;1994 ‎Platt et al., New England Journal of Medicine.‏ 1644( عند نسبة جزيئية؛ كان مرض الخلية المنجلية هو المرض الأول الذي سيرتبط ببديل جزيئي (1949:110:543-548 ‎al., Science.‏ ]© 009ا080). يؤدي التطفر النيكلوتيدي 0 الفردي إلى تحويل حمض جلوتاميك ‎glutamic acid‏ إلى استبدال فالين ‎valine‏ عند الموضع 6 من بروتين (]-جلوبين ‎protein‏ 8-910510. يؤدي هذا التعديل في بلمرة الجزيء في ظروف منزوعة الأوكسجين» و"التمنجل" التالي للكرية الحمراء ‎erythrocyte‏ التي تؤدي بشكل مطلق إلى ‎anemia Lu‏ بواسطة انحلال الدم والمضاعفات الحادة ومضاعفات وعائية-نقص تروية مزمنة ودماغية ‎ig‏ على العديد من الأعضاء؛ شاملة الكلى ‎kidney‏ الدماغ ‎brain‏ الرئة ‎dung‏ ‎(les 5‏ على الرغم ‎ge‏ أن ‎ual‏ الوقائية (شاملة العامل الكيماوي الوقائي ‎chemoprophylactic agent‏ هيدروكسي ‎(hydroxyurea Ls‏ التي أدت إلى تقليل منتوسط في حمل مجموعات المرضى المختارين؛ في الوقت الحالي؛ الدواء العلاجي المتاح لمرض ‎LIAN‏ ‏المنجلية ‎Ble‏ عن زراعة خلية جذعية خيفية مكونة للدم ‎allogeneic hematopoietic stem‏ ‎Hsieh et al., New England Journal of ) (HSCT) cell transplantation‏ ‎Electronic pre-.JiMedicine. 2009;361:2309-2317; Hsieh et 8. 20‏ ; ‎«(publication June 31, 2011‏ ترتبط خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا لسوء الحظ بأوضاع مرض الخلية المنجلية ‎Landy‏ مع وجود أمراض ووفيات؛ والتي تكون جزئيا عبارة عن حمل حديد متعلق بنقل خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا أولي» مرض عائل في مقابل الطعمة؛ وجرعات عالية
من العلاج الكيماوي/الإشعاع المطلوب من أجل الزراعة الأولية للعائل» من بين أشياء أخرى. هناك علاجات جزيئية جديدة تم تطويرها. مثلاء تقوم براءة الاختراع الأمريكية رقم: 4 بوصف 801118 كمنظم أساسي لجينات جلويين ‎globin genes‏ أثناء التطوير.
‎class‏ تقوم 801117 بتعزيز التحويل الانتقالي من التعبير عن جينات هيموجلويين جنيني ‎fetal hemoglobin genes‏ إلى التعبير عن تطوير جينات هيموجلويين بالغة ‎adult‏ ‎hemoglobin genes‏ أثناء التطور الجنيني. يقوم قمع ,801-117 بتقليل هذا التحويل ‎SEY)‏ ‏ويحافظ بشكل أساسي على التعبير الأعلى عن جينات هيموجلوبين جنيني بعد التطور الجنيني. تقوم الكمية الأعلى من جينات هيموجلوبين جنيني الذي يتم التعبير عنه بتخفيف الأعراض المرتبطة بأمراض الهيموجلوبين المختلفة. الوصف العام للاختراع في النماذج التوضيحية المحددة؛ قام الاختراع الحالي؛ ‎(Lida‏ بتطوير تركيبات وطرق لتحقيق علاج جيني في خلايا مكونة للدم ‎hematopoietic cells‏ وخلايا كاشفة مكونة للدم ‎hematopoietic‏ ‎alls precursor cells 0‏ كريات الدم الحمراء ‎WAN erythrocytes‏ الأساسية الحمراء ‎erythroid progenitors‏ والخلايا الجذعية الجنينية ‎.embryonic stem cells‏ يقدم الاختراع أيضا طرق علاج جيني محسنة لعلاج اضطرابات مرتبطة بمكونات الدم. الهدف هو استبعاد 801117 بفاعلية في خلايا مشتفة من خلايا جذعية مكونة للدم ‎hematopoietic stem cells‏ محولة قابلة للتطعيم. سوف يزيد النجاح عند حث /-جلويين ‎©—globin 5‏ وبالتالي تكون هناك زيادة آنية في ‎HBF‏ وتقليل في ‎HBS‏ تعتمد على التقليل الكمي نسخة 8011/8 وبروتين. وقد أشار المخترعون إلى أن ‎shRNA‏ 801118 في حلقة 3 . يسمح هذا المنهج ل ‎ob 8011178 shRNA‏ يتم تحوبله عبر معززات بوليمراز ‎polymerase ١١ ١١ (Poll)‏ بدلا من معززات بوليمراز ‎WIT‏ وهذا يسمح باستغلال مسار التخليق الحيوي ‎microRNA‏ لتوليد ‎SIRNAS‏ الذي يستهدف التعبير عن 8011178 في ‎WA‏ جذعية 0 مكونة للدم ‎(HSCs) hematopoietic stem cells‏ قابلة للتطعيم. يتم تصميم الجينات المتحورة البطيئة للتعبير عن ‎ShRNAs‏ التي تحاكي ‎microRNAs‏ أساسي (ما قبل ‎(MIRNAs‏ وتتم معالجتها بالتالي بواسطة المعالج معقدات ‎Microprocessor and Dicer‏ لتوليد ‎RNAs‏ ‏متداخلة صغيرة ‎(SIRNAS)‏ مع متوالية مكملة ل رنا ‎RNA‏ مرسل ل ‎(MRNA) BCL11A‏ في أحد الجوانب؛ يتم توفير تركيبات وطرق تقوم باستبعاد 801117 بشكل فعال في 5 خلايا مشتقة من خلايا جذعية مكونة للدم محولة قابلة للتطعيم. في أحد النماذج؛ يقوم التقليل
الكمي لنسخة 8011178 وبقوم البروتين بحث إنتاج 7(-جلوبين ‎cy—globin‏ وبالتالي تقوم الزيادة الآنية في ‎HBF‏ والتقليل في ‎HDS‏ المتطفرة. في نموذج معين؛ يتم دمج ‎ShRNA‏ 861117 في حلقة ‎.MIR223‏ في نماذج معينة؛ يتم تصميم فيروس بطيء ‎lentivirus‏ للتعبير عن ‎ShRNAs‏ ‏تحاكي ‎miRNAs‏ أولية والتي تتم معالجتها بالتالي بواسطة معقدات 800 ‎Microprocessor‏ ‎Dicer 5‏ الداخلية لتوليد ‎SIRNAS‏ مع متوالية مكملة ل ‎.BCL11A mRNA‏ بالتالي؛ .في العديد ‎ge‏ النماذج التوضيحية؛ يقدم الوصف ‎dal‏ جزثياء ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي يتضمن ‎gia‏ 8011178 أول» جزء حلقي» ‎gia‏ 8011178 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5” إلى 53 حيث ‎gall‏ الحلقي ‎segment‏ 1000 موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بأجزاء 801118 الأول ‎Sly‏ وحيث ‎gia‏ 861118 الثاني مكمل لجزء ‎BCLIIA 0‏ الأول بحيث تكون أجزاء 801118 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية ‎hairpin loop‏ مع الجزء الحلقي الذي يكون ‎endl‏ الحلقي للحلقة الدبوسية الذي تم تكوينه بالتبعية. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء ‎shal‏ ‏8011178 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات ‎nucleotides‏ جزءِ ‎BCL11A‏ ‏5 الأول مشتق من متوالية 80611178 ويؤدي إلى الجديلة المرسلة أثناء معالجة ‎ShRNA‏ إلى ‎SIRNA‏ مزدوج ‎ging‏ 861118 الثاني مكمل لجز 861118 أول؛ حيث ‎sa‏ 8611/8 الثاني يؤدي إلى الجديلة الموجهة التي يتم دمجها في معقد انتقائية التداخل حلا ‎RNA‏ ‎(RISC) Interference Specificity Complex‏ ل ‎RNA (alas‏ أو إسكات جين ‎BCL11A‏ ‏في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء تحتوي ‎shal‏ ‎BCLITA 0‏ الأول والثاني على متواليات مشتقة من متوالية ‎.BCL11A mRNA‏ في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء يبدأ جزء 801118 الأول ب -666©0- عند الطرف 5” وينتهي ‎ga‏ 8011178 الثاني ب -6060- عند الطرف 3 . في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMiCroRNA‏ التخليقي موضح هناء يتكون جزء 801118 الأول ‎Lad‏ من -666©0- عند الطرف 5” وينتهي ‎ga‏ 8011178 الثاني ب - ‎~GCGC‏ عند الطرف 3” .
في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء يبدأ جزء ‎BCL11A‏ الأول ب ‎-GCGA-‏ . -1016- أو -16- عند الطرف 5 ‎sis‏ 861118 الثاني مكمل لجز 8611/7 أول. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMiCroRNA‏ التخليقي موضح هناء يتكون جزء ‎Lad JNIBCLIIA 5‏ من ‎«—-TCTG- . -GCGA-‏ أو -1©6- عند الطرف 5” . في أحد النماذج وفقا لأي من 8ل801111/10005 التخليقي موضح هناء ينتهي جزء 801118 الثاني ب -1111- عند الطرف 3 . في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎(ba‏ يتضمن ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي متوالية نيكلوتيد ‎sequence‏ 0110160006 مختارة من المجموعة 0 المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:.13-1 44-25. في أحد النماذج وفقا لأي من .8ل861111/10008_التخليقي موضح هناء ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي يتضمن متوالية نيكلوتيد أو ‎gia‏ منها الموضح في هذا الكشف. في أحد النماذج ‎Gy‏ لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎(ba‏ يتكون ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1» 44-25. في أحد النماذج ‎Gy‏ لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎(ba‏ يتكون ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي بشكل أساسي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم 1:48 -18-10¢13 44-25. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء يتم اختيار 0 جزءِ 801118 الأول من المجموعة المكونة من ‎CGCACAGAACACTCATGGATT‏ ‏(متوالية بهوية رقم: 46؛ ‎Gude‏ من 0141© 801118 أوليجو موضحة ‎(Wa‏ ‎CCAGAGGATGACGATTGTTTA‏ (متوالية بهوية رقم: 47؛ مشتق من 8611178 00142 أوليجو موضحة هنا) ‎TCGGAGACTCCAGACAATCGC‏ (متوالية بهوية رقم: 48؛ ‎Gide‏ ‏من ‎E3‏ 8611 أوليجو أو ‎shRNA1‏ أو ‎E3‏ موضحة ‎(be‏ ‎(CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC 5‏ (متوالية بهوية رقم: 49؛ مشتق من ‎ShRNA2‏ أو 5 موضحة ‎TCAGGACTAGGTGCAGAATGT (lia‏ (متوالية بهوية رقم: 50؛ ‎Gide‏
من 90884 أو 811 موضحة ‎TTCTCTTGCAACACGCACAGA «(Us‏ (متوالية بهوية رقم: 51؛ مشتق من ‎D8‏ 801118 أوليجو أو ‎ShRNA3‏ أو 08 موضحة ‎(We‏ ‎GATCGAGTGTTGAATAATGAT‏ (متوالية بهوية رقم: 52؛ مشتق من ‎ShRNAS‏ أو 0 ااه 012 موضحة ‎CAGTACCCTGGAGAAACACAT (lia‏ (متوالية بهوية رقم: 53؛ مشتق من ‎ShRNAS‏ أو 5055 موضحة هنا ‎CACTGTCCACAGGAGAAGCCA‏ ‏(متوالية بهوية رقم: 54؛ ‎Gude‏ من ‎shRNAT‏ أو 50811 موضحة ‎(ba‏ ‎ACAGTACCCTGGAGAAACACA‏ (متوالية بهوية رقم: 55؛ مشتق من 801118 ‎shRNAS XLC4‏ و5004 مروضحة هنا ‎CAACAAGATGAAGAGCACCAA‏ (متوالية بهوية رقم: 56؛ ‎Gude‏ من أوليجو غير مستهدفة ‏ ل 801118 موضحة هنا)؛ ‎gcgcCGCACAGAACACTCATG 0‏ (متوالية بهوية رقم: 57؛ مشتق من 0114165 أوليجو موضحة ‎GCGCTCGGAGACTCCAGACAA «(la‏ (متوالية بهوية رقم: 58؛ مشتق من 65 أو ‎mod sid‏ 53 أو ‎ shRNAImod‏ موضحة هنا)ء ‎gegcCCTCCAGGCAGCTCAAA‏ (متوالية بهوية رقم: 59؛ مشتق من 8565 أو ‎ShRNA2mod‏ موضحة هنا)؛ 6086/58 1 969010866801866 (متوالية بهوية رقم: 5 60؛ مشتق من 165 أو ‎shRNAdmod‏ موضحة | هنا)؛ ‎gCGCGATCGAGTGTTGAATAA‏ (متوالية بهوية رقم: 61؛ ‎ide‏ من 5001265؛ 4 أو 90811850000 موضحة هنا)؛ ‎gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC‏ (متوالية بهوية رقم: 62؛ مشتق من 5085650 50186000 موضحة هنا)؛ ‎gegcCACTGTCCACAGGAGAA‏ (متوالية بهوية رقم: 63؛ مشتق من 5081165 أو 0 9080827000 موضحة هنا)؛ ‎GCGCTTCTCTTGCAACACGCA‏ (متوالية بهوية رقم: 4؛ ‎Gide‏ من 0865 80118 أو ‎mod‏ 08 أو ‎shRNA3mod‏ موضحة هنا)ء ‎GCGCACAGTACCCTGGAGAAA‏ (متوالية بهوية رقم: 65؛ مشتق من 801118 ‎«C4G5‏ أو ‎mod‏ 04 أو ‎ ShRNASmMod‏ موضحة هنا)؛ ‎CGCACAGAACACTCATGGATT‏ (متوالية بهوية رقم: $66 مشتق من 801118 5 01265-2 موضحة ‎ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT 4 (la‏ (متوالية بهوية
رقم: 67؛ مشتق من 01265-2 801118 موضحة هنا).
في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء ‎gall‏ الحلقي مشتق من ‎-MicroRNA‏ في أحد النماذج» ‎MicroRNA‏ عبارة عن ‎microRNA‏ انتقائي لمكونات الدم. ‎.MiR-223 3 014-181 «MiR-155 ¢MiR-142 Sli‏
في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎microRNA la‏
عبارة عن 4223 01.
في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء ‎gall‏ الحلقي عبارة عن 010081919918989 (متوالية برقم هوية:68).
بالتالي؛ في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي جزيء حمض نووي معزول 15018160 ‎Nucleic acid molecule‏ يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات
0 برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25« أو ‎BCL1IMicroRNA‏ تخليقي موضح هنا..
بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي تركيبة تتضمن جزيء حمض نووي ‎nucleic acid molecule‏ واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو ‎BCLI1IMicroRNA‏ تخليقي موضح هنا.
بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي تركيبة تتضمن على الأقل ناقل يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-1013-1» 44-25« أو ‎BCLT1MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:1. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:2. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:3. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 5 لمتوالية برقم هوية:4.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:5. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:6. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:7. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:8. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:9. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:10. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:13. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:14. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:15. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:16. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح؛ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:17. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:18. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح؛ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:25.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:26. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:27. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:28. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:29. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:30. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:31. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:32. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:33. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:34. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:35. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:36. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:37. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:38.
في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح؛ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:39. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:40. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:41. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:42. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:43. في أحد نماذج أي جزيء حمض نووي معزول الموضح. يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية:44. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف ‎Jal‏ ناقل ‎Vector‏ يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:1- 5 18-10¢13« 44-25 أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي ناقل موضح؛ يتضمن الناقل ‎Lad‏ معزز فيروسي مكون تركيز على الطحال ‎53a (SFFV) spleen 10005-10001108 virus‏ قابل للحث بتترا سيكلين ‎«(TET) tetracycline-inducible promoter‏ أو منطقة التحكم في موقع ]-جلويين ‎B=‏ ‎globin locus control region‏ ومعزز ]-جلويين ‎(LCR) B-globin promoter‏ يقدم المعزز تعبير مستهدف عن جزيء الحمض النووي فيه أو ‎BOLT IMICroRNA‏ التخليقي فيه. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة ‎host cell‏ يتضمن ناقل والذي يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1 44-25« أو ‎BCL1IMicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي خلية عائلة موضحة هناء الخلية العائلة عبارة عن خلية ‎Leds‏ جنينية ‎embryonic stem cell 5‏ خلية جذعية جسماتية ‎somatic stem cell‏ خلية أساسية ‎«progenitor cell‏ خلية نخاع عظم ‎bone marrow cell‏ خلية ‎Leds‏ مكونة للدم
‎hematopoietic stem cell‏ أو خلية أساسية مكونة للدم ‎hematopoietic progenitor‏ ‎cell‏ في أحد النماذج؛ يتم ‎Jie‏ الخلية العائلة من خاضع. في أحد النماذج؛ يتم ‎Jie‏ الخلية العائلة من خاضع تم تشخيص حالته أنه مصاب بمرض هيموجلوبين ‎.hemoglobinopathy‏ ‏يمكن أن يتم التشخيص بواسطة أي طريقة معروفة في المجال. ‎Sle‏ بواسطة الفحص الجيني ‎(genetic testing 5‏ بواسطة ‎(PCR-RT‏ وبواسطة فحص خلايا الدم ‎.blood cytology‏
في أحد نماذج أي خلية عائلة موضحة هناء الخلية العائلة عبارة عن ‎LS‏ حمراء
.erythrocyte ‏في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة يتضمن ناقل أو بكتريا يتضمن جزيء‎ ‏حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات‎
0 برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو ‎BCL11A microRNA‏ تخليقي الموضح هنا.
في أحد الجوانب» يقدم الوصف الحالي خلية عائلة تتضمن فيروس يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل تتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو ‎BCL11A microRNA‏ تخليقي الموضح هنا.
في أحد نماذج أي فيروس أو ناقل موضح هناء الفيروس عبارة عن فيروس بطيء.
15 في أحد نماذج أي ناقل أو فيروس الموضح هناء يتم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1 (1-/11)» فيروس نقص المناعة البشري من ‎((HIV=-2) 2 gall‏ فيروس التهاب المفاصل-التهاب الدماغ ‎Geld‏ ‏(/6821)؛ فيروس الأنيميا المعدية للخيول ‎«(EIAV)‏ فيروس نقص المناعة للقطط ‎(FIV)‏ ‏فيروس نقص المناعة البقري ‎¢(BIV)‏ وفيروس نقص المناعة للقردة ‎(SIV)‏
20 بالتالي» في أحد جوانب؛ يقدم الوصف الحالي طرق لزيادة مستويات هيموجلوبين تم التعبير عنها بواسطة خلية؛ تتضمن خطوات ملامسة خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم مع كمية فعالة من تركيبة موضحة هنا أو كمية فعالة من جزيء حمض نووي معزول موضح هنا على الأقل؛ وبالتالي تتم زيادة التعبير عن الهيموجلوبين الجنيني في الخلية؛ أو أساسهاء نسبة إلى الخلية
قبل هذا التلامس. في بعض النماذج؛ تتضمن التركيبة على الأقل ناقل واحد أو خلية تتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل تتضمن ‎the‏ متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة
من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو ‎microRNA‏ 1/8 80611 تخليقي الموضح هنا. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا توفير عينة من ‎DAY‏ الجذعية أو الأساسية للتلامس. في أحد النماذج؛ تتضمن ‎due‏ الخلايا +0034 المختارة. في أحد النماذج؛ تتضمن التركيبة خليط من متواليات نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:1- ‎Ole .44-25 (18-1013 5‏ تتضمن التركيبة 5-2 من متواليات نيكلوتيد مختلفة مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1) 44-25. ‎Ole‏ تتضمن التركيبة متواليات برقم هوية: 34 37 39 41 و43. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي طرق لعلاج؛ أو تقليل خطر ‎pki‏ مرض هيموجلوبين؛ ‎Ole‏ مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا» في خاضع. يمكن أن تتضمن الطرق 0 استبعاد انتقائي لجين 8011178 في ‎WAY‏ الجذعية المكونة للدم للخاضعين أو الأفراد. هؤلاء الخاضعين معرضين لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ الاستبعاد الانتقائي لجين ‎BCLITA‏ في الخلايا الجذعية المكونة للدم يتضمن استخدام جزيء حمض نووي معزول يتضمن متوالية نيكلوتيد من متواليات برقم هوية:18-10013-1؛ 44-25 أو استخدام ناقل (مثلا ناقل فيروسي ‎viral‏ ‎(Vector) 5‏ يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن أي من متالية النيكلوتيد من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو ‎BCL11A microRNA‏ تخليقي الموضح هنا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة ‎cla‏ يتضمن الاستبعاد ‎SEY)‏ لجين 801117 في الخلايا الجذعية المكونة للدم ملامسة الخلايا الجذعية المكونة للدم مع تركيبة تتضمن على الأقل جزيء حمض نووي معزول يتضمن متوالية النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 25- 0 44؛ أو مع تركيبة تتضمن على الأقل ناقل (مثلا ناقل فيروسي) يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن أي من متوالية نيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25« أو 861118 ‎microRNA‏ تخليقي الموضح هنا. في أحد النماذج؛ يتم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم قبل التلامس. في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ يتم الاستبعاد الانتقائي لجين 801117 في ‎Wall‏ ‏5 الجذعية المكونة للدم في الكائن الحي؛ في المعمل؛ أو خارج الكائن الحي. في نموذج آخرء الخلية
الأساسية المكونة للدم مستهدفة لأن الاستبعاد ‎SEY)‏ خاص بالسلالة الحمراء 60/030560 ‎lineage‏ ‏في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ تتم ملامسة الخلايا الجذعية المكونة للدم مع أي تركيبة موضحة هنا في الكائن الحي؛ في المعمل؛ أو خارج الكائن الحي. في نموذج ‎AT‏ ¢ الخلية الأساسية المكونة للدم التي تتم ملامستها من السلالة الحمراء . في أحد نماذج أي طريقة موضحة؛ تتم ملامسة الخلايا الجذعية المكونة للدم مع أي تركيبة موضحة هنا في الكائن الحي؛ في المعمل؛ أو خارج الكائن الحي. في نماذج أخرى لأي طريقة موضحة؛ يتم الاستبعاد الانتقائي لجين 801117 في خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم بالإضافة إلى خلية جذعية 0 مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد النماذج؛ تتم ملامسة خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ أو خلية نخاع عظم مع التركيبة الموضحة. يتم عزل الخلية الجذعية الجنينية؛ الخلية الجذعية الجسمانية؛ الخلية الأساسية؛ أو خلية نخاع العظم قبل الملامسة. في أحد النماذج؛ تتم ملامسة الخلية الجذعية الجنينية؛ الخلية الجذعية الجسمانية؛ الخلية الأساسية؛ أو خلية نخاع العظم مع أي تركيبة موضحة هنا في الكائن الحي؛ في المعمل؛ 5 أو خارج الكائن الحي. في نماذج أخرى لأي طريقة موضحة؛ يتم جمع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الدم المحيط ‎peripheral blood‏ دم الحبل السري ‎«cord blood‏ الزغابات المشيمية ‎chorionic‏ ‎all villi‏ الأمنيوسي ‎«amniotic fluid‏ دم المشيمة ‎«placental blood‏ أو نخاع العظم ‎.bone marrow‏ في نماذج أخرى لأي طريقة موضحة؛ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ أو يتم جمع خلية نخاع عظم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي؛ دم المشيمة؛ أو نخاع العظم. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة: إعطاء الخاضع كمية فعالة علاجيا لواحد أو أكثر من 5 جزيء حمض نووي معزول موضحة هناء فيروس أو ناقل موضحة هناء أو خلية موضحة هناء وبالتالي علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض الهيموجلوبين في الخاضع؛ حيث ‎cag pull‏ الناقل
أو خلية يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25 ‎BCL11MicroRNA i‏ تخليقي موضح هنا. ‎Ole‏ يتم حقن الكمية الفعالة من واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضحة هناء فيروس أو ناقل موضحة هناء أو خلية موضحة هنا بشكل مباشر في نخاع عظم للخاضع. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف ‎Jal‏ طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة ملامسة مجموعة من ‎WIA‏ جذعية مكونة للدم في المعمل أو خارج الكائن الحي مع تركيبة موضحة هنا أو مع على الأقل واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضحة هناء فيروس أو ناقل موضحة هناء وزراعة أو إعطاء الخلايا 0 الجذعية المكونة للدم الملموسة ‎contacted hematopoietic stem cells‏ أو الخلايا التابعة لها إلى الخاضع. في أحد النماذج؛ تقوم الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة أو الخلايا التابعة بالتطعيم في الخاضع. في أحد النماذج؛ تتم زراعة ‎WAY‏ الجذعية المكونة للدم الملموسة أو الخلايا ‎dnl‏ لها مع بروستاجلاندين 2] 2] 00052918000 ‎alae ffs‏ الأكسدة ‎33a (NAC) N-acetyl-L-cysteine نيتسيس-ا.-ليتيسأ-١ل antioxidant‏ طعمات 5 الخلايا الملامسة ‎.contacted cells‏ في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف ‎Jal‏ طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير عن ‎BCLTIMicroRNA‏ تخليقي واحد على ‎JY‏ موضحة هنا في خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية ‎Leds‏ جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم للخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن 0 الحي أو في المعمل؛ وزراعة أو إعطاء الخلية في الخاضع. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي طريقة لزيادة مستويات الهيموجلويين الجنيني الذي يتم التعبير ‎die‏ بواسطة خلية؛ تتضمن الطريقة التعبير عن ‎BCLIIMicroRNA‏ تخليقي ‎aly‏ ‏على الأقل موضحة هنا في خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم لخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن 5 الحي أو في المعمل أو في الكائن الحي. في أحد النماذج؛ يتم التعبير بواسطة ملامسة الخلايا مع
— 6 1 — كمية فعالة من تركيبة موضحة هنا أو كمية فعالة من على الأقل جزيء حمض نووي معزول موضح هنا . في أحد الجوانب»؛ ‎ad‏ الوصف الحالى طريقة لتقليل مستويات ‎BCRLLA‏ الذي يتم التعبير عنه بواسطة خلية؛ تتضمن الطريقة التعبير عن ‎BCLIIMicroRNA‏ تخليقى ‎aly‏ على الأقل موضحة هنا في خلية جذعية جنينية؛ خلية ‎Leds‏ جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع ‎abe‏ خلية جذعية مكونة للدم ‎chematopoietic stem cell‏ أو خلية أساسية مكونة للدم ‎hematopoietic progenitor cell‏ لخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن الحي أو في المعمل أو في الكائن الحي. في أحد النماذج؛ يتضمن التعبير خطوات ملامسة خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة 0 لدم مع كمية فعالة من تركيبة موضحة هنا أو كمية فعالة من على الأقل جزيء حمض نووي معزول موضح هناء بالتالي تتم زيادة التعبير عن هيموجلويين جنيني ‎hemoglobin‏ 1618 في الخلية؛ أو ذربتهاء نسبة إلى الخلية قبل هذه الملامسة. في بعض النماذج؛ تتضمن التركيبة ناقل واحد على الأقل أو خلية تتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25 أو ‎BCL11IMicroRNA 5‏ تخليقي موضح هنا. في نموذج آخر لأي من الطرق الموضحة هناء الخلية الجذعية المكونة للدم أو الخلية الأساسية المكونة للدم التى تمت ملامستها هي من السلالة الحمراء . في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم جمع الخلية الجذعية المكونة للدم أو خلية أساسية مكونة للدم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي؛ دم 0 المشيمة؛ أو نخاع العظم. في نموذج آخر لأي من الطرق الموضحة هناء تتم معالجة الخاضع المستلم مع العلاج الكيماوي ‎chemotherapy‏ و/أو الإشعاع قبل زراعة الخلايا الملموسة أو المنقولة. في أحد النماذج؛ العلاج الكيماوي و/أو الإشعاع عبارة عن تقليل خلايا جذعية ‎Lah‏ ‎endogenous stem cells‏ لتسهيل تطعيم ‎LIAN‏ المزروعة ‎.implanted cells‏ في أحد الجوانب»؛ يقدم الوصف الحالي طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة ‎sare‏ ‏هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة توفير خلايا جذعية مكونة للدم من الخاضع؛ ملامسة
— 7 1 — الخلايا الجذعية المكونة للدم في المعمل أو خارج الكائن الحي مع تركيبة موضحة هنا أو مع على ‎J‏ لأقل واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضح ‎Lia‏ فيروس أو ناقل موضحة هناء وزراعة أو ‎sale]‏ إعطاء الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة في نفس الخاضع. في أحد النماذج؛ تقوم الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة أو الخلايا التابعة بتطعيم في الخاضع.
في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم علاج ‎WAN‏ الجذعية المكونة للدم الملموسة؛ الخلايا الجذعية الجنينية؛ ‎WIA‏ جذعية جسمانية؛ خلايا أساسية؛ خلايا نخاع عظم؛ أو الخلايا التابعة له خارج الكائن الحي مع بروستاجلاندين 2 و/أو مضاد الأكسدة لا-أسيتيل-ا-سيستين لتعزيز التطعيم التالي في خاضع مستقبل.
0 خلايا عائلة من خاضع معرضين لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين أو تم تشخيصهم بمرض في أحد جوانب أي طريقة؛ مجموعة الخلايا الجذعية المكونة للدم ذاتية ‎Lana)‏ أو خيفية فى أحد جوانب أي طريقة؛ مجموعة الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا العائلة متمددة
5 خارج الكائن الحي في مزرعة قبل ملامسة مع تركيبة موضحة هنا أو مع على الأقل واحد أو أكثر
من جزيء حمض نووي معزول موضح هناء فيروس أو ‎Jal‏ موضحة هنا . فى أحد جوانب أي طريقة؛ مجموعة الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا العائلة متمددة خارج الكائن الحي في مزرعة بعد ملامسة مع تركيبة موضحة هنا أو مع على الأقل واحد أو أكثر من جزيء حمض نووي معزول موضح هناء فيروس أو ‎Jal‏ موضحة هنا . في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تمايز المجموعة التي تمت ملامستها من الخلايا الجذعية المكونة للدم أو الخلايا العائلة أوليا خارج ‎All GSN‏ في مزرعة قبل زراعة في خاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تمدد الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة في المعمل أو خارج الكائن الحي قبل الإعطاء في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم حفظ الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة بالتجميد قبل الإعطاء في الخاضع. في جانب آخر من أي طريقة؛ يتم تمدد 5 الخلايا الجذعية المكونة للدم الملموسة في المعمل أو خارج الكائن ‎all‏ ويتم حفظها بالتجميد قبل
— 8 1 — الإعطاء في الخاضع. في جانب ‎DAT‏ من أي طريقة؛ يتم تمدد ‎WAY‏ الجذعية المكونة للدم الملموسة في المعمل أو خارج الكائن الحي بعد الحفظ بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ الخاضع عبارة عن إنسان. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تشخيص الخاضع بمرض هيموجلوبين. في أحد جوانب أي طريقة؛ تتضمن الطريقة ‎Lad‏ اختيار خاضع مشخص بمرض هيموجلوبين أو خاضع معرضين لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في أحد جوانب أي طريقة؛ مرض الهيموجلوبين عبارة عن مرض الخلية المنجلية أو تلإسيميا. ‎Sia‏ أمراض ]-ثلاسيميا ‎.B-thalassemias‏ ‏فى أحد جوانب الطريقة ¢ تتضمن الطريقة ‎Lad‏ إعطاء الخاضع علاج يتضمن أوكسيجين ‎oxygen 0‏ هيدروكسي يوريا ‎hydroxyurea‏ حمض فوليك ‎folic acid‏ أو ‎Ja‏ دم ‎blood‏ ‎transfusion‏ ‏في أحد الجوانب»؛ يقدم الوصف الحالي طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير في الكائن ‎all‏ عن ‎BCL11MicroRNA‏ ‏تخليقي واحد على الأقل موضحة هنا في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم التعبير في الكائن الحي في خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد جوانب أي طريقة؛ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو الخلية الأساسية المكونة للدم ذاتية المنشاً أو خيفية في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم تمدد الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية ‎Leds‏ جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن ال ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي قبل إعطاء في الخاضع. في نموذج آخرء ترجع الخلية الأساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية 5 مكونة للدم وخلية أساسية مكونة للدم إلى السلالة الحمراء .
في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم حفظ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن ال ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في جانب آخر من أي طريقة؛ يتم تمدد الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن اذ ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي ويتم حفظها بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في جانب آخر من أي طريقة؛ يتم تمدد الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم التعبير عن 0 اذ ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي الواحد على الأقل موضحة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي بعد الحفظ بالتجميد قبل إعطاء في الخاضع. في أحد جوانب أي طريقة؛ ال ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي الواحد على الأقل مرتبط تشغيليا بمعزز وبتم تكوينه في ناقل للتعبير في خلية حقيقة النواة ‎-eukaryotic cell‏ في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم التعبير عن ال ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي الواحد على 5 الأقل من بوليمراز ‎RNAI‏ ‏في أحد جوانب أي طريقة؛ لا يتم التعبير عن اذ ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي الواحد على الأقل من بوليمراز ااا ‎RNA‏ ‏في أحد جوانب أي طريقة؛ يتم اختيار المعزز من مجموعة تتكون من معزز فيروسي مكون تركيز على ‎Jalal)‏ معزز قابل للحث بتترا سيكلين» أو منطقة التحكم في موقع ]-جلوبين 0 ومعزز م]-جلوبين؛ أو معزز انتقائي لمكونات الدم. في أحد جوانب أي طريقة؛ الناقل عبارة عن فيروس. في أحد جوانب أي طريقة؛ الفيروس عبارة عن فيروس بطيء. في أحد جوانب أي طريقة؛ تم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس نقص المناعة البشري من ‎«(HIV=1) human immunodeficiency virus type 1 1 gall‏ 5 فيروس نقص المناعة البشري من ‎human immunodeficiency virus type 2 2 soll‏ ‎(HIV=2)‏ فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي ‎caprine arthritis—‏
‎((CAEV) encephalitis virus‏ فيروس فقر الدم المعدي في الخيول ‎equine infectious‏ ‎anemia virus‏ (/ا/اع)» فيروس نقص المناعة في القطط ‎feline immunodeficiency‏ ‎(FIV) virus‏ فيروس نقص المناعة في البقر ‎«(BIV) bovine immune deficiency virus‏ وفيروس نقص المناعة في القردة ‎-(SIV) simian immunodeficiency virus‏
في أحد جوانب أي طريقة؛ الخاضع ‎Ble‏ عن حيوان؛ إنسان أو غير إنسان» وقارض أو غير قارض. ‎Ole‏ يمكن أن يكون الخاضع عبارة عن أي كائن ثديي؛ ‎lie‏ إنسان» أو غيره من الكائنات الأساسية؛ ‎pla‏ قارض مثل فأر أو جرذء ‎cif‏ خنزير غيني؛ هامستر»؛ بقرة؛ حصان؛ قطة؛ كلب؛ خروف أو ماعزء أو كائن غير ثديي ‎Jie‏ طائر.
في أحد جوانب أي طريقة؛ تتضمن الطريقة الحصول على عينة أو مجموعة من الخلايا 0 الجذعية الجنينية ‎Leds LWIA embryonic stem cells‏ جسمانية ‎«somatic stem cells‏ خلايا أساسية ‎«progenitor cells‏ خلايا نخاع عظم ‎WIA bone marrow cells‏ جذعية مكونة للدم ‎hematopoietic stem cells‏ أو خلايا أساسية مكونة للدم ‎hematopoietic‏
‎progenitor cells‏ من الخاضع. في أحد النماذج؛ يتم ‎Je‏ الخلايا الجذعية الجنينية؛ ‎DA‏ جذعية جسمانية؛ خلايا 5 أساسية؛ خلايا نخاع عظم؛ خلايا جذعية مكونة للدم؛ ‎WIA‏ أساسية مكونة للدم من الخاضع العائل» المنقولة» المزروعة (اختياريا)» والمزروعة مرة أخرى في نفس العائل» أي زريعة خلية ذاتية المنشاً. في نموذج آخرء يتم ‎Jie‏ الخلايا الجذعية الجنينية؛ ‎WIA‏ جذعية جسمانية؛ خلايا أساسية؛ خلايا ‎plas‏ عظم؛ خلايا ‎Leds‏ مكونة للدم؛ أو خلايا أساسية مكونة للدم من ‎mile‏ عبارة عن توافق مع النوع اتش ال ايه ‎HLA‏ مع عائل (مستقبل) والذي تم تشخيصه ب أو معرض لخطر 0 الإصابة بمرض هيموجلوبين. هذا التوافق في النوع لمولد ضد مانح-مستقبل معروف جيدا في المجال. تتضمن الأنواع ‎-HLA-D 3 (HLA-C (HLA-B HLA-A HLA‏ وهي تمثل أقل عدد من توافق مولد ضد سطح الخلية المطلوب للزراعة. ذلك أن الخلايا المنقولة مزروعة في عائل مختلف؛ أي؛ خيفية للخاضع العائل المستقبل. يمكن نقل الخلايا الجذعية الجنينية؛ ‎WA‏ جذعية جسمانية؛ ‎LDA‏ أساسية؛ ‎WA‏ نخاع عظم؛ خلايا جذعية مكونة للدم؛ أو خلايا أساسية مكونة للدم 5 للمانح أو الخاضع مع ناقل أو حمض نووي ‎Nucleic acid‏ يتضمن جزيء الحمض النووي موضحة هناء تتم زراعة ‎WAY‏ المنقولة المتمددة؛ ويعد ذلك تتم زراعتها في الخاضع العائل. في
أحد النماذج؛ تقوم الخلايا المزروعة ‎transplanted cells‏ بالتطعيم في الخاضع العائل. يمكن ‎Lad‏ حفظ الخلايا المنقولة بالتجميد بعد ‎Jal‏ والتخزين؛ أو يتم حفظها بالتجميد بعد تمدد وتخزين الخلية.
حسب الاستخدام هناء العلاج أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع يعني تخفيف عرض واحد على الأقل لمرض هيموجلوبين. في أحد الجوانب؛ يقوم الاختراع بوصف طرق علاج؛ ‎Ole‏ تقليل حدة أو ‎aii‏ مرض هيموجلويين في خاضع. في جانب ‎OAT‏ يمكن استخدام الطرق لتقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في ‎pall‏ تأجيل بدء أعراض مرض هيموجلوبين في خاضع؛ أو زيادة طول عمر خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين. في أحد الجوانب؛ يمكن أن تتضمن الطرق اختيار خاضع على أساس أنها تتضمن؛ أو معرضين ‎shal‏ ‏0 الإصابة ب مرض هيموجلويين؛ ولكنها لا تتضمن مرض هيموجلوبين؛ أو خاضع ذو مرض هيموجلويين كامن. يمكن أن يتضمن اختيار الخاضع الكشف عن أعراض مرض هيموجلوبين؛ اختبار دم ‎«blood test‏ اختبار جيني ‎«genetic testing‏ أو تسجيلات سريرية. إذا كانت نتائج الاختبار تشير إلى أن الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين؛ يمكن أن تتضمن الطرق أيضا إعطاء التركيبات الموضحة هناء وبالتالي علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في 5 الخاضع. ‎Ole‏ خاضع تم تشخيصه بمرض الخلية المنجلية مع نمط جيني اتش بي اس اس ‎(HBSS‏ 08/0158 ثلاسيمياء اتش بي اس دي 1550 أو اتش بي اس او 1550؛ و/أو اتش
بي اف ‎HF‏ <710 بواسطة الرحلان الكهربي ‎.electrophoresis‏ ‏حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح ‎ES‏ حالة تتضمن وجود جزيء هيموجلوبين غير طبيعي في الدم. تتضمن أمثلة أمراض الهيموجلوبين ‎chemoglobinopathies‏ ‏0 على سبيل المثال لا الحصرء مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا. ‎Lad‏ تم تضمين أمراض الهيموجلويين ‏ حيث توجد ‎Ads‏ من مركبات هيموجلويين غير الطبيعية ‎abnormal‏ ‏5 في الدم ‎Sb)‏ مرض الخلية المنجلية/110-0). يتضمن مثال مثالي لهذا ‎call‏ على سبيل المثال لا الحصرء؛ مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا. مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا وأعراضها معروفة في المجال وقد تم توضيحها هنا أيضا بالتفصيل. يمكن تشخيص 5 الخاضعين على أنه مصاب بمرض هيموجلوبين بواسطة مقدم رعاية صحية؛ مقدم رعاية طبية؛
طبيب؛ ممرضة؛ عضو أسرة؛ أو أحد المعارف» والذي يعرفون أو يفهمون أو يقررون أو يستنتجون
أو يعتقدون؛ أو يحددون أن الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين. يتم تحديد المصطلح "مرض الخلية المنجلية" هنا بحيث يتضمن أي حالة أنيميا عرضية ‎ll‏ تنتج من تمنجل خلايا الدم الحمراء. تتضمن أعراض مرض الخلية المنجلية: أنيميا ‎anemia 5‏ ألم؛ و/أو قصور وظيفي؛ ‎Jie‏ الفشل الكلوي ‎renal failure‏ اعتلال الشبكية ‎retinopathy‏ متلازمة الصدر الحادة ‎cacute—chest syndrome‏ نقص التروية ‎dschemia‏ ‏قساح 001801507 والسكتة ‎(stroke‏ حسب الاستخدام هنا يشير المصطلح "مرض الخلية المنجلية" إلى ‎ASE‏ من المشاكل السريرية الموجودة عند مرض الخلية المنجلية» خصوصا في هللاء الخاضعين الذين هم عبارة عن زيجوتات متجانسة ‎homozygotes‏ لاستبدال الخلية المنجلية في 0 اتش بي اس ‎(HDS‏ من بين الأعراض التكوينية المشار إليها هنا باستخدام المصطلح يتم تأجيل نمو وتطوير مرض الخلية المنجلية؛ وكان هناك ميل منخفض لتطوير أعراض سيئة؛ تحديدا بسبب جرثومة الالتهاب الرئوي ‎cpneumococcus‏ الضعف المعلم لوظيفة الطحال؛ التصفية الوقائية الفعالة لبكتريا دوارة ‎ccirculating bacteria‏ مع حالات احتشاء متكررة وتدمير نهائي لنسيج الطحال ‎tissue‏ 5016010. أيضا يتضمن المصطلح "مرض الخلية المنجلية" السلاسل الحادة من الألم العضلي الهيكلي؛ والذي يؤثر بشكل أساسي على الفقرات القطنية؛ الجذع؛ وجسم الفخذ؛ والتي تتشابه في الآلية والحدة. في البالغين؛ ‎sale‏ ما تبدو هذه النويات وكأنها هجمات خفيفة أو متوسطة ذات مدة قصيرة كل أسابيع قليلة أو أشهر يقطعها نويات مؤلمة تستمرما بين 5 إلى 7 أيام والتي تتم مرة سنويا. من بين الأحداث المعروفة بأنها تبدأ هذه الكوارث ‎Jie‏ الحماض و نقص الأكسجين والجفاف» وكلها تقوم ببدء بلمرة داخل الخلايا ل ‎Blood: Textbook of ( HbS‏ ,ا200ل ‎J.
H.‏ ‎Hematology, 2nd Ed., Little, Brown and Company, Boston, 1996, pages 0‏
544-545( . حسب _الاستخدام ‎TV, C JV.
FREY‏ إلى اضطراب وراثي يتميز بإنتاج معيب للهيموجلوبين. في أحد النماذج؛ يتضمن المصطلح الأنيميا الوراثية التي تتم بواسطة تطفرات تؤثر على تخليق مركبات الهيموجلويين. في نماذج أخرى؛ يتضمن المصطلح أي أنيميا عرضية ناتجة من حالات ثلاسيمية ‎Jie‏ الثلاسيميا الحادة أو ]-ثلاسيميا» الثلاسيميا الأساسية ‎thalassemia‏ ‏+0[ الثلاسيميا المتوسطة ‎thalassemia intermedia‏ حالات »0-ثلاسيميا ‎o-‏
مثل مرض هيموجلويين ‎hemoglobin H disease H‏ تنتج أمراض ‎—B‏ ‏ثلاسيميا بواسطة تطفر في سلسلة ]-جلويين ‎(B-globin chain‏ ويمكن أن تتم في صورة كبيرة أو صغيرة. في الصورة الكبيرة ل م-ثلاسيمياء ‎JULY)‏ طبيعيون عند الولادة؛ ولكنهم يصابون بالأنيميا أثناء العام الأول من الحياة. تقوم الصورة الخفيفة من م-ثلاسيميا بإنتاج ‎WIA‏ الدم 5 الحمراء الصغيرة. يتم التسبب في حالات ألفا-ثلاسيميا بواسطة حذف جين أو جينات من سلسلة الجلويين ‎.globin chain‏ يقصد بعبار "خطر الإصابة بمرض" الاحتمالية النسبية حيث يصاب خاضع مرض هيموجلوبين في المستقبل مقارنة بخاضع مقارن أو مجموعة مقارنة ‎lie)‏ خاضع سليم أو مجموعة سليمة). ‎lia‏ فرد يحمل التطفر الجيني المرتبط ب مرض الخلية المنجلية؛ تطفر 8 إلى ‎IT‏ جين 0 8-جلوبين؛ وما إذا كان الفرد في الزيتجوت غير المتجانس أو المتجانس لهذا التطفر تزيد من خطر إصابة هذا الفرد. يقصد بالمصطلح ”للا مثبط" أن يتضمن جزيء حمض نووي ‎nucleic acid‏ ‎molecule‏ يحتوي على متوالية تكمل حمض نووي مستهدف ‎MICrORNA Ole)‏ مستهدف) يتوسط في تقليل مستوى أو نشاط الحمض النووي المستهدف. تتضمن الأمثلة غير المقيدة ل ‎RNAs 5‏ مثبطة ‎RNA‏ متداخلة ‎SIRNA shRNA‏ رببوزيمات ‎ribozymes‏ أنتاجوميرات ‎cantagomirs‏ وأوليجو نيكلوتيدات مضادة للحس ‎oligonucleotides‏ 801156056. تم توضيح طرق صنع ‎RNAS‏ مثبطة هنا. هناك طرق إضافية لصنع ‎RNAS‏ مثبطة معروفة في المجال. في أحد النماذج» ال ‎BCL11IMicroRNA‏ الموضحة هنا عبارة عن ‎RNA‏ مثبطة تسبب تقليل في ‎.mRNA BCL11A Ll‏ حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح ‎RNA"‏ متداخل" إلى أي متوالية ‎RNA‏ أحادية الجديلة أو مزدوجة الجديلة؛ قادرة -- إما بشكل مباشر أو بشكل غير مباشر (أي؛ عند التحويل) على تثبيط أو تقليل التعبير الجيني بشكل متحكم فيه بواسطة التوسط في تداخل ‎RNA‏ يتضمن ‎RNA‏ متداخل» على سبيل المثال لا الحصر» ‎RNA‏ متداخل صغير ‎RNA ('SIRNAY)‏ دبوسي صغير (8ل4ا50'). يشير ‎"RNA dal’‏ إلى التدهور الانتقائي لنسبة ‎RNA‏ مرسلة متوالقة مع 5 المتوالية.
حسب الاستخدام هنا يشير ‎RNA) "shRNA"‏ دبوسي صغير ‎(small hairpin‏ إلى جزيء ‎RNA‏ يتضمن منطقة مضادة للحس ‎gia antisense region‏ حلقي ومنطقة حسية ‎region‏ ©5605؛ ‎Cus‏ تتضمن المنطقة الحسية نيكلوتيدات تكميلية حيث زوج قاعدة مع المنطقة المضادة للحس لتكوين خلية جذعية مزدوجة. بعد المعالجة ما بعد التحويل؛ يتم تحويل ‎RNA‏ ‏5 دبوسي صغير في ‎RNA‏ صغير متداخل بواسطة ‎Alls‏ شق يتم التوسط فيها بواسطة الإنزيم ‎(Dicer‏ والذي هو عبارة عن عضو من ‎(RNase lll dle‏ حسب الاستخدام ‎cla‏ تشير العبارة "المعالجة ما بعد التحوبلية" إلى معالجة ‎MRNA‏ تتم بعد التحويل ويتم التوسط فيهاء ‎lie‏ بواسطة الإنزيمات ‎Dicer‏ و/أو ‎.Drosha‏
يشير ”لل صغير متداخل" أو ‎"SIRNA"‏ حسب الاستخدام هنا إلى أي جزيء ‎RNA‏ ‏0 صغير قادر على تثبيط أو تقليل التعبير الجيني بشكل متحكم فيه بواسطة التوسط في تداخل ‎RNA‏ بطريقة انتقائية للمتوالية. يمكن أن يكون ‎RNA‏ صغيرء ‎Mie‏ بطول حوالي 18 إلى 21 نيكلوتيدات. يتم تكوين كل ‎SIRNA‏ مزدوج بواسطة جديلة موجهة وجديلة منتقلة. يقوم النيوكلياز الداخلي 2 ‎(Ago 2) Argonaute‏ بتحفير فك ‎SIRNA‏ مزدوج. بمجرد ‎ill‏ يتم دمج الجديلة الموجهة في معقد انتقائية التداخل ‎(RNA‏ أثناء إطلاق الجديلة المرسلة. يقوم معقد انتقائية التداخل غلا باستخدام الجديلة الموجهة لإيجاد ال ‎MRNA‏ الذي يتضمن متوالية مكملة تؤدي إلى شق
نيكلوتيدي داخلي ‎endonucleolytic cleavage‏ من ‎MRNA‏ المستهدف. الفيروسات الارتجاعية ‎Retroviruses‏ عبارة عن فيروسات ‎RNA‏ تقوم باستخدام ترانسكريبتاز عكسية ‎reverse transcriptase‏ أثناء دورة التكائر ‎replication cycle‏ الخاصة بها. يشير المصطلح "'فيروس ارتجاعي 6007/0005" إلى فيروس ارتجاعي معروف ‎Ole)‏ ‏0 الفيروسات الارتجاعية من النوع © ‎ctype c retroviruses‏ مثل فيروس ساركوما فأرية مولوني ‎«(MOMSV) Moloney murine sarcoma virus‏ فيروس ساركوما فأرية هارفي ‎Harvey‏ ‎((HaMuSV) murine sarcoma virus‏ فيروس ورمي أمي فأري ‎murine mammary‏ ‎(ug yd (MUMTV) tumor virus‏ لوكيميا لقرد جيبون ‎gibbon ape leukemia virus‏ ‎(GalV)‏ فيروس لوكيميا قططي ‎(FLV) feline leukemia virus‏ فيروس سبوما ‎Friend aug spumavirus 5‏ فيروس خلية جذعية فأري ‎Murine Stem Cell Virus‏ ‎(MSCV)‏ وفيروس ساركوما روس ‎(RSV) Rous Sarcoma Virus‏ تتضمن "الفيروسات
الارتجاعية" وفقا للاختراع أيضا فيروسات لوكيميا خلية ‎T‏ بشرية ‎human T cell leukemia‏ ؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1 و فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2 وعائلة الفيروسات البطيئة للفيروسات الارتجاعية؛ ‎Jie‏ فيروسات نقص المناعة البشري ‎Human‏ ‎Immunodeficiency Viruses‏ فيروس نقص المناعة البشري من ‎gall‏ 1؛ فيروس نقص 5 المناعة البشري من النوع 2 فيروس نقص المناعة في القردة؛ فيروس نقص المناعة في القطط فيروس نقص المناعة في الخيل؛ وغيرها من فئات الفيروسات الارتجاعية. يتم تحويل ‎RNA‏ الجينومي الارتجاعي ‎retroviral genomic‏ في دنا ‎DNA‏ مزدوج الجديلة بواسطة ترانسكريبتاز عكسي. هذه الصورة ال ‎DNA‏ مزدوجة الجديلة التي تكون الفيروس قادرة على الاندماج في كروموسوم ‎chromosome‏ الخلية المصابة؛ بمجرد الدمج؛ سوف تتم 0 الإشارة إليها ب 'طليعة فيروس ‎".PFOVIFUS‏ تعمل طليعة الفيروس كقالب لبوليمراز ‎RNAI‏ وتقوم بتوجيه التعبير عن جزيء ‎RNAS‏ والذي يقوم بترميز البروتينات البنيوية وإنزيمات مطلوبة لإنتاج جسيمات فيروسية جديدة. في كل طرف من طليعة الفيروس توجد بنيات ‎HIST‏ طرفية طويلة ‎long terminal‏ ‎"repeats‏ أو ‎LTRs’‏ يشير المصطلح ‎HST‏ طرفي طويل ‎"(LTR) long terminal repeat‏ 5 إلى نطاقات أزواج قاعدة موضوعة عند أطراف ‎DNAs‏ الفيروسية الارتجاعية؛ والتي في سياق المتوالية الطبيعية الخاصة بهاء عبارة عن تكرارات مباشرة وتحتوي على مناطق ذلا + ‎US‏ ‏تقوم تكرارات طرفية طويلة بشكل عام بتوفير وظائف أساسية إلى التعبير عن الجينات الارتجاعية ‎Sls) retroviral genes‏ التعزيز والبدء ومعالجة نسخ ‎gene transcripts (pall‏ ببولي ‎anal‏ ‎ly (polyadenylation‏ عمليات تكاثر فيروسية ‎viral replication‏ تحتوي تكرار طرفي 0 طويل على العديد من الإشارات المنظمة شاملة عناصر تحكم تحويلية ‎transcriptional control‏ ‎elements‏ إشارات معالجة ببولي أدينيل ‎polyadenylation signals‏ ومتواليات مطلوية ‎Sil‏ ودمج الجينوم الفيروسي ‎Lviral genome‏ يتم تقسيم تكرار طرفي طويل الفيروسي في ثلاثة مناطق تسمى ‎R (U3‏ و5لا. تحتوي المنطقة 3لا على عناصر المحسن والمعزز. المنطقة ‎US‏ عبارة عن المتوالية بين موقع ربط المادة البادئة والمنطقة ‎R‏ وتحتوي على متوالية المعالجة 5 ببولي أدينيل. يتم تجنيح المنطقة ‎R‏ (تكرار) بواسطة المناطق 3لا و5لا. يبدو أن ال تكرار طرفي طويل المكون من المناطق ‎U3‏ »ا و5لا؛ عند كل من الأطراف 5' و3' للجينوم الفيروسي. في
أحد نماذج الاختراع؛ يتم استبدال المعزز في تكرار طرفي طويل؛ شاملة 5' تكرار طرفي طويل؛ بمعزز غير متجانس. تتضمن أمثلة المعززات غير المتجانسة التي يمكن استخدامهاء ‎lie‏ معزز فيروس تكوين تركيز ‎(Jada‏ ؛ معزز قابل للحث بتترا سيكلين» منطقة تحكم في موقع ‎Osta‏ ‏ومعزز (|-جلوبين»؛ ومعزز فيروس مضخم للخلايا ‎(CMV) cytomegalovirus‏
يشير المصطلح 'فيروس بطيء" إلى مجموعة (أو جنس) من الفيروسات الارتجاعية التي تؤدي إلى تطوير المرض بشكل بطيء. تتضمن الفيروسات المتضمنة في هذه المجموعة ‎HIV‏ ‏(فيروس نقص المناعة البشري؛ شاملة فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1؛ و فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2)؛ العامل السببي لمتلازمة قصور مناعي بشري ‎human acquired‏ ‎¢(AIDS) immunodeficiency syndrome‏ ميتة فيزنا ‎«visna-maedi‏ والتي تسبب التهاب
0 الدماغ ‎encephalitis‏ (فيزنا ‎(visna‏ أو التهاب رثوي ‎pneumonia‏ (ميثة ‎(maedi‏ في الخراف»؛ فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي ‎caprine arthritis—encephalitis‏ 5 والذي يسبب قصور مناعي ‎deficiency‏ 1017006 التهاب في المفاصل ‎«arthritis‏ ‎cali‏ دماغي ‎encephalopathy‏ في ماعز؛ فيروس فقر الدم المعدي في الخيول؛ والتي تسبب فقر الدم الانحلالي الناتج عن المناعة الذاتية؛ والتلف الدماغي في الخيول؛ فيروس نقص المناعة
5 في القطط ‎lly‏ تؤدي إلى نقص مناعي في القطط؛ فيروس نقص المناعة في البقرء والتي تؤدي إلى اعتلال العقد الليمفاوية» كثرة الليمفاويات؛ ‎(Sg‏ محتمل نظام عصبي مركزي في الماشية؛ وفيروس نقص المناعة في القردة؛ والتي تؤدي إلى قصور مناعي وتلف دماغي في الكائنات الأساسية الأقل من الإنسان. يتم وصف الأمراض الناتجة بواسطة هذه الفيروسات بمدة حضانة طويلة ومسار ممتد. عادة؛ تقوم الفيروسات بشكل مستتر بإصابة ‎DAY‏ الفردية والبلاعم؛ التي
0 تنتشر منها إلى خلايا أخرى. تقوم فيروس نقص المناعة البشري؛ فيروس نقص المناعة في القطط « و وفيروس نقص المناعة في القردة أيضا بإصابة الخلايا الليمفاوية 7؛ أي؛ خلايا 1.
يشير المصطلح 'منطقة ‎R‏ إلى المنطقة في تكرارات طرفية طويلة فيروسية ارتجاعية تبدأ عند بداية المجموعة الغطائية (أي؛ بداية التحويل) وتنهي مباشرة قبل بداية مسار ‎A‏ المتعدد. يتم تحديد المنطقة ‎R‏ أيضا على أنها محاطة بواسطة المناطق 3لا و5لا. تلعب المنطقة ‎R‏ دورا مهما
5 أثناء التحويل العكسي في السماح بنقل ‎DNA‏ ناشئ من طرف واحد للجينوم إلى آخر.
يشير المصطلح 'معزز/محسن ‎"enhancer/promoter‏ إلى جزء من ‎DNA‏ والتي تحتوي على متواليات قادرة على توفير كل من وظائف معزز ومحسن. مثلاء تحتوي التكرارات الطرفية الطويلة للفيروسات الارتجاعية على كل من وظائف المعزز والمحسن. يمكن أن يكون المحسن/المعزز 'داخلياء" "خارجياء" أو "غير متجانس.” المحسن/المعزز "الداخلي" عبارة عن واحد مرتبط بشكل طبيعي بجين محدد في الجينوم. يتم وضع المحسن//المعزز 'الخارجي"” أو "غير المتجانس" في اصطفاف مع جين بواسطة التعديل الجيني ‎ol)‏ التقنيات البيولوجية الجزيئية ‎Cus (Molecular biological techniques‏ .يتم توجيه تحويل هذا الجين بواسطة
المحسن/المعزز المرتبط. ما لم يتم تحديد غير ذلك؛ كل المصطلحات التقنية المستخدمة هنا لها نفس المعنى 0 المفهوم عموما بواسطة أي من ذو الخبرة العادية في المجال الذي ينتمي إليه الاختراع. تم توضيح الطرق والمواد هنا للاستخدام في الاختراع الحالي؛ يمكن أيضا استخدام طرق أخرى مناسبة ومواد معروفة في المجال. هذه المواد والطرق والأمثلة هي للتوضيح فقط ولا يقصد بها أن تكون مقيدة. تم دمج كل المنشورات وطلبات براءات الاختراع وبراءات الاختراع وغيرها من المراجع الأخرى المذكورة هنا بواسطة الإشارة إليها كليا. في ‎dlls‏ التضاد؛ سوف يكون الوصف الحالي؛ شاملا 5 التعريفات؛ هو الحاكم. سوف تكون هناك خواص ومزايا ‎(AT‏ للاختراع واضحة من الوصف
التفصيلي والأشكال ‎ddl)‏ ومن عناصر الحماية.
شرح مختصر للرسومات الشكل 1 عبارة عن مخطط بياني لاثنين من نماذج ‎RNA‏ دقيق ل 8011178 تخليقي المكشوف عنه: أوليجونيكلوتيدات ‎.BCL11A miR2 4 BCL11A miR1 oligonucleotides‏ يتم توليد البنية الجذعية/الحلقية ‎stem/loop structure‏ بواسطة المتواليات المكملة ل متواليات تستهدف /86111 (في قواعد نيكلوتيد لحالة علوية عريضة) في الأوليجونيكلوتيدات. المتواليات ‎Al‏ تستهدف /80111 عبارة عن ‎ag .80111/5 oa‏ ذلك .يتم استنساخ ‎Lull‏ ‏الجذعية/الحلقية في خلفية ‎miR-223/miR-30‏ (خلفية ‎RNA‏ دقيقة). بعد ذلك يتم استنساخ بنية ‎Jel) mIRNA/ShRNA‏ في قالب معزز فيروس تكوين تركيز طحالي/ منطقة تحكم
موضعي / معزز ‎JB‏ للحث بتترا سيكلين يحتوي على ناقل فيروسي بطيء ذات التنشيط -5617 ‎(SIN) inactivating‏ يحتوي على مبلغ جيني انتقالي ‎(Venus)‏ ‏الشكل 2 ‎ple‏ عن مخطط بياني تخطيطي لطلائع فيروس لناقل فيروسي بطيء مع معززات فيروس تكوين تركيز طحالي؛ تترا سيكلين و منطقة تحكم موضعي. الشكل 3 عبارة عن صورة لاثنين من المخططات القضيبية التي تبين أن فيروس تكوين تركيز طحالي- إل 3 ا يقوم باستبعاد ,8011178 بفاعلية ويحفز التعبير عن (©-جلويين ‎.£y—globin‏ ‏الشكل 4 عبارة عن صورة لاثنين من المخططات القضيبية التي تصور أن و منطقة تحكم موضعي/ تترا سيكلين- ‎LV‏ باستبعاد 801-1178 بفاعلية وتقوم بحث التعبير عن (8©-جلويين. الشكل 5 عبارة عن صورة لمخطط ضوئية وصور تبين أن ‎HSC‏ +0034 المحولة تقوم بالتمايز خارج الكائن الحي في كريات الدم الحمراء وتعبر عن ‎HOF‏ ‏الشكل 6 عبارة عن صورة لمخططات تشتيت تصور ‎CD34+ HSCs‏ محولة ب منطقة تحكم موضعي- ‎LV‏ من مرضى مع مرض الخلية المنجلية المزروعة في ‎OE‏ ان اس جي ‎.NSG‏ ‏15 الشكل 7 ‎She‏ عن صورة لصورة ضوئية دقيقة وصور تبين دراسة السمية القوية ل 8011178 في التطور الليمفومي. تبين الأشكال 28-18 مراقبة وتقييم 801117 تستهدف ‎ShRNAs‏ في أنظمة التعبير عن ‎Il yg pol lll‏ ا0م. الشكل 8أ. تمثيل تخطيطي لبوليمراز ‎pol 111) RNA ١١١‏ معزز ‎UG‏ جانب أيسر) و ‎ShRNA 0‏ يعمل بواسطة بوليمراز ‎Il) RNA ١١‏ ا0م؛ معزز /57]1؛ جانب أيمن) وعبوة ‎ShRNA‏ ‏مدمجة في (01408)223؛ على التوالي. تم تصميم كل من عبوات التعبير في نواقل فيروسية بطيئة ‎vectors‏ 16017//015. تمثل المريعات المختلفة الجديلة المرسلة ‎«passenger strand‏ الجديلة الموجهة ‎guide strand‏ والبنية الحلقية ‎loop structure‏ كما هو مشار إليه. يتم تمثيل البنية المتراصة ‎MIRNA223‏ بمريع ذو خط منقوط. تم التعبير عن متواليات ‎shRNA‏ المختلفة 5 التي تستهدف 8611/8 في هذه البنيتين الأساسيتين وتم تقييمها لفعالية الاستبعاد.
الشكل 8ب. المراقبة عالية الخرج للعديد من متواليات ‎shRNA‏ التي تستهدف العديد من المناطق في ‎mRNA‏ 8011178 (متواليات صورة إسوية مشتركة ب اكس ال/ ال ‎XL/L‏ متواليات ترميز ‎XL‏ فريدة و4ا1 لا-'3 من صورة ‎XL‏ إسوية؛ كما هو مشار إليه) لفعالية الاستبعاد باستخدام نواقل فيروسية بطيئة قائمة على ‎١١|‏ ا00. تم استخدام كل من حث 7ع بواسطة ‎QPCR‏ وحث مبلغ ‎mCherry‏ بواسطة ‎dds‏ تصنيف منشطة بالتألق ‎ag) FACS‏ لحث إيبسلون-١‏ ‎epsilon-y‏ في سلالة خلية مبلغة ‎(reporter cell line‏ كقراءة وظيفية لاستبعاد 8061117. تم عمل مخطط للتعبير المعاير ل ‎MRNA‏ 7ع نسبة إلى تحكم غير مستهدف على المحور لا ومتوسط شدة التألق ‎(MFI) mean florescence intensity‏ للتعبير عن ‎mCherry‏ نسبة إلى
تحكم غير محول على المحور #. تم تعليم ال 11 ‎ShRNAS‏ التي تم اختبارها بواسطة دوائر.
الأشكال 8ج و8د. مقارنة فعالية استبعاد ‎ShRNAS‏ مختارة في أنظمة قائمة على أساس ‎pol ١١١‏ واا ا00. تم تحويل خلايا حمراء فأرية ‎(MEL) murine erythroleukemia‏ مع ناقل ‎LKO‏ أو مع ناقل تعبير ال اي جي او ‎LEGO‏ عن ‎ShRNAs‏ المشار ‎Led)‏ وتم اختيار الخلايا المحولة ‎Ll‏ في وجود بيوروميسين ‎(LKO) puromycin‏ أو مصنفة للتعبير عن ‎Venus‏ ‎(LEGO)‏ وقد تمت الإشارة سلفا إلى ‎MRD shRNA‏ بواسطة )( ‎.Sankaran et al.‏ تم
5 توضيح مستويات بروتين 8061117 (الشكل 8ج) بواسطة مخطط مناعي مع 8]-أكتين ‎B-actin‏ ‏كعينة ضابطة. تبين ‎XL‏ وا موضع كل شكل أيزومري ل بروتين 86111/8. (الشكل 8د) تم تحليل شدة النطاق المستخدمة باستخدام برنامج ‎Amaged‏
الشكل 8ه. تم قياس حث طية لتعبير معاير عن 8-7 مقارنة بعينة ضابطة غير مستهدفة بواسطة ‎.qPCR‏ تم استخدام ‎WDA‏ حمراء فأرية محولة ب ‎ShRNA‏ غير مستهدف وتم ضبط
0 اتعبير إلى 1. تمثل البيانات متوسط + ‎SD‏ من تجربة مثالية لثلاثة من التجارب المستقلة التي تم تنفيذها في نسخ ثلاثية. * 0.05<0.؛ ‎>***P «0.01 >**P‏ 0.001.
الأشكال 9أ-9و عبارة عن بيانات تم جمعها من تحليل تتابع ‎RNA‏ صغير ‎lly‏ تكشف عن المعالجة التمايزية بين نسخ ‎pol HI‏ في مقابل ‎pol ١١‏ الأشكال 19 و9ب. تم عزل ‎RNA‏ الكلي من خلايا حمراء فأرية محولة أو مصنفة أو
5 مختارة بواسطة بيوروميسين ‎pUrOMYCIN‏ الذي يعبر عن أي من 00141 أو ‎shRNA‏ 04. بعد
ذلك تم إخضاع ‎RNA‏ إلى ‎RNA‏ عميقة المتوالية. تم تمثيل متوالية توجيه نهائية ‎dallas‏ ومتوالية
جديلة منتقلة تم تحويلها من (الشكل 19( ‎(LKO) pol Il‏ أو (الشكل 9( من ‎(LEGO) pol ١١‏ على المحور # وتم تخطيط تناظر عدد القراءات لكل مليون قراءة كليا لكل جديلة على المحور لا. الأشكال 9ج-9و. تم تخطيط متواليات الجدائل الموجهة المختلفة المعالجة ‎J‏ 01:41 المحولة من (الشكل 9ج) معزز !اا ‎pol‏ أو (الشكل 9د) معزز ‎pol ١١‏ على المحور لا مع عدد القراءات الكلية التي تم تخطيطها على المحور *. يتم تخطيط متوالية أنواع الجديلة الموجهة المختلفة المعالجة من 4© محولة من (الشكل 9ه) معزز ‎pol HI‏ أو (الشكل 9و) معزز ‎pol ١١‏ على المحور لا مع عدد القراءات الكلية على المحور *. تبين الأشكال 310-110 أن تعديل متواليات ‎ShRNA‏ تؤدي إلى استبعاد متزايد وتوجيه محسن في مقابل نسبة الجديلة المنتقلة. الشكل 10ا. تم تعديل ‎shRNAs; miR1‏ 4© بحيث يتم حذف أربعة من 5" قواعد وتمت إضافة ©6064 على الطرف 3' لإعطاء ‎ShRNA‏ معدل يسمى 00141 ‎.C4G5 5 G5‏ الشكل 10ب. مقارنة فعالية استبعاد متواليات ‎ShRNA‏ معدلة وأساسية. تم تحويل خلايا حمراء فأرية مع ‎LEGO‏ للتعبير عن ‎ShRNAS‏ المشار إليها عبر معزز ‎POI ١١‏ وتم تصنيف الخلايا المحولة للتعبير عن 7/80015. تم قياس مستويات بروتين 8011178 بواسطة مخطط 5 مناعي مع 8-أكتين كحمل مقارن. ‎XL‏ وتشير .1 إلى موضع هذه الأشكال الأيزومرية لبروتين ‎.BCL11A‏ ‏الشكل 10ج. تم تحليل شدة نطاق مخطط مناعي باستخدام برنامج ‎Image‏ ‏الشكل 10د. حث طية تعبير معاير مقارنة بعينة ضابطة غير مستهدفة ‎ey‏ بواسطة متواليات ‎ShRNA‏ معدلة/غير معدلة تم قياسها بواسطة ‎(PCR‏ تمثل البيانات متوسط + ‎SD‏ ‏20 من تجرية مثالية لثلاثة من التجارب المستقلة التي تم تنفيذها في نسخ ثلاثية تبين نتائج مشابهة. ‎>**P (0.05>*P‏ 0.01. تبين الأشكال 211-111 تحليل متوالية ‎RNA‏ لأربعة أزواج قاعدة ‎ShRNA‏ معدلة تبين معالجة جيدة. الشكل 111. تم عزل ‎RNA‏ صغير ‎(AS‏ من حمراء فأرية مصنف ومحول الذي يعبر عن 5 0141 معدل و5هل98 ‎C4‏ معدلة وتم عمل متواليتها. تم تخطيط توزيع تردد أنواع جديلة
موجهة معالجة من 10141 معدل ‎MIR1I-GS)‏ و0465) محول من معزز ‎pol ١١‏ على المحور لا مع نسبة القراءات لكل مليون قراءة كلية مخططة على المحور ‎X‏ ‏الأشكال 11ب و11ج. تم عرض متوالية لأنواع الجديلة الموجهة المختلفة المعالجة ل 0141-5 و04-65 على المحور لا وتم توضيح تردد القراءات على المحور ‎X‏ ‏5 الشكل 112. تقوم مرشحات مراقبة ‎ShRNA‏ التي ‎BOLI TAG‏ باستخدام ناقل بي ال كيه او 0كاام. الشكل 12ب. تركيبة متوالية جديلة موجهة وتوزيع في 60ا01. مع بنيات ‎PLKO‏ التي دائما ما تقوم بعمل إزاحة عند الطرف 5 والتي يمكن أن تكون ناتجة عن مد متوالية ‎T‏ غنية عند الطرف 73 ال ‎T's‏ المضافة عبارة عن ‎gia‏ من متوالية إنهاء ‎II‏ ا00. هذه الإزاحة في متوالية ‎ShRNA 7 0‏ ناضجة تشير إلى أنه أثناء المعالجة التي يتم التوسط فيها بواسطة ‎Dicer‏ يكون دور العد 3” مسيطراء بما يعني أن شق ‎SARNA‏ عبارة عن 2104 الذي يتم بدؤه من الطرف 3”. وهذا يؤدي إلى إزاحة 3 أو 4 زوج قاعدة عند الطرف 5" ‎Lady‏ في منطقة بذرة مزاحة بشكل مثالي (قواعد 7-2 من الجديلة الموجهة) وهي خاصة بالتعرف على الهدف. الشكل 13. تركيبة متوالية جديلة موجهة وتوزيع في ‎LEGO‏ يقوم تحليل متوالية ‎RNA‏ ‏5 صغير العميقة بالكشف عن معالجة تمايزة بين نسخ ‎pol HI‏ في مقابل ‎II‏ ا00. مع بنيات ‎lego‏ لم تكن هناك إزاحة عند الطرف 5" وتتم ‎dallas‏ الجديلة الموجهة بواسطة ‎Dicer‏ والذي يؤدي إلى المنتج المتوقع. بالتالي تختلف الجديلة الموجهة النهائية بين بنيات تعمل بواسطة ‎pol ١١و pol ١١١‏ الشكل 14. تصميم ‎ShRNAS‏ جديدة لمحاكاة جدائل موجهة ناضجة تم إنتاجها في ناقل ‎.pLKO‏ تم تعديل كل ‎ShRNAs‏ بحيث يتم حذف أربعة قواعد على 5 وتمت إضافة ‎GCGC‏ ‏0 على الطرف 3 لإعطاء ‎shRNA‏ معدل سمى ‎MiR1GS‏ 365 565 ذو ‎«B11GS‏ 5001265؛ 5081165 50565؛ 500465. مع دمج هذه الإزاحة؛ تمت ملاحظة التحسن المميز مع 365ع؛ 0865 و0465 المتعلقة بحث استبعاد 806011174 وايبسلون-جاما ‎.€psilon—gamma‏ تقوم +7000 بتمثيل موضع إزاحة إطار 4-زوج قاعدة ‎(bP)‏ ‏يؤدي إلى 4-قواعد مزالة من 100141 غير معدل» ‎(E3‏ 85؛ ‎«D8‏ 811؛ 50012 (أيضا المشار إليها ب 012)» 50811؛ 5055 ‎Lad)‏ المشار إليها ب ‎«(AS‏ و5004 (أيضا المشار إليها ب ‎(C4‏
الشكل 14ب. تركيبة متوالية جديلة موجهة وتوزيع في ‎LEGO‏ معدل. تبين ‎ShRNAS‏ ‏معدلة لمتوالية ‎RNA‏ عميقة وجود معالجة جيدة مع إزاحة 4 زوج قاعدة؛ ‎lly‏ تشير إلى أنه بواسطة إدخال الإزاحة كنا قادرين على محاكاة منتج نواقل ‎PLKO‏ بشكل مثالي. حيث تم استخدام نواقل ‎pLKO‏ لمراقبة ‎ShRNAS‏ الفعالة؛ يقوم هذا التعديل بمحاكاة متوالية توجيه المنتج الناضج
المحدد عند نقل قالب ‎ShRNA‏ في أساسات تعمل بواسطة ‎Pol ١١‏
الشكل 15. مقارنة استبعاد 8061117 مع متواليات توجيه معدلة. مقارنة فعالية استبعاد متواليات ‎ShRNA‏ معدلة وأساسية. يبين مخطط وسترن التعبير عن 8611178 (الأشكال الأيزومرية ‎Lg XL‏ صورة علوية). تشير الدوائر الحمراء إلى ‎Cus ShRNAS‏ يوجد استبعاد 801118 محسن عند إدخال إزاحة 4 زوج قاعدة. الصورة السغلية: تمت مقارنة حث طية تعبير
0 7ع معاير بواسطة متواليات ‎ShRNA‏ معدلة/غير معدلة بتحكم غير مستهدف كما هو مقاس بواسطة ‎qPCR‏
الشكل 16. مقارنة ‎MIR‏ تعبير مع متواليات توجيه معدلة. بشكل متوافق مع ‎BL‏ في فعالية استبعاد وحث إيبسلون-لاء؛ كان التعبير عن الجديلة الموجهة عاليا (والتي تؤدي إلى زيادة في فعالية الاستبعاد) عند تنفيذ مخطط نورثرن في بنيات معدلة مقارنة بتلك غير المعدلة خصوصا
5 مع ‎E3G5‏ 0865 و6465.
الشكل 17. فعالية استبعاد 861117 وحث (ع مع نواقل ‎LEGO‏ مقارنة فعالية استبعاد ‎ShRNAS‏ مختارة في أنظمة قائمة على أساس ‎pLKO pol Il‏ واا ‎.pLEGO pol‏ تم تحويل خلايا حمراء فأرية مع ‎ShRNAS‏ تمت الإشارة إليها إما في ناقل ‎pLKO‏ أو مع ناقل ‎PLEGO‏ ‏وتم اختيارالخلايا المحولة إما في وجود بيوروميسين ‎(PLKO) puromycin‏ أو المصنفة للتعبير
0 عن ‎Venus‏ (60ا0). تم قياس مستويات بروتين 8011178 بواسطة مخطط مناعي ‎Bae‏ ‏أكتين كعينة ضابطة. يتم قياس حث طية 8-7 معايرة مقارنة بعينة ضابطة غير مستهدفة بواسطة ‎.gPCR‏ تم استخدام خلايا حمراء فأرية محولة ب ‎ShRNA‏ غير مستهدف كعينات ضابطة سلبية. تمتع ‎dal)‏ الإطار بأثر قوي على كل من فعالية استبعاد وحث (8. تتضمن ‎ShRNAS‏ التي تستهدف صورة ‎XL‏ إسوية منفردة أثر قوي على حث ‎gy‏ تمثل البيانات متوسط + اس دي50 من ثلاثة تجارب مستقلة؛ تم تنفيذ كل منها في نسخ ثلاثية. * 0.05<0.
الشكل 18 يبين المعالجة المتمايزة في نواقل ‎shRNA‏ ١١١-ا0م‏ ونواقل ‎ShRNA‏ مهيأة ‎microRNA als.‏ الحاوم. الأشكال 219-119 تبين مراقبة وتقييم 861-117 تستهدف ‎ShRNAS‏ في أنظمة التعبير عن ‎Il yg pol lll‏ ا0م. الشكل 19أ. التمثيل التخطيطي 1 ‎LKO-U6-BCL11A-shRNA‏ (جانب أيسر) و4 ‎LEGO-SFFV-BCL11A-shRNAmIR‏ (جانب أيمن). تم تصميم كل من عبوات التعبير في نواقل فيروسية بطيئة كما هو موضح في المواد والطرق. تمثل المريعات ذات اللون الرمادي الفاتح الجديلة الحسية؛ ‎Jia‏ المريعات البيضاء الجديلة المضادة للحس؛ تمثل المريعات الرمادية الداكنة البنية الحلقية وتتم الإشارة إلى البنية المتراصة ‎MIRNA223‏ بواسطة خط منقوط. تم
0 توضيح البنيات الدبوسية أدناه. تم التعبير عن متواليات 50518 المختلفة التي تستهدف
801-118 في هذين الأساسين وتم التقييم من حيث فعالية الاستبعاد. الشكل 19ب. المراقبة عالية الإنتاجية لمتواليات ‎ShRNA‏ المتعددة التي تستهدف ‎mRNA‏ 801118 لفعالية استبعاد باستخدام نواقل فيروسية بطيئة قائمة على ‎١١١‏ ا00. تم استخدام كل من حث ‎Hbb-y MRNA‏ بواسطة ‎qRT-PCR‏ وحث مبلغ ‎mCherry‏ بواسطة
‎FACS 5‏ (كبديل لحث 7ع في سلالة خلية مبلغة) كقراءة وظيفية لاستبعاد /80111. يتم تخطيط التعبير المعاير ل ‎Hbb-y MRNA‏ نسبة إلى ‎due‏ ضابطة غير مستهدفة على المحور لا وحث طية التعبير عن ‎mMCherry‏ (بواسطة شدة ‎(alll‏ متوسط شدة التألق) نسبة إلى التحكم غير المحول على المحور #. تم أيضا اختبار أفضل ثمانية ‎ShRNAS‏ في الأداء من حيث الأداء من المراقبة وتمت تسميتها من 1 إلى 8.
‏20 الشكل 19ج. مقارنة فعالية استبعاد 5050/5 مختارة في أنظمة قائمة على أساس ‎pol‏ ‏-(6لا) ‎١١ (SFFV), III‏ ا0م. تم تحويل خلايا حمراء فأرية مع 6لا- ‎das)‏ علوية) أو مع ‎—SFFV‏ (الصورة السفلية) نواقل للتعبير عن ‎ShRNAS‏ المشار إليها وتم اختيارالخلايا المحولة إما في وجود بيوروميسين )1 ‎(POI‏ أو مصنفة للتعبير عن ‎Il) Venus‏ ا00). تم توضيح مستويات بروتين 801117 بواسطة مخطط مناعي مع ]-أكتين كعينة ضابطة. تشير ‎XL‏ وا
‏5 على يسار الصورة إلى موضع كل شكل أيزومري لبروتين 801117.
الشكل 19د. حث طية التعبير المعاير عن مقارنة ‎Hbb-y‏ بعينة ضابطة غير مستهدفة مقاسة بواسطة 0004. تم ضبط تعبير في خلايا حمراء فأرية محولة (غير مستهدفة ‎NT‏ -000 ‎shRNA J (targeting‏ على 1. تقوم القضبان السوداء بتمثيل التعبير النسبي بواسطة ‎ShRNAs‏ ‏تعمل بواسطة معزز 6لا وتمثل القضبان البيضاء ‎ShRNAS‏ تعمل بواسطة معزز فيروس تكوين تركيز ‎Jab‏ تمثل البيانات متوسط + ‎SD‏ من تجربة مثالية لثلاثة تجارب مستقلة تم تنفيذها في نسخ ثلاثية. * ‎.0.05>P‏ ‏تبين الأشكال 20 و20ب تحليل تتابع ‎RNA‏ صغير الذي يكشف المعالجة التممايزة بين تسخ ‎pol ١١١‏ في مقابل ‎pol ١١‏ قامت نتائج تتابع ‎RNA‏ صغيرة لخلايا حمراء فأرية المحولة مع ‎SFFV-shRNAmIRs ; U6-shRNAs‏ 1« 2 3 4« 7« أو 8. تمت محاذاة متواليات ‎RNA‏ ‏0 مع الإشارة المناظرة لمتوالية جديلة موجهة؛ مبينة عند الجزء العلوي من كل صورة بخط عريض والمتواليات الجناحية باللون الرمادي. يتم تخطيط الصور المغايرة المختلفة من الجدائل الموجهة التي تم إنتاجها من (الشكل 120( ‎U6-shRNAs‏ أى (الشكل 20ب) ‎SFFV-shRNAmMIRs‏ ‏على المحور لا. تمت الإشارة إلى كل نسب المساهمة النسبية لكل صورة مغايرة على المحور ‎X‏ ‏المحسوية بناء على العدد الكلي للقراءات التي تتوافق مع متوالية 5041/8 المرجعية. الأشكال 121-121 تبين تعديل متواليات ‎ShRNA‏ تؤدي إلى ‎sal)‏ الاستبعاد والتوجيه المحسن في مقابل نسبة جديلة منتقلة في خلايا حمراء فأرية. الشكل 21أ. تم تعديل ‎SFFV-shRNAMIRs‏ بواسطة حذف أول ‎day‏ قواعد من متوالية التوجيه وإضافة ©6066 إلى الطرف 3" ‎shRNA)‏ معدل) الشكل 21ب. مقارنة فعالية استبعاد متواليات ‎ShRNAMIR‏ معدلة وأساسية التي يتم 0 التعبير ‎lie‏ من معزز ‎SFFV-pol ١١‏ في خلايا حمراء فأرية. تم قياس مستويات بروتين 801118 في خلايا ‎FACS‏ مصنفة محولة بواسطة مخطط مناعي مع 8]-أكتين كحمل مقارن. تشير ‎XL‏ وا على الجزءِ الأيسر من الصورة العلوية إلى موضع هذه الأشكال الأيزومرية لبروتين ‎.BCL11A‏ ناقل معزز ‎¢Plll: pol ١١١‏ ناقل معزز ‎pol ١١‏ :1ا©؛ ناقل معزز ‎PIIM: pol ١١‏ يحتوي على متواليات ‎ShRNAMIR‏ معدلة.
الشكل 21ج. حث طية لمقارنة ‎Hob-y‏ بالعينة الضابطة غير المستهدفة بواسطة متواليات ‎ShARNAMIR‏ غير معدلة (أعمدة بيضاء) ومعدلة (أعمدة مظللة) مقاسة بواسطة ‎qRT-‏ ‎Jia .PCR‏ البيانات متوسط + 50. © **< 0.01. الشكل 21د. قام تحليل بقعة نورثرن ل 8ل]4» كلي مستخلص من خلايا محولة مع العديد من ‎.ShRNAMIRs 3 shRNAS‏ تم استخدام المسابير (2001) المكملة للجدائل الموجهة والمنتقلة من المواضع 1 إلى 20 من ‎ShRNAMIRs 3 ShRNAS‏ لقياس وفرة ‎RNAS‏ صغيرة معالجة. تم استخدام مسبار مكمل ل ‎RNA‏ 55 كعينة ضابطة داخلية لتحديد تحميل ‎RNA‏ يحتوي ناقل معزز ‎pol ١١‏ :11ا©؛ ناقل معزز ‎Ji Pll: pol ١١‏ معزز ‎PIM: pol ١١‏ على متواليات ‎ShARNAMIR‏ معدلة.
الشكل 121. تقوم نتائج متوالية ‎RNA‏ لمجموعات متجانسة من خلايا حمراء فأرية محولة تقوم بالتعبير عن ‎ShRNAL‏ 2« 3< 4« 7 أو 8. تمت محاذاة متواليات هذه ال ‎RNAs‏ مع متوالية جديلة موجهة مناظرة مبينة عند الجزءِ العلوي من كل صورة. تم عرض أنواع جديلة موجهة لمتواليات مختلفة على المحور لا والتردد بنسبة قراءات متحاذية على المحور ‎X‏
تبين الأشكال 222-122 تؤدي ‎ShRNAMIRS‏ معدلة إلى فعالية استبعاد 861117
5 وحث جاما جلوبين ‎gamma globin‏ متزايدة في خلايا حمراء مشتقة من +010034 بشري.
الشكل 22أ. تم اختيار خلايا +6034 محولة مع نواقل تعبير ‎pol Hl‏ أو ‎pol ١١‏ عن ‎ShRNAS‏ مختلفة مع وبدون تعديل إما في وجود بيوروميسين ‎(POI Il)‏ أو مصنفة للتعبير عن ‎pol II) Venus‏ واا ‎pol‏ معدلة). تم قياس التعبير عن 8011178 بواسطة مخطط مناعي مع م-أكتين 8-8000 كحمل مقارن في اليوم 11 من التمايز.
الشكل 22ب. تم تحديد حث /(-جلوبين 910510- ‎MRNA‏ في اليوم 18 من التمايز بواسطة 087-0014. تمثل البياناتتسبة /(-جلوبين لخرج موقع ] الكلي ‎y)‏ + م]-جلوبين + 7 ‎(B-globin‏ ل ‎pol ١١١‏ (الأعمدة السوداء)؛ ‎pol ١١‏ (الأعمدة البيضاء)؛ واا ‎pol‏ المعدلة (الأعمدة الرمادية). * م0.05>0؛ * * * م>0.001.
الشكل 22ج. تم تقييم القياس والتحليل الإحصائي لمرقمات التمايز الحمراء (0071؛ ‎(GPA 5‏ والاستئصال بواسطة التدفق الخلوي. ‎:CTRL‏ نواقل ‎SFFV-shRNAmMIRNT‏ ر//اع5
الضابطة؛ نواقل ‎pol ١١١‏ :|١|©؛‏ نواقل ‎¢Pll: pol ١١‏ نواقل ‎PIM: pol ١١‏ تحتوي على متواليات ‎ShRNAMIR‏ معدلة. تمثل البيانات متوسط + ‎SD‏ من ثلاثة تجارب مستقلة. * * * م0.001>0. الشكل 22د. تم قياس هيموجلويين ‎F‏ لنواتج تحليل الخلية بواسطة كروماتوجراف سائل ‎Je‏ الأداء .في اليوم 18 من التمايز. يشير السهم إلى قمم ‎HOF‏ وتم توضيح نسبة ‎HDF‏ ‏5 لهيموجلويين كلي تحت الكروماتوجراف. الشكل 22ه. قامت صورة علاقة التعبير عن (-جلويين ‎MRNA‏ بواسطة ‎qRT-PCR‏ ‏في مقابل 1107 بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء ‎high performance liquid‏ ‎(HPLC) chromatography‏ تمثل الدوائر السوداء نواقل ‎MII‏ ا00؛ تمثل الدوائر المفتوحة والرمادية ‎pol ١١‏ أو ‎ShRNAMIRs‏ معدلة؛ على التوالي. تم توضيح معامل ‎aD‏ (22) لكل 0 البيانات. الأشكال 23-123ط تبين منع الأثر السلبي لاستبعاد 801117 على خلايا جذعية مكونة للدم في الكائن الحي بواسطة تقييد التعبير بالخلايا الحمراء ‎.erythroid cells‏ الشكل 123. تم تحويل ‎ADL‏ السلبية لخلايا نخاع العظم المعزولة من فثران ‎B-YAC‏ ‎(CD45.2)‏ خارج الكائن الحي مع نواقل ‎LEGO‏ التي تعبر عن 801118 تستهدف ‎*shRNAmMIR 5‏ أو عينة ناقل ضابطة غير مستهدفة ‎(SFF-ShRNAMIRNT)‏ والمزروعة في مستقبلات ‎Boyd‏ تم تعريضها للإشعاع بشكل قاتل (00045.1). تمت زراعة خلايا ضابطة غير محولة كعينة ضابطة. تم تنفيذ تحليل تطعيم بعد 4 8 و12 أسبوع من الزراعة الانتقالية في الدم المحيط ‎(PB) peripheral blood‏ ونخاع العظم ‎(BM) bone marrow‏ على التوالي. (4-0 فأر لكل مجموعة) 20 الشكل 23ب. تم تحديد ‎gia‏ الخلايا المعدلة بالجين (خلايا ‎(+Venus‏ في هذه ‎dll‏ بعد 4» 8 و12 أسبوع الزراعة الانتقالية في الدم المحيط ونخاع العظم. الشكل 23ج. تم تنفيذ الزرائع التنافسية باستخدام 0045.1 5 ‎CD45.2‏ الخلايا المانحة محولة مع النواقل المشار إليها والمزروعة في ‎Oi‏ زيجوت غير متجانس 6045.1/2 (لوحات علوية). بشكل بديل تم استخدام بروتين متألق أزرق ‎(BFP) blue fluorescent protein‏ يرمز اناقل المحايد (فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق) لتحديد لتحديد المجموعة المنافسة في ‎CD45.1 mile‏ في وضع مستقبل 0045.2 (الصور السفلى). تم توضيح
المخططات المنقوطة لمجموعات مخلوطة مختلفة مستخدمة للزراعة الانتقالية بعد ‎abl ADE‏ من التحويل. تتم الإشارة إلى الناقلين المتنافسين فوق كل صورة؛ يشير الأول إلى مجموعات 2 أو فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق محولة؛ على التوالي. الشكل 23د. تم تحليل مساهمة الخلايا المعدلة بالجين في فئران تمت إعادة تجميعها بشكل مجمع عند الأسابيع 4 و8 بعد الزراعة الانتقالية في الدم المحيط أو عند الأسبوع 12 في نخاع العظم والطحال ‎(Spl) spleen‏ تم توضيح المساهمة النسبية للخلايا المعدلة ‎gene (pall‏ ‎modified cells‏ محولة مع الناقلين المتنافسين. قام الناقل الأول المذكور بالتحكم في الخرج المكون للدم. تمثل كل نقطة فأر مستقبل فردي. الشكل 23ه. مقارنة مزدوجة لجزء خلية 8 من نخاع العظم في ‎gill‏ المحول للخلايا بين 0 نواقل تقوم باستهداف 8011178 في مقابل النواقل الضابطة ‎SFF-ShRNAMIRNT)‏ و فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق؛ الصورة اليسرى). بشكل مشابه؛ تم تحليل محتوى ‎LSK‏ في أجزاء خلية محولة ‎transduced cell‏ تمثل كل نقطة مستقبل فردي. تشير * و** إلى قيم ‎<p‏ 0.05 و0.01؛ على التوالي. الشكل 23و. تهيئة ناقل ‎LOR-ShRNAMIR‏ المستخدم لالتعبير ‎SEY)‏ عن السلالة 5 الحمراء (التفاصيل في النص). الشكل 23ز. تم تحليل حالة التعبير في الكائن الحي لناقل منطقة تحكم موضعي في العديد من السلالات المكونة للدم بعد 12 أسبوع بعد الزراعة الانتقالية. تمت معايرة نسب خلايا 65+ في كل فأر مع الخلايا الحمراء ‎CD71+/Terl19+‏ (4-0). الشكل 23ح. تم تنفيذ تجربة زراعة انتقالية تنافسية كما هو موضح في ج ود باستخدام 0 نواقل التعبير منطقة تحكم موضعي أو فيروس تكوين تركيز طحالي عن ‎.ShRNAMIR®‏ تمثل كل نقطة مستقبل فردي. ‎J<al‏ 23ط. تم ‎WA (hes‏ الدم المحيط +6034 المنقولة مع ‎LCR-‏ ‎<shRNAmIR*‏ 3 و8 أو ناقل ‎SFFV-GFP‏ كاذب وتم إخضاعها لتمياز أحمر في المعمل. في اليوم 7 بعد التحويل تم تقييم نشاط المعزز لنواقل ‎SFFV-GFP‏ ومنطقة تحكم موضعي في 5 مجموعة ثانوية ‎ches‏ مختلفة. تم توضيح مخططات بيانية لتدفق تمثيلي. أعمدة الخطأ في كل الأشكال = 50. التحليل الإحصائي: الاختبار ].
الأشكال 524-124 تبين استبعاد 801117 الانتقائي للسلالة وحث جاما جلوبين بواسطة ‎ShRNAMIRSs‏ معدلة. الشكل 124. تم تصنيف ‎HSPCs‏ +0034 محولة ب ‎LCR-shRNAMIR‏ 3 8 أو ناقل ‎SFFV-GFP‏ كاذب ب ‎FACS‏ لمبلغ متألق تعبير وتم قياس التعبير عن 861118 بواسطة مخطط مناعي مع ]-أكتين كحمل مقارن في اليوم 11 من التمايز. الشكل 24ب. تم تحديد حث /(-جلويين ‎MRNA‏ في اليوم 18 من التمايز بواسطة ‎qRT-PCR‏ تمثل البيانات نسبة 7/(+8) جلوبين. الشكل 24ج. القياس والتحليل الإحصائي لمرقمات التمايز الحمراء ‎erythroid‏ (0071؛ ‎(GpA‏ والاستتصال بواسطة تحليل التدفق السيتومتري ‎.flow cytometric analysis‏ قام ‎:CTRL 0‏ ناقل ‎SFFV-GFP‏ ضابط؛ ‎:LCRM‏ 50520145 معدلة المبين في الشكل 123 بالتعبير عبر معزز منطقة تحكم موضعي. تمثل البيانات متوسط + ‎SD‏ من ثلاثة تجارب مستقلة. الشكل 24د. تم قياس مستوى ‎HOF‏ لنواتج تحليل الخلية بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء .في اليوم 18 من التمايز. تشير الأسهم إلى قمم ‎HOF‏ وتم توضيح نسبة ‎HOF‏ ‏لهيموجلوبين الكلي تحت الكروماتوجراف. الشكل 24ه. صورة علاقة حث /-جلويين بواسطة ‎qRT-PCR‏ في مقابل ‎HbF‏ ‏بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . تشير أعمدة الخطأ إلى + 50 من ثلاثة تجارب الشكل 24و. تم تحويل نخاع العظم ‎HSPCs‏ +6034 مع ‎LCR-shRNAMIR3‏ أو غير مستهدفة والمزروعة في فئران ‎NSG‏ تم تعريضها للإشعاع بشكل أقل من القتل ‎3=n)‏ لكل 0 مجموعة). تم استخدام الخلايا غير المحولة كعينة ضابطة. بعد 14 أسبوع تم ‎CD34 Wa Jie‏ من نخاع العظم للحيوانات المزروعة وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل لمدة 14 يوم. تم تقييم التعبير عن ‎Guglay‏ و]-جلويين في خلايا مصنفة للتعبير عن مبلغ ‎Venus‏ ‏الشكل 25 يبين التتابع العميق ل 247 من منتجات ‎TRC ShRNA‏ التي تمت معالجتها في ‎daa)‏ من سلالات الخلايا. الشكل 26 يبين حالة التعبير في الكائن الحي عن ناقل ‎.LCR-ShRNAMIR‏
‎Jal‏ 127 عبارة عن مخطط وسترن لخلايا ‎shes‏ متمايزة في المعمل مشتقة من خلايا 4+ محولة من مانحين أصحاء تبين 801117 الأشكال الأيزومرية ‎(XL L)‏ وم-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 801117 ‎XL‏ تم توضيح ‎VON‏ المحدد بواسطة ‎DNA PCR‏ تحت كل خط.
الشكل 27ب يبين قياس استبعاد ‎BCL11A Error bars‏ في خلايا حمراء. كانت البيانات المشتق من مخططات وسترن كما هو مبين في الشكل 127 تقوم البيانات بتلخيص ثلاثة تجارب مستقلة استخدام ‎WA‏ من ‎mile‏ واحد. (أعمدة خطأ: ‎(SD‏
الشكل 27ج يبين حث جاما جلويين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة 41-0014 ‎wie (HDF) hemoglobin cla sans‏ بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . (أعمدة 0 خطأ: ‎(SD‏ ‏الشكل 28 يبين حث جاما جلوبين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة ‎RT-PCR‏ ‏كان قياس كمية حث ‎lala‏ جلويين في الخلايا الحمراء هو قياس استبعاد 801117 في الخلايا في الكائن الحي. أعمدة الخطاأً: ‎SD‏ تم توضيح البيانات من ثلاثة حيوانات مزروعة لكل مجموعة. الشكل 129 يبين مخططات وسترن التي تبين ل 861117 (صور 1 ‎XLy‏ أيزومرية) و]-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 81011/8-41. تمثل كل صورة (المرقمة 6-1 تحت الخط) تجرية مستقلة باستخدام خلايا من مانح واحد. الشكل 29ب يبين قياس استبعاد 8011178 في خلايا حمراء. البيانات مشتقة من مخططات وسترن المبينة في الشكل 29ا. (عمود خطأً: ‎(SD‏ ‏20 الشكل 29ج يبين حث ‎HE‏ الناتج بواسطة كروماتوجراف ‎Bile‏ عالي الأداء . (أعمدة خطأً: ‎(SD‏ ‏الشكل 30 يبين المتواليات المستخدمة في كل من أساسات فيروس تكوين تركيز طحالي ومنطقة تحكم موضعي لاستبعاد 801117 في خلايا حمراء متمايزة ب +0034. الشكل 31 يبين مخططات وسترن لاستبعاد 8611178 في ‎WA‏ حمراء متمايزة ب ‎.CD34+ 5‏
الوصف التفصيلي: يقوم الكشف الموضح هناء جزئياء على أساس تطوير نواقل علاج جيني فيروسية بطيئة تعبر انتقائيا عن ‎shRNA‏ تستهدف /80111 في ذرية ‎WIA‏ جذعية مكونة للدم ‎hematopoietic stem cells‏ (150). بالتالي» يتضمن الكشف طرق جديدة لتنظيم التعبير عن /(-جلويين في خلايا حمراء. بشكل أكثر ‎Juans‏ يمكن أن يتم تضمين هذه النشاطات في طرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين؛ شاملة مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا؛ بواسطة حث 7(-جلويين عبر تثبيط منتج جين 80111/8. في نماذج معينة؛ تم توفير نواقل علاج جيني فيروسية بطيئة تعبر انتقائيا عن ‎shRNA‏ تستهدف ‎BCLIIA‏ في ذريات خلية جذعية مكونة للدم؛ خلايا أساسية مكونة ‎pall‏ أو خلايا ‎Leds‏ أخرى مثل 0 خلايا جنينية ‎.embryonic cells‏ يتضمن الهيموجلوبين الناضج الطبيعي ‎Normal adult hemoglobin‏ أربعة بروتينات جلوبين» اثنين منها عبارة عن بروتينات ‎alpha (a) proteins (a) Wl‏ واثنين منها عبارة عن بروتينات بيتا ‎beta (B) proteins (B)‏ أثناء التطور الجنيني الثديي؛ تحديدا في ‎pid)‏ ¢ يقوم الجنين بإنتاج هيموجلوبين جنيني؛ والذي يتضمن اثنين من بروتينات جاما (()-جلويين ‎gamma‏ ‎(y)-globin proteins 5‏ بدلا من اثنين من بروتينات ]-جلويين ‎.f3 —globin proteins‏ عند نقطة معينة أثناء التطور الجنيني؛ يتم تبديل الجلوبين الجينيني عند هذه النقطة تتبدل كريات الدم الحمراء في التبدل الجنيني من سيطرة 7-جلويين إلى سيطرة م]-جلويين. يبدأ التبديل التطوري من إنتاج هيموجلوبين جنيني مسيطر أو ‎HBF‏ (0272) إلى إنتاج الهيموجلويين الناضج أو ‎HOA‏ ‏(0202) عند حوالي 28 إلى 34 أسبوع من الحمل ويستمر بشكل قصير بعد الولادة حتى يكون ‎HDA 0‏ مسيطرا. هذا الاستبدال يؤدي إلى بشكل أساسي من استنساخ المنخفض لجينات (-جلويين والنسخ الزائد لجينات ]|-جلويين. بشكل متوسط» يحتوي دم الشخص البالغ الطبيعي فقط على حوالي 72 ‎(HBF‏ على الرغم من أن مستويات ‎HBF‏ المتبقية لها اختلاف يزيد على 20 طية في البالغين الأصحاء ))2001( 38:367-73 ‎.(Atweh, Semin.
Hematol.‏ تتضمن أمراض الهيموجلوبين عدد من حالات الأنيميا ذات الأصل الجيني حيث يكون 5 هناك ‎zl)‏ منخفض و/أو تدمير متزايد (انحلال الدم) لخلايا الدم الحمراء ‎red blood cells‏
‎ay (RBCs)‏ تتضمن ‎Lad‏ عيوب ‎dws‏ تؤدي إلى إنتاج مركبات الهيموجلويين ‎hemoglobins‏ غير الطبيعية مع قدرة ضعيفة متزامنة على الحفاظ على تركيز الأوكسيجين. تتضمن بعض هذه الاضطرابات فشل إنتاج ‎Gustaf‏ الطبيعي بكميات كافية؛ في حين تتضمن الأخرى الفشل في إنتاج ]-جلوبين الطبيعي كليا. تتم الإشارة بشكل عام إلى هذه الاضطرابات المرتبطة ببروتين ]-جلوبين بأمراض الهيموجلوبين. مثلاء تنتج مرض الخلية المنجلية من نقطة تطفر نقطة في جين (]-جلوبين البنيوي؛ بما يؤدي إلى إنتاج هيموجلوبين غير طبيعي (متمنجلة) ‎(sickled) hemoglobin‏ (105). 105 اخلايا الدم الحمراء أكثر ‎Alia‏ من خلايا الدم الحمراء الطبيعية وتخضع لانحلال الدم بشكل أكثر جهوزية؛ ‎le‏ يؤدي بالأخير إلى أنيميا ‎Semin.
Hematol. 38(4):367-73 (2001)) anemia‏ ,200/60)._تنتج ثلاسيميا من عيب جزئي أو كلي في التعبير عن جين م]-جلوبين ‎Le (Boglobin gene‏ يؤدي إلى عيب في أو غياب ‎HbA‏
كان البحث عن العلاج يهدف إلى تقليل عدم توازن سلسلة جلويين في مرضى مصابين بأمراض الهيموجلوبيين على التلاعب الصيدلاني في ‎HPF‏ جنيني. يتم إظهار القدرة العلاجية لهذه المناهج بواسطة الملاحظات بأن هناك مجموعات معينة من المرضى ذوي عيوب ‎Billa‏ وأعلى 5 .من مستويات طبيعية من ‎HOF‏ يعانون من مسار سريري أخف للمرض أكثر من المرضى ذوي مستويات نضج طبيعية ل ‎HDF‏ مثلاء تتضمن مجموعة مرضى أنيميا الخلية المنجلية العرب السعوديين الذين عبروا عن 730-20 ‎HBF‏ مظاهر سريرية خفيفة للمرض ( ‎Pembrey, et al.,‏ ‎(Br.
J.
Haematol. 40: 415-429 )1978(‏ والآن أصبح ‎Vee‏ تخفيف أمراض الهيموجلويين» ‎Jie‏ مرض الخلية المنجلية وثلاسيميا؛ بواسطة إنتاج ‎HbF‏ زائدة ) ‎Jane et al.,‏ ‎Br.
J.
Haematol. 102: 415-422 (1998); Bunn, N.
Engl.
J.
Med. 328: 0‏
)1993( 129-131( يقوم 801117 القامع للنسخ بتمثيل هدف علاجي ل أمراض م-الهيموجلويين. تم تطبيق تداخل ‎RNA‏ باستخدام ‎RNAs‏ دبوسية ‎(ShRNAS)‏ قصيرة المعبر عنها بواسطة معزز ‎pol II‏ لتقليل التعبير عن 801117 في ‎WA‏ مكونة للدم. قام استبعاد 8601117 في ‎WIA‏ جذعية 5 مكونة للدم فأرية بإضعاف التطعيم طويل المدة. لتجنب سمية خلية جذعية مكونة للدم؛ تم قمع التعبير عن ‎BCLIIA‏ في خلايا ‎shes‏ انتقائيا عبر ‎Lge ShRNAS‏ بواسطة ‎microRNA‏
بواسطة ‎xe .(ShRNAMIRs) pol ١١‏ متواليات متوافقة مع الهدف المتطابق؛ تمت ملاحظة التقليل بشكل معلم باستخدام نواقل ‎pol ١!‏ بسبب فروق 5-3 ‎Ant‏ الجدائل الموجهة بين الأنظمة التي تقوم بالتأثير بقوة على الاستبعاد المستهدف. تم تصميم إزاحة مناظرة بمقدار 4 04 في جدائل موجهة ل ‎ShRNAMIRS‏ حيث يتم بشكل مدهش وغير متوقع تحسين استبعاد 8011174 وقمع ‎(Hbb-y 5‏ التناظر الوظيفي لجين 7-جلويين بشري في سلالة الخلية الحمراء الفأرية. تم التعبير عن 904/2045 المعدلة بطريقة انتقائية للخلايا الحمراء لمراوغة الأثر العكسي على تطعيم خلية جذعية مكونة للدم فأري؛ وقد أدى هذا إلى استبعاد 861117 كافي ومستويات عالية من ‎HOF‏ ‏في ‎WA‏ حمراء مشتقة من 00034 بشرية. تم تطوير استراتيجية للتصميم المنظوري ل ‎shRNAmMIRs‏ المشتقة من حواجز ‎ShRNA‏ المعبر عنها بواسطة ‎١١١‏ ا0م. تشكل هذه 0 الاستراتيجية منهج محسن لعلاج جيني في أمراض الهيموجلويين وغيرها من أمراض تتطلب سلالة انتفائية تعبر عن متواليات إسكات جيني. النواقل الفيروسية البطيئة والارتجاعية
في بعض النماذج؛ يقدم الكشف الحالي تركيبات وطرق محسنة لعلاج أمراض الهيموجلويين باستخدام نواقل توصيل جينية قائمة على أساس فيروس ارتجاعي؛ مثلاء فيروس بطيء؛ التي تحقق التعبير عالي المستوى المستديم للجينات العلاجية المنقولة في الخلايا الحمراء ‎eythroid cells‏ أو خلايا حمراء كاشفة ‎.erythroid precursor cells‏ في أحد نماذج ‎pla)‏ يتضمن الناقل ‎MIRNA‏ صناعي يتضمن متواليات مستهدفة إلى 801117 مستنسخ في الحلقة الجذعية ‎stem loop‏ لمتوالية 014-223 الداخلية ( ‎Amendola et al., Mol‏ ‎(Ther 17:1039-52, 9‏ يتم توليد البنية الجذعية/الحلقية للنواقل الحالية بواسطة متواليات 0 مكملة لأوليجونيكلوتيدات ‎oligonucleotides‏ متواليات برقم هوية:18-1 و44-25 مكشوف عنها هنا. انظر الأشكال ‎١1‏ 12 114 21أ؛ ومثال 11. تم استنساخ هذه البنية الحلقية/الجذعية مستنسخ في خلفية ‎.MIR-223/MIR-30‏ بعد ذلك تم استنساخ بنية ‎mIRNA/ShRNA‏ الكلية في قالب جيني مع فيروس تكوين تركيز طحالي؛ تترا سيكلين» أو معزز منطقة تحكم موضعي يحتوي على ناقل ذات التنشيط. تم توضيح النواقل الفيروسية البطيئة المناسبة ‎Why‏ للاختراع بواسطة ‎Pawliuk et al. (2001) Science 294:2368 and Imren et al. (2002) PNAS 5‏
60 التي تم دمجها هنا بالإشارة إليها كمراجع.
بالتالي» في أحد الجوانب؛ تم هنا توفير ‎BCLIIMiCroRNA‏ تخليقي يتضمن ‎a‏ ‏86118 أول» ‎gia‏ حلقي؛ وجزءه 8011178 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5" إلى 3 ؛ حيث الجزء الحلقي موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بأجزاء 8011178 الأول ‎(Jilly‏ وحيث ‎Sa‏ ‏801118 الثاني مكمل لجز 8011178 الأول بحيث تكون أجزاء 8061117 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية 1000 ‎hairpin‏ مع الجزءِ الحلقي الذي يكون ‎gall‏ الحلقي للحلقة الدبوسية الذي تم تكوينه بالتبعية. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء ‎shal‏ ‏801118 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات. جز 8011178 الأول ‎Gide‏ من متوالية 861117 ويؤدي إلى الجديلة المرسلة أثناء معالجة ‎ShRNA‏ إلى ‎SIRNA‏ مزدوج ‎syns‏ ‎BCLIIA 0‏ الثاني مكمل ‎«Jol 8011178 gal‏ حيث ‎gia‏ 8011/8 الثاني يؤدي إلى الجديلة الموجهة التي يتم دمجها_ في معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ تداخل ‎RNA‏ أو إسكات جين ‎.BCL11A‏ ‏في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء ‎shal‏ ‏18 8011 الأول والثاني ‎are‏ مشتق من متوالية ‎.BCL11A MRNA‏ في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء يبدأ جزء 801118 الأول ب -666©0- عند الطرف 5” وينتهي ‎ga‏ 8011178 الثاني ب -6060- عند الطرف 3”. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMiCroRNA‏ التخليقي موضح هناء يتكون جزء 801118 الأول أيضا من -606©6- عند الطرف 5 وينتهي ‎ga‏ 8011178 الثاني ب - 0 6066- عند الطرف 3” . في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء يبدأ جزء ‎BCL11A‏ الأول ب ‎-GCGA-‏ « -1016- أو -16- عند الطرف 5 ‎cians‏ 8611178 الثاني مكمل لجز 8011178 أول. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMiCroRNA‏ التخليقي موضح هناء يتكون جزء ‎Lad JNIBCL1IIA 5‏ من ‎«—-TCTG- . -GCGA-‏ أو -1©6- عند الطرف 5” .
في أحد النماذج وفقا لأي من 8ل801111/10005 التخليقي موضح هناء ينتهي جزء 801118 الثاني ب -1111- عند الطرف 3 . في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎(ba‏ يتضمن ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي متوالية نيكلوتيد ‎sequence‏ 0110160006 مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25. في أحد النماذج ‎Gy‏ لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎(ba‏ يتكون ‎BCL11MicroRNA‏ التخليقي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1) 44-25. في أحد النماذج ‎ly‏ لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎(ba‏ يتكون ‎BCL11MicroRNA 0‏ التخليقي بشكل أساسي من متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء يتم اختيار جزه 801118 الأول من المجموعة المكونة من ‎CGCACAGAACACTCATGGATT‏ ‏(متوالية بهوية رقم: 46؛ ‎Gude‏ من 0141© 801118 أوليجو موضحة ‎(Wa‏ ‎CCAGAGGATGACGATTGTTTA 5‏ (متوالية بهوية رقم: 47؛ مشتق من 00142 ‎BCL11A‏ ‏أوليجو موضحة هنا) ‎TCGGAGACTCCAGACAATCGC‏ (متوالية بهوية رقم: 48؛ مشتق من 853 86118 أوليجو أو ‎shRNAL‏ أو 53 موضحة هنا)ء ‎(CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC‏ (متوالية بهوية رقم: 49؛ مشتق من ‎ShRNA2‏ أو 5 موضحة ‎TCAGGACTAGGTGCAGAATGT «(la‏ (متوالية بهوية رقم: 50؛ مشتق 0 من ‎ShRNA4‏ أو 811 موضحة ‎TTCTCTTGCAACACGCACAGA «(ls‏ (متوالية بهوية رقم: 51؛ مشتق من ‎D8‏ 801118 أوليجو أو ‎ShRNA3‏ أو 08 موضحة ‎(We‏ ‎GATCGAGTGTTGAATAATGAT‏ (متوالية بهوية رقم: 52؛ مشتق من ‎ShRNAS‏ أو 0 اه 012 موضحة ‎CAGTACCCTGGAGAAACACAT (lia‏ (متوالية بهوية رقم: 3؛ مشتق من ‎ShRNAS‏ أو ‎SOAS‏ موضحة ‎CACTGTCCACAGGAGAAGCCA «(lia‏ 5 (توالية بهوية رقم: 54؛ ‎Gude‏ من ‎shRNAT‏ أو 50811 موضحة ‎(ba‏ ‎ACAGTACCCTGGAGAAACACA‏ (متوالية بهوية رقم: 55؛ مشتق من 861118
‎shRNA XLC4‏ و5004 موضحة هنا ‎CAACAAGATGAAGAGCACCAA‏ (متوالية بهوية رقم: 56؛ ‎Gude‏ من أوليجو غير مستهدفة ‏ ل 801118 موضحة هنا)؛ ‎gcgcCGCACAGAACACTCATG‏ (متوالية بهوية رقم: 57؛ مشتق من 0114165 أوليجو موضحة هنا)» ‎GCGCTCGGAGACTCCAGACAA‏ (متوالية بهوية رقم: 58؛ مشتق من 65 أو أوليجو ‎E3 mod‏ أو ‎sh RNA1 mod‏ موضحة ‎(La‏ ‘ ‎gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAA‏ (توالية بهوية رقم: 59؛ مشتق من 8565 أو ‎ShRNA2mod‏ موضحة هنا)؛ ‎gcgcTCAGGACTAGGTGCAGA‏ (متوالية بهوية ‎tad)‏ ‏0؛ ‏ مشتق من 165 أو ‎shRNAdmod‏ موضحة | هنا)؛ 900601068616111 (متوالية بهوية رقم: 61؛ مشتق من 5001265 0 01264 أو ‎ShRNASmod‏ موضحة هنا)؛ ‎gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC‏ (متوالية بهوية رقم: 62؛ مشتق من 5085650 50186000 موضحة هنا)؛ ‎gcgcCACTGTCCACAGGAGAA‏ (متوالية بهوية رقم: 63؛ مشتق من 5081165 أو 900 موضحة هنا)؛ 60/006078 60601101011 (متوالية بهوية رقم: 4؛ مشتق من 0865 806111 أو ‎D8 mod‏ أو ‎ShRNA3mod‏ موضحة 48(« ‎GCGCACAGTACCCTGGAGAAA 5‏ (متوالية بهوية رقم: 65؛ مشتق من 801118 ‎«C4G5‏ أو ‎mod‏ 04 أو ‎ ShRNASmMod‏ موضحة هنا)؛ ‎CGCACAGAACACTCATGGATT‏ (متوالية بهوية رقم: 66؛ مشتق من 80111 ‎D12G5-2‏ موضحة هنا)ء 4 ‎ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT‏ (متوالية بهوية رقم: 67؛ مشتق من ‎DI2G5-2‏ 8011178 موضحة هنا ). في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء ‎gall‏ الحلقي مشتق من ‎-MicroRNA‏ في أحد النماذج» ‎MicroRNA‏ عبارة عن ‎microRNA‏ انتقائي لمكونات الدم. ‎Mi.‏ 142حخااص ‎.MiR-223 s miR-181 (miR-155‏ في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCLIIMicroRNA‏ التخليقي موضح ‎microRNA la‏ عبارة عن 014223. في أحد النماذج وفقا لأي من ‎BCL1IMicroRNA‏ التخليقي موضح هناء ‎gall‏ الحلقي عبارة عن 010081919918989 (متوالية برقم هوية:68).
في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي جزيء حمض نووي معزول ‎isolated nucleic‏ ‎acid molecule‏ يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة_ من متواليات برقم هوية:18-1؛ 44-25« أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي تركيبة تتضمن جزيء حمض نووي ‎nucleic acid molecule 5‏ واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو ‎BCLI1IMicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. بالتالي» في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف ‎Jal‏ تركيبة تتضمن على الأقل ناقل أو ‎LAG‏ ‏يتضمن جزيء حمض نووي يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات 0 برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25« أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة يتضمن ناقل أو فيروس يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25 أو ‎BCLT1MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في أحد الجوانب؛ يقدم الوصف الحالي خلية عائلة يتضمن ‎Jil‏ فيروس أو بكتريا يتضمن جزيء حمض نووي واحد على الأقل يتضمن متوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:18-10:13-1 44-25« أو ‎BCL1IMicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في أحد النماذج؛ الناقل عبارة عن ناقل فيروسي ‎viral vector‏ أو فيروس. تداخل ‎RNA‏ (نهلا») الذي يتم التوسط فيه بواسطة ‎RNAS‏ متداخلة ‎(SIRNA)‏ أو ‎(MIRNA) microRNAs‏ عبارة عن طريقة قوية من أجل تنظيم ما بعد النسخي للتعبير الجيني. 0 تتم استخدام ‎RNAI‏ بشكل موسع لدراسة العمليات البيولوجية في الخلايا الثديية ‎mammalian‏ ‎(Kay cells‏ أن يشكل منهج علاجي لأمراض بشرية حيث سيكون مطلويا تضمين التعبير الجيني. بشكل يعتمد على درجة التكامل بين متواليات ‎MRNA 3 MIRNA‏ المستهدف؛ يتم فقد التعبير الجيني بواسطة حث تدهور ‎MRNA‏ المتجانس أو بواسطة تخفيف الترجمة. يتم تحويل ‎miRNAs‏ الداخلية كنواتج استنساخ أساسية وبالتالي تتم معالجتها بواسطة ‎RNase ١١١ a)‏ ‎Drosha 5‏ )1( لتكوين بنية حلقية جذعية. يقوم التصدير والشق النووي بواسطة ‎Dicer‏ بتوليد قصير ناضج جزيء مزدوج الجديلة ‎(SIRNA) double stranded molecule‏ التي يتم فصلها
في جدائل توجيه وأخرى منتقلة. يتم تحميل الجديلة الموجهة في معقد إسكات محفز ب ‎RNA‏ ‏المعقد المؤثر الذي يتوسط في شق ‎MRNAS‏ المستهدفة مع الجديلة الوظيفية الموجهة التي ترتبط ببروتينات معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ (2) ويتم تدهور هذه الجديلة المرسلة [تمت مراجعتها في (3)]. يعتمد تحميل جدائل التوجيه في مقابل الجدائل المنتقلة في معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ ‏5 بشكل كبير على استقرار الطرف 5” ل ‎SIRNA‏ مع الجديلة الأقل استقرار المدمجة بشكل مفضل في معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ )4 5)؛ على الرغم من التنظيم المحدد في الخلايا الثديية غير مفهوم بشكل كامل. يحتوي الطرف 5" من الجديلة الموجهة على 'منطقة البذرة؛” وهي مهمة لتحديد الهدف (6؛ 7). الشق المضبوط بواسطة ‎Dicer Drosha‏ مهم من أجل توليد ‎RNAS‏ موجهة مع مناطق البذرة المحددة التي تتوسط في الارتباط المناسب ب ‎MRNAS‏ المستهدفة. تؤدي 0 المعالجة غير الدقيقة إلى الارتباط بالجزيئات البعيدة عن الهدف ولكنها تقوم بالإزاحة في مواقع الشق ‎Lay‏ تعدل تركيبة النيكلوتيد للأطراف المزدوجة؛ والتي يمكن أن يكون لها أثر قوي على
تحميل الجديلة في معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ (6). يتم تثبيط التعبير عن البولي ببتيدات المستهدفة المختارة من خلال استخدام عوامل تداخل ‎RNA‏ يقوم تداخل ‎(RNA) RNA‏ باستخدام مزدوجات ‎RNA‏ صغيرة متداخلة ‎(SIRNA)‏ ‏5 تستهدف ‎RNA‏ المرسل الذي يرمز البولي ببتيد المستهدف للتدهور الانتقائي. يتضمن إسكات ما بعد النسخ معتمد على ‎SIRNA‏ للتعبير الجيني شق جزيء ‎RNA‏ مرسل مستهدف عند موقع موجه بواسطة ال ‎RNAI SIRNA‏ عبارة عن عملية محفوظة تقييميا وبالتالي يتم التعبير عن أو إدخال ‎RNA‏ لمتوالية متطابقة أو مشابهة بشكل كبير لجين مستهدف يؤدي في تدهو انتقائي للمتوالية أو إسكات الجين ما بعد الانتساخي الانتقائي ‎(PTGS) post-transcriptional gene silencing‏ 0 لغلا مرسل ‎(MRNA)‏ محول من جين مستهدف ‎Coburn, G. and Cullen, 8. hi)‏ ‎J.
Virology 76(18):9225‏ (2002))؛ وبالتالي يتم تثبيط التعبير عن الجين المستهدف. في أحد النماذج؛ ال ‎RNA‏ عبارة عن ‎RNA‏ مزدوج الجديلة ‎.(dsRNA) double stranded RNA‏ وقد تم توضيح هذه العملية في النباتات» ‎(cl WU‏ والخلايا الثديية. في الطبيعة؛ يتم بدء ‎RNAI‏ ‏بواسطة إندوكلياز ‎Dicer‏ الانتقائي ل ‎RNA‏ مزدوج الجديلة ؛ ‎Ally‏ تقوم بتعزيز شق معالج ل ‎RNA 25‏ مزدوج الجديلة طويل في شظايا مزدوجة الجديلة تسمى ‎(SIRNAS‏ يتم دمج ‎SIRNAS‏ في معقد بروتين (يسمى ‎dad‏ إسكات محفز ب ‎“RNA‏ أو ‎(RISC‏ يقوم بالتعرف على وشق
‎mRNAs‏ المستهدفة. ‎Lad RNAP cy Lad (Sa‏ بواسطة إدخال جزيئات حمض نووي ‎siRNAs Sie nucleic acid molecules‏ تخليقي أو عوامل تداخل ‎(RNA‏ لتثبيط أو إسكات التعبير عن الجينات المستهدفة. حسب الاستخدام هناء يتضمن "تثبيط التعبير الجيني المستهدف" أي تقليل في نشاط التعبير أو البروتين أو مستوى الجين المستهدف أو البروتين المرمز بواسطة الجين المستهدف مقارنة بحالة حيث لا يوجد تداخل ‎RNA‏ تم حثه. سوف يكون التقليل بنسبة على الأقل 710؛ على الأقل 720؛ على الأقل 730؛ على الأقل 740 على الأقل 50 على الأقل 0. على ‎INI‏ 770 على الأقل 780 على الأقل 790؛ على الأقل 795؛ على الأقل 799 أو أكثر مقارنة بالتعبير عن جين مستهدف أو النشاط أو مستوى البروتين ‎protein‏ المرمز بواسطة جين مستهدف والتي تم استهدافها بواسطة عامل تداخل ‎RNA‏
المصطلحات "عامل تداخل ‎"RNA‏ واتداخل ‎"RNA‏ حيث يتم استخدامها لتضمين هذه الصور من الإسكات الجيني الذي يتوسط فيه ‎RNA‏ مزدوجة الجديلة؛ بغض النظر عما إذا كان عامل تداخل ‎RNA‏ يتضمن ‎ShRNA (miRNA (siRNA‏ أو غيرها من جزيئات ‎RNA‏ مزدوجة الجديلة. يتم تحديد ‎SIRNA‏ كعامل ‎RNA‏ يعمل على تثبيط التعبير عن جين مستهدف؛ مثلاء بواسطة ‎RNAI‏ يمكن أيضا تخليق ‎SIRNA‏ كيماويا؛ ويمكن ‎Leal]‏ بواسطة انتساخ في المعمل؛ 5 أو ‎(Sa‏ إنتاجها في خلية عائلة ‎host cell‏ في أحد النماذج؛» ‎SIRNA‏ عبارة عن جزيء ‎RNA‏ ‏مزدوج الجديلة ذو طول حوالي 15 إلى حوالي 40 نيكلوتيد. بشكل مفضل حوالي 15 إلى حوالي 8 نيكلوتيدات؛ بشكل أفضل حوالي 19 إلى حوالي 25 نيكلوتيد؛ ويشكل أفضل حوالي 19؛ 20 1 2 أو 23 نيكلوتيد. ويمكن أن تحتوي على جزءِ معلق 3' و/أو 5' على كل جديلة لها طول بمقدار حوالي 0 1؛ 2 3؛ 4؛ أو 5 نيكلوتيدات. يعتمد طول ‎Glad) gall‏ بين الجديلتين؛ 0 أيء طول ‎gall‏ المعلق على جديلة واحد لا تعتمد على طول ‎gall‏ المعلق على الجديلة الثانية. بشكل مفضل ‎SIRNA‏ قادر على تعزيز تداخل ‎RNA‏ خلال تدهور أو إسكات جيني انتقائي ما
بعد الانتساخ لل ‎RNA‏ مرسل المستهدف ‎(MRNA) target messenger RNA‏ ‎siRNAs cua‏ تتضمن ‎Lad‏ دبوس صغير (أيضا المسمى حلقة ‎RNAS (Leds‏ ‎.(ShRNAS)‏ في أحد النماذج؛ يتم تكوين ‎SARNAS‏ هذه من جديلة مضادة للحس قصيرة ‎Nia)‏ ‏5 حوالي 19 إلى حوالي 25 نيكلوتيد)» متبوعة بواسطة ‎dala‏ نيكلوتيد م1000 ‎nucleotide‏ بمقدار حوالي 5 إلى حوالي 9 نيكلوتيدات؛ والجديلة الحسية المناظرة. بشكل بديل؛ يمكن أن تتخطى
الجديلة الحسية بنية حلقة نيكلوتيد ‎(Sag Nucleotide loop structure‏ أن تتبعها الجديلة المضادة للحس. يمكن احتواء هذه ال ‎ShRNAs‏ في بلازميدات ‎Glug dll plasmids‏ الارتجاعية؛ والفيروسات البطيئة ‎lly‏ يتم التعبير عنها من؛ ‎Sia‏ معزز !اا ‎U6 pol‏ أو معزز
‎jal‏ (انظر؛ مثلاء 9)4(:493-501 ‎(Stewart, et al. (2003) RNA April;‏ الذي تم دمجه
‏5 هنا بالإشارة إليه كمرجع). يمكن أن يكون الجين المستهدف أو متوالية عامل تداخل ‎RNA‏ عبارة عن جين خلوي ‎cellular gene‏ أو متوالية جينومية ‎Sie (genomic sequence‏ المتوالية 8061118. يمكن أن تكون ‎SIRNA‏ مناظرة بشكل ‎pall lad‏ المستهدف أو المتوالية الجينومية؛ أو شظية مما سبق. حسب ما هو مستخدم في هذا السياق؛ يتم تحديد المصطلح 'مناظر" على أنه مطابق بشكل أساسي؛ ‎Jae‏ بشكل مناسب؛ أو مشابه ل ‎MRNA‏ المستهدف؛ أو
‏0 ثشظية مما سبق؛ لتفعيل تداخل ‎RNA‏ للهدف. بالإضافة إلى جزيئات ‎RNA‏ الأصلية ‎RNA‏ ‏مناسبة لتثبيط أو التداخل مع التعبير عن متوالية مستهدفة وتتضمن مشتقات ونظائر ‎RNA‏ بشكل مفضل؛ ال ‎SIRNA‏ متطابقة مع الهدف. يقوم ال ‎SIRNA‏ بشكل مفضل باستهداف متوالية واحدة
‏فقط. يمكن حجم كل من عوامل تداخل ‎(RNA‏ مثل ‎SIRNAS‏ من أجل ‎HEY)‏ القوية بواسطة؛
‎Jackson ‏في‎ Mic ‏حالة التعبير. هذه الطرق معروفة للخبير في المجال وقد تم توضيحهاء‎ Sle
‎Let al.
Nature Biotechnology 6:635-637, 2003 5‏ بالإضافة إلى ‎dls‏ التعبير؛ يمكن ‎ell‏ أن يقوم بحجز المتواليات المستهدفة القوية لمتواليات متشابهة في قواعد بيانات المتوالية لتحديد المتواليات القوية التي يمكن أن يكون لها ‎JBI‏ منفصلة عن الهدف. ‎lie‏ ريما كان عدد
‏5 أو ريما أقل ‎Jie‏ 11 من النيكلوتيدات المتجاورة؛ لهوية متوالية مناسبة لتوجيه عملية إسكات
‏نواتج استنساخ غير مستهدف. ‎(IL‏ يمكن أن يقوم أحدهم أولا بحجز ال ‎SIRNAS‏ المقترح
‏0 لتجنب الإسكات البعيد عن الهدف القوي باستخدام تحليل ‎Liga‏ المتوالية بواسطة أي طرق مقارنة متوالية معروفة؛ مثل بي ال ايه اس تي ‎BLAST‏ يتم اختيار متواليات ‎SIRNA‏ لزيادة استهلاك الجديلة المضادة للحس ‎antisense strand‏ (الموجهة) ل ‎SIRNA‏ في معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ ووبالتالي تقوم بزيادة قدرة معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ لاستهداف ‎BCL11A mRNA‏ للتدهور. يمكن تحقيق ذلك بواسطة مسح متواليات تتضمن أقل طاقة حرة للارتباط عند الطرف 5"
‏5 .من الجديلة المضادة للحس. تؤدي الطاقة الحرة الأقل إلى تحسين عدم لف الطرف 5” من الجديلة المضادة للحس ل ‎SIRNA‏ مزدوج؛ وبالتالي يتم ضمان أن الجديلة المضادة ‎gall‏ سوف يتم
استهلاكها بواسطة معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ وشق انتقائي للمتوالية المباشرة لذ ‎BCLITA‏ ‎MRNA‏ بشري. تحتاج جزيئات ‎SIRNA‏ إلى أن تكون مقيدة لهذه الجزيئات التي تحتوي على ‎RNA‏ فقط ولكن؛ ‎le‏ تتضمن أيضا نيكلوتيدات معدلة كيماويا وغير نيكلوتيدات» وتتضمن
أيضا جزيئات حيث يتم استبدال جزيء سكر ريبوزي ‎ribose sugar molecule‏ لجزيء سكر
‎sugar molecule 5‏ آخر أو جزيء يقوم بتنفيذ وظيفة أخرى. علاوة على ذلك؛ يمكن استخدام رابط غير طبيعي بين وحدات نيكلوتيد ‎Jie nucleotide residues duly‏ رابط فوسفورو ثيوات ‎Sa phosphorothioate linkage‏ اشتقاق جديلة ‎RNA‏ مع مجموعة وظيفية تفاعلية ‎de gan‏ مبلغة؛ ‎Jie‏ فلوروفور ‎fluorophore‏ تحديدا يتم تعديل المشتقات المفيدة عند طرف أو أطراف جديلة ‎(RNA‏ بشكل مثالي الطرف 3' للجديلة الحسية. ‎Ole‏ يمكن أن يقوم 2'-
‏0 هيدروكسيل ‎2'-hydroxyl‏ عند الطرف 73 بالاشتقاق بشكل جاهز وانتقائي مع تشكيلة من المجموعات. تقوم نيكلوتيدات مشتقات ‎RNA‏ أخرى مفيدة تتضمن شقوق كربوهيدرات معدلة؛ ‎Jie‏ ‏وحدات بنائية 0:2- ‎dallas‏ بألكيل ‎2'O-alkylated residues‏ أو مشتقات رببوسيل 0-72-
‏ميثيل ‎2'-O-methyl ribosyl derivatives‏ ومشتقات ريبوسيل 2:-0-فلورو 2-0-1100 ال2ا005. يمكن أيضا تعديل قواعد ‎RNA‏ أيضا. يمكن استخدام أي قاعدة معدلة
‏15 مفيدة لتثبيط أو تداخل مع التعبير عن متوالية مستهدفة. مثلاء قواعد مهلجنة ‎halogenated‏ ‎(Sa Mie (bases‏ دمج 5-برومو يوراسيل ‎S-bromouracil‏ و5-يودو يوراسيل -5 ا[10000186. يمكن أيضا معالجة القواعد بألكيل؛ ‎Ole‏ يمكن دمج 7-ميثيل جوانوسين -7 06 في موضع وحدات جوانوسين بنائية ‎guanosine residue‏ يمكن أيضا
‏دمج قواعد غير طبيعية تؤدي إلى تثبيط ناجح. تتضمن أفضل عمليات تعديل ‎siRNA‏ 2-
‏0 ديوكسي -2"-فلورو يوربدين ‎2'-deoxy—2'-fluorouridine‏ أو نيكلوتيدات حمض نووي مقفلة ‎(LAN) locked nucleic acid‏ ومزدوجات ‎RNA‏ تحتوي .على إما فوسفو داي إستر ‎phosphodiester‏ أو أعداد مختلفة من روابط فوسفورو ثيوات ‎phosphorothioate‏ ‏5. هذه التعديلات معروفة للخبير في المجال وقد تم توضيحهاء ‎Obs‏ في ‎Braasch et‏ ‎.al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003‏ يمكن إدخال أغلب التعديلات المفيدة
‏5 لجزيئات ‎SIRNA‏ باستخدام المركبات الكيماوبة المحددة لتكنولوجية أوليجونيكلوتيد المضادة للحس ‎JSG .8071560156 oligonucleotide technology‏ مفضل»؛ تتضمن التعديلات تعديل 2'-
©-ميثيل ‎Jif 2'-O-methyl‏ بشكل مفضل استبعاد هذا التعديل. تستبعد التعديلات أيضا بشكل مفضل تعديلات مجموعات 5'-هيدروكسيل الحرة من ‎SIRNA‏ تقدم الأمثلة هنا أمثلة انتقائية لعوامل تداخل ‎Jie (RNA‏ جزيئات ‎ShRNA‏ التي تقوم باستهداف ‎mRNA‏ 8011178 بفاعلية. غالبا ما يتم استخدام ‎RNAS‏ دبوسية قصيرة ‎(ShRNAS) short hairpin‏ تعمل بواسطة بوليمراز ‎III (pol) Polymerase‏ في أوضاح تجارب بيولوجية. تقوم ‎ShRNAS‏ بمحاكاة بنية ‎miRNA sale‏ البادئة بالتوسط في؛ وبالتالي تتخطى خطوة الشق الأولى التي تم التوسط فيها بواسطة ‎Drosha‏ يمكن أن يتم التعبير عن ‎SARNAS‏ بوفرة لتوفير استبعاد مناسب. مع ذلك عند حالات الإصابة ذات المضاعفة العالية ‎(MOI) multiplicities of infection‏ تم التبليغ عن التشبع المفرط ل آلية ‎RNAP‏ الداخلية في بعض الحالات التي ترتبط بالآثار السمية الخلوية ‎cytotoxic 0‏ بسبب عدم انتظام ‎miRNAs‏ داخلية (11-9). يبدو أن هناك اثنين من مكونات ‎microRNA‏ التي تقوم بمعالجة؛ 000005 و8902 تقوم بتقييد سعة هذا المسارء وتقوم بالتعبير المفرط عن هذه البروتينات التي تؤدي إلى سعة استبعاد زائدة )15-12( بشكل إضافي؛ يمكن أن يقوم تنشيط الاستجابات المناعية الداخلية التي تم بدؤها بواسطة ‎RNAs‏ صغيرة في متوالية معينة بالإضافة إلى طريقة غير انتقائية بالتوسط في الآثار الجانبية السمية الخلوية (16؛ 5 17)؛ التي تمت مراجعتها في (18). أدت هذه الآثار إلى في ‎aby‏ معدل وفيات في الفتران في بعض الأنظمة الجينية المتحولة الاختبارية بشكل مبلغ كآثار جانبية مباشرة للتعبير المفرط عن .)19 14( shRNA ‏سوف تكون هناك حاجة‎ (RNA ‏بالنسبة للترجمة السريرية للعلاجات القائمة على أساس‎ ‏هذه الفئة‎ . polymerase Il promoters Il ‏إلى أنظمة تعبير بديلة باستخدام معززات بوليمراز‎ ‏-من المعززات تسمح باستخدام العناصر المنظمة المثالية للسلالة أو التعبير الانتقائي لنوع الخلية.‎ 0 ‏يمكن توفير مستويات أقل من التعبير مقارنة بمعززات !اا 00 والتي يمكن أن تبين تشبع مفرط‎ ‏محولة عند حالات الإصابة ذات مضاعفة عالية). تتطلب‎ WIA ‏لآلية معالجة تم التبليغ عنها في‎ ‏في متواليات‎ shRNA ‏دمج متواليات‎ ¢ShRNA ‏للتعبير عن‎ pol I ‏مضاعفة استخدام معززات‎
ShRNAs ‏البادئة الداخلية للمعالجة المناسبة. تقوم‎ MIRNA ‏من مواد‎ ale ‏محاطة مشتقة‎ (YI ‏داخلية (10؛ 20). حتى‎ miRNAs ‏متراصة تحاكي بنية‎ MIRNA ‏المحاطة بواسطة بنية‎ 5 ‏بشرية والتي تم استخدامها بشكل‎ MIRNA-223 5 001400-30 ‏مناطق الإحاطة مشتقة من‎
واسع لدمج ‎ShRNAS‏ ناتج عودة الارتباط الجيني للتعبير في الخلايا الثديية ‎mammalian‏ ‎(cells‏ وكان هناك العديد من الجهود لفهم وتحسين استراتيجية التعبير (21). تم توضيح ال ‎miRNA‏ الأخير تحديدا الفعالة عند الاستخدام كبنية متراصة للتعبير عن ‎shRNA‏ في خلايا
مكونة للدم وتتوسط في استبعاد ‎MRNAS‏ المستهدفة الأساسية كنتيجة لمعالجة فعالة ونشاط جديلة
متتقلة منخفضة في العديد من أنواع الخلية المكونة للدم المتعددة (21؛ 22).
في هذا الكشف؛ قام المخترعون باستخدام 8011178 كهدف لدراسة معالجة وتحسين ‎ShRNAMIRS‏ من أجل التطبيقات العلاجية الممكتة. 801117 عبارة عن هدف ‎(ade‏ مفعل
لإعادة تنشيط جين 7-جلوبين وبالتالي التعبير عن ‎HDF‏ في أغلب أمراض الهيموجلوبين». مرض
الخلية المنجلية وأمراض 8م-ثلاسيميا. يقوم التضمين المنخفض أو الحذف الجيني ل 8611178
0 بإطلاق عملية إبادة 7-جلوبين (23) ويقوم تثبيط 8011178 في السلالة الحمراء بمنع النمط الجيني مرض الخلية المنجلية والسميات العضوية في فثران معدلة ‎Lis‏ (24). جين ‎Hbb-y‏ ‏الجنين الفأري عبارة عن نظير وظيفي لجين 7-جلويين بشري؛ وبالتالي يعمل كمكون محيط لتقييم
أثر استبعاد 801117 في ‎WA‏ حمراء فأرية. كما نقوم أوليا بملاحظة فعالية مخفضة بشكل معلم لاستبعاد 861117 عند التعبير عن ‎ShRNA‏ باستخدام نواقل قائمة على أساس ‎pol ١١‏ مقارنة
5 بنواقل قائمة على أساس ‎lI‏ ا00. تقوم تصاميم ‎shRNAmIR pol 115 Pol ١|!‏ بشكل مثالي بدمج 21 متوالية متوافقة من حيث موقع القاعدة المستهدفة في الخلية الجذعية الدبوسية العكسية ‎palindromic hairpin stem‏ ولكن من المتوقع أن تكون نواتج استنساخ 11805011015 من
هذين النوعين من عبوات التعبير بحيث تتم معالجتها بشكل مختلف (25). تقوم نواتج استنساخ ‎pol ١١ sShRNAMIR‏ بالدخول في مسار معالجة ‎RNAI‏ قبل معالجة ‎Cua Drosha‏ يكون من
0 المتوقع أن تكون هناك منتجات !اا ‎pol‏ أقصر بعد ‎Drosha‏ وليتم شقها فقط عند الطرف الحلقي بواسطة ‎Dicer‏ بناء على متواليات ‎RNAS‏ صغيرة ‎dallas‏ مشتقة من ‎pol ١١١‏ ومعززات ‎pol ١١‏ لاحظنا أن هناك قوالب ‎pol ١١١ shRNAs‏ وقوالب جينية ‎pol ١١ shRNAMIR‏ التي أدت إلى ‎ShRNAs‏ مختلفة معالجة نسبة إلى الموضع النسبي لمتواليات مستهدفة قائمة على أساس 21 قاعدة. تقوم 001/45/ل4ا50 المعادة تصميمها بمحاكاة المتواليات الموجهة ذات الجديلة الناضجة
5 الناتجة بواسطة ‎ShRNAS‏ فعال مفعل بواسطة !اا ‎pol‏ التي أدت إلى تحسين فعالية المعالجة وتثبيط ‎MRNA‏ المستهدف. يؤدي دمج هذه التعديلات في تعبير ناقل ثديي انتقائي للخلايا الحمراء
إلى استبعاد ملحوظ لبروتين 861117 وإعادة حث هيموجلويين جنيني. هذه الاستراتيجية أيضا تقوم بتجنب السمية في الخلية الجذعية المكونة للدم وقطاعات سلالة خلية 8 التي تتم مصاحبتها 0- المكونة للدم التي تعبر عن ‎.ShRNA‏ باختصارء تبين البيانات وجود خواص مهمة ل ‎RNA‏ ‏تقوم بالمعالجة نسبة إلى استخدام ‎ShRNA‏ في سياقات ناقل مختلفة؛ وأيضا تقدم استراتيجية لسلالة جين انتقائية باستثناء أنها تحيط بالنواتج العكسية للتعبير المنتشر. تتضمن النتائج الخاصة بنا وجود مضاعفات مهمة لتصميم ‎ShRNAS‏ مدمجة في ‎MicroRNA‏ واستخدامها في مناهج علاج جيني قائمة على أساس ‎RNAI‏ ‏في أحد النماذج؛ يتم توصيل أو إعطاء عامل تداخل ‎RNA‏ في ‎dela‏ مقبول صيدلانيا ‎So .pharmaceutically acceptable carrier‏ إضافة ‎lee‏ حاملة ‎carrier agents‏ 0 إضافية؛ مثل ليبوسومات 00500065 إلى الحامل المقبول صيدلانيا. في نموذج ‎AT‏ يتم توصيل عامل تداخل ‎RNA‏ بواسطة ‎Jib‏ يرمز ‎RNA‏ دبوسي ‎(shRNA)‏ قصير أو صغير في حامل مقبول صيدلانيا إلى الخلايا في عضو بالفرد. يتم تحويل ‎ShRNA‏ بواسطة الخلايا بعد انتساخ في ‎SIRNA‏ قادرة على استهداف»؛ ‎Sle‏ 5801117. في أحد النماذج؛ عامل تداخل ‎RNA‏ عبارة عن جزيء حمض نووي يتضمن متوالية 5 النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية: 18-1( و44-25؛ أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في أحد النماذج؛ الناقل عبارة عن ناقل قابل للتنظيم ‎vector‏ ©ا1826 9018© مثل ناقل قابل للحث بواسطة تترا سيكلين. يمكن استخدام الطرق الموضحة؛ ‎Sle‏ في ‎Wang et al.‏ ‎Proc.
Natl.
Acad.
Sci. 100: 5103-5106, using pTet-On vectors (BD‏ ‎BIOSCIENCES Clontech, Palo Alto, Calif.) 0‏ في أحد النماذج؛ يتم أخذ عوامل تداخل ‎RNA‏ المستخدم في الطرق الموضحة هنا بشكل نشط بواسطة خلايا في الكائن الحي بواسطة الحقن الوربدي ‎Sie dintravenous injection‏ الحقن الهيدروديناميكي ‎hydrodynamic‏ ‎(ga cinjection‏ استخدام الناقل» يبين الفعالية في توصيل عوامل تداخل ‎interfering agents‏ ‎RNA‏ داخل الكائن الحي. ثمة طريقة خاصة بتوصيل ‎SIRNAS‏ وهي عمل قسطرة وعاء التزويد 5 بالدم ‎blood supply vessel‏ للعضو المستهدف. يمكن ‎Lad‏ استخدام استراتيجيات أخرى لتوصيل عوامل تداخل ‎(RNA‏ مثلاء ‎siRNAs‏ أو ‎shRNAs‏ المستخدمة في طرق الاختراع؛
مثل؛ مثلاء توصيل بواسطة ناقل؛ ‎lie‏ بلازميد ‎plasmid‏ أو ناقل فيروسي؛ ‎lie‏ ناقل فيروسي بطيء. يمكن استخدام هذه النواقل كما هو موضح؛ ‎Ole‏ في ‎Xiao-Feng Qin et al. Proc.‏ ‎Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188‏ تتضمن طرق التوصيل الأخرى توصيل عوامل تداخل ‎(RNA‏ مثلاء ‎siRNAs‏ أو ‎ShRNAs‏ وفقا للاختراع؛ باستخدام ببتيد أساسي ‎basic‏ ‎peptide 5‏ بواسطة ترافق أو خلط عامل تداخل ‎RNA‏ مع ببتيد أساسي؛ ‎lie‏ شطية من ببتيد 56 تي ايه تي ‎(TAT‏ الخلط مع دهون كاتيونية ‎cationic lipids‏ أو صياغة جسيمات. ‎(Kay‏ توصيل عوامل تداخل ‎mRNA Si (RNA‏ 8011178 تقوم باستهداف ‎SIRNAS‏ بشكل ‏منفردء أو في توليفة مع عوامل تداخل ‎(Jie siRNAs Mis (gal RNA‏ مثلا ‎SIRNAs‏ ‏موجهة إلى جينات خلوية ‎cellular genes‏ أخرى. يمكن ‎Lad‏ إعطاء ‎siRNAs‏ 801118 ‏0 أيضا في توليفة مع عوامل صيدلانية أخرى والتي يتم استخدامها لعلاج أو منع الأمراض أو الاضطرابات المضطرية مع ضغط مؤكسد؛ خصوصا الأمراض التنفسية؛ وبشكل أكثر تحديدا الربو 38م. يمكن الحصول على ‎siRNA clus‏ التخليقية؛ شاملة جزيئات ‎ShRNA‏ باستخدام ‏عدد من التقنيات المعروفة للخبير في المجال. مثلاء يمكن تخليق أو إنتاج جزيء ‎SIRNA‏ كيماويا ‏أو بشكل ناتج عودة الارتباط الجينيب ياستخدام طرق معروفة في المجال؛ مثل باستخدام مركبات ‎RNA/DNA ‏محمية بشكل مناسب وعنصر مخلق تقليدي‎ phosphoramidites ‏فوسوفراميديت‎ 5
Elbashir, 5. M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, 5. is ‏(انظرء‎ ‎M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188- ‎200; Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, ‎J. R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017; 0 ‎(Tuschl, T. et al. (1999) Genes & Development 13:3191-3197 0‏ بشكل بديل؛ يتضمن موردو تخليق ‎RNA‏ المختلفين التجاريين المتاحين» على سبيل المثال لا الحصرء 006 (هامبرج؛ ألمانيا) ‎Dharmacon Research‏ (لافايت؛ كولو.؛ الولايات المتحدة)؛ ‎Pierce Chemical‏ (جزء من ‎Science, Rockford, Ill.‏ 061510 الولايات المتحدة)؛ ‎Glen‏ ‎Research‏ (سترلنج؛ ‎«ill «Va‏ المتحدة)؛ ‎cule cadlal) ChemGenes‏ الولايات المتحدة)؛ ‎Cruachemy‏ (جلاسكو؛ المملكة المتحدة). بالتالي؛ لن يكون من الصعب تخليق جزيئات ‎SIRNA‏ ويتم توفيرها بشكل جاهز في جودة مناسبة ل نظلمة. علاوة على ذلك؛ يمكن
التعبير عن ‎dSRNAS‏ كبنيات حلقية جذعية ‎Stem loop structures‏ مرمزة بواسطة بلازميد
Paddison, P. J. et ( ‏الفيروسات الارتجاعية والفيروسات البطيئة‎ «plasmid vectors ‏نواقل‎ al. (2002) Genes Dev. 16:948-958; McManus, M. ٠١ et al. (2002) RNA 8:842-850; Paul, C. P. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508;
Miyagishi, M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500; Sui, 6. et al. 5 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520; Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243; Lee, N. S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505; Yu, J. Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052; Zeng, Y., et al. (2002) Mol. Cell. 9:1327-1333;
Rubinson, D. A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406; Stewart, S. A., 0 ‏قبل‎ pollll ‏عادة ما تتضمن هذه النواقل معزز‎ .(et al. (2003) RNA 9:493-501 ‏الحسية والمضادة للحس بشكل منفصل و/أو كبنيات‎ RNA ‏ويمكن أن تعبر عن جدائل‎ dsRNA (ShRNA) ‏دبوسي قصير‎ RNA ‏بمعالجة‎ Dicer ‏في خلاياء تقوم‎ .hairpin structures ‏دبوسية‎ في ‎SIRNA‏ فعالة. يمكن اختيار المنطقة المستهدفة للجزيء ‎SIRNA‏ وفقا للاختراع الحالي من جين مستهدف متوالية مستهدف» ‎Ole‏ متوالية ترميز 8011178؛ بداية من حوالي 25 إلى 50 نيكلوتيدات؛ من حوالي 50 إلى 75 نيكلوتيد؛ أو من حوالي 75 إلى 100 نيكلوتيد بعد كودون ‎(Sa ed‏ أن تحتوي متواليات النيكلوتيد على كودونات بدء مناطق 5' أو 3' يو تي ار اس ‎UTRSs‏ وقريبة. تتضمن إحدى الطرق تصميم جزيء ‎SIRNA‏ وفقا للاختراع الحالي تحديد متوالية نيكلوتيد حثية 23 واختيار احتمالات مع على الأقل 25 ‎J30‏ 35ت ‎J40‏ 345 50 ‏0 55« 760 765؛ 770 أو 15من منوعة 6/©. بشكل ‎(ay‏ إذا لم تكن هناك هذه المتوالية؛ يمكن مد البحث باستخدام ‎(NA(N2T)‏ حيث لا يمكن أن تكون عبارة عن أي نيكلوتيد. في هذه ‎calla‏ يمكن تحويل الطرف 3 ل ‎SIRNA‏ الحسية إلى تي تي 11 للسماح بتوليد تزاوج متناظر ‏نسبة إلى تركيبة المتوالية للجزء المعلق الحسية والمضاد للحس 3". يمكن تخليق جزيء ‎SIRNA‏ ‏المضاد للحس كمكمل لنيكلوتيد المواضع 1 إلى 21 من متوالية نيكلوتيد حثية 23. باستخدام ‏5 الأجزاء المعلقة 3' ‎TT‏ التناظرية_ قد يكون مفيدا ضمان أن الجسيمات الرببونيكلويروتين ‎ribonucleoprotein particles‏ الصغيرة المتداخلة ‎(siRNPs) small interfering‏ 28 تم
تكوينها مع نسب متساوية من الجسيمات الريبونيكلويروتين الصغيرة المتداخلة تقوم بشق ‎RNA‏ ‎.(Elbashir et al., (2001) supra and Elbashir et al., 2001 supra)‏ يمكن أيضا استخدام التحليل لمتوالية قواعد البيانات؛ شاملة على سبيل المثال لا الحصر ‎«(NCBI the‏ ‎GenSeq; (Derwent (BLAST‏ بالإضافة إلى شركات تخليق الأوليجو المتاحة تجاريا ‎Jie‏ ‎«OLIGOENGINE® 5‏ ويمكن أيضا استخدامها لاختيار متواليات ‎SIRNA‏ في مقابل مجموعات ‎EST‏ لضمان أنه يتم استهداف جين فقط. تتضمن النواقل الفيروسية البطيئة وفقا للاختراع؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ فيروس نقص المناعة البشري ‎Ole)‏ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2)؛ فيروس نقص المناعة في القطط؛ فيروس نقص المناعة في القردة؛ فيروس 0 تقص المناعة البقري؛ وفيروس فقر الدم المعدي في الخيول. يمكن تكوين هذه النواقل وتصميمها باستخدام تقنيات معروفة في المجال لزيادة أمانها للاستخدام في علاج ولحث العناصر التعبيرية المناسبة والجينات العلاجية؛ ‎Jia‏ تلك الموضحة أدناه؛ والتي ترمز ‎SIRNAS‏ لعلاج حالات شاملة؛ على سبيل المثال لا الحصرء أمراض الهيموجلوبين. بالنسبة للسمية القوية للفيروسات البطيئة؛ يمكن تصميم النواقل بطرق مختلفة لزيادة الأمان في تطبيقات علاج جيني. ‎lie‏ يمكن صنع الناقل بحيث يكون أكثر أمانا بواسطة فصل الجينات الفيروسية البطيئة الضرورية ‎Sle)‏ جي ايه جي 989 و بي او ال ‎(pol‏ على نواقل منفصلة كما هو موضح؛ ‎Ole‏ في براءة الاختراع الأمريكية رقم 6365150؛ وقد تم دمج محتوياتها هنا بالإشارة إليها كمراجع. بالتالي؛ يمكن تكوين فيروس ارتجاعي ناتج عودة الارتباط الجيني بجيث يتم استبدال متوالية الترميز الفيروسي الارتجاعي ‎(env pol gag)‏ بواسطة جين محل الاهتمام 0 والذي يكون معيب من حيث تكاثر الفيروس الارتجاعي. بعد ذلك تتم تعبئة الفيروس الارتجاعي المعيب المتكاثر في فيرويونات خلال استخدام فيروس مساعد أو سلالة خلية تعبئة ‎packaging‏ ‏86 اا08؛ بواسطة التقنيات المعيارية. يمكن العثور على بروتوكولات لإنتاج الفيروسات الارتجاعية ناتج عودة الارتباط الجيني ولحقن خلايا في المعمل أو في الكائن ‎All‏ مع هذه ‎ilu dll‏ في ‎Protocols Current‏ في ‎.al et .M .F (Ausubel (Biology Molecular‏ ‎Sections (1989) «Associates Publishing Greene (.eds) 5‏ 9.14-9.10 وغيرها من الكتيبات المعملية.
هناك مطلب أساسي لاستخدام فيروسات كنواقل توصيل جينية لضمان أمان استخدامهاء تحديدا ‎Led‏ يتعلق باحتمالية انتشار فيروس من النوع البري في مجموعة الخلية. وكان تطور سلالات خلايا ‎packaging cell lines Laas‏ والتي تنتج الفيروسات الارتجاعية المعيبة من حيث التكاثرء له فائدة زائدة للفيروسات الارتجاعية للعلاج الجيني؛ والفيروسات الارتجاعية المعيبة للاستخدام في نقل جين لأغراض علاج جيني (للمراجعة ‎Miller, A. 0. (1990) Blood‏ 1:) بالتالي» في أحد نماذج الاختراع؛ يتم استخدام سلالات خلية تعبئة لنشر النواقل (مثلا؛ نواقل فيروسية بطيئة ‎(lentiviral vectors‏ وفقا للاختراع لزيادة معايرة الناقل الفيروسي. باستخدام سلالات خلية تعبئة سوف يتم اعتبار طريقة آمنة لنشر الفيروس؛ حيث يقوم استخدام النظام بتقليل احتمالية أن تتم ‎sale)‏ التوليف لتوليد فيروس من النوع البري. علاوة على ذلك. لتقليل السمية إلى 0 خلايا تم التسبب فيها بواسطة التعبير عن بروتينات ‎packaging proteins das‏ يمكن استخدام أنظمة التعبئة ‎packaging systems‏ حيث البلازميدات التي ترمز وظائف التعبئة الخاصة
بالفيروس المنقولة بشكل انتقالي بواسطة؛ مثلا؛ المتوسطات الكيماوية. في نموذج آخرء يمكن تصنيع ناقل أكثر أمانا بواسطة استبدال متواليات فيروسية بطيئة ‎xe lentiviral sequences‏ متواليات فيروسية غير بطيئة ‎.non-lentiviral sequences‏ 5 بالتالي» يمكن أن تحتوي النواقل الفيروسية البطيئة وفقا للكشف الحالي على ‎ga‏ (مثلاء شق) من جين متواليات فيروسية بطيئة و/أو متواليات فيروسية غير بطيئة ‎Sle)‏ متواليات من الفيروسات الارتجاعية ‎retroviruses‏ الأخرى) طالما أنه وظيفتها لا تقل أساسيا ‎Oe)‏ معايرة فيروسية؛ القابلية للإصابة؛ الدمج والقدر على إضفاء مستويات عالية ومدة التعبير الجيني العلاجي). تتضمن العناصر في الناقل فيروسي؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ التي يمكن استنساخها ‎me‏ ‏0 إشارة ‎dias‏ تكرار طرفي ‎(dosh‏ مسارات بولي بورين ‎polypurine tracts‏ وعنصر استجابة
عكسية ‎.(RRE) reverse response element‏ في أحد نماذج الكشف» يتم تعديل منطقة تكرار طرفي طويل بواسطة استبدال معزز تكرار طرفي ‎dish‏ الفيروسي مع معزز غير متجانس. في أحد النماذج؛ يتم استبدال المعزز ل 5' تكرار طرفي طويل مع معزز غير متجانس. تتضمن أمثلة المعززات غير المتجانسة التي يمكن 5 استخدامهاء على سبيل المثال لا الحصرء فيروس تكوين تركيز طحالي ‎Sine‏ معزز قابلة للحث
بواسطة تترا سيكلين» منطقة تحكم في موقع |-جلويين ومعزز (|-جلوبين؛ ومعزز فيروس مضخم
للخلايا. في بعض النماذج؛ تتضمن النواقل الفيروسية البطيئة وفقا للكشف أيضا نواقل تم تعديلها للتحسين عند الأمان في استخدام النواقل ‎Jie‏ عوامل توصيل جين في علاج جيني. في أحد نماذج الاختراع؛ يتم تعديل منطقة تكرار طرفي ‎ie lish‏ 3" تكرار طرفي طويل؛ من الناقل في 3لا ‎if‏ المناطق ‎(US‏ حيث يتم تكوين ناقل ذاتي التنشيط . تساهم هذه التعديلات في زيادة أمان ‎dal‏ لأغراض توصيل جين. في أحد النماذج؛ يتضمن ناقل ذاتي التنشيط وفقا للاختراع ‎Cada‏ ‏في 3" تكرار طرفي طويل حيث يتم استبدال ‎oda‏ من منطقة 3لا بعنصر عازل. يقوم العازل بمنع متواليات محسن/معزز ‎enhancer/promoter‏ في ‎Jalal‏ من التأثير على التعبير عن جين في
0 جينوم مجاورء والعكس ‎(Sally‏ لمنع المتواليات الجينومية ‎genomic sequences‏ من التأثير على التعبير عن الجينات في الناقل. في نموذج آخر وفقا للاختراع؛ يتم تعديل 3' تكرار طرفي ‎dish‏ بحيث يتم استبدال المنطقة ‎Mie (US‏ مع متوالية بولي ‎(A)‏ متعددة. يجب ملاحظة أن التعديلات إلى تكرارات طرفية طويلة مثل التعديلات إلى 3' تكرار طرفي طويل؛ يتم أيضا تضمين 5" تكرار طرفي ‎dish‏ أو كل من 3' و5" تكرارات طرفية طويلة؛ في الاختراع.
يمكن أن يكون معزز الناقل الفيروسي البطيء عبارة عن معزز مرتبط بشكل طبيعي (أي؛ حيث تتم مع خلية في الكائن الحي) أو بشكل غير طبيعي مع المنطقة 5' المحيطة لجين معين. ‎So‏ اشتقاق المعززات من جينومات حقيقية النواة ‎ceukaryotic genomes‏ الجينومات الفيروسية ‎viral genomes‏ أو متواليات تخليقية ‎.synthetic sequences‏ يمكن اختيار معززات بحيث تكون غير انتقائية (نشطة في كل الأنسجة) ‎lia)‏ فيروس تكوين تركيز طحالي)؛
0 الانتقائية للنسيج ‎Mia)‏ (منطقة تحكم موضعي)؛ المنظمة بواسطة عمليات منظمة طبيعية؛ منظمة بواسطة عقاقير مستخدمة خارجيا ‎Ole)‏ تترا سيكلين)» أو منظمة بواسطة الحالات الفسيولوجية الانتقائية مثل تلك المعززات التي يمكن تنشيطها أثناء استجابة طور حادة أو تلك التي يتم تنشيطها فقط في خلايا متكاثرة ‎replicating cells‏ تتضمن الأمثلة غير المقيدة للمعززات في الاختراع الحالي تركيز المعزز الفيروسي المكون على الطحال؛ معزز قابل للحث بتترا سيكلين» منطقة تحكم
5 في موقع ]-جلويين ومعزز (]|-جلويين؛ فيروس مضخم للخلايا ‎Grae‏ معزز تكرار طرفي ‎dish‏ ‏ارتجاعي؛ فيروس مضخم للخلايا بالتوسط في معزز مبكر؛ معزز 51/40؛ ومعزز ربداكتاز داي
هيدرو فولات ‎reductase promoter‏ ©816ا007000. يمكن ‎Lead‏ اختيار المعزز من تلك المبينة للتعبير انتقائيا في أنواع الخلية التي يمكن أن تكون مرتبطة بظروف شاملة؛ على سبيل المثال لا الحصرء أمراض الهيموجلويين. في أحد نماذج الاختراع؛ المعزز عبارة عن خلية معينة بحيث يتم تقييد التعبير الجيني بخلايا الدم الحمراء. يتم تحقيق عملية تعبير انتقائية للكرية الحمراء باستخدام منطقة معزز ]-جلويين بشرية ‎human (3—globin promoter region‏ ومنطقة تحكم موضعي.
سوف يقوم الممارسون ذو الخبرة بإدراك أن اختيار المعزز للتعبير عن البولي نيكلوتيد ‎polynucleotide‏ محل الاهتمام على الناقل؛ القالب الجيني للحمض النووي ‎nucleic acid‏ 8 نيع الخلية المستهدفة؛ والأثر البيولوجي المطلوب. سوف يقوم الممارسين ذو الخبرة 0 بإدراك أيضا في اختيار المعززء أن المتغيرات يمكن أن تتضمن: تحقيق مستويات عالية من التعبير الجيني لتحقيق أثر فسيولوجي؛ الحفاظ على مستوى التعبير الجيني الأساسي؛ تحقيق التنظيم المؤقت للتعبير الجيني؛ تحقيق التعبير الانتقائي لنوع الخلية؛ تحقيق التنظيم الصيدلاني؛ الغدد الصماء 6000000©6؛ النظير الصماوي ‎«paracrine‏ أو الإفراز الذاتي ‎autocrine‏ ‏007 لتعبير الجيني ‎expression‏ 9606؛ ومنع المستويات غير المناسبة أو غير 5 المطلوية للتعبير. سوف تعتمد أي مجموعة محددة من متطلبات الاختيار على الظروف ولكن سيتم تحديدها بمجرد تحديد المتطلبات المعينة. في أحد نماذج الاختراع؛ المعزز انتقائي للخلية بحيث يتم تقييد التعبير الجيني بخلايا الدم الحمراء. يتم تحقيق التعبير الانتقائي للكرية الحمراء باستخدام
منطقة معزز (]-جلويين بشرية ومنطقة تحكم موضعي. التقنيات المعيارية الخاصة ببناء نواقل تعبير مناسبة للاستخدام في الاختراع الحالي معروفة 0 للخبير في المجال ويمكن أن تكون موجودة في هذه المنشورات مثل ‎Sambrook et al.‏ ‎Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.
Cold Spring‏ )1989( ‎(Harbor, N.Y‏ هناك تشكيلة من الاستراتيجيات المتاحة من أجل ريط شظايا ‎(DNA‏ يعتمد اختيارها على طبيعية مصطلحات شظايا ‎DNA‏ وحيث تؤدي اختياراتها بواسطة الخبير في المجال. يمكن استخدام نواقل علاج جيني ‎Gene therapy vectors‏ وفقا للاختراع الحالي؛ مثل 5 يمكن استخدام النواقل الفيروسية البطيئة السابقة؛ للتعبير عن تشكيلة من ‎SIRNAS‏ علاجية في
خلايا حمراء محولة. في أحد النماذج؛ ال ‎SIRNA‏ محل الاهتمام الذي سيتم التعبير عنه في الناقل المشتق من الجين الذي يمكن استخدامه لعلاج مرض هيموجلويين» مثل ‎siRNA‏ إلى ‎BCLITA‏ ‏تتضمن بنيات العلاج الجيني المعينة وفقا للاختراع» على سبيل المثال لا الحصرء تلك المبينة في الشكل 2. تم توضيح النواقل الفيروسية البطيئة الموضحة هنا تخطيطيا مع جذع ‎shRNA 5‏ يحتوي على متوالية تستهدف ‎MRNA‏ 80111/8؛ في حين تكون الحلقة انتقائية ل 3. كل منها تحتوي على مرقم فلورو كروم ‎aig (Venus) fluorochrome marker‏ بناؤها في أساس دلتا-3لا ‎LEGO‏ ذاتي التنشيط ‎(Ferhse Lab)‏ ألمانيا). تم استخدام استبعاد فيروس بطيء متتابع؛ حيث يتم التعبير عن ‎ShRNA‏ المستهدف عبر معزز فيروس تكوين تركيز طحالي الذي يتم التعبير ‎die‏ بقوة وبشكل مطلق؛ لتقييم وظيفية وسمية ‎ShRNA‏ المستهدف. تم 0 استخدام استبعاد فيروس بطيء قابل للحث؛ حيث يتم التعبير عن ‎ShRNA‏ عبر معزز قابل للحث بواسطة ‎PGK‏ تترا سيكلين» لتقييم الآثار المعتمدة على الوظيفة والجرعة والمخطط ل ‎ShRNA‏ ‏المستهدف. الفيروس البطيء الانتقائي للسلالة؛ ‎Cus‏ يتم التعبير عن ‎ShRNA‏ عبر منظر منطقة تحكم موضعي لمعزز م]-جلوبين (مواقع فائقة الحساسية ل ‎«Lab Naldini 152/3 DNA‏ إيطاليا) عبارة عن اختيار علاج للتحقق من الأنظمة في الكائن الحي. تتضمن مناطق تكرار طرفي طويل أيضا المنطقة 3لا والمنطقة ‎(US‏ بالإضافة إلى منطقة >*ا. يمكن تعديل المناطق 3لا و5لا معا أو بشكل مستقل لتكوين ناقل ذاتي التنشيط؛ بالتالي زيادة أمان الناقل للاستخدام في توصيل
الجين. يمكن تعديل المناطق 3لا و5لا ‎Lead‏ لتتضمن عنصر عازل ‎insulator element‏ يمكن تنفيذ خطوة تسهيل إنتاج الجسيمات الفيروسية المعدية في الخلايا باستخدام التقنيات ‎dpa)‏ مثل تقنيات نمو ‎growth techniques‏ مزرعة الخلية المعيارية ‎standard cell‏ 0 016ا0ا0. عند الحاجة بواسطة الممارس ذو الخبرة؛ يمكن تحضير المحاليل المخزونة من فيروس بطيء ‎lentiviral stock solutions‏ باستخدام النواقل وطرق وفقا للاختراع ‎Jal‏ طرق تحضير المحاليل المخزونة معروفة في المجال وتم توضيحهاء ‎ie‏ في ‎Y.
Soneoka et al.‏ ‎Nucl.
Acids Res. 23:628-633, and N.
R.
Landau et al. (1992) J.‏ )1995( ‎Virol. 66:5110-5113‏ بالطريقة التي تقوم بإنتاج محلول مخزون ‎stock solution‏ في 5 الاختراع الحالي؛ يتم نقل خلايا الفيروسات البطيئة (المشار ‎Led)‏ هنا بخلايا منتجة) مع النظام الناقل وفقا للاختراع الحالي. بعد ذلك يتم نمو الخلايا في ظروف مزرعة مزرعة خلية مناسبة؛
والجسيمات الفيروسية البطيئة المجمعة من أي من الخلايا نفسها أو من وسط الخلية كما هو موضح أعلاه. تتضمن سلالات الخلايا المنتجة؛ على سبيل المثال لا الحصر؛ سلالة خلية الكلى الجنينية البشرية 293؛ خلايا الأدمة للخيول ‎(NBL-6‏ وسلالة الخلايا الصعترية الجنينية للكلاب ‎.Cf2TH‏ ‏5 يمكن تنفيذ خطوة جمع الجسيمات الفيروسية المعدية ‎infectious virus particles‏ باستخدام التقنيات التقليدية. ‎Ole‏ يمكن جمع الجسيمات المعدية بواسطة تحليل الخلية؛ أو جمع المادة الطافية ‎supernatant‏ لخلية المزرعة ‎cell culture‏ كما هو معروف في المجال. اختيارياء ‎(Say‏ تنقية جسيمات الفيروس المجمعة ‎collected virus particles‏ تقنيات التنقية المناسبة معروفة جيدا للخبراء في المجال.
Kay, ‏العثور على طرق تتعلق باستخدام نواقل فيروسية في علاج جيني؛ مثلا؛ في‎ (Sa 10
M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):1385-1425; Ferry, N. and Heard, J.
M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, ‏.ا‎ et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule,
P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. 5. (1992)
Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; 15
Brody, 5. ‏.ا‎ and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90- 101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172;
Smith—Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; .and Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-38 ‎Sa 20‏ إعطاء النواقل الفيروسية الارتجاعية ‎(Retroviral vectors‏ شاملة النواقل الفيروسية البطيئة ‎dlentiviral vectors‏ كما هو موضح أعلاه أو ‎WIA‏ تحتوي عليهاء في الكائن الحي إلى الخاضعين بواسطة أي مسار مناسب؛ كما هو معروف في المجال. يشير المصطلح 'إعطاء" إلى مسار إدخال ناقل مصاغ في الجسم. مثلاء يمكن أن يكون الإعطاء عبر الأوعية أو الشريان الوريد أو العضل أو موضعيا أو فمياء أو بواسطة مسدس جيني أو أداة ترذيذ فوقية. ‏5 بالتالي؛ يمكن أن يكون الإعطاء مباشرا إلى النسيج المستهدف أو من خلال التوصيل الجهازي. يمكن توجيع عملية الإعطاء بالحقن إلى نخاع العظم. يمكن أن يتضمن الإعطاء المباشر إلى
النسيج المستهدف الحقن بإبرة؛ الترذيذ الفوقي؛ الرحلان الكهربي ‎electroporation‏ أو المسدس الجيني ‎.gene gun‏ انظر؛ ‎Sli‏ براءة الاختراع الدولية رقم18759/93 ؛ والتي تم دمجها هنا بالإشارة إليها كمراجع. بشكل بديل» يمكن إعطاء النواقل الفيروسية الارتجاعية وفقا للاختراع خارج الكائن الحي أو في المعمل إلى ‎WIA‏ أو أنسجة باستخدام تقنيات الإصابة المعيارية المعروفة جيدا في المجال. في أحد النماذج» يمكن تحويل النواقل الفيروسية الارتجاعية وفقا للاختراع في خلايا ‎Able‏ ‎LAY dlls‏ الجذعية الجنينية ‎embryonic stem cells‏ خلايا ‎Leds‏ جسمانية؛ أو خلايا أساسية. تتضمن أمثلة الخلايا العائلة الأساسية التي يمكن تحويلها بواسطة النواقل الفيروسية الارتجاعية وفقا للاختراع مواد كاشفة ‎precursors‏ لكريات الدم الحمراء ‎erythrocytes‏ وخلايا 0 جذعية مكونة للدم. في نموذج آخرء الخلية العائلة عبارة عن ‎erythrocyte ches LS‏ يمكن استخدام خلايا محولة ‎Alle‏ كطريقة تحقيق التعبير ‎SEY)‏ عن الخلايا الحمراء للجين محل الاهتمام في علاج أمراض الهيموجلوبين. يقوم جاتب ‎AT‏ من الاختراع بالحفاظ على تركيبات صيدلانية للنواقل الفيروسية البطيئة وفقا للاختراع. في أحد النماذج» تتضمن التركيبة ناقل فيروسي بطيء بكمية فعالة ‎LES Ladle‏ لعلاج أو تقليل خطر الإصابة ب (مثلا تخفيف أعراض مرض هيموجلوبين) وحامل مقبول صيدلانيا. يشير المصطلح ‎LS‏ فعالة علاجيا" إلى كمية ‎(lad‏ عند جرعات ولمدد مطلوية من الوقت؛ لتحقيق الأثر العلاجي المطلوب؛ ‎Jie‏ علاج أو الوقاية من ‎Als‏ هيموجلوبين مرضية. يمكن أن تكون الكمية الفعالة العلاجيا للناقل الفيروسي البطيء وفقا لعوامل مثل الحالة المرضية والسن وجنس ووزن الأفراد» وقدرة الناقل الفيروسي البطيء على إثارة استجابة مطلوية في الفرد. 0 يمكن تعديل أنظمة الجرعة لتوفير الاستجابة العلاجية المطلقة. أيضا تم وزن كمية فعالة علاجيا أيضا حيث يكون هناك في آثار سمية أو ضارة للناقل الفيروسي البطيء بواسطة الآثار المقيدة علاجيا. يمكن تقييم السمية القوية للنواقل الفيروسية البطيئة وفقا للاختراع باستخدام فحوص قائمة على أساس الخلية أو نماذج حيوان معروفة في المجال ويمكن اختيار مضمن فعال علاجيا والذي لا يبين سمية مميزة. في نموذج مفضل؛ الكمية الفعالة ‎Ladle‏ لناقل فيروسي بطيء مناسبة لعلاج 5 مرض هيموجلوبين.
يمكن تحضير المحاليل المعقمة القابلة للحقن بواسطة دمج ناقل فيروسي بطيء ‎lentiviral vector‏ بالكمية المطلوية في مذيب مناسب مع واحد أو توليفة من المكونات المذكورة ‎coded‏ كما هو مطلوب؛ متبوعا بواسطة التعقيم المرشحة. بشكل ‎ale‏ يتم تحضير مشتتات بواسطة دمج المكون النشط في ناقل معقم ‎sterile vehicle‏ والتي تحتوي على وسط تشتيت أساسي ‎basic dispersion mediu 5‏ والمكونات الأخرى المطلوية من تلك المذكورة أعلاه. في حالة المساحيق المعقمة ‎sterile powders‏ لتحضير المحاليل المعقمة القابلة للحقن ‎sterile‏ ‎dnjectable solutions‏ تتضمن الطرق المحضرة للتحضير هي التجفيف بالتفريغ والتجفيف بالتجميد والتي تؤدي إلى مسحوق من المكون النشط بالإضافة إلى أي مكون إضافي مطلوب من
محلول معقم مرشح ‎sterile—filtered solution‏ سلفا مما سبق. 10 سوف تتم ملاحظة أن قيم الجرعة يمكن أن تختلف مع حدة الحالة التي سيتم تخفيفها. سوف يتم أيضا فهم أن هناك أي خاضع معين»؛ يمكن تعديل أنظمة الجرعات الانتقائية على مدار الوقت وفقا لحاجة الفرد والحكم المهني لإعطاء الشخص أو الإشارة على إعطاء التركيبات؛ ‎Oly‏ ‏نطاقات الجرعة المذكورة هنا مثالية فقط ولا يقصد بها تقييد منظور أو ممارسات التركيبة المطلوب حمايتها. في أحد النماذج؛ تتفاوت الجرعة من 108-103 جسيم فيروسي ‎viral particles‏ | 50 كجم وزن. في نماذج ‎(gil‏ تتفاوت الجرعة من 105-103 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن؛ 106-104 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن» 107-105 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن» 103- 108 جسيم فيروسي / 50 كجم وزن٠‏ في أحد النماذج؛ الجرعة ‎is‏ حوالي 104 جسيم فيروسي /
0 كجم وزن. يمكن أن تختلف كمية الناقل الفيروسي في التركيبة وفقا لعوامل مثل الحالة المرضية والسن 0 والنوع ووزن الفرد. يمكن تعديل أنظمة الجرعة لتوفير الاستجابة العلاجية المطلقة. ‎Ole‏ يمكن إعطاء ‎daly‏ فردية؛ يمكن إعطاء الجرعات المقسمة المتعددة على مدار الوقت أو يمكن تقليل أو زيادة الجرعة نسبيا كما هو مشار إليه بواسطة الضرورات التي تحتمها الحالة العلاجية. سوف يكون من المفيد خصوصا صياغة تركيبات حقن في وحدة جرعة لسهولة الإعطاء وتجانس الجرعة. تشير صورة وحدة الجرعة حسب الاستخدام هنا إلى وحدات تقوم بالإفراز ماديا بشكل مناسب 5 كجرعات متجانسة للخاضعين الثديين الذين يتم علاجهم؛ تحتوي كل وحدة على كمية محددة سلفا من مكون نشط محسوب بأنه يؤدي إلى الأثر العلاجي المطلوب مرتبط بالحامل الصيدلاني
— 4 6 — المطلوب . تم ذكر صورة وحدة الجرعة وفقا للاختراع بواسطة ‎JS‏ يعتمد مباشر على 0 الخواص الفريدة للمكون النشط والأثر العلاجي الذي سيتم تحقيقه؛ و(ب) القيود الخاصة بالمجال لتحضير المركب ‎Jie‏ حساسية المركب الفعال في الأفراد. مع ذلك؛ بالنسبة لأي ‎duane Alla‏ يمكن تحديد 'كمية فعالة" مناسبة بواسطة أي من ذو الخبرة العادية في المجال باستخدام التجارب الروتينية ‎asd‏ ‏يشير الاختراع الحالي؛ في نماذج معينة؛ إلى خلايا معدلة جينيا للتعبير عن البولي ببتيدات العلاجية 5 ‎RNAS‏ مثبطة مذكورة هناء للاستخدام في علاج أمراض الهيموجلوبين. حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح "مصمم جينيا" أو "معدل جينيا" إلى إضافة؛ حذف؛ أو تعديل المادة الجينية في الخلية. يتم استخدام المصطلحات؛ ‎WA"‏ معدلة ‎genetically modified Lia‏ ‎LA" "ccells 0‏ معدلة ‎cells‏ 00001060" وء "خلايا موجهة ‎“redirected cells‏ بالتبادل. فى نماذج معينة؛ تم تعديل الخلايا المحولة مع نواقل مذكورة هنا جينيا. حسب ‎١‏ لاستخدام هناء يشير المصطلح "علاج جيني" إلى إدخال مادة جينية خارجية ‎extra genetic material‏ في صورة ‎DNA‏ أو ‎RNA‏ في المادة الجينية الكلية في خلية التي تستخلص أو تصحح أو تعدل فسيولوجيا الخلية لتوفير الناتج العلاجي المطلوب. في العديد من النماذج؛ يتم تحويل الخلايا المعدلة جينيا المذكورة هنا في المعمل أو خارج الكائن الحي مع نواقل ‎lad‏ للاختراع؛ وتم التمدد اختياريا خارج الكائن الحي ‎٠.‏ بعد ذلك يتم إعطاء تتضمن ‎WAY‏ المناسبة هنا للتحويل والإعطاء في طرق العلاج الجيني المذكورة هناء على سبيل المثال لا الحصر خلايا جذعية؛ ‎WIA‏ أساسية؛ وخلايا متمايزة. في النماذج المعينة؛ 0 الخلايا المحولة عبارة عن الخلايا الجذعية الجنينية؛ نخاع العظم ‎DA‏ جذعية؛ ‎WA‏ جذعية من الحبل السري » خلايا جذعية من المشيمة؛ ‎WDA‏ جذعية وسيطة؛ ‎WIA‏ جذعية مكونة للدم « ‎Wa‏ ‏حمراء أساسية؛ وخلايا حمراء. تؤدي الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى خلايا أساسية مكونة للدم ‎Hematopoietic‏ ‎(HPCs) stem cells‏ قادرة على توليد المخزون الكامل لخلايا الدم على مدار حياة الكاثن. 5 يشير المصطلح "خلية جذعية مكونة للدم" أو "156" إلى ‎WIA‏ جذعية متعددة النقطة التي تنتج عن كل أنواع الدم بالكائن» شاملة السلالات النقوية ‎Mie)‏ أحادية الخلية ‎monocytes‏ والبلاعم
‎neutrophils «lds sully macrophages‏ والخلايا الصبغية ‎basophils‏ الخلايا اليوزينية ‎ceosinophils‏ كريات الدم الحمراء» الخلايا المنواة الكبيرة ‎Flall/megakaryocytes‏ ‎(platelets‏ الخلايا المتغضنة ‎«(dendritic cells‏ والسلالات الليمفاوية ‎lymphoid lineages‏ ‎Sly)‏ خلايا 1 خلايا 8؛ خلايا ‎(NK‏ وغيرها من في المجال (انظر ‎Fei, R., etal.‏ براءة الاختراع الأمريكية رقم ¢5635387 ‎(McGlave, et al.‏ براءة الاختراع الأمريكية رقم 4 .اه ‎sel, «Simmons, P., et‏ الاختراع الأمريكية رقم 5677136؛ ‎(Tsukamoto, et al.‏ براءة الاختراع الأمريكية رقم 5750397؛ ‎«Schwartz, et al.‏ براءة الاختراع الأمريكية رقم 5759793؛ ‎et al.‏ ,510أن016؛ براءة الاختراع ‎LN)‏ رقم ‎(Tsukamoto, et 21. 9‏ براءة الاختراع الأمريكية رقم 5716827). عند الزراعة في 0 حيتوات أو بشر تعرضوا للإشعاع بشكل ‎Jil‏ يمكن أن تقوم الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا الأساسية بإعادة تجميع الخلايا الحمراء»؛ نيوروفيل-بلعم ‎«neutrophil-macrophage‏ خلية منواة كبيرة ‎Megakaryocyte‏ ومجموعة خلية ليمفاوية مكونة تلدم ‎lymphoid hematopoietic cell‏ ‎.pool‏ ‏في بعض النماذج؛ الخلايا المحولة ‎transduced cells‏ عبارة عن خلايا جذعية مكونة لدم و/أو خلايا أساسية معزولة من نخاع العظم» دم الحبل السري ‎cumbilical cord blood‏ أو الدورة الدموية المحيطة ‎peripheral circulation‏ في نماذج معينة؛ الخلايا المحولة عبارة عن خلايا جذعية مكونة للدم معزولة من نخاع العظم» دم الحبل السري؛ أو الدورة الدموية المحيطة. في أحد النماذج؛ الخلايا المكونة للدم عبارة عن خلايا +06034. في أحد التماذج؛ الخلايا المكونة للدم عبارة عن ‎shes WIA‏ أساسية ‎erythroid‏ ‎.progenitor cells 0‏ في أحد النماذج؛ الخلايا المكونة للدم عبارة عن ‎WIA‏ حمراء . يمكن أن تكون الخلايا وفقا للاختراع ذاتية المنشاً/خيفية ‎(SY)‏ أو غير ذاتية ‎Land)‏ ‎pe’)‏ ذاتية؛" ‎Ole‏ خيفية ‎allogeneic‏ مسانج ‎syngeneic‏ أو غيروي 6أ600986106). يشير لذاتية المنشاء” حسب الاستخدام هناء إلى خلايا من نفس الخاضع. يشير "خيفية؛” حسب الاستخدام 5 هناء إلى خلايا من نفس النوع والتي تختلف جينيا إلى الخلية محل المقارنة. يشير 'مسانج" حسب الاستخدام ‎cls‏ إلى خلايا خاضع مختلف متطابقة جينيا مع الخلية محل المقارنة. يشير "غيروي؛"
حسب الاستخدام هناء إلى خلايا مختلفة عن الخلية محل المقارنة. في النماذج المفضلة؛ الخلايا وفقا للاختراع خيفية. يشير "خلية معزولة" إلى خلية تم الحصول عليها من نسيج في الكائن الحي أو عضو وخالي بشكل أساسي من المصفوفة خارج الخلية. تتضمن الأمثلة التوضيحية على خلايا معدلة جينيا المناسبة من أجل علاجات قائمة على أساس الخلية المذكورة هناء على سبيل المثال لا الحصر: الخلايا الجذعية الجنينية؛ نخاع العظم خلايا جذعية ‎bone marrow stem cells‏ خلايا جذعية من الحبل السري ‎umbilical cord‏ ‎WIA stem cells‏ جذعية مشيمية ‎Leds LA placental stem cells‏ لحمية متوسطية ‎Leds LIA «mesenchymal stem cells‏ مكونة ‎DIA all‏ أساسية مكونة للدم؛ خلايا أساسية نقوية ‎cmyeloid progenitors‏ الخلايا الأساسية الحمراء»؛ وغيرها من الخلايا الحمراء . في النماذج المفضلة؛ تتضمن الخلايا المناسبة لعلاجات قائمة على أساس الخلية المذكورة هناء على سبيل المثال لا الحصر: خلايا جذعية مكونة للدم أو خلايا أساسية ‎progenitor‏ ‎WIA (cells‏ سليفة أرومية حمراء ‎WAN cproerythroblasts‏ الصبغية الحمراء الأرومية ‎(basophilic erythroblasts‏ الخلايا حمراء متعددة الألوان ‎polychromatic‏ ‎cerythroblasts‏ الخلايا الحمراء الحساسة للتلون ‎corthochromatic erythroblasts‏ كريات 5 الدم الحمراء متعددة الألوان ‎polychromatic erythrocytes‏ وكريات الدم الحمراء» أو أي توليفة مما سبق. طرق ‎dle‏ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين يقدم الاختراع الحالي تركيبات محسنة وطرق لزيادة إنتاج ‎HOF‏ في خلية؛ بواسطة إعطاء نواقل تثبط التعبير عن /86111. تبين البيانات أن تثبيط 801117 يؤدي إلى زيادة التعبير من جينات ‎y‏ جلويين ‎genes‏ 0510ا7-9. كما هو موضح ‎(lis‏ أحد أهداف الاختراع الحالي هو توفير تركيبات وطرق لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني في خلية. في بعض ‎ial)‏ الخلية ‎Sle‏ ‏عن خلية جذعية جنينية؛ خلية ‎Leds‏ جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية ‎Leds‏ ‏مكونة للدم؛ خلية أساسية مكونة للدم أو ذرية مما سبق. بالتالي؛ يقدم أحد جوانب الاختراع طرق لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني الذي يتم 5 التعبير عنه بواسطة خلية؛ يتضمن خطوات ملامسة خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم» خلية جذعية مكونة للدم» أو مكونة للدم مع كمية فعالة من تركيبة
تتضمن على الأقل فيروس أو ‎JU‏ يتضمن جزيء حمض نووي موضح هناء بالتالي يتم تقليل التعبير عن 801117 وتتم زيادة التعبير عن هيموجلوبين جنيني في الخلية؛ أو ذريتهاء نسبة إلى الخلية قبل هذه الملامسة. في أحد النماذج؛ يقوم الناقل أو فيروس بالتعبير عن عامل تداخل ‎RNA‏ والذي هو عبارة عن ‎BCL11IMicroRNA‏ والذي يثبط /80111؛ وبالتالي تقليل التعبير عن ‎.BCL11A‏ ‏فيما يتعلق بملامسة خلية مع مثبط ل 80111/4؛ تشير "زيادة مستويات الهيموجلويين الجنيني” في خلية إلى أن ‎HBF‏ على الأقل 75 أعلى في مجموعات معالجة ‎BCLIIA Li‏ أكثر منها في عينة مقارنة؛ مجموعة مقارنة؛ حيث لا يوجد مثبط /86111. يفضل أن تكون نسبة التعبير عن ‎HDF‏ في مجموعة ‎Laie‏ 8011178 معالجة على الأقل 710 أعلى؛ على الأقل 0 720 أعلى؛ على الأقل 730 ‎(lel‏ على الأقل 740 أعلى؛ على الأقل 750 ‎del‏ على الأقل 0 أعلى»؛ على الأقل 770 ‎(lel‏ على الأقل 780 أعلى؛ على الأقل 790 أعلى؛ على الأقل 1-طية ‎(lel‏ على الأقل 2-طية ‎clef‏ على الأقل 5-طية أعلى؛ على الأقل 10 طية أعلى؛ على الأقل 100 طية ‎«lef‏ على الأقل 1000-طية ‎(del‏ أو أكثر من مجموعة معالجة مقارنة ذات حجم قابل للمقارنة وظروف زراعة. يتم استخدام المصطلح "مجموعة معالجة ‎"alae‏ هنا 5 لوصف مجموعة من خلايا التي تمت معالجتها بأوساط متطابقة؛ حث فيروسي؛ متواليات حمض نووي ‎nucleic acid sequences‏ درجة ‎shall‏ اقتران» حجم وعاء؛ درجة حموضة؛ إلخ.؛ باستثناء أوليجونيكلوتيد ‎Oligonucleotide‏ غير مستهدف. في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة ‎(ls‏ يشتبه في الخاضع أن يكون لديه؛ أو يوجد ‎Gh‏ أو مصاب بمرض هيموجلوبين؛ ‎Sle‏ مرض الخلية المنجلية أو ثلاسيميا. سوف تتضمن مخارات الممارس العادي أن يتعرف الخاضع الذي ‎al‏ أو معرض ‎sare Glas hal‏ يمكن أن يكون الخاضعين هم هؤلاء الذين خضعوا لتشكيلة من العلاجات الإضافية. بالتالي؛ ‎lie‏ يمكن أن يكون الخاضعين هم هؤلاء اللذي تم علاجهم بأوكسيجين؛ هيدروكسي يوريا ‎hydroxyurea‏ حمض فوليك ‎(folic acid‏ أو نقل دم. تتضمن طرق توصيل عوامل تداخل ‎(RNA‏ مثلاء ‎SIRNA‏ أو نواقل تحتوي على عامل تداخل ‎(RNA‏ إلى الخلايا المستهدفة؛ ‎Ole‏ كريات الدم الحمراء أو غيرها من ‎WIA‏ المستهدفة
المطلوية؛ للاستهلاك حقن تركيبة تحتوي على عامل تداخل ‎(RNA interference agent‏ مثلاء ‎SIRNA‏ أو بشكل مباشر ملامسة الخلية؛ مثلاء كرية حمراء»؛ مع تركيبة تتضمن عامل تداخل ‎SIRNA Jie (RNA‏ في نموذج آخرء عامل تداخل ‎lie (RNA‏ يمكن حقن ‎siRNA‏ بشكل مباشر في أي وعاء دموي ‎Jie blood vessel‏ الوريد ‎vein‏ أو الشريان ‎artery‏ أو شعيرات وريد ‎venule‏ أو شعيرات شريان ‎arteriole‏ عبرء مثلاء الحقن الهيدروديناميكي أو القسطرة. يمكن أن يكون الإعطاء بواسطة حقن فردي أو بواسطة اثنين أو أكثر من عمليات الحقن. يتم توصيل عامل تداخل ‎RNA‏ في ‎dela‏ مقبول صيدلانيا. يمكن استخدام واحد أو أكثر من عامل
BCLI1A ‏واحد فقط يستهدف‎ SIRNA ‏آنيا. في أحد النماذج المفضلة؛ يتم استخدام‎ RNA Jal ‏بما يقيد قوة الآثار الجانبية‎ (RNA ‏بشري. في أحد النماذج؛ يتم استهداف خلايا معينة مع تداخل‎ ‎RNA Jalal 0‏ الناتج بواسطة الاستهداف غير الانتقائي لتداخل ‎RNA‏ يمكن أن تقوم الطريقة باستخدام؛ ‎lia‏ معقد أو جزيء دمج يتضمن شق استهداف خلية وشق ربط تداخل ‎RNA‏ يتم استخدامها لتوصيل تداخل ‎RNA‏ بفاعلية في الخلايا. ‎Sle‏ بروتين دمج ‎fusion protein‏ جسم مضاد-بروتامين ‎antibody-protamine‏ عند الخلط ب ‎«sIRNA‏ وترتبط ب ‎SIRNA‏ وتقوم ‎SIRNA dua‏ انتقائيا في خلايا التعبير عن ‎age‏ ضد ‎antigen‏ تم التعرف عليه بواسطة ‏5 الجسم المضاد ‎Le antibody‏ يؤدي إلى إسكات التعبير الجيني فقط في هذه الخلايا التي تعبر عن مولد الضد. شق ربط ‎SIRNA‏ أو جزيء حث تداخل ‎RNA‏ عبارة عن بروتين أو نطاق ربط حمض نووي أو شظية من بروتين» وبتم دمج شق الربط ‎ga‏ من الشق المستهدف. يمكن أن ‏يكون موقع الشق المستهدف ‎Ll‏ في شق كريوكسيل ‎carboxyl-terminal‏ أو طرف أمينو للبنية ‎@amino-terminal end‏ أو في وسط بروتين الدمج. يمكن أن تكون آلية التوصيل الفيروسية التي ‏0 تتم التوسط فيها أيضا لتوصيل ‎SIRNAS‏ إلى خلايا في المعمل وفي الكائن ‎all‏ كما هو موضح في (20)10(:1006 ‎Xia, H. et al. (2002) Nat Biotechnol‏ يمكن أيضا استخدام آليات توصيل ‎delivery mechanism‏ يتم التوسط فيها بواسطة بلازميد- أو فيروس 1 ‎ShRNA‏ ‏لتوصيل ‎ShRNAS‏ بخلايا في المعمل وفي الكائن ‎all‏ كما هو موضح في ‎Rubinson, D.‏ ‎A., et al. ((2003) Nat. Genet. 33:401-406) and Stewart, 5. A., et al. ‎RNA 9:493-501) 5‏ )2003((. يمكن إدخال عوامل تداخل ‎(RNA‏ مثلا ‎siRNAs‏ أو ‎ShRNAS‏ مع مكونات تقوم بتنفي واحد أو أكثر من النشاطات التالية: وتقوم بتحسين استهلاك
عوامل تداخل ‎SIRNA Oe (RNA‏ بواسطة الخلية؛ مثلاء الخلايا الليمفاوية أو غيرها من الخلاياء تقوم بتثبيط تصلب الجدائل الفردية أو تثبيت الجدائل الفردية أو تسهيل التوصيل إلى الخلية المستهدفة وتقوم بزيادة تثبيط الجين المستهدف؛ ‎lie‏ 861117. سوف تكون جرعة عامل تداخل ‎RNA‏ المعين بكمية لازمة لتنفيذ تداخل ‎lie (RNA‏ إسكات جيني ما بعد الترجمة؛ للجين المستهدف المعين؛ وبالتالي يؤدي إلى تثبيط التعبير الجيني المستهدف أو نشاط تثبيط أو مستوى البروتين المرمز بواسطة الجين المستهدف. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم تلامس ‎LAY‏ الجذعية الجنينية؛ خلية ‎Leds‏ ‏جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم خارج الكائن الحي أو في المعمل. في نموذج معين؛ الخلية التي تتم ملامستها عبارة عن خلية من 0 السلالة الحمراء. في أحد النماذج؛ تقوم التركيبة بتثبيط التعبير عن ‎BCLI1A‏ ‏في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية ‎plas‏ عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم معزولة من الخاضع قبل ملامسة مع التركيبة الموضحة هنا أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:1- 5 18-10:13,؛ 44-25؛ أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن ‎BCL1IMicroRNA‏ ‏تخليقي موضح هنا. تتضمن خلايا الدم الناضجة ‎Mature blood cells‏ دورة حياة متناهية ويجب أن يتم استبدالها بشكل مستمر خلال الحياة. يتم إنتاج خلايا الدم بواسطة تكاثر وتمايز المجموعة الصغيرة متعددة القدرة لخلايا جذعية مكونة للدم التي تتضمن أيضا القدرة على استكمال نفسها بواسطة 0 التجديد الذاتي. خلايا جذعية مكونة للدم متعددة ‎alll‏ عبارة عن خلايا أساسية ذاتية التجديد تتطور من ‎WIA‏ أرومية متوسطة وعائية ‎.mesodermal hemangioblast cells‏ خلايا جذعية مكونة للدم عبارة عن خلايا الدم ‎blood cells‏ تنتج كل خلايا الدم الأخرى؛ التي تتضمن كل ‎WDA‏ الدم المتمايزة من السلالات الحمراء» الليمفاوية والنقوية. ‎WA‏ جذعية مكونة للدم موضوعة في نخاع العظم ‎mali)‏ الدم المحيط» ودم الحبل السري. أثناء ‎«lal‏ تتطور ذريات خلية جذعية مكونة للدم خلال العديد من مراحل نضج وسيطة؛ بما يولد ‎WDA‏ أساسية مكونة للدم متعددة القدرة وخلايا أساسية مكونة للدم مرتبطة
‎DLL‏ قبل الوصول إلى النضج. نخاع العظم عبارة عن الموقع الأغلب لتكون الدم في البشر و6 تحت الظروف الطبيعية؛ فقط أعداد صغيرة من ‎WA‏ جذعية مكونة للدم وخلايا أساسية مكونة للدم يمكن أن تكون موجودة في الدم المحيط. العلاج بسيتوكينات ‎cytokines‏ (تحديدا عامل مستعمرة تحفز ‎colony-stimulating factor‏ الخلايا الحبيبية ‎«(G-CSF granulocyte‏ يمكن أن تقوم العقاقير النقوية القامعة ‎myelosuppressive drugs‏ المستخدمة في علاج السرطان ‎ccancer‏ والمركبات التي تعيق التفاعل بين خلايا مكونة للدم وخلايا نخاع العظم اللحمية بنقل أعدد كبيرة من الخلايا الجذعية والخلايا الأساسية في الدورة الدموية. يتم استخدام "خلية أساسية مكونة للدم ‎"Hematopoietic progenitor cell‏ كمصطلح هناء والذي يشير إلى خلايا من رابط خلية جذعية مكونة للدم ‎hematopoietic stem cell‏ ‎lineage 0‏ والتي تنتج كل أنواع خلايا الدم شاملة السلالات النقوية (أحاديات الخلية ‎monocytes‏ ‏والبلاعم؛ النيوروفيلات؛ ‎LIAN‏ الصبغية؛ الخلايا اليوزينية؛ كريات الدم الحمراء؛ الخلايا المنواة الكبيرة/الصفائح؛ الخلايا المتغضنة)؛ والسلالات الليمفاوية ‎(TLR)‏ خلايا 8؛ خلايا >الا). يشير المصطلح 'خلية من السلالة الحمراء" إلى أن الخلية الملامسة عبارة عن خلية تخضع لتكوين الدم بحيث عند التمايز النهائي تقوم بتكوين كرية حمراء أو خلية دم حمراء. تنتمي هذه الخلايا إلى واحد 5 .من ثلاثة سلالات؛ الحمراء» الليمفاوية؛ والنقوية؛ الناتجة من خلايا نخاع العظم أساسية مكونة للدم. عند التعرض لعوامل النمو الانتقائي وغيرها من مكونات البيئة الدقيقة المكونة للدم يمكن أن تنضج الخلايا الأساسية المكونة للدم خلال سلسلة من أنواع التمايز الخلوي الوسيطة؛ كل وسائط السلالة الحمراء» في خلايا الدم الحمراء. ‎JEL‏ تتضمن ‎WIA‏ "السلالة الحمراء؛” ‎Cus‏ يتم استخدام المصطلح هناء ‎WIA‏ أساسية مكونة للدم؛ الأرومات المضرجة ‎crubriblasts‏ السليفات 0 المضرجة ‎prorubricytes‏ الخلايا الأرومية الحمراء ‎erythroblasts‏ الخلايا الحمراء السوية اللون ‎metarubricytes‏ ؛ الخلايا الشبكية ‎reticulocytes‏ وكريات الدم الحمراء. في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة ‎(La‏ تتضمن الخلية الأساسية المكونة للدم على الأقل واحد من مرقمات سطح الخلية ‎cell surface marker‏ التي هي من بين خواص ‎WA‏ ‏الأساسية المكونة للدم: ‎C-5 «CD38lo/~ (Thyl/CD90+ 6059+ (CD34+‏ 5 +0/060117. بشكل مفضل؛ تتضمن الخلايا الأساسية المكونة للدم العديد من هذه المرقمات ‎.markers‏
في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة ‎(lia‏ تتضمن ‎WAY‏ الأساسية المكونة للدم من ‎ADL)‏ الحمراء خواص مرقم سطح الخلية من السلالة الحمراء: ‎Ter119 5 CD71‏ في بعض نماذج أي من الطرق الموضحة ‎(bs‏ تتضمن خلية جذعية مكونة للدم على الأقل واحد من خواص مرقم سطح الخلية من ‎WA‏ أساسية مكونة للدم: +0034 +0059؛
‎.C—kit/CD117+ 5 «CD38lo/- Thy1/CD90+ 5‏ ال خلايا جذعية مكونة للدم؛ المشابهة للخلايا الأساسية المكونة للدم؛ قادرة على تكاثر وإنتاج المزيد من ‎WAY‏ الأساسية التي تتضمن القدرة على توليد عدد كبير من خلايا أمهات يمكن بدورها أن تنتج ‎WIA‏ ذرية متمايزة أو غير قابلة للتمايز. يمكن حث خلايا الذرية للتكاثر وإنتاج ذرية يمكن أن تتمايز بالتالي في واحد أو أكثر من أنواع الخلية الناضجة ‎«mature cell‏ بينما 0 أيضا تتضمن واحد أو أكثر من الخلايا ذات القدرة على التطور الأبوي. يشير المصطلح "خلية جذعية ‎stem cell‏ بعد ذلك إلى خلية لها قدرة أو قوة؛ في ظروف ‎dime‏ للتمايز مع النمط الجيني المتخصص أو المتمايز؛ ووالتي تتضمن القدرة؛ في ظروف معينة؛ على التكاثر بدون التمايز بشكل أساسي. في أحد النماذج؛ يشير المصطلح خلية سلف أو خلية جذعية إلى خلية أم ‎dle‏ والتي تم تخصيص أبناؤها (ذرية)؛ غالبا ما تختلف الاتجاهات؛ بواسطة التمايزء ‎lie‏ ‏5 بواسطة الحصول على خواص فردية كاملة؛ كما يتم في الاختلاف التقدمي للخلايا الجنينية والأنسجة. التمايز الخلوي عبارة عن عملية معقدة تتم بشكل مثالي خلال العديد من أجزاء الخلية. يمكن أن تعمل الخلية المتمايزة ‎derive‏ من خلية متعددة القدرة ‎lly‏ تشتق هي نفسها من خلايا متعددة القدرة؛ وما إلى ذلك. بينما يمكن اعتبار كل هذه الخلايا متعددة القدرة ‎LIA‏ جذعية؛ يمكن أن يختلف نطاق أنواع الخلايا إلى بشكل يتم اعتباره. تتضمن بعض الخلايا المتمايزة أيضا القدرة 0 على إنتاج خلايا ذات قدرة تطور أكبر. يمكن أن تكون هذه القدرة طبيعية أو يمكن حثها صناعيا عند العلاج العديد من العوامل. في العديد من الحالات البيولوجية؛ ‎WAY‏ الجذعية أيضا 'متعددة القدرة” لأنها يمكن أن تنتج ذرية أكثر من من نوع خلية واحد مميزء ولكنها غير مطلوبة من أجل "التجذع.” التجديد الذاتي هو الجزء التقليدي الآخر من تعريف الخلية الجذعية؛ وسوف يكون من الضروري استخدامها في هذه الوثيقة. نظرياء يمكن أن يتم التجديد الذاتي بواسطة إما اثنين من الأليات الأساسية. يمكن أن يتم تقسيم الخلايا الجذعية بشكل غير متناظر؛ مع بنت واحدة تتمتع الحالة الجذعية والبنت الأخرى التي تعبر عن بعض وظيفة ونمط جيني معين آخر. بشكل بديل؛
يمكن أن تقوم بعض الخلايا الجذعية في مجموعة بالتقسيم بشكل مناظر في اثنين من الأجزاء الجذعية؛ بالتالي يتم الحفاظ على بعض الخلايا الجذعية في المجموعة ‎(JSS‏ بينما يمكن أن تقوم بعض الخلايا الأخرى في المجموعة إلى إنتاج ذرية متمايزة فقط. بشكل عام؛ تتضمن "لخلايا ‎"Haul!‏ نمط جيني خلوي أكثر بدائية (أي؛ موجود عند خطوة أولى على طول مسار تطور أو تقدم بدلا من خلية متمايزة كليا). ‎(lle‏ تتضمن الخلايا الأساسية أيضا قوة مميزة أو تكاثر عالي ‎Las‏ يمكن أن تنتج الخلايا الأساسية العديد من أنواع الخلية المميزة المتمايزة أو نوع خلية فردي متمايز؛ ‎La‏ يعتمد على مسار التطور وعلى بيئة يتم فيها تطور وتمايز الخلايا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم جمع الخلية الجذعية المكونة للدم أو خلية أساسية مكونة للدم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي ‎camniotic fluid 0‏ دم المشيمة ‎(placental blood‏ أو نخاع العظم. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ أو يتم جمع خلية نخاع عظم من الدم المحيط» دم الحبل السري؛ الزغابات المشيمية؛ المائع الأمنيوسي؛ دم المشيمة؛ أو نخاع العظم. أصبحت خلايا الدم المحيط الأساسية ‎Peripheral blood progenitor cells‏ ‎(PBPC) 5‏ هي المصدر المفضل لخلايا أساسية مكونة للدم من أجل الزراعة الانتقالية الخيفية وذاتية ‎Lana)‏ بسبب السهولة التقنية للجمع ووقت أقصر مطلوب للتطعيم. ‎(Ladi‏ تم استخدام عامل حث ‎stimulating factor‏ مستعمرة-خلية ‎(G-CSF) granulocyte—colony duns‏ _لحث المزيد من خلايا الدم المحيط الأساسية وإطلاق خلايا أساسية مكونة للدم من نخاع العظم. على الرغم من نجاح الأنظمة التي تستخدم عامل حث مستعمرة-خلية حبيبية عادة في جمع أعداد مناسبة من ‎WIA‏ الدم المحيط الأساسية من مانحين أصحاء؛ سوف تقوم نسبة 710-75 بنقل خلايا جذعية بشكل ضعيف ويمكن أن تتطلب الفصاد المتعدد كبير الحجم أو جمع نخاع العظم. في بعض نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم اختيار الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية ‎Leds‏ ‏مكونة للدم لمرقم سطح +0034 قبل الملامسة. ‎lL 25‏ في أحد نماذج أي طريقة موضحة ‎(Ld‏ تتم ملامسة خلية جذعية جنينية معزولة ‎(CD34+‏ خلية ‎Leds‏ جسمانية معزولة +0034؛ خلية أساسية معزولة +0034؛ خلية نخاع
عظم معزولة +0034؛ خلية أساسية مكونة للدم معزولة ‎(CD34+‏ أو ‎HSC‏ +6034 معزولة بالتركيبة الموضحة هنا أو تتم الملامسة مع الفيروس أو الناقل الذي يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10:13-1؛ 44-25 أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن ‎BCL1IMicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم حفظ الخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم بالتجميد قبل أي ملامسة مع التركيبة الموضحة هنا أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25؛ أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن ‎BCLIIMicroRNA‏ ‏0 تخليقي موضح هنا. في أحد نماذج أي طريقة موضحة ‎ls‏ تتم الملامسة في المعمل؛ خارج الكائن الحي أو في الكائن الحي. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء يتم تكرار الملامسة مرة على الأقل. ذلك أن؛ بعد الملامسة الأولى الأولية للخلية الجذعية الجنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع 5 عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم مع التركيبة الموضحة هنا أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25؛ أو ملامسة مع الفيروس أو ناقل التعبير عن ‎BOLIIMicroRNA‏ تخليقي موضح هناء يتم غسل الخلية؛ وبعد ذلك تتم ملامسة الخلية المغسولة لمدة ثانية مع التركيبة الموضحة هنا أو تتم ملامستها مع الفيروس أو 0 ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25( أو تتم ملامستها مع الفيروس أو ناقل التعبير عن ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. في نماذج أخرى» يتم تكرار الملامسة مرتين على الأقل بعد الملامسة الأولى الأولية. في أحد نماذج أي طريقة موضحة هناء بعد الملامسة؛ يتم حفظ خلية جذعية جنينية؛ خلية 5 جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية ‎Leds‏
مكونة للدم التي تمت ملامستها بالتجميد قبل الاستخدام؛ ‎Ole‏ التمدد خارج الكائن الحي و/أو الزراعة في الخاضع. في أحد ‎pila‏ أي طريقة موضحة هناء بعد الملامسة؛ تتم زراعة خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية ‎Leds‏ جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم الملموسة المتمددة خارج الكائن ‎all‏ قبل الاستخدام؛ ‎lie‏ الحفظ بالتجميد؛ و/أو زراعة/تطعيم في خاضع. في أحد ‎pila‏ أي طريقة موضحة ‎ls‏ بعد الملامسة؛ يتم تمايز خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية ‎Leds‏ جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم؛ أو خلية جذعية مكونة للدم التي تمت ملامستها في مزرعة خارج الكائن ‎all‏ قبل الاستخدام» ‎Sie‏ الحفظ 0 بالتجميد» و/أو زراعة/تطعيم في خاضع. في سياق نشوءٍ الخلية؛ الصفة 'متمايزة؛” أو ‎"lad‏ هي صفة نسبية. "الخلية المتمايزة” عبارة عن خلية تطورت أيضا في مسار التطور بدلا من الخلية التي تمت مقارنتها بها. بالتالي؛ يمكن تمايز ‎DAY‏ الجذعية إلى سلالة خلايا كاشفة مقيدة (مثل خلية أساسية مكونة للدم ‎(hematopoietic progenitor cell‏ والتي بدورها تتمايز في أنواع أخرى من الخلايا الكاشفة 5 الخلايا الكاشفة أيضا في المسار (مثل خلايا كاشفة حمراء ‎erthyrocyte precursor‏ )؛ ‎ang‏ ‏ذلك إلى خلية متمايزة نهائية الطورء مثل خلية حمراء؛ ‎lly‏ تلعب دور وصفي في نوع نسيج معين؛ ‎(Sarg‏ أو يمكن ألا تتضمن القدرة على التكاثر أيضا. في أحد النماذج؛ مثبط التعبير عن 801117 ‎sie‏ عن عامل تداخل ‎RNA‏ انتقائي ل ‎«BCL11A‏ أو ناقل يرمز عامل التداخل ‎RNA‏ الانتقائي ل 8011174. في نموذج واحد معين؛ 0 يتضمن عامل تداخل ‎RNA‏ واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25 يمكن أن يكون "الحمض ‎"(gail‏ الموضح هناء عبارة عن ‎RNA‏ أو ‎DNA‏ ويمكن أن يكون أحادي أو ثنائي الجديلة؛ ويمكن اختياره؛ مثلاء من مجموعة شاملة: حمض نووي يرمز بروتين محل الاهتمام؛ أوليجونيكلوتيداتء نظائر حمض نووي ‎Mie «nucleic acid analogues‏ 5 ببتيد-حمض نووي ‎peptide-nucleic acid‏ (8لا)؛_ببتيد-حمض نووي ‏ شبه مكمل ‎«(Pc—-PNA) pseudo-complementary‏ وحمض نووي مقفول ‎locked nucleic acid‏
‎L(LNA)‏ تتضمن متواليات الحمض النووي هذه؛ ‎Ole‏ على سبيل المثال لا الحصرء بروتينات ترمز متوالية حمض نووي؛ ‎Die‏ التي تعمل كمواد قمع نسخية؛ جزيئات مضادة للحس؛ ريبوزيمات؛ متواليات حمض نووي تثبيطية صغيرة؛ مثلا على سبيل المثال لا الحصر ‎ShRNAI (RNAI‏ ‎«siRNA‏ نمل" عنم ‎«(MiRNA)‏ وأوليجونيكلوتيدات مضادة للحس. حسب ما هو مكشوف عنه هناء أحد أهداف الاختراع الحالي هو توفير طريقة لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني في خاضع. بالتالي؛ يقدم أحد جوانب الاختراع الحالي طريقة لزيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني في خاضع محتاج له؛ تتضمن الطريقة خطوة ملامسة خلية أساسية مكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم في الخاضع مع كمية فعالة من تركيبة تتضمن مثبط ل ‎(BCLTTA‏ بالتالي تتم زيادة التعبير 0 عن ‎(HBF‏ نسبة إلى تعبير قبل هذه الملامسة. في أحد النماذج؛ مثبط ل ‎BCLITA‏ عبارة عن عامل تداخل ‎RNA‏ يتضمن واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25 أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا. فيما يتعلق بملامسة خلية في خاضع مع مثبط ل ‎(BCLITA‏ تشير 'زيادة مستويات ‎HbF‏ ‏في خاضع' إلى أن ‎HDF‏ في الخاضع تبلغ على الأقل 75 أعلى في مجموعات معالجة ب مثبط ‎BCLIIA 5‏ من مجموعة مقارنة أو قابلة للمقارنة؛ حيث لا يوجد مثبط /86111. يفضل أن يبلغ التعبير عن هيموجلوبين جنيني في مثبط ,801117 لمعالجة خاضع على الأقل 710 ‎lel‏ على الأقل 720 أعلى؛ على الأقل 730 أعلى؛ على الأقل 740 ‎(ef‏ على الأقل 750 ‎Jel‏ على الأقل 760 أعلى؛ على الأقل 770 أعلى؛ على الأقل 780 ‎(lef‏ على الأقل 790 ‎Jel‏ على الأقل 1-طية ‎ef‏ على الأقل 2-طية ‎oof‏ على الأقل 5-طية أعلى؛ على الأقل 10 ‎Lh‏ ‏0 أعلى؛ على الأقل 100 طية ‎clef‏ على الأقل 1000-طية أعلى؛ أو أكثر من معالجة خاضع مقارن قابل للمقارنة. يتم استخدام المصطلح ‎dalled’‏ خاضع مقارن قابل للمقارنة" هنا لوصف خاضع تمت معالجته بشكل انتقائي؛ باستثناء إضافة أوليجونيكلوتيد ‎oligonucleotide‏ غير مستهدف. ‎do dull‏ أحد النماذج؛ تم تشخيص الخاضع بمرض هيموجلويين. في نموذج ‎OA‏ ‏5 مرض الهيموجلويين عبارة عن مرض الخلية المنجلية. حسب الاستخدام هناء يمكن أن يكون مرض الخلية المنجلية عبارة عن الخلية المنجلية ‎(badd‏ مرض هيموجلويين © منجلي -5606
‎hemoglobin C disease‏ (1050)؛ ‎Wy‏ بلاس ثالاسيميا منجلية -15ام-5618 ‎sickle‏ ‎«(HbS/B+) thalassaemia‏ أو ثلاسيميا ‎Gy‏ منجلية صفرية ‎sickle beta-zero-‏ ‎(HPS/BO) thalassaemia‏ في نموذج ‎(dante AT‏ مرض الهيموجلوبين عبارة عن ثلاسيميا. يقوم العلاج وفقا للاختراع الحالي بتخفيف واحد أو أكثر من الأعراض المرتبطة بالاضطراب بواسطة زيادة كمية الهيموجلويين الجنيني في الفرد. تتضمن الأعراض المرتبطة بشكل ‎ie‏ بمرض الهيموجلوبين؛ ‎chad! lie‏ نقص أكسجة الأنسجة ‎tissue hypoxia‏ قصور عضوي ‎organ dysfunction‏ قيم هيماتوكريت غير طبيعية ‎abnormal hematocrit‏ ‎(values‏ كريات حمراء غير فعالة ‎ae dneffective erythropoiesis‏ الخلايا الشبكية غير الطبيعي ‎abnormal reticulocyte‏ (كرية ‎(shes‏ حمل حديد غير طبيعي؛ وجود أرومات 0 حديدية حلقية ‎ring sideroblasts‏ تضخم الطحال ‎splenomegaly‏ تضخم الكبد ‎hepatomegaly‏ تدفق ضعيف للدم المحيط ‎dmpaired peripheral blood flow‏ ضيق التنفس ‎dyspnea‏ انحلال الدم المتسارع ‎hemolysis‏ 00168580 اليرقان ‎jaundice‏ أزمة ألم فقر الدم ‎canemic pain crises‏ متلازمة الصدر الحادة ‎«acute chest syndrome‏ عزل الطحال ‎«splenic sequestration‏ قساح ‎«priapism‏ السكتة 68ا500؛ متلازمة الكف- القدم ‎«hand-foot syndrome 5‏ والألم مثل الذبحة الصدرية ‎.angina pectoris‏ في أحد النماذج؛ يتم اعتبار الخلية الأساسية المكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم خارج الكائن الحي أو في المعمل؛ ويتم إعطاء الخلية أو ذريتها إلى الخاضع. في نموذج آخرء ‎Lal‏ ‏الأساسية المكونة للدم عبارة عن خلية من السلالة الحمراء . في أحد النماذج؛ يتم اعتبار الخلية الأساسية المكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم مع 0 تركيبة تتضمن مثبط ل 801117 وحامل أو مخفف مقبول صيدلانيا. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء التركيبة بواسطة حقن؛ تسريب؛ التقطير؛ أو ابتلاع. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء التركيبة بواسطة الحقن المباشر في نخاع العظم. في أحد النماذج ‎Wy‏ لأي طريقة موضحة؛ يتم استخدام طريقة العلاج الجيني لعلاج؛ الوقاية ‎(Ge‏ أو تخفيف مرض هيموجلويين مختار من المجموعة المكونة من: مرض هيموجلوبين ‎hemoglobin © disease © 5‏ هيموجلويين مرض الخلية المنجلية؛ الخلية المنجلية أنيميا ‎(sickle cell anemia‏ أنيميا وراثية ‎Lands hereditary anemia‏ 0-ثلاسيميا ‎B-‏
8 الثلاسيميا الأساسية؛ ثلاسيميا متوسطة؛ 0-ثلاسيميا؛ ومرض هيموجلويين ‎H‏ ‎.hemoglobin H disease‏ في العديد من النماذج وفقا لأي طريقة موضحة» يتم إعطاء النواقل الفيروسية الارتجاعية بواسطة الحقن المباشر إلى خلية؛ نسيج؛ أو عضو خاضع في حاجة إلى علاج جيني؛ في الكائن الحي. في العديد من النماذج الأخرى وفقا لأي طريقة موضحة؛ يتم تحويل الخلايا في المعمل أو خارج الكائن الحي مع نواقل وفقا للاختراع؛ ويتم التمدد اختياريا خارج الكائن الحي. بعد ذلك يتم إعطاء الخلايا المحولة إلى خاضع في حاجة لعلاج جيني. يتضمن "الخاضع؛" حسب الاستخدام هناء أي حيوان ‎Cow‏ عرض مرض أحادي الجين أو ‎dls‏ يمكن علاجها بنواقل العلاج الجيني ‎(gene therapy vectors‏ علاجات قائمة على أساس 0 الخلية؛ وطرق مكشوف عنها هنا. في النماذج المفضلة؛ يتضمن الخاضع أي حيوان يبين عرض مرض أو اضطراب أو حالة للنظام المكون للدم؛ ‎Ole‏ مرض هيموجلوبين؛ ‎(Sa‏ علاجه بنواقل العلاج الجيني؛ علاجات قائمة على أساس ‎lal‏ وطرق مذكورة ‎La‏ يتضمن الخاضعون المناسبون (مثلاء المرضى) حيوانات المعامل ‎Jie)‏ فأرء ‎pa‏ أرنب؛ أو خنزير غيني)؛ حيوانات المزرعة؛ والحيوانات الأليفة أو الحيوانات المنزلية (مثل قطة أو كلب). كائنات رئيسية غير الإنسان 5 وء بشكل مفضل؛ مرضى بشر. يتضمن الخاضعون المثاليين حيوانات تبين تظهر كميات منحرفة (كميات أقل أو أعلى من خاضع "طبيعي" أو '"صحي) لواحد أو أكثر من النشاطات الفسيولوجية التي يمكن تضمينها بواسطة علاج جيني. في أحد النماذج» حسب الاستخدام هنا يتضمن "علاج” أو 'دواء؛' أي أثر مفيد أو مطلوب على الأعراض أو المرض أو الحالة المرضية ويمكن أن يتضمن عمليات تقليل في واحد أو أكثر 0 من المرقمات القابلة للقياس من المرض أو الحالية التي يتم علاجها. في نموذج ‎(Sac AT‏ أن يتضمن العلاج اختياريا إما تقليل أو تخفيف في أعراض مرض أو حالة أو تأجيل تقدم المرض أو الحالة. لا يحتاج ‎Dall‏ بالضروري إلى أن يشير إلى استئصال كامل أو علاج للمرض أو الحالة أو أعراض مرتبطة بها. في أحد النماذج؛ حسب الاستخدام هناء تشير "الوقاية من" والكلمات المشابهة مثل "التي 5 تمت الوقاية منهاء' إلخ.؛ إلى منهج للوقاية من أو تثبيط أو تقليل احتمالية حدوث أو إعادة حدوث مرض أو حالة. في نموذج آخرء؛ يشير المصطلح إلى تأجيل بدء أو ‎sale]‏ حدوث مرض أو حالة
أو تأجيل في حدوث أو انتكاس مرض أو حالة. في نموذج آخرء؛ حسب الاستخدام هناء "الوقاية" وما شابهها من كلمات تتضمن تقليل شدة وأثر وأعراض و/أو حمل مرض أو حالة قبل بدء أو
إعادة حدوث المرض أو الحالة. في أحد النماذج وفقا لأي طريقة موضحة؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار خاضع محتاج _للعلاج الجيني الموضح. ‎Ole‏ يتم اختيار خاضع يبين أعراض مرض هيموجلويين من المجموعة المكونة من مرض هيموجلوبين ©؛ هيموجلوبين مرض الخلية المنجلية؛ الخلية المنجلية أنيميا؛ أنيميا وراثية؛ ‏ ثلاسيميا؛ م-ثلاسيمياء الثلاسيميا الأساسية؛ ثلاسيميا متوسطية؛ »-ثلاسيمياء ومرض هيموجلويين ‎LH‏ بشكل بديل؛ يحمل الخاضع تطفر جيني مرتبط بمرض هيموجلويين؛ تطفر جيني موضح هنا. ‎Ole‏ تشخيث خاضع مرض الخلية المنجلية بنمط جيني ‎(HPSS‏ ثلاسيميا بيتا
0 منجلية صفرية ثلاسيمياء ‎(HOSD‏ أو 11550 و/أو مع ‎HOF‏ >710 بواسطة الرحلان الكهربي.
في العديد من النماذج وفقا لأي طريقة موضحة؛ يتم إعطاء خاضع محتاج لعلاج جيني مجموعة من خلايا تتضمن كمية فعالة من خلايا معدلة جينيا مذكورة هنا. ذلك أن خلايا معدلة ‎Lia‏ تعبر واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25 أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا.
حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح "كمية' إلى " كمية فعالة' أو 'كمية ‎Malic‏ من فيروس أو علاج بخلية محولة لتحقيق نتيجة وقائية أو علاجية مفيدة أو مطلوبة شاملة النتائج السريرية.
يشير المصطلح "كمية فعالة وقائيا” إلى كمية من فيروس أو خلية علاجية محولة فعالة لتحقيق النتيجة الوقائية المطلوية. بشكل مثالي وليس ضروري»؛ ‎Cus‏ يتم استخدام جرعة وقائية؛ في
0 الخاضعين قبل أو عند مرحلة مبكرة من المرض» تكون الكمية الفعالة وقائيا أقل من الكمية الفعالة علاجيا.
يمكن أن يختلف المصطلح "كمية فعالة ‎"ladle‏ من فيروس أو خلية علاجية محولة وفقا ‎algal‏ مثل حالة المرض أو السن أو الجنس أو وزن ‎call‏ وقدرة الخلايا الجذعية والأساسية على الحصول على استجابة مطلوية في الفرد. الكمية الفعالة علاجيا أيضا عبارة عن كمية حيث يتم
5 التفوق على الآثار السمية أو الخطرة للفيروس الخلايا العلاجية المحولة بواسطة الآثار المفيدة علاجيا. يتضمن المصطلح "كمية فعالة علاجيا" كمية فعالة ل "علاج" خاضع ‎Ni)‏ مريض).
في أحد النماذج؛ يقدم الاختراع الحالي طريقة توفير خلية محولة إلى خاضع يتضمن إعطاء؛ ‎lie‏ بالحقن؛ واحد أو أكثر من خلايا محولة مع ناقل مذكور هنا في الخاضع. في أحد النماذج, الناقل عبارة عن ناقل يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:1- 18-3 44-25 أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا.
في نموذج معين»؛ تم توفير طريقة للوقاية من؛ تخفيف؛ أو علاج مرض هيموجلوبين في خاضع. تتضمن الطريقة إعطاء مجموعة من خلايا تتضمن خلايا مكونة للدم محولة مع ناقل مذكور هنا. في أحد النماذج؛ الناقل عبارة عن ناقل يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25 أو ‎BCL1IMicroRNA‏ تخليقي موضح هنا.
في النماذج المعينة؛ تتضمن مجموعة من خلايا تم إعطاؤها إلى خاضع ‎A‏ جذعية 0 مكونة للدم أو خلايا أساسية» ‎WA‏ سليفة أرومية ‎LIAN cohen‏ الصبغية الحمراء الأرومية؛ الخلايا الأرومية الحمراء متعددة التضرج؛ ‎LAY‏ الحمراء الحساسة للتلون» كريات الدم الحمراء متعددة الألوان» وكريات الدم الحمراء» أو أي توليفة مما سبق؛ ‎(gly‏ نسبة منها يمكن أن تكون معدلة جينيا بواسطة النواقل المذكورة هنا. في أحد النماذج؛ الناقل هو ذلك الذي يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25 أو ‎BCL11MicroRNA 5‏ تخليقي موضح هنا. يمكن إعطاء ‎WAY‏ المعدلة جينيا كجزء من زريعة نخاع العظم أو دم الحبل السري في فرد خضع أو لديه علاج نخاع العظم قابل للحت. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء خلايا معدلة جينيا المذكورة هنا في زريعة نخاع العظم إلى فرد خضع لعلاج بنخاع العظم قابل للحت الكيماوي أو الإشعاعي. في أحد النماذج؛ يتم توصيل جرعة من خلايا معدلة جينيا إلى خاضع وريديا. في أحد النماذج؛ يتم إعطاء خلايا معدلة جينيا مكونة للدم وريديا إلى خاضع. في النماذج المعينة؛ يتلقى المرضى جرعة من خلايا معدلة جينياء ‎Ole‏ خلايا جذعية مكونة للدم؛ بمقدار حوالي 1 * 105 خلايا/كجم؛ حوالي 5 ‎X‏ 105 خلايا/كجم؛ حوالي 1 ‎X‏ 106 خلايا/كجم» حوالي 2 ‎X‏ 106 خلايا/كجم»؛ حوالي 3 ‎Xx‏ 106 خلايا/كجم» حوالي 4 ‎x‏ 106 5 خلايا/كجم» حوالي 5 ‎X‏ 106 خلايا/كجم» حوالي 6 ‎X‏ 106 خلايا/كجم» حوالي 7 ‎x‏ 106 خلايا/كجم» حوالي 8 ‎X‏ 106 خلايا/كجم»؛ حوالي 9 ‎X‏ 106 خلايا/كجم» حوالي 1 ‎x‏ 107
خلايا/كجم»؛ حوالي 5 ‎x‏ 107 خلايا/كجم؛ حوالي 1 ‎Xx‏ 108 خلايا/كجم؛ أو أكثر في جرعة وربدية واحدة. في النماذج المعينة؛ يتلقى المرضى جرعة من ‎WIS‏ معدلة ‎Ole clin‏ خلايا جذعية مكونة للدم؛ بمقدار على الأقل 1 ‎x‏ 105 خلايا/كجم»؛ على الأقل 5 ‎x‏ 105 خلايا/كجم؛ على الأقل 1 ‎x‏ 106 خلايا/كجم؛ على الأقل 2 ‎x‏ 106 خلايا/كجم» على الأقل 3 ‎x‏ 106 خلايا/كجم؛ على الأقل 4 ‎x‏ 106 خلايا/كجم» على الأقل 5 ‎X‏ 106 خلايا/كجم؛ على الأقل ‎X6‏ ‏6 خلايا/كجم» على الأقل 7 ‎x‏ 106 خلايا/كجم» على الأقل 8 ‎x‏ 106 خلايا/كجم» على الأقل 9 ‎xX‏ 106 خلايا/كجم»؛ على الأقل 1 ‎x‏ 107 خلايا/كجم»؛ على الأقل 5 ‎x‏ 107 خلايا/كجم؛ على الأقل 1 ‎x‏ 108 خلايا/كجم؛ أو أكثر في جرعة وربدية واحدة. في نموذج إضافي؛ يتلقى المرضى جرعة من خلايا معدلة ‎hin‏ مثلا؛ خلايا جذعية 0 مكونة للدم؛ بمقدار حوالي 1 ‎X‏ 105 خلايا/كجم إلى حوالي 1 ‎Xx‏ 108 خلايا/كجم؛ حوالي 1 ‎X‏ ‏6 خلايا/كجم إلى حوالي 1 ‎x‏ 108 خلايا/كجم؛ حوالي 1 * 106 خلايا/كجم إلى ‎X 9 Joa‏ 6 خلايا/كجم» حوالي 2 ‎X‏ 106 خلايا/كجم إلى حوالي 8 * 106 خلايا/كجم» حوالي 2 ‎X‏ ‏6 خلايا/كجم إلى حوالي 8 * 106 خلايا/كجم؛ حوالي 2 ‎X‏ 106 خلايا/كجم إلى حوالي ‎X5‏ ‏6 خلايا/كجم» حوالي 3 ‎X‏ 106 خلايا/كجم إلى حوالي 5 * 106 خلايا/كجم» حوالي 3 ‎X‏ ‏5 106 خلايا/كجم إلى حوالي 4 ‎X‏ 108 خلايا/كجم» أو أي جرعة متداخلة بمقدار خلايا/كجم. في العديد من النماذج؛ تقدم الطرق وفقا للاختراع علاج جيني أكثر صلابة وأمانا من الطرق الموجودة وتتضمن إعطاء مجموعة جرعة من خلايا تتضمن حوالي 75 خلايا محولة؛ حوالي 710 خلايا محولة؛ حوالي 715 ‎WIA‏ محولة؛ حوالي 720 خلايا محولة؛ حوالي 725 خلايا محولة؛ حوالي 730 ‎WA‏ محولة؛ حوالي 735 خلايا محولة؛ حوالي 740 ‎WIA‏ محولة؛ 0 حوالي 745 خلايا محولة؛ أو حوالي 750 ‎WIA‏ محولة؛ إلى خاضع. في أحد النماذج؛ يقدم الاختراع ‎WA‏ معدلة ‎clin‏ مثل خلية جذعية؛ مثلاء خلية جذعية مكونة للدم؛ مع القدرة على التمدد أو زيادة مجموعة من الخلايا الحمراء. في نماذج معينة؛ يتم تحويل خلايا جذعية مكونة للدم مع ناقل وفقا للاختراع ويتم الإعطاء إلى فرد محتاج لعلاج لمرض هيموجلوبين. الخلايا الجذعية المكونة للدم هي أصل ‎WAN‏ الحمراء وبالتالي؛ فهي مفضلة. في 5 أحد النماذج الناقل عبارة عن ناقل يحمل واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1؛ 44-25« أو ‎BCL11MicroRNA‏ تخليقي موضح هنا.
حسب الاستخدام هناء المصطلح 'مقبول صيدلانياء” والاختلافات النحوية منهاء حيث تشير
إلى تركيبات؛ مواد حاملة؛ مخففات وعوامل كاشفة؛ يتم استخدامها بالتبادل وتمثر المواد القادرة
على إعطاء خاضع بدون إنتاج آثار فسيولوجية غير مطلوية مثل الغثيان ‎nausea‏ والدوخة
وحدم الارتياح بالمعدة ‎gastric upset‏ وما إذا ذلك. يجب على كل ‎dela‏ أن يكون
‎phd 5‏ أيضا من حيث التوافق مع المكونات الأخرى للصيغة. سوف يقوم ‎dela‏ مقبول صيدلانيا
‏بتعزيز إنتاج استجابة مناعية إلى عامل يتم خلطه به؛ ما لم يكن هذا غير مطلوب. سوف يتم فهم
‏تحضير تركيبة صيدلانية تحتوي على مكونات مذابة أو مشتتة فيها في المجال ولا تحتاج إلى أن
‏تكون مقيدة على صيغة. تحتوي الصيغة الصيدلانية على مركب وفقا للاختراع في توليفة مع واحد
‏أو أكثر من مكونات مقبولة صيدلانيا. يمكن أن يكون الحامل في صورة مخفف صلب أو شبه
‏0 صلب أو سائلة أو كريم أو كبسولة. بشكل مثالي يتم تحضير هذه التركيبات لتكون قابلة للحقن أو
‏سوائل محاليل أو معلقات؛ مع ذلك؛ يمكن تحضير الصور الصلبة المناسبة من أجل المحلول أو
‏المعلقات في صورة سائلة قبل الاستخدام. يمكن استحلاب المستحضر أو تقديمه كتركيبة ليبوسوم
‎liposome composition‏ يمكن خلط المكون النشط مع سوائغات مقبولة صيدلانيا ومتوافقة مع
‏المكون النشط وبكميات مناسبة للاستخدام في الطرق العلاجية الموضحة هنا. تتضمن السواغات
‏5 المناسبة؛ ‎lie‏ الماء أو المحلول الملحي أو دكستروز ‎dextrose‏ أو جليسرول ‎glycerol‏ أو
‏إيثانول ‎ethanol‏ أو ما شابه وتوليفات مما سبق. علاوة على ذلك؛ عند الحاجة؛ يمكن أن تحتوي
‏التركيبة على كميات أقل من المواد المضافة ‎Jie‏ عوامل الترطيب أو الاستحلاب ‎wetting or‏
‎cemulsifying agents‏ عوامل تنظيم ‎buffering agents‏ درجة الحموضة وما شابه والتي
‏تعزز فعالية المكون النشط. يمكن أن تتضمن التركيبة العلاجية وفقا للاختراع الحالي أملاح مقبولة
‏0 صيدلانيا من المكونات الخاصة بها. تتضمن الأملاح المقبولة صيدلانيا أملاح الإضافة الحمضية
‏(المكونة مع مجموعات الأمينو الحرة ‎free amino groups‏ للبولي ببتيد ‎(polypeptide‏ الذي
‏يتم تكوينه في أحماض غير عضوية ‎lie (Jie inorganic acids‏ أحماض هيدروكلوريك أو
‏فوسفوريك ‎hydrochloric or phosphoric acids‏ أو هذه الأحماض غير العضوية ‎Jie‏
‏أسيتيك ‎acetic‏ أو طرطريك ‎tartaric‏ أو ماندليك ‎imandelic‏ وما شابه. يمكن ‎Lad‏ اشتقاق
‏5 الأملاح المكونة مع مجموعات الكريوكسيل ‎carboxyl‏ الحرة أيضا من مواد قاعدية غير عضوية
‎Sle «Jie inorganic bases‏ مركبات هيدروكسيد ‎hydroxides‏ الصوديوم ‎sodium‏ أو
— 8 2 —
البوتاسيوم ‎potassium‏ أو الأمونيوم ‎ammonium‏ أو الكالسيوم ‎calcium‏ أو الحديديك ‎ferric‏ ‏وهذه القواعد العضوية ‎Jie‏ أيزو بروييل أمين 100/180106م150 ‎lp‏ ميثيل أمين ‎trimethylamine‏ 2-إيثيل ‎sue‏ إيثاتول ‎ethanol‏ 807100ا/1©-2» هيستيدين ‎histidine‏ ‏بروكيين ‎procaine‏ وما شابه. المواد الحاملة التى يمكن تحملها فسيولوجيا معروفة فى المجال. تتضمن المواد الحاملة السائلة ‎liquid carriers‏ المناسبة محاليل مائية معقمة لا تحتوي على مواد بالإضافة إلى المكونات النشطة والماء أو تحتوي على ‎sale‏ منظمة ‎buffer‏ مثل فوسفات صوديوم ‎sodium phosphate‏ عند ‎ded‏ درجة حموضة فسيولوجية؛ أو محلول ملحي فسيولوجي أو كلاهماء مثل محلول ملحي منظم بفوسفات ‎.phosphate-buffered saline‏ أيضاء يمكن أن تحتوي المواد الحاملة الماثية ‎aqueous carriers‏ ما يزيد على ملح منظم ‎«aly buffer salt‏ 0 بالإضافة إلى أملاح مثل مركبات كلوريد صوديوم وبوتاسيوم ‎sodium and potassium‏ 5م دكستروز ‎Js «dextrose‏ إيثيلين جليسرول ‎polyethylene glycol‏ وغيرها من نواتج الإذابة. يمكن أن تحتوي التركيبات السائلة أيضا أطوار سائلة بالإضافة إلى وباستبعاد الماء. يفضل بشكل مثالى للأطوار السائلة الإضافية أن تتضمن جليسرين ‎glycerin‏ أو زيوت نباتية ‎Jie‏ ‏زبت بذر القطن؛ ومستحلبات ماء-زيت. سوف تعتمد كمية عامل نشط ‎active agent‏ مستخدمة 5 في الاختراع والتي سوف تكون فعالة في علاج اضطراب أو حالة معينة على طبيعة الاضطراب أو ‎dll‏ ويمكن تحديدها بواسطة التقنيات السريرية المعيارية. تتضمن العبارة ‎dela’‏ أو مخفف مقبول صيدلانيا" متوسطات من مادة مقبولة صيدلانياء تركيبة أو موجه؛ مثل سائل أو مادة ملء ‎(abil‏ مخفف ‎«diluent‏ سواغ ‎excipient‏ مذيب أو مادة تغليف ‎«encapsulating material‏ متضمنة في حمل أو نقل عوامل الخاضع من عضو واحد أو ‎ei‏ من الجسم إلى عضو ‎AT‏
0 أو جزءٍ من الجسم. في أحد نماذج أي طريقة الموضح؛ حسب الاستخدام هناء يشير المصطلح ‎oF‏ إعطاؤه" إلى وضع ‎hie‏ ل 801117 في خاضع بواسطة طريقة أو مسار يؤدي إلى تموضع جزئي على الأقل للمتبط عند موقع مطلوب. يمكن إعطاء عامل يثبط 86011178 بواسطة أي مسار مناسب يؤدي إلى علاج فعال في الخاضع؛ أي » يؤدي إعطاء إلى توصيل موضع مطلوب في الخاضع 5 حيث يتم توصيل جزءِ على الأقل من التركيبة التي تم توصيلهاء أي؛ عامل واحد على الأقل؛ والتي تثبط 80111/4؛ نشط في الموقع المطلوب لمدة من الوقت. تعتمد ‎sae‏ نشاط ‎bial‏ على عمر
النصف في الكائن الحي بعد الإعطاء إلى خاضع؛ ويمكن أن تكون قصيرة بمقدار ساعات قليلة؛ ‎Ole‏ على الأقل 1 ساعة؛ على الأقل ساعتين» على الأقل 3 ساعات؛ على الأقل 4 ساعات؛ على الأقل 5 ساعات؛ على الأقل 6 ساعات؛ على الأقل 8 ساعات؛ على الأقل 10 ساعات؛ على الأقل 12 ‎dele‏ على الأقل 18 ساعة؛ على الأقل 24 ساعة؛ إلى عدة ‎calf‏ إلى ما يصل إلى عدة سنوات. تتضمن أوضاع الإعطاء حقن؛ تسريب؛ التقطير؛ أو ابتلاع. يتضمن ال ‎Copa’‏ ‏بدون ‎cad‏ الحقن والتسربب الوريدي أو عبر العضل أو في الوريد أو عبر داخل القراب ‎Jala «intrathecal‏ البطيني ‎Jala cintraventricular‏ المحفظة ‎Jala cintracapsular‏ الحجاج ‎Jala cintraorbital‏ القلب ‎cntracardiac‏ الأدمة ‎Jala cintradermal‏ الصفاق ‎1180811100768١‏ عبر الرغامى ‎ctranstracheal‏ تحت الجلد ‎(subcutaneous‏ تحت البشرة ‎Jala ¢subcuticular 0‏ المفصل ‎cintraarticular‏ داخل المحفظة الفرعية ‎sub capsular‏ تحت العنكبوتية ‎subarachnoid‏ داخل النخاع ‎cintraspinal‏ داخل الدماغ ؛ داخل العمود الفقري ‎spinal‏ 17180616010 و داخل القص ‎.intrasternal‏ ‏في أحد ‎op Sail)‏ تتضمن التركيبة الموضحة هناء أو الفيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من مجموعة تتكون_ من متواليات برقم هوية:1- 5 18-1013( 44-25؛ أو الفيروس أو ناقل التعبير عن ‎alas BCLIIMicroRNA‏ موضح هناء يتم حقنه في نخاع العظم. في أحد النماذج؛ تتم ملامسة الخلية الأساسية المكونة للدم أو خلية جذعية مكونة للدم من خاضع يحتاج إلى علاج مع تركيبة تثبط التعبير عن /86111. في نماذج أخرى؛ تتضمن التركيبة فيروس أو ناقل يحمل جزيء حمض نووي يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من 0 مجموعة تتكون من متواليات برقم هوية:18-10013-1؛ 44-25؛ أو فيروس أو ناقل التعبير عن 8ل4ا801111/1000 تخليقي موضح هنا. الخاضع الذي يحتاج إلى علاج عبارة عن مشخص بمرض هيموجلويين مثل مرض الخلية المنجلية أو ثلاسيميا. يقصد ب 'يثبط التعبير عن 86111/8" أن كمية تعبير عن /806111 أقل بمقدار على الأقل 75 في مجموعات معالجة ‎Lia‏ /80111؛ من مجموعة قارنة قابلة للمقارنة؛ حيث لا 5 ييوجد مثبط 806111/8. يفضل أن تكون نسبة التعبير عن 801118 في مجموعة ‎Lie‏ ‎dallas 801118‏ على الأقل 710 أقل؛ على الأقل 720 أقل؛ على الأقل 730 أقل؛ على الأقل
0 أقل.؛ على الأقل 750 أقل» على الأقل 760 أقل» على الأقل 770 ‎(Jil‏ على الأقل 780 ‎Jd‏ على الأقل 790 ‎JE‏ على الأقل 1-طية ‎oda‏ على الأقل 2-طية ‎odd‏ على الأقل 5-طية ‎(Jd‏ على الأقل 10 طية أقل» على الأقل 100 طية أقل» على الأقل 1000-طية أقل؛ أو أكثر من مجموعة معالجة مقارنة حيث لا تتم إضافة مثبط ‎BCLI11A‏ ‏5 في أحد النماذج؛ الحمض النووي عبارة عن عامل تداخل ‎RNA‏ انتقائي ل ‎BCLITA‏ أو ناقل يرمز عامل تداخل ‎RNA‏ في أحد النماذج؛ عامل تداخل ‎RNA‏ يتضمن واحد أو أكثر من متواليات النيكلوتيد لمتواليات برقم هوية:18-10.13-1 44-25. كمثال على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة إعطاء الخاضع تركيبة تتضمن خلايا معدلة تتضمن ناقل يحمل متوالية حمض
0 نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و44-25؛ أو ‎BCL11MicroRNA‏ موضحة هنا. في أحد النماذج» تتضمن الطريقة أيضا تحديد خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة أيضا اختيار الخاضع المحدد المصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين.
كمثال آخر على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة الخطوات التالية: نقل الخلايا الجذعية المكونة للدم وخلايا أساسية مكونة للدم في خاضع؛ جمع وتجميع الدم المحيط من الخاضع الاختيار الإيجابي لخلايا +0034 من الدم المحيط» تحويل وإصابة خلايا 0034+ المختارة في المعمل مع ناقل يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و44-25؛ أو
‎BCL11MicroRNA 0‏ موضحة هنا؛ غسل خلايا ‎+CD34‏ المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا إلى الخاضع. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا تحديد خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة أيضا التمدد في مزرعة ‎+CD34 WIA‏ المحولة المغسولة المختارة في
‏5 المعمل قبل إعطاء الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة أيضا متمايزة في مزرعة خلايا 4+ المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل إعطاء الخاضع.
كمثال آخر على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة الخطوات التالية: نقل الخلايا الجذعية المكونة للدم وخلايا أساسية مكونة للدم في مانح خاضع؛ وجمع الدم المحيط من المانح الخاضع؛ والاختيار الايجابي لخلايا ‎CD34+‏ ‏من الدم المحيط» ونقل أو إصابة ‎+CD34 WA‏ المختارة في المعمل مع ناقل يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و44-25؛ أو ‎BCLIIMicroRNA‏ موضحة هنا؛ وغسل ‎+CD34 WA‏ المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا في خاضع مستقبل. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار مستقبل خاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة ‎La‏ التمدد في مزرعة ‎+CD34 WIA‏ المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل الإعطاء إلى 0 المستقبل الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة ‎Lad‏ متمايزة في مزرعة ‎+CD34 WA‏
المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل الإعطاء إلى المستقبل الخاضع. كمثال آخر على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة الخطوات التالية: وجمع الدم من نخاع العظم لخاضع, والاختيار الإيجابي لخلايا +0034 من نخاع العظم الدم؛ ونقل أو إصابة خلايا 0034+ المختارة في المعمل مع ‎Jib 5‏ يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-3 ,44-25« أو ‎BCL11MicroRNA‏ موضحة هنا؛ ويتم غسل خلايا ‎+CD34‏ المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا في الخاضع. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة ‎Lad‏ تحديد خاضع مصاب بمرض هيموجلويين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار الخاضع مصاب بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة 0 بمرض هيموجلوبين. في نموذج ‎«AT‏ تتضمن الطريقة ‎Load‏ التمدد في مزرعة خلايا ‎+CD34‏ ‏المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل إعطاء الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة ‎Lad‏ متمايزة في مزرعة خلايا ‎+CD34‏ المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل إعطاء
الخاضع . كمثال على طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ 5 تتضمن الطريقة الخطوات التالية: جمع الدم من نخاع العظم ‎mild‏ خاضع, الاختيار الإيجابي لخلايا +0034 من نخاع العظم الدم؛ ونقل أو إصابة الخلايا ‎+CD34‏ المختارة في المعمل مع
ناقل يحمل متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 ,44-25 أو ‎BCL11MicroRNA‏ موضحة هنا؛ ‎Jue‏ خلايا ‎+CD34‏ المحولة المختارة؛ وإعطاء الخلايا في مستقبل خاضع. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا تحديد مستقبل خاضع مصاب بمرض هيموجلويين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في أحد النماذج؛ تتضمن الطريقة أيضا اختيار مستقبل خاضع مصاب بمرض هيموجلويين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلويين. في نموذج ‎AT‏ تتضمن الطريقة ‎Lad‏ التمدد في مزرعة ‎+CD34 WDA‏ المغسولة المحولة المختارة في المعمل قبل الإعطاء إلى المستقبل الخاضع. في نموذج آخرء تتضمن الطريقة ‎Lad‏ متمايزة في مزرعة ‎+CD34 WIA‏ المغسولة المحولة المختارة
في المعمل قبل الإعطاء إلى المستقبل الخاضع.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا خلية معدلة تتضمن متوالية حمض نووي ‎nucleic‏ ‎acid sequence‏ مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1. 18-13 44-25( أو ‎BCL11MicroRNA‏ موضحة هنا.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا خلية مصممة كانت محولة أو منقولة مع ناقل يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13
5 44-255 أو ‎BCL1IMicroRNA‏ موضحة هنا. في أحد النماذج؛ الناقل ‎Ble‏ عن فيروس
بطيء.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في ‎cali‏ تتضمن الطريقة إعطاء خلية مصممة محولة أو منقولة مع ناقل يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13
0 و44-25؛ أو ‎BCL1IMicroRNA‏ موضحة هنا. في أحد النماذج؛ الناقل ‎Ble‏ عن فيروس
بطيء.
في أحد النماذج؛ يقدم الكشف هنا طريقة علاج لخاضع أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع؛ تتضمن الطريقة إعطاء خلية مصممة يتضمن متوالية حمض نووي مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 44-255 أو
‎BCL11MicroRNA 5‏ موضحة هنا.
في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد النماذج, الخلية المصممة عبارة عن خلية المتمايزة من خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية متمايزة في السلالة الحمراء ‎erythroid‏ ‎lineage‏ ‏في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية متمايزة في كرية حمراء . في أحد النماذج؛ الخلية المصممة عبارة عن خلية ‎+CD34‏ ‏10 يمكن تحديد الاختراع الحالي في أي فقرة تالية. ‎BCL11MicroRNA ]1[‏ تخليقي يتضمن ‎oa «Js 801118 a‏ حلقي؛ ‎gag‏ ‏8078 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5" إلى 3 ؛ حيث الجزءِ الحلقي موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بأجزاء 801118 الأول ‎Sly‏ وحيث ‎gia‏ 861118 الثاني مكمل لجزء 801118 الأول بحيث تكون أجزاء 8011178 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية مع 5 الجزء الحلقي الذي يكون الجزء الحلقي للحلقة الدبوسية الذي تم تكوينه بالتبعية. ‎BCL11MicroRNA ]2[‏ التخليقي وفقا للفقرة 1 حيث أجزاء 8611178 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات. ‎BCL11MicroRNA ]3[‏ التخليقي وفقا للفقرة 1 أو 2 حيث يحتوي ‎oa‏ 8011178 الأول على متوالية مشتقة من متوالية ‎.BCL11A MRNA‏ ‎BCL11MicroRNA ]4[ 0‏ التخليقي وفقا لأي من فقرات 3-1 ‎gia Cum‏ 8011178 الأول مكمل لجزء 8011178 الثاني. ‎BCL1IMicroRNA ]5[‏ التخليقي وفقا لأي من فقرات 4-1؛ ‎cus‏ يبدأ ‎ga‏ 801118 الأول ب -6060- عند الطرف 5” ‎ga gins‏ 801117 الثاني ب ‎~GCGC-‏ عند الطرف 3 ‎BCL1IMicroRNA [6] 5‏ التخليقي وفقا لأي من فقرات 5-1 حيث يتم اختيار جزء 86118 الأول من المجموعة المكونة من ‎CGCACAGAACACTCATGGATT‏ (متوالية
بهوية رقم: 46؛ مشتق من 41نم 80111 أوليجو موضحة ‎(W‏ ‎CCAGAGGATGACGATTGTTTA‏ (متوالية بهوية رقم: 47؛ مشتق من 00182 801118 أوليجو موضحة ‎TCGGAGACTCCAGACAATCGC «(la‏ (متوالية بهوية رقم: 48؛ مشتق من ‎BCLIIA E3‏ أوليجو أو ‎ShRNAL‏ أو 53 موضحة هنا)ء ‎CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC 5‏ (متوالية بهوية رقم: 49؛ مشتق من ‎ShRNA2‏ أو ‎BS‏ موضحة هنا)؛ ‎TCAGGACTAGGTGCAGAATGT‏ (متوالية بهوية رقم: 50؛ مشتق من 90884 أو 811 موضحة ‎TTCTCTTGCAACACGCACAGA «(Us‏ (متوالية بهوية رقم: 51؛ مشتق من ‎D8‏ 801118 أوليجو أو ‎ShRNA3‏ أو 08 موضحة ‎(We‏ ‎GATCGAGTGTTGAATAATGAT‏ (متوالية بهوية رقم: 52؛ مشتق من ‎ShRNAS‏ أو 0 01250 اه 012 موضحة هنا)» ‎CAGTACCCTGGAGAAACACAT‏ (متوالية بهوية رقم: 3؛ مشتق من ‎ShRNAS‏ أو ‎SOAS‏ موضحة فنا ‎CACTGTCCACAGGAGAAGCCA‏ ‏(متوالية بهوية رقم: 54؛ ‎Gude‏ من ‎shRNAT‏ أو 50811 موضحة ‎(ba‏ ‎ACAGTACCCTGGAGAAACACA‏ (متوالية بهوية رقم: 55؛ مشتق من 801118 ‎shRNAS XLC4‏ و5004 مروضحة هنا ‎CAACAAGATGAAGAGCACCAA‏ (متوالية بهوية رقم: 56؛ مشتق من أوليجو غير مستهدفة ل 80111 موضحة ‎(Wa‏ ‏969006080860803 (متوالية ‎diggs‏ رقم: 57؛ مشتق من 001165 أوليجو موضحة ‎GCGCTCGGAGACTCCAGACAA «(la‏ (متوالية بهوية رقم: 58؛ مشتق من 65 أو ‎mod sid‏ 53 أو ‎ shRNAImod‏ موضحة هنا)ء ‎gegcCCTCCAGGCAGCTCAAA‏ (متوالية بهوية رقم: 59؛ مشتق من 8565 أو ‎ShRNA2mod 0‏ موضحة هنا)؛ 6068 1 969010866801866 (متوالية بهوية رقم: 60 مشتق من 165 أو ‎shRNAdmod‏ موضحة | هنا)؛ ‎gCGCGATCGAGTGTTGAATAA‏ (متوالية بهوية رقم: 61؛ ‎ide‏ من 5001265؛ 4 أو 90811850000 موضحة هنا)؛ ‎gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC‏ (متوالية بهوية رقم: 62؛ مشتق من 5085650 50186000 موضحة هنا)؛ ‎gcgcCACTGTCCACAGGAGAA 5‏ (متوالية بهوية رقم: 63؛ مشتق من 5081165 أو 900/8700 موضحة هنا)؛ ‎GCGCTTCTCTTGCAACACGCA‏ (متوالية بهوية رقم:
4؛ مشتق من 0865 806111 أو ‎D8 mod‏ أو ‎ShRNA3mod‏ موضحة 48(« ‎GCGCACAGTACCCTGGAGAAA‏ (توالية بهوية رقم: 65؛ مشتق من 801118 ‎«C4G5‏ أو ‎mod‏ 04 أو ‎ ShRNASmMod‏ موضحة هنا)؛ ‎CGCACAGAACACTCATGGATT‏ (متوالية بهوية رقم: 66؛ مشتق من 80111 01265-2 موضحة هنا)ء 5 ‎ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT‏ (متوالية بهوية رقم: 67؛ مشتق من ‎DI2G5-2‏ 8011178 موضحة هنا ). ‎BCL1IMicroRNA . ]7[‏ التخليقي وفقا لأي من فقرات 6-1؛ حيث ‎gall‏ الحلقي مشتق من ‎.microRNA‏ ‎BCL11MicroRNA ]8[‏ التخليقي وفقا للفقرة 7 حيث ‎She MicroRNA‏ عن ‎microRNA 0‏ انتقائي لمكونات الدم. ‎BCL11MicroRNA ]9[‏ التخليقي وفقا للفقرة 8( ‎MicroRNA Cua‏ عبارة عن ‎-MiR223‏ ‎BCL11MicroRNA ]10[‏ التخليقي ‎Wy‏ للفقرة 9 حيث ‎gall‏ الحلقي ‎Ble‏ عن ‎.ctccatgtggtagag‏ ‎BCL11MicroRNA ]11[‏ التخليقي وفقا لأي من فقرات 1- 10( حيث ‎MICTORNA‏ يتضمن 5 مقتوالية نيكلوتيد مختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية:10-1؛ 18-13 و25- 44
[12] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير في الكائن الحي عن ‎BCLIIMicroRNA‏ تخليقي واحد على الأقل وفقا لأي من فقرات 11-1 في الخاضع. 0 ]13[ الطريقة فقرة 12( حيث يتم التعبير في الكائن الحي في خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم في الخاضع.
[14] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة التعبير عن ‎BCLIIMicroRNA‏ تخليقي واحد على الأقل ‎Wy‏ لأي من فقرات 11-1 في خلية 5 جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛
أو خلية أساسية مكونة للدم للخاضع حيث يتم التعبير خارج الكائن الحي؛ وزراعة الخلية في الخاضع.
[15] طريقة ‎sab)‏ مستويات الهيموجلويين الجنيني الذي يتم التعبير ‎die‏ بواسطة خلية تتضمن التعبير عن ‎BCL1IMicroRNA‏ تخليقي واحد على الأقل وفقا لأي من فقرات 11-1 في خلية؛ حيث الخلية عبارة عن خلية ‎Leds‏ جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع ‎(phe‏ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم. ]16[ الطريقة ‎Wy‏ لأي من فقرات 15-12« ‎cus‏ اذ 8ل801111/100 التخليقي الواحد على الأقل مرتبط تشغيليا بمعزز ‎alg‏ تكوينه في ناقل للتعبير في خلية حقيقة النواة ‎eukaryotic‏ ‎.cell‏ ‏10 ]17[ الطريقة وفقا لأي من فقرات 16-12( حيث يتم التعبير عن اذ ‎BCL11MicroRNA‏ ‏التخليقي الواحد على الأقل من بوليمراز ‎RNA‏ ‏[18] الطريقة وفقا لأي من فقرات 17-12؛ حيث لا يتم التعبير عن ال ‎BCL11MicroRNA‏ ‏التخليقي الواحد على الأقل من بوليمراز ‎RNA‏ ‏[19] الطريقة فقرة 18؛ حيث يتم اختيار المعزز من مجموعة تتكون من معزز فيروسي مكون 5 تركيز على الطحال»؛ معزز قابل للحث بتترا سيكلين؛ أو منطقة التحكم في موقع ]-جلوبين و معزز (|-جلوبين.
[20] الطريقة وفقا لأي من فقرات 19-16( حيث الناقل ‎Ble‏ عن فيروس.
[21] الطريقة فقرة 20؛ حيث الفيروس عبارة عن فيروس بطيء.
[22] الطريقة فقرة 21( حيث تم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس 0 نقص المناعة البشري من النوع 1؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2؛ فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي؛ فيروس فقر الدم المعدي في الخيول؛ فيروس نقص المناعة في ‎caked‏ فيروس نقص المناعة في البقرء وفيروس نقص المناعة في القردة.
[23] جزيء حمض نووي معزول ‎isolated nucleic acid molecule‏ يتضمن متوالية النيكلوتيد المختارة من المجموعة المكونة من متواليات برقم هوية: 10-1 18-13 و44-25. 5 ]24[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 1.
]25[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 2.
[26] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 3. ]27[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 4. ]28[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 5. ]29[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 6. ]30[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 7.
[31] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 8. 5 [32] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 9. ]33[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 10.
[34] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 13.
[35] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 14. ]36[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 15. 5 [37] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 16.
]38[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا ‎Ball‏ 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 17. ]39[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 18.
[40] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 25.
[41] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 26. ]42[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 27.
[43] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 28. ]44[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 29. 5 [45] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Bal Wy‏ 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 30.
[46] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 31. ]47[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية: 33. ]48[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 34. ]49[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 35. ‎[SO] 5‏ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23 حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 36.
]51[ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 37.
[52] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( ‎Cus‏ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 38.
[53] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 39. ]54[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 40.
[55] جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( ‎Cus‏ يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد 0 لمتوالية برقم هوية:41. ]56[ جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 42. ‎[ST]‏ جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 43. 5 [58] جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23( حيث يتضمن الجزيء متوالية النيكلوتيد لمتوالية برقم هوية: 44.
[59] ناقل يتضمن جزيء الحمض النووي المعزول ‎Wy‏ للفقرة 23.
[60] الناقل وفقا ‎pall‏ 59 حيث يتضمن الناقل أيضا معزز فيروسي مكون تركيز على ‎Jindal‏ معزز قابل للحث بتترا سيكلين؛ أو منطقة التحكم في موقع ]-جلويين ومعزز ]-جلوبين. 0 [61] خلية عائلة يتضمن الناقل وفقا للفقرة 59 أو 60.
[62] الخلية ‎Wy‏ للفقرة 61؛ حيث الخلية عبارة عن خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم.
[63] الخلية وفقا ‎spill‏ 61( حيث الخلية عبارة عن كرية حمراء.
[64] بكتريا يتضمن جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23. 5 [65] فيروس يتضمن جزيء الحمض النووي المعزول وفقا للفقرة 23.
[66] الفيروس ‎Wy‏ للفقرة 65؛ ‎Cua‏ الفيروس عبارة عن فيروس بطيء.
]67[ الفيروس ‎Wy‏ للفقرة 66« حيث تم اختيار الفيروس البطيء من المجموعة المكونة من: فيروس نقص المناعة البشري من النوع 1؛ فيروس نقص المناعة البشري من النوع 2؛ فيروس التهاب الدماغ-التهاب المفاصل الماعزي؛ فيروس فقر الدم المعدي في الخيول؛ فيروس نقص المناعة في القطط» فيروس نقص المناعة في البقرء وفيروس نقص المناعة في القردة.
[68] تركيبة تتضمن جزيء حمض نووي معزول وفقا لأي من فقرات 58-1( ناقل وفقا للفقرات 59 أو 60 خلية عائلة وفقا لأي من فقرات 63-61؛ أو فيروس وفقا لأي من فقرات 67-65.
[69] تركيبة تتضمن ناقل وفقا للفقرات 59 أو 60 خلية عائلة وفقا لأي من فقرات 63-61؛ أو فيروس وفقا لأي من فقرات 67-65.
[70] التركيبة وفقا للفقرة 68 أو 69؛ يتضمن أيضا ‎dala‏ أو مخفف مقبول صيدلانيا. 0 [71] تركيبة ‎Wy‏ لأي من فقرات 70-68 للاستخدام في العلاج أو لتقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع.
[72] تركيبة وفقا لأي من فقرات 70-68 للاستخدام في تصنيع دواء في علاج أو لتقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلويين في خاضع.
[73] تركيبة وفقا لأي من فقرات 70-68 للاستخدام في زيادة مستويات الهيموجلويين الجنيني 5 الذي يتم التعبير ‎die‏ بواسطة خلية.
[74] التركيبة وفقا للفقرة 73 حيث الخلية عبارة عن خلية جذعية جنينية؛ خلية جذعية جسمانية؛ خلية أساسية؛ خلية نخاع عظم؛ خلية جذعية مكونة للدم؛ أو خلية أساسية مكونة للدم.
[75] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبيين في خاضع؛ تتضمن الطريقة: إعطاء الخاضع كمية فعالة ‎Ladle‏ من جزيء حمض نووي معزول ‎Why‏ لأي من فقرات 58-1؛ 0 تقل وفقا للفقرات 59 أو 60؛ خلية عائلة وفقا لأي من فقرات 63-61؛ أو فيروس ‎Wy‏ لأي من فقرات 67-65 إلى الخاضع؛ وبالتالي علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض الهيموجلوبين في الخاضع. ]76[ طريقة ‎de‏ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبيين في خاضع؛ تتضمن الطريقة: إعطاء الخاضع كمية فعالة علاجيا لتركيبة وفقا لأي من فقرات 74-68 في الخاضع؛ وبالتالي 5 علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض الهيموجلويين في الخاضع.
[77] طريقة علاج؛ أو تقليل خطر الإصابة بمرض هيموجلوبين في خاضع؛ تتضمن الطريقة زيادة مستويات الهيموجلوبين الجنيني الذي يتم التعبير ‎die‏ بواسطة خلية في الخاضع.
[78] الطريقة ‎Wy‏ لأي من فقرات 77-75 تتضمن الطريقة أيضا اختيار خاضع ‎Glas‏ ‏بمرض هيموجلوبين أو معرض لخطر الإصابة بمرض هيموجلوبين.
[79] الطريقة وفقا لعنصر الحماية 78 حيث مرض الهيموجلويين ‎Ble‏ عن مرض الخلية المنجلية أو ثلاسيميا.
[80] الطريقة وفقا لأي من فقرات 80-75؛ تتضمن الطريقة ‎Lad‏ إعطاء الخاضع ‎le‏ ‏يتضمن أوكسيجين ‎OXYgen‏ هيدروكسي يوريا ‎chydroxyurea‏ حمض فوليك؛ أو نقل دم. يتم أيضا توضيح الاختراع في الأمثلة ‎Cus (All‏ لا تقيد منظور الاختراع الموضح في 0 عناصر الحماية. الأمثلة المواد والطرق سوف تكون ظروف تفاعل ‎PCR‏ المثالية كما يلي: 1* محلول منظم تفاعل (يتكون من ‎MgCl,‏ عند 1.5 مل مولار؛ 3.0 مل مولار؛ 4.5 مل مولار (تركيز نهائي))؛ 0.2 مل مولار 5 من كل من ‎Su 25 «dTTP 3 dGTP «dCTP (dATP‏ مول من كل ‎sale‏ بادئة ‎¢primer‏ 50 نانوجم من قالب ‎DNA template‏ 710-3 (حجم/حجم) ‎DMSO‏ لصهر البنية (وهذا اختياريا) بحجم كلي 100 ميكرولتر. ما يلي هي الظروف المثالية للتفاعل أو الضبط على الدورة الحرارية لتفاعل ‎PCR‏ 2°94 ل 5-3 دقيقة؛ أثناء هذا الوقت تمت إضافة 1وحدة من بوليمراز ‎DNA‏ أو تم ضبط التفاعل على 0 ثج بعد ذلك تم وضع أنابيب في ماكينة ‎PCR‏ عندما تصل إلى 094م؛ المتبوعة بواسطة 25 دورة من ‎L294‏ لمدة 1 دقيقة؛ 260م لمدة دقيقة؛ و70”م لمدة دقيقة؛ وانتهاء مع 04 لحين استخدام عينات ‎PCR‏ ‏مثال 1 تصنيع ‎MIRS‏ تخليقية
تم تكوين ثلاثة 00145 تخليقية مختلفة؛ اثنين منها تستهدف 801117 عند مواقع مختلفة والثالثة غير مستهدفة لتعمل كعينة ضابطة. تم إدخال كل من هذه ال 70145 في تعبير متتالي عن ناقل» ناقل تترا سيكلين قابل للحث؛ وناقل انتقائي للسلالة الحمراء ‎-erythroid specific vector‏ تم صنع ‎MIRS‏ بواسطة تصلب أوليجونيكلوتيدات مكملة؛ والتي تتضمن 4 زوج قاعدة 5" تتداخل بشكل مناظر للطرف المتلصق الأيسر بواسطة تقييد الهضم مع ا855. أوليجو 00141 ‎:BCL11A‏ ‏حي ‎ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT TctecatgtggtagagAATCCATGAGTG‏ ‎TTCTGTGCGAG 0‏ (متوالية برقم هوية:1) مضادة للحس ‎CGCACTCGCACAGAACACTCATGGATTctctaccacatggagAATCCATGAGT‏ ‎GTTCTGTGCGA‏ (متوالية برقم هوية:2) أوليجوهات 00142 ‎:BCL11A‏ ‏= ‎ACGCTCCAGAGGATGACGATTGTTTActccatgtggtagagTAAACAATCGTC‏ ‎ATCCTCTGGag‏ (متوالية برقم هوية:3) مضادة للحس ‎CGCACctCCAGAGGATGACGATTGTTTActctaccacatggagTAAACAATCGTC‏ ‎ATCCTCTGGa‏ (متوالية برقم هوية:4) أوليجوهات غير مستهدفة: حسمي
‎ACGCTCAACAAGATGAAGAGCACCAActccatgtggtagagTTGGTGCTCTTC‏ ‎ATCTTGTTGAG‏ (متوالية برقم هوية:11) مضادة للحس ‎CGCACTCAACAAGATGAAGAGCACCAActctaccacatggagTTGGTGCTCTT‏ ‎CATCTTGTTGA 5‏ (متوالية برقم هوية:12) تم تمسيخ أزواج أوليجونيكلوتيد وبعد ذلك تمت ‎sale)‏ التصليب (بالنسبة لقالب جيني أوليجو ‎Oligo cassette‏ في بروتوكول ال ام - بي سي ار ‎(LM-PCR‏ ويعد ذلك تمت تنقية قالب جيني باستخدام ‎Heal‏ تركيز الطرد المركزي الدقيق. في الوقت المتوسطء تم بلغ بلازميد ‎(MiR223)0.6.pBKS‏ مع 8051 وتمت التنقية بواسطة التشغيل على جل جل أجاروز (بدون 0 علاج بفوسفاتاز قلوي ‎(alkaline phosphatase‏ بعد ذلك تم ارتباط كل قالب جيني أوليجو في بنيات 0.6.0845 المبلوعة وتم التحويل في بكتيريا منافسة (51013). تم التقاط مستنسخات البكتريا ‎Bacterial clones‏ وتم تحضيرها بشكل مصغر لتحضير معزولة نواقل. بعد ذلك تم تتابع ‎miRs‏ التخليقية باستخدام مواد بادئة ‎primers‏ متوالية 0014223 ‎FOR‏ ومتوالية 0014223 ‎REV‏ باستخدام ‎DMSO‏ لصهر البنية. متوالية 0014223 ‎TAAGCTTGATATCGAATTCCFOR‏ (متوالية برقم هوية:19) متوالية ‎GCTCTAGAACTAGTGGATCCREY miR223‏ (متوالية برقم هوية:20) مثال 2 تصنيع نواقل ‎MIR‏ متتالية تم استنساخ كل 0016 في أساس 660-17/2ا فيروسي بطيء بحيث يتم تحريك التعبير 0 عن ‎Venus—miR‏ بواسطة معزز فيروس تكوين تركيز طحالي التالي. تعديل ‎Venus cDNA‏ سوف يتم تكبير ‎Venus cDNA‏ عبر ‎PCR‏ لإضافة موقع قيد ‎Nael‏ إلى الطرف 5" (بالإضافة إلى الحفاظ على متوالية ‎Kozak‏ جيدة متتالية) وموقع ‎Notl‏ إلى الطرف 3" . ‎TTgeeggcATGGTGAGCAAGGGCGAGG FOR Nael Venus‏ (متوالية برقم 21:98(
— 8 9 — ‎TAgeggecgc TTACTTGTACAGCTCGTCC REV Notl Venus‏ (متوالية برقم هوية:22) تم انتهاء منتجات ‎PCR‏ على جل أجاروز ‎aay‏ ذلك تمت التنقية. كان منتج ‎PCR‏ ‏المنقى عبارة عن مستنسخ تي ايه ‎TA‏ في ناقل ‎(INVITROGEN™) TOPO 2.1 PCR‏ باستخدام طقم استنساخ ‎TA‏ تم التقاط مستنسخات بكتيرية ‎DNA‏ محضر. باستخدام تحليل هضم القيد؛ تم اختيار المستنسخات التي أ) تحتوي على منتج ‎Venus PCR‏ (هضم ‎(ECORI‏ ‏وب) تحتوي على المستنسخ في توجيه ‎Cus‏ لم تتم إضافة ‎Notl‏ بعد ذلك إلى موقع ‎Notl‏ في رابط متعدد (أي؛ بحيث لا يقوم ابتلاع ‎Notl‏ بتخطي شظية ‎(PCR‏ ولكن بدلا من ذلك فقط يتم توليد سلالات الناقل). بعد ذلك تم تتابع هذه المستنسخات باستخدام مواد بادئة 13/اأمامي وعكسي.
إدخال متواليات 0014 في بلازميد ‎Venus-PCR 2.1 TOPO‏ تم هضم بلازميد ‎Venus-PCR 2.1 TOPO‏ مع ‎(Notl‏ تمت المعالجة بفوسفاتاز قلوي من أمعاء بقرية؛ ‎aay‏ ‏ذلك تم التشغيل على جل أجاروز وتمت التنقية. تم استتصال بنيات ‎MIR‏ التخليقية من بلازميد ‎O.6.pBKS‏ بواسطة هضم مزدوج مع ‎Notl‏ و0500)/1؛ بعد التنقية بواسطة استخلاص جل أجاروز. تم ربط ولائج ‎MIR‏ المهتضمة في بلازميد ‎Venus-PCR 2.1 TOPO‏ وتم استخدام
5 منتج الريط لتحويل بكتريا منافسة (51013). تم التقاط المستنسخات البكتيرية الفردية وتم التحضير. يتم اختيار البلازميدات التي تحتوي على وليجة ‎MIR‏ تدخل في التوجيه الصحيح (أي؛ تؤدي إلى الشظية الكاملة عند الهضم مع ‎.(Nael y Notl‏
إدخال قالب جيني ‎Venus-miR‏ في ‎LeGO-V2‏ تم ‎Ql Jian‏ الجيني ‎Venus-miR‏ من ‎PCR 2.1 TOPO‏ بواسطة هضم مزدوج مع ‎Notl‏ و ا86ل8؛ متبوعة بواسطة
0 علاج مع شظية ‎Klenow‏ كبيرة بالجزء المعلق إلى 14011 مسنن. تمت تنقية هذا القالب الجيني بواسطة استخلاص جل أجاروز. تم هضم ‎LeGO-V2‏ أو ‎LeGO G2‏ مع ‎«EcoRI y BamHI‏ ‎all‏ أطلقت ‎cDNA‏ 0 +605/66/. تمت ‎dallas‏ سلالة هذا بشظية ‎Klenow‏ كبيرة لقطع الأجزاء المعلقة ‎BamHI, ECORI‏ متبوعا بواسطة تنقية الناقل بواسطة الرحلان الكهربي لجل أجاروز ‎.agarose gel‏ تم ربط قالب جيني ‎Venus-miR‏ المنقى وناقل 16860 معاء وتم
5 استخدام المنتج لتحويل البكتيريا المحولة. تم التقاط المستنسخات البكتيرية الفردية وتم تحضير
‎DNA‏ تم اختيار المستنسخات التي تحتوي على الوليجة في الإتجاه الصحيح وتم نموها واستخدامها في مستحضرات قوية لتصنيع مواد طافية فيروسية ‎viral supernatant‏ مثال 3 تصنيع نواقل ‎MIR‏ انتقائية للسلالة الحمراء تم إلحاق إشارة معالجة ببولي أدينيل ‎polyadenylation signal‏ بالقوالب الجينية ‎Venus-miR‏ المصنع الموضح أعلاه. تم إدخال القوالب الجينية 1/90115-0014-بولي ‎A‏ الناتجة في التوجيه المضاد للحس في ناقل فيروسي بطيء014/41-1153-1152-8 -جلوبين ‎SEY)‏ ‏للسلالة الحمراء المقدم بواسطة ‎.Guilianna Ferrari‏ تعديل إشارة معالجة ‎BGH‏ ببولي أدنيل. تم ‎juss‏ إشارة ‎BGH‏ بولي ‎A‏ عبر ‎PCR‏ ‏0 للحفاظ على تقييد ‎PSpOMI‏ موقع عند الطرف 5” وتتم إضافة المواقع ‎Notl s Nael‏ إلى الطرف 3 ‎ CGCTCGAGCATGCATCTAGAGG FOR PspOMI BGHpA‏ (متوالية برقم هوية:23) ‎:REV Notl/Nael BGHpA‏ ‎TTgcggeegecggcCGCGCTTAATGCGCCGCTACAG 15‏ (متوالية برقم هوية:24) تم استتفاد منتجات ‎PCR‏ على جل أجاروز ويعد ذلك تمت التنقية. تم استنساخ منتج ‎PCR‏ المنقى ‎TA‏ في ناقل ‎(INVITROGEN™) PCR 2.1 TOPO‏ باستخدام طقم استنساخ 18 . تم التقاط مستنسخات بكتيرية وتم تحضير ‎DNA‏ باستخدام تحليل هضم ‎cal)‏ تم اختيار 0 المستنسخات تحتوي على منتج ‎BGHPA PCR‏ (هضم ‎ECORI‏ و/أو ‎PspOMI/Notl‏ هضم مزدوج). تم ‎Jie‏ هذه المستنسخات باستخدام مواد بادئة 13/اأمامي وعكسي. قامت عملية إدخال متوالية 86108 في بلازميدات 2.1 ‎Venus-miR-PCR‏ ‎TOPO‏ المحضرة الموضحة أعلاه. تم استئصال قالب جيني 8610/8 من ‎PCR 2.1 TOPO‏ بواسطة هضم مع ‎PSPOMI‏ وا08ل! بعد ذلك تمت تنثقية الوليجة بواسطة استخلاص جل أجاروز. 5 تم هضم بنيات ‎Venus-miR-PCR 2.1 TOPO‏ المصنعة في الخطوة ب2 أعلاه مع ‎Notl‏ ‏وبالتالي تمت المعالجة بفوسفاتاز قلوي من أمعاء بقرية. تمت تنقية ناقل ‎Venus-miR-PCR‏
Venus— ‏في ناقل‎ BGHPA ‏بواسطة الاستنفاد على جل أجاروز. تم ربط وليجة‎ 2.1 TOPO competent ‏_وتم استخدام المنتج لتحويل البكتيريا المكافئة‎ MIR-PCR 2.1 TOPO
8 (3ا0ا5). سوف يتم التقاط وتحضير المستنسخات البكتيرية الفردية. تم اختيار
البلازميدات التي تحتوي على متوالية وليجة 86110860 في التوجيه الصحيح (تؤدي إلى وليجة
كلية عند الهضم مع ا8186). تم استتصال إدخال قالب جيني ‎Venus-miR-BGHpA‏ في ‎pRRL-HS3- su‏
152-8)-جلوبين. تم استئصال القالب الجيني ‎Venus-miR-BGHpAs‏ من 2.1 ‎PCR‏
‎TOPO‏ بواسطة هضم مع ‎.2186١‏ تمت تنقية هذه الولائج بواسطة الرحلان الكهربي لجل أجاروز.
‏تم هضم ناقل ‎(uglapRRL-HS3-HS2-B‏ مع ‎ECORV‏ ومعالجة بفوسفاتاز قلوي من أمعاء 0 بقرية. تمت تنقية الناقل بواسطة الرحلان الكهربي لجل أجاروز ‎agarose gel‏
‎pRRL-HS3- ‏في‎ Venus-miR-BGHpAs ‏تم ريط القالب الجيني‎ electrophoresis
‏152-8)-جلويين ومنتج الربط المستخدم لتحويل البكتريا المنافسة. تم التقاط المستنسخات
‏البكتيرية الفردية وتم تحضيرها. تم نمو بلازميدات تحتوي على قالب جيني ‎Venus-miR-‏
‏5م861 في التوجيه الصحيح في ناقل 0|4/41-1153-1152-8-جلوبين ‎globin‏ وصولا إلى 5 أقصى تحضير بحيث يمكن نموها لتحضير أقصى ليتم استخدامها لتوليد المادة الطافية الفيروسية
‏البطيئة.
‏مثال 4
‏تم تنفيذ تجارب خلية تداخل ‎RNA‏ في المعمل كما يلي.
‏تم تحويل خلايا لوكيميا حمراء فأرية تم الإبقاء عليها في مزرعة في اى ام دي ام ‎IMDM‏
‏0 مع اف سي اس ‎FCS‏ على فيبرونيكتين ‎fibronectin‏ مع ‎shRNA = NT) SFFV-LVs‏
‏مخلوط ‎ShRNA=MIR-2‏ مستهدف) عند تعدد الإصابة-2 ومصنفة لتألق ‎Venus‏ كانت
‏النقطة الزمنية للتحليل بعد التحويل هي اليوم 7. كانت الخلايا >795 ‎Venus‏ إيجابي و106 تم
‏جمع الخلايا وتم استخلاص ‎(RNA‏ تم الحصول على ‎CDNA‏ بواسطة انتساخ عكسي وتم تنفيذ
‎qPCR‏ في الوقت الفعلي ل 801117 وأ5م©-جاما جلوبين ‎MRNAs‏ مع ‎Gapdh‏ كمسخة 5 عينة ضابطة داخلية (الشكل 3). تم استخدام منحنى معياري لقياس التعبير.
‏تداخل ‎RNA‏ تجارب في الكائن الحي في ‎LO‏
تمت زراعة ‎mile Boj‏ مشتق ‎HSCs LSK‏ المزروعة في فثران ‎CST [BLO‏ بعد تحويل تشتيت عائلة على تجرية السابقة على فيبرونيكتين مع ‎NT=shRNA) SFFV-LVs‏ مخلوط ‎MIR-I=shRNA‏ مستهدف) عند تعدد الإصابةج2. كانت جرعة ‎WAL‏ غير المحقونة 0 خلايا لكل فأر. تم نقع إيجابي ‎WBC‏ عند 4 شهور (220) وتم صنع نخاع العظم المصنف لتألق ‎Venus‏ بعد بقعة حيوية (220-7) (الشكل 3). تم تنفيذ استخلاص ‎RNA‏ ‏و0004 كما هو موضح أعلاه. مثال 5 ‎LCR-LV‏ ‏تم تحويل خلايا لوكيميا حمراء فأرية محفوظة في مزرعة ‎IMDM‏ مع ‎FCS‏ على 0 فيبرونيكتين مع ‎NT=shRNA) LCR-LVs‏ مخلوط 2ل4ا50-ا-0014_مستهدف)_عند تعدد الإصابة-2 وتعدد الإصابة<100 وتم التصنيف من حيث تألق ‎Venus‏ كانت النقطة الزمنية للتحليل بعد التحويل هي اليوم 7. كانت الخلايا >795 ‎Venus‏ إيجابي و106 تم جمع الخلايا وتم استخلاص ‎(RNA‏ تم الحصول على ‎CDNA‏ بواسطة انتساخ عكسي وتم تنفيذ ‎GPCR‏ في الوقت الفعلي ل 801117 وأ5م8-جاما جلوبين ‎MRNAS‏ مع 68000 كمسخة عينة ضابطة 5 داخلية (الشكل 4). تم استخدام طريقة منحني معياري لقياس تعبير. ‎TET-LV‏ ‏تم تحويل خلايا لوكيميا حمراء فأرية محفوظة في مزرعة في ‎FCS‏ على فيبرونيكتين مع ‎NT=shRNA) TET-LVs‏ مخلوط ‎(Caius MIR-I=shRNA‏ عند تعدد الإصابة-2 ومصنفة من حيث تألق ‎Venus‏ بعد التعرض ل دوكسي سيكلين عند تركيزات متمايزة. كانت 0 النقطة الزمنية للتحليل بعد التحويل هي اليوم 7. كانت ‎Venus 795> WAN‏ إيجابي و106 تم جمع الخلايا وتم استخلاص ‎(RNA‏ تم الحصول على ‎CDNA‏ بواسطة انتساخ عكسي وتم تنفيذ ‎gPCR‏ في الوقت الفعلي ل ا05م©-جاما جلوبين ‎MRNA‏ مع 68000 كمسخة عينة ضابطة داخلية (الشكل 4). تم استخدام طريقة منحني معياري لقياس تعبير. مثال 6 تم تجزيء الدم المحيط ‎Peripheral blood‏ المشتق من مريض ‎HSC CD34+ SOD‏ يدور من مادة فصادة تم التخلص منها (تقريبا 200 ‎cde‏ 106 من ‎Wa‏ +00034). تم تحويل
الخلايا ب ‎NT=shRNA) SFFV-LVs‏ مخلوط ‎ShRNA=mMiR-1‏ _مستهدف) ‎de‏ تعدد
الإصابة-2 على فيبرونيكتين ومتمايزة كما هو معدل من ‎Nat Biotech ( .Giarratana et al‏
5. تم تحليل الخلايا من حيث حيازة المرقمات السطحية الحمراء النضجية ‎erythroid‏
‎«GPA) surface markers‏ 0071) بواسطة التدفق الخلوي. تقوم ‎LIAN‏ الحمراء بالتتابع بالحصول على خلية أرومية ‎shes‏ ومورفولوجيا خلية ‎shes‏ وتعبر عنن ‎Venus Gl‏ تم جمع
‏الخلايا عند مرحلة التمايز الطرفي وتم استخلاص ‎RNA‏ وتم تنفيذ تحليل ‎PCR‏ لتقييم حث
‏جاما-جلويين ‎MRNA‏ بواسطة ‎SFFV-IV‏ 04-1 مقارنة بعينة ضابطة (غير مستهدفة)
‏مخلوطة (الشكل 5).
‏مثال 7
‏10 تم تجزيء الدم المحيط لمربيض مرض الخلية المنجلية مشتق من خلايا +0034 تدور في خلية جذعية مكونة للدم من ‎sale‏ فصادة متخلص ‎Lie‏ (تقريبا 200 ‎«Je‏ 106 خلايا +0034). تم تحويل الخلايا ب ‎NT=shRNA) LCR-LVs‏ مخلوط ‎ShRNA=mMIR-1‏ مستهدف) عند تعدد الإصابة-2 على فيبرونيكتين وتم الحقن عند 30000 خلايا/حيوان في ‎Laps NSG gh‏ للإشعاع دون مستوى القتل بدون تصنيف سابق. وتم نزيف الحيوانات عند الأسبوع الرابع من
‏5 الحقن وتم تثبيت خلايا الدم الحمراء وتم الثقب. تم تنفيذ بقعة ‎HOF‏ وتم تحديد ‎LCR-LV-mMIiR—‏ ‏1 حيوان مع إنسان مستويات ‎HBF‏ عند 710 (الشكل 6). مثال 8
‏تم تحويل دم الحبل السري المشتق +6034 إنسان خلايا جذعية مكونة للدم محولة على فيبرونيكتين مع ‎NT=shRNA) SFFV-LVs‏ مخلوط ‎MIR-I=ShRNA‏ مستهدف) عند تعدد
‏0 الإصابة-2 ومصنفة من حيث تألق ‎Venus‏ تم أيضا تصور الخلايا أيضا بواسطة ميكروسكوب تألق ‎fluorescent microscopy‏ على لحمة ‎.MS-5‏ تم تمايز الخلايا على طول المسار 8 الليمفاوي الخلوي بواسطة طرق معدلة من ‎et al‏ 00ا. ‎all)‏ 2009). تم تحليل الخلايا أسبوعايا من لأأجل الحصول على مرقمات السطح الليمفاوية الخلوية الناضجة 8 وفقد مرقمات خلية سلف مناعية لتحديد كتلة في التمايز الناتج بواسطة استبعاد 861117 عبر ‎SSFFV-L‏ مقابل تم
‏5 جمع الخلايا عند نقاط ‎che soul‏ وتم استخلاص ‎RNA‏ لتحقق من استبعاد ‎BCL11A MRNA‏ بواسطة استهداف ‎shRNA‏ عبر ‎SFFV-LV-mIiR-1‏ (الشكل 7).
مثال 9
تحسين ناقل بوليمراز ‎RNA ١|‏ فيروسي بطيء يقوم بتشغيل ‎MicroRNA‏ مدمج ل ‎ShRNAs‏
بمعالجة محسنة واستبعاد 801117 فعال لحث هيموجلويين جنيني في ‎WA‏ حمراء . تم استخدام تقنية تداخل ‎(RNAI) RNA‏ باستخدام ‎RNAS‏ دبوسية قصيرة ‎(ShRNAS)‏ ‏5 الذي يتم التعبير ‎die‏ عبر معززات ‎pol HIE‏ بشكل واسع لتضمين التعبير الجيني في تشكيلة من أنواع الخلايا الثديية. لتحقيق الاستهداف الانتقائي للسلالة ‎(MRNAS‏ سوف تكون هناك حاجة للتعبير عن 50485 عبر معززات ‎pol ١١‏ بما يتطلب دمج ‎ShRNA‏ في متواليات ‎uasll (ShRNAMIR) dual microRNA‏ والمعالجة. ‎cba‏ لتحقيق استبعاد ‏ نسخة 8010 من عامل في خلايا مكونة ‎call‏ والتي لها تطبيق تحويلي مباشر في أمراض 0 الهيموجلوبين» قمنا بمقارنة فعالية تضمين ‎MRNA‏ عبر ‎pol Il‏ في مقابل نواقل فيروسية بطيئة قائمة على أساس !ا ‎pol‏ يمكن أن تمثل إبادة البروتين 861-117 هدف ‎ade‏ لمرض الخلية المنجلية وأمراض م-ثلاسيميا؛ كما تبين أن الاستبعاد يحث التعبير عن جين اتش بي جي ‎HBG‏ ‏الجنيني ((-جلوبين) بشكل مطلق ‎Le‏ يؤدي إلى تحسين مستويات التترامر الهيموجلوبين الجنيني ‎HDF)‏ 0272). في ‎«jl‏ 801117 عبارة عن قامع أساسي ل جين ‎Hbb-y‏ فأري يمثل نظير ‎HBG 5‏ فأري. يبين المخترعون ما يصل ! لى 1000-100 طية ‎Jil‏ في حث ‎Hbb-y‏ بسبب الفعالية المخفضة لاستبعاد 801117 باستخدام ‎ShRNAMIR‏ في مقابل أساسات ناقل ‎shRNA‏ ‏التي تتوسط فيها !اا ‎pol‏ لفهم الأساس الجزيئي لهذه الفروق؛ قام المخترعون بتنفيذ تحليل متوالية ‎RNA‏ صغيرة لخلايا محولة بواسطة العديد من أزواج ‎.ShRNA-ShRNAMIR‏ وقد بين المخترعون أن ‎SARNAS‏ الذي يتم التعبير ‎die‏ عبر 6لا معزز ‎PO! I‏ يؤدي إلى متواليات جديلة 0 موجهة تختلف بمقدار إزاحة 4 زوج قاعدة مقارنة بمتوالية حديلة موجهة ناضجة تعمل بواسطة ‎pol‏ ‎.(ShRNAMIR) ١‏ وقد أبدى تتابع ‎RNA‏ أن تمدد مركبات يوريدين التي تعوض الجزءٍ من إشارة إنهاء ااا ‎pol‏ محول ومتضمن عند الطرف 3 من ‎ShRNA‏ الناضج في أساس ناقل ‎pol ١١١‏ يرتبط غياب هذه المتواليات الإضافية بإزاحة مناظرظة في شق موقع ‎dicer‏ وبالتالي تولد ‎ShRNA‏ ناضج مختلف مع متوالية بذرية بديلة تؤثر على فعالية جين مستهدف على استبعاد في نواقل قائمة على أساس ‎١١‏ ا00. علاوة على ذلك؛ كل من الوفرة المطلقة ونسبة التوجيه إلى الجديلة المنتقلة مختلفة بشكل مميز في خلايا محولة مع أي من نواقل قائمة على أساس ‎pol ١١‏ أو ‎pol‏
‎lI‏ يقوم دمج إزاحة بمقدار 4 زوج قاعدة في الجديلة الموجهة ل ‎ShRNAMIR‏ بمعالجة متوالية جديلة موجهة ناضجة مطابقة لمتوالية ‎SARNA‏ تعمل بواسطة 6لا ‎(Sh—RNAs‏ وفعالية استبعاد محسنة ل 801117 بواسطة 170-50 عند مستوى بروتين وتم الارتباط ب 300-100-طية من حث ‎Hbboy‏ في خلايا لوكيميا حمراء فأرية. وقد اكتشف المخترعون وجود استراتيجية معدلة من أجل التثميم المنظوري لأساسات ناقل ‎ShRNAMIR‏ لتحقيق التنظيم الانتقائية للسلالة للجينات المستهدفة. مثال 10 تحسين ‎ShRNAS‏ مدمج ب ‎MIRNA‏ لاستبعاد 801117 انتقائي للسلالة وحث هيموجلويين ‎.٠‏ ‏المواد وطرق 0 تصميم ومراقبة ‎ShRNAS‏ ‏تم الحصول على نواقل فيروسية بطيئة تعمل بمعزز ‎UG‏ (080م-!!! ‎(POI‏ يعبر عن 80111 مختلف تستهدف ‎mRNA/shRNAs‏ 5801112 من ‎the Broad Institute‏ ‎(MA (Cambridge)‏ يتضمن ‎pol lll-puro‏ مرقم اختيار بيوروميسين | ‎puromycin‏ ‎selection marker‏ يعمل بواسطة معزز ‎.hPGK‏ أكثر من 100 ‎ShRNAs‏ تستهدف إما كل 5 من صور ‎SLXL‏ فقط صورة ‎XL‏ ومنطقة ‎UTR’3‏ في خلايا حمراء فأرية في صورة 96 عين باستخدام طبق ‎Qiagen Turbocapture‏ ومع تفاعل ‎Tagman qRT-PCR‏ مضاعف يقيس ‎.Hbb-y 3 Gapdh‏ بناء بنيات ‎shRNAmMIR‏ ‏تم تكوين نواقل ‎ShRNAMIR‏ بواسطة استنساخ متواليات /ل5040_مع_متواليات 0 014223 محيطة في ناقل ‎LeGO-V2‏ فيروسي بطيء يحتوي على مبلغ فيروس تكوين تركيز طحالي يعمل ب ‎Venus‏ (28). تم تخليق متواليات ‎ShRNAMIR‏ مع حلقة 1014223 بواسطة ‎(NJ) genscript USA Inc.‏ الولايات المتحدة) وتم استنساخ 5014/01/45 الناتج في الأساس ‎pol ١١‏ بعد أن تقوم ‎Venus‏ بترميز متوالية باستخدام المواقع ‎Xbal‏ و8800111. تم ذكر كل متواليات ‎ShRNAS‏ في الشكل 21ا. تم تصميم ‎die‏ ضابطة غير مستهدفة متوالية ‎ShRNA‏ ‏5 وتمت تسمتيها ‎SFFV-shRNAMIRNT‏ أو ‎NT‏ في صورة قصيرة. ناقل ‎SFFV-GFP‏ لا
يحتوي على أي قالب ‎ShRNA‏ وتم استخدام التعبير عن ‎GFP‏ عبر معزز ‎SFFV‏ كعينة ضابطة مزورة (33). إنتاج ومعايرة الفيروس تم توليد مواد طافية من ناقل فيروسي بطيء بواسطة النقل المشترك 10 ميكروجم من نواقل نقل فيروسية بطيئة؛ 10 ميكرو جم من ا989-00؛ 5 ميكرو جم من 167 و2 ميكرو جم من في اس في جي 751/6 بلازميدات تعبئة في خلايا ‎HEK293T‏ في طبق مزرعة بطول 10 سم باستخدام عامل كاشف فوسفات كالسيوم ‎calcium phosphate reagent‏ ‎(INVITROGEN™)‏ تم جمع المواد الطافية ‎Supernatants‏ عند 24 ساعة و48 ساعة بعد الإصابة؛ وتم الترشيح من خلال الطرد المركزي عند 23000 لفة/دقيقة لمدة ساعتين في جهاز 0 طرد مركزي90-ا270 ‎Beckmann‏ باستخدام عبوات هزازة 28-//51. لتحديد المعيار؛ تمت إصابة خلايا 101/1373 بالفيروس في وجود بولي برين (8 ميكروجم/مل) وتم التحليل لمدة 48 ساعة بعد التحويل بواسطة ‎FACS‏ للتعبير عن ‎Venus‏ (بعد بنيات ‎(pol II‏ أو بواسطة اختيار بيوروميسين (1 ملجم/مل؛ بنيات ‎(Pol ١١١‏ مزرعة خلية تم الحفاظ على خلايا 313 2931 وخلايا حمراء فأرية في وسط ‎Eagle's‏ معدل ب ‎DULBECCO’s‏ أو وسط ‎RPMI‏ مكمل ب 710 من مصل ‎dae‏ جنيني ‎fetal calf serum‏ 2 بينسيلين-ستريبتوميسين ‎Wee Je 25 penicillin—streptomycin‏ من جلوتامين ‎Je glutamine‏ التوالي. مزرعة التمايز الأحمر في المعمل تم الحصول على مخزونات مجمدة ‎Frozen stocks‏ من خلايا +0034 بشرية أساسية من الدم المحيط المثقول لمانحين أصحاء ) ‎Center of Excellence in Molecular‏ ‎Hematology at Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle or the‏ ‎(Flow Core at Boston Children’s Hospital‏ وفقا لبروتوكول معتمد بواسطة ‎BCH‏ ‎Institutional Review Board‏ بروتوكول التمايز الأحمر المستخدم قائم على أساس بروتوكول 5 ثلاثي الأطوار من (48). تمت ‎WAY del)‏ في وسط التمايز الأحمر | ‎erythroid‏ ‎(EDM) differentiation medium‏ بناء على ‎DULBECCO’s Lug) IMDM‏ معدل ب
‎(CELLGRO®) «(Iscove‏ مكمل بجلوتامين مستقرء 330 ميكرو جم/مل من هولو- إنسان ترانسفيرين ‎(SIGMA®)‏ 10 ميكرو جم/مل من إنسولين بشري ناتج ‎sage‏ الارتباط الجيني ‎((SIGMA®) recombinant human insulin‏ 2 وحدة مركزة/مل ‎Choay‏ هيبارين ‎heparin‏ ‎(SIGMA®)‏ و75 بلازما مذيب/ فيروس منظف معطل (0/5). أثناء الطور الأول من التمدد (الأيام 0 إلى 7( تمت زراعة خلايا 0034+ في وسط التمايز الأحمر في وجود 6-10 مولار من هيدروكورتيزون ‎(HC) hydrocortisone‏ (©/ا6ا100:)5 نانوجم/مل ‎R&D ( SCF‏ 57515) 5 نانوجم/مل ‎«(R&D SYSTEMS™) IL-3‏ ) و3 وحدة مركزة/مل ‎Epo‏ ‏(©81/6811). في اليوم 4؛ تمت إعادة تعليق الخلايا في وسط التمايز الأحمر يحتوي على ‎(SCF‏ 3حااء ‎Epo‏ و هيدروكورتيزون. في الطور الثاني (الأيام 7 إلى 11)؛ تمت ‎ale)‏ تعليق 0 الخلايا في وسط التمايز الأحمر مكمل ب اس سي اف ‎SCF‏ و اي بي او ‎EPO‏ الطور الثالث (اليوم 11 إلى اليوم 18)؛ تمت زراعة الخلايا في وسط التمايز الأحمر مكمل مع ‎EPO‏ فقط. تم
‏الحفاظ على المزارع عند 37"م في 75 002 في الهواء.
‏تحويل والتدفق الخلوي لمزرعة في المعمل تم تحويل خلايا ‎shes‏ فأرية و 0034+ مع نواقل فيروسية بطيئة التعبير عن -6لا ‎shRNA 5‏ أو ‎SFFV-shRNAmIR‏ في وجود بولي برين )8 ميكروجم/مل) ‎SIGMA-)‏ ‎dually (ALDRICH® Corp.
St.
Louis, MO, US‏ لخلايا حمراء فأرية و10 ميرومولار بروستاجلاندين ‎E2 prostaglandin‏ و2ميكروجم/مل بولي ‎dually polybrene (py‏ لخلايا ‎CD34+‏ تم طردها مركزيا قبل ساعتين عند )4283482000( عند درجة حرارة الغرفة. تم تصنيف الخلايا الحية إما للتعبير عن ‎Venus‏ (نواقل ‎(pol ١١‏ بعدد 48 ساعة من التحويل 0 باستخدام ‎(BD BIOSCIENCES®) BD FACS Aria Il‏ أو خلايا تم اختيارها في وجود بيوروميسين ‎puromycin‏ )1 ملجم/مل» بنيات ‎(pol ١١١‏ بالنسبة لتحليل ‎FACS TAAD‏ ‎(INVITROGEN™)‏ 23 تم تضمينه كمرقم خلية ميت. تم تعليم الخلايا +0034 مع ألوفيكوكيانين ‎(APC) Allophycocyanin‏ فيكويريثرين ‎(PE) phycoerythrin‏ وأجسام مضادة مترافقة مع ‎PE-Cyanine7‏ تم استخدام الأجسام المضادة ‎alias‏ 60235 (جليكوفورين ‎(APC-anti-CD71 (PE- (A 25‏ أى ‎DRAQ-5 anti-CD71- PE-Cyanine7‏ (كلها
‎(EBIOSCIENCE®‏ للتنميط الجيني. تم تنفيذ عمليات التحليل على مقياس تدفق خلوي ‎LSR-‏ ‎(BECTON DICKINSON®) II‏ باستخدام برامج ‎Diva‏ أو ‎FloJoX‏ (1 فاخا قاع ‎.)١١‏ ‏تجارب العزل» التحويل والتدفق الخلوي لفأر الزراعة الانتقالية تم ‎WDA Jie‏ نخاع عظم فأرية سالبة بواسطة كشف عظم الفخذ والورك والساق من ‎Pepcb/BoyJ) 0045.1 Boyd 5‏ 010168-ال86.5) وفثئران 86 0045.2 (ل6/ا0578) متبوعة بواسطة نضوب نسبي باستخدام طقم استنفاد خلية فأرية نسبي ‎«Miltenyi,Biotec Inc.)‏ سان دييجو» الولايات المتحدة). تمت زراعة الخلايا بكثافة 106*1-0.2 خلايا/مل في 100 نانوجم/مل 00560 20 ناتوجم/مل ‎«Hill Rocky (PEPROTECH® both ) mIL-3‏ الولايات المتحدة)» 100 نانوجم/مل ‎hFI3-L‏ 1005 نانوجم/مل ‎hTPO‏ (كل من ‎(Portsmouth «CELLGENIX® 0‏ _الولايات المتحدة) في وسط ‎STEMSPAN™ SFEM‏ ‎(CA Vancouver (STEMCELL © Technologies)‏ بعد 24 ساعة من الحث الأولي لخلايا تم التحويل بكثافة 106«*1 خلايا/مل عند تعدد الإصابة بمقدار 40 وتمت الزراعة في مستقبلات تم تشعيعها بشكل قاتل ‎(GYAHT)‏ جرعة منفصلة) بعد ثلاثة أيام من العزل. بالنسبة لتجارب إعادة التجميع التنافسية؛ تم خلط كميات متساوية من الخلايا من مجموعة تحويل مختلفة قبل الزراعة الانتقالية في 2 أو مستقبلات إيجابية مزدوجة 0045.1/0045.2 زيجوتية غير متجانسة )0.4 - 106*1 لكل حيوان). تم تحويل خلطات الخلية عبر التدفق الخلوي لتأكيد المساهمات الممكنة لكل من أجزاء الخلايا المنافسة؛ وتم التنظيم عند الحاجة. تم تنفيذ تحليل الدم المحيطء نخاع العظم والطحال عند العديد من النقاط الزمنية باستخدام الأجسام المضادة المتالية: ‎«CD71 «CD3 00118 8220 «CD45.2 «CD45.1‏ 162119 وصبغة حيوية يمكن حلها 4780ا1100]©. تم استبعاد التحليل من السلالة الحمراء. تم تنفيذ عمليات التحليل على مقياس تدفق خلوي ‎LSR-II‏ أو ‎(BECTON DICKINSON®) LSRFortessa‏ وبرنامج ‎.(Treestar™) FloJoX i Diva‏ تم تنفيذ عمليات تحليل البيانات والإحصاءات باستخدام ‎.PRISM® 5 GRAPHPAD , (MICROSOFT®) Excel‏ بالنسبة للزراعة الانتقالية لخلايا ‎hCD34‏ ~10 تم تشعيع فثران ‎NSG‏ إناث عمر أسبوع ‎(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) (-/-NOD/LtSz-scid lI2rg) 5‏ ب ‎2.7Gy‏
متوبعة بواسطة حقن -106 خلية لكل حيوان ثلاثة أيام بعد العزل. تمت تغذية فتران التي تم تعريضها 4233 مكمل ‎BAYTRIL®‏ بماء لمدة 14 يوم. استخلاص ‎qRT-PCR § RNA‏ تم استخلاص ‎AS RNA‏ من خلايا حمراء فأرية ف اليوم ال 7 بعد تصنيف/ بعد اختيار مع بيوروميسين ‎puromycin‏ أو بشكل حديث ‎DIA‏ مصنفة في اليوم 18 من التمايز الأحمر من خلايا ‎+CD34‏ باستخدام طقم ‎QIAGEN® RNA Plus‏ دقيق ‎(CA Valencia)‏ تم توليد ‎CDNA‏ باستخدام مواد بادئة هكسامر عشوائية ‎random hexamer primers‏ ومستنسخ فائق ‎(CA (Carlsbad (INVITROGEN ™)superscript Ill II‏ تم تنفيذ ‎PCR‏ كمي باستخدام خليط ‎SYBR® Green PCR‏ رئيسي ‎«®APPLIED BIOSYSTEMS)‏ ‎(UK Warrington 0‏ مع فأر ‎Hbb-y‏ ذو إنترون ممتد ومواد بادئة ‎Hbb-y) Gapdh‏ أمامي نحطم 1 وذ 6661 0600161 ‎-١‏ :3ن عكسي 5= ‎3-GAAGCAGAGGACAAGTTCCCA‏ (متوالية بهوية رقم:69)) ‎Gapdh)‏ أمامي 5= 0 0800008 |-3' (تولية بهوية رقم:70)») عكسي 5- ‎"3-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA‏ (متوالية بهوية رقم:71)) وإنسان ‎HBB (HBG‏ ‎GAPDH 5‏ مواد بادئة ‎HBG)‏ أمامي 088666005 68101 6/1 3-7-1 (متوالية ‎digg‏ )72:08( عكسي 5'— ‎"3-TCAGTGGTATCTGGAGGACA‏ (متوالية بهوية رقم:73)) ‎HBB)‏ أمامي ‎"3-"-CTGAGGAGAAGTCTGCCGTTAS‏ (متوالية بهوية ,74:4( عكسي ‎"3-"-AGCATCAGGAGTGGACAGATS‏ (متوالية بهوية رقم:75)) ‎GAPDH‏ أمامي 5’- 6638166 32-20000600161 (متوالية بهوية رقم:76)؛ عكسي 5’— ‎“3-TTCAGCTCAGGGATGACCTT‏ (متوالية بهوية رقم:77)). كانت ظروف التكبير ‎:PCR‏ 2°95 لمدة 10 دقائق؛ متبوعا بواسطة 40 دورة من 15 ثانية عند 95"م و1 دقيقة عند 60تم. تم تنفيذ ‎qPCRs‏ على آلة 7500 ‎«®APPLIED BIOSYSTEMS) ABI®‏ ‎(CA (City Foster‏ تم استخدام منحنى معياري باستخدام مخففات مسلسلة ل ‎CDNAS‏ لتحديد فعالية التكبير لكل تفاعل. تمت معايرة التعبير عن ‎Hbb-y‏ و/-جلويين ب ‎GAPDH‏ كعينة 5 ضابطة داخلية؛ والتعبير الجيني النسبي (طريقة ‎(AACE‏ لتحليل بيانات ‎(PCR‏ شاملة تصحيح فعاليات التكبير المتمايزة.
تحليل ‎da‏ نورثرن ‎Northern blot analysis‏ تم تصنيف ‎WIA‏ حمراء فأرية محولة مع ‎SFFV-shRNAmIRs y U6-shRNAs‏ وتم تجميعها بعد اختيار مزرعة بيوروميسين لليوم 7. تم ‎JSRNA Jie‏ باستخدام 1 مل من عامل ‎TRIZOL®‏ كاشف ‎((AMBION®)‏ وتمت إذابة 15 ميكروجم على 715 جل أكربلاميد ‎gel 5‏ 80/1800106. تم تحديد الأحجام المستنسخة الصغيرة باستخدام ‎Decade Ladder‏ (©ل80اراط ‎(TX Austin‏ تم تقل ‎RNA‏ إلى ‎HYBOND™-XL le‏ (" الاللاك+ ا عارالط ‎(NJ «Piscataway‏ و01055/10660-/الا. .تم التهيجين الأولي للمخططات باستخدام أوليجو ‎(Tx (Austin AAMBION®) UltraHyb‏ عند 35 “م والتي يتم ‎baja‏ مع أوليجونيكلوتيدات ‎oligonucleotides‏ معلمة ب ‎P-32-y‏ )4 بولي نيكلوتيد كيناز ‎(NJ (Piscataway (AMERSHAM™ ¢polynucleotide kinase 0‏ عند 37 "م لمدة ساعة؛ وتم الغسل في 2* سيترات صوديوم؛ 70.1 سلفات دوديسيل صوديوم ‎sodium citrate‏ عند 35-0 ”0 وتم التعرض للغشاء. كانت متواليات مسبار للكشف عن ‎MIRNA‏ كما يلي: ‎CGGAGACTCCAGACAATCGC 5 shRNAI‏ .3" (توالية بهوية رقم:78)؛ ‎CTCCAGGCAGCTCAAAGATC °5 shRNA2‏ 3' (توالية بهوية رقم:79)؛ ‎TCTCTTGCAACACGCACAGA °5 shRNA3 5‏ 3 (متوالية بهوية رقم:60)؛ ‎CAGGACTAGGTGCAGAATGT 5 shRNA4‏ 3 (متوالية بهوية رقم:61)؛ ‎ATCGAGTGTTGAATAATGAT 5 «shRNAS‏ 3" (متوالية بهرية رقم:62)؛ خلا 65 ‎GTACCCTGGAGAAACACAT 5‏ 3 (متوالية ‎dis‏ رقم:63)؛ ‎shRNAT‏ 5 ‎ACTGTCCACAGGAGAAGCCA‏ .3 (توالية بهوية رقم:64)؛ قحاانكطى 5 ‎CAGTACCCTGGAGAAACACA 0‏ 3“ (متوالية بهوية رقم:65). تحليل مخطط وسترن تم تحليل خلايا حمراء فأرية محولة وخلايا +0034 في محلول تحليل منظم 555لا ‎(RIPA) buffer‏ مع بروتياز ‎(ROCHE®) protease‏ ومثبطات فوسفاتاز ‎phosphatase‏ ‎CRUZ BIOTECHNOLGY) inhibitors‏ /1ل5/1©)؛_بيبستاتين ‎pepstatin‏ وليويبتين ‎(SIGMA) leupeptin 25‏ تم _تقدير_نواتج تحليل بروتين بواسطة فحص ‎BCA (ign‏ ‎(SCIENTIFIC THERMO)‏ تم تعليق 25ميكرو جم من بروتين في 72 من محلول منظم
‎Laemmli‏ وتم ‎Mall‏ وتم التحميل على 78 505-بولي -جل أكريلاميد ‎polyacrylamide‏ ‎gel‏ وبالتالي تم النقل إلى غشاء بولي فينيليدين فلوريد ‎(PVDF) Polyvinylidene fluoride‏ ‎(MILLIPORE®)‏ بعد التكتل في ‎PBS‏ مع 70.1 10010100-7 و75 من لبن ‎Gla‏ غير دهني ‎nonfat dry milk‏ تمت حضانة غشاء بولي فينيليدين فلوريد مع جسم مضاد فأري أحادي النسيلة 1 861118 ‎(ABCAM®)‏ أو فأر 8]-2801-أكتين (©5161/8). تم استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط ب ‎HRP IgG‏ مضاد لفأر (خلية ‎(SIGNALING®‏ للكشف بواسطة التوهج الكيماوي ‎Peroxide X20 3 Reagent LUMIGLO® X20‏ (خلية ‎.(SIGNALING®‏ ‏تحليل كروماتوجراف سائل عالي الأداء تم تحضير حلالات دموية ‎Hemolysates‏ من ‎WIA‏ في اليوم 18 من التمايز باستخدام 0 التحليل التناضحي في الماء وثلاثة من دورات الذوبان والتجميد. وتم تنفيذ ‎Day‏ هيموجلوبين كهربي ‎Hemoglobin electrophoresis‏ مع أسيتات سيليلوز ‎cellulose acetate‏ وكروماتوجراف سائل عالي الأداء مع نواتج التحليل» في المعامل السريرية ل ‎Brigham and‏ ‎Women’s Hospital‏ باستخدام معايير معايرة سريريا لمركبات الهيموجلويين البشرية ‎human‏ ‎.hemoglobins‏ ‏15 تتابع وتحليل ‎RNA‏ ‏تم استخلاص ‎RNAs‏ صغيرة من ‎106X6‏ خلايا حمراء فأرية باستخدام طقم عزل ‎(INVITROGEN™) miRNA mirVana‏ وفقا لتعليمات المصنع وبتم إرسالها من أجل تتابع ‎RNA‏ العميق باستخدام ‎ILLUMINA® ١115602000‏ تم استخدام مخطط ‎PERL‏ ذاتي التطور لإزالة المتوالية المهيأة؛ وتم استخدام 0125-19 ‎RNAS‏ صغيرة أيضا للتحليل. تم استخدام برنامج ‎BOWTIE 0‏ (الذي تم الحصول عليه من على الموقع الألكتروني عند صافي مدة الاتصال الحيوي بالمصدر) للمحاذاة؛ وتم السماح بنسبة عدم توافق تبلغ 1. تمت معايرة مستويات التعبير عن ‎RNAS‏ صغيرة إلى مليون من إجمالي قراءات كل مجموعة للمقارنة بين العينات المختلفة. بالنسبة للتجرية مع 250 ‎ShRNAs TRC‏ في 4 سلالات خلية؛ تم تحضير فيروس بطيء بواسطة ‎Broad Institute‏ باستخدام بروتوكول تحضير فيروس ‎Je‏ الإنتاجية وتمت إصابة الخلايا عند 5 تعدد الإصابة عالي مع ‎ShRNA‏ منفرد لكل عين في أطباق سعة 96 عين (يتم الحصول على البروتوكولات من المواقع الإلكترونية ل ‎«Broad Institute at Cambridge, MA‏ الولايات
المتحدة؛ عند مصادر ‎RNA‏ العامة تحت اسم "بيوروميسين 617/ا0017017") تمت إضافة عند اليوم 1 بعد الإصابة وتم تحليل الخلايا في ‎TRIZOL®‏ عند اليوم الرابع بعد الإصابة. تم نقع كل نواتج التحليل لكل سلالة خلية؛ متبوعة بواسطة استخلاص ‎RNA‏ كلي وتحضير مجموعة ‎RNA‏ ‏صغير (49). تم تلخيص قراءات ©8ل/1/الا1ااء والتي انهارات إلى قراءات فريدة (>0117) مع عدات؛ وتم التخطيط إلى تعبير تي ارسي ‎TRC‏ عن ناقل متواليات ‎ShRNA‏ التي لا تسمح بأي عدم توافق. تم حساب عمليات توزيع متوالية ‎ShRNA‏ الناضجة لكل ‎ShRNA‏ قبل تحديد متوسط عبر ‎.ShRNAs‏ ‏التحليل الاحصائي تم استخدام حزمة برامج 5.0 ‎GRAPHPAD PRISM®‏ من أجل التحليل الإحصائي. يتم التعبير عن النتائج التي يتم التعبير عنها كمعيار انحراف متوسط + ‎standard deviation‏ (50). تم تقييم التميز الإحصائي بواسطة الاختبار ]. النتائج فعالية استبعاد 801117 المنخفضة بواسطة ‎ShRNAS‏ المدمجة في بنية متراصة ‎MicroRNA‏ ‎(ShRNAMIR)‏ مقارنة بحلقات ‎ShRNA‏ بسيطة الجذع لتحديد ‎shRNAS‏ المرشحة التي تتوسط في استبعاد 801117 الفعال؛ تم فحص مجموعة فيروسية بطيئة من 118 ‎ShRNAS‏ تستهدف ترميز متواليات ل ‎mRNA‏ 861118 محفوظة بين البشر والفئران في ‎WIA‏ حمراء فأرية. تم التعبير عن ‎SARNAS‏ من معزز 6لا قائم على أساس ‎pol NI‏ (الشكل 119 الصورة اليسرى) في الأساس ‎LKO‏ الفيروسي البطيء )26( يحتوي على مقاومة لجين بيوروميسين من أجل اختيار ما ‎aw‏ ب ‎LKO-U6-BCL11A-‏ ‎shRNAMIR 0‏ (فيما يلي 8ل6-9050لا). تم تحويل خلايا حمراء فأرية؛ خلية مستخدمة بشكل شائع لدراسة تنظيم جين جلوبين» مع الفيروس البطيء نواقل التعبير عن ‎ShRNAs‏ عند تعدد الإصابة بمقدار 2. يعمل التعبير المعاير لفأر ‎Hbb—y Mma‏ جنيني؛ ‎ly‏ تعمل كنظير وظيفي لجين (-جلوبين بشري )27( يقدم قراءة غير مباشرة لاستبعاد 8011178 (الشكل 19ب؛ المحور لا). كقراءة ثانية؛ تمت مراقبة منقوع ‎ShRNA‏ أيضا استخدام سلالة خلية مبلغة حمراء فأرية تحمل 5 تضمين ‎mCherry‏ عند الموقع ‎Bauer) Hbb-y‏ .0 غير منشورة). تم تحليل حث مبلغ متألق بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 19ب؛ المحور *#). تم استنساخ ثمانية 5050085 (المعلمة
والمسماة ‎shRNAT‏ خلال 8 في الشكل 19ب) التي تم حثها ‎Hbb-y‏ بشكل مناسب ‎flies‏ ‏التعبير عن ‎mCherry‏ في ‎WIA‏ حمراء فأرية في 00100054108223 بشري (014-223) التي تحيط بها وحلقة متواليات لتكوين ‎MicroRNAs‏ تخليقية ‎(ShRNAMIR)‏ مع قيام الهدف بتطوير نواقل التعبير الانتقائية للسلالة لاستبعاد 861-117. للتحليل الأولي؛ تم دمج هذا القالب الجيني في ناقل ‎PLEGO‏ فيروسي بطيء (28) (الشكل19أ؛ الصورة اليمنى) في المنطقة 3 غير ‎das ial‏ ل ‎Venus‏ مبلغ متألق تحت سيطرة معزز/محسن فيروس تكوين التركيز الطحالي القوي والمطلق الذي يتم التعبير عنه المسمى ‎LEGO-SFFV-BCL11A-ShRNAMIR‏ (المشار إليه ‎Las‏ يني ‎.(SFFV-shRNAmMIR‏ ‏تمت مقارنة فعالية استبعاد ‎ShRNAS‏ التي تضمنت نفس متواليات التوافق مع الهدف ذات ال 21-قاعدة بشكل مباشر؛ ولكن في سياق عبوات التعبير ‎U6-shRNAs i) pol ١ااو pol lll‏ في مقابل ‎(.SFFV-shRNAmMIRs‏ في خلايا ‎ches‏ فأرية باستخدام ‎ShRNA‏ غير مستهدفة بكونها عينة ضابطة سلبية. تم الكشف عن بروتين 8011178 بواسطة مخطط مناعي في نواتج تحليل الخلية من حمراء فأرية-خلايا ‎Algae‏ عند تعدد الإصابة بمقدار 2 (الشكل 19ج). كان استبعاد 861-117 أقل كفائة بشكل مستديم في ‎WIA‏ التعبير عن ‎SFFV-shRNAMIR‏ مقارنة 5 ب ‎U6-shRNAs‏ (الشكل 19ج). لتأكيد التميز الوظيفي لهذا الفرق؛ قام المخترعون بقياس مستويات حث ‎Hbb—y MRNA‏ بواسطة 087-0085 (الشكل 19د) في مجموعات متجانسة لخلايا محولة تم الحصول عليها إما بواسطة اختيار بيوروميسين أو بواسطة خلية تصنيف منشطة بالتألق ‎(FACS)‏ كانت فعالية استبعاد ‎SFFV-shRNAMIRS‏ المنخفضة مقارنة ب -6لا ‎ki) shRNAs‏ الشكل 19ج) المبينة في حث ‎Hbb-y‏ الأقل كفاءة بواسطة ‎SFFV-‏ ‎shRNAmMIRs 0‏ (الشكل 19د) والفروق في حث ‎Hbb-y‏ أكثر وضوحا من الفروق في استبعاد ‎.BCL11A‏ ‎U6-ShRNAS 3 SFFV-shRNAMIR Lass‏ عن متواليات الجديلة الموجهة الناضجة المختلفة لفهم الأساس المولاري لهذه ‎cg dl)‏ تم تنفيذ تتابع ‎RNAS‏ صغيرة من ‎WIA‏ محولة مع العديد من ‎U6-ShRNAS‏ ونظائر مناظرة من ‎(SFFV-ShRNAMIR‏ سوف يتم افتراض أن 5 الفروق المميزة في حث ‎Hbb-y‏ بسبب فرق إنتاج الجدائل الموجهة الناضجة من نواتج استنساخ مميزة تحتوي على ‎ShRNA‏ والتي يتم إنتاجها من سياقات ‎pol ١١‏ وااا ا00. ‎July‏ تم تقييم
متواليات الجديلة الموجهة المعالجة من كل من سياقات ‎SFFV-shRNAMIR 3 U6-shRNAs‏ (الشكل 120 وب). تتناظر ال ‎RNAS‏ الموجهة الموجودة بوفرة ‎lly‏ يتم إنتاجها ناضجة من ‎SFFV-shRNAmMIRs‏ بشكل كبيير مع المتوالية الناضجة المتوقعة في سيليكو ‎silico‏ (الشكل 0ب). على العكس» أسفر أغلب ‎U6-ShRNAs‏ عن متواليات جديلة موجهة ناضجة تتوافق مع
منتج ‎Dicer‏ المتوقع الذي يتكون من 7122-7 من الطرف 3" من مستنسخ ‎pol Hl‏ شاملة ناتج مد بمقدار 5-3 ‎nt‏ المشتق من إشارة إنهاء !اا ا00؛ ولكنها تحتاج إلى عدد مناظر من النيكلوتيدات الخاصة بالمتوالية المتوافقة مع الهدف لمتوالية عند الطرف 5”. تمت ملاحظة وجود
توزيع مشابه للمنتجات المعالجة في عملية فحص كبيرة بمقدار 247 من ‎U6—ShRNAS‏ المختلفة
في سلالات الخلايا ‎Jurkat (MCF7 (A549‏ و0937 حيث تتضمن متوالية الجديلة الموجهة
0 المسيطرة متوسط طول بمقدار 0122 مع طرف 5 يبدأ من 4 قواعد من متوالية الحلقة الثابتة. تم تنفيذ التتابع العميق ل 247 من منتجات ‎TRC ShRNA‏ التي تمت معالجتها في سلالات الخلايا الأريعة هذه (الشكل 25). تشير النتائج إلى أن جديلة موجهة الناضجة المسيطرة ‎ag‏ عند الموضع
4 من متوالية مضادة للحس من ‎SARNA‏ وتتضمن أريعة من الوحدات البنائية ‎U=3‏ الطرفية.
كانت المعالجة متوافقة بشكل عام بين سلالات الخلايا وبين العديد من متواليات ‎ShRNA‏
5 المختلفة. وقد وجد أن وزن متوسط قراءة التردد لكل متوالية ناضجة بشكل متساوي عبر 85ل على الرغم من أن بعض ‎ShRNAS‏ التي تم توليدها >1000-طية وكانت بعض القراءات أكثر من غيرها. قامت هذه الطبيعة شبه الكمية لتتابع ال ‎RNA‏ الصغير؛ بسبب ميول
ليجاز ‎RNA‏ القوية أثناء تحضير المجموعة؛ بجعل المقارنات مستحيلة بين مستويات التعبير أو المعالجة النسبية؛ ولكنها تميل بشكل ثابت عبر سلالات ‎ShRNAs ; LIAN‏ التي تبين هوية
0 جديلة موجهة مسيطرة. تم أيضا الكشف عن قراءات الجديلة الحسية (<730 لكل ‎ShRNA‏ بشكل متوسط)؛ حيث الأغلبية الواسعة منها ‎Tas‏ ب '66' وتمتد بمقدار 0420 في متوالية الجديلة الحسية.
هذه المتواليات الناضجة تتوافق بالضبط بشكل متوافق مع منتج ‎Dicer‏ لمستنسخ ‎hU6 shRNA‏ الأساسي؛ دون ‎dala‏ إلى بدء خطوة معالجة ‎.Drosha/DCGRS‏ باعتبار ما سبق؛ تشير هذه النتائج إلى أخمية اعتبار حالات المعالجة التي تنتج متواليات ناضجة من نواتج استنساخ ‎pol ١١‏
‎shRNA 3 shRNAmMIR 5‏ الا ‎pol‏ عند نقل متواليات ‎ShRNA‏ بين النواقل. تمت ملاحظة هذا التوزيع المتشابه جدا للمتواليات الناضجة لأنواع الخلية الأربعة التي تمت دراستها حيث يتم تعميم
أنماط المعالجة عبر مختلف السياقات الخلوية. تساهم هذه الفروق في متوالية الجديلة الموجهة الناضجة الناتجة في !اا ‎pol‏ في مقابل نواقل قائمة على أساس ‎pol Il‏ بشكل أساسي في التخفيض المتحكم فيه ل ‎BCL11A‏ الملحوظ مع ‎U6-ShRNAS‏ مقارنة ‎SFFV-shRNAmMIRs‏ تشير هذه البيانات إلى أن التحويلات المتوقعة بين نواقل ‎pol II‏ واا ‎pol‏ ممكنة بواسطة اعتبار شق ‎Drosha 5‏ و0166 ل ‎pol Il sShRNAs‏ مقارنة بشق ‎Dicer‏ ل ‎.pol ١١١ shRNAs‏
يؤدي تعديل متواليات ‎ShRNA‏ في ناقل قائم على أساس ‎pol Il‏ إلى فعالية استبعاد محسنة بناء على هذه النتائج؛ افترض المخترعون أن استخدام المتوالية الناضجة المتوقعة من نواقل ‎shRNA pol ||١‏ عند نقل متواليات في ‎SFFV-shRNAMIR‏ سوف يؤدي إلى فعالية استبعاد محسنة. بالتالي» تحتوي مجموعة من ‎SFFV-shRNAMIRS‏ على إزاحة 4-نيكلوتيد في 0 الطرف 5 لمتوالية الجديلة الموجهة (الشكل 21). عند الطرف 3" تمت إضافة نيكلوتيدات 06 لتحقيق أعلى ثبات حراري ديناميكي عند الطرف 3-” في ال ‎SIRNA‏ المزدوج والذي يجب أن يعزز تحميل معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ بشكل مفضل للجديلة الموجهة. تم تقييم أثر عمليات التعديل على فعالية استبعاد وتم تقييم حث ‎Hbb-y‏ في خلايا حمراء فأرية بواسطة مخطط مناعي ‎(RT-PCR‏ على التوالي. تمت ملاحظة فعالية الاستبعاد المحسنة لبروتين 861117 مع 1ج ادهل90-/51؛ 3 و8 (الشكل 21ب). قام الاستبعاد المحسن المرتبط بحث نواتج استنساخ ‎Hbb-y‏ زائدة بمقدار 200 إلى 400 طية (الشكل 21ج). لم تبين ‎SFFV-‏ ‎shRNAMIRs‏ الأخرى زيادة يمكن ملاحظتها في فعالية الاستبعاد. لفهم الآلية الكامنة ‎shy‏ ‏الفعالية المحسنة ل ‎SFFV-shRNAMIRSs‏ 1< 3 و8 المعدلة تم تحليل وفرة الجديلة الموجهة والجديلة المنتقلة ل ‎RNAs‏ صغيرة ونسبها بواسطة بقعة نورثرن. أولاء تمت ملاحظة وفرة أكبر 0 لجديلة الموجهة ل ‎pol II‏ في مقابل نواقل ‎pol ١!‏ في كل الحالات. علاوة على ذلك؛ تحديدا بالنسبة ل ‎SFFV-shRNAmMIiRs‏ 1 و3 وجد أن هناك نسب وفرة أكبر وتوجيه أكبر للجديلة المنتقلة في مقابل ‎ShRNAMIRS‏ غير المعدلة؛ بينما لم تتأثر هذه المتغيرات الخاصة ب ‎SFFV-‏ ‎shRNAS‏ (الشكل 21د). تم تنفيذ عملية تتابع عميقة ل ‎RNAS‏ صغيرة لتقييم أثر التعديل على متواليات الجديلة الموجهة ولريطها بالتغيرات الملحوظة في استبعاد ,/80111. بشكل عام؛ قامت 5 المتواليات الناتجة التي تمت معالجتها بتوضيح إزاحة بمقدار 4 ‎nt‏ التي تمت إضافتهاء بما يؤدي إلى جديلة موجهة مع مناطق البذرة المشابهة لمتواليات تم الحصول عليها من ‎pol Ill shRNASs‏
الذي يتم التعبير عنه في أساس ©0»اا. بالنسبة ل ‎SFFV-shRNAMIRs‏ 1« 3 و8؛ وقد وجد أن هناك متوالية مسيطرة فردية موجودة؛ والتي تتضاد مع الفعالية الأقل ‎SFFV-shRNAMIRs‏ ‏التي أوضحت توزيع أوسع للمتواليات. أثر تعديل ‎shRNAMIR‏ على استبعاد 861117 وحث /(-جلوبين في خلايا حمراء أساسية مشتقة من +0034 بشري كان لعملية ‎sale)‏ تنشيط الجلويين الجنيين مع استبعاد 8061117 قدرة علاجية لعلاج مرض الخلية المنجلية و]-ثلاسيميا. لتقييم أثر ‎SFFV-ShRNAMIR‏ معدل على فعالية استبعاد 801118 وحث /-جلوبين والتعبير عن ‎HOF‏ في ‎WIA‏ بشرية أساسية؛ تم تحويل الدم المحيط المنقولة بواسطة ‎HSPCs (MPB) G-CSF‏ +6034 من متطوعين أصحاء مع نواقل التعبير 0 عن ‎dae SFFV-shRNAmMIR; SFFV-shRNAmIR (U6-shRNAs‏ ويعد ذلك يتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر. بعد 11 يوم في مزرعة؛ تم تحديد مستويات 801117 عبر مخطط وسترن (الشكل 22)). بشكل متوافق مع النتائج في خلايا حمراء ‎djl‏ تمت ملاحظة الاستبعاد المحسن مع ‎SFFV-shRNAMIRs‏ 1< 3؛ و8؛ معدلة والتي تؤدي أيضا لزيادة حث نواتج استنساخ (-جلوبين (الشكل 22ب). تم تقييم ‎Alla‏ التمايز الأحمر في اليوم 18 من المزرعة 5 بواسطة تحليل التدفق السيتومتري للتعبير السطحي ل 6071 و8/م6 والاستئصال. لم تتم ملاحظة فروق كبيرة بين ‎SFFV-ShRNAMIRS‏ وعينات ناقل ضابطة محولة (الشكل 22ج). على العكس؛ أدت ‎U6-ShRNAS‏ إلى تأجيل طفيف في الحصول على مرقمات التمايز في الأطوار الأخيرة من النضج؛ والتي يمكن أن تشير إلى السمية بسبب التعبير المفرط عن ‎ShRNA‏ الذي تم التوسط فيه بواسطة معزز 6لا-. تم ‎ast‏ ملاحظات خاصة بحث (-جلويين ‎MRNA‏ بواسطة 0 بروتينات ‎HOF‏ زائدة بواسطة كروماتوجراف عالي الأداء. أدت ال ‎SARNAMIRS‏ معدلة الثلاثة التي تم اختبارها إلى ‎sab‏ خرج ‎HOF‏ مقارنة ب ‎SFFV-shRNAMIRs‏ غير معدلة ‎Jal)‏ ‏2)؛ حيث بين 750-40 من الهيموجلوبين الكلي في الخلايا الحمراء كان يوجد ‎HDF‏ كانت هذه العلاقة بين بروتين (-جلويين ‎HBF 3 MRNA‏ عالية )0.96=12(¢ بما يدعم صدق نواتج التحليل هذه (الشكل 22ه). باختصارء أوضح المخترعون أن ‎ShRNAS‏ المدمجة في بنية ‎MIRNA‏ متراصة والذي يتم التعبير ‎die‏ عبر معززات ‎pol ١|‏ تتم معالجتها لإعطاء ‎SIRNAS‏ ناضجة مختلفة في خلايا
محولة مقارنة ب ‎SIRNA‏ الذي يتم التعبير ‎die‏ من معزز 6لا. تمت إزاحة المتوالية المتوافقة مع الهدف في ‎ShRNA‏ ناضجة مشتقة من بنية معزز !اا ‎pol‏ بشكل غير متجانس عند الطرف 3" بمقدار 5-3 ‎Nt‏ وهذا الفرق مرتبط بفروق كبيرة في فعالية استبعاد المستنسخ المستهدف. في حالة 801118؛ الهدف العلاجي المحتمل؛ أدى هذا إلى فروق كبيرة في إعادة تنسيط التعبير عن (- جلوبين. ‎cps‏ هذه البيانات أهمية تحسين التصميم عند نقل متواليات ‎i 4 shRNA‏
Pol ١١ ‏متراصة للسماح بالتعبير الذي يتوسط فيه‎ MicroRNA يقوم استبعاد 861-117 المطلق في ‎WA‏ جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية ‎hematopoietic‏ ‎(HSPCs) stem and progenitor cells‏ بإضعاف عملية إعادة التكوين المكونة للدم ويمكن ‏أن يتم إحاطتها بواسطة استهداف التعبير عن ‎ShRNAMIR‏ إلى الخلايا الحمراء . ‏10 تم تقييم أثر التعبير عن ‎SFFV-shRNAMIR‏ في الكائن الحي في نموذج فأر لتحويل وزراعة خلية جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية. تم تحويل ‎WIA‏ جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية السلبية للسلالة ‎(lin) Lineage-negative‏ من نخاع عظم ‎B=YAC ly‏ تعبر عن ‎ail‏ 0045.2 لسطح الخلية ‎ally‏ تم تحويلها خارج الكائن ‎all‏ مع نواقل ‎SFFV-‏ ‎shRNAmIR‏ أو ‎non-targeting a‏ ناقل ‎(SFFV-shRNAmMIRNT)‏ وتمت الزراعة في ‏5 فتران ‎Boyd‏ 6045.1 مستقبلة تم قتلها بالإشعاع. تمت زراعة ‎WAY‏ غير المحولة في مجموعة ضابطة. تحمل ‎hid‏ 77/80 -] موقع (]-جلوبين بشري كجين متحول يتم تنظيمها بشكل مطور في بيئة ‎Ally lal‏ تبين تعبير متمايز لجينات الجنينية وجينات ]-جلوبين البالغة. لأغراض التحقق ولمقارنة أفضل مع البيانات المنشورة سلفا تم استخدام ‎ShRNA‏ الموضحة ‎lus‏ (23» 27« 29( (المسمى هنا ‎(ShRNAMIR®‏ المدمجة في متواليات ‎MIRNA223‏ المحيطة. في الأسابيع 4 8 ‏0 و12 بعد الزراعة ‎dV)‏ تم تحديد تطعيم الخلية المانحة بناء على خيمرة 0045.1 و0045.2 (الشكل 123( كان تطعيم الخلية المائحة بعد النمط المتوقع مع تطعيم شبه كامل في الدم المحيط ونخاع العظم بعد 8 أسابيع. مع ذلك؛ بشكل غير متوقع؛ تدهور ‎gia‏ الخلايا المعدلة بالجين بحدة مع الوقت (الشكل 23ب). على الرغم من معدلات التحويل الأولية بمقدار -1740 باستخدام ناقل استبعاد 861-117؛ كان الجين الذي يقوم بالترقيم عند الأسبوع 12 فقط بمقدار 2- ‎Li 23 5‏ من خلايا 0045 المشتقة ‎WS‏ من المانح. كان التعبير المفرط عن ‎SFFV-‏ ‎ShRNAMIR NT‏ مرتبط ‎Wiad‏ بالتطعيم المخفض للخلايا المعدلة بالجين ولكنها بمقدار أقل؛ بما
يشير إلى وجود سمية انتفائية لكل من المتوالية وسمية غير انتقائية في ‎LIA‏ جذعية مكونة للدم ‎LDA,‏ الأساسية التي تقوم بالتطعيم. يشير توقيت فقد الخلايا المائحة التعبير عن ‎ShRNAS‏ إلى
وجود أثر على الأجزاء الأكثر بدائية من الخلية الجذعية المكونة للدم. لفحص الأثر السلبي بشكل أكبر على عملية إعادة تكوين الدم؛ تم تنفيذ تجارب إعادة تكوين كمية مقارنة (الشكل 523-223( تم تحويل خلايا من حيوانات مانحة 6045.1 ‎(BoyJ)‏ ‏عديمة السلالة ‎(BING) CD45.2‏ مع عدة نواقل تعبير عن ‎SFFV-shRNAMIRS‏ في مقابل ‎SARNAMIRNT (BCL11A‏ أو فقط بروتين أزرق متألق مبلغ تحت سيطر معزز فيروس تكوين تركيز طحالي الذي يتم التعبير عنه بشكل مطلق (فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق). تمت زراعة الخلايا في حيوانات 0045.1/0045.2 المسانجة؛ بما يسمح بتعريف كل 0 من المجموعات المائحة والخلايا المستقبلة. في التجارب التي تم فيها استخدام ناقل فيروس تكوين تركيز ‎Mak‏ - بروتين متألق أزرق» تمت زراعة خلايا ‎dail‏ 6045.1 في حيوانات 0045.2 وتم تحديد المجموعات المحولة من الخلية المانحة وتمت المقارنة بناء على التألق. قبل الزراعة ‎dalam)‏ تم خلط أعداد متساوية من ‎WA‏ المجموعات المحولة مع نواقل متنافسة. تم تحليل النسبة النهائية للخلايا المعدلة بالجين التي تم الحصول عليها مع النواقل في المجموعة المزروعة 5 عبر التدفق الخلوي ‎lly‏ أكدت على التحويل المقارن الذي يتفاوت من 770-55 (الشكل 22ج). تم تقييم مساهمة الخلايا المعدلة بالجين في الحيوانات المزروعة في الدم المحيط؛ نخاع العظم والطحال في الأسابيع 4 8 و12 بعد الزراعة الانتقالية (الشكل 23د) وقد تم اعتبار الفروق المنخفضة في نسب الخلايا المحولة المدمجة لهذا التحليل. في كل الحالات وفي كل النقاط الزمنية؛ تم التفوق على الخلايا المحولة بنواقل تستهدف ‎BCLITA‏ بواسطة خلايا محولة ب غير 0 مستهدفة أو ناقل فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق؛ بما يشير إلى عيب انتقائي عند ‎alesis)‏ /86111. لم تتم ملاحظة فروق كبيرة في ‎Bale)‏ تكوين خلايا مكونة للدم مقارنة بنسبة المجموعة المزروعة أوليا عند تنافس اثنين من النواقل التي تقوم باستهداف 801117 في مقابل بعضها البعض. بشكل متوافق مع النتائج في الشكل 23ب؛ كان لهذا التعبير المفرط عن ‎Lad ShRNAMIRNT‏ أثر سلبي على إعادة تكوين ‎ad)‏ حيث تم التفوق على هذه المجموعة 5 بواسطة ‎WIA‏ محولة بواسطة ناقل ‎pal)‏ عن فيروس تكوين تركيز طحالي - بروتين متألق أزرق فقط وليس التعبير عن ‎ShRNA‏ قام المخترعون بتنفيذ تحليل أكثر تفصيلا للخلية الليمفاوية 8
‎olay‏ خلية جذعية مكونة للدم أكثر بدائية في ‎gall‏ المحول لخلايا نخاع العظم (الشكل 23ه).
‏كما هو متوقع من الدراسات السابقة فقد ‎sul‏ غياب خلايا 8 في فتران /80111-/- )30
‏1) وقد تم تقليل عدد خلايا 8 إيجابية ل 8220 عند استبعاد ,/86111. على الرغم من عدم الوصول إلى قيمة ملحوظة؛ كان هناك ميل تجاه فقد المزيد من ‎c—kit+ Sca—1+ lin LIA‏
‎(LSK) 5‏ أكثر بدائية تتضمن ‎sha‏ تطعيم خلية جذعية مكونة للدم.
‏يمكن أن يقوم استبعاد 801117 الانتقائي للمكونات الحمراء بالتغلب على الأثر السلبي
‏لاستبعاد ‎BCLITIA‏ على ‎WIA‏ جذعية مكونة للدم وخلايا 8؛ بينما يتم الحفاظ على الأثر العلاجي لحث /-جلوبين في الخلايا الحمراء. لتوجيه الاستبعاد انتقائيا إلى خلايا حمراء؛ تم توليد
‎JAG‏ فيروسي بطيء حيث يتم التعبير عن قالب جيني ‎ShRNAMIR‏ والمبلغ ‎Venus‏ المتألق
‏0 تحت سيطرة معزز أقل قريب من ]-جلوبين مرتبط بمواقع عالية الشدة 2 و3 ‎HS2)‏ و153) من منطقة التحكم في ‎alse‏ م-جلويين (32) (الشكل 523( المسماة ‎LV-LCR-BCOL11A-‏ ‎ShRNAMIR‏ (المسماة ‎.(LCR-ShRNAMIR‏ تم تقييم ‎Alls‏ التعبير عن الجينات المتحولة لمبلغ في مجموعات الخلية المكونة للدم المطعمة في الكائن الحي أولا في ‎Ob‏ مزروعة مع
‏خلية جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية محول (الشكل 23ز والشكل 26). في الشكل 26؛ تم
‏5 تحويل ‎WAY‏ عديمة السلالة باستخدام ناقل ‎LOR-ShRNAMIR‏ وتم التطعيم في فئران مستقبلة مقتولة بالإشعاع. بعد مرور 12 أسبوع تم تحديد الخلايا المائحة وأنواع الخلية المختلفة المكونة للدم باستخدام مرقمات السطح. والتي أوضحت وجوتد تبويب تمثيلي وبقع تكرارية تبين التعبير عن 5 في السلالات المختلفة. تشير الأعداد في البقع إلى نسبة الخلايا الإيجابية ل ‎venus‏ ‏ومتوسط شدة التألق. تم تنظيم التعبير عن الجين المتحول بشكل دقيق؛ بدون تعبير يمكن الكشف
‏0 عنه في أجزاء ‎LSK‏ وخلية 8؛ ومستويات منخفضة جدا من التعبير في خلايا 1 ومستويات منخفضة من التعبير في ‎WAY‏ النقوية في بعض الحيوانات. على العكس؛ تمت زيادة التعبير الجيني المتحول بشكل متحكم فيه بقوة أثناء التمايز الأحمر؛ بداية من ‎~CDT71+/Terl19 Wa‏
‏تمثل الخلايا الأساسية الحمراء والخلايا الأرومية الحمراء المعززة وصعودا في الطور الإيجابي المزدوج ‎«CDT71+/Terl19+‏ بما يمثل الخلايا الصبغية الحمراء الأرومية. أثناء المراحل الأخيرة
‏25 من نضج المكونات الحمراء؛ ‎shag‏ كبير من ‎+CDT71-/Terll9 WA‏ يمثل الخلايا الشبكية
وكريات الدم الحمراء الناضجة الذي يتم التعبير عنها في المبلغ بنسبة مشابهة مقارنة بخلايا ‎.CD71+/Ter119+‏ ‏بعد ذلك؛ لتحديد ما إذا كان استخدام ناقل منطقة تحكم موضعي يتغلب على عيب إعادة التكوين الملحوظ عند التعبير المفرط عن ‎SFFV- shRNAMIR‏ تم تنفيذ تجرية الزراعة الانتقالية تنافسية باستخدام ‎LCR-ShRNAMIR‏ و ‎SFFV-shRNAMIR‏ (الشكل 23ح). حيث ناقل منطقة تحكم موضعي صامت نسخيا في خلايا ‎=n‏ يتم إخضاع قسامة من خلايا للزراعة الانتقالية مستخدمة إلى التمايز الأحمر في المعمل ونسبة خلايا 7/805+ المقاسة في مجموعة ‎CD71+/Terl 19+‏ النسخية والمستخدمة من أجل معايرة فيروس تكوين تركيز طحالي في مقابل خلايا منطقة تحكم موضعي- محولة. تمت مقارنة التعبير عن ‎Venus‏ في الحيوانات المزروعة 0 في خلايا حمراء» حيث كانت هي المجموعات التي تسمح بالتعبير عن كلا النواقل بشكل متساوي. وقد أبدى ‎sale]‏ بناء الفئران المزروعة سيطرة واشحة للخلايا المشتقة من خلية جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية المحولة مع ناقل منطقة تحكم موضعي؛ بما يشير إلى سمية أقل في خلايا جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية المرتبطة بالسلالة التي تعبر انتقائيا عن السلالة الحمراء ل ‎LCR-shRNAmMIR‏ (الشكل 23ح). باختصارء تبين هذه البيانات أن الأثر العكسي لاستبعاد 5 801118 على تطعيم/وظيفة خلية جذعية مكونة للدم يمكن التغلب عليها بواسطة التعبير عن ‎miRNA‏ الانتقائية للمكونات الحمراء . يؤدي استبعاد 801117 الانتقائي للمكونات الحمراء الذي يتوسط فيه ناقل منطقة تحكم موضعي باستخدام ‎ShRNAMIRS‏ معدلة إلى مستويات عالية من ‎HDF‏ في خلايا حمراء بشرية ‎human‏ ‎erythroid cells‏ لاختبار فعالية استبعاد ‎BCLITA‏ الانتقائي للمكونات الحمراء الذي يتوسط فيه ناقل منطقة تحكم موضعي في نظام اختباري بشري؛ تم تحويل الخلايا +0034 مع ‎ShRNAMIRs‏ ‏معدلة 3 أو 8 تحتوي على نواقل ‎LCR-shRNAMIR‏ (الشكل 23و). وقد أكد المخترعون ‎Vol‏ ‏على حالة التعبير للعديد من نواقل ‎(LCR-shRNA*) LCR-shRNAMIR‏ ‎LCRShRNAMIR3‏ و8) في خلايا بشرية أثناء التمايز الأحمر في المعمل لخلايا بشرية 0008 5 +0034. تم تقييم التعبير عن ‎VENUS‏ بواسطة نواقل منطقة تحكم موضعي وناقل ضابط يعمل بواسطة فيروس تكوين تركيز طحالي بدون قالب ‎shRNAMIR‏ جيني ‎(SFFV-GFP)‏ )33(
عند مراحل مختلفة من نضج المكونات الحمراء؛ كما هو محدد بواسطة تبقيع ‎CD71‏ وم (الشكل 23ط). بشكل متوافق مع النتائج في خلايا فأر مبينة في الشكل 223 تمت ملاحظة مستويات منخفضة من التعبير في خلايا ‎~GpA[-CDT1 shes‏ غير ناضجة. كان هناك زيادة متحكم فيها قوية للتعبير في خلايا إيجابية ل +6071 فردية مع أعلى مستوى للتعبير الجيني
المتحول في خلايا مزدوجة إيجابية لذ 8/م6/+0071+ ‎ST‏ نضجا. كما هو متوقع؛ قامت ‎SFFV-GFP‏ الضابطة بتشغيل التعبير المتتالي عالي المستوى في كل المجموعات الفرعية. بعد بروتوكول التمايز الموضح سلفاء تم قياس مستويات بروتين 801117 في اليوم 11 من المزرعة
وتمت المقارنة بالتواقل الضابطة غير المستهدفة والزائفة ‎SFFV-; LCR-shRNAMIRNT)‏ ‎(GFP‏ تمت ملاحظة التقليل الكبير في 80611178 في ‎WAY‏ التي تعبر عن ‎ShRNAMIR‏
0 معدل مقارنة بالخلايا التي تعبر عن الناقل غير المستهدف والناقل الضابط ‎control vector‏ ) اس اي ‎(SEW sibs‏ (الشكل 124( شكلت جاما ‎MRNA Sula‏ 40 و770 من مركبات جلوبين
شبيهة ب ] في ‎WA‏ مشتقة من خلايا ‎CD34+‏ محولة مع نواقل التعبير عن ‎shRNAMIR3‏
و8؛ على التوالي (الشكل 24ب). لم تتم ملاحظة فروق في نمو الخلية بين ‎WA‏ محولة مع ‎LCR-shRNAMIRSs‏ أو النواقل الضابطة. كان التمايز الأحمر غير ملحوظ؛ عند تقييمه بواسطة
5 اتعبير السطحي عن 0071؛ ‎GPA‏ وبواسطة الاستتصال من العينات الضابطة (الشكل 24ج)؛ بما يشير إلى عدم وجود أثر سلبي لاستبعاد ‎BOLITA‏ عند التعبير ‎SEY)‏ للسلالة ل ‎.BCLI1A shRNAmIRs‏ تمت ملاحظة العلاقة القوية بين مستويات ‎MRNA (slay‏ ‎HBF 5 (QRT-PCR)‏ كما هو مقيم بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء (الشكل 24د).
تساهم ‎HDF‏ في 735 7555 من الهيموجلوبين الكلي في خلايا محولة مع ‎LOR-‏
‎(LCR-shRNAMIRS 5 sShRNAMIR3 0‏ التي تمثل مستويات مقارنة مع التعبير الذي يتوسط فيه معزز فيروس تكوين تركيز طحالي (الشكل 22د والشكل 24ه). ‎pal‏ للتوضيح من أجل
‏إثبات ‎fae‏ أن الاستبعاد الذي يتوسط فيه ‎LCR-ShRNAMIR‏ يسمح بالتطعيم المناسب لخلايا ‎cing hCD34+‏ /-جلوبين» نك تمفيذ الزراعة الانتقالية ل ‎HSPCs‏ +0034 محولة مشتقة من
‏نخاع العظم مع ‎LCR-ShRNAMIR3‏ أو نواقل غير مستهدفة في ‎NSG (yd‏ تم تعريضها
‏25 لمستويات إشعاع غير قاتلة. بسبب التطور الضعيف في ‎WAY‏ الحمراء البشرية في نموذج الطعمة هذاء تم ‎HSPCs Jie‏ +0034 من نخاع العظم للحيوانات المزروعة بعد 14 أسبوع بعد
الزراعة الانتقالية وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. تم تخصيب خلايا ‎Venus‏ ‏بواسطة خلية تصنيف منشطة بالتألق وتم تحديد التعبير عن 7- و[]-جلوبين بواسطة ‎RT-PCR‏ ‏(الشكل 24و). بشكل متوافق مع البيانات السابقة؛ كان خرج ‎ea‏ 7(-جلوبين من موقع (]|-جلويين الكلي 744.9 + 75.5 بالنسبة للخلايا المحولة مع ‎(LCR-ShRNAMIR3‏ مقارنة ب-9/ + 70.5 في المجموعتين الضابطتين المكونتين من ‎LCR-ShRNAMIRNT‏ خلايا محولة أو غير محولة.
وقد تم استخدام ‎ShRNAS‏ بشكل موسع لتحليل الوظائف الجينية في الدراسات البيولوجية؛ وكانت هناك زيادة مهمة في استخدام ‎RNAI‏ للأغراض العلاجية. تمثل 861117 هدف علاجي مشوق لتضمين قائم على أساس ‎RNAI‏ 8611178 عبارة عن وسيلة قمع التعبير عن 7(-جلوبين ‎Jilly 0‏ تعمل كمضمن أساسي لتحويل الهيموجلويين الجنيني إلى هيموجلوبين ناضج في الخلايا الحمراء. بشكل ‎cage‏ ارتبط المستويات العالية من الهيموجلويين الجنيني مع أنماط جينية مرضية أخف في مرض الخلية المنجلية وأمراض م-ثلاسيميا وتم تفعيل الاستبعاد ‎SEY)‏ للسلالة ل 861118 كاستراتيجية علاج في نماذج مرض الخلية المنجلية. في الدراسات المشار إليها هناء كان هدفنا هو تطوير ناقل يمكن استخدامه سريريا ‎sale‏ تنشيط التعبير عن هيموجلوبين جنيني 5 بواسطة قمع يتوسط فيه ‎RNAI‏ ل 806111/8. باستخدام ‎ShRNA‏ مهياً ب ‎MIRNA‏ يحتوي على ناقل فيروسي بطيء محسن ‎(ShRNAMIR)‏ الذي يتم التعبير ‎die‏ من معزز ‎pol ١١‏ انتقائي للسلالة الحمراء قام المخترعون بتحقيق مستويات ‎HOF‏ بمقدار >750 من الهيموجلوبين الكلي في الخلايا الأولية الحمراء المشتقة من ‎HSPCs‏ +6034 محولة. يحتمل أن يكون هذا المستوى العالي من حث ‎HDF‏ فعال سريريا وقابل للمقارنة بشكل مفضل مع النواقل المذكورة سلفا (23؛ 0 27 29) باستخدام عبوات التعبير تعمل بواسطة !اا ‎pol‏ والتي تحتاج إلى انتقائية للسلالة وقد
تمت الإشارة حالة الأمان للنواقل الفيروسية البطيئة ذاتي التنشيط هنا. يمكن الحصول على علاج ل مرض الخلية المنجلية مع زراعة خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا. تعتمد هذه النتائج المفضلة في مرض الخلية المنجلية بشكل كبير على إتاحية أقارب مانحين متوافقين. كانت هناك نسبة أقل من 710 من مرضى مرض الخلية المنجلية لهم مانحين 5 محتملين لديهم توافق (34). يقدم العلاج الجيني لأمراض الهيموجلوبين الميزة الواضحة الخاصة باستبعاد خطر جي في اتش دي ‎GVHD‏ باستخدام خلايا ذاتية المنشاً. يهدف المدى الطويل لهذه
الدراسة_ على تضمين تبديل هيموجلويين؛ بما يؤدي إلى الحث الداخلي والفسيولوجي ل ‎HBF‏ ‏الوقائي وقمع تمنجل الجلويين. يفترض المخترعون أن هذا التلاعب المزدوج للتعبير سوف يكون له أكثر أثر علاجي فعال على الوقاية من السميات في مرض الخلية المنجلية شاملة انحلال الدم وتلف العضو الطرفي للمتطفرء وبلمرة الهيموجلوبين. لإدراك الهدف من الفائدة العلاجية؛ يجب أن يقوم استبعاد ‎BCLITA‏ الفعال وحث ‎HBF‏ على أساس الخلية والأعداد المناسبة من الجين المعدل طويل العمر خلية جذعية مكونة للدم بالتطعيم لخيمرة جزء الخلية الحمراء لتخفيف النمط الجيني للمرض. بالتالي عملية تحسين استبعاد 801117 والحفاظ على قدرة ‎sale]‏ التكوين ل ‎HSCP‏ محولة المبينة هنا مهمة من أجل النجاح ‎dish‏ المدى للعلاج الجيني في مرض الخلية المنجلية. فيما يتعلق بالنقطة الثانية؛ يعتقد المخترعون أن هذا يمكن تحقيقه ‎dlls‏ حيث أبدت 0 اليانات السابقة من الزرائع الخيفية الناتجة عن خيمرة مخلوطة أن هناك خيمرة مخلوطة بنسبة 0 من الجزءٍ النقوي مرتبطة بخيمرة الخلية الحمراء بالدم المحيط بمقدار 7100-80 (35). هذا الانحراف في كتلة الخلية الحمراء بعد التطعيم غالبا ما تكون ناتجة عن النجاة المحسنة للخلايا الحمراء الطبيعية مقارنة بالخلايا المنجلية. وقد تم الحصول على هذا المستوى الملحوظ من الخلايا النقوية طويلة العمر قابلا للحصول عليه في تجارب بشرية باستخدام ناقل فيروسي بطيء (36-
5 38) شاملا ©8]-ثلاسيميا (39). غالبا ما يتم استخدام ‎ShRNAS‏ تعمل بواسطة ‎Pol Il‏ بشكل أكثر ‎legs‏ في أنظمة الناقل للتأثير على الاستبعاد الجيني بواسطة ‎(RNA‏ ولكن هذه النواقل تتوسط في التعبير المطلق الذي يمكن أن يرتبط بكل من السمية غير الانتقائية من مستويات التعبير العالية والسميات غير الانتقائية للمتوالية في أنواع معينة من الخلية. وهنا يبين المخترعون أن استبعاد 801117 في 0 خلايا جذعية مكونة للدم يقوم بإضعاف تطعيم هذه ‎LIAN‏ في أوضاع الزراعة وتطور الخلية 8 في الكائن الحي. على الرغم من أنه لم يتم التبليغ عن ظاخرة التقليل في التطعيم في غياب ‎(BCL11A‏ هذه البيانات المشار إليها هنا تتوافق مع التعبير المعروف عن 8011178 في خلايا جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية سابقة الذكر ومع تقرير ‎(gine‏ خلية جذعية مكونة للدم المخفض بمقدار 2 طية في فئران عند الحذف الجيني ل 8611178 )31 40« 41). يمكن أن 5 يكون هذا الأثر السلبي لاستبعاد 861-117 على تطعيم خلايا جذعية مكونة للدم أكثر وضوحا في الفحوص المشار إليها هنا بسبب الضغط الانتقائي الزائد الموجود في هذه الأوضاع الاختبارية.
تقدم الأرقام المحددة ل خلايا جذعية مكونة للدم بشكل عام بعد إجراء مزرعة خارج الكائن الحي وتحويل هذه الخلايا والتنافس مع ‎WA‏ جذعية مكونة للدم مقارنة مستخدمة في الفحوص المستخدمة التي يمكن أن تحسن الكشف عن السمية عند مستوى خلية جذعية مكونة للدم. في السلالة الحمراء يمكن التخلص من ‎BCLIIA‏ (24). في البيانات المشار إليها ‎(La‏ قام استخدام اناقل الانتقائي ‎ADL‏ الحمراء منطقة تحكم موضعي؛ تحتوي على متواليات منظمة مشتقة من موقع م]-جلويين (32؛ 42) بالتغلب على الآثار السلبية لاستبعاد 8611178 على تطعيم خلية جذعية مكونة للدم. أبدى ناقل منطقة تحكم موضعي وجود درجة عالية من تأمين السلالة في التعبير عن 801117 التي تستهدف ‎.ShRNAMIR‏ علاوة على ذلك؛ وقد تم توضيح هذه البنية لتقليل خطر التنشيط الانتقالي للجينات الخلوية المجاورة عند الاستخدام للتعبير عن جينات متحولة 0 أخرى )43( هناك ميزة مهمة للترجمة_السريرية. بالتالي؛ يبدو الاستهداف النسخي ل ‎ShRNAMIRs‏ مهما في ‎dlls‏ ل /80111؛ بما يؤكد على أهمية تطوير نواقل استبعاد قائمة على أساس ‎pol ١١‏ فعالة. وهذا المنهج يتخطى الأثر السلبي لاستبعاد 861117 على خلايا جذعية مكونة للدم والخلايا الأساسية وأيضا تطور الخلية الليمفاوية (30؛ 31)؛ وبتجنب السمية المتعلقة بالتعبير المفرط عن ‎ShRNA‏ (9؛ 11؛ 19) ويحسن حالة الأمان للنظام الناقل؛ بينما يتم
5 الحفاظ على الفعالية العلاجية. يتطلب استخدام معززات اا ‎pol‏ للتعبير عن ‎shRNA‏ دمج ‎SARNA‏ في متواليات ‎microRNA‏ حيث أغلب متواليات ‎ShRNA‏ الفعالة المتحقق منها سلفا مشتقة من نواتج التحليل التي تم تنفيذها باستخدام معززات !اا ‎pol‏ وأغلب أنظمة الاستبعاد المتاحة بناء على معززات ‎pol‏ ‎lll‏ يكون تحويل متواليات ‎ShRNA‏ في تهيئة اا ا0م مهما. على الرغم من البحث الملحوظ في 0 هذه المنطقة؛ هناك نقص في الإرشادات الخاصة بتحويل متواليات ‎ShRNA‏ المشتقة من نواقل فعالة قائمة على أساس ‎pol ١١١‏ إلى نواقل ‎ShRNAMIR‏ قائمة على أساس ‎١١‏ ا0م. هنا وبمقارنة نتائج ‎RNA‏ التي تقوم بالمعالجة من ‎WAY‏ المحولة بكلا نوعي النواقل بالتوازي مع تأكيد المخترعين على أن منتجات ‎RNA‏ صغير المختلفة يتم توليدها نسبة إلى متواليات المستهدفة المتوافقة الناتجة عن فعالية مخفضة ملحوظة للإستبعاد المستهدف عبر نواقل قائمة على أساس ‎daly) pol II 5‏ المتواليات الموجهة ذات الجديلة الناضجة التي يتم إنتاجها من أنظمة ‎POI ١١‏ مقابل ‎pol ١|١‏ تحتوي على متواليات متطابقة مع ‎MRNA‏ مستهدف بشكل عام بواسطة 5-3 ‎nt‏
نسبة إلى بعضها البعض. تؤدي إضافة 5-3 من الوحدات البنائية لا من إشارة إنهاء ‎١١١‏ ا0م إلى الطرف 3” لمستنسخ ‎ShRNA‏ إلى إزاحة مناظرة لموقع شق ‎Dicer‏ بما يثبت الدور الأساسي لدور عد عند الطرف 3-”لشق ‎Dicer‏ (44؛ 45). تتمتع إزاحة الجديلة الموجهة في ‎III‏ ا00 في مقابل ‎pol ١!‏ أثر كبير على فعالية ‎lia)‏ حيث يتم تعديل منطقة البذرة والخواص الحرارية الديناميكية وهوية النيكلوتيد الطرفية لتغييرات ‎RNA‏ صغير مزدوجة؛ ‎July‏ تؤثر على دمج جديلة موجهة في معقد معقد انتقائية التداخل ‎RNA‏ -مؤثر (4؛ 5؛ 46؛ 47). أدت عملية ‎sale)‏ ‏تصميم 000145ل50]40 إلى محاكاة المتواليات الموجهة ذات الجديلة الناضجة التي يتم إنتاجها بواسطة ‎ShRNAS‏ تعمل بواسطة ‎pol HI‏ إلى تحسين في معالجة واستبعاد ‎MRNA‏ المستهدفة. وهذا المنهج يجب أن يكون قادرا على تطوير نواقل تستهدف جينات أخرى باستخدام معزنات ‎pol‏ ‎dl 0‏ شاملة عبوات التعبير الأخرى الانتقائية للسلالة. باختصارء تبين البيانات وجود خواص مهمة لمعالجة ‎RNA‏ نسبة إلى استخدام ‎ShRNA‏ ‏في سياقات ناقل مختلفة؛ وأيضا توفر استراتيجية لاستبعاد جيني انتقائي للسلالة والذي يتغلب على التوابع العكسية للتعبير المنتشر. تتضمن النتائج وجود ‎Jl‏ مهم ل ‎ShRNAS‏ مدمج ب ‎microRNA‏ وتطبيقها في مناهج علاج جيني قائمة على أساس ‎RNAI‏ ‏15 مثال 11 دراسات فعالية لتحويل ‎BCL11A shRNAMIR‏ في خلايا ‎dale‏ +0034 بشرية صحيحة. ‎(ha‏ 801118 القامعة للنسخ هدف علاجي لأمراض 8م-الهيموجلوبين. أدى القمع ‎sly)‏ ل 801117 في خلايا حمراء عبر ‎Lge SARNAS‏ بواسطة ‎MicroRNA‏ بواسطة ‎pol‏ ‎(ShRNAMIRS) ١١‏ إلى استبعاد 8011178 فعال في كل من خلايا فأرية وخلايا بشرية. قام 0 التعبير عن 5080080145 معدل بطريقة انتقائية للخلايا الحمراء بالتغلب على الآثار العكسية على تطعيم خلية جذعية مكونة للدم فأري وتطوير خلية 8 (انظر المثال 10 أعلاه) وأدت إلى استبعاد 801117 فعالة ومستويات عالية من ‎HOF‏ في خلايا حمراء مشتقة أساسية من ‎CD34‏ ‏بشرية ‎Ag‏ خلايا حمراء بشرية متمايزة في المعمل بعد ‎WIA‏ +0034 معدل بالتطعيم الكامل في طعمات فأرية. وقد أبدى المخترعون أيضا حث ‎HPF‏ فعال في خلايا ‎shes‏ مشتقة من خلايا 5 0034 محولة تم الحصول عليها من مانح مع مرض الخلية المنجلية.
في سلسلة من التجارب؛ تم تحويل 0034 منقول ب 605 من مانحين أصحاء مع ناقل التعبير عن ‎ShRNA‏ غير مستهدف ‎(LCR-NT)‏ أو ‎BMS11-D12G5‏ وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. ‎:shRNA BCL11A D12G5-2‏ حسي ‎ACGCTCGCACAGAACACTCATGGAT TctccatgtggtagagAATCCATGAGTG 5‏ ‎TGTGCGAG TTC‏ (متوالية بهوية )43:43( مضادة للحس ‎CGCACTCGCACAGAACACTCATGGAT TctctaccacatggagAATCCATGAGT‏ ‎CTGTGCGA GTT‏ (متوالية بهوية )44:03( ‎gle 127 Jal 10‏ عن مخطط وسترن ‎shes WIAD‏ متمايزة في المعمل مشتقة من خلايا 4 محولة تبين 861117 الأشكال الأيزومرية ‎(XL gL)‏ و8]-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 861117 ‎XL‏ الشكل 27ب يبين قياس استبعاد 8061117 في خلايا حمراء. البيانات مشتقة من مخططات وسترن كما هو مبين في الشكل 27أ. تلخص البيانات ثلاثة تجارب مستقلة استخدام ‎WA‏ من ‎mile‏ واحد. (أعمدة خطأ: ‎(SD‏ ‏15 الشكل 27ج يبين حث جاما جلوبين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة ‎RT-PCR‏ ‏وهيموجلوبين ‎(HOF)‏ مقيم بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . مثال 12 قياس استبعاد 801117 في خلايا حمراء . تمت دراسة تطعيم خلايا ‎+CD34‏ محولة في ‎NSG gl‏ معيبة ‎(Lelie‏ شاملة فعالية 0 الاستبعاد في الكائن ‎all‏ للتعبير عن /86111. تم تحويل ‎CD34‏ بشري مع ‎LOR-NT‏ أو ‎BMS11-D8GS5‏ وتم الحقن في فتئران ‎NSG‏ مستقبلة تم تعريضها للإشعاع دون قتل. تم عزل نخاع العظم +6034 بعد 14 أسبوع وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. الشكل 28 يبين حث جاما جلويين في خلايا حمراء كما هو مقيم بواسطة ‎RT-qPCR‏ ‏مثال 13 استبعاد 8011178 وحث هيموجلوبين جنيني في خلايا حمراء مشتقة من خلايا ‎CD34‏ محولة من خلية المنجلية لمريض.
تم عزل نخاع العظم 01034 معزولة من مريض ب مرض الخلية المنجلية تلقى علاج ‎HU‏ ‏وكانت له قيمة أساسية عالية ‎(HBF J‏ تم تحويل الخلايا مع ‎LOCR-NT‏ أو ‎LCR-D12G5‏ وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل.
تمت دراسة استبعاد 8011178 في خلايا ‎(ange‏ من الخلية المنجلية. تم ‎Jie‏ نخاع
العظم 6034 معزولة من الخلية المنجلية لمريض وتم تحويل الخلايا مع ‎LCR-NT‏ أو -05ا ‎WAY) 01265-2‏ غير المحولة المستخدمة كعينة مقارنة إضافية) وتم إخضاعها إلى التمايز الأحمر في المعمل. يبين الشكل 129 مخططات وسترن تبين 1 8611178 (صور ا وال أيزومرية) وم]-أكتين كعينة مقارنة للتحميل وتبين استبعاد فعال ل 11-/81011. كل صورة (مرقمة ب 6-1 تحت الخط) تمثل تجرية مستقلة باستخدام ‎WIA‏ من ‎mile‏ واحد. الشكل 29ب يبين
0 قياس استبعاد 801117 في خلايا حمراء. تبين البيانات المشتقة من مخططات وسترن المبينة في ‎Jal)‏ 29أ. يبين الشكل 29ج حث ‎HF‏ ناتج بواسطة كروماتوجراف سائل عالي الأداء . كان هذا المريض يتلقى علاج هيدروكسي محتسب لمستوى عالي من ‎Hb ٠‏ مثال 14 نموذج على بروتوكول العلاج
5 التقييم الأولي
سوف يخضع المرضى لعمل معياري ‎deh)‏ نخاع العظم ذاتي المنشاً انتقاليا وفقا لإرشادات معروفة؛ ويعد ذلك سوف يخضعون لاثنين من عمليات جمع نخاع العظم عند مدة لا تقل عن 4 أسابيع ‎ally‏ يمكن استخدامها لنخاع العظم (لا يقل عن 2 ‎x‏ 106 خلايا +0034/كجم) ولمجموعة من نخاع العظم ذاتي المنشاً للنقل الجيني (هدف بمقدار 5 ‎x‏ 106
خلايا 01034+/كجم مع ما لا يقل عن 4 ‎(p2S/CD34+ WIA 106 Xx‏ جمع طعم دعم ذاتية المنشأ
سوف يتم جمع الخلايا المكونة للدم من المريض سلفا قبل العلاج؛ لتكون بمثابة إجراء أخير طعمة ‎(Tae‏ يجب ألا تكون هناك عملية استخلاص لمكونات الدم لمدة 6 أسابيع بعد حقن خلايا تم تعديلها جينياء أو في حالة فشل ‎WAY‏ المعدلة في تلبية معايير الإطلاق. سوف يتم
جمع نخاع العظم (ما يصل إلى 20 سم مكعب/كجم) من المريض تحت تخدر عام من القمم الخلفية الحرقفية على كلا الجانبية بواسطة العديد من الثقوب عند مالا يقل عن 4 أسابيع قبل
العلاج الجيني. سوف يتم تجميد ‎gla‏ من نخاع العظم الذي يحتوي على 2 ‎x‏ 106 من خلايا +00034/كجم ويتم تخزينها غير معدلة في أبخرة نيتروجين سائلة ‎liquid nitrogen vapors‏ )2°162 2180-5( وفقا لإجراءات سريرية معيارية لجمع نخاع العظم ذاتي المنشاً ‎autologous‏ ‏6 لتكوين طعمة الدعم. سوف يتم اختيار بقية خلايا +0034 (الموضحة أدناه) والمستخدمة للجين المعدل (الموضح أدناه). جمع نخاع العظم سوف يتم استخدام بقية نخاع العظم المجمع أولا بشكل فائض عن الحاجة لدعم النخاع مع مجموعة نخاع العظم الثانية لنقل الجين. سوف تتم عملية الجمع الثانية في مدة لا تقل عن 4 أسابيع بعد عملية الجمع الأولى (الموضحة أعلاه). بالنسبة للمجموعة ‎(All‏ سوف يتم جمع نخاع 0 العظم من المريض تحت تخدير كامل من القمم الخلقية الحرقفية على كلا الموقعين بواسطة العديد من الثقوب. سوف تصل كمية النخاع المجمعة إلى 20 مل/كجم من وزن الجسم. وهذا سوف يعطي عدد ‎WA‏ منواة أكبر من -4 ‎X‏ 108 خلايا/كجم. وهذا بدوره يجب أن يعطي جرعة خلية 4+ أكبر من 4 ‎X‏ 106 خلايا/كجم بعد اختيار خلية ‎+CD34‏ ‏لن يتلقى الخاضعين الذين تم منهم جمع عدد +0034 المقدر > 4 ‎X‏ 106 خلايا/كجم 5 أي علاج. بعد مدة لا تقل عن 6 أسابيع؛ إذا كان الخاضع يود في البقاء في الدراسة؛ يمكن أن يتم جمع نخاع منه مرة أخرى. إذا كان الخاضع لا يرغب في الجمع مرة أخرى؛ سوف يتم سحبه من الدراسة. سوف يستمر الخاضعين المنسحبين من الدراسة قبل إعطاء خلايا ‎+CD34‏ محولة في الحصول على رعاية طبية طبيعية (رعاية دعمية و/أو خلية جذعية مكونة للدم انتقاليا خيفية). لن 0 “يتم تنفيذ تقييمات الفعالية والأمان من حيث الانسحاب ولن يتم جمع بيانات لهم في قاعدة البيانات. عزل خلية ‎+CD34‏ وإثارتها أوليا وتحويلها ‎dan‏ خلية 61034+. للسماح بوقت مناسبة من أجل تصفية عوامل التهيئة وتقليل وقت التحفيز الأولي والزراعة؛ سوف يتم حمل نخاع العظم طوال الليل. سوف يتم تنفيذ كل خطوات التصنيع في & ‎Connell‏ ‎Families Cell Manipulation Core Facility 5‏ لاااع4ا7© عند ‎١‏ -ا0ا. سوف يكون نخاع العظم خاليا من الخلايا الحمراء بواسطة الطرد المركزي تدريجي الشدة. سوف يتم اختيار
خلايا +0034 بشكل إيجابي من ‎WIA‏ نخاع العظم أحادية النواة ‎bone marrow‏ ‎mononuclear cells‏ باستخدام العامل الكاشف وأداة ‎.CliNIMACS‏ تم أخذ عينات ضوابط الجودة ‎(QC) Quality control‏ لتقييم النقاء والتعقيم. سوف تتم معالجة الخلايا المنقاة فورا من أجل التحفيز الأولي والتحويل. الحث الأولي والتحويل 1 ‎CD34+‏
سوف يتم تنفيذ التحويل على واحد من أو كلا المجموعتين. سوف يتم تحويل الخلايا في فائض دعم النخاع المستهدف من المجموعة الأولى وبتم تجميده للاستخدام المستقبلي. سوف يتم استخدام المجموعة الثانية لنقل جين كليا وسوف يتم دمج المنتج المحول من المجموعة الثانية مع الخلايا الذائبة المحولة من المجموعة الأولى بعد التهيئة.
يتم بذر خلايا +0034 المنقاة في أكياس مزرعة مغلقة بكثافة 1-0.5 ‎x‏ 106/مل في وسط خالي من المصل مكمل بعوامل نمو ‎(TPO (FLT3L (SCF (IL-3)‏ وتم وضعها على حاضن عند 2°37( 75 002. بعد 30-24 ساعة؛ يتم جمع الخلايا وعدها. تتضمن اختبارات ضوابط الجودة الإضافية فحص خلية حيوية؛ ووحدة تكوين مستعمرة ‎Colony Forming Unit‏ ‎(CFU)‏ يتم نقل الخلايا إلى كيس مزرعة جديد وتتم تهيئتها بالمادة الطافية الفيروسية البطيئة
‎Wlentiviral supernatant 5‏ بالنسبة لهذه الدورة الأولى من التحويل؛ تتم حضانة الخلايا لمدة 24-8 ساعات. بعد ذلك يتم جمع الخلايا وعدها ونقلها إلى كيس ‎cds‏ مع المادة الطافية الفيروسية البطيئة لدورة ثانية من التحويل. الجمع النهائي والصياغة
‏بعد الدورة الثانية من التحويل»؛ يتم جمع ‎(WA‏ يتم الغسل في بلازما لأايت ‎plasmalyte‏
‏0 وتتم إعادة التعليق في الصيغة النهائية ‎(HSAZ1 (PLASMALYTE)‏ بحجم 100-50 مل. سوف يتم دمج كل الخلايا المتاحة بعد إزالة عينات ضوابط الجودة في المريض. يتضمن عدد ‎QC‏ ‎(dS‏ حيوية؛ التعقيم على مادة ‎Jue‏ طافية ‎«wash supernatant‏ ميكويلازما ‎«Mycoplasma‏ إندوتوكسين ‎Endotoxin‏ على المادة الطافية والنمط الجيني؛ وحدة تكوين مستعمرة ¢ ‎RCL‏ (عينات مأخوذة ومحفوظة)؛ تحليل الإدخال وعدد نسخ ناقل متوسطة بواسطة
‎DAY) 9008 5‏ المزروعة). يتم أخذ عينة لبقعة ‎Gram‏ من المنتج فورا قبل التوصيل إلى المريض.
اختبار ما قبل ‎sale)‏ التسريب إلى الخاضع يتم جمع العينات أثناء ‎dey‏ نهاية الإجراء لعدد وحيوية الخلايا (استبعاد زرقة التريبان ‎trypan‏ أو ما يعادلها)؛ التعقيم» الميوكويلازما؛ فعالية التحويل (عدد نسخ الناقل ‎vector copy‏ ‎«(number‏ بقعة ‎«Gram‏ إندوتوكسين واختبار ‎(ROL‏ من بين ما سبق سوف تكون قياسات حيوية الخلية؛ التعقيم (في ‎lee‏ 72 ساعات)؛ بقعة ‎Gram‏ وإندوتوكسين متاحة قبل التسريب. إذا كانت المزارع الميكروبيولوجية تكشف عن التلوث البكتيري الانتقالي» بواسطة بقعة 0 أو مزرعة إيجابية عند 72 ساعة؛ سوف يقوم طاقم عمل ‎Cell Manipulation Core‏ ‎Facility‏ بملامسة ‎Pl‏ يقرر المدير الطبي المساعد والطبيب المقيم ما إذا كان سيتم تسريب مجموعة الدعم أو تسريب المنتج مع تغطية بالمضاد الحيوي. إذا تم تسريب مجموعة ‎cae all‏ سوف يتم سحب الخاضع من البروتوكول. إذا كانت حيوية الخلية <770؛ يكون اختبار التعقيم إيجابي؛ أو إندوتوكسين > 5 لا/كجم/ساعة؛ لن تتم إعادة ‎(WAN‏ سوف يتم تسريب مجموعة الدعم وسوف يتم تسريب الخاضع من البروتوكول. إذا كان عدد ‎WAN‏ الحية من كلا المجموعتين/عمليات التحويل أكبر من أو يساوي 4 ‎X‏ ‏6 خلايا +0034/كجم عند طرف التحويل؛ سوف يتم تسريب الخلايا. إذا كانت الخلية الحية 5 من كلا المجموعتين /عمليتي التحويل أقل من 4 ‎Wa 106 x‏ +0034/كجم عند طرف التحويل» لن يتم تسريب الخلايا وسوف يتم تسريب مجموعة الدعم بعد 48 ساعة. نظام تهيئة الخاضع سوف يتلقى الخاضعون تهيئة نقوية الجذ مع بوسولفان ‎Busulfan‏ )~4 ملجم/كجم وربديا يومياء المعدلة للوزن؛ (المحددة على مدار 3 ساعات مرة يوميا) الذي يتم إعطاؤه في الأيام -4 0 إلى -2؛ قبل تسريب ‎WAN‏ المحولة. سوف تتم التهيئة المتزامنة مع التنقية وتحويل خلايا نخاع العظم. سوف يتم سحب مستويات بوسولفان على كل عمليات الإعطاء في الأيام ‎ADA‏ وسوف يتم استخدام المستويات في الأيام 1 و2 لتعديل المنطقة تحت المنحنى المستهدف. تسريب الخلايا المحولة سوف يتم تسريب الخلايا وريديا على مدار 45-30 دقيقة بعد التميه الأولي المعياري 5 ونعادة المعالجة ‎Gy‏ للإرشادات المعيارية لوحدة زراعة الخلية الجذعية المكونة للدم انتقاليا بمستشفى بوسطن. تتطلب هذه المعايير أن يكون المريض تحت ماقبة قلبية مستمرة وتنفسية
وتشبع بأوكسيجين خلال التسريب ولمدة 30 دقيقة بعد ذلك. سوف يتم قياس الإشارات الحيوية ‎ping‏ ‏تسجيلها أولياء بعد 15 دقيقة من التسريب؛ كل ساعة من التسريب تسريب؛ ونهاية التسريب. سوف تظل ار ان لل مع المريض لمدة أول 5 دقائق من التسريب. إذا كان هناك اثنين من المنتجات التي تم إعطاؤها؛ سوف يتم إعطاء المنتج الثاني المحول بدون تأجيل الأول.
سوف يتم فهم أنه إذا تم شرح الاختراع ‎Lad‏ يتعلق بالوصف المفصل ‎Del‏ من المقصود أن يقوم الوصف السابق بشرح وعدم تقييد منظور الاختراع؛ والتي يتم تحديدها بواسطة منظور عناصر الحماية الملحقة. هناك جوانب أخرى ومزايا وتعديلات متضمنة في منظور عناصر الحماية التالية.
0 المراجع ‎Lee, Y. et al., The nuclear RNase lll Drosha initiates microRNA 1.‏ ‎processing.
Nature 425, 415-419 (2003).‏ ‎Ha, M. and Kim, V.
N., Regulation of microRNA biogenesis.
Nature 2.‏ ‎reviews.
Molecular cell biology 15, 509-524 (2014).‏ ‎Winter, J. et al., Many roads to maturity: microRNA biogenesis 3. 15‏ ‎pathways and their regulation.
Nature cell biology 11, 228-234 (2009).‏ ‎Khvorova, A. et al., Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand 4.‏ ‎bias.
Cell 115, 209-216 (2003).‏ ‎Schwarz, D.
S. et al., Asymmetry in the assembly of the RNAI 5.‏ ‎enzyme complex.
Cell 115, 199-208 (2003). 0‏ ‎Lai, E.
C., Micro RNAs are complementary to 3' UTR sequence 6.‏ ‎motifs that mediate negative post-transcriptional regulation.
Nature‏ ‎genetics 30, 363-364 (2002).‏ ‎Lewis, B.
P. et al., Prediction of mammalian microRNA targets.
Cell 7.‏ 5 .)2003( 787-798 ,115
Park, J. E. et al., Dicer recognizes the 5' end of RNA for efficient 8. and accurate processing. Nature 475, 201-205 (2011).
Grimm, D. et al., Fatality in mice due to oversaturation of cellular 9. microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441, 537-541 (2006).
McBride, J. ‏.ا‎ et al., Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated 10. 5 toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAI.
Proc Natl Acad Sci U S A 105, 5868-5873 (2008).
Khan, A. A. et al., Transfection of small RNAs globally perturbs 11. gene regulation by endogenous microRNAs. Nat Biotechnol 27, 549-555 (2009). 0
Yi, R. et al., Overexpression of exportin 5 enhances RNA 12. interference mediated by short hairpin RNAs and microRNAs. RNA 11, 220-226 (2005).
Borner, K. et al., Robust RNAi enhancement via human Argonaute- 13. 2 overexpression from plasmids, viral vectors and cell lines. Nucleic Acids 15
Res 41, e199 (2013).
Grimm, D. et al., Argonaute proteins are key determinants of RNAI 14. efficacy, toxicity, and persistence in the adult mouse liver. The Journal of clinical investigation 120, 3106-3119 (2010).
Diederichs, S. and Haber, D. A., Dual role for argonautes in 15. 20 microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell 131, 1097-1108 (2007).
Persengiev, 5. P. et al., Nonspecific, concentration—-dependent 16. stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA 10, 12-18 (2004). 25
Fish, R. J. and Kruithof, E. K., Short-term cytotoxic effects and 17. long-term instability of RNAI delivered using lentiviral vectors. BMC Mol
Biol 5, 9 (2004).
Jackson, A. ‏.ا‎ and Linsley, P. S., Recognizing and avoiding siRNA 18. off-target effects for target identification and therapeutic application. Nat 5
Rev Drug Discov 9, 57-67 (2010).
Martin, J. N. et al., Lethal toxicity caused by expression of shRNA 19. in the mouse striatum: implications for therapeutic design. Gene Ther 18, 666-673 (2011).
Zeng, Y. et al., Both natural and designed micro RNAs can inhibit 20. 10 the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells.
Molecular cell 9, 1327-1333 (2002).
Fellmann, C. et al., An optimized microRNA backbone for effective 21. single-copy RNAi. Cell Rep 5, 1704-1713 (2013).
Amendola, M. et al., Regulated and multiple miRNA and siRNA 22. 15 delivery into primary cells by a lentiviral platform. Mol Ther 17, 1039- 1052 (2009).
Sankaran, V. G. et al., Human fetal hemoglobin expression is 23. regulated by the developmental stage-specific repressor 8011
Science (New York, N.Y 322, 1839-1842 (2008). 0
Xu, J. et al., Correction of sickle cell disease in adult mice by 24. interference with fetal hemoglobin silencing. Science 334, 993-996 (2011).
Cullen, B. R., Derivation and function of small interfering RNAs and 25. microRNAs. Virus Res 102, 3-9 (2004). 25
Moffat, J. et al., A lentiviral RNAI library for human and mouse 26. genes applied to an arrayed viral high—content screen. Cell 124, 1283- 1298 (2006).
Xu, J. et al., Transcriptional silencing of {gamma}-globin by 27.
BCL11A involves long-range interactions and cooperation with SOX6. 5
Genes Dev 24, 783-798 (2010).
Weber, K. et al., Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped 28. with novel drug-selectable fluorescent proteins: new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther 17, 511-520 (2010).
Wilber, A. et al., Therapeutic levels of fetal hemoglobin in erythroid 29. 10 progeny of beta-thalassemic CD34+ cells after lentiviral vector-mediated gene transfer. Blood 117, 2817-2826 (2011).
Liu, P. et ‏.اه‎ BCL11A is essential for normal lymphoid 30. development. Nat Immunol 4, 525-532 (2003).
Yu, Y. et al., BCL11A is essential for lymphoid development and 31. 15 negatively regulates p53. J Exp Med 209, 2467-2483 (2012).
Miccio, A. et al., In vivo selection of genetically modified 32. erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta- thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 105, 10547-10552 (2008). 0
Demaison, C. et al., High-level transduction and gene expression 33. in hematopoietic repopulating cells using a human immunodeficiency [correction of imunodeficiency] virus type 1-based lentiviral vector containing an internal spleen focus forming virus promoter. Hum Gene
Ther 13, 803-813 (2002). 5
Hansbury, E. N. et al., Bone marrow transplant options and 34. preferences in a sickle cell anemia cohort on chronic transfusions. Pediatr
Blood Cancer 58, 611-615 (2012).
Andreani, M. et al., Quantitatively different red cell nucleated cell 35. chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed 5 chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica 96, 128-133 (2011).
Cartier, N. et al., Hematopoietic stem cell gene therapy with a 36. lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science (New York,
N.Y 326, 818-823 (2009). 10
Biffi, A. et al., Lentiviral Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy 37.
Benefits Metachromatic Leukodystrophy. Science (New York, N.Y, (2013).
Aiuti, A. et al., Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in 38. patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science 341, 1233151 (2013). 5
Cavazzana-Calvo, M. et al., Transfusion independence and 39.
HMGA?2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia.
Nature 467, 318-322 (2010).
Wu, X. et al., BCL11A controls FIt3 expression in early 40. hematopoietic progenitors and is required for pDC development in vivo. 20
PLoS One 8, e64800 (2013).
Ippolito, 6. C. et al., Dendritic cell fate is determined by BCL11A. 41.
Proc Natl Acad Sci ‏ل‎ 5 A 111, E998-1006 (2014).
Roselli, E. A. et al., Correction of beta-thalassemia major by gene 42. transfer in haematopoietic progenitors of pediatric patients. EMBO Mol 25
Med 2, 315-328 (2010).
Zychlinski, D. et al., Physiological promoters reduce the genotoxic 43. risk of integrating gene vectors. Mol Ther 16, 718-725 (2008).
Zhang, H. et al., Single processing center models for human Dicer 44. and bacterial RNase III. Cell 118, 57-68 (2004).
Vermeulen, A. et al., The contributions of dsRNA structure to Dicer 45. 5 specificity and efficiency. RNA 11, 674-682 (2005).
Chiang, H. R. et al., Mammalian microRNAs: experimental 46. evaluation of novel and previously annotated genes. Genes Dev 24, 992- 1009 (2010).
Frank, F. et al., Structural basis for 5'-nucleotide base-specific 47. 10 recognition of guide RNA by human AGO2. Nature 465, 818-822 (2010).
Giarratana, M. C. et al., Proof of principle for transfusion of in vitro— 48. generated red blood cells. Blood 118, 5071-5079 (2011).
Grimson, A. et al., Early origins and evolution of microRNAs and 49.
Piwi-interacting RNAs in animals. Nature 455, 1193-1197 (2008). 5 ‏التخليقية‎ MIR ‏قائمة أوليجونيكلوتيدات‎ :BCL11A 00141 ‏أوليجوهات‎ ‏حصي‎ ‎ACGCTCGCACAGAACACTCATGGAT TcteccatgtggtagagAATCCATGAGTG 0 ‏(متوالية برقم هوية:1)‎ TTCTGTGCGag ‏مضادة للحس‎
CGCACtCGCACAGAACACTCATGGATT TctctaccacatggagAATCCATGAGTG ‏(متوالية برقم هوية:2)‎ 1101616068 5 :BCL11A 00142 ‏أوليجوهات‎
حسي ‎ACGCTCCAGAGGATGACGATTGTTTActccatgtggtagagTAAACAATCGTC‏ ‎ATCCTCTGGag‏ (متوالية برقم هوية:3) مضادة للحس ‎CGCACtCCAGAGGATGACGATTGTTTActctaccacatggagTAAACAATCGTC‏ ‎ATCCTCTGGa‏ (متوالية برقم هوية:4) 3 801118 أوليجوة: 0 حسي ‎ACGCTTCGGAGACTCCAGACAATCGCctccatgtggtagagGCGATTGTCTG‏ ‎GAGTCTCCGAag‏ (متوالية برقم هوية:3) مضادة للحس ‎CGCACtTCGGAGACTCCAGACAATCGCctctaccacatggagGCGATTGTCTG 5‏ ‎GAGTCTCCGAa‏ (متوالية برقم هوية:6) ‎BCL11A 8‏ أوليجوة: حسي ‎ACGCTTTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagagTCTGTGCGTGTT‏ ‎GCAAGAGAAag 20‏ (متوالية برقم هوية:7) مضادة للحس ‎CGCACtTTCTCTTGCAACACGCACAGActctaccacatggagTCTGTGCGTGTT‏ ‎GCAAGAGAAa‏ (متوالية برقم هوية:8) 5 ووليجوهات ‎BCL11A XLC4‏ أر ‎:C4‏ ‏حسي
‎ACGCTACAGTACCCTGGAGAAACACActccatgtggtagagTGTGTTTCTCCA‏ ‎GGGTACTGTag‏ (متوالية برقم هوية:9) مضادة للحس ‎CGCACtACAGTACCCTGGAGAAACACActctaccacatggagTGTGTTTCTCCA 5‏ 838 (متوالية برقم هوية:10) أوليجوهات غير مستهدفة: حصي ‎ACGCTCAACAAGATGAAGAGCACCAActccatgtggtagagTTGGTGCTCTTC 0‏ 810116119 (متوالية برقم هوية:11) مضادة للحس ‎CGCACctCAACAAGATGAAGAGCACCAActctaccacatggagTTGGTGCTCTTC‏ ‎ATCTTGTTGa 5‏ (متوالية برقم هوية:12) 365 801118 أو أوليجوهات ‎:E3 mod‏ (نسخة معدلة) حسي ‎ACGCTGCGCTCGGAGACTCCAGACAActccatgtggtagagTTGTCTGGAGT‏ ‎CTCCGAGCGCag‏ (متوالية برقم 13:49( مضاد للحس ‎CGCActGCGCTCGGAGACTCCAGACAActctaccacatggagTTGTCTGGAGT‏ ‎CTCCGAGCGC‏ #(متوالية برقم هوية:14) أوليجوهات 0865 ‎BCL11A‏ أو ‎:D8 mod‏ (نسخة معدلة) حصي ‎ACGCTGCGCTTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAA 5‏ 9 (متوالية برقم هوية:15)
مضاد للحس ‎CGCACctGCGCTTCTCTTGCAACACGCActctaccacatggagTGCGTGTTGCA‏ ‎AGAGAAGCGC‏ #(متوالية برقم هوية:16) أوليجوهات 241-0465 ‎:BCL11A‏ (نسخة معدلة) حسي
ACGCTGCGCACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGT ‏برقم هوية:17)‎ Ll) ACTGTGCGCag ‏مضاد للحس‎
CGCACctGCGCACAGTACCCTGGAGAAActctaccacatggagTTTCTCCAGGG 0 ‏(متوالية برقم هوية:18)‎ TACTGTGCGCa miR1
CGCACAGAACACTCATGGATT TctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTG ‏(متوالية برقم هوية:25)‎ TGCG (E3 ‏أو‎ shRNAL)
TCGGAGACTCCAGACAATCGCctccatgtggtagagGCGATTGTCTGGAGTCT ‏(متوالية برقم هوية:26)‎ CCGA ‎shRNA2) 0‏ أو 85 ( ‎CCTCCAGGCAGCTCAAAGATCctccatgtggtagagGATCTTTGAGCTGCCTG‏ ‏0 (متوالية برقم هوية:27) ‎shRNA3)‏ أو ‎(D8‏ ‎TTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagagTCTGTGCGTGTTGCAAG 5‏ ‎AGAA‏ (متوالية برقم هوية:25)
‎shRNA4)‏ أو ‎(B11‏ ‎TCAGGACTAGGTGCAGAATGTctccatgtggtagagACATTCTGCACCTAGTC‏ ‏68 01 (متوالية برقم هوية:29) ‎shRNA3) 5‏ أو ‎50D12‏ أو ‎(D12‏ ‎GATCGAGTGTTGAATAATGATctccatgtggtagagATCATTATTCAACACTCG‏ ‎ATC‏ (متوالية برقم هوية:30) ‎6shRNA)‏ أو ‎S50A5‏ أو ‎(AS‏ ‎CAGTACCCTGGAGAAACACATctccatgtggtagagATGTGTTTCTCCAGGGT‏ ‎ACTG 0‏ (متوالية برقم هوية:31) ‎shRNAT)‏ أو ‎(50B11‏ ‎CACTGTCCACAGGAGAAGCCActccatgtggtagagTGGCTTCTCCTGTGGAC‏ ‎AGTG‏ (متوالية برقم هوية:32) ‎shRNAGS)‏ أو ‎(50C4‏ ‎ACAGTACCCTGGAGAAACACACctccatgtggtagagTGTGTTTCTCCAGGGTA 5‏ ‎CTGT‏ (متوالية برقم هوية:33) 0141 ‎gcgcCGCACAGAACACTCATGctccatgtggtagagCATGAGTGTTCTGTGCGg‏ ‏6 (متوالية برقم هوية:34)
‎shRNA1mod)‏ أو ‎(E3G5‏ ‎gcgc TCGGAGACTCCAGACAActccatgtggtagagTTGTCTGGAGTCTCCGAg‏ 6 (متوالية برقم هوية:35)
‎shRNA2mod)‏ أو ‎(B5G5‏ ‎gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAActccatgtggtagagTTTGAGCTGCCTGGAGGY‏ ‏6 (متوالية برقم هوية:36) ‎shRNA3mod) 5‏ أو ‎(D8G5‏ ‎gcgc TTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAAGAGAAge‏ 6 (متوالية برقم هوية:37) ‎shRNA4mod)‏ أو ‎(B11G5‏ ‎gcgcTCAGGACTAGGTGCAGActccatgtggtagagTCTGCACCTAGTCCTGAg 0‏ 6 (متوالية برقم هوية:38) ‎shRNAS5mod)‏ أو 005 أو ‎(D12G5‏ ‎gcgcGATCGAGTGTTGAATAActccatgtggtagagTTATTCAACACTCGATCge‏ ‏15 96 (متوالية برقم هوية:39) ‎shRNAGmod)‏ أو ‎(50A5G5‏ ‎gcgcCAGTACCCTGGAGAAACC tccatgtggtagagGTTTCTCCAGGGTACTGg‏ 6 (متوالية برقم هوية:40)
‎shRNA7mod)‏ أو ‎(50B11G5‏ ‎gcgcCACTGTCCACAGGAGAActccatgtggtagagTTCTCCTGTGGACAGT Gg‏ 6 (متوالية برقم هوية:41)
(C4G5 ‏أو 006465 أو‎ shRNA8mod) gcgcACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGTACTGTge ‏(متوالية برقم هوية:42)‎ 6 ‏حسي‎ :(ShRNA BCL11A D12G5-2)
ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT TctccatgtggtagagAATCCATGAGTG 5 (43:58) ‏(متوالية بهوية‎ TTCTGTGCGAG ‏مضادة للحس‎ :(ShRNA BCL11A D12G5-2)
CGCACTCGCACAGAACACTCATGGATT TctctaccacatggagAATCCATGAGT (44:53) ‏(متوالية بهوية‎ GTTCTGTGCGA -5 10
CCGGCGCACAGAACACTCATGGATTCTCGAGAATCCATGAGTGTTCTG
(80:8) ‏(متوالية بهوية‎ 3-16061111 "CGCTCGCACAGAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGT (87:08) ‏'(متوالية بهوية‎ 3-8616 10161606 5 5 "CGCTGCGCCGCACAGAACACTCATGctccatgtggtagagCATGAGTGTTCT ‏بهوية رقم:85)‎ llgia)’3-GTGCGGCGCAGTG -5
CCGGACAGTACCCTGGAGAAACACACTCGAGTGTGTTTCTCCAGGGTA 20 (89:08) ‏(متوالية بهوية‎ 3-01611111 -5
CGCTACAGTACCCTGGAGAAACACACctccatgtggtagagTGTGTTTCTCCAG (90:8) ‏"(متوالية بهوية‎ 3-AGTG GGTACTGT
’CGCTGCGCACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGT (91:48, ‏(متوالية بهوية‎ 3-ACTGTGCGCAGTG 5
CCGGTTCTCTTGCAACACGCACAGACTCGAGTCTGTGCGTGTTGCAAG 5 (92:48) ‏'(متوالية بهوية‎ 3-AGAATTTTT 5 ’CGCTTTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagag TCTGTGCGTGTTG (93:48) ‏'(متوالية بهوية‎ 3-CAAGAGAAAGTG 5 0 ’CGCTGCGCTTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAA (94:48, ‏'(متوالية بهوية‎ 3-GAGAAGCGCAGTG 5
CCGGGATCGAGTGTTGAATAATGATCTCGAGATCATTATTCAACACTCG
(95:48) ‏(متوالية بهوية‎ 3-ATCTTTTT 5 ”-5
CGCTGATCGAGTGTTGAATAATGATctccatgtggtagagATCATTATTCAACA (96:4) ‏بهوية‎ ls)’ 3-8616 CTCGATC 5 ’CGCTGCGCGATCGAGTGTTGAATAActccatgtggtagagTTATTCAACACTC 0 (97:48) ‏'(متوالية بهوية‎ 3-GATCGCGCAGTG
I
قائمة التتابع: ل القواعد الاقل بالخط المائل- حلقة ‎shRNA‏ ‏"ب" ‎ShRNA‏ قواعد الحالة العليا بالخط السميك- متوالية استهداف ‎ALL‏ 3801 لتكوين ب" القواعد الموضوع تحتها خط-نهايات استنساخ(تخليقي) 2 استبعاد تكويني (تقييم سمي ووظيفي) 'و حس او مضاض للحس از" اوليجونيكلوتيدات 1 ‎miR‏ 501118 0 "جح (توالية برقم هوية:1) اط (متوالية برقم هوية:2) يي" (متوالية برقم هوية:3) كك (متوالية برقم هوية:4) ل" اوليجونيكلوتيدات 2 ‎miR‏ 501118
و استبعاد ان استبعاد حثي (تقييم الجرعة والوظيفة) 'س" -- امتبعاد خطي انتقائي (اختيار علاجي) 2 في الكائن الحي : ‎LSK-HSC‏ مزروعة مستنبتة اف" في المعمل : خلايا اللوكيميا الارومية الحمراء لفأز اص" 7 جلولين لفأر 3 نخاع عظم مفصل ‎Venus‏ -8220 2 الحث 20 مرة اش" التعبير عن ‎MRNA‏ نسبة الى ‎Gapdh‏ ‏0 ات" التعبير عن 801118 نسبة الى ‎Gapdh‏ ‏انث" تقوم ‎LV-SFFV‏ باستبعاد 3801118بفاعلية وتثير التعبير عن 47-جلويولين 4 تقوم ‎LOR/TET-LV‏ باستبعاد 3801118بفاعلية وتثير التعبير عن 47-جلوبولين ‎:TET-LV ik‏ اعتماد على جرعة إثارة دوكسي سيكلين ‎LCR-LV a",‏ : آثار نقل ‎MOI‏ أعلى 5 "1" حث 150 طية 'ب1" خث 5 طيات ‎Ig!‏ التعبير عن جلويين ‎mRNA‏ نسبة الى ‎Gapdh‏ ‎"1a‏ 7 جلولين "1" نقطة زمنية (يوم) و1" اليوم ‎"Ty‏ عدد الخلايا ‎Le‏ التعبير عن جلويين معيار ب ‎Gapdh‏ ‎"LW‏ تتمايز ©0034+115 المنقولة خارج الكائن الحي في الخلايا الأرومية الحمراء وتعبير عن ‎Hbf‏ ‏25 ي1" تمدد خلايا ‎CD34+BM‏ (موجه-متبرع طبيعي) 'ك 1" 1 ‎SSFV-LV‏
‏منقولة إلى‎ SCD ‏من مرضى لديهم‎ CD34+HSCs ‏بنقل‎ LCR-LV ‏قامت‎ "1J
NSG
LCR-LV NT "1
LCR-LV mir-1 "1
HbF ‏س1"‎ 5
SSFV-LV mir-1 "Ig
SFFV-LV NT "1 ‏"لص 1" فحص قدرة السمية لدور 801118 في تطوير ليمفوي‎
Gapdh ‏التعبير عن 004118801118 نسبة الى‎ "14 ‏مرة‎ MS=5 100 ‏بواسطة فينوس على‎ فنصما١‎ 01034115 "1 10 ‏ش1" - موجه‎ ‏حلقة‎ lo ‏"ث1" ناقل‎
RNA Pol ١١ ‏استنساخ‎ "1
RNA Pol lll ‏ذ1" استنساخ‎ 0 5
ShRNAs ‏في مقابل‎ shRNAs ‏مهيا" ب‎ RNA ‏دقيق‎ "1x"
PLKO ‏باستخدام موحه‎ ShRNA ‏تستهدف مراقبة‎ Bell 1A "2
QPCR adhe "2
GAPDH ‏نسبة الى‎ ACtE-Y 2
XL/L-d sie (n=70) ‏د2'‎ 20
Lan )CDSXL=35) "2a"
Laain)3UTRXL=13) "24 ‏مراقبة05م-‎ "27 ‏الى تلك غير المحولة)‎ LuwmCherry MFI) "27
RNA Pol lI ‏ط2"‎ 25
RNA Pol ١١ "24
24" استبعاد ‎A‏ 80111 وحث ‎E-Y‏ في اساسات 1160مو60ا ‎2J‏ شدة نطاق نسبية م2 غير مستهدف 2" 801118 س2" أكتين ع2 ‎pLKO‏ ‎Lego "2‏ ‎XL/L 2a‏ ‎XL 23‏ 0 ,2 حث ‎GAPDH/ ai 6-١7‏ ‎SD 2‏ + متوسط ‎mIR1 pLKO "2‏ ا ث2" ‎C4 pLKO‏ ‎miR-1 LEGO "2‏ ذ2' ‎C4 LEGO‏ ‎mIR-1 pLKO 2a‏ ‎mIR1 "3‏ ‎C4G5 "3‏ ‎LEGO "3"‏ 0465 ‎LEGO 38 20‏ 0141-65 ‎"3a‏ قراءات 3 متوالية توجيه ‎Passenger KB)‏ ‎3g‏ متالية برقم هوية: 5 - طذ' مرشحات من /80111 يستهدف مراقبة ‎ShRNA‏ باستخدام موجه ‎PLKO‏ ‏'ي3" .| تركيب وتوزيع متوالية جديلة موجهة في ‎PLKO‏
ك3 جديلة توجيه تركيب وتوزيع متوالية جديلة موجهة في ‎LEGO‏ ‏م3 تصميم ‎ShRNAS‏ جديدة لتقليد الجدائل الموجهة الناضجة التي تم إنتاجها في موجه ‎pLKO‏ ‏ا تركيب وتوزيع متوالية جديلة موجهة في ‎LEGO‏ معدلة أس 3 معدل ‎"3g"‏ مستهدف ‎LM "34‏ 3" مقارنة استبعاد 8061117 بواسطة متواليات توجيه معدلة ‎PLKO 33 0‏ موجدم- 3" 60 اموجه ا- 3 توجيه ات3" مقارنة التعبير عن ‎MIR‏ بواسطة متوالية توجيه معدلة ث3" ‎NT‏ ‎P-pLKO 315‏ ‎L-pLEGO 33‏ ‎LM-pLEGOJae "3‏ ‎RNA 41‏ ‎XLD12 "4‏ ‎XLB11 "4" 20‏ 43" كما ‎XLC4 "4a‏ 44" الصورة الأيزومرية ‎XLJL‏ ‏'ز 4" الصورة الأيزومرية ‎XL‏ ‏5 "ح4 الجديلة الموجهة 4%" جدلية ناقلة للارسال s rRNA 5 "4 4" المرجع
MODLEGO "40 و المعالجة المتمايزة في نواقل ‎SARNA‏ ا(١-اا0م‏ ونواقل ‎SNRNA‏ مهيأة بواسطة pol-Il microRNA 5 po AY
Pol lll shRNA "44
Pol ١١ shRNA 2 'ف4" | ‎ACTIN‏ ‏0 ص4" مرقبة ‎FACS‏ (حث طية ‎(mCherry MFI‏ 3 حسي mir223 "4 5 sachbb-y "4 ( ACt Hbb-y ‏نسبة الى‎ qPCR ) Gapdh ‏مراقبة‎ eh
Pol ١١١ "4 ‏اث‎ 15
Pol ١١ 4
Term "43
SFFV "4
LEGO-SFFV-BCL11A-shRNA 5
LKO-U6-BCL11A-shRNA "5 20 pol ll ‏نسخ قائم على اساس بوليمراز‎ "Sz
Bs U5 shRNA Sa pol ١١ ‏نسخ قائم على اساس بوليمراز‎ "Sy ‏ناقل إرسال‎ "53 25 shRNAmIR ‘Se!
shRNAmiRmod "54"
Pol ١١ M ‏ي5'‎ ‏نسبي‎ ١100-7 "Sal
POI Il ‏معدل بالنسبة لنسخ قائم على اساس بوليمراز‎ "SJ
Pol II Mod ‏لم5‎ 5
HBF "5
HBF (HPLC) "Su ‏النسبة من المجموعة الكلية‎ Sg ‏جلويين‎ (MRNA (qPCR "5
PIIM "Sua 10
PBw4 "58
PBwS '5)
BMw12 "SU ‏غير محول‎ "Sd ‏مزروعة انتقاليا‎ WIA ‏ث5"‎ 15 ‏مائع‎ 5 "5 ‏نمائع نسبة‎ 5 "5
BFP "Soa" cd45,2 "61"
Venus "6 20
CD45 "oz" ‏غير مستهدف‎ Bellla ‏استهداف‎ "6. ‏في نخاع العظم‎ Venus + +CD45 ‏نسبة خلايا 8 من‎ "62" oa Venus + ‏من خلايا /10-81ا في‎ LSK ‏"و6" نسبة‎ ‏التعبير النسبي‎ '6y 25
LSK "oz"
‏خلايا‎ "6k" ‏خلايا حبيبية‎ 6
SFFV-shRNAmMIR .LCR-shRNAmIR vs "6 sinLTR ‏'ل6"‎ ‎HS3 ‏لم6"‎ 5 52 ‏أن6'‎ ‎pA ‏س6"‎ ‎cPPT "0g"
RRE "6
LCR-BCL11AshRNAmMIR "60" 10 ‏#«جلويين‎ 63 ‏'ر6' العدد نسبي‎
GpA "6
LCR-shRNAmMIiRNT "6 *CR-shRNAmMIR '6&’ 15
LCR-shRNAmMIRSY "oF"
LCR-shRNAmMIR3 '6Y —-CD71-/GpA "6a -CD71+/GpA 7 ‏جلويين‎ MRNA ‏ب7"‎ 20 +CD71+/GpA "Tz! ‏نسبة المجموعة الكلية‎ UT
SFFV-GFP ry
LCR-shRNAmMIR "Ts ctrl "Ty 5 untrans ie
Jurkat aN
MCF 74
All "7 ‏اك‎ ‎AS 7ل‎ ‏م7 (لجديلة غير المنطقية) الطرف‎ 5
ShRNA ‏تردد قراءة متوسط لكل‎ 70
CD3 "To
CD11b Te! ssc Td
TER ‏ص7"‎ 0 shes ‏'ق7” خلايا‎ ‏'ر7 خلايا نقوية‎ -8/7 ‏خلايا‎ MT
CD 45- ‏مبوب على‎ TS
CD 45- pe ‏مبوب على‎ TE 5 rel. BCL11A/B-ACTIN ve
VCN "Ty
B-ACT "7 )- ‏/جلوبين‎ 7 8
HPLC(HBF) 8 20
D12G5-2 ‏و8"‎ ‏86و جلوبين‎ "84 ‏محول‎ "8a" duced "8
BCL11A/B-ACTIN. sus 83 25
‎Se!‏ استبعاد 801117 بواسطة متواليات في كل من الاساسات ‎SFFV‏ و ‎ALCOR‏ ‎WIA‏ حمراء متمايزة بواسطة ‎CD34‏ ‎LEGO-SFFV-shRNAMIR EIN‏ ي 8" ‎LV-LCR-shRNAmIR‏ ‎cd71 8g 5‏

Claims (1)

عناصر الحماية
1. حمض نووي رببوزي دقيق ‎(MicroRNA) micro-Ribonucleic acid‏ لجزء 501118 تخليقي يتضمن: 1 جزء ‎BCL11A‏ أول؛ جزء حلقي ‎tloop segment‏ و ب) ‎ga‏ 301118 ثاني مجهز ترادفيا في إتجاه 5" إلى 53 حيث الجزء الحلقي ‎loop segment‏ موجود بين ومرتبط بشكل مباشر بجزئي 301118 الأول والثاني؛ و حيث ‎gi‏ 301118 الأول ‎fan‏ مع -©006- عند الطرف 5 وينتهي ‎gia‏ 301118 الثاني مع ‎—GOGC-‏ عند الطرف 3 و حيث جزءِ 301118 الأول مكمل لجز 301118 الثاني بحيث يكون ‎(Sa‏ 301118 الأول والثاني زوج قاعد لتكوين حلقة دبوسية ‎hairpin loop‏ مع الجزءِ الحلفي ‎loop segment‏ الذي يكون 0 النجزء الحلقي ‎Joop segment‏ للحلقة الدبوسية ‎hairpin loop‏ الذي تم تكوينه بالتبعية.
2. الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجزء ‎BCL11A‏ التخليقي ‎ly‏ ‏لعنصر الحماية 1؛ حيث جزئي 8011178 الأول والثاني بطول حوالي 18 إلى 25 نيكلوتيدات
‎.nucleotides‏ ‏15
‏3. الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجزء 501.118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1 ‎Cua‏ يحتوي جزءِ 301.118 الأول على متوالية مشتقة من متوالية الحمض النووي الريبوزي المرسل ‎(mRNA) Messenger Ribonucleic acid‏ لجن ‎.BCL11A‏ ‏20 4. الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجزء 501118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1 حيث ‎gia dai‏ 301118 الأول على متوالية نيوكليوتيد ‎nucleotide‏ تم توضيحها أعلاه في أي واحدة من المتواليات بهويات أرقام: 57( 58 59 60 61 ¢62 63؛ 564 65.
5. الحمض النووي الرببوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجز 301118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1 حيث ‎gia dai‏ 301118 الأول على متوالية نيوكليوتيد ‎nucleotide‏ تم توضيحها أعلاه في المتوالية بهوية رقم 61.
6. الحمض النووي الرربوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجز ‎BCL11A‏ التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث أن الجزء الحلفي ‎loop segment‏ مشتق من الحمض النووي الريبوزي الميكروي ‎-micro-Ribonucleic acid‏
7. الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجن 80118 التخليقي ‎Lai,‏ ‏0 لعنصر الحماية 1؛ حيث أن الجزء الحلفي ‎loop segment‏ مشتق من الحمض النووي الريبوزي الميكروي ‎micro-Ribonucleic acid‏ المختار من المجموعة المكونة من ‎«miR-155 «miR-142:‏ ‎miR-181‏ و0116-223.
6. الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجن 80118 التخليقي وفقاً 5 لعنصر الحماية 1؛ حيث أن الجزء الحلفي ‎loop segment‏ مشتق من الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ الذي تم اختياره من 011-223.
9. الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجن 80118 التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل الجزءِ الحلقي ‎Toop segment‏ على متوالية بولى نيوكليوتيد ‎polynucleotide ~~ 0‏ تم توضيحها أعلاه في المتوالية بهوية رقم: 68.
0. الحمض النووي الرربوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجن ‎BCL11A‏ التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل الحمض النووي الريبوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ الأول على متوالية بولي نيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ تم توضيحها أعلاه في أي واحدة من المتواليات بهويات أرقام: 34 35 36 37 38 39« 40 41 و 42
1. الحمض النووي الرربوزي الدقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجن ‎BCL11A‏ التخليقي وفقاً لعنصر الحماية 1؛ حيث يشتمل الحمض النووي الريبوزي الميكروي ‎micro-Ribonucleic acid‏
الأول على متوالية بولي نيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ تم توضيحها أعلاه في المتوالية بهوية رقم: 39
2. تركيبة تشضتمل على حمض نووي رببوزي دقيق ‎micro-Ribonucleic acid‏ لجزءِ ‎BCL11A‏ تخليقي وفقاً لأي من عناصر الحماية من 3-1 و10-4.
3. تركيبة صيدلانية ‎pharmaceutical composition‏ تشضتمل على حمض نووي رببوزي دقيق ‎yal micro-Ribonucleic acid‏ 501,118 التخليقي وفقاً لأي من عناصر الحماية من 3-1 4 10-4 ومادة حاملة مقبولة صيدلأنياً ‎pharmaceutically acceptable carrier‏ أو مادة مخففة
‎.diluent 0‏
CS ‏اع‎ ed ; : El a" A CR RRR REE rE ‏ل ا‎ RA AR ORR ‏ا‎ ‏حي‎ wn AAR AORN Ch A ‏ري‎ RRP NNR ‏امي‎
. E RS 5 hE : Nop y a . B . we “en A ON I SRNR tS SR CBR ER TORR ‏لاح‎ اح ل د ا ا نت امج اا ل ام ‎TR‏ اجا لايق اا ب 8 5 0 1 1 اع اح wie Sa ww > 8 ‏شل‎ ّ ‏ل‎ ‎5 3 * i 8 ‏اج الم ناض مم ل‎ isang} i ‏مج م مما‎ ‏ا‎ a ‏لح‎ EE Wo 53 3 i | i 6 ‏اجات‎ RR SNE ‏لد‎ a a] 1 | ‏ممم م ممح‎ 0 ‏موه ع الا ات وس و ا‎ BT SERRE ‏ب‎ ‏ال‎ ‎3 \ 3 ] 5 PR ‏امسج الج جا اق ل ا‎ ٍ | gross : ‏ا‎ ‏دا‎ I ‏ا أ«_دد د د اد اساي د‎ ‏شكل ؟*‎ N L A
ال ايع 4 4 3 8 بن كر ‎RE‏ ‎Ea Ea‏ ‎pS SI‏ ‎Rody SPR‏ ‎RY 1 pe]‏ ا ¥ . الا ٍ 01 ب ® ‎N EIS) i‏ ‎i‏ 5% 1 = ‎ht FN {‏ ‎FY 1‏ ‎SA‏ 3 ‎i N 1 i‏ ‎i‏ 1 ميدي § ‎is‏ ‎i ton H i‏ ‎Boca H i‏ ¥ ‎i Sa 1 i‏ ‎i 3 Load SH‏ ‎I EE BER‏ 2 ‎i foun {Eis‏ ‎pho 1 Esha‏ ¥ ‎Bee i Sens‏ 3 ‎Yo MWe bE i EEE‏ ‎en Bis 8‏ : 1 ‎bs Ss | Esa‏ م ‎BEN»‏ ب .££ ‎i OEE wow 8 {EE‏ 5 شن ‎١ ami * Tem Aad 1 0‏ ‎Esa‏ { مسد لمش ‎pe‏ ذا ‎RISERS on | Ns‏ ا ‎RoE Eo SER‏ ‎SEE Jo ++ esa‏ لضي ‎Sans PEENES SREER FE‏ ? ‎SIRENS fo 1 0‏ ‎Bene Rn‏ مسح ‎RRS‏ 0 ‎k Joo NI 0‏ ل مبا ‎a Ea Ham i ON‏ }+ ‎Lah SE fn 0 eens‏ ‎es 3 ns JR Rn NER‏ 0 ا تيش ‎gas‏ ‎+f Sa rr en {Essie 0‏ ‎mama‏ التي | ‎FB‏ د آل ا ‎el EE Be EEE a. JL on‏
‎AR... RR... 0 RHE. = :‏ »3 ‎Gey‏ ا > 8 ‎Ry‏ = ‎Re an a pre ~ a‏ ‎ead a Rg > & BS) PRs‏ ال ‎SEE‏ دل ي[التتط ‎oe Shad‏ اجن ‎any‏ ‏ى ص ‎Ray‏
LIENS Ee 8 ‏لهي‎ ‎EEE ‎ee) ‎0 HY Ta ) \ 5 1 ‏وج‎ !ْ
- a. hic N NNT RIN 1 1 : \ H N 0 3 ANN 1 ‏إْ‎ ‎od ‏ع‎ Kod 1 1# “1 1 1 1 ْ ' N 8 ‏ا 0 اجات لي‎ 1 ‏را‎ lag ew 1 ,/ / 8 ‏ال لحت -- ؟:‎ / ‏ا إٍْ‎ RFS ‏محا اج‎ 1 : 0 i 5S ny i 8 3 3 N god i OER N : 1 i $ Vieng PL ‏ض‎ 0 + ani [EY i i BR 8 1 1 0 3 1 ‏ا‎ Ro 0 ‏ب‎ ‎pad ‏حي ذا‎ Co 1 = } . o ِ 0 ‏بويع لين‎ i B i. 1d i Saas Said de (BE sy vet 4 ‏ا‎ ‎2X 0 bea Yad a 1 1 fo a ) & 19, > 1 1
1 . TERROR veel LE u § Ee i YR ~ wm ‏حي‎ i 8 Se & A H EEE JR ps hy 2 rd rr ‏بع الا حم 5 ا‎ Vd 0 gs ee ‏ل‎ 8 a id : wy Re | Ba frog & {i . = Ea = NE » NE on BB fog ‏بس" ال«‎ 1 EERE Sa Bl fa 1 BEER BEB RS 0 ' 0 i + i ae 2 ‏ا الم‎ BG ‏ايا ا‎ a3 ‏ا 2 ا‎ Se i H aa 3 pny 88 I RoR ‏ل‎ a 2 8 y : ‏ل‎ ‎1 1 iB +3 1 i aie H Sane ae Sa ‏ا ؟: ا 2 ل ا‎ H nig IEE BE ‏ا‎ 2 RE WN 2 H * Rn H DRL CBE GREE 8 LF Pan i Saas So A RADE RR on RRR PR H 8 SERA ١ ‏ل‎ ‎Nae A KOR ERE FRE ei Baa ‏ل ل لل ب‎ Gar ‏ل ا مش‎ SEE : ‏ب‎ , ّ 3 RS 7 FORE... SSSR a o - 0 8 + Frome Pr v i * oe ‏لء_‎ 0 a BN Sr Wp AS >< ‏ص ل‎ ١ 3 Frisia Frum : ‏ممع‎ ١ ‏الم‎ ‏تيج‎ J PRR § 0 ig 3
8# 0 Be sy ‏متي‎ ‏يا‎ ‏الم‎ 0 my ‏كد جو حي‎ 8 By ‏نا‎ Ny $ Ty 2 ‏تيد‎ YY ‏و73 5؟ة لوجخ‎ ) nn : : - Nth ol #8 mas Eee ‏لاع اكد‎ Wo wl JR DB ARR NS 3 8 WN WN TRESR ® he oo 3 0 ‏ا‎ N iH RR 7 *“ fad 1 i : 2 ‏اا الت تت‎ RR Ee EER 0 ‏ا‎ 0 “8 8 2 ey : 1 3 : { “ly 1 RI 3 LE : JERI 0 N 0 hE fo : 5 Gln : 8 3 ‏ا‎ i &
Gob. gE : PR at ‏أ ما‎ 8 N bE a H EE Ned EAGER ‏لقي‎ ed Er ‏ات‎ Fra i Pia } Pg SR : ‏ا‎ 0 ٍ & H NEE PERRET N TH Sr ‏السك لمتكي متت ات ل‎ ‏م لاي ؟‎ H Ag 8 SSE ; ; . : ‏امير ا ا موسو و امات‎ ¥ > 5 ‏المت 5 7 الا‎ EE 3 #4 ‏نّ‎ Mx RE REY “5 1 ‏اي‎ ‏ا ا مك‎ § aR SIRE ERR ae £3 ge aaa. i ms ‏ل ل‎ i be Tha sy wd Sa 0 ‏ا 2 ا ا ل‎ ‏لا ااا ا‎ ae & \ A ‏ل ا‎ a ‏ا‎ RRR RR A IN IN 88 RRS RRA NR ‏كد‎ an 8: i Sa 3 8 Sas Rs NC ¥3 Soa 3 A i EE 2 EET 0 0 0 ‏سس » ا‎ ‏ا لا ال الا‎ REE 0 ‏ل‎ a Es EE EN ty aaa iE Ga ANE NOON -: NBN 7B SRE SEE 3 Na aba POE. LEER © = aaa 5 3 8 RT ‏كل‎ :
EX ji TS ‏الس ا‎ es nn TRAIN nny 5 IF ‏م‎ ‎03 ‏لجست ا ال ا‎ A : ‏ل امج ب‎ ‏ان ا ا‎ ‏ا ا ل‎ SE Nod XRT EE RENE H “ : ‏ل‎ N 3 : EE ‏اا ا‎ ee a 5 0 fo 8 ‏ان لق ا ات خا ا لل‎ Sg E Ni hi % so ‏ا‎ NE ik OR A a a Ne NE 1 BS N 0 fod ‏اانا تا‎ Le ‏إٍْ‎ Wk FEE 3 EER Na Sy BER i = RN : 8 ‏ا‎ a ; NEE BE OR ‏ا‎ Aen : ‏لاد زا اد‎ ‏م ا‎ PE : : ‏ا‎ ‎TEE Re IE win § Si Ce ‏الخال 7 ل الاو لا جيه‎ ‏ا ا‎ Teed 7 BET ER 7 ١١١١ 1 Ey : i Be ie. a Lo eR NT 1 SESE : ‏اس‎ 3d 3 2 ‏ا‎ 2 : H NE i : Auge el 10 ‏ضح‎ i : 0 8 1 7 ‏ل اا مار ا ا‎ 3 te a 3 E 8 Wd : ES ‏ل<<_<“_‎ Sav Na ah EET a Sl si eae 38 NN TEL SORE RT TER nae : NEY Ie 8 Sana BEES EET : : x 3 SE FLAT a Na ‏ا‎ RES CIN : 8 RN 25.08 BE 4 ‏ا 4 ل‎ 7 : 8 0 : hod RI ONE NG LE : ‏ا : : ا‎ 3 : He NE SRW 5 : CARR : FR JUS ‏ا‎ EX 8 ‏الات‎ ‎EEE IAA + RR ee be i ee AE 0 ‏ااا ا‎ TEER ‏ا ال اه ال‎ ‏ا ا ا ات ا ا ا« د‎ ‏ايد ا ل ا ال 7 المي‎
اصن ً ب
ٍْ - 8 : - اموس ‎i‏ ا ‎Hr Te ١‏ ب سد 1 ا ‎"TR‏ \ . : ا ا ال } : ‎NR NN Sani i Es‏ ا ‎BES re a Cn A‏ )\ ل ‎LL‏
LL ee a Aa ND N N gy ‏ا‎ i) ‏“رو‎ i ,/ “oy ‏ا - ننه‎ ‏ا ال سيط و ل‎ ‏ا‎ JE PET SE seve ‏ااا ا لات‎ ‏)م‎ bE ‏ا« #010« | نم‎ ‏ا ان | ال‎ ْ ْ 0 ‏ا ل ال ”ع‎ ‏ان ان ا ا‎ Lp Nam Pn Miata acannses 3 ‏اموا را جات احم سد ل‎ 8 A ‏اا جحت ا جا‎ & & ‏ا بحت‎ > aa TRE ER "
٠ ‏شل‎
كبا الو ين % ‎rs s 8 5 o tw www ow www www.‏ جر كحضن 1 مجه حا اللي اجنم 1 الم نا امد ‎RAN‏ المع م ‎i‏ يذ ‎May TR TE TR‏ ‎NUR RR FR Bway FEAR TER FAA TEAR SRA Ut Sve: ee ee‏ امسا ‎EE NE‏ ‎he) J 8‏ > ب ) ‎A <1 a‏
‎oo. es 0‏ 7 ,5 ب ب تت ب متي ا ب ا لين ‎a “re‏ ‎Pe Ree proms tty‏ 8 ل م ‎ay PRET‏ ع 3# ايا لخدتت ام الول أ اا 0 ‎ow‏ جا ‎Ser a NER we RY‏ سس ‎Ris: SH SOY XT A sd i} TY BRE uy IE‏ ‎[STI | al Emin ; "% 0‏ ‎Na ER SOE ENCE IEEE mmm SR‏ مهمه هده _ ضفن الج > لمر ااا ‎ot‏ ‏امسا £ ‎Fa‏ نر اموا ‎a, x‏ بي ا ع ب ا ااا او ا ادل لاج م م اك م اا سح ا م جا ‎ERS‏ ‏اتا ‎ROH‏ اا متت ا الا ااا اا ا ‎By‏ ذا وض ‎LP‏ د با اه ‎hd‏ 0 ¥ ‎Sn £ ey‏ ‎١ 8 1‏ سي ‎bX md‏ لوحم ‎WF‏ اس ‎١‏ 5 ٍ 3 شكل ‎A‏
=yir 3 1 : . ‏رج‎ ‎: © Led iid 0 st SF £2 3 : u : 3 te : _ E a ‏اب‎ ‏رح : آ‎ £0 em : xy : Wa om ANS J Rpt 8 ‏لج‎ : i ‏ب" 8 ££ ع‎ x ww sed SE & } x 0 ‏ب اديه‎ wy Roe ) ‏عه 00 | اط‎ SR ‏ام رت‎ 0 | ‏ار أ ال ا‎ ie des 1 ‏ع‎ REE ‏تعن‎ ‎: 5 ‏ا ا ماق‎ 1 a 3 oo RISES SOME ‏ا‎ ‎hess 3 EF ie ‏اليم‎ 0 ‏ا اذ ا ا الام الا ال اا‎ ‏ا‎ ‎| ‏ل‎ ‎1 “Ka 3 Fo I ‏ا‎ ‎I ¥ 1 1 BA Mig I ‏درا‎ ‎LL ‎i ‏اي‎ pti Wg x. IT ig xa Te Yon
STS... ‏در را د ار ل‎ HE ‏بترن‎ ie ‏ا مي خخ‎ Sha pe
EL. ‏ااا‎ Se gr Cds a ae ETE FEF TTY fF ee dF EW ¥ 8 wo 1 Ln RE STERN i i REE RS RE se RCE a aE a Sanh aan i od aa a ‏ا اا ا ا ا ابر‎ TR mT ‏اا اا ايا‎ ER ‏ااا ا ا‎ AR ‏الا‎ ‏تت‎ pens | ‏يي سسا‎ ‏ل ل‎ aay BE ‏لس سسستسسساا‎ EA: Bid ww Wg XC EES Ix Wat EW Te Vid ‏في ؟‎ 8 3 DE ‏الب و‎ SN ‏ال‎ 3 1 : ‏ور ا‎ § 0 0 Foy VU. MN 8 7 5 ld . ‏نوع ا‎ 4 a LE : oe ! 2 ‏ب‎ ‎A "
3 i. ‏ذا أ دالا‎ id oo a me H EE i 8 = | 3 N 0" FE LE: 38 | 3 : ‏ا‎ ‏لاجد‎ EE iE ‏ااي‎ Nx I FEHB ‏ا ذا‎ N bi 0 RAE: Ek: BE: BE: N A 3 IE BE: PIE <4 bi IE: BE: ENE RE ER . : ‏ان‎ 4 3 E: BE: EE: ٠ hE ‏لخاد ا ب‎ EE NE IE N EEE SE EE EE BE OIE IE Be § Ei i BE: EN EY yo Rh Rc ERR ‏اب ا اا‎ FRE RRR. ag Ry 3 X Bs > Ba 2 FARE A EE © ‏شي‎ ‎& ‎Tog WE Fa ¥ ; 1 Fe Si ‏شكل‎
١و‎ vy ‏البو‎ ‎١ ١ 1 3 fl 1 ‏د ع‎ i > ‏مج اميه‎ ‏وا واو‎ i EY ‏دوك‎ 5 Sy ‏ات ¥ ا‎ 3 0 3 1 : i I | 1 1 i RS IE ‏ا‎ RIN H H ’ © i 1 8 3 H i 8 SEINE (BIE } H H IEE 8 BY 3} Ya ot Hel By : NSLE RIN ERE Eid ‏لي‎ ‎PEE NE ‏اي«‎ ‎yd #8 REE IR 1 ‏ب ايه‎ oe ‏اي شيا اللاي الي الا تي‎ ce REARS Se ‏عد‎ Save Sa 30 Fa ‏اله ا‎ ah ‏ل‎ CN . CN NR ‏م‎ R, 3 ‏اا ااام ا ا‎ ER ES ‏مضع‎ ® 8 X ae 3 ‏ا‎ 3 pry Rad ‏ب‎ ON of JE Es & A £3 Eo FEC ‏لوا ااي‎ eR See FR STIFF ES AA ‏شكل‎
Foewa a Spe? le x pee ‏لباة‎ Sipe 3 8% 3 ; GR mn Rn ft 8 ٠ i" ¥ on gree Sve] ‏يتم اما‎ pg ees TTT : : 1 ¥ & : 3 t ‏إ ل ع يغ‎ rt 4 1 1 8 ‏يا‎ fi 1 - 1 : 1 1 F. ] Feoaoad 1 ٌ i ْ | 10 ‏و‎ 0". i ‏ولك‎ nd i ++ 'ِ 1 i : i ‏أ‎ 1+ : 3 1 1 : ‏ا‎ 2 Paw e 5d 1 ‏ا لت‎ 1 5 3 1 !ِ ] ]1 8 ‏إْ 1 1 1 متسس ا‎ 1 1 ‏السب الع سر وا شتت ل وات تهنا سا‎ 0 I... WO H Vet He ; ‏بر‎ ‎4 7 Le wid Sam
ا ف أ العا رو ا 8 ب : يبلا ا اج ا ‎ie‏ 1 ‎CEE EA NE IN TTS‏ اوري ارا حت اج ‎EE AA‏ ‎A RA A RR RR Sent ns sn -‏ ا ا ‎rn :‏ ل 3 ال ااا ‎a a;‏ الل ل ل ا ‎a A A SAY Re a 9 ED pt TY = SU‏ لا ‎EEE EL‏ ‎AD‏ لات ا ‎REA‏ ا وج ا ل اح ل ل ل و ‎CUNEO IN,‏ بو ا بي ل ل ل ا الي ل مش مج ل ل ا ل . ا ‎ER‏ ا ‎CRNA VERE REE Re‏ به جا ا ا ل ‎Xe‏ جناي ‎Sa FREE A Ea Ye Co 3 = Seder RUE Y sh‏ & ‎a8 RR So‏ + 2 ال ‎i ee‏ 3 ِ 3 ‎a fog, & vs‏ ‎RY‏ د ‎Ce ER‏ و ‎AE TE‏ ا ‎PRY Sob‏ 77000776 لاج ‎AAT‏ ‏لي 5 ‎RE pS Tat Sg SNS ERE‏ 1 047 ل الاق اسست ‎Sr‏ المت لت لت ااا تتا ‎BR‏ £3 1 ا ‎TT RN‏ 3 اسك ا ااا ات ا ‎Re‏ اا ال ل ال ل ل ل وا ل ا ‎Fa : : 3 3 Comm‏ اا ا م : حي اد م ات تت سر ا اي § الخ ااا ما تا 8 8 ووم و موا مايخ ‎SENN‏ ان : حي ‎ES Yas er Res‏ 0 : سي ال 1 ‎ES Shan od ‘‏ 15 0 شكل يلي مفو * 3 ‎agg‏
4: ‏ولب ارا 3 جا‎ ‏يش ؟*‎ “4 “3 « ol & Bh NS eh A BS NC VR ‏ايكيا‎ hd A ‏بقار‎ ry ‏رم اخ‎ rag - we ‏نا اليو وا اه الا جد نا ا‎ 4 i ! EER CE EATER SCARE EERE ‏اله‎ AATCC ATGANTOETUTRTROG : Th a ‏ل ا ما ل ارت‎ ‏لاا واي 0 مإ‎ a en BE Fa psn AARFCAPCAG 700106 GUS x : SRA EA ‏لا‎ A A ‏ل‎ Maia itera PLITGTE 1 : “Eat 3UL EA SANE BUTE ALA RA Lines tn SARAATTRCTOOAGHH AUTRE GOS 0 ‏م يا ل ف اس ا ل عات ااه اس د‎ ‏ب خأ‎ 4 A a ‏كلس‎ ah : ye FF ED Dg Yo NT ‏الا اا‎ of ¥ FL MRCS ‏نج أ أل‎ ‏ل‎ SEAR SI CR ER AE ‏ان ا ل‎ ‏لل‎ mae FAS ede ‏م‎ IN NA NR nN $ RRR RN : ‏ا الل‎ ND LL YL” .- Toe i 1 ‏مكل‎ 1
A ES ® 7 I م١‎ RCE ‏ا‎ I Aa SE : ٍ ‏ض‎ ‎Fak A Ll ‏ا 1 م‎ | Loge 1 1 1 : I SE EAA AEA EAC OE ‏انان‎ ‏لول لطت الاي‎ ‏اا‎ ‎<١ ١ ‏شكل‎ ‏م +* ا‎ Ras w fav EN at Food le hes IE ; Yo veal ty baad - JFL TONE NE REA I 1 1 ‏مك كي كي م كرك كو كي ا نو‎ ‏و الاي ا‎ ‏لي‎ ‎د٠١ ‏شكل‎
PEERY Sey BE ‏ا‎ I LENG: | RY H ‏ب"‎ we i: Fide § x wR 3 H { ‏بلا‎ ‎H : H LEON 8 ١ 3 ang, oe H ‏يب‎ 3 Fae ‏و‎ H / 000 . 3 N i H ‏الداع‎ Foy H i 0 ion § i § % AER § ~ 3 : N 5 Ed end i Re 0 H i
: I. 1 Fos i i 3 : H i A AL SRS ‏وي الوا ريق اللا‎ vi ¥ & BT ‏سن‎ © FEN ‏ل ا > ا‎ SE wy a Nae ‏ا‎ 3 3 TR TAEDA NR TR ‏ااا ام رجه أ وى جا را اال تي و ا‎ FH SONA 3 ‏تساي‎ Ba ‏ا‎ 4 1 8 6 : 0 San ‏ا ااا لا : 1 ا‎ Re: 3 BR : RS : ® 0 ‏اتا اس لاا ام‎ ‏لت ااا ااا‎ : 3 ‏و ات اتا‎ ‏ل ا اا‎ ERENT : Arena ¥ AR EIR ‏اتا‎ TERI SRR SERS 1: ‏ص‎ ny SEEEEEEEERL ‏<<دٍوددددد.‎ CERES 0" ay Saw wan Welw ‏لل تيه‎ Rial 0 Fg ‏حر الا‎ goes Sods Bra ‏بيرع‎ ‎feed | + ‏خش‎ eS 1 £1 TR Yo WY in EE 3 k : J ‏ل‎ oH ‏اشوا‎ HE Yo jo oS “ey <> Ld y oy 8 ‏د‎ 3 £7
WIRE ‏و مومه ته من جاه رعوه مم ممعم‎ © TE ‏ايا وخا ورا اه فوا ميف افا ل«‎ 85 ‏ا ل حت سا ا ا ا ا ا‎ © Tg ‏ا ال ا اس ف‎ ww Tp” ‏ل الاي لت ا‎ Lota ‏ال ا اع باجا‎ w» Ye” FER GATOEASTITTRANTASTART SOTERA STFA TDATTATTOABCEOTONESS w Te ¢ SRG ‏همهت اعت اط‎ Ls Lia saa ‏مت و‎ DACRE ‏ا بذ‎ ‏بورع‎ CRGEAICOTEGRGEARIBERTO SUR THR ‏ا‎ El i TA ei Se] + “rp” a7 ATEETAQROTRSRGASRRCATRCTRCA NTE Assy TOYEITICINORGERTACYRY ww Fe"
i 4 0 ji A
3 الال ‎LIS‏ ‏ب ‏وى ‎ha‏ من بيد الا ا ل تت ا يوون يوني ميونت ووو ووو مووي لمشت ‎IR ER‏ مسسشستسششييسيا ‏ الما لو ع ااا ‎snd 4 : 0‏ لح جحت سحي اح حا : ‎a‏ اما اا ما 2 ‎iy vcd : : i‏ لح جح : ‎PRA SE i] R H‏ ا ا ‎a CR aaa IE : : 3‏ ا ا ‎BS H‏ : لومي ‎TANT SETS TRARY.‏ 8 : : تيبي امت مسي ‎PoE‏ بيجي ‎CARER,‏ ‎CNET mee : : H‏ ا ال المج ا ا ا ‎ee © FEI USI NENG. ew : : : H‏ ال ‎aaa Poi [Ea ٠ | : ;‏ ‎Pee © 1 : 1 0! 0 a : : :‏ ‎BS : FRAN = 5 8 8‏ هه الي مج 1 ‎A 1 2 ou oe pS a ES ht oF hie a te pares = ~‏ اي ‎TRAY‏ الا ‎[ed RY SL HE‏ ‎BERR EN Sg ee‏ ااال ‎EA RNR‏ ا ‎eves. © : 1‏ اد مس ل ‎SETTERS‏ مص مص ‎SPY FETE‏ اللاي 3 ‎YN‏ ا ا ا ا : : لحي ‎I ie‏ : اسه ججح اا لاا 1 : : : احج لما : 8 ‎rT RS : 08 p‏ ‎١ : : i ; : :‏ لمم ‎RO‏ ست م لما : : : وا الوم جد لو ل (00[00 ‎EA a‏ ‎EE aa : : :‏ : : المي ‎BE‏ ‎i : :‏ ع اللي 1000010 سيا لخ ا سا : : : المت لج د ‎EE‏ نهذ ا تت سس : : : : ال لح ا : : ‎REY wo‏ لاا ‎SEI SR‏ ا رس ‎FL BE AR‏ : : : الحو ا ة ‎ae Ge > 8 i pS BS ho MN se EER > ES Ey 4: =‏ ‎R Td CE es‏ ‎nn FERN‏ ا مت مسقي ‎RN‏ ااا ا ا ‎i‏ لجو ‎A AA a‏ مات مل سحأ : ‎Sa‏ دسج سس للح اح تت الل ا ا ‎RRNA ١ 8‏ للد بذج جر و ا 1 : النسسحسب ‎IE‏ ا ‎a mss: : H‏ بجت : : ‎١ ata‏ جد ا ‎sessassses : 2‏ ارد ست م ا ا ا : : ‎TER OR] wees‏ ‎a : : FRNA RRA eee : : : :‏ ; ‎i‏ : الم لحا : : : لسسع ‎TOR SE‏ ا ‎RRR. ee : : : i‏ اا : : : سر اماج اس اه ااا : : : : لحا وي جد الج ا : : : ‎AIAN ANN 1 ee‏ ‎IE :‏ يس الت ا جر : : 00 ا ا ا اا ‎FU:‏ تا ‎SOU JUROR‏ اف الس سسا ‎et NEN SN SU:‏ سا ا ل ‎pe Ya a Ly PRN > : Woo‏ شر اد ‎SER‏ تم د مح ا ‎EE‏ ‎SRR‏ و ا ‎RRM! :‏ الم يتات ضحت الت ام : : تالكا احا ل ل ‎nn :‏ ال اا اا 8 : : ا ا ب ¥ ‎A‏ ‏: المهجهههها ‎fad? TL ee ERRNO TTI‏ : : :لمر ال ااا سا ‎a x Se‏ * ‎posses :‏ د جحي ا : الجججههر ‎YE‏ وم اا ‎CRNA‏ ‎٠ :‏ اموب ‎ANT‏ ا ا ‎ANN y - 1‏ ‎Raa RRS SEE‏
Yd LIE oy 8 8 ‏رن بي‎ ‏اجفا تة ملكي‎ ‏ا الا ا ا ل اا ل د ل ل‎ ‏اج جاح اح تج جا ا‎ Nee H ‏نمطي مود الام‎ ‏سسسب امجح حت ا‎ ١ ‏وموم الم سج ال ا‎ ١١١ ‏و‎ ‏اللبوسييا احم امج اج جا‎ FE NATIT — © © © ‏اج ل‎ a 0:0 ‏لصحيب لح ل ال‎ 1010/0707 7 ‏الل‎ FIER ‏ا ا‎ ONAN a : : : f ‏الست _ سج سس احج‎ ee 3 ‏متخت ص تح‎ « : : 0:00:00 ‏اذ بي تالح اس جحت د م‎ : : 2 MIEN ‏الس‎ : : : n Sadho nna WF Pod Beare ‏امم‎ WE SEE SE ARTIC ‏ا نهر‎ Bl H 3 ‏ا ا‎ AR SE: : : E H ‏تم‎ HT.
RB : : : 2 ‏تجح وم ياج حص يح‎ : : : : n KY FO a BN CO SS SE SE SO EO STENT] ‏مال ل الت ا ا ان ا انا د اس أب ل ممح‎ “ra “rt ‏ال‎
مدي ‎x‏ د
ل ل ا ‎PY ROR‏ اح ا سا نيديد دوحج حجر الب اس لح رن ليست سمي سم سمي ‎UE‏ جما لم لج امج ال : ب ‎Sa‏ الي ات جه ‎nee : 1 : FEI‏ ا ‎Ree © : :‏ جب جما : ‎E‏ :© سس الل اا ‎a = : : :‏ : : : هيو ‎TERR IIR TRAN TE‏ : : : م اللا ل ا : : : : يوا 7 الما ‎RUNS‏ ‎CAN 8 : : :‏ : : : ع 7 ‎SRE‏ ‏: : : و ‎Ne‏ : : : الم د ا : : : اتاد مج يه ا ل ‎ARERR RANA : : 8 BN‏ ‎er : : :‏ : : : : ا ‎I CT een‏ ا سإ سس ا : : : ‎fretting BREE‏
ل : : : : م ‎Ya‏ ع + اه الال ‎i‏ و ~ 4 * ‎FS‏ اي تت الي ايع
Ta ١ Se A TEAS ‏اماك‎
اا ‎ARN‏ وج ا ‎er le Ee ROE‏ سس ممسسمسجججو ‎١‏ وال ا ل لا ‎RR He‏ ا ب م ‎aE : : :‏ الوه وو ‎eee RE‏ ححا الح حت قا : 1 لا حاتت ا لتم المج 7 ‎NERY Bs ? 0‏ ا اجووووو و ووو وار ااا لا : : : : دحج الو ا يسبيب ‎١‏ لج م ال ين ‎ eeataaaeand OER RR i : ; :‏ مس : : : ا 5 : ‎LN.‏ ‎Ne I B : :‏ ا : ويد ا لح يت الس : : : 8 © الج تج لش : ‎A‏ جح مح جح 8 : : 8 الج سح امي : : الم ...المحم اتا م لم ‎IRIAN EE BE CREE er A AR SAA‏ ‎BRE COE 8 5 3 Rist 3 ّ i .‏ جيني حب لبد يجيا لجيج جد اج لان أووو دجم وومجوجيجيمبا ‎١‏ ا ححا حا اح اها الجمجدد تدحت جحدد دحت ‎RR‏ لت حك الدع حال ا ا ا ‎See ٠‏ كارت ا ‎Jere‏ الج اج ا ‎ees. :‏ جح الا م الس سا . ‎FY ARREARS a‏ 8 0 سس اج ري دجا ات جح اج لج ا شيل : % سمه دج التي الح نبب 7 : لوم لدت ا ا ا ‎EU Re i: BS a Re‏ fret “3 3 4 3 ‏ب‎ 3 + ُ = NESE A ‏يام ا ات عن لمعت‎ EL ECAR TOT Pi ges. T 8 Fe” 85 ‏اع المع ا ب ع رع اا عت وج وات لتم لض ل‎ “re
BEY. pose ‏ايه لد ومع‎ RL ‏ا اح‎ Pn TTT RROD RE Seg. TY Fe a 805 ‏الات يي‎ IACMR ee Oa ‏و ل اانا‎ CAS Agog. TY Te 7 ‏ل ا لي ال ل ل ل ل ل ل 8خ‎ Ln a نيل ماك الي ‎Ran‏ اج لي ‎CL SUE‏ و عات ا ااا 82 “نج ‎TRE‏ .مين كه مت > و ا اك ‎IAT ARR‏ اهموي ‎SETAC‏ ‎B10 Ye”‏ او ع ران ا ع ل ودع رع با تدع التاق البو" 1% ‎pee‏ عم ةادا ا م ام مهاه الل احم هاج 0 ‎SOASGY‏ ‎ra‏ يي الم و و خم ا ل خا كت ل ب اله هلا مودي ‎SOS49Y‏ Ie ‏شكل‎
خاي ب" ‎ad‏ 33 اخ ‎Spm.‏ ‎“ral wp» vu wy‏ ‎oT La EER‏ الا ‎ERTS‏ 0 مس ‎jt‏ ا ‎RAEN ETA PRE RR ENA‏ ‎١‏ ”ممم الأ ‎IS IR‏ ا حك ‎aii sessensenaanasasscaansan oof‏ احج ل ا : الود سي ال د ا سأ ا : : لطا :7 ‎RT ae © © HE‏ مد : : ‎SRURATRTWDISNRN CL aang‏ : : 1 & ااي ا تا : : : : نيا ا ‎SRNR NRA‏ : 100 ال لست تج ‎TAR pith 8 : : BE CRA‏ ‎TORR SN 400: : :‏ : : : ا الح لجس سس ‎To‏ ل ‎NERS CI‏ سم : : : لج م ل 700001007 1[ اي ل حصا : 8 : ‎AE‏ ل ‎RB 3 :‏ : : ملاسم تتا : ّ : : ‎CAN‏ ساسا سسا : : - ووم حي ججح ا : : : الجا امي ‎vol‏ : 0007 متسس تسح الس ال ا ‎FRE RPE SNE: OO‏ ا ا الج ‎ve‏ ال الم 8 ‎i de‏ ‎dog iN RA "OR Ks Pads ome A‏ ! ا ل فر ‎Spe op‏ ‎Fad) : 3‏ 9 1 ‎Ca JE‏ ل ؟ 5 ‎a a sere bg‏ امت ‎AR‏ ‏بيه 0 ‎RRR RARITIES‏ ا | ارسيو سدم سوس وميه ‎١١‏ الاحد جد مت الجا ل ‎ALS‏ ‎i :‏ ألم ذه تح حت جا ا ل : 3 : لببيييها لاحم حي الاج ‎RB :‏ : اوها :الاج اوجح ار جا 1 : ‎RRR Eo i p‏ جلا لح ‎BS :‏ : ا ‎NETTING ¥ : : : : AREA REE‏ : 2 : بها 7 الحا ا سا : : ‎TROBE § H I‏ : 3 : 7010 ااا ‎R : B‏ : ا الاي ا ا ل ‎suena od : : : : [Raa عكتلا[ i‏ ‎SANG : Hi‏ يو يه : : : : | ‎Settee‏ ‎FRR : : : : ES : K :‏ 1 8 ّ الججااي ابا ااا : : ‎va H I‏ الج ‎NN EE‏ ا ب مم ا ا و ا اا ديا الا يت لاا ‎i‏ 6 3 ا > الس سح بم 20ح بلج 40ح سق لخت ‎seg ap‏ م بر ‎‘a‏ ا 4 بيجي ‎Gy if‏ ا : ‎se ER 3 pe‏ ¥ > ل ‎Le aR‏ احا ‎ARR A Bet FR rn AAA ANA‏ ل ال لح ‎HE ANITA a‏ : بطي ‎TERRESTRES‏ ‏الدم»ممم»مه»ممهه ممم ممم | ‎SONNE RINNE RY,‏ : ل 1 ‎ee‏ ال 1 ‎Ea RAED BN‏ ‎ana‏ © :الماح ااا د : : ‎Labi aE‏ : : ادجو ووجوجوة ‎i : CRIMEAN]‏ : مسي ‎ORAS‏ حا اس : : توعدو ‎w : ; : ; Tl‏ ا ل ل : مجم لجار تالت جما : : : : ‎Ee a‏ : اا ال ص ‘ : ; : لخد ا ‎pi : vasa dw : :‏ : : #ة الت ‎CNR ETE ISOS ORO ee be :‏ سسا مس سا لس ا 0 ‎i‏ “ : اال لجح جل جل ا «# 2و ل اله ‎da‏ اتات ‎t t] ® Pg om‏ 5 ضر اتا : مادا مر دج ا ا ال : ممهو مم وموم مو وموم ووو | 77ت ‎SETTER :‏ ‎١ anna :‏ الام ا وات ا تح ‎١ : :‏ البممسسسسسسس ‏ ألا اح ا ‎eee— : : :‏ 1 اللي سس : : : : الوح ‎DEANE RAN RY‏ ‎teas 5: : : :‏ 0571 الج جا جا ا ‎SN a CJ 8 : : :‏ ا ا ا ‎TE Ee HB : : :‏ ا ل ‎foo ET I TE AN I SU‏ ‎hy am Ra FE‏ اله ‎de‏ الست ‎he‏ ا ا # 5 زم شك ‎pro ry & {‏
أجل ليجات ‎Yi‏ ‏جما ‎KLAN‏ ( معدت دع« #31 ‎oa‏ 83 رح بت ‎HY‏ ‎PORE GRE)‏ خم ‎TC.‏ اج << لحب < ! ‎oR‏ يما ‎AR RU MRL‏ .م 0 بير 0 الح ججح حر اا اجو هوم مج وج ا أي ا يت ا ا ااي وه اج ا ما او ا ل 1 ‎ht J‏ ا : احج ل :الل :وول ‎A‏ اوبحي الجاع لمجو ...اذا 0 ‎RR‏ تلن الا اله الم لا الا ‎oe‏ 20007 انها المتتلاده ‎EL a‏ قد كن" ا ل ا ل ل ‎LEE‏ ‏ات ين سي لمحت الم سد ا ااا من سي جم الم ل ل ‎BE Eg, 30 Age HY‏ امو ا آل امو قي ‎Ye‏ ون اي ¥ ‎Te‏ ب ‎a aT‏ + ا لاس ‎E v8 » ho A was, A‏ ‎de RR ARE‏ ٍ رج ين الا ‎A‏ ‏الب اط : ‎a ;‏ 8 ¥ ايج ‎EY 4 bed |‏ ‎a‏ ‏ب ‎ETS‏ ‎ne j‏ ص :3< ‎We ® ppd BE aE‏ إْ ا ‎Sa‏ امه المت 5 3 لوو * إٍْ ل ا 00 01 مما | 1 إن ا ا الجخ ‎EE - == Bi Ni i‏ الو ‎RN} Ey‏ اد ل 1 § + 2 ‎ME Tie | Vigil‏ + 2 ¥ ‎RS BE‏ ا ‎[RE pas oy‏ ا ‎Sx TY‏ 8 ‎EAL.‏ .ا 4 ‎Em Rice RR‏ يم ‎$y a ate Er Pe] 3 . LE BN‏ رع فرق ر قرتبالرقيتقيترقيقيامقيم الك واد لقو ارا الا كرا ‎a A‏ الو ا ا لكين لكاي الي ون تي روي لكين اج تك وال اا لمجي اف ‎A‏ ال ا ‎NEE At‏ د اندر ا اا د حا ال م في ال ل عن الاي ‎LES WES Fe SR‏ اتاد جرد ونا ا + + ا ا
‏ا‎ hy War dR sega 1 : : ‏ا‎ vi ‏حر‎ Ou Ad Yh 2: Pf A LTR RL Behind, LEE Sig ‏ا ل ا‎ SA J ARENA HARA ‏الجا ا‎ ey ‏ا‎ ley ‏ال ا‎ EE a a of Le ‏الله « ال اد بأ‎ ‏ا ع‎ 8 88 no RE a: RT ER A 8 ‏بجح لح‎ RR NRE. 3 no 0 ‏جح‎ SE al TT Ga a RR 12 ‏اد ا ا‎ es 50° ‏ا‎ ‎2 Ml ‏المع سس جا الع اا‎ ‏م‎ ¥ ” SF RES ES ey 5 4 ‏ا‎ ‎<< ‏ا 8 8 خخ 1 # ما ا‎ RS Sg ‏كل‎ aa SE .. LION ‏ا‎ 0 ERK NR TT NENT EE ‏الس ا‎ aR hi - - = an ‏م‎ ame ee Gee Lew thal MW . Se pe 8 ‏ا‎ La — NE IMT SOE ‏ال‎ aa ‏ال ا‎ feo BREIL ‏ل ليع‎ ve i Lg 3 5 8 ‏شكا‎ Ne
Pag & p ad wy HH ‏ال ال‎ Be oO & ‏شي‎ ‎Fp ‏ان ا‎ : oF & ‏ا ا‎ Ben, FEF FFE F Cx RIE CHEESE TE JE ‏عي‎ pon Bn & ‏ا‎ & & oF 4 ‏ص اج ل‎ : $ 3 ‏كل‎ eT $e on rx 2 FSF AE ew 1 ‏سيدا ب‎ ER ‏ما كن‎ a. ‏لجرك ال ل‎ i 0 nn in H : | ‏مب‎ ‎as ‏ا‎ EE ui EE Yi it a Er . 2: ‏لاا‎ : ‎or‏ الست المبجي بجح جيجه جججيلة ال مم ‎A ES & Pg oo ra 3 b‏ ا ‎ba] x2 . E b 3 8 1‏ ‎ly i‏ مسد ‎SE ., Ais‏ ل ا اال حجر مع بحن ‎LE SE #8 Bhs nf no a‏ على ‎IE AJC, SE SE al ET A‏ لان ماق ‎ER Ro‏ ا اق ‎k 8 Fy HF ad‏ ا ا 1 ب المي ان ا 88 ل ا 8 : لي قلي م ‎FF @ FE Gee‏ @ ‎a2 a $B SY SM SFR‏ :+ ا ‎Toga RES fo a 2 Ra ul Ea‏ ‎EE F&F Fd‏ ‎EE Re SER als 0 3‏ ‎a‏ يلجتلا ل ‎SE ST Rh Nn ORE‏ ‎Nn NL N a YET Gg we wm‏ لحا ‎PEER ERT a N ١ ry Ry‏ ‎TRUER SN FREER 0 9 3 = 4‏ ‎ww :‏ ل اا ‎Ea‏ ‎ow waa REE ge pe ad Figen oy‏ » 8 ® : ¥ ® ب ‎SERRE NE TR‏ ‎ji &‏ لأا
3 2 غ ب ‎A Wa ga‏ ‎i BN SI SE ae H 1 E 3‏ ‎I Sr A ER H 2.‏ ل ‎By‏ ل ا ‎i A‏ ‎i ay ve 1‏ يح ‎wee‏ ‏ا 8 ب >" ممم 8 بع لوك عي ‎H I EE‏ ‎EE A EA Ee 3 Ege Poy‏ ا ا ‎H £ a a‏ 8 ‎GLI, eu 0 3‏ ‎i BR ER MR RR BO ROE Cp SE LN H ha‏ ‎BLE ©‏ > 8 ‎be tn BS EER H‏ ‎iA a Tn TAR TU 3‏ ‎I RS H 1 .‏ ل ‎H PEN‏ مسد مد ممم مهمه ممم مجه ممم ‎FE TR RE ae N RENN‏ اا § ‎HN‏ ل مب سي اوور 3 اا اج ‎od‏ ‎ia 1‏ م ا 1 ‎Rr‏ ا ا لأس ‎H N Cag H‏ ا ل ل ‎H‏ مح اه ‎ERE EE DA H HN AIR SS SES‏ لات اا ‎H‏ #ج تحت 77 ‎H fw «i‏ ‎H A Te EE Lowe wi i‏ ‎i‏ وج م م الج واي و يت 8 نا § ‎H TENET ES‏ ‎H FS SERIE TE A : N SE i‏ ‎H‏ جات جو ود ماح م اج الم تح 8 ‎ae}‏ حي حي ‎RR A‏ ‎bo eT AT A AE AY H N SEL TN SRR ER Rr ERE A H‏ ‎to Ae Sh Hy FE EE AFIS RETEST SET: |‏ لقي ‎[ERE‏ ‏8 ا ‎H AARNE RESCH‏ ‎HN AN AA NAAR RRA‏ لوحي ورد م عي و ‎TS‏ لالد توتو ‎H‏ ‎AAG ERRTTY § FE }‏ تت ال ‎i‏ 0 ل 8 ‎we FEE Ae‏ ‎N 7 §‏ § يت ‎SEE ESTE AN‏ ¥ \ ل ‎SA HN N‏ { ا ‎TRO‏ يا ا د ما أجلي ‎Pos‏ ل 0 ‎i‏ ا ‎SRR REE i FER A‏ ااي ا د لاا ‎i‏ ‎H‏ لي لا ‎At at § ER ne‏ ‎ERR { EE EE NOE BERR {‏ 1 ايج لومي ا حا يل جا ع يحي ‎a i i‏ اج متم اتح ا اجات تيع ‎bo‏ ‎RR ES i‏ اتا ا ا ‎HN‏ { ا ‎Er‏ ل ا ا ل ال ا ‎A ee 8 LNA‏ 1 ا 1 1 ال ل ‎RE TA H‏ ا اتا 0 8 ‎La Hy‏ ‎EE SR BR oe H‏ ‎i TETRA TARTU TINE 8‏ ‎AR AA AAA A AA AAA AAR AAA‏ تن ا ‎AAA‏ ل ا متاح لس ا 1 ل خخ ‎PYVGRBUTR‏ § ‎St ali‏ ف ‎RR CREE SY SERIES So‏ 1 gy 8 nT ; IE: si 1 8 i Bay ‏عيب‎ : ‏لج لوجي ججحب جد وات لمج و مج‎ SRE ‏ب ا ل ل مس الج‎ ARRAN va: eee ‏ا لاا لا ا ات ل‎ EE ee ‏ب" ب‎ Sg § a EY SiR * NL ‏م ا ار‎ Cs a ‏“يا الخ‎ LE ow aS eS Ea wa oY Re ‏ا‎ - Ce p REY SR psa Re 1 ‏و سحن تا‎ ey Joan ‏لد‎ ST TU Rn iSite Fb : REO C02 J J SFE SE CRIN FO Gee. oN Se ae ov ‏م‎ fore cw Team ‏ا اا‎ fee ANRC ‏ا الات ات‎ SR ‏ب ال ااا‎ TENE SERS NRHN SRR ‏ل‎ ‎= 0 . 7: 0" 0 0 -ٍ ‏بن‎ ‎+ ‏ليون‎ 2 cn SER ‏لاا ال‎ SESE oR TAN EE wed RR SE ssl Bg Aad Ta fom EY EA EAA AAA LA AA SAAR RASA NR pF Wg CRETE ٠ FEE ‏ا تج‎ YA 13 y Psy : 8 Foe ‏ا اال ا ا‎ ey ‏ال نا ا 8« ل‎ : 3 ‏ا‎ SR NN seas SEER 3 SRA 3 ; 4 1 8 aa aaa ‏ا‎ 3 0 1 1 10 a ‏ف‎ CPE SE ‏يها‎ ‎) wi THA ‏ال‎ Sa Nt ‏اال‎ ‎B « +4 ‏ا اي‎ 8 8 0 ‏ل 1 ال اام‎ ow ‏ال‎ 7 ) RENE PRET ‏دين ا‎ fs FA EY ‏الي اللهداع اله“‎ “hu ‏ار د دا عد د ب ا ل‎ 1 ‏الاي«‎ WY ‏خخ يه 4 ؟ ؟‎ ٍ ‏"م + 8 امي‎ + F FE ‏الوا‎ Ee A 3 3 3 =F 3 poss Ea Wp, WE ERS EE A il ‏كر ب"‎ Ri LE Ss N MRA a.
EL A BA ee me 1 Li ‏اج عع ا ا ل اا ا‎ ‏اماه الت اا الاج‎ Re Ree ‏ا ا ا ا ا ني ل‎ 0 EL FR ERR Er ON ORRee Said ‏الج مين + 8 اا‎ ii i Ba RE ‏اسح تت‎ RE LR fa *# i 5 ai : 1 wp ‏م‎ ‎8 a ‏ليبا‎ rg ‏امال‎ ‎Yoon ‏لاي‎ 3 ® Hk ; PE R k EN) Tog Yasw sd 8 ‏ا‎ ‎Hd 5 ‏ار‎ ‏ا ل‎ 8 ّ = a cB 3 © ‏اميه‎ TO J : hE . 3 DEAR :T BF © LEE: : k : : 8 4 1 8 0 3 5 + 8 2 ‏م‎ Indlill ‏لي‎ SO = 3 ‏كل ام‎ ‏د 3% #3 د ذا‎ 13 1 FFE WN k I ‏ا‎ 8 x i - = wR K ‏ا‎ EE EEE 53 BE ‏بخ‎ ‏ا لا لب‎ EE EE » ‏ا ا‎ ‏ند‎ Bi is RS a FS FS dH FSS EE CCR RR aR ‏الج الجن الج‎ CE ‏اجن‎ ‏الي أ ري أ ا أي‎ FF HHS FF RS 0 q 1 ‏شا‎ ee
«: Ed ‏اجرخ‎ ‎1 ‎we a BES ‏ب‎ ‎ig TR ١ 1 ‏امم‎ ‏ل ل ب ا‎ FP ‏ال ا ل‎ RR A RRR ‏لومي‎ SEE Sh AR HE 0: BE re aa : ‏ال م‎ BT A : ; 3 ‏الت ا التي ماح ا اننا‎ BH : AAAS RAN TY § 3 i i CY ‏الم لا مح‎ 1 0 3 NS 3 LANTERN AND ern ty : ‏يسيب اتح‎ : i : TT je. ١ i i i 0 ‏ا‎ o N H 3 ‏ال‎ EE py ¥ 3 ‏اي تا لت‎ wee i H : ‏اتات ا تع‎ ST: i ‏د‎ i TINTING we ١ 0 ٌ : BE EE SI 3 i : ‏اليد الي ويج سيا‎ i i : ‏الست ا ا‎ we | i H i ‏يا يح جه مج مجح‎ 1 : £ : ER EN ‏الت‎ 0 i H i ‏سس‎ RS SS ka) So i BN i : ‏د تم اا ال‎ We H x 3 3 3 2 ‏ب‎ RK a Fan NAY NE, ac - 3 a ‏بل ا الحا الج لح‎ : B : : IRCA, [3 ENR JE JRE OC ‏اج‎ BNI eh SOR 3 BN Ke 3 [EET Rh: SOE : 8 ‏بج ا سد أي وا‎ 3 Xe Ta Ty Fa ‏تف مح‎ 8 Xo ao Fu 7 ‏بن اناد‎ od ol Regan: ‏اج‎ ‏مم‎ I ‏مض ا ا‎ ¥ 5 0 SY ‏عه ‘ 8 8 د ا جا جح م ا‎ RR AS ‏اا‎ RENE EN BE ‏الا ال‎ ١ wa AIAN SAMA ‏ال ممص جد أجسجوي‎ a et at an TEE ARRAN INRIA Cr ee. : ‏امس مش تحرس‎ 5 R od FR Rall: ° 5 : : ‏وج يج تس‎ Me — © ‏الل ا ات ا‎ RRR : H ‏ىج ويح‎ "I TR SS SINNOTT RRR : 8 Pherae Lo 0000010000100 SYN Ret ‏اي رمسا م ال ٍ : ال‎ 1 : : : 8: ‏ال‎ : ; TR i TT TE I RAR AN RNR re ‏المج‎ i : E ‏ات‎ sma FR i : § : 1 i ‏لو‎ a woot SEE BEE SE ‏المي‎ © ١ 1 1001010 1 ‏تح ادها‎ | Desens i ; : ‏اا امي تح‎ SE TE SE FATA ‏لاك حا‎ Devete ١ H : i RNC PY 100100 Pog ‏ا ادن ا اح ا اس‎ eden RAEN wl : tS k b 3 ‏ا ا ميد المت ل د ا 0 8 : ل‎ foc ‏لجا صر دك‎ we xe oa ‏«ج‎ SEAT hw Rove AR We ‏لجاع‎ ‏و لديا‎ 7 v ‏مو‎ + ‏معي ا‎ ‏امس اا‎ 8 i RN i LT ARRREN Be ‏اا‎ aE A AE IE ‏الاج ا ااا‎ . ‏تيه و م‎ RAIN ‏ا‎ ka 8 : : H , ‏لم7 حي مما اج الم‎ : 5 8 ‏ا 4 ال‎ i : H NV ‏اجو مح‎ 2 5 = 5 : ‏الج ااي ») ووو الل سح عا‎ ee ١ : : ‏الجا ا‎ rn ‏اوج 8 : 8 ار‎ — : : : ‏اا‎ SE AAR ‏اا‎ Cb 3 : 8 ‏ام‎ 5 : 5 : H CE I wel : Cod Re # : : : : ‏سسا الع حت سن‎ SE SONNE SE ‏ا« تسيإ إ'_ تس ا‎ : : ‏اسم الات ا تا‎ Y 8 : i ‏ا‎ ot ‏ا‎ : : : : ‏يبا ا ب جل‎ : : i ‏حب‎ RANE ‏“ا‎ : : : : POMBE INE RES »n v : : i Te sy 8 3 : : : ‏ل‎ TE YL 3 : i TREN : ; : : : FARR ts Es A Finns dss ‏معاي اا‎ CR RONDA SE CN : : 3 i : Td ‏عا ابطر‎ EE ‏مخ م» كد‎ Be ‏امسق‎ ‎wg PA *! > An A ٠٠١ ‏شكل‎ ‎1 * {eet
‎pd‏ ا ‎REY‏ ‏3 ‏ا لايع كا الوك ‎Ts‏ 53 المج الم . 0 ارح لتر ‎ARR‏ تت ااا اا لا الا : : ‎١‏ : ل ال ‎i‏ الحا ا لدت اح سج التو ‎VARA A‏ الد ل ال د حت ‎IS‏ ‎Ns: 3‏ ادر ا ا ا 8 0 ٍ 3 المج ايت ‎i 8 STREP XE § i‏ الل ال تست سمح ‎ARATE Wee H H H‏ جا لحت لمي 3 3 ‎Aa‏ الت اسلجم ‎Jae i i‏ ال دا ا ا ا 8 ‎i i‏ . § الح دكا الاج ‎i i‏ ¢ بدا ال ا ا ا ‎i‏ 1 لس الما ااا ‎i i i‏ ل ل ل ا ‎i i‏ السبسسسة الح ل ات ‎H i THREES 2 : : i‏ 0 سا ‎MERTENS‏ ‎hw i i i DSTIICEANITRIOONR 2 : i :‏ الست ميات ‎H i‏ 3 عا عم بناج ا ‎H 3 3 i‏ ونيا حا > ‎BEN ph‏ ‎SHERRIE. 8 i i EE SL SI‏ عل 3 8 ‎AORN, we H H i Hast‏ ‎H 3 sage las ’‏ 5 ا امسا د لح ل ل ا ا ان ارجأ ‎١‏ 8 ا ‎EE Ra‏ ا ا 5 البمت ببسيس سب للستت ل د اس ‎AW‏ + ‎H b3 3 i‏ 8 اح ججح عي مج جوع ‎oh a‏ ‎i H 3 3‏ ما ‎ATITIPEINTARGIATNR,‏ سي ‎RRS SAT a vn‏ ‎H 8 3 i‏ ب لاد نت ا لا ا السو :اح ‎H H i :‏ واكم ل ا ا : 3 5 ب 3 ‎os‏ جه ‎١‏ ‎SNA i :‏ ; المج سي ال تح ا الاي ‎bd 3 H‏ 3 با ا ا ارا لاا : ‎A VT NE Fee) : i‏ اا ‎ANE i § i i‏ ايا تست بجاح سمس ‎DO a : ¢ i‏ ‎H H § i‏ § لني سج ا تان ‎i‏ § : لشي الست تك ا ‎H i H :‏ § المت ته ‎ARIST PRETEND Jose i H H TERE‏ ‎i i 1 :‏ و اميد يدجي ‎SANS ITO TRARY RR : i i‏ ‎i i Beaks SOUR SET SUITE SUN‏ : ال ات ا ري ‎ARERR NR ENR Teva by 3 be : CEN Co we. me 0‏ ‎ik 5 ERAN‏ مقر ‎SE SY wa‏ ا أ ااا تا ع ان م ‎TR oo } Te‏ ‎Ng }‏ ب 3 * در ل ‎ges X* BRIER‏ ‎Ys i NE YE RRR A a‏ ‎Mi H‏ الو لعا ‎SR‏ سمش ‎EE SONIA ST DR CEE BEE‏ ‎i‏ السس سيم امتح حت الف ‎Uren.‏ اتا ا اا ديت كا ‎RO‏ ‎H‏ : : الم ‎i : FETTER‏ 1 © سيا ‎FIRE RGR‏ ‎H i‏ : بي ‎RETREAT.
H i : ATER REECE‏ ‎SRI : 8 8‏ مح عض 3 ‎i ty‏ : اجر 0 ‎RR RS py‏ ‎i H : RT inane : 3 8‏ : لبي ال ل ل ا ‎H‏ ; : ا ‎vii: i i i : EE‏ جما ‎IE i i : RE RU : 1 i‏ ات مه لح ‎i‏ : : الا ‎Re Rh‏ ا : 3 ‎AN : i‏ ل ‎H 3‏ : 3 تيه رح دا ا د ‎i 3 : : SIRS‏ ا الا ل ل تاج م 0 تت ل م امم الست سس 2 ٍ ل . ل ٍ 3 ‎BER‏ ‎is Tog‏ ا مشر ‎x £ A & Hay‏ امار ‎Hd‏ ‎YS‏ ¥ ‎٠‏ ؟ ‎Saad‏
N Hay BY
H i. - ‏ا ل امه‎ 0 i Wien pes ‏اليد ؟‎ Boa ‏تا‎ ‎He Set a, EFS fad ‏ن‎ Fi EE TAR ‏ا‎ ro he 1 ‏ا ا مزه يي‎ wl ny ARE da Fo DO: Ee LARIAT AGRT BR CATIA RRO > 9 9 ‏لضا لحك اا ل‎ EDR 8 ‏ا‎ ONIN N WwW XO NE ed "ْ ER RINE 3 i ‏ل مو ا 38 الما‎ Np RT RE ‏د‎ ‏ا‎ ha aden ‏م‎ a REN REY ‏جا‎ SRE ‏م‎ -" TAG ‏با‎ Esse Vo EE NR EE SRR RRR 0 i & ES 8 A Co i Ne AEE FER 3 SEE : 8 BER STRAINERS, pe : Sh i a | He Se wi ‏ل أ أ ان‎ EBERT H CPE ee ESE tht Ce ; J TITTY 1 pe Emme RN SE RR HE RE FRYER FRR RT J 1 ‏ا‎ Eu FE SE SE i i pes fen FIRE TERENCE TE TN N SE go NE bE ‏ا‎ SH ER et SE ‏ا ا‎ Ta a ‏اح د‎ A ‏ا ل ا‎ ‏ام ا ا ا اق :المح اا ؟:‎ RAS ‏ليه ناا‎ an i 8 ‏عب § ا‎ ‏اتن ل ا ا ا ع‎ 3 i =" ‏لكر حي ال لس ا اج مال مح المح‎ 3 one ١ ‏ات‎ ‎A ‏موت و‎ LR ‏يا الا ا ا ا ا ات لا لح‎ ad
8.58 ‏ا ترات‎ oe ‏اا ا سا ا ا‎ ‏ااا ال ا الما حر ا‎ DR A ‏ال‎ re PRES A RR Sid AS f SER ‏تجوت وه وتو‎ Re Te 1 ‏ل اا‎ LR HY EE USNR OORT A ‏اج‎ IE 0 ‏ا الي ل‎ TUE ‏ال ا ا ا ان‎ ‏تا لح و ا ا ممعي ا م ام‎ SRE ERY 3 LEE 0 A ‏اتوت‎ EN ‏امام لمم مم ا حر ا‎ 0 dus SNe Pras PETITE L Sone rot bei TH a = CHEATERS REN Fo ‏تام ا ا‎ ie ‏لاا ايا امك‎ RA ‏ا ما الح ا شتا‎ 1 3 > ESE REE ‏ا ا‎ a LE HE. ‏ير لع اح ال ون لبلا‎ “a ow aw ES ER RAR DRE RY ‏ا‎ v dni i i: 2 Real ‏لل ا‎ ‏اغية‎ Sage ‏تت اق‎ SE ‏الاق ا ما‎ REE ERT RR 1 E fe LE GN CEVA Soran fas mene ‏اااي لما الي لشم لا ا‎ Md My TE 3 5 ‏ا‎ NER ‏انحا م اجات‎ ah TRE ‏با مدن الا با لبا‎ k RRR eT ‏ات تم‎ Ne NERA RE ‏اتش‎ Aer AR RRR Ea ‏ال‎ LORE a Los RE ES AE FEE RAR LR RR ‏عا‎ ‎: : ‏يو اا‎ GENER ‏الس اتات ا‎ ann : EN NEE El dreamed aa ane ta SRR RE FREER SER ‏الجا‎ . RES | ‏اا ا ا و‎ Inna Tr ECE RG RENEE RE RE SE Fornarina HERES REGIE REC ‏اتح ايب‎ TERR JR: RAS \ = Ry ‏او لوعي مدعت حتت ا‎ i i RRA EE TET NRE ERR Re NE SC SOL ‏حي‎ SNR PE ‏سي الا‎ : SIREN Rs pits Farben pe RATTAN REN RARE ‏سس‎ ‎1 A. NL ‏ل لل تت‎ beet ‏ال‎ TRONICTRIRRNANTERES ¥ Fea ‏مد‎ Reon FRAT SN he RAC SIE Vp et ّ . 0 ‏ال حمست‎ 8 ‏دي‎ k REE ‏ل‎ RE ‏ا‎ i. NEE EWE ER ERE SR eyes : ‏م سسا‎ Sai : Ey 5 + DR ‏ل م وج يه و وج و ا ل ل ال‎ Ss SH SEERA EN 31 0 LS 1 x Shige XK @ 3 Gd F RY 8 ER * BW 5 SRE ERE : SHARE ‏لا لش‎ RENAE she BREAN ‏ب ال اا‎ i ‏لضا اي ضاي‎ SRR ٠ ‏ا اتوت‎ 0 ‏يي جو جه ع )؟آاأل[(88‎ SE ‏برضي اتات تلض ااا‎ rE FS SA ‏قالطو الجاع‎ ens. ‏ا‎ sHENES ee oF x ES wa ak 8 ‏مسي‎ #5 NE 8 88 Pe PRANAB, | ‏ب‎ OPS 2 vy 1 3 ‏ال رو اااي مت لاج ل 0 ل‎ Fo ‏الي‎ ‎k 0 RR 8 NAN RAPES ‏يخ لبخت‎ i ‏ا ا اج‎ 1 ‏ال اح وشح جا لح وو ا ألا الا ست ا‎ ‏ا‎ BANE nN ‏وا 5 لل «سووو«‎ Rd BRANES BRR REN E NAR RE ‏حا‎ JR A ‏اي‎ 994 RA RE ay Se ‏ا‎ Hi BS Ba RE 2 ER RR 3 1 ‏ا‎ x a yg _y 3 : Ferber I ‏ا ل الت ل‎ ٍ " Rb irae Betis Lom Ky RRA) ER 2 ER BL RO SET : ‏ا ين‎ Gof PE REAR AAAI ‏ال‎ ‏جح‎ a ‏ل‎ er ee ‏الجديييتتيييي‎ ‏ال‎ ae | sa a a a a ag 5 3 sts ———— ETRE TIN 0500000: | 2 iy es ANNAN 5 Sg 3 1 ‏كا‎ : ‏عيب‎ 5 i
3 CIE SE 2 . ‏لخ جع ا ب‎ bead 0 ET A ١ 0 ‏هن‎ | Rat IE Eee :
“od” Yd 0 ‏ا ا ل‎ SE ERE ER SEs: ia WN R'E iN IF IB
3 | I ٍْ | it IR IB IB IB IB NET RIE iN Ii HNN IR IR ER FT a a a ‏بي عي‎ A aL & 221 ‏شكا‎ ‏بو‎ 8 by ‏ل ا ب‎ ol 0 ‏ا‎ re rh RET ‏اخ‎ ‎Act RNA ‏لاز للها تلا‎ SHINS ‏لل‎ SRN mRNA SUA SATE ANNE Sana ‏الا‎ HAGE SAAN BAY laa wy gn DPSS em-———— 3 ‏ا ا 1 ا‎ LL Na LL En oC gee Gre Be 8 Had ON ‏ا ا ام ا ات اد ا اا‎ or ‏ااا‎ Weel ‏لا‎ WI 2 LL] ‏ل‎ ee 8 ‏ااا‎ ‎SERA TEETER ETE... SERIE he د؟١ ‏مكل‎ -
“a pe A ELTA Bar.
ME Cs st Ty ALEVE ‏المج‎ ‏لاا تا ااا‎ RE A IR ‏جد ل لاا اناي ااا ا‎ TRO ‏لدي‎ IR ‏اا‎ 8: A © 0 EA ‏ماي ال م حا‎ Na CR CD 2 ‏ا‎ ANAT AE ‏سح ا ا لا ا مجع مح ا‎ H ‏ددا الا‎ I ‏نسدد مسمس سوم‎ : REG SR Rr A VIE wiv sss nr Sa SE ‏الت لد ححا تن ل ان 8 : 2 5 لاا اج لصتا‎ 5 ¥ 2 8 ‏م مح‎ Ea aa: : : ‏:اس اماه مج اجاج احج ا‎ H H : H § RR al sa ١ H : 3 PAIN RARE ® 8 3 : H i DESTINO * 3 H : i RE _ ESE ‏الإ‎ : 0:0: |: 0340 4 ‏ا‎ NERS * 3 H : H ‏حت ا‎ i i i Bi ; i 8 ‏ست الم لح ا ا‎ TW 3 H : 3 ‏ا‎ RENCE ERRATA § H H § ; i i EE ty 8 8 : ‏جد اجا ا اي‎ Hy Hy H 3 : 1 HS PENSE Ra iia alate 3 K 3 H Ce, Np cad nL 3 Ie 8 : 3 ¥ TE Ben den B nnd FOTIA 1007 FI ; i 8 SRI TONE 8 8 ee 5 ‏ب‎ v a - ey RB MN kl Forde ringed Nod 3 3 + a RRR H 3 8 3 : 8 8: ‏لان معي‎ AE ‏الي‎ ‎6 , 5 £5 ‏انه » بارع ص‎ SO ‏ل ب‎ Xs i of SX a 0 i ian Rd a FR : 3 STIRS NN ‏عد ياج دجا‎ 1 Kg 1 0 : ‏ل كا ات ل ات ا ل ا‎ aka: sar ‏تيب سيم‎ Mt ‏ل‎ i RHA WIT PRCT TALE, ١ ‏اسح سيم سس‎ i FEATS A NN AN H ALTRI NIKO RAVAN, ‏اميس يست سي‎ i i ‏تا تاج‎ RR ‏اليج ببست لجيجب‎ § ARTISAN RR Ferrrosoodeeretoodovernt i i H ‏ماسح لت جاع مم‎ Dinca : HN 3 ‏المت له جات رع م ا‎ ana, i 3 3 RAT MIRE ‏ا‎ i 3 H H ‏الا الات اما را ادا‎ RRR ¥ H H 3 FURRIERS w—— : 5 i ot fo : 8 5 ‏الم اممتجيية لمك اح ال‎ 8 i Bi i ‏جحي ان‎ Chron ‏ام‎ : § 8 : ‏ادي ا اد الجا ا‎ ee ‏يُّ‎ bd i : H H RR REA RS ‏نر‎ 3 : 3 3 H PERERA ‏الود حلم ا‎ Ny 8 : : By ‏حت ا‎ A SR ‏ا‎ 3 3 3 + 3 ‏الل الس لح حت‎ H : H H ‏اد ال ا ا ص‎ E i i i ‏اسمس مت د ل ا‎ CO US SU SUS SU RVI a ‏ا‎ ‎ae) RASA 2: 4 : { PS EPC ‏ماسر‎ Th ux + ‏جا‎ ‏ا د سب م لذ‎ Re We RE ‏م اود‎ Car ‏أت‎ N 5 ‏هه‎ ™ 13 SEAS CE hha I TR RRR FY ‏الم‎ RR ‏ا‎ RR 8 : : BR ‏سس سم اتاج ا تا ارات‎ > ١ ‏اسح تسج حا‎ oat: ‏مضي ومسي‎ coset ‏ا ال ا ا الت‎ 0 : £ ‏الست سي‎ Se. : ٌ : ‏عا الاج ا ص‎ : 8 : i ‏لتك اا اا الا‎ bh) H i ps : ‏اواج تاناعم لع ا اي‎ i : : 1 ‏ب الم ححا ا ا‎ : : i : ‏ل هوا 0 المت و اوتا اي‎ H : 8 ‏ا‎ 0 i i i § REAR TI i i : H SIREN RNR 8 : : i : ‏امح يع سج د ا‎ ¥ H H : : AES ‏مما‎ ARAL 3 H 8 : : ‏اا الل‎ SRS SR H 3 : H ARR ‏ا‎ By : i : ‏د‎ SON ‏ا ا‎ Sag MAR RY 3 3 : 8 ‏الا ا ل‎ i i i : RSE SE RI ERs SIN § Fi : § ‏ا‎ CREO ROTEL hela SO SN ON. ‏جاجتحا انا‎ rer 4 H i : 3 STREET Tag on a eR PR REN EA SUITE.
TUS Se 3 3 2 ‏ا * اا ا‎ J, aby ‏ا‎ BK gh BE EAA ‏المج ا‎ ‏ا اس توج لام مع 0 * 3 مق جع(‎ SE PR ‏شكل ليه‎
BU SE aa ‏الح الب‎ ART. ‏دي‎ ay : TH SES ‏ب" شح حك اس مسج‎ ‏اس ل اذا اك‎ 8 8 NE Fata Rta Shon SHEE ae RoR yo EL # pen By = EJ WN ER ‏مسح مجم‎ ¥ MERTEN a LE 0 7 NE : 8 ‏ل‎ a Ss a SEAN Sa Noo FRE Ean 0 8 Nes: SL VoNE a STEEN us Se Na aE ‏اد لعا سد‎ wy a Eee 38S aan RA a 3 WN Es o SUNT TT ‏ا ل ل‎ x so » 8 ‏ف‎ es NG ‏ال ل 0 ا ص ا‎ ‏أ يتنا تايبا امت ع دا‎ ١ ‏ا‎ EA connie 3 a ‏ع ل ايا‎ a 3 RR sR a] ‏م‎ ‎% ‏م ع‎ ‏ا‎ ; se Gi = YE] wat ‏ب الل‎ 3 ‏د جك الما 8 & : + أ‎ 0 pa FE TI 5 ‏اال الي واي‎ 8 gr: ® Ci ES 1 + = ie ; 3 8 2 Ra ¥ + 3 NK 8 : 3 ty #3 Fa ay Ri 3 8 ol & 0 3 5 ‏اي ااا‎ ‏ال ٍ ال‎ HRS i Fay ba i yr BE 5 i ‏ا‎ ‎8 1 i BUR & 53 3 § NEE 0% ‏ا & د‎ 4 753 Ny 8 HN BURR & REE 8 ‏الا‎ Fe HY gi BYR OB NEY : § 3 wl Fig NE LB Sd FE WE FH RUE Nia Aid SE, HEE ENE NE 53 RELL LE 3.2 # NIE NE SEN ES. > 3 CR Ra NE Tey ‏ذا ل‎ 3 2 NE JR 3 1 ‏د‎ : ‏مد‎ EX Sk ‏ل‎ ER 3 Li, of 3 3 ‏ا ادسج لعا‎ AE 8 1 88 Ses § Tis SE 8 5 ‏ا ادي عسي ديدي الحا ال‎ SORE T/A NR Aud 3 oF OF ‏الا‎ CT Et] & 8 i ‏ب تيت جا‎ NES SEs Faas Fae APP AONE ‏أ ايل‎ EB ‏ا‎ ‏الى ا ال @ غم ال ل الا‎ & af SRT : ‏مودي اليا ا دي ل‎ ‏لج مج اق ىج ى‎ yy SUT SRT ‏اي‎ EN FFE ‏ال‎ oF ; ¥ 8 8 ‏اتويت‎ Ags ‏ل مس‎ >“ : a EWE EE wma _ : OUD A ‏محا‎ ‎Hye Xow & SE SER ‏مستي‎ ‎Yd CR 0 i GE RE SRN ‏؟‎ HE f va ‏الس‎ HEE 8 by px HN 8 ky i A : 5 BS + 5 3 i Macy 8 ‏ا‎ 0 i fn ‏ل 2 ؟‎ 4 food : * FEN SE 0 42 3 ; i : a $0 5 ‏لب ا‎ 0 ag EE 8 ‏ب‎ : 3 ks A H ‏ل ا الو‎ ‘A 8 i = © : 1 ‏ونا حم ا اا لاا‎ IR { ep ® ‏ال اا امو ا ااا 5 3 مل‎ Saw.) ‏د‎ ‎ECE FH ‏لا‎ ae FY 0} oa . ! PRT i nd HE HI Ls eT Sy EE tid ok ‏ال‎ NS § 8# ‏ل‎ ES iy ow 3 BS ‏ع‎ Wn ed 3 a 2 Lo 3 Tyo ¥ = 5 H RR NTE Ue ‏7ض‎ i ¥ Hy = 1. 8 #*# ‏خخ‎ 8 YEE ‏ال ا‎ { } 9 pd = 8 : ‏الخ‎ 5 § : a Nd Bd HS a Be ES By NS : 0 15 J ii EF ‏ءا‎ Sw, © 8 Ll EN i CR hat LER & Ff Rasa Sat En RE J ‏ا‎ i : ‏ل‎ a ‏مما‎ lied 0. ‏ا‎ ‏سا دالا‎ : 3 Cea Ta Dinan SER ‏ا ؟‎ EN ‏موي‎ ER sae a : ‏؟‎ Er ‏بيد‎ ERR ‏امجح‎ ‎1 ‏اج‎ a Rds WES ‏لات جو‎ SER ¥ SE iF IC EE SEE RICE.
SI EW ‏ا 1 1د 13 لق‎ Re iS IE: I ‏يي‎ © 8 1 Sow ‏؟ ل‎ - % 8 Waa 8 ‏الا ال ...نذا‎ © i ES H 3 a Et) 8 i RS a BR be LW 8 i RS = EY 3 ih I J ‏.ا‎ 3 ‏ل‎ 8 8 BN 4 TRAC 5 pa 3 A 8 Fea SRG SF LE ‏سب طاسب احج اي‎ 7 ‏لاملا كه ا‎ RISER ia I ‏المح‎
‎SEE‏ ‎LA EE J‏
‎a.‏ ا — ‎AY‏ ‎Wa LW + : \ = a \ = \ a 3 8, a"‏ ‎St‏ ا تس 0 ا تس ‎Bh‏ 83 و د ا لذ | ان ‎NONE EEE‏ = ا ‎١‏ انا 0 ‎UN‏ " د ‎he Ex‏ ‎an 17 wa am‏ ا © ا \ خخ 3 40# ‎AEE BE EB EE‏ ‎a‏ ا ‎BY. nb Nl NN‏ ‎L‏ \ - \ اد 0 5 #7 ا ‎NEE‏ 0 1د ايا الى ” ا أل اي صر ‎Bh‏ ‎soy & 9 sa a‏ . حور شكل ‎ry‏ ‏اا ا ا الما ان اا 8 ان ‎sy‏ . ا اق ات * و ‎A rf . “05”‏ «#رع* 5 لس ال | اس * ‎“op” oy‏ ‎“op‏ « م ا ل سسا حول ع 8 = ها صف 86 ب ‎i fh (3 {a‏ دي وا شكل ‎Yr‏
Se ‏ايد‎ fad 2k : : v3” i shRNAY ‏الا لفقل‎ shRNAY shRNAZ shiRN FR ‏اماج ليا الى اير اي‎ 5 ESE IN ‏ا‎ shRNAS | shRNA 1# 3 4 ET, 3 Ie fu x i i 8 Nil 1 = en ‏ا سسا‎ Re ‏لالد ا الا م ل اا لل ال ات‎ 3 7 3 Am ‏ات‎ SE ‏داج‎ NER ‏ا الام الل تيع‎ TE a SETS od Su k Na 8 > JR ‏ال ىا ااا‎ 3 ete: ‏ماي اا ا ااا لا‎ : ‏ا‎ NEA RE tk ser wy ETRE Se TA) NENA TERRY SEX ‏ال ال‎ NR 8 ‏ا‎ EER ‏ا ل الح ل‎ RRS ‏ا‎ Ra o03 ABE SER IRONT SRR 2 RSE RT : 1 bd 0 ahaa > ‏اح اتا‎ a ‏و ا‎ EN ‏ا‎ 8 FOREN ea NN ERIE re serena I EE i gL ¢ i SNE i AE \ NN fam NN NN AR ARNE EEN SOR THER Sa I ‏الا‎ it I ‏ل‎ Tr ‏ا الى لت ا[ الا ا الأ‎ 70 ‏ل ل المع بجو جا اع 2 07 انها‎ RETA ‏ا الا حت‎ To NT Te Me ‏ل‎ lL ‏د‎ THREE Sl hi i a A ) N rE Ri 3 EI B q Ys 3 nd 0 ِ ‏ا الل‎ 0 i ‏كح ام‎ Sut f shRNA J chRNA Cn pet Eia8) fF shiRNAR 3 ‏اج اي ب لني‎ ‏ا ين > : اام ا نس ري‎ FE Se A gE EE A. 1-5 NN sere Ped geet ‏الب ا مسا م ل ل‎ ‏ا‎ I ‏ا‎ RE 3 RE a orate ald 3 EI ‏ب‎ 1 i . 3 A Eri i 3 NN Re : Fa ER J & ‏م ا‎ J.
NN Sa : ‏اال اع ا‎ 0 ٍ EY PRCT FRC SE ‏ممه‎ iL NN LL 1 TARE : 3 Roi ‏ال ا«‎ ER ee ed i NS ‏الخ‎ doo iN CET es FO ‏موسج و دب امج الي الا لاحي ا اه ا‎ 3 Fon ‏ا‎ is ‏ايا‎ 1 NUR SA BT SEER ER RR aa Ff Sl ‏الت ا‎ ‏الل ااا ا‎ Ea EE ‏ل ال‎ ‏ل الا 600 ا اه ا ل ل‎ Sa : i ‏جا اا‎ TRE ‏ال أب‎ EA 8 8 ‏الما‎ SEER : EEN + oy Fe Ye 5 abe BE ‏التي ست ولي ا 2 الو‎ Way 2 1 33 a¥ ‏كا‎ & CERNE ‏ما‎
NE ‏ا ا 4 خا > يي ا »> ا يريت ا بن بج‎ OW ‏وج ع‎ 5 ® & 3 ee 0 p * ‏ا‎ ْ : p 0 8 Yam ¥ > ‏ا «#اج 2؟‎ #« : & & FT & 1 a By <= HE 3 fay T B be NE & pd RE # i Ye we Fw Tow 8 ‏م ان ا‎ ‏موق‎ *% *¥ : Bl Fe & {os ‏اع‎ i aa d N 8 ‏الحا اي‎ ©: 8 pS . 3 Bw 88 £3 Y Beet Td wee ay 8 ‏ا يي‎ ® 8 en ‏م‎ aoa 3 8 ‏ا الي‎ by cd YY EY ‏جد‎ 1 8 ‏ل‎ ia = bs <>*+* ‏د لد ؟‎ FEE # ‏احج‎ ‎: < » RE. by WE 3 ‏تت 2 8 ماح ا المع‎ Voge BOW x 3} POR ae {Sem N * * 1 ‏ل 8 ا الم مد‎ NRW N X RE 5 8 . wv i fo EAR ‏الس اه ا‎ Ea ‏ا ا ا ا ا ا ا ا تن تتا ا ا‎ Ee : ? 3 8 5 by £34 Foie { 3 : Yt Toa © :* ْ : 3 2 3 i HS 3 i i 8 8 ‏الا‎ H H 8 H N 3 3 HS H 3 3 BS 8 ‏ج‎ ‎5 i ¥ H HS 8 2 HR N H ‏سك‎ NN Sede ean Seder ‏التاق‎ de ‏الع ا أ‎ Se Se the hota Se de Warde ‏الل عت لت ل ا ا ل‎ J, ‏م ع ع حي الاج حت كرت تح اه تح رت ل ا‎ ge ERIN ‏اه‎ RR TRE ‏و حا الو ا الود الا ا لاح هن الوا ماي ام ات دا ال لا‎ ‏مار ل اي ع ليك‎ So FUR aa Past 8 LTTE XY ‏شكل‎ ‎Yas 3 ge ped 33 roe SED BE wey 8 > ٍ 8 i «1 i * : Ax 4 8 > i sa® 0 1 Tr 1 8 8 ‏ج ا ججججيع جم‎ 8 8 ‏م‎ k 8 ‏يي‎ ‎{a 3} > a E ¥ ; RE FES J ‏ب‎ i Bi ER i # NER EVE 1 50% # Ea ١ 1 8 . ‏ل‎ "- soning we. "> i + * hd k RR ‏الل بين‎ 8 a 3 ‏اين‎ 3 1 8 : pe FE J x3 i I TY REE : ‏الل‎ 8 co gan ‏البو‎ anal RR Fg i i «<١ od ‏مس ف‎ Fw ] a BEX i 1 ‏دع‎ Ve . 1 wade * j Aged ‏امد د ل ل صخر‎ hue ‏يي بحي‎ ‏المع‎ EE ١ ‏ات واي‎ Ta 1a Cas ‏لي‎ Rog ‏ا‎ ‎ALYY ‏شكل‎
‏ة‎ ‎0" NR ‏سيسم ببسيس سيبس‎ , ¥en SY ‏شكل‎ ‎J I 18 8 ‏ب‎ ١ ‏؛*‎ ee \ 0 ٍْ SEE ET 8 ‏بك‎ ‏يا‎ x ‏تتح حم حت يب]‎ AAR ‏ا‎ \ ~ NS 0 = ‏م با اا مستت يي اتا 363 ال‎ Yi N X N “ge EAA a EA aa a i a Fo son k PERE] * ‏ال‎ == b SEE NTR ee ‏ع ع الع‎ _ SEE = Gh an ev ANE aN yw ELE ) ‏ع‎ ‏م : 35 0 لت شكل بدي‎
Sam. ow XR Are Shy ‏ل ار‎ ‏فنا‎ Wi ‏دولا‎
الم" ال الت ا م١‏
1 ‏مستت‎ wi . ved RE] :
—— XH : ERE ‏ا لأ لسوت نات‎ Ss ‏ملل‎ ‏يأ‎ : Ni i : he 8 0 + SER a 8 = wf Fo 0" 8 : ‏اا‎ EE aS
0 ‏ال —— اا‎ ١
‎do a EE % ie NY ;‏ +< 1 + خض( 1 8 : ‎Raa‏ م
‎stop x 5 SRT “3 \ TE ‏م ست الاي‎ ‏ا 5 : > ل" 8 ا‎ 5 Pei 0 ‏يا‎ EE IE Sn ‏اي‎ AN NEE = f —-—
‏قا ‎Cr‏ لسكا تي ل ‎oo ETE DE‏ ‎IRL‏ سنا" ندا ا ان
‎Gin 3 SNE 4 “3 8 ‏ا ا‎ 73 8 a U3 3 ‏تيع‎ RN ‏لج‎ ‏حي‎ IE ‏ل‎ SA Wy ْ (SE £1 NE BE SW eed aaa Ey ps nasi prs Ry El BEIM ‏لد‎ RON § aga? Sar 5 0 ‏تاليا #إتتتت‎ - 1_0 ‏ا‎ 1 8 : 8 Ped SR i WAR A 0 ‏ب‎ ay : SN (IE ER LL 3 ‏تا ا تسسا ةا‎ EAN ‏ل‎ ‏اا‎ ET ‏الجاع الات‎ 7! eed TV Tera
‏9045 \ 97 ادن 53 ا - ل
‎fig ‏ا‎ SER EE 2 8 ‏الس ا سح‎ i 8 ‏ع 3" الس ا‎ CANNED | I oa ol ‏الا‎ ‏ااا‎ WE ‏لت‎ WE
‎IR 0 N . 5 5 2 = > 5 ٍ ‏ب م‎ ٍ = = BS 3 ِ
‎« ARC a > ١
‎3 ‏م‎ Tags Lat + 0 BY ‏شكل‎
‏يب‎ tas i & ‏م«‎ 8 k a .: ol a Ey AN FF SSF } 3 . & ‏ص‎ & & PN Fa \ = ‏ل ب‎ a 3 \ 8 oo 8 ‏ا‎ Ti : ‏ل‎ es 1 0 wor BE ‏الس« اس‎ * 0 N ‏ا تدع‎ : \ \ ‏اس ل اه‎ : \ \ ‏سين‎ CRE ‏و اللتتاحاا‎ Pp pe $e NR : ٍ ‏كي اخ الى‎ ‏لايل ب‎ 0 & WF oF eg OF 8 : ‏حمق‎ SEF 3 = 3 ht fh H i ' ‏لقع‎ ‎wd by 0 wget 1 i TS Khel j B] h ‏ل‎ ‎J Wao ox NTE A 4 i ha : 7 3 El * ْ ‏كيد ا« لل‎ ‏ال و‎ fees H i ER : Fa ‏مس الا‎ sa EE. ‏المج ا‎ ‏د ا سرد و‎ ١ AOR ‏ميا ما الي‎ PTT IE ‏ا ل م‎ ‏لين تت‎ WY Hae EA ‏داس ل تجو‎ Sg
48 ‏أ الي ب‎ 4 1 ‏به 1 ا‎ v . i i 1 8 i i { i : i N 5 8 i ES 2 ¥ i 0 i 1 i HB 3 2 2 i i Eo i § i 13 i Say ¥ #4 i i 0 i i} i 1 ‏ل‎ yd $5 oar dd Wo ‏ل‎ ‎SAR ‏حالاحتةة‎ » WE ‏لي‎ I. N SRE see, Dey Be 0 0 0 E:T XY ERE. : wr Yeh BV es 0 3 3 N a \ i ‏تيد 1 دا‎ \ 8 1 ‏ج‎ ٍِ . \ HEE $ A ne NEN N TR 3 HN 3 N NN NN NR 8 i 1 8 ‏الا صقر‎ ANNE DN 8 8 Ny g . ERR Ts > 8 ES E NE 8 ® 8 pl = RAE, 5 0 i 3 0 ROE ‏بح‎ : ‏ا‎ i ‏اي اد ال 3 ف‎ FEE 2 4 hy 3 AE 5 $3 3 Es 3 i i PEN 13 BR 8 TERY 13 + + 8 REIN i £3 5 FIRS RE 8 bh! UN ‏أ‎ Ta BRL iH EN i SNE mE EL HR wa id . ‏سج ل ل‎ J amie ea ‏مس‎ ‎Wo ‏ا‎ G5 as Bhs 80 8 0 ‏ل‎ ‎bog AE vy Has 3 LEN Bete te Bre 3 . Bre 4+ ‏الا‎ ] | ٍْ 8 va “AN “(> ‏مب ا دن | اط‎ rs re ‏اكه ل ل ا ل ل‎ Toke Tr WE Tere he We ‏ون كن‎ ‏ا‎ TEE... ‏ااا‎ ‎+ ‏لس‎ -- Deas ١ ‏ل‎ | ER ‏ف‎ EE EET a ae ‏ااا« لصي 0 السمنتسح>‎ NORE ‏ا السفي* ا‎ te ‏شكل‎ pa ih EE ‏قم“‎ So yy" pi ng ‏ال‎ ge ‏اح‎ > 1 Lh Le Pa La ‏ا | ال ايو« د ان‎ | alli ul Wa TE i ae TEE ‏ا‎ Ped : ‏مي‎ EE TE SC 0 ‏ا‎ 0 Lak FETE ‏الال اي‎ ‏الل زوع " ب هيد‎ 0 La av ‏ب‎ ١ ape ‏ال وت الو يت ا ولا‎ Sed yet ١ 5# 1 [f= Ce 4 8 : i 4 : 38# Wale IR BET ‏اع‎ ‎0 ERIN: ir ‏اسيم يجا‎ I ‏اح‎ HN 7 BS) pe ‏ال لح مدير‎ 1 ‏ا ل‎ ‏اا ب‎ 1 va Cv Vo ] ‏انبا‎ 7 Wa HI ‏سس ع يع مسو‎ ‏ا‎ I 3 ‏اا ا‎ LN ET 1 EE ‏افق 0 0 لال‎ 4 \ ; SS : . : qT \¥ i | + Adis { iy ‏لجن سو موسا‎ 8 F 8 FER 3 od CET ‏ال‎ ‏ا‎ rae » ‏زا‎ ‎i : & iy i BG i A ! & ad iN Goa ag \ ‏ا‎ } : a 3 ‏ال‎ ‎UES ‎“a” : YY % ‏شكز‎ Nl
يي ليا ا
‎vy Yun A 8 8 Ao pss‏ تيا ا« عع
‎TTT 3 \ wy . ‏امسسة‎
‎pyr TE - 0 ‏نجه‎ 0 oil | I"
‎al | EE We 0 . i — 5 . 1 . Bh § | . sale Yo Ni . HET 3 0 ‏حي‎ Spt ‏ا * نا‎ ‏لاا‎ ged ‏د ااا‎ Th
‎LE ‏أن‎
‎IN RY I ‏ا‎
‎MEE |‏ ا صقري
‎hg “ae” wp ‏حرج‎ ap"
‎TARY
‏و‎ : 2 ‏اج‎ | T Be 3 88 3 Be © . ‏ل‎ : BN : ES ‏ل ءا “يلا‎ 0 : : NN ‏؟‎ 0 0 N a YN NY ‏لا لاصف‎ .! > PA x» LE A 2 aka Shy” “yy YA ‏شكل‎
‎i or 013‏ ا اا ا لأا اا اال مل ‎i‏ — مو 1 ‎oe Lotsa RR TY on A‏ 3 باب ‎RC‏ ‏جر * ‎Bh 3 BB pate‏ متكت جه جحي جحت ري لل ع و 1 0 ‎Bh‏ ‎i‏ ‏ا : :. 3 جا 3 ‎LER I Bah SE‏ 2% ال ات 8 ‎wr 1‏ انك وو ا لمش ...4 ‎NN‏ ‏م © ‎I LAAN‏ اليل = ا ند ‎INE‏ ‎LR Va no TT a "0‏ ¥ ل ا ا ‎rN‏ 2 ‎LEN‏ صقر ا 008 ا اا ‎ORYAYE‏ تيبو" ‎hha LT RIAN to.‏ شكلةٌ ‎١‏
WwW ed Ag ETRE 1 ‏ا‎ ‏]متت > ججح حت جع وا مستت مد ا را نما جد دن مج جو لمج لمج حي جا جر نين جحو جيرا ا اد لح اه رن‎ ‏د لكك« ا ل‎ FEES REA A A A RR TE TGS SN BRA LER Bu ‏ست كيه‎ 1 ‏ست ع ا ل ا‎ ‏ل لا ل‎ ri ‏ات‎ ‎PET Ton deine ‏لإ ا ب‎ TTT HEE ‏ل‎ HR TE ‏ا ب‎ RE PLR SUT LT an eddie o 4 ‏اح ا‎ TCR aT ‏مو‎ a ‏مشر‎ 1 3 PEPPER RRR HRS ‏الا ا ا اا ا معدي ل مد‎ 8 ‏لك بم ةا نجنا اكد لماعت للد ا ا‎ eae TN FA TON TRAIT RTT ‏بر ري‎ Adige 1 ‏ا‎ ‏؟‎ ٠ ‏شكل‎ ‏راطم ا م‎ 0 a ‏كن كنآ أل‎ a ‏م اج‎ ‏الج ادك ارح اليد الاك الح ال ل‎ : es ed ‏الا‎ Ll ‏ام لات سس ااا‎ ‏ا ل سو ا ا ب حي‎ Ag } nd 3 ‏ا‎ 3 H SS RR RN sina - : : : FF FS & & & Ee & ‏م ا الما ماق ةك‎ Ag : - LRAT
لاله الهيلة السعودية الملضية الفكرية ا ‎Sued Authority for intallentual Property‏ ‎RE‏ .¥ + \ ا 0 § 8 ‎Ss o‏ + < م ‎SNE‏ اج > عي كي الج ‎TE I UN BE Ca‏ ‎a‏ ةا ‎ww‏ جيثة > ‎Ld Ed H Ed - 2 Ld‏ وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها ‎of‏ سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. ‎Ad‏ ‏صادرة عن + ب ب ‎٠.‏ ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > فهذا ص ب ‎101١‏ .| لريا ‎1*١ v=‏ ؛ المملكة | لعربية | لسعودية ‎SAIP@SAIP.GOV.SA‏
SA516380143A 2014-04-25 2016-10-25 تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين SA516380143B1 (ar)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461984247P 2014-04-25 2014-04-25
US201462066783P 2014-10-21 2014-10-21
PCT/US2015/027527 WO2015164750A2 (en) 2014-04-25 2015-04-24 Compositions and methods to treating hemoglobinopathies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SA516380143B1 true SA516380143B1 (ar) 2020-05-14

Family

ID=54333430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SA516380143A SA516380143B1 (ar) 2014-04-25 2016-10-25 تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين

Country Status (17)

Country Link
US (4) US10287588B2 (ar)
EP (2) EP3598984B1 (ar)
JP (2) JP6514717B2 (ar)
KR (1) KR102390629B1 (ar)
CN (2) CN106794260B (ar)
AU (1) AU2015249381B2 (ar)
BR (1) BR112016024565A2 (ar)
CA (1) CA2946309C (ar)
DK (1) DK3134130T3 (ar)
ES (1) ES2744186T3 (ar)
IL (1) IL248469B (ar)
MX (1) MX2016013832A (ar)
RU (1) RU2707540C2 (ar)
SA (1) SA516380143B1 (ar)
SG (2) SG10201809290SA (ar)
WO (1) WO2015164750A2 (ar)
ZA (1) ZA201607540B (ar)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2925864T3 (en) 2012-11-27 2019-02-11 Childrens Medical Ct Corp DIRECTIONAL TARGETING OF DISTANT BCL11A CONTROLS FOR FETAL HEMOGLOBIN REINUCTION
CA2946309C (en) 2014-04-25 2021-11-09 Michael MILSOM Synthetic bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
WO2016182917A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
CA3009727A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
WO2017156015A2 (en) * 2016-03-07 2017-09-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Micrornas and methods of their use
EP3526319A4 (en) 2016-10-14 2020-07-29 Children's Medical Center Corporation METHOD AND COMPOSITIONS AND FOR TREATING DISEASES AND DISORDERS OF THE CENTRAL VENTILATION SYSTEM
AU2018210853B2 (en) 2017-01-17 2023-09-28 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating lysosomal storage diseases and disorders
WO2018136434A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for diagnosing and treating peroxisomal diseases
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
WO2018183692A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Bluebird Bio, Inc. Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
US11261441B2 (en) * 2017-03-29 2022-03-01 Bluebird Bio, Inc. Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
WO2018220211A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Viral vector combining gene therapy and genome editing approaches for gene therapy of genetic disorders
US10648728B2 (en) 2017-09-29 2020-05-12 Nxp Usa, Inc. Multifunctional radio frequency systems and methods for UV sterilization, air purification, and defrost operations
CN109722415B (zh) * 2017-10-27 2021-01-26 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培养方法
BR112020011255A2 (pt) * 2017-12-05 2020-11-24 Vertex Pharmaceuticals Incorporated células-tronco e progenitoras hematopoiéticas cd34+ humanas modificadas por crispr-cas9 e usos das mesmas
WO2019213013A1 (en) * 2018-05-02 2019-11-07 The Children's Medical Center Corporation Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
EP3942046A1 (en) * 2019-03-22 2022-01-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bifunctional vectors allowing bcl11a silencing and expression of an anti-sickling hbb and uses thereof for gene therapy of b- hemoglobinopathies
WO2021067613A1 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
KR20230023612A (ko) 2020-04-02 2023-02-17 마이레큘, 인크. 조작된 올리고뉴클레오티드를 사용한 표적화된 억제
US20240279657A1 (en) * 2021-06-16 2024-08-22 Duke University Compositions and methods for the prevention and treatment of hemoglobinopathies
CN114990164B (zh) * 2022-06-16 2023-12-05 北京大学 中介体复合物亚基抑制剂及其应用

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5635387A (en) 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
AU671450B2 (en) 1992-03-20 1996-08-29 Baylor College Of Medicine A DNA transporter system and method of use
US5460964A (en) 1992-04-03 1995-10-24 Regents Of The University Of Minnesota Method for culturing hematopoietic cells
US5409813A (en) 1993-09-30 1995-04-25 Systemix, Inc. Method for mammalian cell separation from a mixture of cell populations
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
US5928638A (en) 1996-06-17 1999-07-27 Systemix, Inc. Methods for gene transfer
US8101349B2 (en) * 1997-12-23 2012-01-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Gene products differentially expressed in cancerous cells and their methods of use II
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
EP1076715B1 (en) 1998-05-13 2007-07-18 Genetix Pharmaceuticals Inc. Lentiviral packaging cells
CZ308053B6 (cs) 2000-12-01 2019-11-27 Max Planck Gesellschaft Izolovaná molekula dvouřetězcové RNA, způsob její výroby a její použití
DK2284266T3 (da) 2002-11-14 2014-01-13 Thermo Fisher Scient Biosciences Inc sIRNA-MOLEKYLE MOD TP53
ES2348868T3 (es) 2002-12-13 2010-12-16 Genetix Pharmaceuticals Inc. Vectores retrovirales terapeuticos para terapia genica.
KR20070085113A (ko) 2004-05-11 2007-08-27 가부시키가이샤 알파젠 Rna간섭을 생기게 하는 폴리뉴클레오티드, 및 이를 이용한유전자발현억제 방법
EP2479285B1 (en) * 2006-01-05 2014-05-14 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-based methods and compositions for the diagnosis and treatment of solid cancers
US20080051431A1 (en) 2006-05-26 2008-02-28 Dominique Verhelle Methods and compositions using immunomodulatory compounds in combination therapy
US9051391B2 (en) 2007-06-11 2015-06-09 Takara Bio Inc. Method for expression of specific gene
GB0713183D0 (en) 2007-07-06 2007-08-15 King S College London Method
WO2010030963A2 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Children's Medical Center Corporation Modulation of bcl11a for treatment of hemoglobinopathies
US20110294114A1 (en) 2009-12-04 2011-12-01 Cincinnati Children's Hospital Medical Center Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells
EP2509418A4 (en) 2009-12-08 2013-03-20 Hemaquest Pharmaceuticals Inc METHODS AND REGIMES AT LOW DOSE FOR TREATING RED GLOBULAR DISORDERS
EP3502254A1 (en) 2010-04-23 2019-06-26 Cold Spring Harbor Laboratory Novel structurally designed shrnas
GB201012420D0 (en) * 2010-07-23 2010-09-08 Univ Erasmus Medical Ct Foetal heamoglobin inhibitor
WO2012073047A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Genome Research Limited Compositions and methods
EP2648763A4 (en) * 2010-12-10 2014-05-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR EXPRESSION INHIBITION OF GENES KLF-1 AND BCL11A
WO2012170911A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Bluebird Bio, Inc. Gene therapy vectors for adrenoleukodystrophy and adrenomyeloneuropathy
KR102011532B1 (ko) 2011-09-30 2019-08-16 블루버드 바이오, 인코포레이티드. 개선된 바이러스 형질도입을 위한 화합물
ES2641840T3 (es) 2012-02-24 2017-11-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Composiciones y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías
US10174315B2 (en) 2012-05-16 2019-01-08 The General Hospital Corporation Compositions and methods for modulating hemoglobin gene family expression
DK2800811T3 (en) 2012-05-25 2017-07-17 Univ Vienna METHODS AND COMPOSITIONS FOR RNA DIRECTIVE TARGET DNA MODIFICATION AND FOR RNA DIRECTIVE MODULATION OF TRANSCRIPTION
DK2925864T3 (en) 2012-11-27 2019-02-11 Childrens Medical Ct Corp DIRECTIONAL TARGETING OF DISTANT BCL11A CONTROLS FOR FETAL HEMOGLOBIN REINUCTION
KR20150105633A (ko) 2012-12-12 2015-09-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 시스템, 방법 및 최적화된 가이드 조성물의 조작
WO2014093965A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Case Western Reserve University Genomic rna packaging enhancer element
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
WO2015065964A1 (en) 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
PL3492593T3 (pl) 2013-11-13 2022-04-19 Children's Medical Center Corporation Regulacja ekspresji genów, w której pośredniczą nukleazy
EP3981876A1 (en) 2014-03-26 2022-04-13 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
SG10201809379UA (en) 2014-04-25 2018-11-29 Bluebird Bio Inc Mnd promoter chimeric antigen receptors
EP3134434A4 (en) 2014-04-25 2017-10-25 Bluebird Bio, Inc. Kappa/lambda chimeric antigen receptors
CA2946309C (en) 2014-04-25 2021-11-09 Michael MILSOM Synthetic bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
EP3160980B1 (en) 2014-05-28 2020-05-20 The Regents of the University of California HYBRID tRNA/pre-miRNA MOLECULES AND METHODS OF USE
SG11201704727WA (en) 2014-12-12 2017-07-28 Bluebird Bio Inc Bcma chimeric antigen receptors
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
EP3294879A4 (en) 2015-05-14 2019-02-20 University of Southern California OPTIMIZED GENETIZATION WITH A RECOMBINANT ENDONUCLEASE SYSTEM
CN108136014A (zh) 2015-08-31 2018-06-08 蓝鸟生物公司 抗唾液酸tn嵌合抗原受体
GB201522243D0 (en) 2015-12-16 2016-01-27 Ucl Business Plc Treatment
EP3414321B8 (en) 2016-02-12 2023-05-03 bluebird bio, Inc. Vcn enhancer compositions and methods of using the same
WO2017173092A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 The Regents Of The University Of California Methods for genome editing in zygotes
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery

Also Published As

Publication number Publication date
US10287588B2 (en) 2019-05-14
JP2017513505A (ja) 2017-06-01
EP3134130A2 (en) 2017-03-01
CN106794260B (zh) 2021-02-23
CA2946309C (en) 2021-11-09
US20200370048A1 (en) 2020-11-26
RU2707540C2 (ru) 2019-11-27
AU2015249381B2 (en) 2020-04-30
AU2015249381A2 (en) 2018-03-29
DK3134130T3 (da) 2019-08-26
JP6514717B2 (ja) 2019-05-15
IL248469B (en) 2020-04-30
US11124794B2 (en) 2021-09-21
KR20170005025A (ko) 2017-01-11
KR102390629B1 (ko) 2022-04-26
IL248469A0 (en) 2016-12-29
WO2015164750A3 (en) 2015-12-17
ZA201607540B (en) 2019-04-24
US20170218372A1 (en) 2017-08-03
JP6713073B2 (ja) 2020-06-24
MX2016013832A (es) 2017-03-09
EP3134130A4 (en) 2018-04-04
RU2016145964A3 (ar) 2019-04-23
AU2015249381A1 (en) 2016-11-10
SG10201809290SA (en) 2019-01-30
US20190316136A1 (en) 2019-10-17
CN112852812A (zh) 2021-05-28
CN106794260A (zh) 2017-05-31
EP3134130B1 (en) 2019-06-12
JP2019129846A (ja) 2019-08-08
ES2744186T3 (es) 2020-02-24
BR112016024565A2 (pt) 2018-01-23
WO2015164750A2 (en) 2015-10-29
EP3598984A1 (en) 2020-01-29
US20220056453A1 (en) 2022-02-24
US11739329B2 (en) 2023-08-29
RU2016145964A (ru) 2018-05-25
US10662429B2 (en) 2020-05-26
NZ726792A (en) 2020-09-25
SG11201608482UA (en) 2016-11-29
CA2946309A1 (en) 2015-10-29
EP3598984B1 (en) 2024-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SA516380143B1 (ar) تركيبات وطرق لعلاج أمراض الهيموجلوبين
KR101793615B1 (ko) 유전자 벡터
BR112020018364A2 (pt) Sistemas e métodos para o tratamento de hemoglobinopatias
EP3088526B1 (en) Use of mirna-214 inhibitor in inhibiting regulatory t cells
Johansson et al. Hematopoietic stem cell–targeted neonatal gene therapy reverses lethally progressive osteopetrosis in oc/oc mice
CN102438631A (zh) 抗hiv干细胞及其用途
US11566226B2 (en) Natural killer cells
US20210085707A1 (en) Improved bcl11a micrornas for treating hemoglobinopathies
WO2014200557A1 (en) Method of increasing the amount of fetal hemoglobin in a cell and/or mammal
US20150283164A1 (en) Treatment of Myelodysplastic Syndrome by Inhibition of NR2F2
WO2023081003A1 (en) Constructs comprising tandem microrna-adapted short hairpin rna (shmir) for increasing fetal hemoglobin
NZ726792B2 (en) Compositions and methods to treating hemoglobinopathies
Wang Alternatively Spliced CSF3R in Human Health and Disease
EP3301175A1 (en) Means and methods for mobilizing hematopoietic stem cells (hscs)