BR112020018364A2 - Sistemas e métodos para o tratamento de hemoglobinopatias - Google Patents

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Jack HEATH
John Anthony Zuris
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Abstract

SISTEMAS E MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE HEMOGLOBINOTATIAS. Sistemas de edição de genoma, RNAs guia e métodos mediados por CRISPR são fornecidos para alterar porções dos loci HBG1 e HBG2, porções do intensificador específico de eritroide do gene BCL11A, ou uma sua combinação, em células e aumentar a expressão de hemoglobina fetal.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SISTEMAS E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE HEMOGLOBINOPATIAS". Referência a Pedidos Relacionados
[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisó- rio dos Estados Unidos Nos. 62/643.168, depositado em 14 de março de 2018, 62/767.488, depositado em 14 de novembro de 2018 e 62/773.073, depositado em 29 de novembro de 2018, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Listagem de Sequências
[0002] Este pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web, e é incorporada por referên- cia na sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 14 de março de 2019, é denominada de 2019-03-14 EM115PCT Editas 8013WO002 Sequen- ce Listing.txt e tem 811 KB de tamanho.
CAMPO
[0003] Esta divulgação refere-se a sistemas de edição de genoma e métodos para alterar uma sequência de ácido nucleico alvo ou modu- lar a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo e suas aplica- ções em conexão com a alteração de genes que codificam subunidades de hemoglobina e/ou tratamento de hemoglobinopatias. Antecedentes
[0004] A hemoglobina (Hb) transporta oxigênio nos eritrócitos ou glóbulos vermelhos (RBCs, do inglês red blood cells) dos pulmões para os tecidos. Durante o desenvolvimento pré-natal e até pouco depois do nascimento, a hemoglobina está presente na forma de hemoglobina fe- tal (HbF), uma proteína tetramérica composta por duas cadeias alfa (a)- globina e duas cadeias gama (y)-globina. A HbF é amplamente substi- tuída pela hemoglobina adulta (HbA), uma proteína tetramérica na qual as cadeias y-globina da HbF são substituídas por cadeias beta (B)-glo- bina, por meio de um processo conhecido como troca de globina. O adulto médio produz menos de 1% de HbF da hemoglobina total (Thein 2009). O gene a-hemoglobina está localizado no cromossomo 16, en- quanto o gene B-hemoglobina (HBB), cadeia A gama (Ay)-globina (HBG1, também conhecida como globina gama A), e cadeia G gama (Gy)-globina (HBG2, também conhecida como globina gama G) estão localizados no cromossomo 11 dentro do agrupamento de genes da glo- bina (também conhecido como locus da globina).
[0005] Mutações no HBB podem causar distúrbios de hemoglobina (ou seja, hemoglobinopatias), incluindo doença falciforme (SCD, do in- glês sickle cell disease) e beta-talassemia (B-Thal). Aproximadamente
93.000 pessoas nos Estados Unidos são diagnosticadas com hemoglo- binopatia. Em todo o mundo, 300.000 crianças nascem com hemoglobi- nopatias todos os anos (Angastiniotis 1998). Como estas condições es- tão associadas a mutações de HBB, os seus sintomas geralmente não se manifestam até que a globina mude de HbF para HbA.
[0006] A SCD é a doença hematológica hereditária mais comum nos Estados Unidos, afetando aproximadamente 80.000 pessoas (Bro- usseau 2010). A SCD é mais comum em pessoas de ascendência afri- cana, para quem a prevalência de SCD é de 1 em 500. Na África, a prevalência de SCD é de 15 milhões (Aliyu 2008). A SCD também é mais comum em pessoas de ascendência indiana, saudita e mediterrâ- nea. Nos descendentes de hispano-americanos, a prevalência da do- ença falciforme é de 1 em 1.000 (Lewis 2014).
[0007] A SCD é causada por uma única mutação homozigótica no gene HBB, c.17A>T (mutação HbS). A mutação falciforme é uma muta- ção pontual (GAG > GTG) no HBB que resulta na substituição da valina por ácido glutâmico na posição 6 do aminoácido no éxon 1. A valina na posição 6 da cadeia B-hemoglobina é hidrofóbica e causa uma mudança na conformação da proteína B-globina quando ela não está ligada ao oxigênio. Essa mudança de conformação faz com que as proteínas HbS se polimerizem na ausência de oxigênio, levando à deformação (isto é, falcificação) dos eritrócitos. A SCD é herdada de forma autossômica re- cessiva, de modo que apenas pacientes com dois alelos de HbS têm a doença. Indivíduos heterozigotos têm traço falciforme e podem sofrer de anemia e/ou crises dolorosas se estiverem gravemente desidratados ou com falta de oxigênio.
[0008] Os eritrócitos em formato de foice causam vários sintomas, incluindo anemia, crises de células falciformes, crises vaso-oclusivas, crises aplásticas e síndrome torácica aguda. Os eritrócitos em formato de foice são menos elásticos que os eritrócitos do tipo selvagem e, por- tanto, não podem passar tão facilmente pelos leitos capilares e causar oclusão e isquemia (ou seja, vaso-oclusão). A crise vaso-oclusiva ocorre quando as células falciformes obstruem o fluxo sanguíneo no leito capi- lar de um órgão, causando dor, isquemia e necrose. Esses episódios geralmente duram de 5 a 7 dias. O baço desempenha um papel na eli- minação de eritrócitos disfuncionais e, portanto, está tipicamente au- mentado durante a primeira infância e indivíduo a crises vaso-oclusivas frequentes. No final da infância, o baço em pacientes com SCD costuma estar infartado, o que leva à autosplenectomia. A hemólise é uma ca- racterística constante da SCD e causa anemia. As células falciformes sobrevivem por 10-20 dias em circulação, enquanto RBCs saudáveis sobrevivem por 90-120 dias. Os indivíduos com SCD são transfundidos conforme necessário para manter níveis adequados de hemoglobina. Transfusões frequentes colocam indivíduos em risco de infeção com HIV, Hepatite B e Hepatite C. Os indivíduos também podem sofrer de crises torácicas agudas e infartos de extremidades, órgãos terminais e do sistema nervoso central.
[0009] Indivíduos com SCD têm uma expectativa de vida diminuída. O prognóstico para pacientes com SCD está melhorando continua- mente com a gestão cuidadosa de crises e anemia durante toda a vida.
A partir de 2001, a esperança média de vida de indivíduos com doença falciforme foi de meio a final dos anos 50. Os tratamentos atuais para a SCD envolvem hidratação e controle da dor durante as crises, e trans- fusões conforme necessário para corrigir a anemia.
[0010] Talassemias (por exemplo, B-Thal, ó-Thal e B/ó-Thal) cau- sam anemia crônica. Estima-se que a B-Thal afete aproximadamente 1 em 100.000 pessoas em todo o mundo. A sua prevalência é maior em certas populações, incluindo descendentes de europeus, onde sua pre- valência é de aproximadamente 1 em 10.000. A B-Thal maior, a forma mais grave da doença, apresenta risco de vida, a menos que seja tra- tada com transfusões de sangue e terapia de quelação durante toda a vida. Nos Estados Unidos, existem aproximadamente 3.000 indivíduos com B-Thal maior. A B-Thal intermédia não requer transfusões de san- gue, mas pode causar atraso no crescimento e anormalidades sistêmi- cas significativas, e frequentemente requer terapia de quelação durante toda a vida. Embora a HbA constitua a maioria da hemoglobina em eri- trócitos adultos, aproximadamente 3% da hemoglobina adulta está na forma de HbA2, uma variante da HbA na qual as duas cadeias de y- globina são substituídas por duas cadeias delta (A)-globina. A ó-Thal está associada a mutações no gene da A hemoglobina (HBD) que cau- sam uma perda da expressão de HBD. A co-herança da mutação HBD pode mascarar um diagnóstico de B-Thal (ou seja, B/5d-Thal) ao diminuir o nível de HDA2 para a gama normal (Bouva 2006). 8/ó-Thal é geral- mente causada pela deleção das sequências de HBB e HBD em ambos os alelos. Em pacientes homozigotos (50/50 Bo/Bo), o HBG é expresso, levando à produção de apenas HbF.
[0011] Como a SCD, a B-Thal é causada por mutações no gene HBB. As mutações HBB mais comuns que levam a B-Thal são: c.- 136C>G, c.92+1G>A, c.92+6T>C, c.93-21G>A, c.118C>T, c.316- 106C>G, c.25 26delAA, c.27 28insG, c.92+5G>C, c.118C>T, c.135delC,
c.315+1G>A, c.-78A>G, c.52A>T, c.59A>G, c.92+5G>C, c.124 127del- TTCT, c.316-197C>T, c.-78A>G, c.52A>T, c.124 127delTTCT, c.316- 197C>T, c.-138C>T, c.-79A>G, c.92+5G>C, c.75T>A, c.316-2A>G, e c.316-2A>C. Estas e outras mutações associadas com B-Thal causam cadeias B-globina mutadas ou ausentes, o que causa uma interrupção da proporção normal de Hb a-hemoglobina para B-hemoglobina. O ex- cesso de cadeias de a-globina precipita em precursores eritroides na medula óssea.
[0012] Em B-Thal maior, ambos os alelos de HBB contêm mutações sem sentido, deslocação do quadro de leitura ou splicing que levam à ausência completa de produção de B-globina (denotado Bº%/Bº). A B-Thal maior resulta em redução severa nas cadeias de B-globina, levando a precipitação significativa de cadeias de a-globina em eritrócitos e ane- mia mais grave.
[0013] A B-Thal intermédia resulta de mutações na região 5' ou 3' não traduzida de HBB, mutações na região promotora ou sinal de polia- denilação de HBB, ou mutações de splicing dentro do gene HBB. Os genótipos dos pacientes são designados por Bo/B+ ou B+/B+. Bo repre- senta expressão ausente de uma cadeia B-globina; B+ representa uma cadeia B-globina disfuncional, mas presente. A expressão fenotípica va- ria entre os pacientes. Uma vez que existe alguma produção de B-glo- bina, a B-Thal intermédia resulta em menos precipitação de cadeias de a-globina nos precursores eritroides e anemia menos grave do que B- Thal maior. No entanto, existem consequências mais significativas da expansão da linhagem eritroide secundária à anemia crônica.
[0014] Indivíduos com B-Thal maior apresentam idades entre 6 me- ses e 2 anos e sofrem de deficiência de crescimento, febre, hepatoes- plenomegalia e diarreia. O tratamento adequado inclui transfusões re- gulares. A terapia para B-Thal maior também inclui esplenectomia e tra-
tamento com hidroxiureia. Se os pacientes são transfundidos regular- mente, eles se desenvolverão normalmente até o início da segunda dé- cada. Naquela época, eles requerem terapia de quelação (além de transfusões contínuas) para prevenir complicações da sobrecarga de ferro. A sobrecarga de ferro pode se manifestar como atraso no cresci- mento ou na maturação sexual. Na idade adulta, a terapia de quelação inadequada pode causar cardiomiopatia, arritmias cardíacas, fibrose he- pática e/ou cirrose, diabetes, anormalidades da tireoide e da paratire- oide, trombose e osteoporose. As transfusões frequentes também colo- cam os indivíduos em risco de infeção por HIV, hepatite B e hepatite C.
[0015] Indivíduos com B-Thal intermédia geralmente apresentam idades entre 2 e 6 anos. Geralmente não requerem transfusões de san- gue. No entanto, as anomalias ósseas ocorrem devido à hipertrofia crô- nica da linhagem eritroide para compensar a anemia crônica. Os indiví- duos podem ter fraturas dos ossos longos devido à osteoporose. A eri- tropoiese extramedular é comum e leva ao aumento do baço, do fígado e dos gânglios linfáticos. Também pode causar compressão da medula espinhal e problemas neurológicos. Os indivíduos também sofrem de úlceras nas extremidades inferiores e apresentam risco aumentado de eventos trombóticos, incluindo acidente vascular cerebral, embolia pul- monar e trombose venosa profunda. O tratamento de B-Thal intermédia inclui esplenectomia, suplementação com ácido fólico, terapia com hi- droxiureia e radioterapia para massas extramedulares. A terapia de que- lação é usada em indivíduos que desenvolvem sobrecarga de ferro.
[0016] A expectativa de vida costuma ser reduzida em pacientes B- Thal. Os indivíduos com B-Thal maior que não recebem terapia de trans- fusão geralmente morrem na segunda ou terceira década. Os indivíduos com B-Thal maior que recebem transfusões regulares e terapia de que- lação adequada podem viver até a quinta década e além. A insuficiência cardíaca secundária à toxicidade do ferro é a principal causa de morte em indivíduos com B-Thal maior devido à toxicidade do ferro.
[0017] Uma variedade de novos tratamentos está atualmente em desenvolvimento para SCD e B-Thal. A entrega de um gene HBB anti- falciforme por meio de terapia genética está atualmente sendo investi- gada em ensaios clínicos. No entanto, a eficácia e segurança em longo prazo dessa abordagem são desconhecidas. Foi demonstrado que o transplante com células-tronco hematopoéticas (HSCs) de um doador de células-tronco alogênicas compatíveis com HLA cura SCD e B-Thal, mas este procedimento envolve riscos, incluindo aqueles associados à terapia de ablação, que é necessária para preparar o indivíduo para o transplante, aumenta o risco de infeções oportunistas com risco de vida e o risco de doença enxerto vs. hospedeiro após o transplante. Além disso, os doadores alogênicos compatíveis geralmente não podem ser identificados. Portanto, há necessidade de métodos melhorados de con- trole dessas e de outras hemoglobinopatias. Sumário
[0018] São fornecidos aqui sistemas de edição de genoma, comple- xos de ribonucleoproteína (RNP), RNAs guia, proteínas Cpf1, incluindo proteínas Cpf1 modificadas (variantes Cpf1) e métodos mediados por CRISPR para alterar a região promotora de um ou mais genes de y- globina (por exemplo, HBG1, HBG2 ou HBG1 e HBG2) e expressão crescente de hemoglobina fetal (HbF). Em certas modalidades, um complexo RNP pode incluir um RNA guia (gRNA) complexado a uma nuclease guiada por RNA de Cpf1 de tipo selvagem ou Cpf1 modificada (proteína Cpf1 modificada). Em certas modalidades, um gRNA pode compreender uma sequência estabelecida na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, um gRNA pode compreender um domínio de direcionamento de gRNA. Em certas modalidades, um do- mínio de direcionamento de gRNA pode compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1002, 1254,
1258, 1260, 1262 e 1264. Em certas modalidades, um gRNA pode com- preender uma sequência de gRNA estabelecida na Tabela 19. Em cer- tas modalidades, um gRNA pode compreender uma sequência selecio- nada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1022, 1023, 1041-1105. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um com- plexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, um complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 modificada codificada pela se- quência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21).
[0019] Os inventores descobriram aqui que a entrega de um com- plexo RNP incluindo um gRNA complexado com uma proteína Cpf1 mo- dificada pode resultar em edição aumentada de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode conter uma ou mais modificações. Em certas modalidades, as uma ou mais modifi- cações podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em uma sequência de aminoácidos de Cpf1 de tipo selvagem, uma ou mais mu- tações em uma sequência de ácidos nucleicos de Cpf1 de tipo selva- gem, um ou mais sinais de localização nuclear (NLS), um ou mais tags de purificação (por exemplo, tag His), ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, uma Cpf1 modificada pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências polinucleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, o gRNA pode ser um gRNA modificado ou não modificado. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1i modificada codificada pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21). Em certas mo- dalidades, um complexo RNP compreendendo uma proteína Cpf1i mo- dificada pode aumentar a edição de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, um complexo RNP compreendendo uma proteína Cpf1 modificada pode aumentar a edição, resultando em um aumento de in- dels produtivos. Em várias modalidades, um aumento na edição do ácido nucleico alvo pode ser avaliado por qualquer meio conhecido pe- los versados na técnica, tais como, mas não se limitando a, amplificação por PCR do ácido nucleico alvo e análise de sequenciamento subse- quente (por exemplo, sequenciamento de Sanger, sequenciamento de próxima geração).
[0020] Os inventores também descobriram aqui que a entrega de um complexo RNP incluindo um gRNA modificado complexado com uma proteína Cpf1 modificada ou não modificada pode resultar em edi- ção aumentada de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, o gRNA modificado pode compreender uma ou mais modificações inclu- indo uma modificação de ligação de fosforotioato, uma modificação de ligação de fosforoditioato (PS2), uma modificação de 2'-O-metila, uma ou mais ou um trecho de bases de ácido desoxirribonucleico (DNA) (também referido neste documento como uma "extensão de DNA"), uma ou mais ou um trecho de bases de ácido ribonucleico (RNA) (também referido neste documento como uma "extensão de RNA") ou suas com- binações. Em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreen- der uma sequência apresentada na Tabela 24. Por exemplo, em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada em SEQ ID NOs: 1235-1250. Em certas modalidades, a extensão de RNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Por exemplo, em certas modalidades, a extensão de RNA pode compreender uma sequência apresentada em SEQ ID NOs: 1231- 1234, 1251-1253. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 modificada codificada pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21). Em certas mo- dalidades, um complexo RNP compreendendo um gRNA modificado pode aumentar a edição de um ácido nucleico alvo. Em certas modali- dades, um complexo RNP compreendendo gRNA modificado pode au- mentar a edição, resultando em um aumento de indels produtivos.
[0021] Em certas modalidades, um complexo RNP compreendendo um gRNA modificado e uma proteína Cpf1 modificada pode aumentar a edição de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, um complexo RNP compreendendo um gRNA modificado e uma proteína Cpf1i modi- ficada pode aumentar a edição, resultando em um aumento de indels produtivos.
[0022] Os inventores também descobriram que coentrega de um complexo RNP compreendendo um gRNA complexado com uma molé- cula Cpf1 (por exemplo, "dRNA-Cpf1-RNP") com um "elemento de re- forço" pode resultar num aumento da edição de um alvo ácido nucleico. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um com- plexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 modificada codificada pela se- quência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21). Tal como aqui utilizado, o termo "elemento de reforço" refere-se a um ele- mento que, quando coentregue com um complexo RNP compreen- dendo um gRNA complexado a uma nuclease guiada por RNA ("gRNA- nuclease-RNP"), aumenta a edição de um ácido nucleico alvo em com- paração com a edição do ácido nucleico alvo sem o elemento de reforço.
Em certas modalidades, um ou mais elementos de reforço podem ser coentregues com um complexo gRNA-nuclease-RNP para aumentar a edição de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a entrega em conjunto de um elemento de reforço pode aumentar a edição, resultando em um aumento de indels produtivos. Em várias modalidades, um au- mento na edição do ácido nucleico alvo pode ser avaliado por qualquer meio conhecido pelos versados na técnica, tais como, mas não se limi- tando a, amplificação por PCR do ácido nucleico alvo e análise de se- quenciamento subsequente (por exemplo, sequenciamento de Sanger, sequenciamento de próxima geração).
[0023] Em certas modalidades, um gRNA-nuclease-RNP pode com- preender um gRNA-Cpf1-RNP. Em certas modalidades, uma molécula Cpf1 do complexo gRNA-Cpf1-RNP pode ser uma Cpf1 de tipo selva- gem ou Cpf1 modificada. Em certas modalidades, a molécula de Cpf1 modificada de gRrNA-Cpf1-RNP pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências polinucleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, o complexo gRNA-Cpf1-RNP pode compreender um gRNA compreendendo um domínio de direcionamento estabelecido na Tabela 13 ou Tabela 18. Em certas modalidades, o complexo gRNA- Cpf1-RNP pode compreender um gRNA compreendendo uma sequên- cia estabelecida na Tabela 19. Em certas modalidades, o gRNA pode ser um gRNA modificado ou não modificado.
[0024] Em certas modalidades, um elemento de reforço pode com- preender um RNP morto compreendendo uma molécula de gRNA morta complexada com uma molécula de nuclease guiada por RNA ("gRNA- nuclease-RNP morto"). Em certas modalidades, o gRNA-nuclease-RNP morto pode compreender um gRNA morto complexado com uma molé- cula Cas9 de tipo selvagem (TS) ("rg RNA-Cas9-RNP morto"), um gRNA morto complexado com uma molécula de nickase Cas9 ("gRNA- nickase-RNP" morto) ou um gRNA morto complexado com uma molé- cula Cas9 enzimaticamente inativa (ei) ("(gRNA-eiCas9-RNP morto"). Em certas modalidades, o complexo gRNA-nuclease-RNP morto pode ter atividade diminuída ou não ter atividade de nuclease.
Em certas mo- dalidades, o gRNA morto do complexo gRNA-nuclease-RNP morto pode compreender qualquer um dos gRNAs mortos aqui estabelecidos.
Por exemplo, o gRNA morto pode compreender um domínio de direcio- namento que pode ser igual ou pode diferir em não mais do que 3 nu- cleotídeos de um domínio de direcionamento de gRNA morto estabele- cido na Tabela 10 ou Tabela 15. Em certas modalidades, o gRNA morto pode incluir um domínio de direcionamento que compreende uma trun- cagem de um domínio de direcionamento de gRNA.
Em certas modali- dades, o domínio de direcionamento de gRNA a ser truncado pode ser um domínio de direcionamento de gRNA estabelecido na Tabela 2, Ta- bela 10 ou Tabela 15. Em certas modalidades, o gRNA morto pode ser um gRNA morto modificado ou não modificado.
Como mostrado aqui, a entrega codificada de um gRNA-Cpf1-RNP com um gRNA-Cas9-RNP morto (ou seja, um RNP compreendendo um gRNA morto complexado a uma Cas9 TS) ou a coentrega de um gRNA-Cpf1-RNP com um gRNA- nickase-RNP morto (ou seja, um RNP compreendendo um gRNA morto complexado com uma Cas9 nickase (ou seja, a Cas9 D10A nickase)) resultou em um aumento na edição total acima dos níveis observados após a entrega de gRNA-Cpf1-RNP sozinho (ver, por exemplo, Exem- plo, 15, 17, 18). As moléculas de gRNA morto podem compreender do- mínios de direcionamento complementares às regiões proximais ou dentro de uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo de 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae) em um ácido nucleico alvo.
Em certas modalidades, "proximal a" pode denotar a região dentro de
10, 25, 50, 100 ou 200 nucleotídeos de uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do pro- motor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae). Em certas modalidades, um ou mais elementos de reforço podem ser constituídos por um ou mais gRNA-nuclease-RNPs mortos, por exem- plo, gRNA-Cas9-RNP morto, gRNA-nickase-RNP morto, gRNA-eiCas9- RNP morto, para ser codificado com um gRNA-Cpf1-RNP. Em certas modalidades, a coentrega de um gRNA-nuclease-RNP morto não altera o perfil indel de um gRNA-Cpf1-RNP.
[0025] Em certas modalidades, um elemento de reforço pode com- preender um complexo RNP compreendendo uma molécula de gRNA complexada com uma molécula de nuclease nickase guiada por RNA ("gRNA-nickase-RNP"). Em certas modalidades, a molécula de nu- clease nickase guiada por RNA pode ser uma molécula de nickase Cas9, por exemplo, nickase Cas9 D10A. Em certas modalidades, o gRNA do gRNA-nickase-RNP pode compreender qualquer um dos gRNAs aqui estabelecidos. Por exemplo, o gRNA pode compreender um domínio de direcionamento de gRNA estabelecido na Tabela 2, Ta- bela 10 ou Tabela 15. Em certas modalidades, o gRNA pode ser um gRNA modificado ou não modificado. Como mostrado aqui, a coentrega de gRNA-Cpf1-RNP com um complexo gRNA-nickase-RNP (RNP com- preendendo um RNA guia complexado com uma molécula de nickase Cas9D10A) resultou em um aumento na edição total acima dos níveis observados após a entrega de gRNA-Cpf1-RNP sozinho (ver, por exem- plo, Exemplos 15, 16). Além disso, a coentrega de um complexo gRNA- nickase-RNP com um complexo gRNA-Cpf1-RNP alterou a direcionali- dade, comprimento e/ou posição do perfil indel de gRNA-Cpf1-RNP. Em certas modalidades, um intensificador de reforço pode ser usado para fornecer um resultado de edição desejado, por exemplo, para aumentar a taxa de indels produtivos. Em certas modalidades, a coentrega de um complexo gRNA-nickase-RNP com um complexo gRNA-Cpf1-RNP pode alterar o perfil indel do gRNA-Cpf1-RNP.
[0026] Em certas modalidades, um elemento de reforço pode com- preender um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (ssSODN) ou um oligodesoxinucleotídeo de cadeia dupla (dsODN). Em certas modalida- des, o sSODN pode ser qualquer ssODN divulgado aqui. Em certas mo- dalidades, um ssSODN pode compreender uma sequência estabelecida na Tabela 11. Por exemplo, em certas modalidades, um ssODN pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1040.
[0027] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um complexo RNP compreendendo um CRISPR de nuclease guiada por RNA de Prevotella e Franciscella 1 (Cpf1) ou uma sua variante e um gRNA, em que o gRNA é capaz de se ligar a um sítio alvo em um promotor de um gene HBG em uma célula. Em certas modalidades, o gRNA pode ser modificado ou não modificado. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma ou mais modificações, incluindo uma modificação de ligação de fosforotioato, uma modificação de ligação de fosforoditioato (PS2), uma modificação de 2'-O-metila, uma extensão de DNA, uma extensão de RNA ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas modalidades, a extensão de RNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, o complexo RNP pode com- preender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 variante codifi- cada pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21). Em certas modalidades, a proteína variante Cpf1 pode conter uma ou mais modificações. Em certas modalidades, as uma ou mais modifi- cações podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em uma sequência de aminoácidos de Cpf1 de tipo selvagem, uma ou mais mu- tações em uma sequência de ácidos nucleicos de Cpf1 de tipo selva- gem, um ou mais sinais de localização nuclear (NLS), um ou mais tags de purificação (por exemplo, tag His), ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, uma proteína variante Cpf1 pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008- 1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências polinucleotídi- cas Cpf1).
[0028] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método de al- teração de um promotor de um gene HBG em uma célula que compre- ende o contato da célula com um complexo RNP divulgado neste docu- mento. Em certas modalidades, a alteração pode compreender um indel dentro de uma ou mais regiões estabelecidas na Tabela 17. Em certas modalidades, a alteração pode compreender um indel dentro de uma região alvo de caixa CCAAT do promotor de um gene HBG. Por exem- plo, em certas modalidades, a alteração pode compreender um indel dentro de Chr 11 (NC 000011.10): 5,249,955 — 5,249,987 (Tabela 17, Região 6), Chr 11 (NC 000011.10): 5,254,879 — 5,254,909 (Tabela 17, Região 16), ou suas combinações. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um gRNA e uma proteína Cpf1. Em certas mo- dalidades, o gRNA pode compreender um domínio de direcionamento de RNA estabelecido na Tabela 19. Em certas modalidades, o domínio de direcionamento de gRNA pode compreender uma sequência seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1002, 1254, 1258, 1260, 1262 e 1264. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequência de gRNA estabelecida na Tabela 19. Em certas moda- lidades, o gRNA pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1022, 1023, 1041-1105. Em certas modalidades, um gRNA pode ser configurado para fornecer um evento de edição em Chr11:5249973, Chr11:5249977 (HBG1); Chr11:5250042, Chr11:5250046 (HBG1); Chr11:5250055, Chr11:5250059 (HBG1); Chr11:5250179, Chr11:5250183 (HBG1); Chr11:5254897, Chr11: 5254901 (HBG2); Chr11:5254897, Chr11:5254901 (HBG2); Chr11: 5254966, 5254970 (HBG2); Chr11:5254979, 5254983 (HBG2) (Tabela 22, Tabela 23). Em certas modalidades, a célula pode ainda ser conta- tada com um elemento de reforço. Em certa modalidade, um elemento de reforço pode compreender um oligodesoxinucleotídeo de cadeia sim- ples (ssODN) ou um oligodesoxinucleotídeo de cadeia dupla (dsODN). Em certas modalidades, o ssSODN pode ser qualquer ssODN divulgado aqui. Em certas modalidades, um ssSODN pode compreender uma se- quência estabelecida na Tabela 11. Por exemplo, em certas modalida- des, um ssSODN pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1040.
[0029] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma célula isolada que compreende uma alteração em um promotor do gene HBG gerado pela entrega de um complexo RNP à célula. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um gRNA e uma proteína Cpf1. Em certas modalidades, o gRNA pode ser modificado ou não modificado. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma ou mais mo- dificações, incluindo uma modificação de ligação de fosforotioato, uma modificação de ligação de fosforoditioato (PS2), uma modificação de 2'- O-metila, uma extensão de DNA, uma extensão de RNA ou combina- ções dos mesmos. Em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas mo- dalidades, a extensão de RNA pode compreender uma sequência apre- sentada na Tabela 24. Em certas modalidades, o gRNA pode compre- ender uma sequência apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela
19. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 variante codificada pela se- quência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21). Em certas modalidades, a proteína variante Cpf1 pode conter uma ou mais modificações. Em certas modalidades, as uma ou mais modificações podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em uma sequência de aminoácidos de Cpf1 de tipo selvagem, uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos de Cpf1 de tipo selvagem, um ou mais sinais de localização nuclear (NLS), um ou mais tags de purifica- ção (por exemplo, tag His), ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, uma proteína variante Cpf1 pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências polinucleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, um elemento de reforço pode ser coentregue com o complexo RNP. Em certa modalidade, um elemento de reforço pode compreender um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (ssSODN) ou um oligodesoxinucleotídeo de cadeia dupla (dsODN). Em certas moda- lidades, o ssSODN pode ser qualquer ssODN divulgado aqui. Em certas modalidades, um ssODN pode compreender uma sequência estabele- cida na Tabela 11. Por exemplo, em certas modalidades, um ssSODN pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1040.
[0030] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método ex vivo de aumentar o nível de hemoglobina fetal (HbF) em uma célula humana por edição do genoma usando um complexo RNP compreendendo um gRNA e uma nuclease guiada por RNA Cpf1 ou uma variante deste para afetar uma alteração em um promotor de um gene HBG, aumentando assim a expressão de HbF. Em certas modalidades, o gRNA pode ser modificado ou não modificado.
Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma ou mais modificações, incluindo uma modificação de ligação de fosforotioato, uma modificação de ligação de fosforoditioato (PS2), uma modificação de 2'-O-metila, uma extensão de DNA, uma ex- tensão de RNA ou combinações dos mesmos.
Em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas modalidades, a extensão de RNA pode compre- ender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas modalida- des, o gRNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 variante codificada pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21). Em certas modalidades, a proteína variante Cpf1 pode con- ter uma ou mais modificações.
Em certas modalidades, as uma ou mais modificações podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em uma sequência de aminoácidos de Cpf1 de tipo selvagem, uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos de Cpf1 de tipo sel- vagem, um ou mais sinais de localização nuclear (NLS), um ou mais tags de purificação (por exemplo, tag His), ou uma combinação dos mesmos.
Em certas modalidades, uma proteína variante Cpf1 pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências po- lipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências po- linucleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, um elemento de reforço pode ser coentregue com o complexo RNP.
Em certa modalidade, um elemento de reforço pode compreender um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (ssODN) ou um oligodesoxinucleotídeo de cadeia dupla (AsODN). Em certas modalidades, o ssSODN pode ser qualquer ssSODN divulgado aqui. Em certas modalidades, um ssODN pode compreender uma sequência estabelecida na Tabela 11. Por exemplo, em certas mo- dalidades, um ssSODN pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1040.
[0031] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma população de células CD34+ ou células-tronco hematopoiéticas, em que uma ou mais células na população compreende uma alteração em um promotor de um gene de HBG, cuja alteração é gerada pela entrega de um complexo RNP compreendendo um gRNA e uma nuclease guiada por RNA Cpf1 ou uma sua variante para a população de células CD34+ ou células- tronco hematopoiéticas. Em certas modalidades, o gRNA pode ser mo- dificado ou não modificado. Em certas modalidades, o gRNA pode com- preender uma ou mais modificações, incluindo uma modificação de |i- gação de fosforotioato, uma modificação de ligação de fosforoditioato (PS2), uma modificação de 2'-O-metila, uma extensão de DNA, uma ex- tensão de RNA ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas modalidades, a extensão de RNA pode compre- ender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas modalida- des, o gRNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 variante codificada pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21). Em certas modalidades, a proteína variante Cpf1 pode con- ter uma ou mais modificações. Em certas modalidades, as uma ou mais modificações podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em uma sequência de aminoácidos de Cpf1 de tipo selvagem, uma ou mais mutações em uma sequência de ácidos nucleicos de Cpf1 de tipo sel- vagem, um ou mais sinais de localização nuclear (NLS), um ou mais tags de purificação (por exemplo, tag His), ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, uma proteína variante Cpf1 pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências po- lipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências po- linucleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, um elemento de reforço pode ser coentregue com o complexo RNP. Em certa modalidade, um elemento de reforço pode compreender um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (ssODN) ou um oligodesoxinucleotídeo de cadeia dupla (AsODN). Em certas modalidades, o ssSODN pode ser qualquer ssSODN divulgado aqui. Em certas modalidades, um ssODN pode compreender uma sequência estabelecida na Tabela 11. Por exemplo, em certas mo- dalidades, um ssSODN pode compreender a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 1040.
[0032] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método para aliviar um ou mais sintomas da doença falciforme em um indivíduo em necessidade, o método compreendendo: a) isolar uma população de CD34+ ou células-tronco hematopoiéticas do indivíduo; b) modificar a população de células isoladas ex vivo através da entrega de um com- plexo RNP compreendendo um gRNA e uma nuclease guiada por RNA Cpf1 ou uma sua variante para a população de células isoladas, afe- tando assim uma alteração em um promotor de um gene HBG em um ou mais células na população; e c) administrar a população modificada de células ao indivíduo, para assim aliviar um ou mais sintomas da do- ença falciforme no indivíduo. Em certas modalidades, a alteração pode compreender um indel dentro de uma região alvo de caixa CCAAT do promotor do gene HBG. Em certas modalidades, o complexo RNP pode ser entregue usando eletroporação. Em certas modalidades, pelo me- nos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% das células na po- pulação de células compreendem um indel produtivo.
[0033] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um gRNA compre- endendo uma extremidade 5' e uma extremidade 3', e compreendendo uma extensão de DNA na extremidade 5' e uma modificação 2'-O-metil- 3'-fosforotioato noa extremidade 3', em que o gRNA inclui um segmento de RNA capaz de hibridizar com um sítio alvo e um segmento de RNA capaz de se associar a uma nuclease guiada por RNA Cpf1. Em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada em SEQ ID NOs: 1235-1250. Em certas modalidades, o gRNA pode ser modificado ou não modificado. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma ou mais modificações, incluindo uma modificação de ligação de fosforotioato, uma modificação de ligação de fosforoditioato (PS2), uma modificação de 2'-O-metila, uma extensão de DNA, uma extensão de RNA ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, a extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em certas modalidades, a extensão de RNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Em cer- tas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequência apresen- tada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19.
[0034] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um complexo de RNP compreendendo uma nuclease guiada por RNA Cpf1 conforme di- vulgado neste documento e um gRNA conforme divulgado neste docu- mento.
[0035] Também são fornecidos aqui sistemas de edição de ge- noma, RNAs guia e métodos mediados por CRISPR para alterar um ou mais genes de y—globina (por exemplo, HBG1, HBG2 ou HBG1 e HBG2), o intensificador específico de eritroide do gene BCL11A (BCL11Ae), ou uma combinação dos mesmos, e aumento da expressão de hemoglobina fetal (HbF). Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo uma sequência apresentada na Tabela 18 ou Tabela 19 podem ser usados para introduzir alterações na região do promotor do gene HBG.
Em certas modalidades, os sistemas de edição de ge- noma, RNAs de guia, e métodos mediados por CRISPR podem alterar uma região alvo de 13 nucleotídeos (nt) que está em 5' do sítio de trans- crição do gene HBG1, HBG2, ou HBG1 e HBG2 ("região alvo 13 nt"). Em certas modalidades, sistemas de edição de genoma, RNAs guia e métodos mediados por CRISPR podem alterar uma região alvo de caixa CCAAT que está em 5' do sítio de transcrição do gene HBG71, HBG2 ou HBG1 e HBG2 ("região alvo de caixa CCAAT"). Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode ser a região que está em ou perto da caixa CCAAT distal e inclui os nucleotídeos da caixa CCAAT distal e 25 nucleotídeos a montante (5') e 25 nucleotídeos a jusante (3') da caixa distal CCAAT (ou seja, HBG1/2 c.-86 a -140). Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode ser a região que está em ou perto da caixa CCAAT distal e inclui os nucleotídeos da caixa CCAAT distal e nucleotídeos a montante (5') e 5 nucleotídeos a jusante (3') da caixa distal CCAAT (ou seja, HBG1/2 c.-106 a -120). Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 18 nt, uma região alvo de 13 nt, uma região alvo de 11 nt, uma região alvo de 4 nt, uma região alvo de 1 nt, uma região alvo -117G>A, ou uma sua combinação, conforme divulgado aqui.
Em certas modalidades, a alteração pode ser uma deleção de 18 nt, deleção de 13 nt, deleção de 11 nt, deleção de 4 nt, deleção de 1 nt, uma substituição de G para A em c. -117 do gene HBG1, HBG2 ou HBG1 e HBG2, ou uma combina- ção dos mesmos.
Em certas modalidades, a alteração pode ser uma alteração de ocorrência não natural ou uma alteração de ocorrência na- tural. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 251-901 ou 940-942 podem ser usados para introduzir alterações na região alvo de 13 nt. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 251-901, 940-942, 996, 997, 970, 971, 1002 ou 1003 podem ser usados para introduzir alterações na região alvo da caixa CCAAT. Em certas modalidades, sistemas de edi- ção de genoma, RNAs guia e métodos mediados por CRISPR podem alterar um motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae que está na região do sítio hipersensível +58 DNase | (DHS) do íntron 2 do gene BCL11A ("motivo de ligação GATA1 em BCL114e"). Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direcionamento esta- belecido em SEQ ID NOs: 952-955 podem ser usados para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ãe. Em certas mo- dalidades, um ou mais gRNAs podem ser usados para introduzir altera- ções no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ãe e um ou mais gRNAs podem ser usados para introduzir alterações na região alvo de 13 nt de HBG1 e/ou HBG?2.
[0036] Também é fornecido aqui em certas modalidades o uso de componentes opcionais do sistema de edição de genoma, tal como áci- dos nucleicos modelo (modelos de doadores de oligonucleotídeos). Em certas modalidades, os ácidos nucleicos modelo para uso no direciona- mento da região alvo CCAAT podem incluir, sem limitação, ácidos nu- cleicos modelo que codificam alterações da região alvo da caixa CCAAT. Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 18 nt, uma região alvo de 11 nt, uma região alvo de 4 nt, uma região alvo de 1 nt ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo pode ser um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (ssODN) ou um oligodeoxinu- cleotídeo de cadeia dupla (dsODN). Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' e as alterações de codificação de modelos de doa- dor de comprimento total exemplificativos na região alvo da caixa CCAAT também são apresentados abaixo (por exemplo, SEQ ID NOS: 904-909, 974-995). Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo pode ser uma cadeia positiva ou uma cadeia negativa. Em certas mo- dalidades, o sSODN pode compreender um braço de homologia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3'. Em certas mo- dalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos ou mais de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento; a sequência de substituição pode compreender O nucleotídeos de com- primento; e o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos ou mais de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o sSODN pode compreender um ou mais fos- forotioatos.
[0037] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma, RNAs guia e métodos mediados por CRISPR para alterar um ou mais genes de y-globina (por exemplo, HBG1, HBG2 ou HBG1 e HBG2) po- dem incluir uma nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma Cas9 ou Cas 9 modificada. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma Cpf1 ou Cpf1 modificada, conforme divulgado neste documento.
[0038] Em um aspecto, a divulgação refere-se a composições que incluem uma pluralidade de células geradas pelos métodos descritos acima, em que, pelo menos, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células incluem uma alteração de uma sequência de uma re- gião alvo 13 nt do gene humano HBG1 ou HBG2 ou uma pluralidade de células geradas pelos métodos descritos acima, em que, pelo menos, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80% ou 90% das células incluem uma alteração de uma sequência de uma região alvo 13 nt do gene hu- mano HBG1 ou HBG2 e, pelo menos, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células incluem uma alteração de uma sequência do motivo de ligação GATA1 em BCL11Ãe. Em certas modalidades, pelo menos uma porção da pluralidade de células pode estar dentro de uma linhagem eritroide. Em certas modalidades, a pluralidade de células pode ser caracterizada por um nível elevado de expressão de hemoglo- bina fetal em relação a uma pluralidade de células não modificada. Em certas modalidades, o nível de hemoglobina fetal pode ser aumentado em pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%. Em certas modalidades, as composições podem incluir ainda um transpor- tador farmaceuticamente aceitável.
[0039] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método para alterar uma célula, que inclui desenrolar um segmento de cromatina dentro ou próximo a uma região alvo de um ácido nucleico em uma cé- lula e gerar uma quebra de cadeia dupla (DSB) dentro da região alvo do ácido nucleico para alterar a região alvo. Em certas modalidades, a etapa de desenrolar o segmento de cromatina pode incluir o contato do segmento de cromatina com uma helicase guiada por RNA. Em certas modalidades, a etapa de desenrolar a cromatina não inclui o recruta- mento de um fator de ação trans exógeno para o segmento de croma- tina. A helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA e a nuclease guiada por RNA pode ser complexada a um RNA guia morto (dgRNA) incluindo uma primeira sequência de domínio de direci- onamento de 15 ou menos nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o dgRNA pode incluir modificações na extremidade 5' ou 3', incluindo, mas não se limitando a, um análogo de cap anti-reverso (ARCA) na extremidade 5' do RNA, uma cauda poliA na extremidade 3'
do RNA, ou ambos. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA enzimaticamente ativa ou pode ser configurada para não ter atividade de nuclease. Em certas modali- dades, a sequência de domínio de direcionamento do dgRNA pode ser complementar a uma sequência proximal à região alvo. "Proximal a", em algumas modalidades aqui, pode significar dentro de 10, 25, 50, 100 ou 200 nucleotídeos da região alvo. Em certas modalidades, o passo de desenrolar o segmento de cromatina pode não incluir a formação de uma quebra de cadeia simples ou dupla no ácido nucleico dentro do segmento de cromatina. Em certas modalidades, o passo de gerar o DSB dentro da região alvo pode incluir o contato do segmento de cro- matina com uma nuclease guiada por RNA com atividade de nuclease. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA com atividade de nuclease pode ser complexada a um gRNA incluindo um domínio de direcionamento configurado para se sobrepor à região alvo. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA com atividade de nuclease pode ser uma molécula Cpf1.
[0040] Outro aspecto da divulgação inclui um método de induzir acessibilidade a uma região alvo de um ácido nucleico para edição em uma célula, incluindo o contato da célula com uma helicase guiada por RNA e um dgRNA e DNA de desenrolamento dentro ou próximo à região alvo com a helicase guiada por RNA, induzindo assim acessibilidade à região alvo para edição. Em vários casos, a helicase guiada por RNA e o dgRNA podem ser configurados para se associar dentro ou próximo à região alvo. Em certas modalidades, o dgRNA pode ser configurado de modo que não forneça um evento de clivagem de nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA e dgRNA po- dem complexar para formar uma ribonucleoproteína morta (RNP) que carece de atividade de clivagem. Em certas modalidades, o dgRNA pode incluir uma sequência de domínio de direcionamento de 15 ou me- nos nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA e dgRNA não são configura- dos para recrutar um fator de ação trans exógeno para a região alvo. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser um Cas9 ou uma proteína de fusão Cas9. Em certas modalidades, a Cas9 pode ser uma Cas9 enzimaticamente ativa ou uma Cas9 enzimaticamente morta. Em certas modalidades, a Cas9 pode ser uma nickase, por exemplo, Cas9 D10A. Em certas modalidades, o passo de desenrolar do DNA não compreende a formação de uma quebra de cadeia simples ou dupla no DNA. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA com atividade de nuclease pode ser complexada a um gRNA incluindo um domínio de direcionamento configurado para se sobrepor à região alvo. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA com atividade de nuclease pode ser uma molécula Cpf1.
[0041] Em outro aspecto, a divulgação refere-se a um método para aumentar uma taxa de formação de indel em um ácido nucleico que in- clui o desenrolamento de DNA de cadeia dupla dentro ou próximo a uma região alvo do ácido nucleico usando uma helicase guiada por RNA con- figurada para associar dentro ou próximo da região alvo e gerando um DSB dentro da região alvo. Em certas modalidades, a geração de um DSB dentro da região alvo resulta na formação de um indel na região alvo. Em certas modalidades, o DSB pode ser reparado de uma maneira formando um indel na região alvo. Em certas modalidades, a taxa de formação de indel no gene alcançada usando a helicase guiada por RNA é aumentada em comparação com uma taxa de formação de indel no gene alcançada sem usar a helicase guiada por RNA. Em certas mo- dalidades, a helicase guiada por RNA pode formar um complexo RNP com um dgRNA configurado para se associar dentro ou próximo à re- gião alvo. Em certas modalidades, o dgRNA pode incluir uma sequência de domínio de direcionamento de 15 nucleotídeos ou menos de compri- mento. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a nuclease gui- ada por RNA pode ser um Cas9 ou uma proteína de fusão Cas9. Em certas modalidades, a Cas9 pode ser uma Cas9 enzimaticamente ativa ou uma Cas9 enzimaticamente morta. Em certas modalidades, a Cas9 pode ser uma nickase, por exemplo, Cas9 D10A. Em certas modalida- des, a nuclease guiada por RNA e o dgRNA não são configurados para recrutar um fator de ação trans exógeno para a região alvo. Em certas modalidades, o passo de desenrolar do DNA de cadeia dupla não inclui a formação de uma quebra de cadeia simples ou dupla no DNA.
[0042] Em ainda outro aspecto, esta divulgação refere-se a um mé- todo de exclusão de um segmento de um ácido nucleico alvo em uma célula que inclui o contato da célula com uma helicase guiada por RNA e a geração de um DSB dentro da região alvo, em que um segmento do ácido nucleico alvo é deletado. Em certas modalidades, o DSB pode ser reparado de uma maneira que exclui um segmento do ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser con- figurada para se associar dentro ou próximo a uma região alvo do ácido nucleico alvo e desenrolar o DNA de cadeia dupla (dsDNA) dentro ou próximo à região alvo. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode formar um complexo de ribonucleoproteína com um dgRNA configurado para se associar dentro ou próximo à região alvo. Em certas modalidades, o dgRNA pode incluir uma sequência de domínio de dire- cionamento de 15 nucleotídeos ou menos de comprimento. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser um Cas9 ou uma proteína de fusão Cas9. Em certas modalidades, a
Cas9 pode ser uma Cas9 enzimaticamente ativa ou uma Cas9 enzima- ticamente morta. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA e o dgRNA não são configurados para recrutar um fator de ação trans exógeno para a região alvo. Em certas modalidades, o ácido nucleico alvo pode ser uma região promotora de um gene, uma região codifica- dora de um gene, uma região não codificadora de um gene, um íntron de um gene ou um éxon de um gene. Em certas modalidades, o seg- mento do ácido nucleico alvo pode ter pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 100 pares de bases de compri- mento.
[0043] A divulgação também refere-se a uma molécula de gRNA morto (dgRNA) incluindo um domínio de direcionamento que compre- ende um truncamento de um domínio de direcionamento de gRNA. Em certas modalidades, o domínio de direcionamento de gRNA a ser trun- cado pode ser um domínio de direcionamento de gRNA estabelecido na Tabela 2, Tabela 10 ou Tabela 15. Em certas modalidades, o domínio de direcionamento de gRNA pode ser truncado de uma extremidade 5' do domínio de direcionamento de gRNA. Em certas modalidades, o dgRNA pode incluir uma sequência de domínio de direcionamento de nucleotídeos ou menos de comprimento. Em certas modalidades, o primeiro domínio de direcionamento pode ser o mesmo ou pode diferir em não mais do que 3 nucleotídeos de um domínio de direcionamento de dgRNA estabelecido na Tabela 10 ou Tabela 15.
[0044] Outro aspecto da divulgação refere-se a composições inclu- indo pelo menos um polinucleotídeo que codifica uma pluralidade de gRNAs e uma helicase guiada por RNA, em que pelo menos um gRNA pode ser um dgRNA configurado de modo que não forneça uma nu- clease guiada por RNA evento de clivagem. Em certas modalidades, o dgRNA pode incluir uma sequência de domínio de direcionamento de 15 nucleotídeos ou menos de comprimento. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser um Cas9 ou uma proteína de fusão Cas9. Em certas modalidades, a Cas9 pode ser uma Cas9 enzimaticamente ativa ou uma Cas9 enzimaticamente morta. Em certas modalidades, a Cas9 pode ser uma nickase, por exemplo, Cas9 D10A. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA e o dgRNA não são configurados para recrutar um fator de ação trans exó- geno para a região alvo. Em certas modalidades, as composições in- cluem ainda um segundo gRNA configurado para fornecer um evento de clivagem. Em certas modalidades, as composições incluem ainda um segundo gRNA configurado para fornecer um evento de clivagem.
[0045] Em outro aspecto, a divulgação refere-se a sistemas de edi- ção de genoma que incluem uma nuclease guiada por RNA e uma heli- case guiada por RNA configurada para se associar a um ácido nucleico alvo proximal a uma região alvo do ácido nucleico alvo e induzir uma mudança conformacional na região alvo, promovendo assim a acessibi- lidade à região alvo para a nuclease guiada por RNA para formar uma quebra na região alvo. A divulgação também refere-se a sistemas de edição de genoma que incluem um dgRNA incluindo uma sequência de domínio de direcionamento de 15 nucleotídeos ou menos de compri- mento, uma primeira nuclease guiada por RNA e uma helicase guiada por RNA. Em certas modalidades, o sistema de edição de genoma inclui ainda um gRNA. Em certas modalidades, o gRNA e a primeira nuclease guiada por RNA podem se associar a uma região alvo em um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a primeira nuclease guiada por RNA pode ser uma molécula Cpf1. Em certas modalidades, o gRNA e a primeira nuclease guiada por RNA podem se associar a uma primeira sequência PAM em um ácido nucleico alvo, em que a primeira sequên- cia PAM está voltada para fora. Em certas modalidades, a helicase gui-
ada por RNA pode ser uma segunda nuclease guiada por RNA. Em cer- tas modalidades, a segunda nuclease guiada por RNA e o dgRNA não são configurados para recrutar um fator de ação trans exógeno para a região alvo. Em certas modalidades, o dgRNA e a segunda nuclease guiada por RNA se associam dentro ou proximal a uma região alvo no ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a primeira nuclease guiada por RNA e a segunda nuclease guiada por RNA podem ser complexa- das com o gRNA e dgRNAs, respectivamente, formando primeiro e se- gundo complexos de ribonucleoproteína.
[0046] Em outro aspecto, a divulgação refere-se a um sistema de edição de genoma que inclui um dgRNA compreendendo uma sequên- cia de domínio de direcionamento de 15 nucleotídeos ou menos de com- primento, uma primeira nuclease guiada por RNA e uma helicase guiada por RNA. Em certas modalidades, o gRNA e a primeira nuclease guiada por RNA podem se associar a uma região alvo em um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a primeira nuclease guiada por RNA pode ser uma molécula Cpf1. Em certas modalidades, o gRNA e a primeira nuclease guiada por RNA podem se associar a uma sequência de mo- tivo adjacente do primeiro protoespaçador (PAM) em um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a primeira sequência PAM pode estar voltada para fora. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma segunda nuclease guiada por RNA. Em certas modalida- des, a segunda nuclease guiada por RNA e o dgRNA não são configu- rados para recrutar um fator de ação trans exógeno para a região alvo. Em certas modalidades, o dgRNA e a segunda nuclease guiada por RNA podem se associar dentro ou proximal a uma região alvo no ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a primeira nuclease guiada por RNA e a segunda nuclease guiada por RNA podem ser complexadas com o gRNA e dgRNAs, respectivamente, formando primeiro e segundo complexos de ribonucleoproteína. Em certas modalidades, o dgRNA e a segunda nuclease guiada por RNA podem se associar a uma segunda sequência PAM em um ácido nucleico alvo, em que a segunda sequên- cia PAM pode estar voltada para fora.
[0047] Em outro aspecto, a divulgação refere-se a um sistema de edição de genoma que inclui um dgRNA, um primeiro gRNA compreen- dendo uma segunda sequência de domínio de direcionamento maior do que 17 nucleotídeos de comprimento, uma primeira nuclease guiada por RNA e uma segunda nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a primeira nuclease guiada por RNA e o dgRNA podem ser configurados para se associar dentro de uma primeira região alvo em um ácido nu- cleico alvo. Em certas modalidades, a segunda nuclease guiada por RNA e o primeiro gRNA podem ser configurados para se associarem dentro de uma segunda região alvo e gerar uma quebra de cadeia dupla (DSB) no ácido nucleico alvo por meio do qual criar um indel entre a primeira região alvo e a segunda região alvo. Em certas modalidades, a segunda nuclease guiada por RNA pode ser uma molécula Cpf1. Em certas modalidades, o dgRNA compreende uma primeira sequência de domínio de direcionamento de 15 nucleotídeos ou menos de compri- mento. Em certas modalidades, o dgRNA reduziu ou não reduziu a ati- vidade de clivagem de nuclease guiada por RNA. Em certas modalida- des, o dgRNA pode ser configurado de modo que não forneça um evento de clivagem de nuclease guiada por RNA. Em certas modalida- des, o dgRNA e a primeira nuclease guiada por RNA podem se associar a uma sequência de motivo adjacente do primeiro protoespaçador (PAM) no ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a primeira se- quência PAM pode estar voltada para fora. Em certas modalidades, o primeiro gRNA e a segunda nuclease guiada por RNA podem se asso- ciar a uma segunda sequência de PAM no ácido nucleico alvo. Em cer- tas modalidades, a segunda sequência de PAM pode estar voltada para fora.
[0048] Em outro aspecto, a divulgação refere-se a um método de alteração de uma célula, incluindo o contato da célula com um dgRNA, um primeiro gRNA compreendendo uma segunda sequência de domínio de direcionamento maior que 17 nucleotídeos de comprimento, uma pri- meira nuclease guiada por RNA, e uma segunda nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a primeira nuclease guiada por RNA e o dgRNA podem ser configurados para se associar dentro de uma pri- meira região alvo em um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a segunda nuclease guiada por RNA e o primeiro gRNA podem se asso- ciar dentro de uma segunda região alvo e gerar uma quebra de cadeia dupla (DSB) no ácido nucleico alvo por meio do qual criar um indel entre a primeira região alvo e a segunda região alvo. Em certas modalidades, a segunda nuclease guiada por RNA pode ser uma molécula Cpf1. Em certas modalidades, o dgRNA compreende uma primeira sequência de domínio de direcionamento de 15 nucleotídeos ou menos de compri- mento. Em certas modalidades, o dgRNA reduziu ou não reduziu a ati- vidade de clivagem de nuclease guiada por RNA. Em certas modalida- des, o dgRNA pode ser configurado de modo que não forneça um evento de clivagem de nuclease guiada por RNA. Em certas modalida- des, o dgRNA e a primeira nuclease guiada por RNA podem se associar a uma sequência de motivo adjacente do primeiro protoespaçador (PAM) no ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a primeira se- quência PAM pode estar voltada para fora. Em certas modalidades, o primeiro gRNA e a segunda nuclease guiada por RNA podem se asso- ciar a uma segunda sequência de PAM no ácido nucleico alvo. Em cer- tas modalidades, a segunda sequência de PAM pode estar voltada para fora.
[0049] A divulgação neste documento também refere-se a métodos de alteração de células, incluindo o contato de uma célula com qualquer um dos sistemas de edição de genoma divulgados neste documento.
Em certas modalidades, o passo de contatar a célula pode compreender o contato da célula com uma solução compreendendo primeiro e se- gundo complexos de ribonucleoproteína. Em certas modalidades, o passo de contatar a célula com a solução compreende ainda eletroporar as células, introduzindo assim o primeiro e o segundo complexos de ribonucleoproteína na célula.
[0050] Em outro aspecto, a divulgação refere-se a células que são alteradas usando os métodos aqui divulgados. As células que incluem um indel produtivo que resulta na expressão de HbF, também são aqui divulgadas. Em certas modalidades, o indel pode ser produzido pelo contato da célula com um dgRNA, um primeiro gRNA incluindo uma se- gunda sequência de domínio de direcionamento maior que 17 nucleotí- deos de comprimento, uma primeira nuclease guiada por RNA e uma segunda nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, a primeira nuclease guiada por RNA e o dgRNA podem ser configurados para se associar dentro de uma primeira região alvo em um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a segunda nuclease guiada por RNA e o pri- meiro gRNA podem se associar com uma segunda região alvo e gerar uma quebra de cadeia dupla (DSB) no ácido nucleico alvo por meio do qual criar um indel entre a primeira região alvo e a segunda região alvo. Em certas modalidades, as células aqui divulgadas podem ser capazes de se diferenciar em um eritroblasto, eritrócito ou um precursor de um eritrócito ou eritroblasto. Em certas modalidades, a célula pode ser uma célula CD34+.
[0051] Um sistema ou método de edição de genoma incluindo qual- quer uma das características descritas acima pode incluir um ácido nu- cleico alvo compreendendo um gene humano HBG71, HBG2 ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a região alvo pode ser uma região alvo de caixa CCAAT do gene humano HBG71, HBG2 ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a primeira se- quência de domínio de direcionamento pode ser complementar a uma primeira sequência em um lado de uma região alvo da caixa CCAAT do gene humano HBG71, HBG2 ou uma combinação dos mesmos, em que a primeira sequência opcionalmente se sobrepõe à região alvo de caixa CCAAT do gene humano HBG71, HBG2, ou uma combinação dos mes- mos. Em certas modalidades, a segunda sequência de domínio de dire- cionamento pode ser complementar a uma segunda sequência em um lado de uma região alvo de caixa CCAAT do gene humano HBG1, HBG2 ou uma combinação dos mesmos, em que a segunda sequência opcio- nalmente se sobrepõe à região alvo de caixa CCAAT do gene humano HBG1, HBG2, ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalida- des, o primeiro domínio de direcionamento pode compreender um trun- camento de um domínio de direcionamento de gRNA. Em certas moda- lidades, o domínio de direcionamento gRNA podem incluir os gRNAs estabelecidos na Tabela 2, Tabela 10, ou Tabela 15, e o domínio de direcionamento gRNA foi truncado a partir de uma extremidade 5' do domínio de direcionamento gRNA. Em certas modalidades, o primeiro domínio de direcionamento pode ser o mesmo ou difere em não mais do que 3 nucleotídeos de um domínio de direcionamento de dgRNA es- tabelecido na Tabela 10 ou Tabela 15. Em certas modalidades, o se- gundo domínio direcionamento difere por não mais do que 3 nucleotí- deos a partir de um domínio de direcionamento gRNA apresentados na Tabela 2, Tabela 10 ou Tabela 15. Em certas modalidades, o indel pode alterar o indel da região alvo da caixa CCAAT. Em certas modalidades, o indel pode ser um indel produtivo, resultando em um nível elevado de expressão de hemoglobina fetal. Em certas modalidades, o gRNA, dgRNA ou ambos podem ser sintetizados in vitro ou sintetizados quimi- camente.
[0052] Em certas modalidades, uma célula pode incluir pelo menos um alelo modificado do locus HBG gerado por qualquer um dos métodos para alterar uma célula aqui divulgada, em que o alelo modificado do locus HBG compreende uma alteração do gene humano HBG71, gene HBG2, ou uma combinação dos mesmos.
[0053] Em certas modalidades, uma população isolada de células pode ser modificada por qualquer um dos métodos para alterar as célu- las aqui divulgados, em que a população de células pode incluir uma distribuição de indels que podem ser diferentes de uma população iso- lada de células ou seus descendentes do mesmo tipo de célula que não foram modificadas pelo método.
[0054] Em certas modalidades, uma pluralidade de células pode ser gerada por qualquer um dos métodos para alterar as células aqui divul- gadas, em que pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% das células podem incluir uma alteração de uma sequência na re- gião alvo da caixa CCAAT do gene HBG1 humano, gene HBG2 ou uma combinação dos mesmos.
[0055] Em certas modalidades, as células aqui divulgadas podem ser usadas para um medicamento. Em certas modalidades, as células podem ser para uso no tratamento de B-hemoglobinopatia. Em certas modalidades, B-hemoglobinopatia pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em doença falciforme e beta-talassemia.
[0056] Em um aspecto, a divulgação refere-se a composições inclu- indo uma pluralidade de células geradas por um método incluindo um dgRNA divulgado acima, em que pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 % ou 90% das células incluem uma alteração de uma sequência de uma região alvo de caixa CCAAT do gene HBG1 ou HBG2 humano ou uma pluralidade de células geradas pelo método divulgado acima, em que pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% das células incluem uma alteração de uma sequência de uma re-
gião alvo da caixa CCAAT de HBG1 ou HBG2 humano. Em certas mo- dalidades, pelo menos uma porção da pluralidade de células pode estar dentro de uma linhagem eritroide. Em certas modalidades, a pluralidade de células pode ser caracterizada por um nível elevado de expressão de hemoglobina fetal em relação a uma pluralidade de células não mo- dificada. Em certas modalidades, o nível de hemoglobina fetal pode ser aumentado em pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%. Em certas modalidades, as composições podem incluir ainda um transportador farmaceuticamente aceitável.
[0057] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma população de células modificadas por um sistema de edição de genoma incluindo um dgRNA descrito acima, em que a população de células compreende uma maior percentagem de um indel produtivo em relação a uma popu- lação de células não modificadas pelo sistema de edição de genoma. À divulgação também refere-se a uma população de células modificadas pelo sistema de edição de genoma incluindo um dgRNA descrito acima, em que uma maior percentagem da população de células é capaz de se diferenciar em uma população de células de uma linhagem eritroide que expressa HbF em relação a uma população de células não modificadas pelo sistema de edição do genoma. Em certas modalidades, a percen- tagem mais elevada pode ser pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30% ou pelo menos cerca de 40% maior. Em certas modalidades, as células podem ser células-tronco hematopoiéticas. Em certas modalidades, as células podem ser capazes de se diferenciar em um eritroblasto, eritró- cito ou um precursor de um eritrócito ou eritroblasto. Em certas modali- dades, o indel pode ser criado por um mecanismo de reparação dife- rente da reparação de união de extremidade mediada por micro-homo- logia (MMEJ).
[0058] A divulgação também refere-se ao uso de qualquer uma das células aqui divulgadas na fabricação de um medicamento para o trata- mento de B-hemoglobinopatia em um indivíduo.
[0059] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método de tra- tamento de uma B-hemoglobinopatia em um indivíduo em necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo das células aqui divulga- das. Em certas modalidades, um método de tratamento de uma B-he- moglobinopatia em um indivíduo em necessidade pode incluir a admi- nistração de uma população de células hematopoiéticas modificadas ao indivíduo, em que uma ou mais células foram alteradas de acordo com os métodos de alteração de uma célula aqui divulgados.
[0060] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um sistema de edi- ção de genoma, compreendendo: uma nuclease guiada por RNA; e um primeiro RNA guia, em que o primeiro RNA guia pode compreender um primeiro domínio de direcionamento que é complementar a uma pri- meira sequência em um lado de uma região alvo de caixa CCAAT de um gene HBG71, HBG2 humano ou uma combinação dos mesmos, em que o a primeira sequência se sobrepõe opcionalmente à região alvo da caixa CCAAT do gene HBG71, HBG2 humano ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o sistema de edição de genoma pode compreender ainda um ácido nucleico modelo que codifica uma altera- ção da região alvo da caixa CCAAT de um gene HBG1, HBG2 humano ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido nu- cleico modelo pode ser um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (SsSODN) ou um oligodeoxinucleotídeo de cadeia dupla (dSODN). Em certas modalidades, o ssSODN pode compreender um braço de homolo- gia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3'. Em certas modalidades, os braços de homologia podem ser simétricos em comprimento. Em certas modalidades, os braços de homologia podem ser assimétricos em comprimento. Em certas modalidades, o sSODN pode compreender uma ou mais modificações de fosforotioato.
Em cer- tas modalidades, uma ou mais modificações de fosforotioato podem es- tar na extremidade 5', na extremidade 3' ou uma sua combinação.
Em certas modalidades, o ssSODN pode ser uma cadeia positiva ou negativa.
Em certas modalidades, a alteração pode ser uma alteração de ocor- rência não natural.
Em certas modalidades, a alteração pode compre- ender uma deleção da região alvo da caixa CCAAT.
Em certas modali- dades, a deleção pode compreender uma deleção de 18 nt, uma dele- ção de 11 nt, uma deleção de 4 nt, uma deleção de 1 nt ou uma combi- nação das mesmas.
Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 18 nt, uma região alvo de 11 nt, uma região alvo de 4 nt, uma região alvo de 1 nt ou uma com- binação das mesmas.
Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 ou mais nucleotídeos de compri- mento, por exemplo, pelo menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento; a sequência de substituição pode com- preender O nucleotídeos de comprimento; e o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 ou mais nucleotídeos de compri- mento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento.
Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 18 nt e o braço de homologia 3' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 18 nt.
Em certas modalidades, o sSODN pode com- preender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em SEQ ID NO: 974 ou SEQ ID NO: 975. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 11 nt e o braço de homologia 3' pode compreender cerca de 50 a 100 pb,
por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 11 nt.
Em certas modalidades, o sSODN pode compreen- der, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em SEQ ID NO: 976 ou SEQ ID NO: 978. Em certas modalidades, o braço de ho- mologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 4 nt e o braço de homologia 3' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 4 nt.
Em certas modalidades, o sSODN pode compreender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994 e SEQ ID NO: 995. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 1 nt e o braço de homologia 3' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homo- logia 3' da região alvo de 1 nt.
Em certas modalidades, os braços de homologia podem ser simétricos em comprimento.
Em certas modalida- des, o SsSODN pode compreender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em SEQ ID NO: 982 ou SEQ ID NO: 983. Em certas modalidades, a alteração pode ser uma alteração de ocorrência natural.
Em certas modalidades, a alteração pode compreender uma deleção ou mutação da região alvo da caixa CCAAT.
Em certas modalidades, a re- gião alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 13 nt, uma região alvo -117G>A ou uma combinação das mesmas.
Em certas modalidades, a alteração pode compreender uma deleção de 13 nt na região alvo de 13 nt ou uma substituição de G para A na região alvo - 117G>A, ou uma combinação das mesmas.
Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 13 nt e o braço de homologia 3' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homo- logia 3' da região alvo de 13 nt.
Em certas modalidades, o ssSODN pode compreender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em SEQ ID NO: 977 ou SEQ ID NO: 979. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 13 nte o braço de homologia 3' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 13 nt.
Em certas modalidades, o sSODN pode com- preender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em SEQ ID NO: 980 ou SEQ ID NO: 981. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma Cas9 de S. pyogenes.
Em certas moda- lidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma variante Cpf1, con- forme divulgado neste documento.
Em certas modalidades, o primeiro domínio de direcionamento pode diferir em não mais do que 3 nucleotí- deos de um domínio de direcionamento listado na Tabela 7, Tabela 18, Tabela 19 ou um gRNA na Tabela 12, Tabela 19. Em certas modalida- des, o sistema de edição de genoma pode compreender ainda um se- gundo RNA guia, em que o segundo RNA guia pode compreender um segundo domínio de direcionamento que pode ser complementar a uma segunda sequência em um lado de uma região alvo de caixa CCAAT de um gene HBG1, HBG2 humano, ou uma combinação dos mesmos, em que a segunda sequência se sobrepõe opcionalmente à região alvo da caixa CCAAT do gene HBG71, HBG2 humano ou uma combinação dos mesmos.
Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma nickase e, opcionalmente, não possui atividade de RuvC.
Em cer- tas modalidades, o sistema de edição de genoma pode compreender primeira e segunda nucleases guiadas por RNA.
Em certas modalida- des, a primeira e a segunda nucleases guiadas por RNA podem ser complexadas com o primeiro e o segundo RNAs guia, respectivamente, formando o primeiro e o segundo complexos de ribonucleoproteína.
Em certas modalidades, o sistema de edição de genoma pode compreender ainda um terceiro RNA guia; e, opcionalmente, um quarto RNA guia, em que o terceiro e o quarto RNA guia podem compreender terceiro e quarto domínios de direcionamento complementares à terceira e quarta sequências em lados opostos de posições de um motivo de ligação GATA1 no intensificador eritroide BCL11A (BCL114e) de um gene BCL11A humano, em que uma ou ambas as terceira e quarta sequên- cias se sobrepõem opcionalmente ao motivo de ligação GATA1I1 em BCL 11A4e do gene BCL11A humano.
Em certas modalidades, o sistema de edição de genoma pode compreender ainda um modelo de ácido nucleico que codifica uma deleção do motivo de ligação GATA1I1 em BCL11Ae.
Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma Cas9 de S. pyogenes.
Em certas modalidades, a nuclease gui- ada por RNA pode ser uma nickase e, opcionalmente, não possui ativi- dade de RuvC.
Em certas modalidades, o terceiro domínio de direcio- namento pode ser complementar a uma sequência dentro de 1000 nu- cleotídeos a montante do motivo de ligação GATA1 em BCL11ÃAe.
Em certas modalidades, o terceiro domínio de direcionamento pode ser complementar a uma sequência dentro de 100 nucleotídeos a montante do motivo de ligação GATA1 em BCL11AÃAe.
Em certas modalidades, o terceiro domínio de direcionamento pode ser complementar a uma se- quência dentro de 100 nucleotídeos a montante do motivo de ligação GATA1 em BCL114Ae.
Em certas modalidades, o quarto domínio de di- recionamento pode ser complementar a uma sequência dentro de 50 nucleotídeos a jusante do motivo de ligação GATA1 em BCL11Ãe.
Em certas modalidades, pelo menos um do terceiro e quarto domínios de direcionamento podem diferir em não mais do que 3 nucleotídeos de um domínio de direcionamento listado na Tabela 9. Em certas modalidades, o sistema de edição de genoma pode compreender primeira e segunda nucleases guiadas por RNA. Em certas modalidades, a primeira e a se- gunda nucleases guiadas por RNA podem ser complexadas com o ter- ceiro e quarto RNAs guia, respectivamente, formando o terceiro e o quarto complexos de ribonucleoproteína.
[0061] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método de al- teração de uma célula que compreende o contato de uma célula com um sistema de edição de genoma. Em certas modalidades, o passo de contato da célula com o sistema de edição do genoma pode compreen- der o contato da célula com uma solução compreendendo o primeiro e o segundo complexos de ribonucleoproteína. Em certas modalidades, o passo de contatar a célula com a solução pode compreender ainda ele- troporar as células, introduzindo assim o primeiro e o segundo comple- xos de ribonucleoproteína na célula. Em certas modalidades, o método de alteração de uma célula pode compreender ainda o contato da célula com um sistema de edição do genoma, em que o passo de contato da célula com o sistema de edição do genoma pode compreender o contato da célula com uma solução compreendendo primeiro, segundo, terceiro e opcionalmente, quarto complexos de ribonucleoproteína. Em certas modalidades, o passo de contato da célula com a solução pode com- preender ainda a eletroporação das células, introduzindo assim o pri- meiro, o segundo, o terceiro e, opcionalmente, o quarto complexos de ribonucleoproteína na célula. Em certas modalidades, a célula pode ser capaz de se diferenciar em um eritroblasto, eritrócito ou um precursor de um eritrócito ou eritroblasto. Em certas modalidades, a célula pode ser uma célula CD34+.
[0062] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um método medi-
ado por CRISPR de alteração de uma célula, compreendendo: a intro- dução de uma primeira quebra de DNA de cadeia simples (SSB) ou que- bra de cadeia dupla (DSB) dentro de um genoma da célula entre as posições c. -106 a -120 de um gene humano HBG1 ou HBG2; e, opcio- nalmente, a introdução de uma segunda SSB ou DSB no genoma da célula entre as posições C-106 a -120 do gene HBG1 ou HBG2 humano, em que as primeira e segunda SSB ou DSB podem ser reparada pela célula de uma maneira que altera uma região alvo de caixa CCAAT do gene humano HBG71 ou HBG2. Em certas modalidades, a primeira e a segunda SSBs ou DSBs podem ser reparadas pela célula de uma ma- neira que resulte na alteração de uma região alvo de caixa CCAAT do gene humano HBG71 ou HBG2. Em certas modalidades, o método me- diado por CRISPR pode compreender ainda um ácido nucleico modelo que codifica a alteração da região alvo da caixa CCAAT de um gene humano HBG71, HBG2 ou uma combinação dos mesmos.
Em certas mo- dalidades, o ácido nucleico modelo pode ser um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (ssSODN). Em certas modalidades, o ssSODN pode compreender um braço de homologia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3'. Em certas modalidades, os sSODNs podem ser uma cadeia positiva ou negativa.
Em certas modalidades, a altera- ção pode ser uma alteração de ocorrência não natural.
Em certas mo- dalidades, a primeira e a segunda SSBs ou DSBs podem ser reparadas pela célula de uma maneira que resulta na formação de pelo menos um de um indel, uma deleção ou uma inserção na região alvo da caixa CCAAT do gene HBG1 ou HBG2 humano.
Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 18 nt, uma região alvo de 11 nt, uma região alvo de 4 nt, uma região alvo de 1 nt ou uma combinação das mesmas.
Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos ou mais de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50,75,
100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento; a sequência de substituição pode compreender O nucleotídeos de comprimento; e o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos ou mais de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50,75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento.
Em certas mo- dalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 18 nt, a região alvo de 11 nt, a região alvo de 4 nt ou a região alvo de 1 nt e o braço de homologia 3' podem compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 900 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 18 nt, a região alvo de 11 nt, a região alvo de 4 nt ou a região alvo de 1 nt.
Em certas modalidades, o SSODN pode compreender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:974, SEQ ID NO:975, SEQ ID NO:976, SEQ ID NO:978, SEQ ID NO:984, SEQ ID NO:985, SEQ ID NO:986, SEQ ID NO:987, SEQ ID NO:988, SEQ ID NO:989, SEQ ID NO:990, SEQ ID NO:991, SEQ ID NO:992, SEQ ID NO:993, SEQ ID NO:994, SEQ ID NO:995, SEQ ID NO:982 e SEQ ID NO:983. Em certas modalidades, a alteração pode ser uma alteração de ocorrência não natural.
Em certas modalidades, a primeira e a segunda SSBs ou DSBs podem ser reparadas pela célula de uma maneira que resulta na formação de pelo menos um de um in- del, uma deleção ou uma inserção na região alvo da caixa CCAAT do gene HBG1 ou HBG2 humano.
Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 13 nt, uma re- gião alvo -117G>A ou uma combinação das mesmas.
Em certas moda- lidades, a alteração pode compreender uma deleção de 13 nt na região alvo de 13 nt ou uma substituição de G para A na região alvo -117G>A, ou uma combinação das mesmas.
Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 13 nt ou a região alvo -117G>A e o braço de homologia 3' pode compreen- der cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 13 nt ou a região alvo -117G>A. Em certas modalidades, o ssSODN pode compreender, pode consistir es- sencialmente em, ou pode consistir em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 977 ou SEQ ID NO: 979. SEQ ID NO:980 ou SEQ ID NO:981.
[0063] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma composição que pode compreender uma pluralidade de células geradas por um mé- todo de alteração de uma célula aqui divulgado, em que pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80% ou 90% das células pode com- preender uma alteração de uma sequência de uma região alvo da caixa CCAAT do gene HBG71, gene HBG2 humano, ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a alteração pode compreender uma deleção de 18 nt, uma deleção de 11 nt, uma deleção de 4 nt, uma de- leção de 1 nt, uma deleção de 13 nt, uma substituição de G para A em -117, do gene HBG71, gene HBG2, humano ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, pelo menos uma porção da plurali- dade de células pode estar dentro de uma linhagem eritroide. Em certas modalidades, a pluralidade de células pode ser caracterizada por um nível elevado de expressão de hemoglobina fetal em relação a uma plu- ralidade de células não modificada. Em certas modalidades, o nível de hemoglobina fetal pode ser aumentado em pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%. Em certas modalidades, a composição pode compreender ainda um transportador farmaceuticamente aceitá- vel.
[0064] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma célula que compreende um genótipo sintético gerado por um método de alteração de uma célula aqui divulgado, em que a célula pode compreender uma deleção de 18 nt, uma deleção de 11 nt, uma deleção de 4 nt, uma de- leção de 1 nt, uma deleção de 13 nt, uma substituição de G para A em -117, do gene HBG1, HBG2 humano, ou uma combinação dos mesmos.
[0065] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma célula que compreende pelo menos um alelo do locus HBG gerado por um método de alteração de uma célula aqui divulgado, em que a célula pode codi- ficar uma deleção de 18 nt, uma deleção de 11 nt, uma deleção de 4 nt, uma deleção de 1 nt, uma deleção de 13 nt, uma substituição de G para A em -117, do gene HBG1, HBG2 humano, ou uma combinação dos mesmos.
[0066] Em um aspecto, a divulgação refere-se a um vetor AAV que pode compreender um ácido nucleico modelo que codifica uma altera- ção de ocorrência não natural de uma região alvo da caixa CCAAT de um gene HBG71, HBG2 humano ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo pode ser um oligodesoxi- nucleotídeo de cadeia simples (ssSODN). Em certas modalidades, a re- gião alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 18 nt, uma região alvo de 11 nt, uma região alvo de 4 nt, uma região alvo de 1 nt ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, o sSODN pode compreender um braço de homologia 5', uma sequência de subs- tituição e um braço de homologia 3'. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 ou mais nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento; a sequência de substituição pode compreender O nucleotídeos de comprimento; e o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 ou mais nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb,
homologia 5' da região alvo de 18 nt, a região alvo de 11 nt, a região alvo de 4 nt ou a região alvo de 1 nt e o braço de homologia 3' podem compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 18 nt, a região alvo de 11 nt, a região alvo de 4 nt ou a região alvo de 1 nt. Em certas mo- dalidades, o sSODN pode compreender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em uma sequência selecionada do grupo que con- siste em SEQ ID NO:974-976, SEQ ID NO:978, SEQ ID NO:982-995.
[0067] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma sequência de nucleotídeos compreendendo um ácido nucleico modelo que codifica uma alteração de ocorrência não natural de uma região alvo de caixa CCAAT de um gene HBG1, HBG2 humano ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo pode ser um oligodesoxinucleotídeo de cadeia simples (ssODN) ou um oligodeoxinu- cleotídeo de cadeia dupla (dsODN) compreendendo a alteração. Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode compreender uma região alvo de 18 nt, uma região alvo de 11 nt, uma região alvo de 4 nt, uma região alvo de 1 nt ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, o ssSODN pode compreender um braço de homolo- gia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3'. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 ou mais nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento; a sequência de substituição pode compreender O nucleo- tídeos de comprimento; e o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 ou mais nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 18 nt, a região alvo de 11 nt, a região alvo de 4 nt ou a região alvo de 1 nt e o braço de homologia 3' podem compreender cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 18 nt, a região alvo de 11 nt, a região alvo de 4 nt ou a região alvo de 1 nt. Em certas modalidades, o ssSODN pode compreender, pode consistir essencialmente em, ou pode consistir em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:974-976, SEQ ID NO:978, SEQ ID NO:982-995.
[0068] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma célula que compreende um genótipo sintético, em que a célula pode compreender uma deleção de 18 nt, uma deleção de 11 nt, uma deleção de 4 nt, uma deleção de 1 nt, uma deleção de 13 nt, uma substituição de G para À em -117, do gene HBG1, HBG2 humano, ou uma combinação dos mes- mos.
[0069] Em um aspecto, a divulgação refere-se a uma composição, compreendendo uma população de células gerada por um método de alteração de uma célula aqui divulgado, em que as células compreen- dem uma frequência mais alta de uma alteração de uma sequência de uma região alvo de caixa CCAAT do gene HBG71, gene HBG2 humano ou uma combinação dos mesmos em relação a uma população de cé- lulas não modificada. Em certas modalidades, a frequência mais alta é pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% maior. Em certas modalidades, a alteração compreende uma dele- ção de 18 nt, uma deleção de 11 nt, uma deleção de 4 nt, uma deleção de 1 nt, uma deleção de 13 nt, uma substituição de G para A em -117, do gene HBG71, HBG2 humano, ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, pelo menos uma porção da população de células está dentro de uma linhagem eritroide.
[0070] Esta listagem pretende ser exemplificativa e ilustrativa, em vez de abrangente e limitativa. Aspectos e modalidades adicionais po- dem ser estabelecidos ou aparentes no restante desta divulgação e nas reivindicações. Breve Descrição das Figuras
[0071] Os desenhos anexos destinam-se a fornecer exemplos ilus- trativos e esquemáticos, em vez de abrangentes, de certos aspectos e modalidades da presente divulgação. Os desenhos não se destinam a limitar ou vincular qualquer teoria ou modelo específico e não estão ne- cessariamente em escala. Sem limitar o precedente, os ácidos nuclei- cos e polipeptídeos podem ser representados como sequências lineares ou como estruturas esquemáticas bidimensionais ou tridimensionais; essas representações pretendem ser ilustrativas, em vez de limitar ou vincular a qualquer modelo ou teoria em particular a respeito de sua estrutura.
[0072] Fig. 1 representa, em forma esquemática, gene(s) HBG1 e HBG2 no contexto do agrupamento de genes B-globina no cromossomo humano 11. Fig. 1. Cada gene no agrupamento de genes da B-globina é regulado transcricionalmente por um promotor proximal. Embora não desejando estar limitado por qualquer teoria em particular, geralmente pensa-se que a expressão de A, e/ou G, é ativada por engajamento entre o promotor proximal com o intensificador específico de eritroide forte distal, a região de controle do locus (LCR). A transativação longa- gama pela LCR está pensada para ser mediada pela alteração configu- ração/confirmação de cromatina. A LCR é marcada por 4 sítios hiper- sensíveis à Dnase | específicos para eritroides (HS1-4) e 2 elementos intensificadores distais (5' HS e 3' HS1). A expressão do gene da globina é regulada de uma maneira específica do estágio de desenvolvimento, e a expressão das alterações dos genes da globina coincide com as alterações no sítio principal de produção de sangue.
[0073] Figs. 2A-2B ilustram genes HBG1 e HBG2, sequências de codificação (CDS) e pequenas deleções e mutações pontuais dentro e a montante de promotores proximais de HBG1 e HBG2 que foram iden- tificadas em pacientes e associados com elevação de hemoglobina fetal (HbF). Elementos centrais dentro dos promotores proximais (caixa CAAT, sequência 13 nt) que foram deletados em alguns pacientes com persistência hereditária de hemoglobina fetal (HPFH). A região de 'se- quência alvo' de cada locus, que foi rastreada para sítios alvo de ligação de gRNA, também é identificada.
[0074] Fig. 3 mostra dados de rastreamento de gRNA para incorpo- ração da deleção de 13 nt em células humanas de eritroleucemia K562. Fig. 3A Edição de genes, tal como determinado por análise de ensaio endonuclease T7E1 (referida alternadamente como uma "análise T7E1") de produtos de PCR específicos lócus de HBG1 e HBG2 ampli- ficados a partir de DNA genômico extraído de células K562, após a ele- troporação com DNA que codifica para gRNAs específicos de S. pyoge- nes e DNA de plasmídeo que codificam Cas9 de S. pyogenes. Fig. 3B Edição de gene conforme determinado pela análise da sequência de DNA de produtos de PCR amplificados a partir do locus HBG1 em DNA genômico extraído de células K562 após eletroporação com DNA que codifica o gRNA indicado e o plasmídeo Cas9. Fig. 3C Edição de gene conforme determinado pela análise da sequência de DNA de produtos de PCR amplificados a partir do locus HBG2 em DNA genômico extraído de células K562 após eletroporação com DNA que codifica o gRNA in- dicado e o plasmídeo Cas9. Para Fig. 3B-C, os tipos de eventos de edição (inserções, deleções) e subtipos de deleções (13 nt alvo parcial- mente [12 nt HPFH] ou totalmente [13-26 nt HPFH] deletado, outras se- quências deletadas [outras deleções]) são indicados por barras com pa- drões/sombreados diferentes.
[0075] Fig. 4 representa os resultados da edição de genes no san- gue do cordão umbilical (CB) e células CD34* humanas adultas após eletroporação com RNPs complexados com gRNAs de S. pyogenes transcritos in vitro que têm como alvo uma sequência específica de 13 nt para deleção (HBG sgRNAs Sp35 e Sp37). Fig. 4A representa a per- centagem de indels detectados por análise de T7E1 de produtos de PCR específicos de HBG1 e HBG2 amplificados de gDNA extraído de células CB CD34* tratadas com os RNP'ss indicados ou células de con- trole não tratadas correspondentes de doador (n=3 células CB CD34*, 3 experiências separadas). Os dados mostrados representam a média e as barras de erro correspondem ao desvio padrão entre os 3 doado- res/experiências separados. Fig. 4B representa a percentagem de in- dels detectados por análise de T7E1 de produto de PCR específico de HBG2 amplificado de gDNA extraído de células CB CD34* ou células CD34* adultas tratadas com os RNP'ss indicados ou células de controle não tratadas correspondentes do doador (n=3 CB CD34* células, n=3 células CD34* de sangue periférico mobilizado (MPB), 3 experiências separadas). Os dados mostrados representam a média e as barras de erro correspondem ao desvio padrão entre os 3 doadores/experiências separados. Fig. 4C (painel superior) descreve indels detectados por análise de T7E1 de produtos de PCR de HBG?2 amplificados a partir de gDNA extraído de células CB CD34+ humanas eletroporadas com HBG Sp35 RNP ou HBG Sp37 RNP +/- ssODN (extremidades 5' e 3' não mo- dificada ou modificadas com PhTx). O painel inferior esquerdo mostra o nível de edição do gene conforme determinado pela análise da sequên- cia de DNA Sanger de gDNA de células editadas com HB G Sp37 RNP e ssSODN. O painel inferior direito mostra os tipos específicos de dele- ções detectadas no total de deleções.
[0076] Fig. 5 representa a edição de genes de HBG em células CD34* de sangue periférico humano mobilizado (MPB) e indução de he- moglobina fetal na descendência eritroide de células tratadas com RNP após eletroporação de células mPB CD34* com HBG Sp37 RNP +/-
SSODN codificando a deleção de 13 nt. Fig. 5A representa a percenta- gem de indels detectados por análise de T7E1 de produto de PCR de HBG2 amplificado a partir de gDNA extraído de células CD34* mPB tra- tadas com o RNP ou células de controle não tratadas correspondentes de doador. Fig. 5B representa o número de vezes de alteração na ex- pressão de mRNA de HBG em eritroblastos do dia 7 que foram diferen- ciados de células mPB CD34* de controle correspondentes de doador não tratadas e tratadas com RNP. Os níveis de MRNA são normalizados para GAPDH e calibrados para os níveis detectados em controles não tratados nos dias de diferenciação correspondentes.
[0077] Fig. 6 representa o potencial de diferenciação ex vivo de cé- lulas mPB CD34* tratadas com RNP e não tratadas do mesmo doador. Fig. 6A mostra o potencial de células hematopoéticas mieloides/forma- doras de colônias eritroides (CFC), onde o número e o subtipo de colô- nias são indicados (GEMM: colônia de granulócitos-eritroides-monóci- tos-macrófagos, E: colônias de eritroides, GM: colônias de granulócitos- macrófagos, M: colônia de macrófagos, G: colônia de granulócitos). Fig. 6B representa a percentagem de Glicoforina A expressa ao longo do tempo de diferenciação eritroide, conforme determinado por análise de citometria de fluxo nos pontos de tempo indicados e para as amostras indicadas.
[0078] Fig. 7A descreve indels detectados por análise T7E1 de pro- duto de PCR de HBG amplificado de gDNA extraído de células mPB CD34* humanas tratadas com RNPs de HBG (nickases emparelhadas D10A). Para um subconjunto de amostras, as células também recebe- ram ssSODN que codifica a deleção de 13 nt mais SNPs silenciosos para monitorar HDR (ssODN). Fig. 7B representa a análise de sequencia- mento de DNA para selecionar subconjunto de amostras apresentado na Fig. 7A. Os indels foram subdivididos de acordo com o tipo de indel (inserção, deleção de 13 nt ou outra deleção).
[0079] Fig. 8A representam os indels no sítio alvo HBG após eletro- poração de células mPB CD34* com os pares indicados de gRNAs com- plexados em nickase D10A e pares RNP TS. Fig. 8B representa os grandes eventos de deleção (por exemplo, deleção de HBG2) após ele- troporação de células mPB CD34* com os pares indicados de gRNAs complexados em D10A nickase e RNPs TS. Fig. 8C representa a aná- lise de sequenciamento de DNA e os subtipos de eventos (inserções, deleções) detectadas no gDNA de células mPB CD34'* tratadas com pa- res de D10A nickase emparelhados. Fig. 8D representa a análise de sequenciamento de DNA e os subtipos de eventos (inserções, deleções) detectadas no gDNA de células mPB CD34* tratadas com pares de RNP TS emparelhados.
[0080] Fig. 9 representa o resumo da proteína HbF e expressão de MRNA na descendência de células mPB CD34* tratadas com RNPs em- parelhados direcionados a HBG, para as experiências mostradas nas Figs. 7 e 8. A proteína HbF (por análise de HPLC) e a expressão de MRNA de HbF (análise de ddPCR) foram avaliadas na descendência eritroide de células mPB CD34* humanas tratadas com RNP (níveis de base de HbF detectados em controles não tratados compatíveis com doadores foram subtraídos dos níveis detectados na descendência de células CD34* tratadas com RNP).
[0081] Fig. 10 representa as frequências indel e o potencial hema- topoiético de curto prazo ex vivo e in vivo de células CD34* após o tra- tamento com diferentes concentrações (0, 2,5, 3,7 uM) de RNPs de nickase D10A emparelhados (SpA + Sp85). Os indels foram avaliados por análise T7E1 (Fig. 10A) e por análise de sequenciamento Illumina (inserções e deleções, Fig. 10B). Fig. 10C representa a % de proteína HbF detectada por análise de HPLC (% HbF = 100% x HbF/(HbF + HbA). Fig. 10D representa a atividade hematopoiética das células
CD34* de controle tratadas com RNP e não tratadas de doador corres- pondente em ensaios de células formadoras de colônia (CFC). CFCs mostradas são por mil células CD34* plaqueadas. Fig. 10E mostra a reconstituição de células CD45* de sangue humano do sangue perifé- rico em camundongos imunodeficientes (NSG) 1 mês após o transplante com mPB CD34* humanas de doador compatível que não foram trata- das (O uM) ou tratadas com uma de duas doses (2,5 e 3,75 uM) de RNP D10A e gRNAs emparelhados. Fig. 10F mostra a reconstituição de cé- lulas CD45* de sangue humano do sangue periférico em camundongos imunodeficientes (NSG) 2 meses após o transplante. Figs. 10G e 10H representam as distribuições de linhagem a seguir à reconstituição de células de sangue humanas CD45* de camundongos NSG em 1 mês (Fig. 10G) e 2 meses (Fig. 10H).
[0082] Fig. 11A correlaciona os níveis de HbF conforme ensaiados por HPLC e frequência indel conforme avaliado por análise de T7E1 para dois pares de RNP de nickase D10A (SP37 + SPB e SP37 + SPA) entregues nas concentrações indicadas para células mPB CD34*. Os níveis de HbF foram analisados na descendência eritroide (dia 18) de células CD34* editadas. A proteína HbF detectada em controles não tra- tados compatíveis com doador foi subtraída das amostras editadas. Fig. 11B representa as taxas indel sobrepostas na atividade das células for- madoras de colônias hematopoiéticas (CFC) associadas às células CD34* tratadas com os pares de nickase D10A indicados ou controles não tratados. Fig. 11C representa a reconstituição de células sanguí- neas CD45* humanas de camundongos NSG imunodeficientes um mês após o transplante de células mPB CD34* tratadas com pares de nickase D10 RNP indicados nas concentrações dadas ou controles não tratados correspondentes de dadores. Fig. 11D representa a distribui- ção da linhagem de sangue humano detectada na fração CD45* hu- mana no sangue periférico de camundongo um mês após o transplante.
[0083] Fig. 12 representa um sítio alvo para desrepressão de HbF, o motivo GATA1 do intensificador específico de eritroide de BCL11A (BCL11Ae) do sítio de hipersensibilidade +58 DNase | (DHS) (coorde- nadas genômicas: chr2: 60,495,265 a 60,495,270).
[0084] Fig. 13A representa a percentagem de indels detectados pela análise de endonuclease T7E1 de produtos de PCR BCL11A am- plificados de gDNA extraído de células CB CD34* tratadas com células de controle não tratadas RNP +/- ssODN ou correspondentes de doa- dor. Os dados mostrados representam a média de três 3 doadores/ex- periências separadas. Fig. 13B representa indels detectados por aná- lise de endonuclease T7E1 de produtos de PCR BCL11A amplificados a partir de gONA extraído de células CB CD34* tratadas com o RNP TS indicado (gRNA único direcionado ao intensificador eritroide BCL11A complexado com Cas9 S. pyogenes TS tendo ambas as atividades RuvC e HNH) ou nickase RNP emparelhada (gRNAs emparelhados com alvo no intensificador eritroide do BCL11A complexado com nickases Cas9 S. pyogenes partilhando a mesma atividade de corte em cadeia simples HNH (por exemplo, D10A), bem como a atividade hematopoié- tica de células em cada condição.
[0085] Fig. 14A representa a frequência de edição de BCL11Ae (usando uma abordagem de gRNA único visando o motivo GATA1) em células humanas adultas MO CD34*. Fig. 14B mostra a edição monoa- lélica e bialélica detectada em colônias hematopoiéticas (GEMMs, des- cendência clonal de células CD34* tratadas com RNP BCL11ÃAe) con- forme determinado por análise de sequenciamento de DNA. Fig. 14C mostra a cinética da maturação do eritroblasto (enucleação conforme determinado por células DRAQS5' detectadas por análise de citometria de fluxo). Fig. 14D mostra a aquisição do fenótipo eritroide (células Gli- coforina A* ) no controle diferenciado e células MO CD34* tratadas com RNP, enquanto a Fig. 14E mostra o número de aumento nas células
HbF* conforme determinado por análise de citometria de fluxo relativa a células HbF* em amostras de controle emparelhadas de doadores não tratados.
[0086] Fig. 15 representa a edição de genes de BCL11Ae em célu- las mPB CD34* e indução de hemoglobina fetal na descendência eri- troide de células tratadas com RNP e ssODN após eletroporação de células mPB CD34* com ssODN não especifico BCL11Ae RNP +. Fig. 15A representa a percentagem de indels detectados por análise de T7E1 de produto de PCR de HBG2 amplificado a partir de gONA extra- ído de células CD34* mPB tratadas com BCL11A4e RNP e ssODN não específico ou células de controle não tratadas correspondentes de doa- dor. Fig. 15B representa o número de vezes de alteração na expressão de mRNA de HBG em eritroblastos do dia 10 que foram diferenciados de células mPB CD34* de controle correspondentes de doador tratadas com BCL11Ae RNP e não tratadas (os níveis de RNAm são normaliza- dos para GAPDH e calibrados para os níveis detectados em controles não tratados em os dias correspondentes de diferenciação). Fig. 15C representa a percentagem de Glicoforina A expressa ao longo do de- curso da diferenciação eritroide do tratamento de células +/- mPB CD34* com BCL11Ae RNP e ssODN não específico, tal como determi- nado por análise de citometria de fluxo, nos pontos de tempo indicados e para as amostras indicadas.
[0087] Fig. 16 representa a percentagem de indels detectados por sequenciamento de próxima geração (NGS) do produto HBG PCR am- plificado de gDNA extraído de células-tronco hematopoiéticas/progeni- toras (HSPCs) tratadas com Cas9 complexado com o RNA guia sinteti- zado quimicamente OL! 7066 (SEQ ID NO: 970, Tabela 10) ("OLI 7066 -RNP") a uma concentração de 16 uM. Vários indels foram identificados, incluindo HBG 4-102:-121, HBG A-114:-124, HBG A4-116, HBG -114+T, HBG -116+G, HBG A-112:-115, HBG 4-113:-115, HBG A8-114:-115,
HBG A-115, HBG A-102:-114 (a deleção 13nt de ocorrência natural).
[0088] Figs. 17A-D representam níveis de expressão da cadeia G gama (Gy)-globina, cadeia A gama (Ay)-globina (ou AG gama (AGy)- globina resultante da deleção de 4,9 kb) conforme determinado por [ca- deia gamal/[todas-cadeias gama + cadeia beta] em comparação com indels relativos transportados em HBG1 ou HBG2 conforme medido por análise UPLC na descendência eritroide de HSPC único que foi eletro- cporado com Cas9 complexada com o gRNA OLI7066 (SEQ ID NO: 970) ("OLI7066-RNP") (Tabela 10). Fig. 17A representa a expressão da cadeia de AgamaT (AyT)-globina conforme determinado por [cadeia AvyT-globinal/[cadeias gama + cadeia beta] para clones que transportam os indels indicados no alelo HBG1 correspondente (HBG1 A-115, HBG1 10-114:-115, HBG1 4-113:-115, HBG1 A-112:-115, HBG1 4-102:-114, HBG1 A-104:-121, HBG1 A4-116). Fig. 17B representa a expressão da cadeia de G gama (Gy)-globina conforme determinado por [cadeia Gy- gamal/[cadeias gama + cadeia beta] para clones que transportam os indels indicados no alelo HBG2 (HBG2 A-115, HBG2 A-114:-115, HBG2 10-113:-115, HBG2 4-112:-115, HBG2 A0-102:-114, HBG2 A-104:-121, HBG2 A-116). Para garantir que a análise da indução de G gama (Gy)- globina seja o resultado de um único alelo editado, apenas clones com edição monoalélica de HBG2 ou com uma deleção de um dos alelos de HBG?2 foram analisados (resultante da deleção de 4,9 kb). Fig. 17C des- creve expressão da cadeia AG gamaT (AGyT)-globina, tal como deter- minado por [cadeia AGyT-gama] [todas-cadeias gama + cadeia beta]/para os clones que transportam os indels indicados no correspon- dente alelo HBG1/2 (HBG1/2 A-115, HBG1/2 A-114:-115, HBG1/2 À- 113:-115, HBG1/2 4-112:-115, HBG1/2 0-102:-114, HBG1/2 A0-104:- 121, HBG1/2 0-116). Fig. 17D descreve expressão da cadeia AGgamal (AGylI)-globina, tal como determinado por [cadeia AGyI-gama] [todas- cadeias gama + cadeia beta]l/para os clones que transportam os indels indicados no correspondente alelo HBG1/2 (HBG1/2 0-115, HBG1/2 A- 114:-115, HBG1/2 4-113:-115, HBG1/2 4-112:-115, HBG1/2 2-102:- 114, HBG1/2 0-104:-121, HBG1/2 24-116).
[0089] Fig. 18 representa, em forma esquemática, gene(s) HBG1 e HBG2 no contexto do agrupamento de genes B-globina no cromossomo humano 11. O esquema mostra os sítios alvo da caixa CCAAT em HBG1 e HBG2. Devido à homologia dentro desta região, um único RNA guia, como OLI8394 (SEQ ID NO: 971), complexado a uma nuclease de RNA (por exemplo, Cas9) cortará em HBG1 e HBG2. Os resultados de edição a seguir à entrega de Cas9 complexada com OLI8394 ("OLI8394-RNP") variam e resultam na redução diferentes deleções ou inserções. Os oligodesoxinucleotídeos de cadeia simples (ssODN) fo- ram projetados para fornecer um modelo que copia a assinatura indel desejada na caixa CCAAT (Tabela 11). O ssODN "codifica" a respectiva deleção com braços de homologia de sequência flanqueando a sequên- cia ausente para criar uma deleção perfeita.
[0090] Figs. 19A-G representam os resultados da edição do gene da região alvo da caixa CCAAT de HBG de células CD34+ humanas adultas de mPB ("células mPB CD34+") eletroporadas com 2 uM de OLI8394-RNP ou OLI7O066-RNP e 2,5 uM de vários ssSODNs (Tabela 11). Fig. 19A representa a percentagem de indels detectados por se- quenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com OLI8394-RNP e ssODN OLI1I6413 ("-11 nt + cadeia") ou ssSODN OLI6411 ("-11 nt - cadeia"). Fig. 19B mostra a percentagem precisa de "deleção -11 nt" para o total de indels detectados por sequenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com OLI8394-RNP e ssSODN OLI16413 ("-11 nt + cadeia") ou sSODN OLI16411 ("-11 nt - cadeia"). Fig. 19C representa a percentagem de indels detectados por sequenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com OLI8394-RNP e ssODN OLI1I6430 ("-4 nt + cadeia") ou sSODN
OLII6424 ("-4 nt - cadeia"). A percentagem da deleção de -4 nt precisa (ou seja, 4-112:-115) é diferenciada de outros indels. Fig. 19D repre- senta a percentagem de indels detectados por sequenciamento do pro- duto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com OLI8394-RNP e ssODN OLI16418 ("-1 nt + cadeia") ou sSODN OLI1I6417 ("-1 nt - ca- deia"). A percentagem da deleção de -1 nt precisa (ou seja, 4-116) é diferenciada de outros indels. Fig. 19E representa a percentagem de indels detectados por sequenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com OLI8394-RNP e ssODN OLI16409 ("-18 nt + cadeia") ou ssSODN OLI16410 ("-18 nt - cadeia"). A percentagem da de- leção de -18 nt precisa (ou seja, 4-104:-121) é diferenciada de outros indels. Fig. 19F representa a percentagem de indels detectados por se- quenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com OLI7066-RNP e ssODN OLI1I6414 ("-13 nt + cadeia") ou ssSODN OLI6412 ("-13 nt - cadeia"). A percentagem da deleção de -13 nt pre- cisa (ou seja, A-102: -114) é distinta de outros indels. Fig. 19G repre- senta a percentagem de indels detectados por sequenciamento do pro- duto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com OLI8394-RNP e sSSODN OLIN16416 ("-117 G>A + cadeia") ou sSODN OLI16415 ("-117 G>A - cadeia"). A percentagem de leituras com a substituição -117 G> A, com ou sem indels, é diferenciada de outras leituras.
[0091] Figs. 20A-B representam os níveis de expressão de cadeias de gama-globina sobre cadeias de globina semelhante a beta total (ca- deias gama/[cadeias gama + cadeia beta]) conforme medido por análise UPLC na descendência eritroide de células mPB CD34+ que foram ele- troporadas com OLI8394-RNP ou OLI7066-RNP e vários ssODNs (Ta- bela 11). Fig. 20A representa a percentagem de cadeias globina-gama sobre cadeias de globina semelhante a beta total (cadeias gama/[ca- deias gama + cadeia beta]), conforme medido por UPLC após a eletro- poração com (i) OLIS8394-RNP e OLI7O66-RNP sozinho, (ii) OLI8394-
RNP e ssODN OLIN6430 ("-4 nt + cadeia"), ssSODN OLIN6424 ("-4 nt - cadeia"), ssSODN OLI16413 ("-11 nt + cadeia"), ou sSODN OLI16411 ("- 11 nt - cadeia"), e (iii) OLITZO6G6-RNP e ssODN OLIN6414 ("-13 nt + ca- deia") ou sSODN OLI16412 ("-13 nt - cadeia"). Fig. 20B representa a percentagem de cadeias globina-gama sobre cadeias de globina seme- lhante a beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]), con- forme medido por UPLC após a eletroporação com OLI8394-RNP e ssSODN OLI16418 ("-1 nt + cadeia"), ssSODN OLIN16417 ("-1 nt - cadeia"), sSsSODN OLI6416 ("-117 G>A + cadeia"), ssSODN OLIN6415 ("-117 G>A - cadeia"), ssSODN OLI16409 ("-18 nt + cadeia"), ou sSODN OLI16410 ("-18 nt - cadeia").
[0092] Figs. 21A-D representam resultados de edição de genes de células mPB CD34+ eletroporadas com 2 uM OLI8394-RNP e ssODN OLI6424 ("-4 nt - cadeia") (Tabela 11) em doses que variam de 0,625 UM a 10 UM. Fig. 21A representa a percentagem de indels detectados por sequenciamento do produto de PCR de HBG 72 horas após a ele- troporação. Fig. 21B representa a frequência de deleções de 4,9 kb de- tectadas por ddPCR entre HBG1 e HBG2 após eletroporação. Fig. 21C descreve a viabilidade percentual de células CD34+ humanas adultas de mPB 48 horas após a eletroporação. Fig. 21D representa a percen- tagem de cadeias de gama-globina sobre o total de cadeias de globina semelhante a beta (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]l), con- forme medido por análise UPLC dos lisados celulares da descendência eritroide de células eletroporadas.
[0093] Figs. 22A-D representam resultados de edição de genes de células mPB CD34+ eletroporadas com doses indicadas de OLI8394- RNP e doses indicadas de ssSODN OLI16424 ("-4 nt - cadeia") (Tabela 11). Fig. 22A representa a percentagem de indels detectados por se- quenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com doses indicadas (2, 4 ou 8 uM) de OLI8394-RNP e doses indicadas (0,
1,25, 2,5 ou 5 UM) de ssODN OLIN16424 ("-4 nt - cadeia"). Fig. 22B re- presenta a percentagem de deleções de -4 nt ("deleções -112: -115") detectadas por sequenciamento de próxima geração (NGS) do produto HBG PCR após a eletroporação com doses indicadas (2, 4 ou 8 uM) de OLI8394-RNP e doses indicadas (0, 1,25, 2,5 ou 5 uM) de ssODN OLII6424 ("-4 nt - cadeia"). Fig. 22C representa a frequência de dele- ções de 4,9 kb entre HBG1 e HBG2 após eletroporação com as doses indicadas (2, 4 ou 8 uM) de OLI8394-RNP e doses indicadas (0, 1,25, 2,5 ou 5 uM) de ssSODN OLI16424 ("-4 nt - cadeia"). As deleções foram medidas via ddPCR. Fig. 22D representa a percentagem de cadeias de gama-globina sobre o total de cadeias de globina semelhante a beta (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]l), conforme medido por análise UPLC dos lisados celulares da descendência eritroide de células CD34+ mPB após eletroporação com as doses indicadas (2, 4 ou 8 uM) de OLI8394-RNP e doses indicadas (0, 1,25, 2,5 ou 5 uM) de ssSODN OLI16424 ("-4 nt - cadeia").
[0094] Figs. 23A-B representam um esquema e os resultados for- necidos por modelos ssODN com braços de homologia simétricos e as- simétricos. Fig. 23A representa os sítios alvo de caixa CCAAT em HBG1 e HBG2 que é direcionado por OLI8394 (SEQ ID NO: 971) e OLI7066 (SEQ ID NO: 970). SS ODNs com braços simétricos ou assi- métricos foram desenhados para fornecer um modelo que copia a dele- ção -4nt (HBG-112: -115) de HBG1 e HBG2 (Tabela 11). O ssODN "co- difica" a respectiva deleção com braços de homologia de sequência flanqueando a sequência ausente para criar uma deleção perfeita em HBG-112:-115. Fig. 23B representa a percentagem de indels detecta- dos pelo sequenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletro- poração de células CD34+ mPB com 2 uM de OLI8394-RNP e 2,5 uM de vários ssODNs, OLI16424 ("90/90"), OLI1I6419 ("40/80") ou OLI6421 ("50/50"), que "codifica" a deleção de 4 nt (HBG-112: -115)
(Tabela 11).
[0095] Fig. 24 representa a percentagem de indels detectado por sequenciamento de produto HBG de PCR 72 horas após a eletropora- ção de células CD34+ mPB com D10ACas9 complexado com Sp37 e SpA gRNAs (Tabela 12) ("sp37-D10A-RNP + SPA-D10A- RNP") sozi- nho ou com ssSODN OLIN6424 ("-4 nt - cadeia") (Tabela 11). A percen- tagem da deleção de -4 nt precisa (ou seja, 4-112:-115) é diferenciada de outros indels.
[0096] Fig. 25 representa a edição de genes de HBG de células CD34+ mPB eletroporadas com variantes de Cpf1 Acidaminococcus sp. ("ASCpf1"), nomeadamente His-AsCpf1-nNLS (SEQ ID NO: 1000) e His- AsCpf1-sNLS-sNLS (SEQ ID NO: 1001) complexado com o RNA guia HBG1-1 (OLI13620) (Tabela 13) ("His-ASCpf1-nNLS HBG1-1 RNP" e "His-AsCpf1-sNLS-sNLS HBG1-1RNP"). Os RNP foram eletroporados a 5 uM ou 20 uM.
[0097] Figs. 26 A-C representam a edição de genes de HBG de cé- lulas CD34+ mPB eletroporadas com His-AsCpf1-sNLS-sNLS HBG1-1 RNP apenas ou com vários ssODNs. Fig. 26A representa a percenta- gem de indels detectados por sequenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com His-AsCpf1-sNLS-sSNLS HBG1-1 RNP apenas ou com OLI 164324 ("-4nt - cadeia"), OLI16430 ("-4 nt + cadeia"), OLII6410 ("-18 nt - cadeia") ou OLI16409 ("-18 nt + cadeia"). Fig. 26B representa a percentagem de indels de deleção de 18 nucleotídeos pre- cisa detectados por sequenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com His-AsCpf1-sNLS-sSNLS HBG1-1 RNP ape- nas ou com OLI16410 ("-18 nt - cadeia") ou OLI16409 ("-18 nt + cadeia"). Fig. 26C representa a percentagem da deleção precisa de 18 nt em to- dos os indels detectados por sequenciamento do produto HBG PCR 72 horas após a eletroporação com His-AsCpf1-sNLS-sSNLS HBG1-1 RNP apenas ou com OLI1I6410 ("-18 nt - cadeia") ou OLI16409 ("-18 nt + cadeia").
[0098] Figs. 27 A-F ilustram esquemas da região alvo de HBG1-1 e pares Cas9 S. Pyogenes gRNA usados em combinação. Fig. 27A mos- tra a região alvo de HBG1-1 gRNA (compreendendo o domínio de dire- cionamento de RNA estabelecido em SEQ ID NO: 1002, Tabela 15). À caixa distal CCAAT do promotor HBG (ou seja, HBG1/2 c.-111 a -115) é indicada por uma caixa cinza. Fig. 27B mostra a região alvo de HBG1- 1, a caixa CCAAT distal de HBG e o gRNA SpA da região alvo (compre- endendo o domínio de direcionamento de SEQ ID NO: 941, Tabela 15). Fig. 27C mostra a região alvo de HBG1-1, a caixa CCAAT distal de HBG e o gRNA SpG da região alvo (compreendendo o domínio de direciona- mento de SEQ ID NO: 359, Tabela 15). Fig. 27D mostra a região alvo de HBG1-1, a caixa CCAAT distal de HBG, a região alvo de tSpA gRNA morto ("dgRNA") (compreendendo o domínio de direcionamento de SEQ ID NO: 326, Tabela 15), e o região alvo de Sp182 dgRNA (com- preendendo o domínio de direcionamento de SEQ ID NO: 1028, Tabela 15). Fig. 27E mostra a região alvo de HBG1-1, a caixa CCAAT distal de HBG e tSpA dgRNA (compreendendo o domínio de direcionamento de SEQ ID NO: 326, Tabela 15). Fig. 27F mostra a região alvo de HBG1- 1, a caixa CCAAT distal de HBG e Sp182 dgRNA da região alvo (com- preendendo o domínio de direcionamento de SEQ ID NO: 1028, Tabela 15).
[0099] Figs. 28A-B representam a expressão de HbF alcançada por edição ex vivo de células mPB CD 34+ usando HBG1-1-AsCpf1-RNP direcionando a região do promotor de HBG. Fig. 28A mostra os resulta- dos da edição na região do promotor de HBG após a entrega de 5 uM ou 20 uM de HBG1-1-AsCpf1-RNP ( "HBG-1-1") por meio de eletropo- ração Amaxa em células CD34+ mPB. A entrega de 20 uM HBG1-1- AsCpf1-RNP através de eletroporação Amaxa resulta em até -43% de edição, e 21% de indução de HbF (acima dos níveis de base). Os níveis de HbF são representados por um círculo preto representando os níveis de expressão de cadeias de globina gama sobre cadeias de globina se- melhante a beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia betal]), conforme medido por análise UPLC na descendência eritroide de célu- las CD34+ mPB. Barras a cinza representam a percentagem de indels 72 horas após a eletroporação detectados por sequenciamento de pró- xima geração (NGS) do produto de PCR de HBG. Fig. 28B mostra os resultados da edição na região do promotor de HBG após a entrega de UM ou 20 uM de HBG1-1-AsCpf1-RNP ( "HBG-1-1") por meio de ele- troporação MaxCyte em células CD34+ mPB. A entrega de 20 uM HBG1-1-AsCpf1-RNP através de eletroporação MaxCyte resulta em até —16% de edição, e 7% de indução de HbF (acima dos níveis de base). Os níveis de HbF são representados por um círculo preto representando os níveis de expressão de cadeias de globina gama sobre cadeias de globina semelhante a beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]), conforme medido por análise UPLC na descendência eritroide de células CD34+ mPB. Barras a cinza representam a percentagem de in- dels 72 horas após a eletroporação detectados por NGS do produto de PCR de HBG.
[0100] Fig. 29 representa a edição melhorada por HBG1-1-As- Cpf1H800A-RNP na região do promotor HBG no dispositivo Maxcyte por coentrega de vários Cas9 TS S. Pyogenes ou Cas9D10A RNPs. "S.Py D10A" representa a proteína de nickase Cas9 D10A e "S.Py TS" repre- senta a proteína Cas9 TS. Os RNPss testados incluem SpA-D10A-RNP, SpG-D10A-RNP, tSpA-Cas9-RNP, Sp182-Cas9-RNP, e tSpA-Cas9- RNP + Sp182-Cas9-RNP (Tabela 14). Edição total na região do promo- tor HBG (barras cinza) e a indução da proteína HbF associada (círculos pretos) após a entrega de HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP sozinho ("HBG1-1"), ou em combinação com Cas9 S. Pyogenes RNPs ou pares de RNP. Os níveis de HbF são representados por um círculo preto re- presentando os níveis de expressão de cadeias de globina gama sobre cadeias de globina semelhante a beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]), conforme medido por análise UPLC na descen- dência eritroide de células CD34+ mPB. Barras a cinza representam a percentagem de indels detectados por NGS do produto de PCR de HBG.
[0101] Fig. 30 representa a viabilidade de células CD34+ mPB após a entrega MaxCyte de HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP sozinho ("HBG1-1") ou em combinação com vários Cas9 S. Pyogenes TS ou Cas9D10A RNPs. "S.Py D10A" representa a proteína de nickase Cas9 D10A e "S.Py TS" representa a proteína Cas9 TS. Os RNPs testados incluem SpA-D10A-RNP, SpG-D10A-RNP, tSpA-Cas9-RNP, Sp182-Cas9-RNP, e tSpA-Cas9-RNP + Sp182-Cas9-RNP (Tabela 14). A viabilidade foi medida por coloração DAPI e análise de citometria de fluxo 24 horas após a eletroporação.
[0102] Figs. 31A-B representam os sítios de clivagem de HBG1-1- AsCpf1H800A-RNP e D10A- Cas9 RNP na região alvo e o perfil de edi- ção resultante da coentrega de HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP com um D10A RNP. Fig. 31A representa a posição dos sítios de corte HBG1-1- AsCpf1H800A-RNP em cada cadeia da região alvo (setas cinza claro), bem como a posição do sítio de corte direcionado pelo SpG- D10A- RNP e SpA-D10A-RNP (setas escuras) (Tabela 14). Fig. 31B representa o perfil de edição resultante da coentrega do HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP ("HBG1-1 RNP") com SpG-D10A-RNP ("spG RNP") ou SpA-D10A-RNP ("SpA RNP") em mPB CD34+ em 72h pós-eletroporação, conforme de- tectado pela análise NGS do produto de PCR de HBG (Tabela 14). O eixo X representa a posição genômica do centro do indel em relação ao sítio de clivagem da cadeia positiva HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP. O eixo Y representa o comprimento do indel, onde as deleções são repre- sentadas como valores negativos e as inserções são representadas como valores positivos. A frequência total de cada indel é representada pela área do símbolo. Indels ocorrendo em frequência igual ou acima de 0,1% são representados. Os sítios alvo de SpG e SpA são indicados por linhas pontilhadas.
[0103] Figs. 32A-B representam que a coentrega de Sp182-Cas9- RNP com HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP resulta em um aumento em in- dels totais e em indels de interrupção de caixa CCAAT distal sem alte- ração substancial do perfil indel, conforme detectado por NGS análise do produto HBG PCR 72h pós-eletroporação. Fig. 32A mostra os perfis indel após a edição com HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP ("HBG1-1 RNP") sozinho ou em combinação com Sp182-Cas9-RNP ("sp182 RNP"). O eixo X representa a posição genômica do centro do indel em relação ao sítio de clivagem da cadeia positiva HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP. O eixo Y representa o comprimento do indel, onde as deleções são repre- sentadas como valores negativos e as inserções são representadas como valores positivos. A frequência total de cada indel é representada pela área do símbolo. Indels ocorrendo em frequência igual ou acima de 0,1% são representados. O sítio alvo Sp182 é indicado por uma linha pontilhada. Fig. 32B representa a frequência de indels interrompendo nenhum, 1nt, 2nt, 3nt, 4nt ou todo o 5nt da sequência da caixa CCAAT distal.
[0104] Fig. 33 mostra que as doses ideais de HBG1-1-As- Cpf1H800A-RNP codistribuídas com Sp182-Cas9 -RNP resultam em um aumento na edição total e na produção de HbF (Tabela 14). Entrega de HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP ("HBG1-1") como um par RNP ao lado de Sp182-Cas9-RNP ("Sp182"), alcançou edição > 92% (barras cinzas) na região do promotor HBG com até 34% de indução de HbF (acima do fundo) (círculos pretos). Nenhuma edição foi observada quando Sp182-
Cas9-RNP foi administrado sozinho a 12 uM. Os níveis de HbF são representados por um círculo preto representando os níveis de expres- são de cadeias de globina gama sobre cadeias de globina semelhante a beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]), conforme me- dido por análise UPLC na descendência eritroide de células CD34+ mPB. Barras a cinza representam a percentagem de indels detectados por NGS do produto de PCR de HBG.
[0105] Fig. 34 representa a distribuição dos níveis de expressão da cadeia gama sobre as cadeias semelhante a beta totais (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia betal), conforme medido por UPLC na descendência eritroide clonal de células humanas mPB CD34+ únicas editadas na região do promotor HBG com HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP em combinação com Sp182-Cas9-RNP (Tabela 14). Cada círculo preto representa o nível de proteína gama-globina detectado em uma popula- ção eritroide clonal derivada de uma única célula, isolada por classifica- ção FACS 48h após a eletroporação.
[0106] Figs. 35A-C representa a edição total, a produção de HbF, a viabilidade e o potencial de formação de colônias após a coentrega de RNP contendo gRNA HBG1-1 modificado (SEQ ID NO: 1041, Tabela 14) complexado com His-AsCpf1-sNLS-sNLS H800A (SEQ ID NO: 1032, Tabela 14) ("His-AsSCpf1-sNLS-sNLS H800A HBG1-1 RNP,"re- presentado como "HBG1-1"nas Figs. 35A-C) com concentrações cres- centes de ssSODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) (represen- tado como "OLII16431"nas Figs. 35A-C) (Tabela 11). Fig. 35A repre- senta a edição da caixa CAATT distal (barras cinzentas) e indução de HDbF (círculos pretos), após coentrega de 6 uM -His-AsCpf1 SNLs-SNLs H800Aº HBG1-1 RNP e concentrações crescentes de ssODN OLI16431. Os níveis de HDF são representados por um círculo preto representando os níveis de expressão de cadeias de globina gama so- bre cadeias de globina semelhante a beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]), conforme medido por análise UPLC na descen- dência eritroide de células CD34+ mPB. Barras a cinza representam a percentagem de indels detectados por NGS do produto de PCR de HBG. Fig. 35B representa a viabilidade de células CD34+ mPB após a entrega de His-AsCpf1-sNLS-sNLS H800A HBG1-1 RNP sozinho ou em combinação com doses crescentes de ssSODN OLI16431. A viabili- dade foi medida por deleção DAPI a 72 h após a eletroporação. Fig. 35C representa a atividade hematopoiética de "HBG1-1" RNP e ssSODN OLI6431 tratados com HBG1-1 RNP e não tratadas de doador corres- pondente em ensaios de células formadoras de colônia (CFC). CFCs mostradas são por 800 células CD34* plaqueadas. O número e o sub- tipo de colônias são indicados (GEMM: colônia de granulócitos-eritroi- des-monócitos-macrófagos (preto), GM: colônia de granulócitos-macró- fagos (cinza escuro), E: colônia de eritroides (cinza claro)).
[0107] Figs. 36A-B representa a edição total, produção de HbF, e resultados de viabilidade usando diferentes concentrações de RNP con- tendo HBG1-1 gRNA não modificado (SEQ ID NO: 1022, Tabela 14) complexado a His-AsCpf1 SNLs-SNLs H800A (SEQ ID NO: 1032, Ta- bela 14) ("His-AsSCpf1-sSNLS-sSNLS H800A HBG1-1 RNP;/"represen- tado como "HBG1-1" nas Figs. 36A-B) coentregue com diferentes con- centrações de ssODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) (repre- sentado como "OLI 6431" nas Figs. 36A-B) (Tabela 11). Fig. 36A des- creve a edição na caixa CAATT distal (barras pretas (48 horas) e barras cinza claro (14 dias de cultura eritroide)) e indução de HbF (círculos pre- tos) após a coentrega de His-AsCpf1-sNLS-sNLS H800A HBG1-1RNP ("HBG1-1") e ssODN OLI16431 em concentrações variáveis. Os níveis de HbF são representados por um círculo preto representando os níveis de expressão de cadeias de globina gama sobre cadeias de globina se- melhante a beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia betal]),
conforme medido por análise UPLC na descendência eritroide de célu- las CD34+ mPB. As barras representam a percentagem de indels de- tectados por NGS do produto de PCR HBG em pontos de tempo de 48 horas (preto) e cultura eritroide de 14 dias (cinza claro). Fig. 36B repre- senta a viabilidade de células CD34+ mPB após a entrega de His-As- Cpf1-sNLS-sNLS H800A HBG1-1 RNP sozinho ("HBG1-1"), ssSODN OLI6431 sozinho, ou em combinação com doses crescentes de HBG1- 1 e OLI16431. A viabilidade foi medida por deleção DAP! a 48 h após a eletroporação e após 14 dias em cultura eritroide. Após a edição das células CD34+ mPB;, a diferenciação ex vivo na linhagem eritroide foi realizada por 18 dias (Giarratana 2011). No dia 14 de cultura, um sub- conjunto de células foi isolado e medições de viabilidade (deleção DAPI) e edição (NGS do produto de PCR de HBG) foram tomadas.
[0108] Fig. 37 descreve a edição por RNP em células CD34+ mPB. Os RNPs incluíram gRNA complexado com a proteína Cpf1 conforme estabelecido na Tabela 21. O sequenciamento Illumina foi realizado em DNA genômico isolado 72 horas após a eletroporação.
[0109] Figs. 38A-B representam a edição na população de células CD34+ em massa (barras pretas), células progenitoras (barras cinza claro) e HSCs (barras cinza escuro), conforme determinado pelo se- quenciamento lllumina 48 horas após a eletroporação. Fig. 38A repre- senta RNP33 (Tabela 21) administrado sozinho ou co-administrado com ssODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11). Fig. 38B representa RNP33 (Tabela 21) entregue sozinho ou coentregue com Sp182 RNP (gRNA morto compreendendo SEQ ID NO: 1027 (Tabela 14) comple- xado com Cas9 S. Pyogenes (SEQ ID NO: 1033)).
[0110] Fig. 39 representa a edição na população de células CD34+ em massa (barras pretas), células progenitoras (barras cinza claro) e HSCs (barras cinza escuro), conforme determinado pelo sequencia- mento lllumina 48 horas após a eletroporação. RNP34, RNP33 e RNP43
(Tabela 21) foram entregues sozinhos ou em combinação com Sp182 RNP (gRNA morto compreendendo SEQ ID NO: 1027 (Tabela 14) com- plexado com Cas9 S. Pyogenes (SEQ ID NO: 1033)) ou ssODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11).
[0111] Fig. 40 mostra a edição em células CD34+ conforme deter- minado pelo sequenciamento Illumina 72 horas após a eletroporação. RNP64, RNP63 e RNP45 (Tabela 21) foram entregues a uma estequi- ometria (razão de complexação gRNA:Cpf1) de 2 ou 4, onde o gRNA está em um excesso molar.
[0112] Fig. 41 mostra a edição em células CD34+ conforme deter- minado pelo sequenciamento Illumina 72 horas após a eletroporação. RNP33, RNP64, RNP63 e RNP45 (Tabela 21) foram entregues sozi- nhos ou em combinação com Sp182 RNP (gRNA morto compreendendo SEQ ID NO: 1027 (Tabela 14) complexado com Cas9 S. Pyogenes (SEQ ID NO: 1033)) ou ssSODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11).
[0113] Fig. 42 mostra a edição em células CD34+ conforme deter- minado pelo sequenciamento Illumina. RNP compreendendo Cpf1 (SEQ ID: 1094) complexado com gRNAs com várias extensões de DNA 5' (Tabela 21), foram fornecidos por si só ou em combinação com 8 uM OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11).
[0114] Fig. 43 mostra a edição em células CD34+ conforme deter- minado pelo sequenciamento Illumina. RNPs compreendendo gRNAs com extremidades 5' correspondentes (RNP49 vs RNP58 e RNP59 vs RNP60, Tabela 21) foram entregues às células CD34+ para avaliar o impacto das modificações 3'. Em ambas as comparações, gRNAs com 3' PS-OMe superaram a inalterada versão 3' em 24 h após eletropora- ção.
[0115] Figs. 44A-B mostram a edição em células CD34+ conforme determinado pelo sequenciamento lllumina 24 e 48 horas após a eletro- poração. RNP58 (Tabela 21) foi entregue às células CD34+ em uma estequiometria (razão de complexação gRNA:Cpf1) de razões molares de 2:1, 1:1 ou 0,5:1. Em todas as doses testadas, a edição foi melhor quando RNP foi complexado em uma proporção de 2:1.
[0116] Figs. 45A-B representam a edição em células CD34+ con- forme determinado por sequenciamento Illumina. Figs. 45A e 45B repre- sentam RNPs compreendendo gRNAs com extremidades 5' correspon- dentes, mas diferentes modificações 3' (Tabela 21) entregues às células CD34+ para avaliar o impacto das modificações ou extensões 3'.
[0117] Figs. 46A-C representam a eliminação em células CD34+ e sua descendência eritroide, e os níveis de HDF na descendência eri- troide após a entrega de RNPss direcionados a vários sítios de corte den- tro do locus HBG. Fig. 46A representa RNP compreendendo gRNAs guia contendo uma extremidade 5' não modificada e 3' 1 x PS-Ome (Ta- bela 21). Fig. 46B representa RNP compreendendo gRNAs guia con- tendo uma extremidade 5' com extensão 2PS +20 DNA e 3' 1 x PS-Ome (Tabela 21). Fig. 46C representa RNP compreendendo gRNAs guia contendo uma extremidade 5' com extensão 25 DNA e 3' 1 x PS-Ome (Tabela 21).
[0118] Fig. 47 representa a edição e os níveis de HbF na descen- dência eritroide de células CD34+ após a entrega de RNP58 a 1 uM, 2 UM e 4 uM.
[0119] Fig. 48 representa a edição em células CD34+ após a ele- troporação Maxcyte de RNPs. RNP58, RNP26, RNP27, e RNP28 com- preendendo gRNA SEQ ID: 1051 complexado para diferentes proteínas Cpf1 (SEQ IDs: 1094, 1096, 1107, 1108) (Tabela 21) foram entregues em células CD34+. A edição foi determinada por sequenciamento Illu- mina 24 e 48 horas após a eletroporação.
[0120] Fig. 49 representa a edição em células CD34+ após a ele- troporação Maxcyte de RNPs. RNP58, RNP29, RNP30, e RNP31 com- preendem proteína Cpf1 SEQ ID: 1094 complexada para guiar RNAs com várias extensões 5' (Tabela 21) foram entregues em células CD34+. A edição foi determinada por sequenciamento lIllumina 24 e 48 horas após a eletroporação. RNP30 não foi testado (nt) a 1 uM devido ao número limitado de células.
[0121] Fig. 50 representa a edição na população de células CD34+ em massa (barras pretas), células progenitoras (barras cinza escuro) e HSCs (barras cinza claro), conforme determinado pelo sequenciamento Illumina 48 horas após a eletroporação. RNP58, RNP27 e RNP26 (Ta- bela 21) foram entregues a células CD34+ a 2 uM ou 4 UM.
[0122] Fig. 51 representa a edição na população de células CD34+ em massa (barras pretas), células progenitoras (barras cinza escuro) e HSCs (barras cinza claro), conforme determinado pelo sequenciamento Illumina 48 horas após a eletroporação. RNP61, RNP62 e RNP34 (Ta- bela 21) (8 uM) foram coentregues às células CD34+ com ssODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) (8 uM).
[0123] Fig. 52 representa a edição na população de células CD34+ em massa (barras pretas), células progenitoras (barras cinza escuro) e HSCs (barras cinza claro), conforme determinado pelo sequenciamento Illumina 48 horas após a eletroporação. RNP58, e RNP32 (Tabela 21) foram entregues a células CD34+ a 2 uM.
[0124] Fig. 53 representa a edição na população de células CD34+ em massa (barras pretas), células progenitoras (barras cinza escuro) e HSCs (barras cinza claro), conforme determinado pelo sequenciamento Illumina 48 horas após a eletroporação. RNP58, e RNP1 (Tabela 21) foram entregues a células CD34+ a 2 uM, 4 UM, ou 8 uM. As células editadas com RNP1 a 2 uM não foram classificadas (NS) e, portanto, os dados de edição não estão disponíveis.
[0125] Fig. 54 representa os indels de células enxertadas CD34+ mPB a partir de MO de camundongos "NBSGW" de 8 semanas após- infusão de células eletroporadas. RNP34 e RNP33 (Tabela 21) (8 uM) foram coentregues às células CD34+ com ssODN OLIN16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) (6 uM).
[0126] Figs. 55A-B representam os indels de células CD34+ mPB enxertadas e expressão de HbF por células eritroides derivados de MO quimérica de camundongos "NBSGW" de 8 semanas após-infusão de células eletroporadas. RNP33 ou RNP34 (Tabela 21) foi coentregue com Sp182 RNP (gRNA morto compreendendo SEQ ID NO: 1027 (Ta- bela 14) complexado com Cas9 S. Pyogenes (SEQ ID NO: 1033)) (16 UM de RNP total) para células CD34+. Fig. 55A representa a frequência indel na medula óssea não fracionada ou populações individuais sepa- radas por fluxo de células CD15+, CD19+, GIyA+ e Lin-CD34+ em célu- las simuladas transfectadas (sem RNP adicionado) ou células transfec- tadas com RNP. As células Lin-CD34+ são definidas como células CD34+ que são negativas para CD3, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20 e CD56) da medula óssea (MO) de camundongos NOD,B6.SCID Il2ry- /- Kit(W41/W41) ("'NBSGW") não irradiados, infundidos com células CD34+ mPB simuladas (sem RNP) ou transfectadas com RNP. Os in- dels foram determinados para cada população de células por sequenci- amento lllumina. Fig. 55B representa a expressão de HbF, calculada por UPLC como gama/semelhante a beta (%) de lisados de células eri- troides após uma cultura de diferenciação eritroide de 18 dias de MO quimérica total.
[0127] Figs. 56A-B representam os indels de células CD34+ mPB enxertadas e expressão de HbF por células eritroides derivados de MO quimérica de camundongos "NBSGW" de 8 semanas após-infusão de células eletroporadas. RNP61 ou RNP62 (Tabela 21) (8 uM) foram co- entregues com ssSODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) (8 uM)
a células CD34+. Fig. 56A representa os indels na medula óssea não fracionada ou populações individuais separadas por fluxo de células CD15+, CD19+, GIyA+ e Lin-CD34+ em células simuladas transfecta- das (sem RNP adicionado) ou células transfectadas com RNP. As célu- las Lin-CD34+ são definidas como células CD34+ que são negativas para CD3, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20 e CD56) da medula óssea (MO) de camundongos NBSGW não irradiados, infundidos com células CD34+ mPB simuladas (sem RNP) ou transfectadas com RNP. Os in- dels foram determinados para cada população de células por sequenci- amento lllumina. Fig. 56B representa a expressão de HbF, calculada por UPLC como gama/semelhante a beta (%) de células eritroides após uma cultura de diferenciação eritroide de 18 dias de MO quimérica total.
[0128] Fig. 57 representa o quimerismo humano na medula óssea 8 semanas após a infusão após a infusão com células mPB CD34+ si- muladas (sem RNP adicionado) ou células CD34+ mPB editadas com RNP1 (4 ou 8 uM) ou RNP58 (2, 4 ou 8 UM ) (tabela 21). Quimerismo humano e reconstituição de linhagem (CD45+, CD14+, CD19+, glicofo- rina A (GIyA, CD235a+), linhagem e expressão do marcador CD34+ e CDA45+ de camundongo) na MO foi determinada por citometria de fluxo.
[0129] Fig. 58 representa indels dentro da medula óssea não sepa- rados em massa, 8 semanas após a infusão após a infusão com células mPB CD34+ simuladas (sem RNP adicionado) ou células CD34+ mPB editadas com RNP1 (4 ou 8 uM) ou RNP58 (2, 4 ou 8 UM ) (tabela 21). Os indels foram determinados por sequenciamento lllumina.
[0130] Fig. 59 representa a frequência indel na medula óssea não fracionada ou populações individuais separadas por fluxo de células CD15+, CD19+, GIyA+ e Lin-CD34+ em células simuladas transfecta- das (sem RNP adicionado) ou células transfectadas com RNP. As célu- las Lin-CD34+ são definidas como células CD34+ que são negativas para CD3, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20 e CD56 da medula óssea
(MO) de camundongos NOD,B6.SCID II2ry-/- Kit0(W41W41) ("'NBSGW") não irradiados, infundidos com células CD34+ mPB simuladas (sem RNP) ou transfectadas com RNP. Os indels foram determinados para cada população de células por sequenciamento lllumina.
[0131] Fig. 60 representa HbF da fração GIyA+ isolada da medula óssea 8 semanas após a infusão com células mPB CD34+ simuladas (sem RNP adicionado) ou células CD34+ mPB editadas com RNP58 (2, 4 ou 8 uM) (tabela 21).
[0132] Fig. 61 mostra o potencial de formação de colônias de célu- las a partir de descargas de medula óssea tomadas 8 semanas após a infusão de células CD34+ humanas mobilizadas simuladas ou editadas. O número e o subtipo de colônias são indicados (GEMM: colônia de granulócitos-eritroides-monócitos-macrófagos (preto), GM: colônia de granulócitos-macrófagos (cinza escuro), E: colônia de eritroides (cinza claro)).
[0133] Fig. 62 representa as sequências de variantes da proteína Cpf1 apresentadas na Tabela 20. As sequências de localização nuclear são mostradas como letras em negrito, as sequências de seis histidinas são mostradas como letras sublinhadas. Permutações adicionais da identidade e posições N-terminal/C-terminal de sequências NLS, por exemplo, anexar duas ou mais sequências nNLS ou combinações de nNNLS e sequências sSNLS (ou outras sequências NLS) às posições N- terminal/C-terminal, bem como sequências com e sem sequências de purificação, por exemplo, sequências de seis histidinas, estão dentro do escopo da matéria divulgada instantaneamente. Descrição Detalhada Definições e Abreviações
[0134] A menos que especificado de outra forma, cada um dos ter- mos a seguir tem o significado associado a ele nesta seção.
[0135] Os artigos indefinidos "um" e "uma" referem-se a pelo menos um dos substantivos associados e são usados alternadamente com os termos "pelo menos um" e "um ou mais." Por exemplo, "um módulo" significa pelo menos um módulo, ou um ou mais módulos.
[0136] As conjunções "ou" e "e/ou" são usadas indistintamente como disjunções não exclusivas.
[0137] "Domínio" é usado para descrever um segmento de uma pro- teína ou ácido nucleico. Salvo indicação em contrário, um domínio não precisa ter nenhuma propriedade funcional específica.
[0138] O termo "fator de ação trans exógena" refere-se a qualquer componente de peptídeo ou nucleotídeo de um sistema de edição de genoma que (a) interage com uma nuclease guiada por RNA ou gRNA por meio de uma modificação, tal como uma inserção ou fusão de pep- tídeo ou nucleotídeo à nuclease guiada por RNA ou gRNA, e (b) interage com um DNA alvo para alterar uma estrutura helicoidal do mesmo. As inserções ou fusões de peptídeo ou nucleotídeo podem incluir, sem |li- mitação, ligações covalentes diretas entre a nuclease guiada por RNA ou gRNA e o fator de ação trans exógeno e/ou ligações não covalentes mediadas pela inserção ou fusão de domínios de interação RNA/prote- ína tais como laços de MS2 e domínios de interação proteína/proteína, tal como PDZ, Lim ou SH1, 2 ou 3 domínios. Outros RNA específicos e motivos de interação de aminoácidos serão familiares para aqueles ver- sados na técnica. Fatores de ação trans podem incluir, geralmente, ati- vadores transcricionais.
[0139] O termo "elemento de reforço" refere-se a um elemento que, quando coentregue com um complexo de ribonucleoproteína (RNP) compreendendo um gRNA complexado a uma nuclease guiada por RNA ("gRNA-nuclease-RNP"), aumenta a edição de um ácido nucleico alvo em comparação com a edição do ácido nucleico alvo sem o elemento de reforço. Em certas modalidades, a coentrega pode ser sequencial ou simultânea. Em certas modalidades, um elemento de reforço pode ser um complexo RNP composto por um RNA guia morto complexado com uma proteína Cas9 TS, uma proteína de nickase Cas9 (por exemplo, proteína Cas9 D10A) ou uma proteína Cas9 enzimaticamente inativa (eiCas9). Em certas modalidades, um elemento de reforço pode ser um complexo RNP composto por um RNA guia complexado com uma pro- teína de nickase Cas9 (por exemplo, proteína Cas9 D10A) ou uma pro- teína Cas9 enzimaticamente inativa (eiCas9). Em certas modalidades, um elemento de reforço pode ser um DNA modelo doador de cadeia simples ou dupla. Em certas modalidades, um ou mais elementos de reforço podem ser coentregues com um gRNA-nuclease-RNP para au- mentar a edição de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, um elemento de reforço pode ser coentregue com um RNP compreendendo um gRNA complexado com uma molécula Cpf1 ("gRNA-Cpf1-RNP") para aumentar a edição de um ácido nucleico alvo.
[0140] "Indel produtivo" refere-se a um indel (deleção e/ou inser- ção), que resulta na expressão de HbF. Em certas modalidades, um in- del produtivo pode induzir a expressão de HbF. Em certas modalidades, um indel produtivo pode resultar em um nível elevado de expressão de HbF.
[0141] Um "indel" é uma inserção e/ou deleção em uma sequência de ácido nucleico. Um indel pode ser o produto de reparação de uma quebra de cadeia dupla de DNA, tal como uma quebra de cadeia dupla formada por um sistema de edição de genoma da presente divulgação. Um indel é mais vulgarmente formado quando uma quebra é reparada por uma via de reparação "erro propensa", tais como a via de NHEJ descrita abaixo.
[0142] "Conversão gênica" refere-se à alteração de uma sequência de DNA pela incorporação de uma sequência homóloga endógena (por exemplo, uma sequência homóloga dentro de uma matriz de genes). "Correção gênica" refere-se à alteração de uma sequência de DNA pela incorporação de uma sequência homóloga exógena, tal como um DNA molde doador de cadeia simples ou dupla exógeno. A conversão e cor- reção de genes são produtos da reparação de quebras de DNA de ca- deia dupla por vias HDR, tais como as descritas abaixo.
[0143] Indels, conversão gênica, correção gênica e outros resulta- dos de edição do genoma são tipicamente avaliados por sequencia- mento (mais comumente por métodos de "próxima geração" ou "se- quenciamento por síntese", embora o sequenciamento Sanger ainda possa ser usado) e são quantificados pela frequência relativa de mu- danças numéricas (por exemplo, + 1, + 2 ou mais bases) em um sítio de interesse entre todas as leituras de sequenciamento. As amostras de DNA para sequenciamento podem ser preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica e podem envolver a amplificação de sítios de interesse por reação em cadeia da polimerase (PCR), a captura de extremidades de DNA geradas por quebras de cadeia dupla, tal como no processo GUIDEsegq descrito em Tsai 2016 (aqui incorporado por referência) ou por outros meios bem conhecidos na técnica. Os resulta- dos da edição do genoma também podem ser avaliados por métodos de hibridização in situ, tal como o sistema FiberComb'Y comercializado pela Genomic Vision (Bagneux, França) e por quaisquer outros métodos adequados conhecidos na técnica.
[0144] "AIlt-HDR," "reparação alternativa dirigida por homologia," ou "HDR alternativa" são utilizadas indiferentemente para referir o processo de reparação de danos de DNA, utilizando um ácido nucleico homólogo (por exemplo, uma sequência homóloga endógena, por exemplo, uma cromátide irmã ou um ácido nucleico exógeno, por exemplo, um ácido nucleico modelo). AIt-HDR é diferente de HDR canônico porque o pro- cesso utiliza diferentes vias do HDR canônico e pode ser inibido pelos mediadores HDR canônicos, RAD51 e BRCA?2. AIt-HDR também se dis- tingue pelo envolvimento de um modelo de ácido nucleico homólogo de cadeia simples ou cortado, enquanto o HDR canônico geralmente en- volve um modelo homólogo de cadeia dupla.
[0145] HDR canônico", "reparação dirigido por homologia canônica" ou "cHDR" referem-se ao processo de reparação de danos de DNA, uti- lizando um ácido nucleico homólogo (por exemplo, uma sequência ho- móloga endógena, por exemplo, uma cromátide irmã ou um ácido nu- cleico exógeno, por exemplo, um ácido nucleico modelo). HDR canônico normalmente atua quando há resseção significativa na quebra da cadeia dupla, formando pelo menos uma porção de cadeia simples do DNA. Em uma célula normal, cHDR normalmente envolve uma série de pas- sos, tal como reconhecimento da quebra, estabilização da quebra, res- seção, estabilização de DNA de cadeia simples, formação de um inter- mediário de cruzamento de DNA, resolução do intermediário de cruza- mento, e ligação. O processo requer RAD51 e BRCA2, e o ácido nu- cleico homólogo é tipicamente de cadeia dupla.
[0146] A menos que indicado de outra forma, o termo "HDR", con- forme usado neste documento, abrange tanto HDR canônico quanto alt- HDR.
[0147] "União de extremidade não homóloga" ou "NHEJ" refere-se à reparação mediada por ligação e/ou reparação mediada por não mo- delo incluindo NHEJ canônico (CNHEJ) e NHEJ alternativo (altNHEJ), que por sua vez inclui a união de extremidade mediada por micro-ho- mologia (MMEJ), anelamento de cadeia simples (SSA) e união de ex- tremidade mediada por micro-homologia dependente de síntese (SD- MMEJ).
[0148] "Substituição" ou "substituída," quando utilizado com refe- rência a uma modificação de uma molécula (por exemplo, um ácido nu- cleico ou proteína), não necessita de um processo de limitação, mas apenas indica que a entidade de substituição está presente.
[0149] "Indivíduo" significa um humano, camundongo ou primata não humano. Um indivíduo humano pode ter qualquer idade (por exem- plo, um bebê, criança, jovem adulto ou adulto) e pode sofrer de uma doença, ou pode precisar de alteração de um gene.
[0150] "Tratar", "tratando" e "tratamento" significa o tratamento de uma doença num indivíduo (por exemplo, um indivíduo humano), inclu- indo uma ou mais de inibição da doença, isto é, paragem ou impedindo o seu desenvolvimento ou progressão; aliviar a doença, ou seja, causar regressão do estado de doença; aliviar um ou mais sintomas da doença; e curar a doença.
[0151] "Prevenir", "prevenindo" e "prevenção" referem-se à preven- ção de uma doença num indivíduo, incluindo (a) evitar ou impedir a do- ença; (b) afetar a predisposição para a doença; ou (c) prevenir ou retar- dar o início de pelo menos um sintoma da doença.
[0152] Um "kit" refere-se a qualquer coleção de dois ou mais com- ponentes que juntos constituem uma unidade funcional que pode ser aplicada para um propósito específico. A título de ilustração (e não de limitação), um kit de acordo com esta divulgação pode incluir um RNA guia complexado ou capaz de complexar com uma nuclease guiada por RNA e acompanhado por (por exemplo, suspenso em, ou em suspen- são em) um transportador farmaceuticamente aceitável. Em certas mo- dalidades, o kit pode incluir um elemento de reforço. O kit pode ser usado para introduzir o complexo em, por exemplo, uma célula ou um indivíduo, com o propósito de causar uma alteração genômica desejada em tal célula ou indivíduo. Os componentes de um kit podem ser emba- lados juntos ou separadamente. Os kits de acordo com esta divulgação também incluem opcionalmente instruções de uso (DFU, do inglês di- rections for use) que descrevem o uso do kit, por exemplo, de acordo com um método desta divulgação. As DFU podem ser embaladas fisi- camente com o kit, ou podem ser disponibilizadas para um usuário do kit, por exemplo, por meio eletrônico.
[0153] Os termos "polinucleotídeo", "sequência de nucleotídeos", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "sequência de ácido nu- cleico" e "oligonucleotídeo" referem-se a uma série de bases de nucle- otídeos (também chamadas de"nucleotídeos") em DNA e RNA, e signi- ficam qualquer cadeia de dois ou mais nucleotídeos. Os polinucleotí- deos, sequências de nucleotídeos, ácidos nucleicos, etc. podem ser misturas quiméricas ou derivados ou suas versões modificadas, de ca- deia simples ou dupla. Eles podem ser modificados na fração de base, fração de açúcar ou estrutura de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, seus parâmetros de hibridização, etc. Uma sequência de nucleotídeos normalmente carrega informações genéti- cas, incluindo, mas não se limitando às informações utilizadas pela ma- quinaria celular para produzir proteínas e enzimas. Estes termos in- cluem DNA genômico de cadeia simples ou dupla, RNA, qualquer poli- nucleotídeo sintético e geneticamente manipulado e polinucleotídeos senso e antissenso. Esses termos também incluem ácidos nucleicos contendo bases modificadas.
[0154] A notação IUPAC convencional é usada em sequências de nucleotídeos aqui apresentadas, como mostrado na Tabela 1, abaixo (ver também Cornish-Bowden A, Nucleic Acids Res. 1985, 10 de maio; 13(9): 3021-30, incorporado aqui por referência). Deve-se notar, no en- tanto, que "T" denota "Timina ou Uracila" nos casos em que uma se- quência pode ser codificada por DNA ou RNA, por exemplo, em domí- nios de direcionamento de gRNA. Tabela 1: Notação IUPAC de ácido nucleico [E assa "=" E ese
& ess E am E ee 8 es 8 ess Rem E esam Eae Bo asa Mo aesam —
[0155] Os termos "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são utiliza- dos indiferentemente para se referir a uma cadeia sequencial de amino ácidos ligados uns aos outros através de ligações peptídicas. Os termos incluem proteínas individuais, grupos ou complexos de proteínas que se associam, bem como fragmentos ou porções, variantes, derivados e análogos de tais proteínas. As sequências peptídicas são apresentadas aqui usando notação convencional, começando com o amino ou N-ter- minal à esquerda e prosseguindo para o carboxilo ou C-terminal à di- reita. Abreviações padrão de uma ou três letras podem ser usadas.
[0156] A notação "região alvo da caixa CCAAT" e semelhantes re- ferem-se a uma sequência que está a 5' do sítio de iniciação da trans- crição (TSS) do gene HBG1 e/ou HBG2. As caixas CCAAT são motivos altamente conservados dentro da região promotora dos genes de glo- bina do tipo a e do tipo B. As regiões dentro ou perto da caixa CCAAT desempenham papéis importantes na regulação do gene da globina. Por exemplo, a caixa CCAAT distal da y-globina está associada à per- sistência hereditária da hemoglobina fetal. Foi relatado que uma série de fatores de transcrição se ligam à região de caixa CCAAT duplicada do promotor de y-globina, por exemplo, NF-Y, COUP-TFII (NF-E3), CDP, GATA1/NF-E1 e DRED (Martyn 2017). Embora não desejando es- tar limitado pela teoria, acredita-se que os sítios de ligação do ativador transcricional NF-Y se sobrepõem aos repressores transcricionais no promotor da y-globina.
As mutações HPFH presentes na região distal do promotor da y-globina, por exemplo., dentro ou perto da caixa CCAAT, pode alterar a ligação competitiva desses fatores e, assim, con- tribuir para o aumento da expressão de y-globina e níveis elevados de HbF.
As localizações genômicas fornecidas neste documento para HBG1 e HBG2 são baseadas nas coordenadas fornecidas na Sequên- cia de Referência NCBI NC 000011,"Homo sapiens chromosome 11, GRCh38.p12 Primary Assembly" (Versão NC 000011.10). A caixa CCAAT distal de HBG1 e HBG2 está posicionada em HBG1 e HBG2c. -111 a -115 (a localização genômica é Hg38 Chr11:5,249,968 a Chr11:5,249,972 e Hg38 Chr11:5,254,892 a Chr11:5,254,896, respecti- vamente). A região HBG1 c-111 a -115 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 (HBG1) nas posições 2823-2827, e a região HBG2 c-111 a -115 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) nas posições 2747-2751. Em certas modalidades, a "região alvo da caixa CCAAT" indica a região que está em ou perto da caixa CCAAT distal e inclui os nucleotídeos da caixa CCAAT distal e 25 nucleotídeos a montante (5') e 25 nucleotídeos a jusante (3') da caixa CCAAT distal (ou seja, HBG1/2 C-86 a -140) (loca- lização genômica é Hg38 Chr11:5249943 a Hg38 Chr11:5249997 e Hg38 Chr11:5254867 a Hg38 Chr11:5254921, respectivamente). A re- gião HBG1 c.-86 a -140 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 (HBG1) nas posições 2798-2852, e a região HBG2 c.-86 a -140 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) nas posições 2723-2776 Em outras moda- lidades, a "região alvo da caixa CCAAT" indica a região que está em ou perto da caixa CCAAT distal e inclui os nucleotídeos da caixa CCAAT distal e 5 nucleotídeos a montante (5') e 5 nucleotídeos a jusante (3') da caixa CCAAT distal (ou seja, HBG1/2 c.-106 a -120) (localização genô- mica é Hg38 Chr11:5249963 a Hg38 Chr11:5249977 (HGB1 e Hg38 Chr11:5254887 a Hg38 Chr11:5254901, respectivamente). A região HBG1 c.-106 a -120 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 (HBG1) nas posições 2818-2832, e a região HBG2 c.-106 a -120 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) nas posições 2742-2756 O termo "alteração do sítio alvo da caixa CCAAT" e semelhantes referem-se a alterações (por exemplo, deleções, inserções, mutações) de um ou mais nucleotí- deos da região alvo da caixa CCAAT. Exemplos de alterações da região alvo da caixa CCAAT exemplificativos incluem, sem limitação, a exclu- são de 1 nt, exclusão de 4 nt, exclusão de 11 nt, exclusão de 13 nte exclusão de 18 nt e alteração -117 G>A. Conforme usado neste docu- mento, os termos "caixa CCAAT" e "caixa CAAT" podem ser usados indistintamente.
[0157] As notações "região c.-114 a -102", "região c.-102 a -114","- 102:-114", "região alvo 13 nt" e semelhantes referem-se a uma sequên- cia que é 5' do sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene HBG1 e/ou HBG2 na localização genômica Hg38 Chr11:5,249,959 a Hg38 Chr11:5,249,971 e Hg38 Chr11:5,254,883 a Hg38 Chr11:5,254,895, respectivamente. A região HBG1 c-102 a -114 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 (HBG1) nas posições 2824-2836, e a região HBG2 c-102 a -114 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) nas posições 2748-
2760. O termo "deleção 13 nt" e semelhantes referem-se a deleções da região alvo de 13 nt.
[0158] As notações "região c.-121 a -104", "região c.-104 a -121","- 104:-121", "região alvo 18 nt" e semelhantes referem-se a uma sequên- cia que é 5' do sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene HBG1 e/ou HBG2 na localização genômica Hg38 Chr11:5,249,961 a Hg38 Chr11:5,249,978 e Hg38 Chr11:5,254,885 a Hg38 Chr11: 5,254,902,
respectivamente. A região HBG71 c-104 a -121 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 (HBG1) nas posições 2817-2834, e a região HBG2 c-104 a -121 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) nas posições 2741-
2758. O termo "deleção 18 nt" e semelhantes referem-se a deleções da região alvo de 18 nt.
[0159] As notações "região c.-105 a -115", "região c.-115 a -105", "- 105:-115", "região alvo 11 nt" e semelhantes referem-se a uma sequên- cia que é 5' do sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene HBG1 e/ou HBG2 na localização genômica Hg38 Chr11:5,249,962 a Hg38 Chr11:5,249,972 e Hg38 Chr11:5,254,886 a Hg38 Chr11:5,254,896, respectivamente. A região HBG1 c-105 a -115 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 (HBG1) nas posições 2823-2833, e a região HBG2 c-105 a -115 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) nas posições 2747-
2757. O termo "deleção 11 nt" e semelhantes referem-se a deleções da região alvo de 11 nt.
[0160] As notações "região c.-115 a -112", "região c.-112 a -115","- 112:-115", "região alvo 4 nt," e semelhantes referem-se a uma sequên- cia que é 5' do sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene HBG1 e/ou HBG2 na localização genômica Hg38 Chr11:5,249,969 a Hg38 Chr11:5,249,972 e Hg38 Chr11:5,254,893 a Hg38 Chr11:5,254,896, respectivamente. A região HBG1 c-112 a -115 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 nas posições 2823-2826, e a região HBG2 c-112 a -115 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) nas posições 2747-2750. O termo "deleção 4 nt" e semelhantes referem-se a deleções da região alvo de 4 nt.
[0161] As notações "região c.-116", "HBG-116", "região alvo 1 nt", e semelhantes referem-se a uma sequência que é 5' do sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene HBG1 e/ou HBG2 na localização genô- mica Hg38 Chr11:5,249,973 e Hg38 Chr11:5,254,897, respectivamente. A região HBG1 c.-116 é exemplificada na SEQ ID NO: 902 na posição
2822, e a região HBG2 c.-116 é exemplificada na SEQ ID NO: 903 (HBG2) na posição 2746. O termo "deleção 1 nt" e semelhantes refe- rem-se a deleções da região alvo de 1 nt.
[0162] As notações "região c.-117 G>A", "HBG-117 G>A", "região alvo -117 G>A" e semelhantes referem-se a uma sequência que é 5' do sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene HBG1 e/ou HBG2 na localização genômica Hg38 Chr11:5,249,974 a Hg38 Chr11:5,249,974 e Hg38 Chr11:5,254,898 a Hg38 Chr11:5,254,898, respectivamente. À região HBG1 c.-117 G>A é exemplificada por uma substituição de gua- nina (G) por adenina (A) na SEQ ID NO: 902 na posição 2821, e a região HBG2 c.-117 G>A é exemplificada por uma substituição de G para A na SEQ ID NO: 903 (HBG2) na posição 2745. O termo "alteração -117 G>A'" e similares referem-se a uma substituição de G para A na região alvo -117G>A.
[0163] O termo "sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal" de- nota a região dentro de 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 pb de uma se- quência promotora HBG1/2 proximal incluindo a região alvo de 13 nt. Alterações por sistemas de edição de genoma de acordo com esta di- vulgação facilitam (por exemplo, causam, promovem ou tendem a au- mentar a probabilidade de) regulação positiva da produção de HbF em descendência eritroide.
[0164] O termo "motivo de ligação GATA1 em BCL114e" refere-se à sequência que é o motivo de ligação GATA1 no intensificador especií- fico de eritroide de BCL11A (BCL11Ae) que se encontra na região do sítio hipersensível +58 DNase | (DHS) do intrão 2 de o gene BCL11A. As coordenadas genômicas para o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae são chr2: 60,495,265 a 60,495,270. O sítio +58 DHS compre- ende uma sequência de 115 pares de bases (pb) conforme estabelecido na SEQ ID NO: 968. A sequência do sítio +58 DHS, incluindo — 500 pb a montante e — 200 pb a jusante é estabelecida na SEQ ID NO: 969.
[0165] Onde os intervalos são aqui fornecidos, os pontos finais são incluídos. Além disso, deve ser entendido que, salvo indicação em con- trário ou de outro modo evidente a partir do contexto e/ou da compreen- são de um versado na especialidade, os valores que são expressos como intervalos podem assumir qualquer valor específico dentro dos in- tervalos estabelecidos em diferentes formas de realização da invenção, para o décimo da unidade do limite inferior do intervalo, a menos que o contexto indique claramente o contrário. É também para ser entendido que, salvo indicação em contrário ou de outra forma evidente a partir do contexto e/ou da compreensão de um versado na especialidade, valores expressos como intervalos podem assumir qualquer sub-intervalo den- tro do intervalo dado, em que os pontos finais do sub-intervalo são ex- pressos com o mesmo grau de precisão que o décimo da unidade do limite inferior do intervalo.
Visão Geral
[0166] As várias modalidades da presente divulgação, geralmente referem-se a sistemas de edição de genoma configurados para introdu- zir alterações (por exemplo, uma deleção ou inserção, ou outra muta- ção) no DNA cromossômico que aumentam a transcrição dos genes HBG1 e/ou HBG2, que codificam as subunidades Ay e Gy da hemoglo- bina, respectivamente. Em certas modalidades, a expressão aumentada de um ou mais genes de y—globina (por exemplo, HBG1, HBG2) usando os métodos fornecidos neste documento resulta na formação preferen- cial de HDF sobre HbA e/ou níveis aumentados de HDF como uma per- centagem da hemoglobina total. Em certas modalidades, a divulgação geralmente refere-se ao uso de complexos RNP compreendendo um gRNA complexado com uma molécula Cpf1. Em certas modalidades, o gRNA pode ser não modificado ou modificado, a molécula Cpf1i pode ser uma proteína Cpf1 de tipo selvagem ou uma proteína Cpf1 modifi-
cada. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequên- cia apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas mo- dalidades, uma Cpf1 modificada pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências polinucleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 modificada codificada pela sequência apre- sentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21).
[0167] Foi previamente mostrado que pacientes com a condição Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal (HPFH) contêm muta- ções em um elemento regulador de y-globina que resulta na expressão da y-globina fetal ao longo da vida, em vez de ser reprimido por volta da época do nascimento (Martyn 2017). Isso resulta em expressão elevada de hemoglobina fetal (HbF). As mutações HPFH podem ser delecionais ou não delecionais (por exemplo, mutações pontuais). Indivíduos com HPFH apresentam expressão de HbF ao longo da vida, ou seja, não sofrem ou sofrem apenas troca parcial de globina, sem sintomas de ane- mia.
[0168] A expressão de HbF pode ser induzida por meio de muta- ções pontuais em um elemento regulador de y—globina que está asso- ciado a uma variante de HPFH de ocorrência natural, incluindo, por exemplo, HBG1 c.-114 C>T; c.-117 G>A; c.-158 C>T; c.-167 C>T; c.- 170 G>A; c.-175 T>G; c.-175 T>C; c.-195 C>G; c.-196 C>T; c.-197 C>T; c.-198 T>C; c.-201 C>T; c.-202 C>T; c.-211 C>T, c.-251 T>C;ou c.-499 T>A;ou HBG?2 c.-109 G>T; c.-110 A>C; c.-114 C>A; c.-114 C>T; c.-114 C>G; c.-157 C>T; c.-158 C>T; c.-167 C>T; c.-167 C>A; c.-175 T>C; c.- 197 C>T; c.-200+C; c.-202 C>G; c.-211 C>T; c.-228 T>C; c.-255 C>G;
c.-309 A>G; c.-369 C>G; ou c.-567 T>G.
[0169] Tem sido mostrado que as mutações que ocorrem natural- mente no motivo da caixa CCAAT distal encontrado dentro do promotor dos genes HBG1 e/ou HBG2 (ou seja, HBG1/2 c.-111 para -115) resul- tam em expressão continuada da y-globina e a condição HPFH. Pensa- se que a alteração (mutação ou deleção) de caixa CCAAT pode pertur- bar a ligação de um ou mais repressores transcricionais, resultando em expressão contínua do gene da y-globina e elevada expressão de HbF (Martyn 2017). Por exemplo, um par de 13 bases de ocorrência natural del c.-114 a -102 ("deleção de 13 nt") mostrou estar associado a níveis elevados de HbF (Martyn 2017). A caixa CCAAT distal provavelmente se sobrepõe aos motivos de ligação dentro e ao redor da caixa CCAAT de fatores de transcrição reguladores negativos que são expressos na idade adulta e reprimem HBG (Martyn 2017).
[0170] Uma estratégia de edição de gene aqui descrita é para au- mentar a expressão de HbF por interromper um ou mais nucleotídeos na caixa CCAAT distal e/ou em torno caixa CCAAT distal. Em certas modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode ser a região que está em ou perto da caixa CCAAT distal e inclui os nucleotídeos da caixa CCAAT distal e 25 nucleotídeos a montante (5') e 25 nucleotídeos a jusante (3') da caixa distal CCAAT (ou seja, HBG1/2 c.-86 a -140). Em outras modalidades, a região alvo da caixa CCAAT pode ser a região que está em ou perto da caixa CCAAT distal e inclui os nucleotídeos da caixa CCAAT distal e 5 nucleotídeos a montante (5') e 5 nucleotídeos a jusante (3') da caixa distal CCAAT (ou seja, HBG1/2 c.-106 a -120). AI- terações únicas que não ocorrem naturalmente da região alvo da caixa CCAAT são aqui divulgadas que induzem expressão de HBG incluindo, sem limitação, HBG del c. -104 a -121 ("deleção 18 nt"), HBG del c.-105 a -115 ("deleção 11 nt"), HBG del c.-112 a -115 ("deleção 4 nt"), e HBG del c.-116 ("deleção 1 nt"). Em certas modalidades, os sistemas de edi- ção de genoma divulgados neste documento podem ser usados para introduzir alterações na região alvo da caixa CCAAT de HBG1 e/ou HBG2. Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma po- dem incluir um ou mais de um doador de DNA modelo que codifica uma alteração (tal como uma deleção, inserção ou mutação) na região alvo da caixa CCAAT. Em certas modalidades, as alterações podem ser al- terações de ocorrência não natural ou alterações de ocorrência natural. Em certas modalidades, os modelos de doador podem codificar a dele- ção de 1 nt, deleção de 4 nt, deleção de 11 nt, deleção de 13 nt, deleção de 18 nt ou alteração c.-117 G>A. Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma podem incluir uma nuclease guiada por RNA in- cluindo uma Cas9, Cas 9 modificada, uma Cpf1 ou Cpf1 modificada. Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma podem incluir um RNP compreendendo um gRNA e uma molécula Cpf1. Em certas modalidades, um gRNA pode ser não modificado ou modificado, a mo- lécula Cpf1 pode ser uma proteína Cpf1 de tipo selvagem ou uma pro- teína Cpf1 modificada, ou suas combinações. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, uma Cpf1 modificada pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequên- cias polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequên- cias polinucleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, o complexo RNP pode compreender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a se- quência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 modifi- cada codificada pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Tabela 21).
[0171] A expressão de HbF também pode ser induzida por meio da interrupção direcionada da expressão específica da célula eritroide de um repressor transcricional, BCL171A, que codifica um repressor que si- lencia HBG1 e HBG2 (Canvers 2015). Uma outra estratégia de edição de genes aqui divulgada é aumentar a expressão de HbF direcionando a interrupção do intensificador específico de eritroide de BCL11A (BCL11Ae) (também discutido na Publicação Internacional de Patente No. WO 2015/148860 comumente atribuída de Friedland et al. ("Frie- dland"), publicada em 1 de outubro de 2015, que é incorporada por re- ferência em sua totalidade neste documento). Em certas modalidades, a região de BCL11Ae direcionada para interrupção pode ser o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ãe. Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma divulgados neste documento podem ser usados para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11ÃAe, a região alvo da caixa CCAAT, a região alvo de 13 nt de HBG1 e/ou HBG2, ou uma combinação dos mesmos.
[0172] Os sistemas de edição de genoma da presente divulgação podem incluir uma nuclease guiada por RNA, tais como Cas9 ou Cpf1 e um ou mais gRNAs possuindo um domínio de direcionamento que é complementar a uma sequência em ou perto da região alvo, e, opcio- nalmente, um ou mais de um modelo doador de DNA que codifica uma mutação específica (tal como uma deleção ou inserção) em ou perto da região alvo, e/ou um agente que aumenta a eficiência com que tais mu- tações são geradas incluindo, sem limitação, um oligonucleotídeo alea- tório, uma molécula pequena agonista ou antagonista de um produto gênico envolvido na reparação do DNA ou uma resposta a danos no DNA, ou um agente peptídico.
[0173] Uma variedade de abordagens para a introdução de muta- ções na região alvo da caixa CCAAT, região alvo de 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae pode ser empregue nas modalidades da presente divulgação.
Numa abordagem, uma única alteração, tal como uma quebra de cadeia dupla, é feita dentro da região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL114Ae, e é reparado de uma forma que perturba a função da região, por exemplo, pela formação de um indel ou pela incorporação de uma sequência modelo doadora que codifica a deleção da região. Em uma segunda abordagem, duas ou mais alterações são feitas em ambos os lados da região, o que resulta na supressão da sequência de intervenção, incluindo a região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae.
[0174] O tratamento de hemoglobinopatias por terapia gênica e/ou edição do genoma é complicado pelo fato de que as células que são fenotipicamente afetadas pela doença, eritrócitos ou RBCs, são enucle- adas e não contêm material genético que codifica as subunidades da proteína hemoglobina aberrante (Hb) nem as subunidades Ay ou Gy di- recionadas nas abordagens de edição de genoma exemplificativas des- critas acima. Esta complicação é tratada, em certas modalidades desta divulgação, pela alteração das células que são competentes para se di- ferenciarem em, ou de outra forma dar origem a, eritrócitos. As células dentro da linhagem eritroide que são alteradas de acordo com várias modalidades desta divulgação incluem, sem limitação, células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSCs), eritroblastos (incluindo eri- troblastos basofílicos, policromáticos e/ou ortocromáticos), proeri- troblastos, eritrócitos ou reticulônicos policromáticos, células-tronco em- brionárias (ES) e/ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Es- sas células podem ser alteradas in situ (por exemplo, dentro de um te- cido de um indivíduo) ou ex vivo. Implementações de sistemas de edi- ção de genoma para alteração in situ e ex vivo de células são descritas sob o título "Implementação de sistemas de edição de genoma: entrega, formulações e vias de administração" abaixo.
[0175] Em certas modalidades, as alterações que resultam na indu- ção da expressão de Ay e/ou Gy são obtidas através do uso de um sis- tema de edição de genoma compreendendo uma nuclease guiada por RNA e pelo menos um gRNA tendo um domínio de direcionamento com- plementar a uma sequência dentro da região alvo da caixa CCAAT de HBG1 e/ou HBG2 ou próximo a ela (por exemplo, dentro de 10, 20, 30, 40, ou 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 bases da região alvo da caixa CCAAT). Como é discutido em mais detalhes abaixo, a nuclease guiada por RNA e o gRNA formam um complexo que é capaz de se associar e alterar a região alvo da caixa CCAAT ou uma região próxima a ela. Exemplos de gRNAs adequados e domínios de direcionamento de gRNA direcionados à região alvo da caixa CCAAT de HBG1 e/ou HBG2 ou próxima a ela, para uso nas modalidades aqui divulgadas incluem, sem limitação, aqueles estabelecidos em SEQ ID NOs: 251-901, 940- 942, 970, 971, 996, 997, 1002, e 1004.
[0176] Em certas modalidades, as alterações que resultam na indu- ção da expressão de Ay e/ou Gy são obtidas através do uso de um sis- tema de edição de genoma compreendendo uma nuclease guiada por RNA e pelo menos um gRNA tendo um domínio de direcionamento com- plementar a uma sequência dentro da região alvo 13 nt de HBG1 e/ou HBG2 ou próximo a ela (por exemplo, dentro de 10, 20, 30, 40, ou 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 bases da região alvo 13 nt). Como é discutido em mais detalhes abaixo, a nuclease guiada por RNA e o gRNA formam um complexo que é capaz de se associar e alterar a região alvo 13 nt ou uma região próxima a ela. Exemplos de gRNAs adequados e domí- nios de direcionamento de gRNA direcionados à região alvo 13 nt de HBG1 e/ou HBG2 ou próxima a ela, para uso nas modalidades aqui di- vulgadas incluem, sem limitação, aqueles estabelecidos em SEQ ID NOs: 251-901, 940-942, 970, 971, 996, 997, 1002, e 1004.
[0177] Em certas modalidades, as alterações que resultam na indu- ção da expressão de HbF são obtidas através do uso de um sistema de edição de genoma compreendendo uma nuclease guiada por RNA e pelo menos um gRNA tendo um domínio de direcionamento comple- mentar a uma sequência dentro do motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae ou próximo do mesmo (por exemplo, dentro de 10, 20, 30, 40, ou 50, 100, 200, 300, 400 ou 500 bases do motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae). Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA e o gRNA formam um complexo que é capaz de se associar e alterar o mo- tivo de ligação GATA1 em BCL11Ae. Exemplos de domínios de direcio- namento adequados direcionados ao motivo de ligação GATA1I1 em BCL11Ae para uso nas modalidades aqui divulgadas incluem, sem limi- tação, aqueles estabelecidos em SEQ ID NOs: 952-955.
[0178] O sistema de edição do genoma pode ser implementado de várias maneiras, conforme discutido abaixo em detalhe. Como exemplo, um sistema de edição de genoma desta divulgação pode ser implemen- tado como um complexo de ribonucleoproteína ou uma pluralidade de complexos nos quais múltiplos gRNAs são usados. Este complexo de ribonucleoproteína pode ser introduzido em uma célula alvo usando mé- todos conhecidos na técnica, incluindo eletroporação, conforme descrito na Publicação Internacional de Patente No. WO 2016/182959 comu- mente atribuída de Jennifer Gori ("Gori"), publicada em 17 de novembro de 2016, que é incorporado por referência em sua totalidade neste do- cumento.
[0179] Os complexos de ribonucleoproteína dentro dessas compo- sições são introduzidos nas células alvo por métodos conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, eletroporação (por exemplo, usando a tecnologia Nucleofection'"y comercializada por Lonza, Basel, Suíça ou tecnologias semelhantes comercializadas por, por exemplo, Maxcyte
Inc. Gaithersburg, Maryland) e lipofecção (por exemplo, usando o rea- gente Lipofectamine'!" comercializado pela Thermo Fisher Scientific, Waltham Massachusetts). Alternativamente, ou adicionalmente, os complexos de ribonucleoproteína são formados dentro das próprias cé- lulas alvo após a introdução de ácidos nucleicos que codificam a nu- clease guiada por RNA e/ou gRNA. Essas e outras modalidades de en- trega são descritas em termos gerais abaixo e em Gori.
[0180] As células que foram alteradas ex vivo de acordo com esta divulgação podem ser manipuladas (por exemplo, expandidas, passa- das, congeladas, diferenciadas, desdiferenciadas, transduzidas com um transgene, etc.) antes de sua entrega a um indivíduo. As células são, variavelmente, entregues a um indivíduo a partir do qual são obtidos (em um transplante "autólogo"), ou a um recetor que é imunologica- mente distinto de um doador de células (em um transplante "alogênico").
[0181] Em alguns casos, um transplante autólogo inclui os passo de obtenção, do indivíduo, de uma pluralidade de células, tanto circulando no sangue periférico, quanto dentro da medula ou outro tecido (por exemplo, baço, pele, etc.) e manipulação das células para enriqueci- mento de células na linhagem eritroide (por exemplo, por indução para gerar iPSCs, purificação de células que expressam certos marcadores de superfície celular, como CD34, CD90, CD49f e/ou não expressando marcadores de superfície característicos de linhagens não eritroides, como CD10, CD14, CD38, etc.). As células são, opcionalmente ou adi- cionalmente, expandidas, transduzidas com um transgene, expostas a uma citocina ou outro peptídeo ou agente de molécula pequena e/ou congeladas/descongeladas antes da transdução com um sistema de edição de genoma direcionado à região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae. O sistema de edição de genoma pode ser implementado ou entregue às células em qualquer formato ade- quado, incluindo como um complexo de ribonucleoproteína, como pro- teínas separadas e componentes de ácido nucleico e/ou como ácidos nucleicos que codificam os componentes do sistema de edição de ge- noma.
[0182] Em certas modalidades, as células-tronco hematopoéticas e progenitoras CD34+ (HSPCs) que foram editadas usando os métodos de edição de genoma divulgados neste documento podem ser usadas para o tratamento de uma hemoglobinopatia em um indivíduo em ne- cessidade. Em certas modalidades, a hemoglobinopatia pode ser do- ença falciforme grave (SCD) ou talassemia, tal como B-talassemia, õ- talassemia ou B/ó-talassemia. Em certas modalidades, um protocolo exembplificativo para o tratamento de uma hemoglobinopatia pode incluir a coleta de CD34+ HSPCs de um indivíduo em necessidade, a edição ex vivo dos autólogos CD34+ HSPCs usando os métodos de edição de genoma divulgados neste documento, seguido por reinfusão de CD34+ HSPCs autólogos editados no indivíduo. Em certas modalidades, o tra- tamento com CD34+ HSPCs autólogas editadas pode resultar em au- mento da indução de HbF.
[0183] Antes de colher CD34+ HSPCs, em certas modalidades, um indivíduo pode descontinuar o tratamento com hidroxiureia, se aplicável, e receber transfusões de sangue para manter níveis suficientes de he- moglobina (Hb). Em certas modalidades, um indivíduo pode receber ple- rixafor intravenoso (por exemplo, 0,24 mg/kg) para mobilizar CD34+ HSPCs da medula óssea para o sangue periférico. Em certas modalida- des, um indivíduo pode sofrer um ou mais ciclos de leucaferese (por exemplo, cerca de um mês entre os ciclos, com um ciclo definido como duas coletas de leucaferese mobilizada de plerixa realizadas em dias consecutivos). Em certas modalidades, o número de ciclos de leucafe- rese realizados para um indivíduo pode ser o número necessário para atingir uma dose de CD34+ HSPCs autólogas editadas (por exemplo, > 2x 106 células/kg, = 3 x 106 células/kg, 2 4 x 106 células/kg, 2 5 x 10º células/kg, 2 x 10º células/kg a 3 x 10º células/kg, 3 x 10º células/kg a 4 x 108 células/kg, 4 x 106 células/kg a 5 x 108º células/kg) para serem reinfundidas de volta no indivíduo, junto com uma dose de CD34+ HSPCs/kg autólogas não editadas para armazenamento de backup (por exemplo, 2 1,5 x 106º células/kg). Em certas modalidades, as CD34+ HSPCs colhidas do indivíduo podem ser editadas usando qualquer um dos métodos de edição de genoma aqui discutidos. Em certas modali- dades, qualquer um ou mais dos gRNAs e uma ou mais das nucleases guiadas por RNA divulgadas neste documento podem ser usados nos métodos de edição de genoma.
[0184] Em certas modalidades, o tratamento pode incluir um trans- plante autólogo de células-tronco. Em certas modalidades, um indivíduo pode ser submetido a condicionamento mieloablativo com condiciona- mento de busulfan (por exemplo, dose ajustada com base na análise farmacocinética de primeira dose, com uma dose de teste de 1 mg/kg). Em certas modalidades, o condicionamento pode ocorrer por quatro dias consecutivos. Em certas modalidades, após um período de elimi- nação de busulfano de três dias, CD34+ HSPCs autólogos editados (por exemplo, 2 2 x 10º células/kg, 2 3 x 108 células/kg, 2 4 x 106º células/kg, > 5 x 106 células/kg, 2 x 10º células/kg a 3 x 108º células/kg, 3 x 10º células/kg a 4 x 10º células/kg, 4 x 106 células/kg a 5 x 10º células/kg) podem ser reinfundidas no indivíduo (por exemplo, no sangue perifé- rico). Em certas modalidades, as CD34+ HSPCs autólogas editadas po- dem ser fabricadas e criopreservadas para um determinado indivíduo. Em certas modalidades, um indivíduo pode obter enxerto de neutrófilos após um regime de condicionamento mieloablativo sequencial e infusão de células CD34+ autólogas editadas. O enxerto de neutrófilos pode ser definido como três medições consecutivas de ANC 2 0,5 x 10%L.
[0185] No entanto é implementado, um sistema de edição de ge- noma pode incluir, ou pode ser coentregue com, um ou mais fatores que melhoram a viabilidade das células durante e após a edição, incluindo sem limitação de um antagonista do receptor de hidrocarboneto de arila, tais como StemRegenin-1 (SR1), UM171, LGCO0006, alfa-napthoflavona e CH-223191 e/ou um antagonista da resposta imune inata, tal como ciclosporina A, dexametasona, reservatrol, um peptídeo inibidor MyD88, um agente de RNAi direcionado a Myd88, uma proteína recombinante B18R, um glicocorticoide, OXxPAPC, um antagonista de TLR, rapami- cina, BK795 e um RLR shRNA. Estes e outros factores que melhoram a viabilidade das células durante e após a edição são descritos em Gori, sob o título "l. Optimization of Stem Cells" a partir da página 36 até pá- gina 61, que é aqui incorporado por referência.
[0186] As células, após a entrega do sistema de edição de genoma, são opcionalmente manipuladas, por exemplo, para enriquecer para HSCs e/ou células na linhagem eritroide e/ou para células editadas, para expandi-las, congelar/descongelar ou de outra forma preparar as células para voltar ao indivíduo. As células editadas são então devolvi- das ao indivíduo, por exemplo, no sistema circulatório por meio de ad- ministração intravenosa ou administração ou em um tecido sólido, como a medula óssea.
[0187] Funcionalmente, a alteração da região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae usando as composições, méto- dos e sistemas de edição de genoma desta divulgação resulta em sig- nificativa indução, entre as células que expressam hemoglobina, das subunidades Ay e/ou Gy (referidas como expressão de HbF), por exem- plo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ou maior indução da expressão da subunidade Ay e/ou Gy em relação aos controles não modificados. Esta indução da expressão da proteína é geralmente o resultado da alteração da região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae (expressos, por exemplo, em termos da percentagem de genoma total compreendendo mutações in- del com a pluralidade de células) em algumas ou todas da pluralidade de células que são tratadas, por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40 %, 45%, 50% da pluralidade de células com- preendem pelo menos um alelo que compreende uma alteração de se- quência, incluindo, sem limitação, um indel, inserção ou deleção em ou perto da região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae.
[0188] Os efeitos funcionais das alterações causadas ou facilitadas pelos sistemas e métodos de edição do genoma da presente divulgação podem ser avaliados em qualquer número de maneiras adequadas. Por exemplo, os efeitos das alterações na expressão da hemoglobina fetal podem ser avaliados ao nível da proteína ou do MRNA. A expressão de MRNA de HBG1 e HBG?2 pode ser avaliada por PCR digital de gotículas (ddPCR), que é realizada em amostras de cDNA obtidas por transcrição reversa de mMRNA colhido de amostras tratadas ou não. Os iniciadores para HBG1, HBG2, HBB e/ou HBA podem ser usados individualmente ou multiplexados usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a análise ddPCR de amostras pode ser conduzida usando o sistema QX2007Y" ddPCR comercializado pela Bio Rad (Hercules, CA), e proto- colos associados publicados pela BioRad. A proteína de hemoglobina fetal pode ser avaliada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), por exemplo, de acordo com os métodos discutidos nas pp. 143-44 em Chang 2017 (incorporado aqui por referência), ou cromato- grafia líquida de proteína rápida (FPLC), usando colunas de troca iônica e/ou fase reversa para resolver as cadeias de globina HbF, HDbB e HDA e/ou Ay e Gy como é conhecido na técnica.
[0189] Deve-se notar que a taxa na qual a região alvo da caixa CCAAT (por exemplo, regiões alvo 18 nt, 11 nt, 4 nt, 1 nt, c.--117 G> A), região alvo de 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL114Ae é alterada nas células alvo pode ser modificada pela utilização de componentes opcionais de edi- ção do sistema de genoma, tais como modelos de oligonucleotídeos do- adores. O desenho do modelo do doador é descrito em termos gerais abaixo sob o título "Desenho do modelo do doador". Modelos doadores para utilização no direcionamento a região alvo 13 nt podem incluir, sem limitação, os modelos de doadores que codificam alterações (por exem- plo, deleções) de HBG71 c.-114 a -102 (correspondente a nucleotídeos 2824-2836 de SEQ ID NO: 902), HBG1 c.-225 a -222 (correspondendo aos nucleotídeos 2716-2719 de SEQ ID NO: 902)) e/ou HBG2 c.-114 a -102 (correspondendo a nucleotídeos 2748-2760 de SEQ ID NO: 903). Braços de homologia 5' e 3' exemplificativos e as deleções de codifica- ção de modelos de doador de comprimento total exemplificativas, tais como c.-114 a -102 também são apresentados abaixo (SEQ ID NOS: 904-909). Em certas modalidades, os modelos de doadores para uso no direcionamento da região alvo de 18 nt podem incluir, sem limitação, os modelos de doadores que codificam alterações (por exemplo, deleções) de HBG1 c.-104 a -121, HBG2 c.-104 a -121, ou uma combinação dos mesmos. Modelos de doador de comprimento total exemplificativos que codificam deleções, tais como c.-104 a -121, incluem SEQ ID NOs: 974 e 975. Em certas modalidades, os modelos de doadores para uso no direcionamento da região alvo de 11 nt podem incluir, sem limitação, os modelos de doadores que codificam alterações (por exemplo, deleções) de HBG1 c.-105 a -115, HBG2 c.-105 a -115, ou uma combinação dos mesmos. Modelos de doador de comprimento total exemplificativos que codificam deleções, tais como c.-105 a -115, incluem SEQ ID NOs: 976 e 978. Em certas modalidades, os modelos de doadores para uso no direcionamento da região alvo de 4 nt podem incluir, sem limitação, os modelos de doadores que codificam alterações (por exemplo, deleções) de HBG1 c.-112 a -115, HBG2 c.-112 a -115, ou uma combinação dos mesmos. Modelos de doador de comprimento total exemplificativos que codificam deleções, tais como c.-112 a -115, incluem SEQ ID NOs: 984-
995. Em certas modalidades, os modelos de doadores para uso no di- recionamento da região alvo de 1 nt podem incluir, sem limitação, os modelos de doadores que codificam alterações (por exemplo, deleções) de HBG1 c.-116, HBG2 c.-116, ou uma combinação dos mesmos. Mo- delos de doador de comprimento total exemplificativos que codificam deleções, tais como c.-116, incluem SEQ ID NOs: 982 e 983. Em certas modalidades, os modelos de doadores para uso no direcionamento da região alvo c.-117 G>A podem incluir, sem limitação, os modelos de do- adores que codificam alterações (por exemplo, deleções) de HBG1 c.- 117 G>A, HBG2 c.-117 G>A, ou uma combinação dos mesmos. Mode- los de doador de comprimento total exemplificativos que codificam de- leções, tais como c.-117 G>A, incluem SEQ ID NOs: 980 e 981. Em certas modalidades, o modelo doador pode ser uma cadeia positiva ou uma cadeia negativa.
[0190] Os modelos de doadores aqui utilizados podem ser de mo- delos não específicos que são não homólogas a regiões de DNA dentro ou próximo da sequência alvo. Em certas modalidades, os modelos de doadores para uso no direcionamento da região alvo de 13 nt podem incluir, sem limitação, modelos específicos não alvo que são não homó- logos a regiões de DNA dentro ou perto da região alvo de 13 nt. Por exemplo, um modelo de doador não específico para uso no direciona- mento da região alvo de 13 nt pode ser não homólogo às regiões de DNA dentro ou perto da região alvo de 13 nt e pode compreender um modelo de doador que codifica a deleção de HBG1 c.- 225 a -222 (cor- respondendo aos nucleotídeos 2716-2719 de SEQ ID NO: 902). Em cer- tas modalidades, os modelos de doadores para uso no direcionamento do motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae podem incluir, sem limitação, modelos específicos não alvo que não são homólogos a regiões de DNA dentro ou perto do motivo de ligação GATA1I na sequência alvo BCL11Ae. Outros modelos de doadores para uso no direcionamento de BCL11Ae podem incluir, sem limitação, modelos de doadores incluindo alterações (por exemplo, deleções) de BCL11Ae, incluindo, sem limita- ção, o motivo GATA1 em BCL114Ãe.
[0191] As modalidades aqui descritas podem ser usadas em todas as classes de vertebrados, incluindo, mas não se limitando a, primatas, camundongos, ratos, coelhos, porcos, cães e gatos.
[0192] Esta visão geral focou-se em várias modalidades exemplifi- cativas que ilustram os princípios dos sistemas de edição de genoma e métodos de alteração de células mediados por CRISPR. Para maior cla- reza, no entanto, esta divulgação abrange modificações e variações que não foram expressamente abordadas acima, mas serão evidentes para aqueles versados na técnica. Com isso em mente, a divulgação a seguir se destina a ilustrar os princípios operacionais dos sistemas de edição de genoma de forma mais geral. O que se segue não deve ser entendido como limitante, mas sim ilustrativo de certos princípios de sistemas de edição de genoma e métodos mediados por CRISPR utilizando esses sistemas, que, em combinação com a divulgação instantânea, informa- rão aqueles versados na técnica sobre implementações e modificações adicionais que estão dentro do seu escopo. Helicases quiadas por RNA, RNAs quias e RNAs quias mortos
[0193] Várias modalidades da presente divulgação também refe- rem-se geralmente a sistemas de edição de genoma configurados para alterar a estrutura helicoidal de um ácido nucleico para aumentar a edi- ção do genoma de uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo de 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 pro- ximal e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae) no ácido nucleico e métodos e composições dos mesmos. Muitas modalidades referem- se à observação de que o posicionamento de um evento que altera a estrutura helicoidal do DNA dentro ou adjacente às regiões alvo no ácido nucleico pode melhorar a atividade dos sistemas de edição de genoma direcionados a tais regiões alvo. Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, pensa-se que as alterações da estrutura helicoidal (por exemplo, por desenrolamento) dentro ou próximo às regiões alvo de DNA podem induzir ou aumentar a acessibilidade de um sistema de edição de ge- noma para a região alvo, resultando em edição aumentada das regiões- alvo pelo sistema de edição do genoma.
[0194] As nucleases CRISPR evoluíram principalmente para defen- der bactérias contra patógenos virais, cujos genomas não são organiza- dos naturalmente em cromatina. Em contraste, quando os genomas eu- carióticos são organizados em unidades nucleossômicas que compre- endem segmentos de DNA genômico enrolados em torno de histonas. Nucleases CRISPR de várias famílias bacterianas foram consideradas inativas para editar DNA eucariótico, sugerindo que a capacidade de editar DNA ligado ao nucleossomo pode diferir entre as enzimas (Ran 2015). Evidências bioquímicas mostram que S. pyogenes Cas9 pode clivar DNA de forma eficiente nas pontas do nucleossomo, mas reduziu a atividade quando o sítio alvo está posicionado próximo ao centro da díade do nucleossomo (Hinz 2016).
[0195] Em muitos tipos de células, os sítios alvo de interesse podem ser fortemente ligados por nucleossomos ou podem possuir apenas PAM;s adjacentes para enzimas que não são editadas de forma eficiente na presença de nucleossomos. Nesse caso, os nucleossomos proble- máticos podem ser deslocados primeiro usando sítios alvo adjacentes que estão mais próximos da ponta do nucleossomo ou são ligados por uma enzima que é mais eficaz na ligação ao DNA nucleossômico. No entanto, a clivagem nesses sítios adjacentes pode ser prejudicial para a estratégia terapêutica. Portanto, ter uma enzima programável que se liga a esses sítios adjacentes, mas não cliva, pode permitir uma edição funcional mais eficiente.
[0196] Uma estratégia relacionada utiliza o recrutamento de fatores de ação trans exógenos para facilitar o deslocamento do nucleossomo. No entanto, os sistemas e métodos desta divulgação são vantajosos sobre esta estratégia porque eles não requerem modificações de gRNA além do truncamento do domínio de direcionamento, não requerem o recrutamento de fatores de ação trans exógenos e não requerem ativa- ção transcricional para atingir o aumento taxas de edição.
[0197] Uma variedade de abordagens para o desenrolamento e al- teração do ácido nucleico são empregadas nas várias modalidades desta divulgação. Uma abordagem compreende desenrolar (ou abrir) um segmento de cromatina dentro ou próximo a uma região alvo (por exemplo, a região alvo de caixa CCAAT, região alvo de 13 nt, sequência alvo de promotor HBG1/2 proximal e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae) de um ácido nucleico em uma célula e gerando uma quebra de cadeia dupla (DSB) dentro da região alvo do ácido nucleico em que a região alvo é alterada. Em certas modalidades, o DSB pode ser repa- rado de uma maneira que altera a região alvo. Desenrolar o segmento de cromatina usando os métodos fornecidos neste documento pode fa- cilitar o acesso aumentado de RNP's cataliticamente ativos (por exem- plo, nucleases guiadas por RNA cataliticamente ativas e gRNAs) à cro- matina para permitir uma edição mais eficiente do DNA. Por exemplo, esses métodos podem ser usados para editar regiões alvo na cromatina que são difíceis para uma ribonucleoproteína (por exemplo, nuclease guiada por RNA complexada com gRNA) para acessar porque a croma- tina é ocupada por nucleossomos, tal como a cromatina fechada. Em certas modalidades, o desenrolamento do segmento de cromatina ocorre por meio da atividade de helicase guiada por RNA. Em certas modalidades, a etapa de desenrolamento não requer o recrutamento de um fator de ação trans exógeno para o segmento de cromatina. Em cer- tas modalidades, o passo de desenrolar o segmento de cromatina não compreende a formação de uma quebra de cadeia simples ou dupla no ácido nucleico dentro do segmento de cromatina.
[0198] Em certas modalidades das abordagens e métodos descritos acima, a alteração da estrutura helicoidal do DNA é alcançada por meio da ação de uma "helicase guiada por RNA", cujo termo é geralmente usado para se referir a uma molécula, tipicamente um peptídeo, que (a) interage (por exemplo, complexos) com um gRNA, e (b) junto com o gRNA, associa-se e desenrola um sítio alvo. Helicases guiadas por RNA podem, em certas modalidades, compreender nucleases guiadas por RNA configuradas para não ter atividade de nuclease. No entanto, os inventores observaram que mesmo uma nuclease guiada por RNA com- petente para clivagem pode ser adaptada para uso como uma helicase guiada por RNA complexando-a a um gRNA morto tendo um domínio de direcionamento truncado de 15 ou menos nucleotídeos de compri- mento. Complexos de nucleases guiadas por RNA de tipo selvagem com gRNAs mortos exibem atividade de clivagem de RNA reduzida ou eliminada, mas parecem reter a atividade de helicase. Helicases guia- das por RNA e gRNAs mortos são descritos em mais detalhes abaixo.
[0199] Em relação às helicases guiadas por RNA, de acordo com a presente divulgação, uma helicase guiada por RNA pode compreender qualquer uma das nucleases guiadas por RNA aqui divulgadas e infra sob o título intitulado "nucleases guiadas por RNA", incluindo, sem limi- tação, uma Cas9 ou nuclease guiada por RNA Cpf1. A atividade heli- case dessas nucleases guiadas por RNA permitem o desenrolamento do DNA, proporcionando maior acesso aos componentes do sistema de edição do genoma (por exemplo, sem limitação, nuclease guiada por RNA cataliticamente ativa e gRNAs) para a região alvo desejada a ser editada (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo de 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal e/ou o motivo de liga- ção GATA1 em BCL11Ae). Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA cataliticamente ativa com atividade de nuclease. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser configurada para não ter atividade de nuclease. Por exemplo, em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA cataliticamente inativa que carece de ati- vidade de nuclease, tal como uma molécula Cas9 cataliticamente morta, que ainda fornece atividade helicase. Em certas modalidades, uma he- licase guiada por RNA pode formar um complexo com um gRNA morto, formando um RNP morto que não pode clivar o ácido nucleico. Em ou- tras modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA cataliticamente ativa complexada com um gRNA morto, formando um RNP morto que não pode clivar o ácido nucleico. Em cer- tas modalidades, a nuclease guiada por RNA não está configurada para recrutar um fator de ação trans exógeno para a região alvo desejada a ser editada (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL114Ae).
[0200] Voltando aos gRNAs mortos, estes incluem qualquer um dos gRNAs mortos discutidos aqui e infra sob o título intitulado "Moléculas de gRNA morto". Os gRNAs mortos (também aqui referidos como "dgR- NAs") podem ser gerados truncando a extremidade 5' de uma sequência de domínio de direcionamento de gRNA, resultando em uma sequência de domínio de direcionamento de 15 nucleotídeos ou menos de compri- mento. Em certas modalidades, um dgRNA pode ser gerado truncando a extremidade 5' de qualquer uma de uma sequência de domínio de direcionamento de gRNA divulgada aqui na Tabela 2 ou Tabela 10. Mo- léculas de RNA guia mortas de acordo com a presente divulgação in- cluem moléculas de RNA guia mortas que têm atividade de clivagem reduzida, baixa ou indetectável. As sequências de domínio de direcio- namento de RNAs guia mortos podem ser menores em comprimento por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos em comparação com a sequência de domínio de direcionamento de RNAs guia ativos. As mo- léculas de gRNA morto podem compreender domínios de direciona- mento complementares às regiões proximais ou dentro de uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo de 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae) em um ácido nucleico alvo. Em certas modalida- des, "proximal a" pode denotar a região dentro de 10, 25, 50, 100 ou 200 nucleotídeos de uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11AÃAe). Em certas modalidades, gRNAs mortos compreendem domínios de direciona- mento complementares à cadeia de transcrição ou cadeia não transcri- ção de DNA. Em certas modalidades, o RNA guia morto não está confi- gurado para recrutar um fator de ação trans exógeno para uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal e/ou o GATA1 motivo de ligação em BCL114e).
[0201] Também são fornecidos aqui métodos para aumentar a taxa de formação de indel em um ácido nucleico alvo por desenrolamento do DNA dentro ou próximo à região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo de 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae) usando uma helicase guiada por RNA, gerando uma DSB dentro da região alvo e formando um indel na região alvo através da reparação de DSB. O passo de desenrolar o DNA usando uma helicase guiada por RNA for- nece maior formação de indel em comparação com um método de for- mação de indels que não usa uma helicase.
[0202] Esta divulgação abrange ainda métodos de deleção de um segmento de um ácido nucleico alvo em uma célula, compreendendo o contato da célula com uma helicase guiada por RNA e a geração de uma quebra de cadeia dupla (DSB) dentro da região alvo (por exemplo, a caixa CCAAT região alvo, região alvo de 13 nt, sequência alvo do pro- motor HBG1/2 proximal e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ãe). Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA é configurada para se associar dentro ou próximo a uma região alvo do ácido nucleico alvo e desenrolar o DNA de cadeia dupla (dsDNA) dentro ou próximo à re- gião alvo. Em certas modalidades, o ácido nucleico alvo é uma região promotora de um gene, uma região codificadora de um gene, uma re- gião não codificadora de um gene, um íntron de um gene ou um éxon de um gene. Em certas modalidades, o segmento do ácido nucleico alvo a ser deletado pode ter pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ou 100 pares de bases de comprimento. Em certas modalidades, o DSB é reparado de uma maneira que exclui um seg- mento do ácido nucleico alvo.
[0203] Os sistemas de edição de genoma configurados para intro- duzir alterações na estrutura helicoidal podem ser implementados de uma variedade de maneiras, como é discutido abaixo em detalhes. Como exemplo, um sistema de edição de genoma desta divulgação pode ser implementado como um complexo de ribonucleoproteína ou uma pluralidade de complexos nos quais múltiplos gRNAs são usados.
Em certas modalidades, um complexo de ribonucleoproteína do sistema de edição do genoma pode ser uma helicase guiada por RNA comple- xada com um RNA guia morto. Os complexos de ribonucleoproteína po- dem ser introduzidos em uma célula alvo usando métodos conhecidos na técnica, incluindo eletroporação, conforme descrito em Gori. Os sis- temas de edição de genoma que incorporam helicases guiadas por RNA também podem ser modificados de qualquer maneira adequada, inclu- indo, sem limitação, a inclusão de um ou mais de um modelo de doador de DNA que codifica uma mutação específica (tal como uma deleção ou inserção) em ou perto da região alvo, e/ou um agente que aumenta a eficiência com que tais mutações são geradas incluindo, sem limitação, um oligonucleotídeo aleatório, uma molécula pequena agonista ou an- tagonista de um produto gênico envolvido na reparação do DNA ou uma resposta a danos no DNA, ou um agente peptídico. Essas modificações são descritas em mais detalhes abaixo, sob o título "Estratégias de Edi- ção de Genoma". Para maior clareza, esta divulgação inclui composi- ções compreendendo um ou mais gRNAs, gRNAs mortos, helicases gui- adas por RNA, nucleases guiadas por RNA ou uma combinação dos mesmos.
[0204] Embora várias das modalidades exemplificativas acima te- nham se concentrado no desenrolamento do DNA, deve-se notar que outras alterações helicoidais estão dentro do escopo da presente divul- gação. Estes incluem, sem limitação, overwinding, underwinding, au- mento ou diminuição da tensão de torção nas cadeias de DNA dentro ou próximo a uma região alvo (por exemplo, através da atividade da topoisomerase), desnaturação ou separação da cadeia e/ou outras al- terações adequadas, resultando em modificações da estrutura da cro- matina. Cada uma dessas alterações pode ser catalisada por uma ativi- dade guiada por RNA, ou pelo recrutamento de um fator endógeno para uma região-alvo.
[0205] Também são fornecidos neste documento sistemas de edi- ção de genoma e métodos de alteração de um ou mais indels (por exem- plo, assinatura de indel) gerados por um guia ativo. Como os inventores descobriram aqui, o emparelhamento de um RNP morto (dRNP) (isto é, um RNA guia morto complexado com uma nuclease guiada por RNA) e um RNP ativo (isto é, um RNA guia ativo complexado com uma nuclease guiada por RNA) pode resultar em uma mudança da direcionalidade dos indels (por exemplo, assinatura indel) gerada apenas pelo RNP ativo (sem um dRNP). Como mostrado nos exemplos abaixo, o uso do RNA guia morto pode resultar em um aumento da frequência de deleções maiores que se estendem do sítio de corte do RNA guia ativo em direção ao sítio de ligação do RNA guia morto. Assim, o RNA guia morto pode ser usado para efetivamente "orientar" a edição de deleção em direção a um sítio alvo desejado. Em certas modalidades, o uso do RNA guia morto com um RNA guia ativo pode aumentar a frequência de deleções que não estão associadas a micro-homologias.
[0206] Embora os exemplos divulgados na seção de Exemplos abaixo sejam direcionados a alterações da região alvo da caixa CCAAT, os versados na técnica contemplariam que os sistemas de edição de genoma, métodos, células e composições aqui descritos podem ser usados para alterar qualquer outra região alvo, por exemplo, sem limi- tação, para aumentar a frequência de deleções na região alvo, aumen- tar a frequência de deleções na região alvo que não estão associadas a micro-homologias (por exemplo, não reparadas via MMEJ).
[0207] Esta visão geral focou-se em várias modalidades exemplifi- cativas que ilustram os princípios dos sistemas de edição de genoma e métodos de alteração de células mediados por CRISPR. Para maior cla- reza, no entanto, esta divulgação abrange modificações e variações que não foram expressamente abordadas acima, mas serão evidentes para aqueles versados na técnica. Com isso em mente, a divulgação a seguir se destina a ilustrar os princípios operacionais dos sistemas de edição de genoma de forma mais geral. O que se segue não deve ser entendido como limitante, mas sim ilustrativo de certos princípios de sistemas de edição de genoma e métodos mediados por CRISPR utilizando esses sistemas, que, em combinação com a divulgação instantânea, informa- rão aqueles versados na técnica sobre implementações e modificações adicionais que estão dentro do seu escopo. Sistemas de edição de genoma
[0208] O termo "sistema de edição de genoma" refere-se a qualquer sistema com atividade de edição de DNA guiada por RNA. Os sistemas de edição de genoma da presente divulgação incluem pelo menos dois componentes adaptados de sistemas CRISPR de ocorrência natural: um RNA guia (gRNA) e uma nuclease guiada por RNA. Esses dois com- ponentes formam um complexo que é capaz de se associar a uma se- quência de ácido nucleico específica e editar o DNA em ou em torno dessa sequência de ácido nucleico, por exemplo, fazendo uma ou mais de uma quebra de cadeia simples (uma SSB ou corte), uma quebra de cadeia dupla (uma DSB) e/ou uma mutação pontual.
[0209] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma nesta divulgação podem incluir uma helicase para desenrolar DNA. Em certas modalidades, a helicase pode ser uma helicase guiada por RNA. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser uma nu- clease guiada por RNA, como aqui descrito, tal como uma molécula Cas9 ou Cpf1. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA não está configurada para recrutar um fator de ação trans exógeno para uma região alvo. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser configurada para não ter atividade de nuclease. Em certas modali- dades, a helicase guiada por RNA pode ser complexada com um RNA guia morto, conforme divulgado neste documento. Por exemplo, o RNA guia morto (dgRNA) pode compreender uma sequência de domínio de direcionamento com menos de 15 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o RNA guia morto não está configurado para recru- tar um fator de ação trans exógeno para uma região alvo.
[0210] Os sistemas CRISPR de ocorrência natural são organizados evolutivamente em duas classes e cinco tipos (Makarova 2011, incorpo- rado por referência neste documento), e enquanto os sistemas de edi- ção de genoma da presente divulgação podem adaptar componentes de qualquer tipo ou classe de sistema CRISPR de ocorrência natural, as modalidades apresentadas neste documento são geralmente adap- tadas aos sistemas CRISPR de classe 2 e tipo Il ou V. Os sistemas de Classe 2, que abrangem os tipos || e V, são caracterizados por proteínas de nuclease guiadas por RNA de vários domínios relativamente grandes (por exemplo, Cas9 ou Cpf1) e um ou mais RNAs guia (por exemplo, um crRNA e, opcionalmente, um tracr»RNA) que formam complexos de ribonucleoproteína (RNP) que se associam com (ou seja, alvo) e clivam loci específicos complementares a uma sequência de direcionamento (ou espaçador) do crRNA. Os sistemas de edição de genoma de acordo com a presente divulgação visam e editam de forma semelhante se- quências de DNA celular, mas diferem significativamente dos sistemas CRISPR que ocorrem na natureza. Por exemplo, os RNAs guia unimo- leculares aqui descritos não ocorrem na natureza, e ambos os RNAs guia e nucleases guiadas por RNA de acordo com esta divulgação po- dem incorporar qualquer número de modificações de ocorrência não na- tural.
[0211] Sistemas de edição de genoma podem ser implementados (por exemplo, administrados ou entregues a uma célula ou um indiví- duo) de uma variedade de maneiras, e diferentes implementações po- dem ser adequadas para aplicações distintas. Por exemplo, um sistema de edição de genoma é implementado, em certas modalidades, tal como um complexo de proteína/RNA (uma ribonucleoproteína ou RNP), que pode ser incluído em uma composição farmacêutica que inclui opcional- mente um transportador farmaceuticamente aceitável e/ou um agente encapsulante, tal como, sem limitação, um lipídeo ou polímero micro ou nanopartícula, micela ou lipossomo. Em certas modalidades, um sis- tema de edição de genoma é implementado como um ou mais ácidos nucleicos que codificam a nuclease guiada por RNA e componentes de RNA guia descritos acima (opcionalmente com um ou mais componen- tes adicionais); em certas modalidades, o sistema de edição de genoma é implementado como um ou mais vetores compreendendo tais ácidos nucleicos, por exemplo, um vetor viral, como um vírus adeno-associado (ver seção abaixo sob o título "Implementação de sistemas de edição de genoma: entrega, formulações, e vias de administração"); e em cer- tas modalidades, o sistema de edição de genoma é implementado como uma combinação de qualquer um dos anteriores. Implementações adi- cionais ou modificadas que operam de acordo com os princípios aqui estabelecidos serão evidentes para os versados na técnica e estão den- tro do escopo desta divulgação.
[0212] Deve-se notar que os sistemas de edição de genoma da pre- sente divulgação podem ser direcionados para uma única sequência de nucleotídeos específica, ou podem ser direcionados para - e capazes de editar em paralelo - duas ou mais sequências de nucleotídeos espe- cíficas através do uso de dois ou mais RNAs guia. O uso de múltiplos gRNAs é referido como "multiplexação" ao longo desta divulgação e pode ser empregado para direcionar múltiplas sequências alvo não re- lacionadas de interesse, ou para formar múltiplas SSBs ou DSBs dentro de um único domínio alvo e, em alguns casos, para gerar edições espe- cíficas dentro de tal domínio alvo. Por exemplo, a Publicação Internaci- onal de Patente No. WO 2015/138510 de Maeder et al. ("Maeder"), que é aqui incorporado por referência, descreve um sistema de edição de genoma para corrigir uma mutação pontual (C.2991 + 1655A a G) no gene CEP290 humano que resulta na criação de um sítio de emenda críptico, que em por sua vez, reduz ou elimina a função do gene. O sis- tema de edição do genoma de Maeder utiliza dois RNAs-guia direciona- dos a sequências em ambos os lados (ou seja, flanqueando) a mutação pontual e forma DSBs que flanqueiam a mutação. Isto, por sua vez, pro- move a deleção da sequência interveniente, incluindo a mutação, elimi- nando assim o sítio de emenda críptico e restaurando a função normal do gene.
[0213] Como outro exemplo, WO 2016/073990 de Cotta-Ramusino et al. ("Cotta-Ramusino"), que é incorporado por referência neste docu- mento, descreve um sistema de edição de genoma que utiliza dois gRNAs em combinação com uma nickase Cas9 (uma Cas9 que faz um corte de cadeia única, tal como S. pyogenes D10A), um arranjo deno- minado um "sistema dual-nickase." O sistema de dual-nickase de Cotta- Ramusino está configurado para fazer dois cortes em cadeias opostas de uma sequência de interesse que são compensadas por um ou mais nucleotídeos, que se combinam para criar uma quebra de cadeia dupla com uma saliência (5' no caso de Cotta-Ramusino, embora saliências de 3' também sejam possíveis). A saliência, por sua vez, pode facilitar eventos de reparação direcionados por homologia em algumas circuns- tâncias. E, como outro exemplo, WO 2015/070083 de Palestrant et al. (incorporado por referência neste documento) descreve um gRNA dire- cionado a uma sequência de nucleotídeos que codifica Cas9 (referido como um "RNA governante"), que pode ser incluído em um sistema de edição de genoma compreendendo um ou mais gRNAs adicionais para permitir a expressão transitória de um Cas9 que pode de outra forma ser expressa constitutivamente, por exemplo, em algumas células trans- duzidas por vírus. Essas aplicações de multiplexação se destinam a ser exemplificativas, em vez de limitantes, e o versado na técnica apreciará que outras aplicações de multiplexação são geralmente compatíveis com os sistemas de edição de genoma descritos aqui.
[0214] Como divulgado aqui, em certas modalidades, dos sistemas de edição de genoma pode compreender gRNAs múltiplos que podem ser utilizados para introduzir mutações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae ou a região alvo 13 nt de HBG1 e/ou HBG2. Em certas moda- lidades, os sistemas de edição de genes divulgados neste documento podem compreender gRNAs múltiplos usados para introduzir mutações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae e na região alvo de 13 nt de HBG1 e/ou HBG?2.
[0215] Os sistemas de edição de genoma podem, em alguns casos, formar quebras de cadeia dupla que são reparadas por mecanismos de quebra de cadeia dupla de DNA celular, tal como NHEJ ou HDR. Esses mecanismos são descritos em toda a literatura (ver, por exemplo, Davis & Maizels 2014 (descrevendo AIt-HDR); Frit 2014 (descrevendo Alt- NHEJ); lIyama & Wilson 2013 (descrevendo HDR canônico e vias de NHEJ em geral)).
[0216] Quando os sistemas de edição de genoma operam formando DSBs, tais sistemas incluem opcionalmente um ou mais componentes que promovem ou facilitam um modo particular de reparação de quebra de cadeia dupla ou um resultado de reparação particular. Por exemplo, Cota-Ramusino também descreve sistemas de edição de genoma em que um oligonucleotídeo de cadeia simples "modelo de doador" é adici- onado; o modelo de doador é incorporado em uma região alvo do DNA celular que é clivado pelo sistema de edição do genoma e pode resultar em uma mudança na sequência alvo.
[0217] Em certas modalidades, os sistemas de edição de genoma modificam uma sequência alvo ou modificam a expressão de um gene em ou perto da sequência alvo, sem causar quebras de cadeia simples ou dupla. Por exemplo, um sistema de edição de genoma pode incluir uma nuclease guiada por RNA fundida a um domínio funcional que atua no DNA, modificando assim a sequência alvo ou sua expressão. Como um exemplo, uma nuclease guiada por RNA pode ser conectada a (por exemplo, fundida a) um domínio funcional da citidina desaminase e pode operar gerando substituições C-para-A direcionadas. Fusões nu- clease/desaminase exemplificativas são descritas em Komor 2016, que é aqui incorporado por referência. Alternativamente, um sistema de edi- ção de genoma pode utilizar uma nuclease inativada por clivagem (ou seja, uma "morta"), tal como uma Cas9 morta (dCas9), e pode operar formando complexos estáveis em uma ou mais regiões-alvo do DNA celular, interferindo assim com funções que envolvem a(s) região(ões) alvo(s), incluindo, sem limitação, o MRNA de transcrição, a remodela- ção da cromatina, etc. Em certas modalidades, um sistema de edição de genoma pode incluir uma helicase guiada por RNA que desenrola o DNA dentro ou proximal à sequência alvo, sem causar quebras de ca- deia simples ou dupla. Por exemplo, um sistema de edição de genoma pode incluir uma helicase guiada por RNA configurada para se associar dentro ou perto da sequência alvo para desenrolar o DNA e induzir aces- sibilidade à sequência alvo. Em certas modalidades, a helicase guiada por RNA pode ser complexada a um RNA guia morto que está configu- rado para não ter atividade de clivagem, permitindo o desenrolamento do DNA sem causar quebras no DNA.
Moléculas de RNA quia (gRNA)
[0218] Os termos "RNA guia" e "gRNA" referem-se a qualquer ácido nucleico que promove a associação específica (ou"direcionamento") de uma nuclease guiada por RNA, tal como Cas9 ou Cpf1, para uma se- quência alvo, tal como uma sequência genômica ou epissomal em uma célula. Os gRNAs podem ser unimoleculares (compreendendo uma única molécula de RNA e, alternativamente, referidos como quiméricos) ou modulares (compreendendo mais de uma, e normalmente duas, mo- léculas de RNA separadas, tal como um crRNA e um tracrRNA, que estão geralmente associados um ao outro, por exemplo, duplexação). gRNAs e suas partes componentes são descritos em toda a literatura (ver, por exemplo, Briner 2014, que é incorporado por referência; Cotta- Ramusino). Exemplos de gRNAs modulares e unimoleculares que po- dem ser utilizados de acordo com as modalidades aqui incluem, sem limitação, as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 29 e 31 e 38-
51. Exemplos de domínios proximais e de cauda de gRNA que podem ser usados de acordo com as modalidades aqui incluem, sem limitação, as sequências estabelecidas em SEQ ID NOs: 32-37.
[0219] Em bactérias e archea, os sistemas CRISPR tipo |l geral- mente compreendem uma proteína nuclease guiada por RNA, tal como Cas9, um RNA CRISPR (crRNA) que inclui uma região 5' que é comple- mentar a uma sequência estranha e um crRNA transativador (tracr»RNA) que inclui uma região 5' que é complementar e forma um duplex com uma região 3' do cr»RNA. Embora não pretenda estar limitado por qual- quer teoria, pensa-se que este duplex facilita a formação de - e é neces- sário para a atividade de - complexo Cas9/gRNA. Como os sistemas CRISPR tipo Il foram adaptados para uso na edição de genes, foi des- coberto que o crRNA e o tracrRNA poderiam ser unidos em um único RNA guia unimolecular ou quimérico, em um exemplo não limitante, por meio de um quatro nucleotídeo (por exemplo, GAAA) "tetralaço" ou se- quência "ligante" em ponte com regiões complementares de crRNA (na sua extremidade 3') e o tracrRNA (na sua extremidade 5'). (Mali 2013; Jiang 2013; Jinek 2012; todos aqui incorporados por referência).
[0220] Os RNAs guia, sejam unimoleculares ou modulares, incluem um "domínio de direcionamento" que é total ou parcialmente comple- mentar a um domínio alvo dentro de uma sequência alvo, tal como uma sequência de DNA no genoma de uma célula onde a edição é desejada. Os domínios de direcionamento são referidos por vários nomes na lite-
ratura, incluindo, sem limitação, "sequências guia" (Hsu 2013, incorpo- rado por referência neste documento), "regiões de complementaridade" (Cotta-Ramusino), "espaçadores" (Briner 2014) e genericamente como "crRNAs" (Jiang). Independentemente dos nomes que recebem, os do- mínios de direcionamento têm tipicamente 10-30 nucleotídeos de com- primento e, em certas modalidades, têm 16-24 nucleotídeos de compri- mento (por exemplo, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos de comprimento), e estão no ou próximo ao terminal 5' no caso de um gRNA Cas9, e no ou próximo ao terminal 3' no caso de um gRNA Cpf1.
[0221] Além dos domínios de direcionamento, gRNAs tipicamente (mas não necessariamente, conforme discutido abaixo) incluem uma pluralidade de domínios que podem influenciar a formação ou atividade de complexos gRNA/Cas9. Por exemplo, como mencionado acima, a estrutura duplexada formada pelos primeiros e secundários domínios de complementaridade de um gRNA (também referido como um duplex re- petição:anti-repetição) interage com o lóbulo de reconhecimento (REC) de Cas9 e pode mediar a formação de complexos de Cas9/gRNA (Nishi- masu 2014; Nishimasu 2015; ambos aqui incorporados por referência). Deve-se notar que o primeiro e/ou segundo domínios de complementa- ridade podem conter um ou mais tratos poli-A, que podem ser reconhe- cidos por RNA polimerases como um sinal de terminação. A sequência dos primeiros e segundos domínios de complementariedade é, por con- seguinte, opcionalmente modificada para eliminar estas extensões e promover a transcrição de gRNAs completa in vitro, por exemplo através da utilização de trocas A-G, tal como descrito em Briner 2014, ou trocas U-A. Estas e outras modificações semelhantes ao primeiro e segundo domínios de complementaridade estão dentro do escopo da presente divulgação.
[0222] Junto com o primeiro e o segundo domínios de complemen- taridade, os gRNAs de Cas9 normalmente incluem duas ou mais regiões duplexadas adicionais que estão envolvidas na atividade de nuclease in vivo, mas não necessariamente in vitro. (Nishimasu 2015). Um primeiro laço de haste próximo à porção 3' do segundo domínio de complemen- taridade é referido de várias maneiras como o "domínio proximal", (Cotta-Ramusino) "laço de haste 1" (Nishimasu 2014 e 2015) e o "nexo" (Briner 2014). Uma ou mais estruturas em laço de haste estão geral- mente presentes perto da extremidade 3' do gRNA, com o número vari- ável por espécies: gRNAs S. pyogenes tipicamente incluem dois laços de haste em 3' (para um total de quatro estruturas em laço de haste, incluindo o duplex repetição:anti-repetição), enquanto S. aureus e ou- tras espécies têm apenas uma (para um total de três estruturas de laço de haste). Uma descrição das estruturas em laço de haste conservadas (e estruturas gRNA mais geralmente) organizadas por espécies é forne- cida em Briner 2014.
[0223] Embora a descrição anterior tenha se concentrado em gRNAs para uso com Cas9, deve ser apreciado que existem outras nu- cleases guiadas por RNA que utilizam gRNAs que diferem em alguns aspectos daqueles descritos até este ponto. Por exemplo, Cpf1 ("CRISPR de Prevotella e Franciscella 1") é uma nuclease guiada por RNA recentemente descoberta que não requer um tracrRNA para funci- onar. (Zetsche 2015, aqui incorporado por referência). Um gRNA para uso em um sistema de edição do genoma Cpf1 geralmente inclui um domínio de direcionamento e um domínio de complementaridade (alter- nativamente referido como uma "alça"). Também deve ser observado que, em gRNAs para uso com Cpf1, o domínio de direcionamento está geralmente presente na extremidade 3' ou próximo dela, em vez da ex- tremidade 5', conforme descrito acima em conexão com gRNAs Cas9 (a alça está em ou próximo da extremidade 5' de um gRNA Cpf1). Do- mínios de direcionamento exemplificativas de gRNAs Cpf1 são apresen- tados na Tabela 13 e Tabela 18.
[0224] Aqueles versados na técnica apreciarão, no entanto, que embora possam existir diferenças estruturais entre gRNAs de diferentes espécies procarióticas, ou entre gRNAs Cpf1 e Cas9, os princípios pelos quais os gRNAs operam são geralmente consistentes. Devido a esta consistência de operação, os gRNAs podem ser definidos, em termos gerais, por suas sequências de domínio de direcionamento e os versa- dos na técnica apreciarão que uma dada sequência de domínio de dire- cionamento pode ser incorporada em qualquer gRNA adequado, inclu- indo um gRNA unimolecular ou quimérico, ou um gRNA que inclui uma ou mais modificações químicas e/ou modificações sequenciais (substi- tuições, nucleotídeos adicionais, truncamentos, etc.). Assim, para eco- nomia de apresentação nesta divulgação, gRNAs podem ser descritos apenas em termos de suas sequências de domínio de direcionamento.
[0225] De forma mais geral, os versados na técnica apreciarão que alguns aspectos da presente divulgação referem-se a sistemas, méto- dos e composições que podem ser implementados usando múltiplas nu- cleases guiadas por RNA. Por esta razão, a menos que especificado de outra forma, o termo gRNA deve ser entendido como abrangendo qualquer gRNA adequado que pode ser usado com qualquer nuclease guiada por RNA, e não apenas aqueles gRNAs que são compatíveis com uma espécie particular de Cas9 ou Cpf1. A título de ilustração, o termo gRNA pode, em certas modalidades, incluir um gRNA para uso com qualquer nuclease guiada por RNA que ocorre em um sistema CRISPR de Classe 2, tal como um tipo || ou tipo V ou sistema CRISPR, ou um sistema guiado por RNA nuclease derivada ou adaptada desta. Desenho de gRNA
[0226] Métodos para seleção e validação de sequências alvo, bem como análises fora do alvo, foram descritos anteriormente (ver, por exemplo, Mali 2013; Hsu 2013; Fu 2014; Heigwer 2014; Bae 2014; Xiao 2014). Cada uma dessas referências é incorporada aqui por referência.
Como um exemplo não limitativo, de criação gRNA pode envolver a uti- lização de uma ferramenta de software para otimizar a escolha de se- quências alvo potenciais que correspondem a uma sequência alvo de utilizador, por exemplo, para minimizar a atividade total fora do alvo em todo o genoma. Embora a atividade fora do alvo não se limite à cliva- gem, a eficiência da clivagem em cada sequência fora do alvo pode ser prevista, por exemplo, usando um esquema de ponderação derivado experimentalmente. Esses e outros métodos de seleção de guias são descritos em detalhes em Maeder e Cotta-Ramusino.
[0227] No que diz respeito à seleção de sequências de domínio alvo de gRNA direcionadas a sítios alvo de HBG1/2 (por exemplo, a região alvo de 13 nt), uma ferramenta de identificação de domínio alvo de gRNA in-silico foi utilizada e os resultados foram estratificados em qua- tro camadas. Para S. pyogenes, os domínios de direcionamento de nível 1 foram selecionados com base em (1) distância a montante ou a ju- sante de qualquer extremidade do sítio alvo (ou seja, região alvo 13 nt HBG1/2), especificamente dentro de 400 pb de qualquer extremidade do sítio alvo, (2) um nível elevado de ortogonalidade, e (3) a presença de 5' G. Os domínios de direcionamento de nível 2 foram selecionados com base em (1) distância a montante ou a jusante de qualquer extre- midade do sítio alvo (ou seja, região alvo 13 nt HBG1/2), especifica- mente dentro de 400 pb de cada extremidade do sítio alvo, e (2) um nível elevado de ortogonalidade. Os domínios de direcionamento de ní- vel 3 foram selecionados com base em (1) distância a montante ou a jusante de qualquer extremidade do sítio alvo (ou seja, região alvo 13 nt HBG1/2), especificamente dentro de 400 pb de qualquer extremidade do sítio alvo, (2) a presença de 5' G. Os domínios de direcionamento de nível 4 foram selecionados com base na distância a montante ou a ju- sante de qualquer extremidade do sítio alvo (ou seja, região alvo 13 nt HBG1/2), especificamente dentro de 400 pb de cada extremidade do sítio alvo.
[0228] Para S. aureus, os domínios de direcionamento de nível 1 foram selecionados com base em (1) distância a montante ou a jusante de qualquer extremidade do sítio alvo (ou seja, região alvo 13 nt HBG1/2), especificamente dentro de 400 pb de cada extremidade de o sítio alvo, (2) um nível elevado de ortogonalidade, (3) a presença de 5' G, e (4) PAM tendo a sequência NNGRRT (SEQ ID NO: 204). Os domí- nios de direcionamento de nível 2 foram selecionados com base em (1) distância a montante ou a jusante de qualquer extremidade do sítio alvo (ou seja, região alvo 13 nt HBG1/2), especificamente dentro de 400 pb de cada extremidade de o sítio alvo, (2) um nível elevado de ortogona- lidade, e (3) PAM tendo a sequência NNGRRT (SEQ ID NO: 204). Os domínios de direcionamento de nível 3 foram selecionados com base em (1) distância a montante ou a jusante de qualquer extremidade do sítio alvo (ou seja, região alvo 13 nt HBG1/2), especificamente dentro de 400 pb de cada extremidade de o sítio alvo, e (2) PAM tendo a se- quência NNGRRT (SEQ ID NO: 204). Os domínios de direcionamento de nível 4 foram selecionados com base em (1) distância a montante ou a jusante de qualquer extremidade do sítio alvo (ou seja, alvo 13 nt HBG1/2), especificamente dentro de 400 pb de cada extremidade de o sítio alvo, e (2) PAM tendo a sequência NNGRRV (SEQ ID NO: 205).
[0229] A Tabela 2, abaixo, apresenta domínios de direcionamento para gRNAs de S. pyogenes e S. aureus, divididos por (a) nível (1,2,3 ou 4) e (b) HBG1 ou HBG2. Tabela 2: Sequências de domínio de direcionamento de gRNA para sítios alvo de HBG1/2 HBG1 HBG2 o”
HBG1 HBG2 HBG1 HBG2 292, 295, 347, 348, 353, 360-362, 366, 462-468 252-254, 256, 268, 272-274, | 476-481, 489-587, 601- Nível 4 292, 295, 347, 348, 353, 607, 614-620, G640-666, 360-362, 366, 598-759 674-679, 687-693, 708- 714, 733-753, 762-764, 775, 779-781, 804-901
[0230] Sequências gRNA adicionais que foram concebidas para al- teração alvo da região alvo da caixa CCAAT incluem, mas não estão limitados a, sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 970 e 971. As sequências do domínio de direcionamento de gRNAs que foram dese- nhadas para direcionar interrupção da região alvo da caixa CCAAT in- cluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NO: 1002. As sequências do domínio de direcionamento mais PAM (UUUG) de gRNAs que foram desenhadas para direcionar interrupção da região alvo da caixa CCAAT incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NO: 1004. Em certas mo- dalidades, os gRNAs que compreendem a sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1002 e/ou 1004 podem ser complexados com uma prote- ína Cpf1i ou proteína Cpf1 modificada para gerar alterações na região alvo da caixa CCAAT. Em certas modalidades, gRNAs que compreen- dem qualquer um dos Cpf1 gRNAs apresentados na Tabela 15, Tabela 18, ou de Tabela 19 podem ser complexados com uma proteína Cpf1 ou proteína modificada Cpf1 formando uma RNP ("gRNA-Cpf1-RNP") para gerar alterações na região alvo da caixa CCAAT. Em certas mo- dalidades, a proteína Cpf1 modificada pode ser His-AsCpf1-nNLS (SEQ ID NO: 1000) ouHis-AsCpf1-sNLS-sNLS (SEQ ID NO:1001). Em certas modalidades, a molécula de Cpf1 modificada de gRNA-Cpf1-RNP pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs:1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39 (sequências polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs:1019-1021 (sequências polinucleotídicas Cpf1).
[0231] Os gRNAs podem ser concebidos para direcionar o intensifi- cador específico de eritroide de BCL11A (BCL11Ae) para interromper a expressão de um repressor transcricional, BCL11A (descrito em Frie- dland, que é aqui incorporado por referência). Os gRNAs foram dese- nhados para direcionar o motivo de ligação GATA1 que está no intensi- ficador específico eritroide de BCL11A que está na região +58 DHS do íntron 2 (ou seja, o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ãe), onde a região intensificadora +58 DHS compreende a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 968. As sequências do domínio de direcionamento de gRNAs que foram concebidas para interrupção alvo do motivo de liga- ção GATA1 em BCL171Ae, incluem, mas não estão limitados a, as se- quências apresentadas nas SEQ ID NOs: 952-955. As sequências do domínio de direcionamento mais PAM (NGG) de gRNAs que foram con- cebidas para interrupção alvo do motivo de ligação GATA1I1 em BCL11Ae, incluem, mas não estão limitados a, as sequências apresen- tadas nas SEQ ID NOs: 960-963. Modificações de gRNA
[0232] A atividade, estabilidade ou outras características dos gRNAs podem ser alteradas através da incorporação de certas modifi- cações. Como um exemplo, ácidos nucleicos expressos ou entregues transitoriamente podem ser propensos à degradação por, por exemplo, nucleases celulares. Consequentemente, os gRNAs aqui descritos po- dem conter um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados que introduzem estabilidade em relação às nucleases. Embora não dese- jando estar limitado pela teoria, também se acredita que certos gRNAs modificados aqui descritos podem exibir uma resposta imune inata re- duzida quando introduzidos nas células. Os versados na técnica estarão cientes de certas respostas celulares comumente observadas em célu- las, por exemplo, células de mamíferos, em resposta a ácidos nucleicos exógenos, particularmente aqueles de origem viral ou bacteriana. Essas respostas, que podem incluir a indução da expressão e liberação de ci- tocinas e morte celular, podem ser reduzidas ou eliminadas completa- mente pelas modificações aqui apresentadas.
[0233] Certas modificações exemplificativas discutidas nesta seção podem ser incluídas em qualquer posição dentro de uma sequência de gRNA incluindo, sem limitação na ou perto da extremidade 5' (por exem- plo, dentro de 1-10, 1-5, ou 1-2 nucleotídeos do Extremidade 5') e/ou na ou próximo à extremidade 3' (por exemplo, dentro de 1-10, 1-5 ou 1-2 nucleotídeos da extremidade 3'). Em alguns casos, as modificações são posicionadas dentro de motivos funcionais, tais como o duplex de repe- tição-anti-repetição de um gRNA Cas9, uma estrutura em laço de haste de uma Cas9 ou Cpf1 gRNA e/ou um domínio de direcionamento de um gRNA.
[0234] Como um exemplo, a extremidade 5' de um gRNA pode in- cluir uma estrutura cap de mMRNA eucariótica ou análogo de cap (por exemplo, um análogo de cap G(5)ppp(5)G, um análogo de cap m7G(5)ppp(5')G, um análogo de cap anti-reverso 3-O-Me-m7G(5')ppp (5)G (ARCA)), como mostrado abaixo: o o Oo EX + 4 eo n NR RN | nO & Qd Oo K< 9 . o H H OH OCH3 OH Oo
[0235] O cap ou o análogo de cap podem ser incluídos durante a síntese química ou a transcrição in vitro do gRNA.
[0236] Em linhas semelhantes, a extremidade 5' do gRNA pode não ter um grupo trifosfato 5'. Por exemplo, gRNAs transcritos in vitro podem ser tratados com fosfatase (por exemplo, usando fosfatase alcalina de bezerro intestinal) para remover um grupo 5' trifosfato.
[0237] Outra modificação comum envolve a adição, na extremidade 3' de um gRNA, de uma pluralidade (por exemplo, 1-10, 10-20 ou 25- 200) de resíduos de adenina (A) referidos como um trato poliA. O trato poliA pode ser adicionado a um gRNA durante a síntese química, após a transcrição in vitro usando uma poliadenosina polimerase (por exem- plo, Poli(A)Polimerase E. coli), ou in vivo por meio de uma sequência de poliadenilação, conforme descrito em Maeder.
[0238] Deve-se notar que as modificações aqui descritas podem ser combinadas de qualquer maneira adequada, por exemplo, um gRNA, seja transcrito in vivo a partir de um vetor de DNA, ou gRNA transcrito in vitro, podem incluir um ou ambos de uma estrutura cap 5' ou análogo de cap e um trato poliA 3'.
[0239] Os RNAs guia podem ser modificados em uma ribose U no terminal 3'. Por exemplo, os dois grupos hidroxila terminais da ribose U podem ser oxidados a grupos aldeído e uma abertura concomitante do anel de ribose para proporcionar um nucleosídeo modificado como mos- trado abaixo:
U 7 5d em que "U" pode ser uma uridina não modificada ou modificada.
[0240] A ribose U do terminal 3' pode ser modificada com um fosfato cíclico 2'3', conforme mostrado abaixo:
Ho. U O.
É Oo o
PD em que "U" pode ser uma uridina não modificada ou modificada.
[0241] Os RNAs guia podem conter nucleotídeos 3' que podem ser estabilizados contra a degradação, por exemplo, incorporando um ou mais dos nucleotídeos modificados aqui descritos. Em certas modalida- des, as uridinas podem ser substituídas por uridinas modificadas, por exemplo, uridina 5-(2-amino)propila e uridina 5-bromo, ou por qualquer uma das uridinas modificadas aqui descritas; adenosinas e guanosinas podem ser substituídas por adenosinas e guanosinas modificadas, por exemplo, com modificações na posição 8, por exemplo, guanosina 8- bromo, ou por qualquer uma das adenosinas ou guanosinas modifica- das aqui descritas.
[0242] Em certas modalidades, os ribonucleotídeos modificados com açúcar podem ser incorporados, por exemplo, em que o grupo OH- 2' é substituído por um grupo selecionado de H, -OR, -R (em que R pode ser, por exemplo, alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açú- car), halo, -SH, -SR (em que R pode ser, por exemplo, alquila, cicloal- quila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar), amina (em que amina pode ser, por exemplo NH>; alquilamina, dialquilamina, heterociclila, arila- mina, diarilamina, heteroarilamina, di-heteroarilamina ou aminoácido); ou ciano (-CN). Em certas modalidades, o esqueleto de fosfato pode ser modificado como aqui descrito, por exemplo, com um grupo fosforotio- ato (PhTx). Em certas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos do gRNA podem ser, cada um, independentemente, um nucleotídeo modi- ficado ou não modificado incluindo, mas não se limitando a 2'-açúcar modificado, tal como, 2'-O-metila, 2-O-metoxietila, ou 2'-Fluoro modifi- cado incluindo, por exemplo, 2'-F ou 2'-O-metila, adenosina (A), 2'-F ou
2'-O-metila, citidina (C), 2-F ou 2'-O-metila, uridina (U), 2-F ou 2'-O- metila, timidina (T), 2-F ou 2'-O-metila, guanosina (G), 2-O-metoxietil- 5-metiluridina (Teo), 2-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2':-O-metoxietil-5- metilcitidina (m5Ceo) e quaisquer combinações dos mesmos.
[0243] RNAs guia podem também incluem ácidos nucleicos "blo- queados" (LNA) nos quais o grupo OH 2' pode ser ligado, por exemplo, por uma ponte alquileno C1-6 ou heteroalquileno C1-6, para o carbono 4' do mesmo açúcar ribose. Qualquer porção adequada pode ser usada para fornecer tais pontes, incluindo, sem limitação, pontes de metileno, propileno, éter ou de amino; O-amino (em que amino pode ser, por exemplo, NH>z; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diari- lamino, heteroarilamino, ou di-heteroarilamino, etilenodiamina ou polia- mino) e aminoalcóxi ou O(CH2).-amino (em que amino pode ser, por exemplo, NH>, alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diari- lamino, heteroarilamino, di-heteroarilamino ou, etilenodiamina, ou polia- mino).
[0244] Em certas modalidades, um gRNA pode incluir um nucleotí- deo modificado que é multicíclico (por exemplo, triciclo; e formas "des- bloqueadas", tais como o ácido nucleicoglicol (GNA) (por exemplo, R- GNA ou S-GNA, onde a ribose é substituída por unidades glicol ligadas a ligações fosfodiéster), ácido nucleico treose (TNA, onde a ribose é substituída por a-L-treofuranosil-(3'-2')).
[0245] Geralmente, o gRNAs incluem o grupo de açúcar ribose, que é um anel de 5 membros com um oxigênio. Os gRNAs modificados exemplificativos podem incluir, sem limitação, a substituição do oxigênio na ribose (por exemplo, com enxofre (S), selênio (Se) ou alquileno, tal como, por exemplo, metileno ou etileno); adição de uma ligação dupla (por exemplo, para substituir a ribose por ciclopentenila ou ciclo-hexe- nila); contração do anel da ribose (por exemplo, para formar um anel de 4 membros de ciclobutano ou oxetano); expansão do anel da ribose (por exemplo, para formar um anel de 6 ou 7 membros tendo um carbono ou heteroátomo adicional, tal como por exemplo, anidro-hexitol, altritol, ma- nitol, ciclo-hexanila, ciclo-hexenila e morfolino que também tem um es- queleto de fosforamidato). Embora a maioria das alterações de análo- gos de açúcar estejam localizadas na posição 2', outros sítios são pas- síveis de modificação, incluindo a posição 4'. Em certas modalidades, um gRNA compreende uma modificação 4'-S, 4'-Se ou 4'-C-aminometil- 2'-O-Me.
[0246] Em certas modalidades, nucleotídeos deaza, por exemplo, 7-deaza-adenosina, podem ser incorporados no gRNA. Em certas mo- dalidades, os nucleotídeos O- e N-alquilados, por exemplo, adenosina N6-metila, podem ser incorporados no gRNA. Em certas modalidades, um ou mais ou todos os nucleotídeos em um gRNA são desoxinucleotí- deos.
[0247] Em certas modalidades, os gRNAs, conforme aqui utilizados, podem ser gRNAs modificados ou não modificados. Em certas modali- dades, um gRNA pode incluir uma ou mais modificações. Em certas mo- dalidades, uma ou mais modificações podem incluir uma modificação de ligação de fosforotioato, uma modificação de ligação de fosforoditio- ato (PS2), uma modificação de 2'-O-metila ou suas combinações. Em certas modalidades, a uma ou mais modificações podem estar na extre- midade 5' do gRNA, na extremidade 3' do gRNA, ou combinações dos mesmos.
[0248] Em certas modalidades, uma modificação gRNA pode com- preender uma ou mais modificações de ligação fosforoditioato (PS2).
[0249] Em algumas modalidades, um gRNA usado aqui inclui uma ou mais ou um trecho de bases de ácido desoxirribonucleico (DNA), também aqui referido como uma "extensão de DNA". Em algumas mo- dalidades, um gRNA usado aqui inclui uma extensão de DNA na extre-
midade 5' do gRNA, na extremidade 3' do gRNA ou uma sua combina- ção.
Em certas modalidades, a extensão do DNA pode ter 1,2,3,4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 bases de DNA de comprimento.
Por exemplo, em certas modalidades, a extensão de DNA pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou 25 bases de DNA de comprimento.
Em certas modalidades, a extensão de DNA pode in- cluir uma ou mais bases de DNA selecionadas de adenina (A), guanina (G), citosina (C) ou timina (T). Em certas modalidades, a extensão de DNA inclui as mesmas bases de DNA.
Por exemplo, a extensão do DNA pode incluir um trecho de bases de adenina (A). Em certas modalidades, a extensão de DNA pode incluir um trecho de bases de timina (T). Em certas modalidades, a extensão de DNA inclui uma combinação de di- ferentes bases de DNA.
Em certas modalidades, uma extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada na Tabela 24. Por exemplo, uma extensão de DNA pode compreender uma sequência apresentada em SEQ ID NOs: 1235-1250. Em certas modalidades, um gRNA usado aqui inclui uma extensão de DNA, bem como uma ou mais modificações de ligação de fosforotioato, uma ou mais modificações de ligação de fosforoditioato (PS2), uma ou mais modificações de 2' -O- metila ou suas combinações.
Em certas modalidades, a uma ou mais modificações podem estar na extremidade 5' do gRNA, na extremidade 3' do gRNA, ou combinações dos mesmos.
Em certas modalidades, um gRNA incluindo uma extensão de DNA pode compreender uma sequên- cia apresentada na Tabela 19 que inclui uma extensão de DNA.
Em uma modalidade particular, um gRNA incluindo uma extensão de DNA pode compreender a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051. Em certas modalidades, um gRNA incluindo uma extensão de DNA pode compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1046-1060, 1067, 1068, 1074, 1075, 1078, 1081-1084, 1086-1087, 1089-1090, 1092-1093, 1098-1102 e 1106. Sem desejar ser limitado pela teoria, é contemplado que qualquer extensão de DNA pode ser usada aqui, desde que não hibridize com o ácido nucleico alvo sendo direcionado pelo gRNA e também exiba um aumento na edição no ácido nucleico alvo relativo a um gRNA que não inclui tal extensão de DNA.
[0250] Em algumas modalidades, um gRNA usado aqui inclui uma ou mais ou um trecho de bases de ácido ribonucleico (RNA), também aqui referido como uma "extensão de RNA". Em algumas modalidades, um gRNA usado aqui inclui uma extensão de RNA na extremidade 5' do gRNA, na extremidade 3' do gRNA ou uma sua combinação. Em certas modalidades, a extensão do RNA pode ter 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 bases de RNA de comprimento. Por exemplo, em certas modalidades, a extensão de RNA pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 ou 25 bases de RNA de comprimento. Em certas modalidades, a extensão de RNA pode incluir uma ou mais bases de RNA selecionadas de adenina (r A, guanina (rG), citosina (rC) ou uracila (rU), em que o "r" representa RNA, 2'-hidroxi. Em certas mo- dalidades, a extensão de RNA inclui as mesmas bases de RNA. Por exemplo, a extensão do RNA pode incluir um trecho de bases de ade- nina (rA). Em certas modalidades, a extensão de RNA inclui uma com- binação de diferentes bases de RNA. Em certas modalidades, uma ex-
tensão de RNA pode compreender uma sequência apresentada na Ta- bela 24. Por exemplo, uma extensão de RNA pode compreender uma sequência apresentada em 1231-1234, 1251-1253. Em certas modali- dades, um gRNA usado aqui inclui uma extensão de RNA, bem como uma ou mais modificações de ligação de fosforotioato, uma ou mais mo- dificações de ligação de fosforoditioato (PS2), uma ou mais modifica- ções de 2' -O-metila ou suas combinações. Em certas modalidades, a uma ou mais modificações podem estar na extremidade 5' do gRNA, na extremidade 3' do gRNA, ou combinações dos mesmos. Em certas mo- dalidades, um gRNA incluindo uma extensão de RNA pode compreen- der uma sequência apresentada na Tabela 19 que inclui uma extensão de RNA. gRNAs incluindo uma extensão de RNA na extremidade 5' do gRNA podem compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1042-1045, 1103-1105. gRNAs incluindo uma extensão de RNA na extremidade 3' do gRNA podem compreender uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1070-1075, 1079, 1081, 1098-1100.
[0251] É contemplado que gRNAs aqui utilizados, também pode in- cluir uma extensão de RNa e uma extensão de DNA. Em certas moda- lidades, a extensão de RNA e a extensão de DNA podem estar ambas na extremidade 5' do gRNA, na extremidade 3' do gRNA ou uma com- binação das mesmas. Em certas modalidades, a extensão do RNA está na extremidade 5' do gRNA e a extensão do DNA está na extremidade 3' do gRNA. Em certas modalidades, a extensão do RNA está na extre- midade 3' do gRNA e a extensão do DNA está na extremidade 5' do gRNA.
[0252] Em algumas modalidades, um gRNA que inclui uma modifi- cação de fosforotioato na extremidade 3', bem como uma extensão de DNA na extremidade 5' é complexado com uma nuclease guiada por RNA, por exemplo, Cpf1, para formar um RNP, que é então aplicado para editar uma célula-tronco hematopoiética (HSC) ou uma célula CD34+ ex vivo (isto é, fora do corpo de um indivíduo de quem tal célula é derivada), nos locus HBG.
[0253] Um exemplo de um gRNA, tal como aqui utilizado, compre- ende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051.
Moléculas de gRNA mortas
[0254] Moléculas de RNA (dgRNA) guia mortas de acordo com a presente divulgação incluem moléculas de RNA guia mortas que com- preendem atividade de clivagem reduzida, baixa ou indetectável. As se- quências de domínio de direcionamento de RNAs guia mortos são me- nores em comprimento por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos em comparação com a sequência de domínio de direcionamento de RNAs guia ativos. Em certas modalidades, as moléculas de RNA guia mortas podem compreender um domínio de direcionamento compreendendo nucleotídeos ou menos de comprimento, 14 nucleotídeos ou menos de comprimento, 13 nucleotídeos ou menos de comprimento, 12 nucle- otídeos ou menos de comprimento, ou 11 nucleotídeos ou menos de comprimento. Em algumas modalidades, os RNAs guia mortos são con- figurados de modo que não forneçam um evento de clivagem de nu- clease guiada por RNA. Os RNAs guia mortos podem ser gerados re- movendo a extremidade 5' de uma sequência de domínio de direciona- mento de gRNA, que resulta em uma sequência de domínio de direcio- namento truncada. Por exemplo, se uma sequência de gRNA, configu- rada para fornecer um evento de clivagem (ou seja, 17 nucleotídeos ou mais de comprimento), tem uma sequência de domínio de direciona- mento que tem 20 nucleotídeos de comprimento, um RNA guia morto pode ser criado removendo 5 nucleotídeos da extremidade 5' da se- quência de gRNA. Por exemplo, os dgRNAs usados neste documento podem compreender um domínio de direcionamento estabelecido na Tabela 2 ou Tabela 10 que foi truncado da extremidade 5' da sequência de gRNA e compreende 15 nucleotídeos ou menos de comprimento. Em certas modalidades, o dgRNA pode ser configurado para se ligar a (ou se associar a) uma sequência de ácido nucleico dentro de ou proximal a uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae) a ser editada. Por exemplo, qualquer um dos dgRNAs apresentados na Tabela 10 pode ser aplicado para ligar uma sequência de ácido nucleico proximal à região alvo de 13 nt ou região alvo de caixa CCAAT. Em certas modalidades, proximal a pode denotar a região dentro de 10, 25, 50, 100 ou 200 nucleotídeos de uma região alvo (por exemplo, a região alvo da caixa CCAAT, região alvo 13 nt, sequência alvo do promotor HBG1/2 proximal, e/ou o motivo de liga- ção GATA1 em BCL11Ae). Em certas modalidades, o RNA guia morto não está configurado para recrutar um fator de ação trans exógeno para uma região alvo. Em certas modalidades, o dgRNA é configurado de modo que não forneça um evento de clivagem de DNA quando comple- xado com uma nuclease guiada por RNA. Os versados na técnica apre- ciarão que as moléculas de RNA guia mortas podem ser desenhadas para compreender domínios de direcionamento complementares às re- giões proximais ou dentro de uma região alvo em um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, os RNAs guia mortos compreendem se- quências de domínio de direcionamento que são complementares à ca- deia de transcrição ou cadeia de não transcrição de DNA de cadeia du- pla. Os dgRNAs aqui podem incluir modificações nas extremidades 5' e 3' do dgRNA conforme descrito para RNAs guia na seção "modificações de gRNA'" aqui. Por exemplo, em certas modalidades, os RNAs guia mortos podem incluir um análogo de cap anti-reverso (ARCA) na extre- midade 5' do RNA. Em certas modalidades, os dgRNAs podem incluir uma cauda poliA na extremidade 3'.
[0255] Em certas modalidades, o uso de um RNA guia morto com os sistemas e métodos de edição do genoma aqui divulgados pode au- mentar o nível de edição total de um RNA guia ativo. Em certas modali- dades, o uso de um RNA guia morto com os sistemas de edição de genoma divulgados neste documento e seus métodos podem aumentar a frequência de deleções. Em certas modalidades, as deleções podem se estender do sítio de corte do RNA guia ativo em direção ao sítio de ligação do RNA guia morto. Desta forma, o RNA guia morto pode alterar a direcionalidade de um RNA guia ativo e orientar a edição em direção a uma região alvo desejada.
[0256] Conforme usado neste documento, os termos "gRNA morto" e "gRNA truncado" são usados indistintamente.
Nucleases guiadas por RNA
[0257] As nucleases guiadas por RNA de acordo com a presente divulgação incluem, mas não estão limitadas a, nucleases CRISPR de Classe 2 de ocorrência natural, tal como Cas9 e Cpf1, bem como outras nucleases derivadas ou obtidas a partir das mesmas. Também foi de- monstrado que certas nucleases guiadas por RNA, tal como Cas9, tam- bém têm atividade helicase que lhes permite desenrolar o ácido nu- cleico. Em certas modalidades, as helicases guiadas por RNA de acordo com a presente divulgação podem ser qualquer uma das nucleases de RNA aqui descritas e supra na seção intitulada "nucleases guiadas por RNA". Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA não está configurada para recrutar um fator de ação trans exógeno para uma re- gião alvo. Em certas modalidades, uma helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA configurada para não ter atividade de nuclease. Por exemplo, em certas modalidades, uma helicase guiada por RNA pode ser uma nuclease guiada por RNA cataliticamente inativa que não possui atividade de nuclease, mas ainda retém sua atividade de helicase. Em certas modalidades, uma nuclease guiada por RNA pode ser mutada para abolir sua atividade de nuclease (por exemplo,
Cas9 morta), criando uma nuclease guiada por RNA cataliticamente ina- tiva que é incapaz de clivar o ácido nucleico, mas que ainda pode de- senrolar o DNA. Em certas modalidades, uma helicase guiada por RNA pode ser complexada com qualquer um dos RNAs guia mortos, con- forme descrito neste documento. Por exemplo, uma helicase guiada por RNA cataliticamente ativa (por exemplo, Cas9 ou Cpf1) pode formar um complexo RNP com um RNA guia morto, resultando em um RNP morto cataliticamente inativo (RNP). Em certas modalidades, uma helicase guiada por RNA cataliticamente inativa (por exemplo, Cas9 morta) e um RNA guia morto podem formar um dRNP. Esses dRNPs, embora inca- pazes de fornecer um evento de clivagem, ainda retêm sua atividade de helicase, que é importante para o desenrolamento do ácido nucleico.
[0258] Em termos funcionais, nucleases guiadas por RNA são defi- nidas como aquelas nucleases que: (a) interagem com (por exemplo, complexam com) um gRNA; e (b) juntamente com o gRNA, associam e opcionalmente clivam ou modificam uma região alvo de um DNA que inclui (i) uma sequência complementar ao domínio de direcionamento do gRNA e, opcionalmente, (ii) uma sequência adicional referida como um "motivo adjacente de protoespaçador" ou "PAM", que é descrito em mais detalhes abaixo. Como os exemplos a seguir irão ilustrar, nuclea- ses guiadas por RNA podem ser definidas, em termos gerais, por sua especificidade de PAM e atividade de clivagem, embora possam existir variações entre nucleases guiadas por RNA individuais que comparti- lham a mesma especificidade PAM ou atividade de clivagem. Os versa- dos na técnica apreciarão que alguns aspectos da presente divulgação referem-se a sistemas, métodos e composições que podem ser imple- mentados usando qualquer nuclease guiada por RNA adequada tendo uma certa especificidade de PAM e/ou atividade de clivagem. Por este motivo, a menos que especificado de outra forma, o termo nuclease gui- ada por RNA deve ser entendido como um termo genérico e não limitado a qualquer tipo particular (por exemplo, Cas9 vs. Cpf1), espécies (por exemplo, S. pyogenes vs. S. aureus) ou variação (por exemplo, compri- mento total vs. truncado ou dividido; especificidade de PAM de ocorrên- cia natural vs. especificidade de PAM manipulada, etc.) de nuclease gui- ada por RNA.
[0259] Várias nucleases guiadas por RNA podem exigir diferentes relações sequenciais entre PAMs e protoespaçadores. Em geral, Cas9s reconhecem sequências PAM que estão a 3' do protoespaçador. Cpf1, por outro lado, geralmente reconhece as sequências PAM que estão 5' do protoespaçador.
[0260] Além de reconhecer orientações sequenciais específicas de PAMs e protoespaçadores, as nucleases guiadas por RNA também po- dem reconhecer sequências PAM específicas. Cas9 de S. aureus, por exemplo, reconhece uma sequência PAM de NNGRRT ou NNGRRV, em que os resíduos N estão imediatamente a 3' da região reconhecida pelo domínio de direcionamento de gRNA. Cas9 de S. pyogenes reco- nhece sequências NGG PAM. E F. novicida Cpf1 reconhece a sequên- cia TTN PAM. As sequências PAM foram identificadas para uma varie- dade de nucleases guiadas por RNA, e uma estratégia para identificar novas sequências PAM foi descrita por Shmakov 2015. Também deve ser observado que nucleases guiadas por RNA manipuladas podem ter especificidades PAM que diferem das especificidades PAM de molécu- las de referência (por exemplo, no caso de uma nuclease guiada por RNA manipulada, a molécula de referência pode ser a variante de ocor- rência natural a partir da qual a nuclease guiada por RNA é derivada, ou a variante de ocorrência natural com a maior homologia de sequência de aminoácidos com a nuclease guiada por RNA manipulada). Exem- plos de PAMs podem ser usados de acordo com as modalidades aqui incluem, sem limitação, as sequências estabelecidas em SEQ ID NOs: 199-205.
[0261] Além de sua especificidade PAM, nucleases guiadas por RNA podem ser caracterizadas por sua atividade de clivagem de DNA: nucleases guiadas por RNA de ocorrência natural normalmente formam DSBs em ácidos nucleicos alvo, mas variantes manipuladas foram pro- duzidas que geram apenas SSBs (discutido acima e em Ran & Hsu 2013, incorporado por referência neste documento), ou que não cortam de todo. Cas9
[0262] As estruturas cristalinas foram determinadas para Cas9 de S. pyogenes (Jinek 2014) e para Cas9 de S. aureus em complexo com um RNA guia unimolecular e um DNA alvo (Nishimasu 2014; Anders 2014; e Nishimasu 2015).
[0263] Uma proteína Cas9 de ocorrência natural compreende dois lóbulos: um lóbulo de reconhecimento (REC) e um lóbulo de nuclease (NUC); cada um dos quais compreende domínios estruturais e/ou funci- onais particulares. O lóbulo REC compreende um domínio de hélice de ponte rico em arginina (BH) e pelo menos um domínio REC (por exem- plo, um domínio REC1 e, opcionalmente, um domínio REC2). O lóbulo REC não compartilha similaridade estrutural com outras proteínas co- nhecidas, indicando que é um domínio funcional único. Embora não de- sejando se limitar a qualquer teoria, as análises mutacionais sugerem papéis funcionais específicos para os domínios BH e REC: o domínio BH parece desempenhar um papel no reconhecimento de gRNA:DNA, enquanto o domínio REC parece interagir com o duplex repetição:anti- repetição do gRNA e mediar a formação do complexo Cas9/gRNA.
[0264] O lóbulo NUC compreende um domínio RuvC, um domínio HNH e um domínio que interage com PAM (PI). O domínio RuvC com- partilha similaridade estrutural com os membros da superfamília da in- tegrase retroviral e cliva a cadeia não complementar (isto é, inferior) do ácido nucleico alvo. Ele poderá ser formado a partir de dois ou mais motivos RuvC divididos (tal como RuvC |, RuvCll e RuvClll em S. Pyo- genes e S. Aureus). O domínio HNH, entretanto, é estruturalmente se- melhante aos motivos da endonuclease HNN e cliva a cadeia comple- mentar (ou seja, superior) do ácido nucleico alvo. O domínio PI, como o próprio nome sugere, contribui para a especificidade do PAM. Exem- plos de sequências polipeptídicas que codificam domínios Cas9 seme- lhantes a RuvC e Cas9 semelhantes a HNH que podem ser usados de acordo com as modalidades deste documento são apresentados em SEQ ID NOs: 15-23, 52-123 (domínios semelhantes a RuvC) e SEQ ID NOs: 24-28, 124-198 (domínios semelhantes a HNH).
[0265] Embora certas funções de Cas9 estejam ligadas (mas não necessariamente totalmente determinadas por) aos domínios especiífi- cos estabelecidos acima, essas e outras funções podem ser mediadas ou influenciadas por outros domínios Cas9, ou por vários domínios em qualquer lóbulo. Por exemplo, em Cas9 de S. pyogenes, conforme des- crito em Nishimasu 2014, o duplex repetição:anti-repetição do gRNA cai em um sulco entre os lóbulos REC e NUC, e os nucleotídeos no duplex interagem com os aminoácidos nos domínios BH, Pl e REC. Alguns nu- cleotídeos na estrutura do primeiro laço de haste também interagem com aminoácidos em vários domínios (PI, BH e REC1), assim como al- guns nucleotídeos no segundo e terceiro laço de haste (domínios RuvC e PI). Exemplos de sequências polipeptídicas que codificam moléculas Cas9 que podem ser utilizadas de acordo com as modalidades aqui apresentadas são apresentadas em SEQ ID NOs: 1-2, 4-6, 12 e 14. Cpf1
[0266] A estrutura cristalina de Cpf1 de Acidaminococcus sp. em complexo com crRNA e um alvo de DNA de cadeia dupla (ds) incluindo uma sequência TTTN PAM foi resolvido por Yamano 2016 (incorporado por referência aqui). Cpf1, como Cas9, tem dois lóbulos: um lóbulo REC
(reconhecimento) e um lóbulo NUC (nuclease). O lóbulo REC inclui do- mínios REC1 e REC2, que não têm semelhança com quaisquer estru- turas de proteínas conhecidas. O lóbulo NUC, entretanto, inclui três do- mínios RuvC (RuvC-l, -Il e -1l1l) e um domínio BH. No entanto, em con- traste com Cas9, o lóbulo REC Cpf1 carece de um domínio HNH e inclui outros domínios que também não têm semelhança com estruturas de proteínas conhecidas: um domínio PI estruturalmente único, três domí- nios Wedge (WED) (WED-I, -1l e - III), e um domínio de nuclease (Nuc).
[0267] Embora Cas9 e Cpf1 de partilhem semelhanças de estrutura e função, deve ser apreciado que certas atividades Cpf1 são mediadas pelos domínios estruturais que não são análogos aos quaisquer domí- nios Cas9. Por exemplo, a clivagem da cadeia complementar do DNA alvo parece ser mediada pelo domínio Nuc, que difere sequencialmente e espacialmente do domínio de HNH de Cas9. Além disso, a porção não direcionamento de Cpf1 gRNA (a alça) adopta uma estrutura pseudo- nó, em vez de uma estrutura em laço de haste formada pelo duplex re- petição:anti-repetição em Cas9 gRNAs.
[0268] Em certas modalidades, uma proteína Cpf1i pode ser uma proteína Cpf1 modificada. Em certas modalidades, uma proteína Cpf1 modificada pode incluir uma ou mais modificações. Em certas modali- dades, as modificações podem ser, sem limitação, uma ou mais muta- ções em uma sequência de nucleotídeos Cpf1 ou sequência de amino- ácidos Cpf1, uma ou mais sequências adicionais, tal como um marcador de His ou um sinal de localização nuclear (NLS), ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um Cpf1 modificado também pode ser referido neste documento como uma variante de Cpf1.
[0269] Em certas modalidades, a proteína Cpf1 pode ser derivada de uma proteína Cpf1 selecionada a partir do grupo que consiste em proteína Cpf1 da cepa V3L6 de daminococcus sp. (AsCpf1), proteína Cpf1 da bactéria Lachnospiraceae ND2006 (LbCpfi) e bactéria
Lachnospiraceae MA2020 (Lb2Cpf1). Em certas modalidades, a prote- ína Cpf1 pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs. 1016-1018, tendo as sequências de ácido nucleico com códons otimizados de SEQ ID NOs. 1019-1021, respecti- vamente.
[0270] Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, mas não como limitação, as sequências NLS úteis em conexão com os mé- todos e composições aqui divulgados compreenderão uma sequência de aminoácidos capaz de facilitar a importação de proteínas para o nú- cleo da célula. As sequências NLS úteis em conexão com os métodos e composições aqui divulgados são conhecidas na técnica. Exemplos de tais sequências NLS incluem a nucleoplasmina NLS com a sequên- cia de aminoácidos: KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO. 1006) e NLS do vírus símio 40 "SV40" com a sequência de aminoácidos P KKKRKV (SEQ ID NO. 1007).
[0271] Em certas modalidades, a sequência NLS da proteína Cpf1 modificada é posicionada no ou próximo ao terminal C da sequência da proteína Cpf1. Por exemplo, mas não como limitação, a proteína Cpf1 modificada pode ser selecionada a partir do seguinte: His-ASCpf1-nNLS (SEQ ID NO. 1000); His-AsCpf1-sNLS (SEQ ID NO. 1008) e His-As- Cpf1-sNLS-sNLS (SEQ ID NO. 1001), em que "His" refere-se a uma se- quência de purificação de seis histidinas, "AsCpf1" refere-se à sequên- cia da proteína Cpf1 Acidaminococcus sp.,"nNLS" refere-se à nucleo- plasmina NLS e "sNLS" refere-se a SV40 NLS. Permutações adicionais da identidade e posições C-terminal de sequências NLS, por exemplo, anexar duas ou mais sequências nNLS ou combinações de nNLS e se- quências sNLS (ou outras sequências NLS), bem como sequências com e sem sequências de purificação, por exemplo, sequências de seis his- tidinas, estão dentro do escopo da matéria divulgada instantaneamente.
[0272] Em certas modalidades, a sequência NLS da proteína Cpf1 modificada pode ser posicionada no ou próximo ao terminal N da se- quência da proteína Cpf1 Por exemplo, mas não como limitação, a pro- teína Cpf1 modificada pode ser selecionada a partir do seguinte: His- SNLS-AsCpf1 (SEQ ID NO. 1009), His-sNLS-sNLS-AsCpf1 (SEQ ID NO. 1010), e SNLS-SNLS-AsCpf1 (SEQ ID NO. 1011). Permutações adicio- nais da identidade e posições N-terminal de sequências NLS, por exem- plo, anexar duas ou mais sequências nNLS ou combinações de nNLS e sequências sNLS (ou outras sequências NLS), bem como sequências com e sem sequências de purificação, por exemplo, sequências de seis histidinas, estão dentro do escopo da matéria divulgada instantanea- mente.
[0273] Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender sequências NLS posicionadas no ou próximo a ambos os terminais N e C da sequência da proteína Cpf1. Por exemplo, mas não como limitação, a proteína Cpf1 modificada pode ser selecionada a par- tir do seguinte: His-sSNLS-AsCpf1-sNLS (SEQ ID NO. 1012) e His-sNLS- SNLS-AsCpf1-sNLS-sNLS (SEQ ID NO. 1013). Permutações adicionais da identidade e posições N-terminal/C-terminal de sequências NLS, por exemplo, anexar duas ou mais sequências nNLS ou combinações de nNNLS e sequências sSNLS (ou outras sequências NLS) às posições N- terminal/C-terminal, bem como sequências com e sem sequências de purificação, por exemplo, sequências de seis histidinas, estão dentro do escopo da matéria divulgada instantaneamente.
[0274] Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender uma alteração (por exemplo, uma deleção ou substitui- ção) em um ou mais resíduos de cisteína da sequência da proteína Cpf1. Por exemplo, mas não como limitação, a proteína Cpf1 modifi- cada pode compreender uma alteração em uma posição selecionada a partir do grupo que consiste em: C65, C205, C334, C379, C608, C674,
C1025 e C1248. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender uma substituição de um ou mais resíduos de cisteína por uma serina ou alanina. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 mo- dificada pode compreender uma alteração selecionada do grupo que consiste em: C65S, C205S, C334S, C379S, C608S, C674S, C10258S e C12488S. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode com- preender uma alteração selecionada do grupo que consiste em: C65A, C205A, C334A, C379A, C608A, C674A, C1025A e C1248A. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender alterações nas posições C334 e C674 ou C334, C379 e C674. Em certas modali- dades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender as seguintes al- terações: C334S e C674S, ou C334S, C379S e C674S. Em certas mo- dalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender as seguintes alterações: C334A e C674A, ou C334A, C379A e C674A. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender uma ou mais alterações de resíduos de cisteína, bem como a introdução de uma ou mais sequências NLS, por exemplo, His-AsCpf1-nNLS Cys-menos (SEQ ID NO. 1014) ou His-AsCpf1-nNLS Cys-menos(SEQ ID NO. 1015). Em várias modalidades, a proteína Cpf1l compreendendo uma deleção ou substituição em um ou mais resíduos de cisteína exibe agre- gação reduzida.
[0275] Em certas modalidades, outras proteínas Cpf1 modificadas conhecidas na técnica podem ser usadas com os métodos e sistemas aqui descritos. Por exemplo, em certas modalidades, a Cpf1 modificada pode ser Cpf1 contendo a mutação S542R/K548V/N552R ("Cpf1 RVR"). Demonstrou-se que Cpf1 RVR cliva sítios alvo com um PAM TATV. Em certas modalidades, Cpf1 modificada pode ser Cpf1 contendo a muta- ção S542R/K607R ("Cpf1 RR"). Foi demonstrado que Cpf1 RR cliva sí- tios alvo com um PAM TYCV/CCCC.
[0276] Em algumas modalidades, uma variante Cpf1 é usada aqui,
em que a variante Cpf1 compreende mutações em um ou mais resíduos de AsCpf1 (Acidaminococcus sp. BV3L6) selecionados do grupo que consiste em 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 34, 36, 39, 40, 43, 46, 47, 50, 54, 57, 58, 111, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 676, 679, 680, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 707, 711, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 739, 765, 768, 769, 773, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876, 877, 878, 879, 880, 881, 882, 883, 884, ou 1048 ou a posição correspondente de um ortólogo, homólogo ou variante de AsCpf1.
[0277] Em certas modalidades, uma variante Cpf1, tal como aqui utilizada, pode incluir qualquer uma das proteínas Cpf1 descritas na Pu- blicação Internacional Número WO 2017/184768 A1 por Zhang et al. ("Publicação 768"), que é aqui incorporada por referência.
[0278] Em certas modalidades, uma proteína Cpf1 modificada (tam- bém referida como uma variante Cpf1) usada aqui pode ser codificada por qualquer uma das sequências estabelecidas em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências po- lipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências po- linucleotídicas Cpf1). A Tabela 20 apresenta sequências de aminoáci- dos e nucleotídeos Cpf1i variantes exemplificativas. Estas sequências são apresentadas na Fig. 62, que detalha as posições das sequências de seis histidinas (letras sublinhadas) e sequências NLS (letras a ne- grito). Permutações adicionais da identidade e posições N-terminal/C- terminal de sequências NLS, por exemplo, anexar duas ou mais sequên- cias nNLS ou combinações de nNLS e sequências sNLS (ou outras se- quências NLS) às posições N-terminal/C-terminal, bem como sequên- cias com e sem sequências de purificação, por exemplo, sequências de seis histidinas, estão dentro do escopo da matéria divulgada instanta- neamente.
[0279] Em certas modalidades, qualquer uma das proteínas Cpf1 ou proteínas Cpf1 modificadas aqui divulgadas podem ser complexadas com um ou mais gRNA compreendendo o domínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs 1002 e/ou 1004 para alterar uma região alvo de caixa CCAAT. Em certas modalidades, qualquer uma das pro- teínas Cpf1 ou proteínas Cpf1 modificadas aqui reveladas podem ser complexadas com um ou mais gRNA compreendendo uma sequência estabelecida na Tabela 18 ou Tabela 19. Em certas modalidades, a pro- teína Cpf1 modificada pode ser His-AsCpf1-nNLS (SEQ ID NO: 1000) ou His-AsCpf1-sNLS-sNLS (SEQ ID NO:1001). Em certas modalidades, uma proteína Cpf1 modificada usada aqui pode ser codificada por qual- quer uma das sequências estabelecidas em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008-1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências polipeptí- dicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências polinu- cleotídicas Cpf1). Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode compreender a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097. Modificações de nucleases quiadas por RNA
[0280] As nucleases guiadas por RNA descritas acima têm ativida- des e propriedades que podem ser úteis em uma variedade de aplica- ções, mas o versado na técnica apreciará que nucleases guiadas por RNA também podem ser modificadas em certos casos, para alterar a atividade de clivagem, especificidade de PAM, ou outros recursos es- truturais ou funcionais.
[0281] Voltando primeiro para as modificações que alteram a ativi- dade de clivagem, as mutações que reduzem ou eliminam a atividade dos domínios dentro do lóbulo NUC foram descritas acima. Mutações exemplificativas que podem ser feitas nos domínios RuvC, no domínio Cas9 HNH ou no domínio Cpf1 Nuc são descritas em Ran & Hsu 2013 e Yamano 2016, bem como em Cotta-Ramusino. Em geral, as muta- ções que reduzem ou eliminam a atividade em um dos dois domínios de nuclease resultam em nucleases guiadas por RNA com atividade de nickase, mas deve-se notar que o tipo de atividade de nickase varia de- pendendo de qual domínio está inativado. Como um exemplo, a inativa- ção de um domínio RuvC de um Cas9 resultará em uma nickase que cliva a cadeia complementar ou superior conforme mostrado abaixo (onde C denota o sítio de clivagem).
[0282] Por outro lado, a inativação de um domínio Cas9 HNH resulta em uma nickase que cliva a cadeia inferior ou não complementar.
[0283] As modificações da especificidade de PAM em relação às moléculas de referência Cas9 de ocorrência natural foram descritas por Kleinstiver et al. para S. pyogenes (Kleinstiver 2015 a) e S. aureus (Kleinstiver 2015b). Kleinstiver et al. também descreveram modificações que melhoram a fidelidade de direcionamento de Cas9 (Kleinstiver 2016). Cada uma dessas referências é incorporada aqui por referência.
[0284] Nucleases guiadas por RNA foram divididas em duas ou mais partes, conforme descrito por Zetsche 2015 e Fine 2015 (ambas aqui incorporado por referência).
[0285] As nucleases guiadas por RNA podem ser, em certas moda- lidades, com tamanho otimizado ou truncadas, por exemplo, por meio de uma ou mais deleções que reduzem o tamanho da nuclease, embora ainda retendo a associação de gRNA, o reconhecimento de alvo e PAM e as atividades de clivagem. Em certas modalidades, as nucleases gui- adas por RNA são ligadas, covalentemente ou não covalentemente, a outro polipeptídeo, nucleotídeo ou outra estrutura, opcionalmente por meio de um ligante. Nucleases e ligantes ligados exemplificativos são descritos por Guilinger 2014, incorporados neste documento por refe- rência para todos os efeitos.
[0286] As nucleases guiadas por RNA também incluem opcional- mente um marcador, tal como, mas não se limitando a, um sinal de lo- calização nuclear para facilitar o movimento da proteína nuclease gui- ada por RNA para o núcleo. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode incorporar sinais de localização nuclear C- e/ou N-termi- nais. As sequências de localização nuclear são conhecidas na técnica e são descritas em Maeder e em outros lugares.
[0287] A lista de modificações anterior se destina a ser exemplifica- tiva por natureza, e o versado na técnica apreciará, em vista da presente divulgação, que outras modificações podem ser possíveis ou desejáveis em certas aplicações. Por questões de brevidade, portanto, sistemas, métodos e composições exemplificativas da presente divulgação são apresentados com referência a nucleases guiadas por RNA particula- res, mas deve ser entendido que as nucleases guiadas por RNA usadas podem ser modificadas de maneiras que não alteram seus princípios operacionais. Tais modificações estão dentro do escopo da presente di- vulgação. Ácidos nucleicos que codificam nucleases guiadas por RNA
[0288] Os ácidos nucléicos que codificam nucleases guiadas por RNA, por exemplo, Cas9, Cpf1 ou seus fragmentos funcionais, são for- necidos neste documento. Exemplos de sequências de ácido nucleico que codificam moléculas Cas9 que podem ser usadas de acordo com as modalidades aqui descritas são apresentadas em SEQ ID NOs: 3, 7-
11,13. Ácidos nucleicos exemplificativos que codificam nucleases gui- adas por RNA foram descritos anteriormente (ver, por exemplo, Cong 2013; Wang 2013; Mali 2013; Jinek 2012).
[0289] Em alguns casos, um ácido nucleico que codifica uma nu- clease guiada por RNA pode ser uma sequência de ácido nucleico sin- tética. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico sintética pode ser qui- micamente modificada. Em certas modalidades, um mRNA que codifica uma nuclease guiada por RNA terá uma ou mais (por exemplo, todas) das seguintes propriedades: pode ser recoberto; poliadenilado; e subs- tituído com 5-metilcitidina e/ou pseudouridina.
[0290] As sequências de ácido nucléico sintéticas também podem ser códon otimizado, por exemplo, pelo menos um códon não comum ou códon menos comum foi substituído por um códon comum. Por exemplo, o ácido nucleico sintético pode dirigir a síntese de um mMRNA mensageiro otimizado, por exemplo, otimizado para expressão num sis- tema de expressão de mamífero, por exemplo, aqui descrito. Exemplos de sequências de codificação de Cas9 com códon otimizado são apre- sentados em Cotta-Ramusino.
[0291] Além disso, ou alternativamente, um ácido nucleico que co- difica uma nuclease guiada por RNA pode compreender uma sequência de localização nuclear (NLS). As sequências de localização nuclear são conhecidas na técnica. Análise Funcional de Moléculas Candidatas
[0292] Nucleases candidatas guiadas por RNA, gRNAs e seus com- plexos, podem ser avaliados por métodos padrão conhecidos na téc- nica. Ver, por exemplo, Cotta-Ramusino. A estabilidade dos complexos RNP pode ser avaliada por fluorimetria de varredura diferencial, con- forme descrito abaixo. Fluorimetria de varredura diferencial (DSF)
[0293] A termoestabilidade de complexos de ribonucleoproteína
(RNP) compreendendo gRNAs e nucleases guiadas por RNA pode ser medida via DSF. A técnica DSF mede a termoestabilidade de uma pro- teína, que pode aumentar em condições favoráveis, tal como a adição de uma molécula de RNA de ligação, por exemplo, um gRNA.
[0294] Um ensaio DSF pode ser realizado de acordo com qualquer protocolo adequado e pode ser aplicado em qualquer configuração ade- quada, incluindo, sem limitação (a) o teste de diferentes condições (por exemplo, diferentes razões estequiométricas de gRNA: proteína nu- clease guiada por RNA, diferentes soluções tampão, etc.) para identifi- car as condições ideais para a formação de RNP; e (b) testar modifica- ções (por exemplo, modificações químicas, alterações de sequência, etc.) de uma nuclease guiada por RNA e/ou um gRNA para identificar aquelas modificações que melhoram a formação ou estabilidade de RNP. Uma leitura de um ensaio DSF é uma mudança na temperatura de fusão do complexo RNP; um deslocamento relativamente alto sugere que o complexo RNP é mais estável (e pode, assim, ter maior atividade ou cinética de formação mais favorável, cinética de degradação ou outra característica funcional) em relação a um complexo RNP de referência caracterizado por uma mudança inferior. Quando o ensaio DSF é im- plantado como uma ferramenta de rastreamento, uma mudança de tem- peratura de fusão limite pode ser especificada, de modo que o resultado seja um ou mais RNPs tendo uma mudança de temperatura de fusão igual ou acima do limite. Por exemplo, o limite pode ser 5-10 ºC (por exemplo, 5º, 6º,7º,8º,9º,10º) ou mais, e o resultado pode ser um ou mais RNPs caracterizados por uma mudança de temperatura de fu- são maior ou igual ao limite.
[0295] Dois exemplos não limitativos de condições de ensaio DSF são apresentados abaixo:
[0296] Para determinar a melhor solução para formar complexos RNP, uma concentração fixa (por exemplo, 2 uM) de Cas9 em água +
10x SYPRO Orange (Life Technologies catttS-6650) é dispensada em uma placa de 384 poços. Uma quantidade equimolar de gRNA diluída em soluções com pH e sal variados é então adicionada. Depois de in- cubar em temperatura ambiente por 10' e breve centrifugação para re- mover quaisquer bolhas, um termociclador Bio-Rad CFX384'Y Real- Time System C1000 Touch'" com o software Bio-Rad CFX Manager é usado para executar um gradiente de 20 ºC para 90 ºC com um aumento de 1 ºC na temperatura a cada 10 segundos.
[0297] O segundo ensaio consiste em misturar várias concentra- ções de gRNA com concentração fixa (por exemplo, 2 uM) de Cas9 em tampão ideal do ensaio 1 acima e incubar (por exemplo, à temperatura ambiente por 10') em uma placa de 384 poços. Um volume igual de tampão ideal + 10x SYPRO Orange& (Life Technologies cattS-6650) é adicionado e a placa selada com adesivo Microseal& B (MSB-1001). Após breve centrifugação para remover quaisquer bolhas, um termoci- clador Bio-Rad CFX384'7Y Real-Time System C1000 Touch'"" com o software Bio-Rad CFX Manager é usado para executar um gradiente de ºC para 90 ºC com um aumento de 1 ºC na temperatura a cada 10 segundos. Estratégias de edição de genoma
[0298] Os sistemas de edição de genoma descritos acima são usa- dos, em várias modalidades da presente divulgação, para gerar edições em (ou seja, para alterar) regiões alvo de DNA dentro ou obtidas de uma célula. Várias estratégias são descritas neste documento para gerar edi- ções particulares, e essas estratégias são geralmente descritas em ter- mos do resultado de reparação desejado, o número e o posicionamento de edições individuais (por exemplo, SSBs ou DSBs) e os sítios alvo de tais edições.
[0299] Estratégias de edição de genoma que envolvem a formação de SSBs ou DSBs são caracterizadas por resultados de reparação, in- cluindo: (a) deleção de toda ou parte de uma região-alvo; (b) inserção ou substituição de toda ou parte de uma região-alvo; ou (c) interrupção total ou parcial de uma região alvo. Este agrupamento não se destina a ser limitativo ou vinculativo a qualquer teoria ou modelo em particular, e é oferecido apenas para economia de apresentação. Os versados na técnica apreciarão que os resultados listados não são mutuamente ex- clusivos e que algumas reparações podem resultar em outros resulta- dos. A descrição de uma estratégia ou método de edição específico não deve ser entendida como exigindo um resultado de reparação especí- fico, a menos que especificado de outra forma.
[0300] A substituição de uma região alvo geralmente envolve a substituição de toda ou parte da sequência existente dentro da região alvo por uma sequência homóloga, por exemplo, por meio de correção genética ou conversão genética, dois resultados de reparação que são mediados por vias de HDR. HDR é promovido pelo uso de um modelo de doador, que pode ser de cadeia simples ou dupla, conforme descrito em mais detalhes abaixo. Os modelos de cadeia simples ou dupla po- dem ser exógenos, caso em que promoverão a correção do gene, ou podem ser endógenos (por exemplo, uma sequência homóloga dentro do genoma celular), para promover a conversão do gene. Os modelos exógenos podem ter saliências assimétricas (ou seja, a parte do modelo que é complementar ao sítio de DSB pode ser deslocada em uma dire- ção 3' ou 5', em vez de ser centralizada dentro do modelo doador), por exemplo, conforme descrito por Richardson 2016 (incorporado por refe- rência aqui). Nos casos em que o modelo é de cadeia simples, ele pode corresponder à cadeia complementar (superior) ou não complementar (inferior) da região alvo.
[0301] A conversão e a correção de genes são facilitadas, em al- guns casos, pela formação de um ou mais cortes em ou em torno da região alvo, conforme descrito em Ran & Hsu 2013 e Cotta-Ramusino. Em alguns casos, uma estratégia de dupla nickase é usada para formar duas SSBs de deslocamento que, por sua vez, formam uma única DSB com uma saliência (por exemplo, uma saliência em 5').
[0302] A interrupção e/ou deleção de toda ou parte de uma sequên- cia alvo pode ser alcançada por uma variedade de resultados de repa- ração. Como um exemplo, uma sequência pode ser excluída ao gerar simultaneamente duas ou mais DSBs que flanqueiam uma região alvo, que é então excisada quando as DSBs são reparadas, conforme des- crito em Maeder para a mutação LCA10. Como outro exemplo, uma se- quência pode ser interrompida por uma deleção gerada pela formação de uma quebra de cadeia dupla com saliências de cadeia simples, se- guido por processamento exonucleolítico das saliências antes da repa- ração.
[0303] Um subconjunto específico de interrupções de sequência alvo é mediado pela formação de um indel dentro da sequência alvo, onde o resultado da reparação é tipicamente mediado por vias NHEJ (incluindo AIt-NHEJ). NHEJ é referido como uma via de reparação "pro- pensa a erro" por causa de sua associação com mutações InDel. Em alguns casos, no entanto, uma DSB é reparada por NHEJ sem alteração da sequência em torno dela (uma reparação denominada "perfeita" ou "sem cicatriz"); isso geralmente requer que as duas extremidades da DSB estejam perfeitamente ligadas. Enquanto isso, pensa-se que Indels surgem do processamento enzimático de extremidades livres de DNA antes de serem ligadas, o que adiciona e/ou remove nucleotídeos de uma ou ambas as cadeias de uma ou ambas as extremidades livres.
[0304] Como o processamento enzimático de extremidades de DSB livres pode ser de natureza estocástica, as mutações indel tendem a ser variáveis, ocorrendo ao longo de uma distribuição e podem ser influen- ciadas por uma variedade de fatores, incluindo o sítio alvo específico, o tipo de célula usado, a estratégia de edição genoma usado, etc. Mesmo assim, é possível traçar generalizações limitadas sobre a formação do indel: as deleções formadas pelo reparação de uma única DSB estão mais comumente na gama de 1-50 pb, mas podem atingir mais de 100- 200 pb. As inserções formadas pela reparação de uma única DSB ten- dem a ser mais curtas e frequentemente incluem duplicações curtas da sequência imediatamente em torno do sítio de quebra. No entanto, é possível obter grandes inserções e, nestes casos, a sequência inserida foi muitas vezes atribuída a outras regiões do genoma ou ao DNA plas- mídico presente nas células.
[0305] Mutações Indel - e sistemas de edição de genoma configu- rados para produzir indels - são úteis para interromper sequências alvo, por exemplo, quando a geração de uma sequência final específica não é necessária e/ou onde uma mutação de deslocamento de quadro seria tolerada. Eles também podem ser úteis em cenários onde sequências particulares são preferidas, na medida em que certas sequências dese- jadas tendem a ocorrer preferencialmente a partir da reparação de uma SSB ou DSB em um determinado sítio. As mutações Indel também são uma ferramenta útil para avaliar ou rastrear a atividade de sistemas de edição de genoma específicos e seus componentes. Nessas e em ou- tras configurações, os indels podem ser caracterizados por (a) suas fre- quências relativas e absolutas nos genomas de células em contato com sistemas de edição de genoma e (b) a distribuição de diferenças numé- ricas em relação à sequência não editada, por exemplo, + 1, + 2, 3 t, etc. Como um exemplo, em uma configuração de localização de lide- rança, vários gRNAs podem ser rastreados para identificar aqueles gRNAs que mais eficientemente conduzem o corte em um sítio alvo com base em uma leitura indel sob condições controladas. Guias que produ- zem indels em ou acima de uma frequência limite, ou que produzem uma distribuição particular de indels, podem ser selecionados para es- tudo e desenvolvimento posterior. A frequência e distribuição de Indel também podem ser úteis como uma leitura para avaliar diferentes im- plementações de sistema de edição de genoma ou formulações e mé- todos de entrega, por exemplo, mantendo o gRNA constante e variando certas outras condições de reação ou métodos de entrega. Estratégias Multiplex
[0306] Sistemas de edição de genoma de acordo com esta divulga- ção podem também ser aplicados para edição de gene multiplex para gerar dois ou mais LAP, quer no mesmo locus ou em loci diferentes. Qualquer uma das nucleases guiadas por RNA e gRNAs divulgadas neste documento podem ser usadas em sistemas de edição de genoma para edição de genes multiplex. Estratégias de edição que envolvem a formação de múltiplas DSBs, ou SSBs, são descritas em, por exemplo, Cotta-Ramusino.
[0307] Conforme divulgado neste documento, múltiplos gRNAs po- dem ser usados em sistemas de edição de genoma para introduzir alte- rações (por exemplo, deleções, inserções) na região alvo de 13 nt de HBG1 e/ou HBG2. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compre- endendo um domínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 251-901, 940-942 podem ser usados para introduzir alterações na re- gião alvo de 13 nt de HBG1 e/ou HBG2. Em outras modalidades, vários gRNAs podem ser usados em sistemas de edição de genoma para in- troduzir alterações na região alvo da caixa CCAAT. Em certas modali- dades, um ou mais gRNAs compreendendo uma sequência estabele- cida em SEQ ID NOs: 970, 971, 996, 997 podem ser usados para intro- duzir alterações na região alvo da caixa CCAAT. Em certas modalida- des, um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direciona- mento estabelecido em SEQ ID NOs: 1002, 1004 podem ser usados para introduzir alterações na região alvo da caixa CCAAT. Em outras modalidades, vários gRNAs podem ser usados em sistemas de edição de genoma para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 952-955 podem ser usados para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae. Múltiplos gRNAs também podem ser usados em sistemas de edição de genoma para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae, a região alvo da caixa CCAAT, a região alvo de 13 nt de HBG1 e/ou HBG2, ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo um domí- nio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 952-955 podem ser usados para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae e um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direci- onamento estabelecido em SEQ ID NOs: 251-901, 940-942 pode ser usado para introduzir alterações na região alvo de 13 nt de HBG1 e/ou HBG2. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 952-955 po- dem ser usados para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae e um ou mais gRNAs ou gRNAs compreendendo um do- mínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 970-971, 996- 997 pode ser usado para introduzir alterações na região alvo da caixa CCAAT. Em certas modalidades, um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 952-955 podem ser usados para introduzir alterações no motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae e um ou mais gRNAs compreendendo um domínio de direcionamento estabelecido em SEQ ID NOs: 1002, 1004 pode ser usado para introduzir alterações na região alvo da caixa CCAAT.
[0308] Em certas modalidades, gRNAs múltiplos e uma nuclease guiada por RNA podem ser usados em sistemas de edição de genoma para introduzir alterações (por exemplo, deleções, inserções) na região alvo da caixa CCAAT de HBG1 e/ou HBG2. Em certas modalidades, a nuclease guiada por RNA pode ser uma Cas9, Cas9 modificada (por exemplo, D10A), Cpf1 ou Cpf1 modificada. Desenho de modelo de doador
[0309] O desenho do modelo de doador é descrito em detalhes na literatura, por exemplo, em Cotta-Ramusino. Modelos de doadores de oligêômero de DNA (oligodeoxinucleotídeos ou ODNs), que podem ser de cadeia simples (ssODNs) ou de cadeia dupla (dsODNs), podem ser usados para facilitar a reparação baseada em HDR de DSBs ou para aumentar a taxa de edição geral e são particularmente úteis para a in- trodução alterações em uma sequência de DNA alvo, inserindo uma nova sequência na sequência alvo ou substituindo a sequência alvo por completo.
[0310] Quer sejam de cadeia simples ou de cadeia dupla, os mode- los de doadores geralmente incluem regiões que são homólogas às re- giões do DNA dentro ou perto (por exemplo, flanqueando ou adjacente) de uma sequência alvo a ser clivada. Essas regiões homólogas são re- feridas aqui como "braços de homologia" e são ilustradas esquematica- mente abaixo: [Braço de homologia 5'] - [sequência de substituição] - [braço de homo- logia 3'].
[0311] Os braços de homologia podem ter qualquer comprimento adequado (incluindo O nucleotídeos se apenas um braço de homologia for usado), e os braços de homologia 3' e 5' podem ter o mesmo com- primento ou podem diferir em comprimento. A seleção de comprimentos de braço de homologia apropriados pode ser influenciada por uma vari- edade de fatores, tal como o desejo de evitar homologias ou micro-ho- mologias com certas sequências, tal como repetições Alu ou outros ele- mentos muito comuns. Por exemplo, um braço de homologia 5' pode ser encurtado para evitar um elemento de repetição de sequência. Em ou- tras modalidades, um braço de homologia 3' pode ser encurtado para evitar um elemento de repetição de sequência. Em algumas modalida- des, os braços de homologia 5' e 3' podem ser encurtados para evitar a inclusão de certos elementos de repetição de sequência. Além disso, alguns desenhos de braço de homologia podem melhorar a eficiência da edição ou aumentar a frequência de um resultado de reparação de- sejado. Por exemplo, Richardson 2016, que é incorporado aqui por re- ferência, descobriu que a assimetria relativa dos braços de homologia 3' e 5' de modelos de doador de cadeia simples influenciou as taxas de reparação e/ou resultados.
[0312] Sequências de substituição em modelos de doadores foram descritas em outro lugar, incluindo em Cotta-Ramusino. Uma sequência de substituição pode ser de qualquer comprimento adequado (incluindo zero nucleotídeos, onde o resultado de reparação desejado é uma de- leção) e, tipicamente, inclui uma, duas, três ou mais modificações de sequência em relação à sequência de ocorrência natural dentro de uma célula em que a edição é desejada. Uma modificação de sequência co- mum envolve a alteração da sequência de ocorrência natural para repa- rar uma mutação que está relacionada a uma doença ou afeção para a qual o tratamento é desejado. Outra modificação de sequência comum envolve a alteração de uma ou mais sequências que são complementa- res a, ou então, a sequência PAM da nuclease guiada por RNA ou o domínio de direcionamento do(s) gRNA(s) sendo usados para gerar uma SSB ou DSB, para reduzir ou eliminar a clivagem repetida do sítio alvo após a sequência de substituição ter sido incorporada no sítio alvo.
[0313] Quando um ssODN linear é usado, ele pode ser configurado para (i) emparelhar à cadeia cortada do ácido nucleico alvo, (ii) empa- relhar à cadeia intacta do ácido nucleico alvo, (iii) emparelhar à cadeia positiva do ácido nucleico alvo e/ou (iv) emparelhar com a cadeia nega- tiva do ácido nucleico alvo. Um ssODN pode ter qualquer comprimento adequado, por exemplo, cerca de, pelo menos, ou não mais do que 80- 200 nucleotídeos (por exemplo, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200 nucleotídeos).
[0314] Deve-se notar que um ácido nucleico modelo também pode ser um vetor de ácido nucleico, tal como um genoma viral ou DNA de cadeia dupla circular, por exemplo, um plasmídeo. Os vetores de ácido nucleico que compreendem modelos de doadores podem incluir outros elementos codificantes ou não codificantes. Por exemplo, um ácido nu- cleico modelo pode ser entregue como parte de um genoma viral (por exemplo, em um genoma de AAV ou lentiviral) que inclui certos elemen- tos da estrutura genômica (por exemplo, repetições terminais invertidas, no caso de um genoma de AAV) e opcionalmente inclui sequências adi- cionais codificação para um gRNA e/ou uma nuclease guiada por RNA. Em certas modalidades, o modelo de doador pode ser adjacente a, ou flanqueado por, sítios alvo reconhecidos por um ou mais gRNAs, para facilitar a formação de DSBs livres em uma ou ambas as extremidades do modelo doador que pode participar na reparação de SSBs corres- pondentes ou DSBs formados no DNA celular usando os mesmos gRNAs. Vetores de ácido nucleico exemplificativos adequados para uso como modelos de doadores são descritos em Cotta-Ramusino, que é incorporado por referência.
[0315] Qualquer que seja o formato usado, um ácido nucleico mo- delo pode ser concebido para evitar as sequências indesejáveis. Em certas modalidades, um ou ambos os braços de homologia podem ser encurtados para evitar sobreposição com certos elementos de sequên- cia de repetição, por exemplo, repetições Alu, elementos LINE, etc.
[0316] Em certas modalidades, SNP's silenciosos e não patogênicos podem ser incluídos no modelo de doador ssODN para permitir a iden- tificação de um evento de edição de gene.
[0317] Em certas modalidades, um modelo de doador pode ser um modelo não específico que não é homólogo a regiões de DNA dentro ou perto de uma sequência alvo a ser clivada. Em certas modalidades, os modelos de doadores para uso no direcionamento do motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae podem incluir, sem limitação, modelos específicos não alvo que não são homólogos a regiões de DNA dentro ou perto do motivo de ligação GATA1 em BCL11Ae. Em certas modalidades, os mo- delos de doadores para uso no direcionamento da região alvo de 13 nt podem incluir, sem limitação, modelos específicos não alvo que são não homólogos a regiões de DNA dentro ou perto da região alvo de 13 nt.
[0318] Um modelo de doador ou ácido nucleico modelo, como esse termo é usado aqui, refere-se a uma sequência de ácido nucleico que pode ser usada em conjunto com uma molécula de nuclease de RNA e uma ou mais moléculas de gRNA para alterar (por exemplo, excluir, in- terromper ou modificar) uma sequência de DNA alvo. Em certas moda- lidades, o ácido nucleico modelo resulta em uma alteração (por exem- plo, deleção) na região alvo da caixa CCAAT de HBG1 e/ou HBG2. Em certas modalidades, a alteração é uma alteração que não ocorre natu- ralmente. Em certas modalidades, a alteração de ocorrência não natural na região alvo da caixa CCAAT de HBG1 e/ou HBG2 pode compreender a região alvo de 18 nt, a região alvo de 11 nt, a região alvo de 4 ntou a região alvo de 1 nt, ou uma combinação das mesmas. Em certas moda- lidades, a alteração é uma alteração que ocorre naturalmente. Em cer- tas modalidades, a alteração que ocorre naturalmente na região alvo da caixa CCAAT de HBG1 e/ou HBG2 pode compreender a região alvo de 13 nt, a região alvo c.-117 G>A ou uma combinação das mesmas. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo é um ssODN. Em certas modalidades, o ssSODN é uma cadeia positiva ou uma cadeia negativa.
[0319] Por exemplo, um ácido nucleico modelo para a introdução da deleção 18 nt na região alvo 18 nt (HBG1 c.-104 a -121, HBG2 c.-104 a -121, ou uma combinação dos mesmos) pode compreender um braço de homologia 5', uma sequência de substituição e um braço de homolo- gia 3', em que a sequência de substituição é O nucleotídeos ou O pb. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos ou mais de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' compre- ende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 18 nt. Em certas modalida- des, o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nu- cleotídeos ou mais de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homo- logia 3' da região alvo de 18 nt. Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' são simétricos em comprimento Em certas modalida- des, os braços de homologia 5' e 3' são assimétricos em comprimento. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo é um ssODN. Em cer- tas modalidades, o ssSODN é uma cadeia positiva. Em certas modalida- des, o sSODN é uma cadeia negativa. Em certas modalidades, o sSODN compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO: 974 (OLI16409) ou SEQ ID NO: 975 (OLI16410).
[0320] Em certas modalidades, um ácido nucleico modelo para a introdução da deleção 11 nt na região alvo 11 nt (HBG1 c.-105 a -115, HBG?2 c.-105 a -115, ou uma combinação dos mesmos) pode compre- ender um braço de homologia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3', em que a sequência de substituição é O nucleo- tídeos ou O pb. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exem- plo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleo- tídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 11 nt. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homo- logia 3' da região alvo de 11 nt. Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' são simétricos em comprimento Em certas modalida- des, os braços de homologia 5' e 3' são assimétricos em comprimento. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo é um ssODN. Em cer- tas modalidades, o ssSODN é uma cadeia positiva. Em certas modalida- des, o sSODN é uma cadeia negativa. Em certas modalidades, o sSODN compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO: 976 (OLI16411) ou SEQ ID NO: 978 (OLI16413).
[0321] Em certas modalidades, um ácido nucleico modelo para a introdução da deleção 4 nt na região alvo 4 nt (HBG1 c.-112 a -115, HBG?2 c.-125 a -115, ou uma combinação dos mesmos) pode compre- ender um braço de homologia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3', em que a sequência de substituição é O nucleo- tídeos ou O pb. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exem- plo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleo- tídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 4 nt. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de
200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homo- logia 3' da região alvo de 4 nt. Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' são simétricos em comprimento Em certas modalida- des, os braços de homologia 5' e 3' são assimétricos em comprimento. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo é um ssODN. Em cer- tas modalidades, o ssSODN é uma cadeia positiva. Em certas modalida- des, o sSODN é uma cadeia negativa. Em certas modalidades, o sSODN compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO:984 (OLI16419), SEQ ID NO:985 (OLI16420), SEQ ID NO:986 (OLI16421), SEQ ID NO:987 (OLI16422), SEQ ID NO:988 (OLI16423), SEQ ID NO:989 (OLI16424), SEQ ID NO:990 (OLI16425), SEQ ID NO:991 (OLI16426), SEQ ID NO:992 (OLI16427), SEQ ID NO:993 (OLI16428), SEQ ID NO:994 (OLI16429), ou SEQ ID NO:995 (OLI16430).
[0322] Em certas modalidades, um ácido nucleico modelo para a introdução da deleção 1 nt na região alvo 1 nt (HBG1 c.-116, HBG2 c.- 116, ou uma combinação dos mesmos) pode compreender um braço de homologia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3', em que a sequência de substituição é O nucleotídeos ou O pb. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de compri- mento. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 900 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 1 nt. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100,
125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modali- dades, o braço de homologia 3' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 1 nt. Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' são simétricos em comprimento Em certas modalidades, os braços de ho- mologia 5' e 3' são assimétricos em comprimento. Em certas modalida- des, o ácido nucleico modelo é um ssODN. Em certas modalidades, o SSODN é uma cadeia positiva. Em certas modalidades, o ssSODN é uma cadeia negativa. Em certas modalidades, o sSODN compreende, con- siste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO: 982 (OLI16417) ou SEQ ID NO: 983 (OLI16418).
[0323] Em certas modalidades, a alteração na região alvo da caixa CCAAT recapitula ou é semelhante a uma alteração que ocorre natural- mente, tal como uma deleção de 13 nt. Em certas modalidades, um ácido nucleico modelo para a introdução da deleção 13 nt na região alvo 13 nt (HBG1 c.-116, HBG2 c.-116, ou uma combinação dos mesmos) pode compreender um braço de homologia 5', uma sequência de subs- tituição e um braço de homologia 3', em que a sequência de substituição é O nucleotídeos ou O pb. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de ho- mologia 5' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo de 13 nt. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de compri- mento. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 900 ou 80 a 90 pb, homologia 3' da região alvo de 13 nt. Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' são simétricos em comprimento Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' são assimétricos em com- primento. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo é um SSODN. Em certas modalidades, o ssSODN é uma cadeia positiva. Em certas modalidades, o ssSODN é uma cadeia negativa. Em certas moda- lidades, o SsSODN compreende, consiste essencialmente em, ou con- siste em SEQ ID NO: 979 (OLI16414) ou SEQ ID NO: 977 (OLI16412).
[0324] Em certas modalidades, a alteração na região alvo da caixa CCAAT recapitula ou é semelhante a uma alteração que ocorre natural- mente, tal como uma substituição de G para A na região alvo -117G>A. Em certas modalidades, um ácido nucleico modelo para a introdução da substituição de -117G>A na região alvo -117G>A (HBG1 c.-117 G>A, HBG?2 c.-117 G>A, ou uma combinação dos mesmos) pode compreen- der um braço de homologia 5', uma sequência de substituição e um braço de homologia 3', em que a sequência de substituição é O nucleo- tídeos ou O pb. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' pode ter cerca de 100 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 5' com- preende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homologia 5' da região alvo -117G>A. Em certas moda- lidades, o braço de homologia 3' pode ter cerca de 25 a cerca de 200 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, pelo menos cerca de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, o braço de homologia 3' compreende cerca de 50 a 100 pb, por exemplo, 55 a 95, 60 a 90, 70 a 90 ou 80 a 90 pb, homo- logia 3' da região alvo -117G>A. Em certas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' são simétricos em comprimento Em certas modalida- des, os braços de homologia 5' e 3' são assimétricos em comprimento.
Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo é um ssODN. Em cer- tas modalidades, o ssSODN é uma cadeia positiva. Em certas modalida- des, o sSODN é uma cadeia negativa. Em certas modalidades, o sSODN compreende, consiste essencialmente em, ou consiste em SEQ ID NO: 980 (OLI16415) ou SEQ ID NO: 981 (OLI16416).
[0325] Em certas modalidades, o braço de homologia 5' compre- ende uma modificação de fosforotioato (PhTx) 5. Em certas modalida- des, o braço de homologia 3' compreende uma modificação PhTx 3'. Em certas modalidades, o ácido nucleico modelo compreende uma modifi- cação PhTx5'e3.
[0326] Em certas modalidades, os ssODNs para introduzir altera- ções (por exemplo, deleções) na região alvo da caixa CCAAT podem ser usados em conjunto com uma nuclease de RNA e um ou mais gRNAs que têm como alvo a região alvo CCAAT, por exemplo, os gRNAs divulgados na Tabela 7, Tabela 10, Tabela 12, Tabela 13, Ta- bela 18, Tabela 19. Células alvo
[0327] Os sistemas de edição de genoma de acordo com esta divul- gação podem ser usados para manipular ou alterar uma célula, por exemplo, para editar ou alterar um ácido nucleico alvo. A manipulação pode ocorrer, em várias modalidades, in vivo ou ex vivo.
[0328] Uma variedade de tipos de células pode ser manipulada ou alterada de acordo com as modalidades desta divulgação e, em alguns casos, tais como aplicações in vivo, uma pluralidade de tipos de células são alterados ou manipulados, por exemplo, entregando sistemas de edição de genoma de acordo com a esta divulgação a uma pluralidade de tipos de células. Em outros casos, entretanto, pode ser desejável limitar a manipulação ou alteração a um determinado tipo ou tipos de células. Por exemplo, pode ser desejável em alguns casos editar uma célula com potencial de diferenciação limitado ou uma célula diferenci- ada terminal, tal como uma célula fotorrecetora no caso de Maeder, em que a modificação de um genótipo é esperada para resultar em uma mudança na célula fenótipo. Em outros casos, no entanto, pode ser de- sejável editar uma célula-tronco ou progenitora menos diferenciada, multipotente ou pluripotente. A título de exemplo, a célula pode ser uma célula-tronco embrionária, célula-tronco pluripotente induzida (iPSC), célula-tronco hematopoiética/progenitora (HSPC) ou outro tipo de cé- lula-tronco ou progenitora que se diferencia em um tipo de célula rele- vante para uma determinada aplicação ou indicação.
[0329] Como corolário, a célula sendo alterada ou manipulada é, de forma variada, uma célula em divisão ou uma célula sem divisão, de- pendendo do(s) tipo(s) de célula sendo direcionado e/ou o resultado de edição desejado.
[0330] Quando as células são manipuladas ou alteradas ex vivo, as células podem ser usadas (por exemplo, administradas a um indivíduo) imediatamente, ou podem ser mantidas ou armazenadas para uso poste- rior. Os versados na técnica apreciarão que as células podem ser manti- das em cultura ou armazenadas (por exemplo, congeladas em nitrogênio líquido) usando qualquer método adequado conhecido na técnica. Implementação de sistemas de edição de genoma: entrega, formula- ções e vias de administração
[0331] Conforme discutido acima, os sistemas de edição de ge- noma desta divulgação podem ser implementados de qualquer maneira adequada, o que significa que os componentes de tais sistemas, inclu- indo, sem limitação, a nuclease guiada por RNA, gRNA e ácido nucleico modelo de doador opcional, podem ser entregues, formulados ou admi- nistrados em qualquer forma adequada ou combinação de formas que resulta na transdução, expressão ou introdução de um sistema de edi- ção de genoma e/ou causa um resultado de reparação desejado em uma célula, tecido ou indivíduo.
As tabelas 3 e 4 apresentam vários exemplos não limitativos de implementações de sistemas de edição de genoma.
Aqueles versados na técnica apreciarão, no entanto, que es- sas listagens não são abrangentes e que outras implementações são possíveis.
Com referência à Tabela 3 em particular, a tabela lista várias implementações exemplificativas de um sistema de edição de genoma compreendendo um único gRNA e um modelo de doador opcional.
No entanto, os sistemas de edição de genoma de acordo com esta divulga- ção podem incorporar múltiplos gRNAs, múltiplas nucleases guiadas por RNA e outros componentes, tais como proteínas, e uma variedade de implementações serão evidentes para os versados na técnica com base nos princípios ilustrados na tabela.
Na tabela, [N/A] indica que o sistema de edição do genoma não inclui o componente indicado.
Tabela 3 Componentes do Sistema de Edição de Genoma Nuclease gui- Modelo | Comentários ada por RNA doador Uma proteína nuclease guiada por RNA Proteína RNA [N/A] complexada com uma molécula de gRNA (um complexo RNP) Um complexo RNP conforme descrito Proteína RNA DNA acima mais um modelo de doador de ca- deia simples ou dupla. , Uma proteína nuclease guiada por RNA Proteína DNA [N/A] mais gRNA transcrito do DNA Uma proteína nuclease guiada por RNA Proteína DNA DNA mais DNA que codifica gRNA e um modelo de doador de DNA separado.
Uma proteína nuclease guiada por RNA e Proteína DNA um único DNA que codifica um gRNA e um modelo de doador.
Um DNA ou vetor de DNA que codifica DNA uma nuclease guiada por RNA, um gRNA e um modelo de doador.
Dois DNAs separados, ou dois vetores de [N/A] DNA separados, codificando a nuclease
Componentes do Sistema de Edição de Genoma Nuclease gui- Modelo | Comentários ada por RNA doador guiada por RNA e o gRNA, respectiva- mente. Três DNAs separados, ou três vetores de DNA separados, codificando a nuclease DNA DNA DNA guiada por RNA, o gRNA e o modelo do doador, respectivamente. Um DNA ou vetor de DNA que codifica [N/A] uma nuclease guiada por RNA e um gRNA Um primeiro DNA ou vetor de DNA que co- difica uma nuclease guiada por RNA e um DNA DNA gRNA, e um segundo DNA ou vetor de DNA que codifica um modelo de doador. Um primeiro DNA ou vetor de DNA que co- difica uma nuclease guiada por RNA e um DNA DNA segundo DNA ou vetor de DNA que codi- fica um gRNA e um modelo de doador. Um primeiro DNA ou vetor de DNA que co- difica uma nuclease guiada por RNA e um DNA modelo de doador, e um segundo DNA ou vetor de DNA que codifica um gRNA DNA Um DNA ou vetor de DNA que codifica uma nuclease guiada por RNA e um mo- RNA delo de doador, e um gRNA Um RNA ou vetor de RNA que codifica RNA [N/A] uma nuclease guiada por RNA e que com- preende um gRNA Um RNA ou vetor de RNA que codifica uma nuclease guiada por RNA e que com- RNA DNA preende um gRNA e um DNA ou vetor de DNA que codifica um modelo de doador.
[0332] A Tabela 4 resume vários métodos de entrega para os com- ponentes de sistemas de edição de genoma, conforme descrito neste documento. Mais uma vez, a listagem pretende ser exemplificativa, em vez de limitativa.
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Entrega baseada em ácido nucleico de sistemas de edição de genoma
[0333] Os ácidos nucleicos que codificam os vários elementos de um sistema de edição de genoma de acordo com a presente divulgação podem ser administrados a indivíduos ou entregues em células por méto- dos conhecidos na técnica ou conforme descrito neste documento. Por exemplo, DNA codificador de nuclease guiada por RNA e/ou DNA codifi- cador de gRNA, bem como ácidos nucleicos de modelo de doador podem ser entregues por, por exemplo, vetores (por exemplo, vetores virais ou não virais), métodos não baseados em vetores (por exemplo, usando DNA nu ou complexos de DNA) ou uma combinação dos mesmos.
[0334] Os ácidos nucleicos que codificam sistemas de edição de genoma ou seus componentes podem ser entregues diretamente às cé- lulas como DNA ou RNA nu, por exemplo, por meio de transfecção ou eletroporação, ou podem ser conjugados a moléculas (por exemplo, N- acetilgalactosamina) promovendo a absorção pelas células alvo (por exemplo, eritrócitos, HSCs). Os vetores de ácido nucleico, tais como os vetores resumidos na Tabela 4, também podem ser usados.
[0335] Os vetores de ácido nucleico podem compreender uma ou mais sequências que codificam componentes do sistema de edição de genoma, tal como uma nuclease guiada por RNA, um gRNA e/ou um modelo de doador. Um vetor também pode compreender uma sequên- cia que codifica um peptídeo sinal (por exemplo, para localização nu- clear, localização nucleolar ou localização mitocondrial), associada a (por exemplo, inserida em ou fundida a) uma sequência que codifica uma proteína. Como um exemplo, um vetor de ácido nucleico pode in- cluir uma sequência de codificação Cas9 que inclui uma ou mais se- quências de localização nuclear (por exemplo, uma sequência de loca- lização nuclear de SV40).
[0336] O vetor de ácido nucleico também pode incluir qualquer nú- mero adequado de elementos reguladores/de controle, por exemplo,
promotores, intensificadores, íntrons, sinais de poliadenilação, sequên- cias de consenso Kozak ou sítios de entrada de ribossomo interno (IRES). Esses elementos são bem conhecidos na técnica e são descri- tos em Cotta-Ramusino.
[0337] Vetores de ácidos nucleicos de acordo com esta invenção incluem vetores virais recombinantes. Vetores virais exemplificativos são apresentados na Tabela 4, e vetores virais adequados adicionais e seu uso e produção são descritos em Cotta-Ramusino. Outros vetores virais conhecidos na técnica também podem ser usados. Além disso, as partículas virais podem ser usadas para entregar componentes do sis- tema de edição de genoma na forma de ácido nucleico e/ou peptídeo. Por exemplo, partículas virais "vazias" podem ser montadas para conter qualquer carga adequada. Os vetores virais e as partículas virais tam- bém podem ser projetados para incorporar ligantes de direcionamento para alterar a especificidade do tecido alvo.
[0338] Além de vetores virais, vetores não virais podem ser usados para entregar ácidos nucleicos que codificam sistemas de edição de ge- noma de acordo com a presente divulgação. Uma categoria importante de vetores de ácido nucleico não virais são as nanopartículas, que po- dem ser orgânicas ou inorgânicas. As nanopartículas são bem conheci- das na técnica e estão resumidas em Cotta-Ramusino. Qualquer dese- nho de nanopartícula adequado pode ser usado para fornecer compo- nentes do sistema de edição de genoma ou ácidos nucleicos que codi- ficam tais componentes. Por exemplo, não partículas orgânicas (por exemplo, lipídeos e/ou polímeros) podem ser adequadas para uso como veículos de entrega em certas modalidades desta divulgação. Lipídeos exembplificativos para uso em formulações de nanopartículas e/ou trans- ferência de genes são mostrados na Tabela 5, e a Tabela 6 lista polí- meros exemplificativos para uso em formulações de transferência de genes e/ou nanopartículas.
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Tabela 6: Polímeros Usados para Transferência de Genes | PL modificado com ísiica | | Poltropienimia)y pr |Poltgaminaéstan |Poifatlamimay — — “ PA: [Pol (brometo de Aeti-â-iniaifíitoy o |qutosama — — — ( [Qutosana galaetostada | Quitosana N-Dodacltada — | [Histora [O |coágeno — DM
[0339] Os vetores não virais incluem opcionalmente direcionamento modificações para melhorar a absorção e/ou seletivamente certos tipos de células alvo. Essas modificações de direcionamento podem incluir, por exemplo, antígenos específicos de células, anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeia única, aptâmeros, polímeros, açúcares (por exem- plo, N-acetilgalactosamina (GalNAc)) e peptídeos de penetração celu- lar. Tais vetores também usam opcionalmente peptídeos/polímeros fu- sogênicos e desestabilizadores de endossomo, sofrem alterações con- formacionais desencadeadas por ácido (por exemplo, para acelerar o escape endossomal da carga) e/ou incorporam um polímero clivável por estímulo, por exemplo, para liberação em um compartimento celular. Por exemplo, podem ser utilizados polímeros catiônicos à base de dis- sulfureto que são clivados no ambiente celular redutor.
[0340] Em certas modalidades, uma ou mais moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de DNA) diferentes dos componentes de um sistema de edição de genoma, por exemplo, o componente de nuclease guiado por RNA e/ou o componente de gRNA aqui descrito, são entregues. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico é fornecida ao mesmo tempo que um ou mais componentes do sistema de edição de Genoma. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico é entregue antes ou depois (por exemplo, menos do que cerca de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 1 semana, 2 semanas ou 4 semanas) de um ou mais componentes do sistema de edição do Genoma serem entregues. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico é entregue por um meio diferente do que um ou mais dos componentes do sistema de edi- ção do genoma, por exemplo, o componente de nuclease guiada por RNA- e/ou o componente de gRNA, são entregues. A molécula de ácido nucleico pode ser administrada por qualquer um dos modos de entrega aqui descritos. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ser ad- ministrada por um vetor viral, por exemplo, um lentivírus deficiente em integração, e o componente da molécula de nuclease guiada por RNA e/ou o componente da molécula de gRNA podem ser administrados por eletroporação, por exemplo, a toxicidade causada por ácidos nucleicos (por exemplo, DNAs) pode ser reduzida. Em certas modalidades, a mo- lécula de ácido nucleico codifica uma proteína terapêutica, por exemplo, uma proteína aqui descrita. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico codifica uma molécula de RNA, por exemplo, uma molécula de RNA aqui descrita. Entrega de RNPs e/ou componentes do sistema de edição de genoma que codificam RNA
[0341] RNPs (complexos de gRNAs e nucleases guiadas por RNA) e/ou RNAs que codificam nucleases guiadas por RNA e/ou gRNAs po- dem ser entregues em células ou administrados a indivíduos por méto- dos conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos em Cotta - Ramusino. In vitro, o RNA codificador de nuclease guiado por RNA e/ou RNA codificador de gRNA pode ser entregue, por exemplo, por microin- jeção, eletroporação, compressão ou aperto de células transitórias (ver, por exemplo, Lee 2012). A transfecção mediada por lipídeos, entrega mediada por peptídeos, entrega mediada por GalNAc ou outro conju- gado, e suas combinações, também pode ser utilizado para entrega in vitro e in vivo. Um sistema de proteção, interativo e sem condensação (PINC) pode ser usado para a entrega.
[0342] A distribuição in vitro via eletroporação compreende a mis- tura das células com o RNA que codifica nuclease guiada por RNA e/ou gRNAs, com ou sem moléculas de ácido nucleico modelo de doador, em um cartucho, câmara ou cuvete e aplicação de um ou mais impulsos elétricos de duração e amplitude definidas. Sistemas e protocolos para eletroporação são conhecidos na técnica, e qualquer ferramenta de ele- troporação adequada e/ou protocolo pode ser usado em conexão com as várias modalidades desta divulgação.
Via de administração
[0343] Sistemas de edição de genoma, ou células alteradas ou ma- nipuladas usando tais sistemas, podem ser administrados a indivíduos por qualquer modo ou via adequada, seja local ou sistêmica. Os modos de administração sistêmicos incluem as vias oral e parenteral. As vias parentéricas incluem, a título de exemplo, as vias intravenosa, intrame- dular, intrarterial, intramuscular, intradérmica, subcutânea, intranasal e intraversadoneal. Os componentes administrados sistemicamente po- dem ser modificados ou formulados para atingir, por exemplo, HSCs, células-tronco hematopoiéticas/progenitoras ou progenitoras eritroides ou células precursoras.
[0344] Os modos locais de administração incluem, a título de exem- plo, injeção intramedular no osso trabecular ou injeção intrafemoral no espaço medular e infusão na veia porta. Em certas modalidades, quan- tidades significativamente menores dos componentes (em comparação com abordagens sistêmicas) podem exercer um efeito quando adminis- trados localmente (por exemplo, diretamente na medula óssea) em com- paração com quando administrados sistemicamente (por exemplo, por via intravenosa). Os modos locais de administração podem reduzir ou eliminar a incidência de efeitos colaterais potencialmente tóxicos que podem ocorrer quando quantidades terapeuticamente eficazes de um componente são administradas sistemicamente.
[0345] A administração pode ser fornecida como um bolus periódico (por exemplo, por via intravenosa) ou como infusão contínua de um re- servatório interno ou de um reservatório externo (por exemplo, de uma bolsa intravenosa ou bomba implantável). Os componentes podem ser administrados localmente, por exemplo, por liberação contínua de um dispositivo de liberação sustentada de fármaco.
[0346] Além disso, os componentes podem ser formulados para permitir a liberação por um período de tempo prolongado. Um sistema de liberação pode incluir uma matriz de um material biodegradável ou um material que libera os componentes incorporados por difusão. Os componentes podem ser homogênea ou heterogeneamente distribuídos dentro do sistema de liberação. Uma variedade de sistemas de libera- ção pode ser útil, entretanto, a escolha do sistema apropriado depen- derá da taxa de liberação exigida por uma aplicação particular. Podem ser usados sistemas de liberação degradáveis e não degradáveis. Os sistemas de liberação adequados incluem polímeros e matrizes polimé- ricas, matrizes não poliméricas ou excipientes e diluentes inorgânicos e orgânicos, tais como, mas não se limitando a, carbonato de cálcio e açúcar (por exemplo, trealose). Os sistemas de liberação podem ser na- turais ou sintéticos. No entanto, os sistemas de liberação sintéticos são preferidos porque geralmente são mais confiáveis, mais reproduzíveis e produzem perfis de liberação mais definidos. O material do sistema de liberação pode ser selecionado de modo que os componentes com pe- sos moleculares diferentes sejam liberados por difusão ou degradação do material.
[0347] Polímeros sintéticos, biodegradáveis representativos in- cluem, por exemplo: poliamidas, tais como poli(aminoácidos) e poli(pep- tídeos); poliésteres, tais como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido láctico-coglicólico) e poli(caprolactona); poli(anidridos); polior- toésteres; policarbonatos; e seus derivados químicos (substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquila, alquileno, hidroxila- ções, oxidações e outras modificações rotineiramente feitas por aqueles versados na técnica), copolímeros e suas misturas. Polímeros sintéticos representativos não degradáveis incluem, por exemplo: poliéteres tais como poli(óxido de etileno), poli(etilenoglicol) e polifóxido de tetrameti- leno); polímeros de vinil-poliacrilatos e polimetacrilatos, tais como me- tila, etila, outra alquila, hidroxietila metacrilato, ácidos acrílico e metacrí- lico e outros, como poli(álcool vinílico), poli(vinilpirolidona) e poli(acetato de vinila); polifuretanos); celulose e seus derivados, tais como alquila, hidroxialquila, éteres, ésteres, nitrocelulose e vários acetatos de celu- lose; polissiloxanos; e quaisquer derivados químicos destes (substitui- ções, adições de grupos químicos, por exemplo, alquila, alquileno, hi- droxilações, oxidações e outras modificações feitas rotineiramente por aqueles versados na técnica), copolímeros e suas misturas.
[0348] Microesfera de poli(lactídeo-coglicolídeo) também pode ser usada. Normalmente, as microesferas são compostas por um polímero de ácido lático e ácido glicólico, que são estruturados para formar esfe- ras ocas. As esferas podem ter aproximadamente 15-30 mícrons de di- âmetro e podem ser carregadas com os componentes aqui descritos. Em algumas modalidades, os sistemas de edição de genoma, os com- ponentes do sistema e/ou os ácidos nucleicos que codificam para os componentes do sistema, são fornecidos com um copolímero em bloco, tais como um poloxamero ou um poloxamina. Entrega multimodal ou diferencial de componentes
[0349] Os versados na técnica irão apreciar, em vista da presente descrição, que os diferentes componentes dos sistemas de edição de genoma aqui divulgados podem ser administrados em conjunto ou se- paradamente e simultânea ou não - simultaneamente. A entrega sepa- rada e/ou assíncrona de componentes do sistema de edição de genoma pode ser particularmente desejável para fornecer controle temporal ou espacial sobre a função de sistemas de edição de genoma e para limitar certos efeitos causados por sua atividade.
[0350] Modos diferentes ou diferenciais, conforme usados neste do- cumento, referem-se a modos de entrega que conferem diferentes pro- priedades farmacodinâmicas ou farmacocinéticas na molécula de com- ponente em questão, por exemplo, uma molécula de nuclease guiada por RNA, gRNA, ácido nucleico modelo ou carga útil. Por exemplo, os modos de entrega podem resultar em distribuição tecidular diferente,
meia-vida diferente ou distribuição temporal diferente, por exemplo, em um compartimento, tecido ou órgão selecionado.
[0351] Alguns modos de entrega, por exemplo, a entrega por um vetor de ácido nucléico que persiste em uma célula, ou em descendên- cia de uma célula, por exemplo, por replicação autônoma ou inserção em ácido nucléico celular, resultam em uma expressão mais persistente de um componente. Os exemplos incluem entrega viral, por exemplo, AAV ou lentivírus.
[0352] A título de exemplo, os componentes de um sistema de edi- ção de genoma, por exemplo, uma nuclease guiada por RNA e um gRNA, podem ser entregues por modos que diferem em termos de meia-vida resultante ou persistente do componente entregue no corpo, ou em um determinado compartimento, tecido ou órgão. Em certas mo- dalidades, um gRNA pode ser entregue por tais modos. O componente da molécula de nuclease guiada por RNA pode ser distribuído por um modo que resulta em menos persistência ou menos exposição ao corpo ou a um compartimento ou tecido ou órgão específico.
[0353] Mais geralmente, em certas modalidades, um primeiro modo de entrega é utilizado para fornecer um primeiro componente e um se- gundo modo de entrega é utilizado para fornecer um segundo compo- nente. O primeiro modo de entrega confere uma primeira propriedade farmacodinâmica ou farmacocinética. A primeira propriedade farmaco- dinâmica pode ser, por exemplo, distribuição, persistência ou exposi- ção, do componente, ou de um ácido nucleico que codifica o compo- nente, no corpo, num compartimento, tecido ou órgão. O segundo modo de entrega confere uma segunda propriedade farmacodinâmica ou far- macocinética. A segunda propriedade farmacodinâmica pode ser, por exemplo, distribuição, persistência ou exposição, do componente, ou de um ácido nucleico que codifica o componente, no corpo, num comparti- mento, tecido ou órgão.
[0354] Em certas modalidades, a primeira propriedade farmacodi- nâmica ou farmacocinética, por exemplo, distribuição, persistência ou exposição, é mais limitada do que a segunda propriedade farmacodinâã- mica ou farmacocinética.
[0355] Em certas modalidades, o primeiro modo de entrega é sele- cionado para otimizar, por exemplo, minimizar, uma propriedade farma- codinâmica e farmacocinética, por exemplo, distribuição, persistência Ou exposição.
[0356] Em certas modalidades, o segundo modo de entrega é sele- cionado para otimizar, por exemplo, maximizar, uma propriedade farma- codinâmica e farmacocinética, por exemplo, distribuição, persistência Ou exposição.
[0357] Em certas modalidades, o primeiro modo de distribuição compreende a utilização de um elemento relativamente persistente, por exemplo, um ácido nucleico, por exemplo, um plasmídeo ou vetor viral, por exemplo, um AAV ou um lentivírus. Como tais vetores são produtos relativamente persistentes, transcritos a partir deles, seriam relativa- mente persistentes.
[0358] Em certas modalidades, o segundo modo de entrega com- preende um elemento relativamente transiente, por exemplo, um RNA ou proteína.
[0359] Em certas modalidades, o primeiro componente compreende gRNA, e o modo de entrega é relativamente persistente, por exemplo, o gRNA é transcrito de um plasmídeo ou vetor viral, por exemplo, um AAV ou lentivírus. A transcrição desses genes seria de pouca consequência fisiológica, porque os genes não codificam para um produto proteico, e os gRNAs são incapazes de agir isoladamente. O segundo componente, uma molécula de nuclease guiada por RNA, é distribuído de uma maneira transiente, por exemplo como mRNA ou como proteína, garantindo que o complexo completo de molécula de nuclease guiada por RNA/gRNA es- teja presente e ativo por um curto período de tempo.
[0360] Além disso, os componentes podem ser distribuídos em di- ferentes formas moleculares ou com diferentes vetores de entrega que se complementam para aumentar a segurança e a especificidade dos tecidos.
[0361] O uso de modos de entrega diferencial pode melhorar o de- sempenho, a segurança e/ou a eficácia, por exemplo, a probabilidade de uma eventual modificação fora do alvo pode ser reduzida. Entrega de componentes imunogênicos, por exemplo, moléculas Cas9, por mo- dos menos persistentes podem reduzir a imunogenicidade, como peptí- deos da enzima Cas derivada de bactérias, são apresentados na super- fície da célula por moléculas MHC. Um sistema de entrega de duas par- tes pode aliviar essas desvantagens.
[0362] Os modos de entrega diferencial podem ser usados para for- necer componentes para regiões alvo diferentes, mas sobrepostas. O complexo ativo de formação é minimizado fora da sobreposição das re- giões alvo. Assim, em certas modalidades, um primeiro componente, por exemplo, um gRNA, é distribuído por um primeiro modo de entrega que resulta numa primeira distribuição espacial, por exemplo, de tecido. Um segundo componente, por exemplo, uma molécula de nuclease gui- ada por RNA, é distribuído por um segundo modo de entrega que resulta numa segunda distribuição espacial, por exemplo, de tecido. Em certas modalidades, o primeiro modo compreende um primeiro elemento sele- cionado a partir de um lipossoma, de nanopartículas, por exemplo, de nanopartículas poliméricas e um ácido nucleico, por exemplo, vetor vi- ral. O segundo modo compreende um segundo elemento selecionado do grupo. Em certas modalidades, o primeiro modo de entrega compre- ende um primeiro elemento de direcionamento, por exemplo, um recep- tor celular específico ou um anticorpo, e o segundo modo de entrega não inclui esse elemento. Em certas modalidades, o segundo modo de entrega compreende um segundo elemento de direcionamento, por exemplo, um segundo receptor celular específico ou segundo anticorpo.
[0363] Quando a molécula de nuclease guiada por RNA é entregue em um vetor de entrega de vírus, lipossoma ou nanopartícula polimé- rica, existe o potencial para liberação e atividade terapêutica em múlti- plos tecidos, quando pode ser desejável que apenas um único tecido seja atingido. Um sistema de entrega em duas partes pode resolver esse desafio e melhorar a especificidade do tecido. Se a molécula de gRNA e a molécula de nuclease guiada por RNA forem empacotadas em veículos de entrega separados com tropismo de tecido distinto mas sobreposto, o complexo totalmente funcional só será formado no tecido que é alvo de ambos os vetores. Exemplos
[0364] Os princípios e modalidades descritos acima são ainda ilus- trados pelos exemplos não limitativos que se seguem: Exemplo 1: Rastreamento de gRNAs de S. pyogenes entregues a célu- las K562 como complexos de ribonucleoproteína para uso em causar deleções de 13 nt em regiões regulatórias de HBG1 e HBG2
[0365] gRNAs com alvo em um fragmento de 26 nt que abrange e incluindo os 13 nucleotídeos na região alvo 13 nt de HBG1 e HBG2 fo- ram concebidos por métodos padrão. Depois que os gRNAs foram de- senhados in silico e em colocados em níveis, um subconjunto dos gRNAs foi selecionado e rastreado quanto à atividade e especificidade em células K562 humanas. Os gRNAs selecionados para rastreamento são apresentados na Tabela 7. Resumidamente, os gRNAs foram trans- critos in vitro e, em seguida, complexados com a proteína Cas9 de S. bpyogenes de tipo selvagem (Ts) para formar complexos de ribonucleo- proteína (RNPs). Os gRNAs complexadas com proteína Cas9 de S. pyo- genes foram saRNAs modificados ((por exemplo, ARCA 5' recoberto e cauda poliA 3' (20A); Tabela 7) e regiões regulatórias alvo HBG1 e HBG2. Para permitir a comparação direta da atividade destes RNPs em células K562 e células humanas CD34*, RNPs foram primeiro entregues a células K562 por eletroporação (Amaxa Nucleofector).
[0366] Três dias após a eletroporação RNP, o gDNA foi extraído das células K562 e, em seguida, os loci HBG1 e HBG2 foram amplifica- dos por PCR a partir do gDNA. A edição do gene foi avaliada nos pro- dutos de PCR por análise de ensaio de endonuclease T7E1. Oito em nove RNPs apoiavam uma alta percentagem do NHEJ. Sp37 RNP, o único gRNA que mostrou ser ativo em células CD34* humanas (<10% de edição em células CD34*) foi altamente ativo em células K562, com > 60% indels detectados em HBG1 e HBG2 e oito cortes em ambas as regiões alvo de HBG1 e HBG2 nas sequências promotoras (Fig. 3A).
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[0367] Os produtos de PCR HBG1 e HBG2 para as células K562 que foram alvo com os oito saRNAs ativos foram, em seguida, analisa- dos por análise de sequenciamento de DNA e marcados para as inser- ções e deleções detectadas. As deleções foram subdivididas em dele- ções precisas de 13 nt no sítio alvo, sítio alvo de 13 nt inclusive e pe- quenas deleções proximais (18-26 nt), deleções de 12 nt (ou seja, dele- ção parcial) do sítio alvo de 13 nt, deleções de >26 nt que se estendem por uma porção do sítio alvo HPFH e outras deleções, por exemplo, de- leções proximais, mas fora do sítio alvo HPFH. Sete dos oito saRNAs direcionaram a deleção do 13 nt (indução da mutação HPFH) (Fig. 3B) para HBG71. Pelo menos cinco dos oito sa RNAs também suportaram a deleção direcionada de 13 nt na região do promotor HBG2 (Fig. 3C). Note que os resultados da sequência de DNA para HBG2 em células tratadas com HBG Sp34 sgRNA não estavam disponíveis. Estes dados indicam que Cas9 e saRNA suportam indução precisa das deleções de 13 nt. Figs. 3B-3C representam exemplos dos tipos de deleções obser- vadas em sequências alvo em HBG71. Exemplo 2: Cas9 RNP contendo gRNA direcionado à mutação de dele- ção de 13 nt suporta a edição de genes em células progenitoras/tronco hematopoiéticas humanas
[0368] Dos RNP contendo diferentes gRNAs testados em células CD34* do sangue do cordão umbilical humano (CB) apenas a Sp37 re- sultou na edição detectável no sítio alvo nos promotores HBG1 e HBG2, tal como determinado por análise de T7E1 de indels em produtos de PCR específicos de HBG1 e HBG2 amplificados de gDNA extraídos de células CD34* CB eletroporadas de três doadores de sangue do cordão umbilical (Fig. 4A). O nível médio de edição detectado em células ele- troporadas com proteína Cas9 complexada com Sp37 foi 5 + 2% indels em HBG1 e 3 + 1% indels detectados em HBG2 (3 experiências sepa- radas e doadores CB).
[0369] Em seguida, três gRNAs S. pyogenes cujos sítios alvo estão dentro do promotor HBG (Sp35, Sp36, Sp37) foram complexados com a proteína Cas9 de S. pyogenes de tipo selvagem para formar comple- xos de ribonucleoproteína. Estes RNPS alvo de HBG foram eletropora- dos em células CD34* CB (n = 3 doadores) e doadores de células CD34* de sangue periférico mobilizado adulto (MPB) (n = 3 doadores). Em se- guida, o nível de inserções/deleções no sítio alvo foi analisado por aná- lise de endonuclease T7E1 dos produtos de PCR de HBG?2 amplificados a partir de DNA genômico extraído das amostras aproximadamente 3 dias após a entrega de Cas9 RNP. Cada um desses RNPs suportou apenas a edição de genes de baixo nível em células CB e CD34* adultas em 3 doadores e 3 experiências separadas (Fig. 4B).
[0370] Para aumentar edição de gene e a ocorrência da deleção 13 nt no sítio alvo, foram gerados modelos de reparação de doador de de- soxinucleotídeo de cadeia simples (ssODN s) que codificam 87 nt e 89 nt de homologia em cada lado do sítio de deleção alvo. Os ssSODNs, não modificados nas extremidades (ou seja, ssSODN1, SEQ ID NO: 906, Ta- bela 8) ou modificados para conter fosforotioatos (PhTx) nas extremida- des 5' e 3' (ou seja, PhTx ssODN1, SEQ ID NO: 909, Tabela 8). O sSsSODN foi desenhado para 'codificar' a deleção de 13 nt com braços de homologia de sequência manipulados para flanquear essa sequência ausente para criar uma deleção perfeita.
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[0371] ssODN1 e PhTx ssODN1 foram coentregues com RNP dire- cionado a HBG contendo o gRNA Sp37 (HBG Sp37 RNP) ou HBG Sp35 (HBG Sp35 RNP) a células CD34* CB. A coentrega do doador ssSODN que codifica a deleção de 13 nt com HBG Sp35 RNP ou HBG Sp37 RNP levou a um aumento de 6 vezes e 5 vezes na edição do gene do sítio alvo, respectivamente, conforme determinado pela análise T7E1 do pro- duto de PCR de HBG2 (Fig. 4C). A análise de sequenciamento de DNA (sequenciamento Sanger) do produto PCR HBG2 indicou que 20% da edição do gene em células que foram tratadas com HBG Sp37 RNPe o ssSODN 1 modificado com PhTx, com 15% de deleções e 5% de inser- ções (Fig. 4C, painel esquerdo inferior). Uma análise mais aprofundada do tipo específico e tamanho das deleções no sítio alvo revelou que 75% das deleções totais detectadas continham a deleção de 13 nt (que in- cluiu a deleção em c. -110 da caixa CAAT no promotor proximal), a au- sência de que está associado à elevação da expressão de HbF (Fig. 4C, painel inferior direito). O 4 restante das deleções foram deleções parciais que não abrangeram a deleção total de 13 nt. Esses dados in- dicam que a coentrega de um ssSODN homólogo que é manipulado para ter uma deleção suportou a edição precisa do gene (deleção) em HBG em células CD34* humanas.
Exemplo 3: Cas9 RNP tendo como alvo a mutação de deleção de 13 nt suporta a edição de genes em células progenitoras/tronco hematopoié- ticas de sangue periférico humanas adultas mobilizadas com expressão aumentada de HBG na descendência de eritroblastos.
[0372] Para determinar se a edição de HBG com Cas9 RNP com- plexado a Sp37 gRNA ou Sp35 gRNA (ou seja, os gRNAs que visam a deleção de 13 nt que está associada com HPFH) no promotor de HBG suporta um aumento na expressão de HBG na descendência eritroide de células CD34* editadas humanas, células CD34* adultas humanas a partir de sangue periférico mobilizado (MPB) foram eletroporadas com os RNPs. Resumidamente, as células CD34* mPB foram pré-estimula- das por 2 dias com citocinas humanas e PGE2 em StemSpan SFEM e depois eletroporadas com proteína Cas9 pré-complexada para Sp35 e Sp37, respectivamente. A análise de T7E1 do produto de PCR de HBG indicou indels de — 3% detectados para células CD34* mPB tratadas com RNP complexado com Sp37, enquanto nenhuma edição foi detec- tada para células que foram tratadas com RNP complexado com Sp35 (Fig. 5A).
[0373] De modo a aumentar a edição do gene no sítio alvo e au- mentar a ocorrência da deleção de 13 nt no sítio alvo, PhTx ssODN1 (SEQ ID NO: 909) foi coentregue com o RNP pré-complexado direcio- nado a HBG contendo o Sp37 gRNA. A coentrega do doador ssSODN que codifica a deleção de 13 nt levou a um aumento de quase 2 vezes na edição do gene do sítio alvo (Fig. 5A). Para determinar se a edição de HBG aumenta a produção de hemoglobina fetal na descendência eritroide de células CD34* adultas editadas, as células foram diferenci- adas em eritroblastos por cultura até 18 dias na presença de citocinas humanas (eritropoietina, SCF, IL3), plasma humano (Octoplas) e outros suplementos (hidrocortisona, heparina, transferrina). Ao longo do tempo de diferenciação, o MRNA foi coletado para avaliar a expressão do gene HBG na descendência eritroide de células CD34* mPB tratadas com RNP e controles negativos (não tratados) correspondentes de doador. No dia 7 de diferenciação, a descendência de eritroblastos de células CD34* humanas que foram tratadas com HBG Sp37 RNP e deleção 13 nt que codifica ssSODN (indels — 5% detectados em gDNA da população de células em massa por análise T7E1) exibiu um aumento de 2 vezes em produção de mMRNA de HBG (Fig. 5B). É importante ressaltar que as células CD34* que foram eletroporadas com HBG RNP mantiveram sua atividade hematopoiética ex vivo (ou seja, nenhuma diferença na quantidade ou diversidade de colônias eritroides e mieloides em com- paração com o controle negativo de células CD34* correspondentes de doadores não tratados), conforme determinado nos ensaios de células de formação de colônias hematopoiéticas (CFC) (Fig. 6A). Além disso, os eritroblastos diferenciados de células CD34* tratadas com RNP man- tiveram a cinética de diferenciação observada para células de controle não tratadas correspondentes de doador, conforme determinado por análise de fluxo para aquisição de fenótipo eritroide (% células Glicofo- rina A*) (Fig. 6B). Estes dados indicam que a interrupção direcionada da região promotora proximal de HBG1/HBG2 suportou um aumento na expressão de HBG na descendência eritroide de células progenito- ras/tronco hematopoiéticas adultas tratadas com RNP sem alterar o po- tencial de diferenciação.
Exemplo 4: Cas9 RNP tendo como alvo a mutação HPFH suporta a edi- ção de genes em células progenitoras/tronco hematopoiéticas de san- que periférico humanas adultas mobilizadas com expressão aumentada de HBG na descendência de eritroblastos
[0374] Para determinar se a coentrega de RNPs de nickase empa- relhados com HBG aumentaria a interrupção direcionada do promotor HBG proximal, as células CD34* mPB foram cultivadas por 2 dias com citocinas humanas e PGE2 em StemSpan SFEM e, em seguida, eletro- poradas com proteína Cas9 D10A S. pyogenes pré-complexada a dois gRNAs que têm como alvo sítios que flanqueiam o sítio da deleção de 13 nt. As sequências de domínio de direcionamento para gRNAs usados em pares de nickase neste exemplo (incluindo, sem limitação, SpA, Sp85 e SpB) são apresentadas na Tabela 7. Os pares de nickase D10A foram selecionados de modo que os PAMs para os alvos fossem orien- tados para fora e a distância entre os sítios de corte fosse <100 nt. Os gRNAs foram complexados com a proteína D1I0A Cas9 para formar complexos RNP e, em seguida, as células CD34* humanas e a nickase emparelhada foram submetidas a eletroporação. Para determinar se a coentrega de um ssODN que codifica a deleção de 13 nt aumentaria a edição e a introdução da mutação nas células, em algumas experiên- cias, SSODN1 foi adicionado à mistura de RNP celular antes da eletro- poração. Aproximadamente 3 dias após a eletroporação, o gDNA foi ex- traído das células tratadas com RNP e analisado por ensaio de endonu- clease T7E1 e/ou sequenciamento de DNA Sanger de produtos de PCR de HBG2 amplificados do gDNA extraído. Dos três pares de nickase D10A testados, indels detectados por análise de endonuclease T7E1 foram aumentados para amostras de um par de nickase (gRNAs SpA + Sp85) para as quais ssODN 1 foi incluído (Fig. 7A). A análise de se- quenciamento de DNA foi realizada em amostras limitadas mostradas na Fig. 7A. A análise de sequenciamento de DNA mostrou até -27% de indels no sítio alvo, com inserções como o indel dominante detectadas, seguido por deleções da região alvo (área entre os sítios de corte das nickases emparelhadas), e a mutação de deleção de 13 nt também foi detectada a uma frequência de 2-3% quando ssODN1 que codifica a deleção foi coentregue (Fig. 7B). SNPs não patogénicos silenciosos fo- ram incluídos no modelo de doador de ssODN1, e foram detectados nas sequências que continha a deleção de 13 nt, que indica que a criação da mutação HFPH ocorreu através de um evento de HDR.
Exemplo 5: RNPs emparelhados com D10A eletroporados em células CD34+ adultas suportam a indução da proteína HbF na descendência eritroide.
[0375] Para otimizar ainda mais as condições de edição em células CD34* mPB no sítio alvo e para avaliar a edição em doadores de células humanas adicionais, células CD34* mPB humanas foram eletroporadas com D10A Cas9 e RNPs emparelhados de Cas9 TS com alvo em HBG. O par guia mais eficiente para RNPs D1I0A Cas9 e Cas9 TS foi
Sp37+SpA, que suportou indels >30%, conforme determinado pela aná- lise de endonuclease T7E1 de produtos de PCR HBG2 (Fig. 8A). Dado que a edição, tanto HBG1 e HBG2 poderia resultar em grandes dele- ções de HBG2 e a região intergênica entre HBG2 e HBG71, indels foram ainda caracterizados, a fim de capturar indels locais por ensaio de en- donuclease T7E1 e sequenciamento e grande deleção através de aná- lise ddPCR. Grandes deleções foram detectadas em todas as amostras em frequências variáveis para os pares de nickase RNP D10A Cas9 e Cas9 TS (Fig. 8B). A análise de sequenciamento Illumina de indels cor- relacionados com indels determinados por análise T7E1 (Fig. 8C-8D).
[0376] Para determinar se as células CD34+ editadas com nickases duais no promotor de HBG deram origem à descendência eritroide com expressão elevada de HbF, controles tratados e não tratados com RNP correspondentes de doadores foram induzidos para a diferenciação eri- troide e então avaliados para manutenção de indels durante a diferenci- ação e por expressão de mRNA e proteína de HbF. O nível de edição (conforme determinado pelo ensaio de endonuclease T7E1) foi avaliado ao longo das primeiras 2 semanas de diferenciação eritroide na descen- dência de células tratadas com RNP antes da enucleação. Os indels foram detectados na descendência eritroide em cada ponto de tempo testado, sugerindo que a edição que ocorreu nas células CD34* foi man- tida durante a diferenciação eritroide e que as células CD34* editadas mantêm o potencial de diferenciação eritroide.
[0377] Os níveis de MRNA de HBG (dia 10 de diferenciação) e pro- teína HbF (dia 20-23 de diferenciação) foram quantificados por ddPCR e análise de HPLC (de acordo com o método de HPLC descrito em Chang 2017 nas páginas 143-44, incorporado por referência aqui), res- pectivamente (Fig. 9). Um aumento de —2 vezes (+ 40% em transcritos de HBG vs. controle compatível com doador não editado) foi observado para a proporção de HBG:HBA (dados não mostrados) e a proporção de HbF/HbF+HDbA (ou seja, HBG mRNA / HGB + HBB mRNA) aumentou para 30% acima do nível detectado em amostras de controle não trata- das correspondentes com doadores.
[0378] Para os pares de nickase D10A Cas9, a regulação positiva do mRNA e da proteína de HbF foi detectada na descendência eritroide (Fig. 9). No que diz respeito à análise da proteína HbF, dois pares apoi- aram a indução de HbF a 20% para dois pares de nickase D10A. Na regulação positiva de HbF foi detectada em descendência eritroide de células CD34* tratadas com Cas9 RNP TS (dados não apresentados). Exemplo 6: Aumento da dose de RNP aumenta a eficiência total de edi- ção em células CD34* humanas adultas no locus HBG.
[0379] A concentração de D10A Cas9 RNP para o par de nickase SpA+Sp85 foi aumentada (concentração padrão de 2,5 uM e 3,7 uM) e entregue às células CD34* mPB por eletroporação. O aumento da con- centração de RNP suportou um aumento nos indels no sítio alvo de HBG para > 30% (Fig. 10A), conforme determinado pela análise de endonu- clease T7E1 do produto de PCR de HBG amplificado para gDNA extra- ído 3 dias após a eletroporação de células CD34*. A análise de sequen- ciamento indicou que o aumento da concentração de RNP aumentou as inserções (Fig. 10B). A descendência eritroide de células CD34* trata- das com RNP também teve um aumento na produção de proteína HbF (Fig. 10C). É importante ressaltar que o potencial de formação de colô- nia hematopoiética foi mantido após a edição (Fig. 10D). Essas células foram então transplantadas em camundongos imunodeficientes e seu enxerto foi avaliado 1 mês (Fig. 10E) e 2 meses (Fig. 10F) após o trans- plante, por amostragem de sangue periférico e medição da percenta- gem de células CD45* humanas. Os dados de enxerto inicial não mos- traram nenhuma diferença no enxerto entre coortes de recetores de con- troles não tratados compatíveis com doadores (O uM RNP) e camun- dongos transplantados com células tratadas com RNP. Além disso, não houve diferença na distribuição da linhagem do sangue humano (mie- loide, células B, células T) dentro da fração CD45* humana entre as coortes nos pontos de tempo indicados (Fig. 10G- H).
[0380] Dois pares de nickase D10A adicionais também foram testa- dos em estudos de resposta à dose RNP em células adultas CD34* mPB (Sp37+SpA, Sp37+SpB). Aqui, as células CD34* mPB foram ele- troporadas com nickases emparelhadas com D10A entregues a 0, 2,5 e 3,75 uM de RNP total. As células tratadas com RNP foram diferenciadas em descendência eritroide e os níveis de proteina HbF (% HbF/HbF+HDbA) foram analisados por análise de HPLC. A frequência in- del detectada em células CD34* foi traçada com os níveis de HbF de- tectados na descendência eritroide a fim de correlacionar a edição e a indução de HbF (Fig. 11A). Células CD34* mPB de controle tratadas com RNP e não tratadas também foram diferenciadas em colônias para avaliar a atividade hematopoiética ex vivo. A atividade das células for- madoras de colônias (CFC) foi mantida para a descendência de células CD34* de controle tratadas com RNP e não tratadas correspondentes de doador (Fig. 11B). Não houve diferença na percentagem de células CDA45+ humanas no sangue periférico de camundongo 1 mês após o transplante e nenhuma diferença na distribuição da linhagem sanguínea (Fig. 11C-D) para células expostas a diferentes pares DI0A RNP em doses diferentes em comparação com células CD34* de controle não tratadas correspondentes de doador. Exemplo 7: A coentrega de RNP direcionando para o intensificador es- pecífico de eritroide de BCL11A e uma sequência de desoxinucleotídeo de cadeia única não específica (N) ou RNPs emparelhados aumenta a edição de genes em células CD34* humanas e suporta a indução da expressão de hemoglobina fetal na descendência eritroide
[0381] A expressão de hemoglobina fetal pode ser induzida por meio da interrupção direcionada da expressão específica da célula eri- troide de um repressor transcricional, BCL171A (Canvers 2015). Uma es- tratégia potencial para aumentar a expressão de HbF por meio de uma estratégia de edição de genes é multiplexar a edição de genes para a introdução da deleção de 13 nt associada ao promotor proximal de HBG e também para a interrupção direcionada do motivo de ligação GATA1 no intensificador específico de eritroide de BCL171A que está na região +58 DHS do íntron 2 do gene BCL11A (Fig. 12). A fim de realizar esta estratégia multiplex para aumentar a expressão do gene através da edi- ção de HbF em multiplex, o efeito de interrupção do intensificador eri- troide BCL11A (BCL11Ae) deve primeiro ser determinada como um único evento de edição.
[0382] Nesta experiência, células CD34* CB foram eletroporadas com Cas9 Ts S. pyogenes complexada com sgRNA transcrita in vitro direcionando para o motivo GATA1 na região +58 DHS do íntron 2 do gene BCL171A (gRNA SpK, Tabela 9) (Fig. 13A). Para determinar se a coentrega de um ssODN específico não alvo aumentaria a edição da sequência alvo, BCL11Ae RNP foi coentregue com ssODN (que não é homólogo à sequência alvo BCL11Ae) em células CD34* CB. A análise T7E1 do produto de PCR do intensificador eritroide BCL11A de gDNA extraído de células CB CD34* tratadas com BCL11Ae RNP indicou que indels de -5% foram alcançados (Fig. 13A). Coentrega de BCL11Ae RNP com um aumento de ssODN específico não alvo em indels de 5 vezes mais a 20%, conforme detectado por análise de endonuclease T7E1. A análise de sequenciamento Illumina indicou que >90% das edi- ções tiveram interrupção do motivo GATA1 no intensificador da região +58 DHS no íntron 2 do gene BCL171A (dados não mostrados). Para aumentar a edição, células CD34* CB humanas foram eletroporadas com Cas9 RNP TS (gRNAs únicos complexados com Cas9 TS) ou com Cas9 RNPs TS emparelhados (gRNAs emparelhados complexados com Cas9 TS), de modo que os sítios de corte em cada par flanquem o sítio alvo para excisão do motivo GATA1 (gRNAs SpC, SpK, SpM, SpN) (Tabela 9). Dois dos gRNAs únicos e dois pares tinham >50% indels conforme determinado pela análise de endonuclease T7E1 (Fig. 13B).
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[0383] Em seguida, células CD34* da medula óssea humana adulta foram eletroporadas com o RNP BCL114e. A análise de sequencia- mento de DNA do produto de PCR BCL11A amplificado a partir de gDNA extraído de células CD34* de medula indicou 15% de edição de gene compreende inserções e deleções (Fig. 14A). É importante res- saltar que todas as deleções resultaram na deleção do motivo GATA1 e todas as inserções interromperam o motivo GATA1 por meio da adição de um pequeno número de pb no motivo. As células CD34* foram se- meadas em ensaios de formação de colônias e as colônias hematopoié- ticas mistas (GEMMs), que correspondem a clones de células CD34”, foram selecionadas. O gDNA foi isolado e analisado por sequencia- mento Illumina para quantificar a interrupção monoalélica e bialélica do sítio alvo. A maioria dos GEMMs diferenciados a partir de clones de cé- lulas CD34* tinham interrupção monoalélica e interrupção bialélica tam- bém foi detectada, com a taxa global indel — 2/8 maior em comparação com a que foi detectada na população de células CD34* em massa (Fig. 14B). Isso provavelmente foi um reflexo da percentagem de progenito- res mieloides comuns (CMPs) que dão origem a GEMMs que consti- tuem uma fração maior das células CD34* heterogêneas em relação às outras linhagens presentes, mas não capturadas/diferenciadas em en- saios CFC de curto prazo. As células CD34* da medula tratadas com RNP também mantiveram cinética semelhante de maturação eritroide (enucleação, Fig. 14C) e diferenciação (aquisição de fenótipo, Fig. 14D) em comparação com células de controle não tratadas correspondentes de doador. A descendência eritroide de células CD34* de medula edi- tada exibiu um aumento de — 5 vezes na indução de HbF, conforme determinado por análise de citometria de fluxo (Fig. 14E).
[0384] A edição de genes e a indução de hemoglobina fetal também foram avaliadas em células humanas adultas CD34* mPB. A coentrega de BCL11Ae RNP e ssODN não especifico suportou — 20% indels no sítio alvo (Fig. 15A). Para avaliar a indução precoce de hemoglobina fetal na descendência eritroide de células editadas, as células CD34* mPB foram diferenciadas em eritroblastos e a indução da transcrição da hemoglobina fetal (MRNA de HBG) foi avaliada por análise de gqRT- PCR. A descendência eritroide de células CD34* tratadas com BCL11A RNP exibiu uma indução de 2 vezes mais de MRNA HBG em compara- ção com controles não tratados, sugerindo indução da expressão de he- moglobina fetal (Fig. 15B). As células CD34* da medula tratadas com RNP também mantiveram cinética de diferenciação semelhante (aquisi- ção de fenótipo, Fig. 15C) em comparação com células de controle não tratadas correspondentes de doador. Exemplo 8: Eletroporação de Cas9 RNP direcionando para a caixa CCAATdistal no promotor HBG em células progenitoras/tronco hemato- poéticas humanas gera várias deleções que promovem a expressão de HBG após diferenciação eritroide
[0385] A persistência hereditária da hemoglobina fetal (fenótipo HPFH) é observada em pacientes com uma deleção de 13 nt que se sobrepõe à caixa CCAAT distal de HBG. Cas9-RNP direcionado à caixa CCAAT distal de HBG pode ser usado em células progenitoras/tronco hematopoiéticas (HSPCs) para reproduzir o fenótipo HPFH, provavel- mente interrompendo os sítios de ligação de fatores de transcrição que reprimem a expressão de HBG. As quebras de cadeia dupla de DNA (DSBs) criadas por Cas9 RNP podem levar a uma variedade de resul- tados de reparação, incluindo inserções e deleções proximais ao sítio de corte RNP. Alguns dos indels introduzidos podem interromper a liga- ção de fatores de repressão com menos eficiência. Foi previsto que mo- delos de doadores ssODN poderiam ser usados para melhorar a fre- quência de indels que reproduzem o fenótipo HPFH direcionando a re- paração para deleções específicas que levam à expressão do gene HBG.
[0386] Para avaliar o resultado da reparação de Cas9-RNP direcio- nado à caixa CCAAT distal no promotor HBG, Cas9 foi complexada com o RNA guia OLI7066 sintetizado quimicamente (SEQ ID NO: 970, Ta- bela 10) ("OLI7Z066-RNP") e RNP foram eletroporados em HSPCs a 16 UM.
A análise de sequenciamento (sequenciamento de próxima gera- ção) realizada no dia 2 pós-eletroporação indicou que 23,7% dos alelos carregavam a deleção de 13 nt idêntica à mutação de HPFH de ocor- rência natural (Fig. 16, deleção de 13 nt indicada por "A-102:-114"). Vá- rias outras deleções frequentes foram também observadas em torno do sítio do corte OLI7066-RNP (Fig. 16).
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[0387] Uma experiência de célula única foi realizada para avaliar o nível de expressão de HbF induzida pelas deleções mais frequentes ge- radas pela entrega de RNP (Cas9 complexado com o gRNA OLI7066 (SEQ ID NO: 970) ("OLITZO66-RNP")) direcionando para a caixa distal CCAAT.
Resumidamente, HSPC únicas eletroporadas com complexos OLI7066-RNP que direcionam para a caixa CCAAT distal foram seme- adas em poços únicos e diferenciadas em células eritroides por cultura durante 18 dias na presença de citocinas humanas (eritropoietina, SCF, IL3), plasma humano (Octoplas), e outros suplementos (hidrocortisona, heparina, transferrina, insulina). Uma fração da descendência eritroide de cada célula foi dividida após 14 dias para extração de gDNA.
A aná- lise de sequenciamento do produto de PCR de HBG1 e HBG?2 foi reali- zada para identificar o genótipo de cada população clonal.
A análise ddPCR também foi realizada no DNA genômico de cada população clo- nal para detectar deleções do fragmento de 4,9 kb entre os sítios alvo do RNA guia em HBG1 e HBG2. No dia 18, as células eritroides deriva- das de cada clone foram lisadas e a expressão relativa das cadeias de globina foi determinada por cromatografia líquida de ultraeficiência (UPLC). Finalmente, o nível de expressão da cadeia de G-gama (Gy)- globina, A-gama (Ay)-globina (ou AG-gama (AGy)-globina resultante da deleção de 4,9 kb) conforme determinado por [cadeia gamal/[todas as cadeias gama + cadeia beta] foi comparada em relação aos indels trans- portados em HBG1 e HBG2, respectivamente.
A deleção 13 nt que re- produz o genótipo HPFH foi mostrado para induzir a expressão de HBG.
Além disso, foram identificas várias deleções que ocorrem não natural- mente únicas que induzem a expressão de HBG em níveis comparáveis.
Estas incluem HBG A-112:-115 ("deleção 4 nt"), HBG A-104:-121 ("de- leção 18 nt"), HBG 4-116 ("deleção 1 nt") (Figs. 17A-D).
Exemplo 9: A coentrega de Cas9 RNP direcionando para a região em ou próximo à caixa CCAAT distal com doadores ssODN suporta a edi- ção de genes precisos em células progenitoras/tronco hematopoiéticas humanas expressão aumentada de gama-globina na descendência eri- troide
[0388] Para melhorar a frequência de indutores de HDF em HSPC, modelos de reparação de doador de desoxinucleotídeo de cadeia sim- ples (ssSODNs) "codificando" identificaram deleções indutoras de HbF (por exemplo, as deleções "1nt" (HBG A-116) e "4nt" (HBG A-112:-115)) foram manipulados (Fig. 18). ssSODNs usados para induzir essas dele- ções foram os seguintes: "Int" ssODNs: OLI16417-18; "4nt" ssODNs: OLI6424, OLIN16430, Tabela 11). ssSODNs foram desenhados com bra- ços de homologia de 90 nt flanqueando essa sequência ausente para criar uma deleção perfeita. Os ssSODNs foram modificados para conter fosforotioatos (PhTx) nas extremidades 5' e 3'. ssODNs adicionais foram desenhadas para codificar mutações de ocorrência natural observadas em pacientes com HPFH (por exemplo, HBGA-102:-114 (deleção "13 nt", Fig. 18) e mutação HBG-117 G>A ("HBG-117 G>A"). ssODNs usa- dos para induzir essas deleções foram os seguintes: "13nt" ssODN: OLI6412, OLIN6414 e "-117 G>A" ssODN: OLIIN6415-16, Tabela 11). Finalmente, para facilitar a avaliação da correção do gene, ssSODN s (OLI16411, OLI16413, Tabela 11) foram desenhados para codificar uma deleção 11 nt sobrepondo a caixa CCAAT distal que ocorre em baixa frequência após a eletroporação de OLI8394-RNP sozinho (0,1 %, ver Fig. 19B, Fig. 18).
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[0389] Os doadores ssODN, OLI16409 - OLI1I6418, OLII6424 e OLI6430 (Tabela 11), foram coentregues a células CD34* mPB adultas com proteína Cas9 pré-complexada a OLI8394 ("OLI8394-RNP") ou proteína Cas9 pré-complexada a OLI7066 ("OLI7066 -RNP") direcio- nando para a caixa CCAAT distal de HBG (Tabela 10). Resumidamente, as células CD34* mPB foram pré-estimuladas por 2 dias com citocinas humanas em X-Vivo-10 e então eletroporadas com uma mistura com- posta por um doador ssODN a 2,5 uM e OLI8394-RNP ou OLI7066-RNP a 2 uM. Após três dias após a eletroporação, o DNA genômico foi extra- ído e o sequenciamento de próxima geração foi realizado nos produtos de PCR de HBG. O nível de edição foi aumentado de 62,1% ao usar OLI8394-RNP sozinho para até 78,73% ao coentregar "-11"ssODN (ou seja, OLI16411 ou OLII6413) (Fig. 19A). O nível de correção de genes mediada pela coentrega dos modelos ssSODN para HSPC humano foi mostrado contribuir até 42,4% do total de indels como medido pela fre- quência de deleção "-11"dentro indels totais detectados por sequencia- mento do Produto de PCR de HBG de HSPC eletroporado com OLI8394-RNP +"11"ssODN (Fig. 19B). A correção de gene eficiente foi observada em outros modelos ssODN e OLI8394-RNP (Figs. 19C-E, G) ou OLI7066-RNP (Fig. 19F).
[0390] As células CD34* mPB eletroporadas com OLI8394-RNP ou OLI7066-RNP coentregues com modelos ssODN foram diferenciadas em células eritroides para avaliar o nível de expressão de gama-globina resultante da edição do gene. Para determinar se a coentrega de RNP com ssODNs aumentou a produção de hemoglobina fetal na descen- dência eritroide de células CD34* adultas editadas, as células foram di- ferenciadas em células eritroides por cultura por 18 dias na presença de citocinas humanas (eritropoietina, SCF, IL3), plasma humano (Octoplas) e outros suplementos (hidrocortisona, heparina, transferrina, insulina). No dia 18, os níveis de expressão relativa de cadeias de gama-globina sobre cadeias de globina tipo beta total (cadeias gama/[cadeias gama + cadeia beta]) foram medidos por UPLC. Até 39,1% de gama-globina foi detectada após a coentrega de ssSODN em vez de 29% quando se utiliza OLI8394-RNP isolado (Figs. 20A-B).
[0391] O efeito da dose de ssODN foi avaliado usando ssSODN OLI16424. As células CD34+ mPB foram pré-estimuladas por 2 dias com citocinas humanas em X-Vivo-10 e depois eletroporadas com uma mistura composta por OLI16424-ssODN em doses que variam de 0,625 UM a 10 uM e OLI8394-RNP a 2 uM. Após três dias após a eletropora- ção, o DNA genômico foi extraído e o sequenciamento de próxima ge- ração foi realizado nos produtos de PCR de HBG. O aumento da dose de ssODN até 5 uM resultou em correção de gene aumentada e fre- quência reduzida de deleções de 4,9 kb entre HBG1 e HBG2 (conforme medido por ddPCR), mantendo o nível de edição geral e sem afetar a viabilidade celular (Figs. 21A-C). O nível de gama-globina aumentou até 39,5% do total de cadeias semelhantes a beta na dose de 5 uM de ssODN (Fig. 21D), conforme medido por análise UPLC dos lisados ce- lulares após 18 dias de cultura eritroide.
[0392] A coentrega do OLI8394-RNP e do OLI16424 ssODN foi oti- mizada pela variação da dose relativa de ssSODN e RNP. As células CD34* mPB foram pré-estimuladas por 2 dias com citocinas humanas em X-Vivo-10 e depois eletroporadas com uma mistura composta de OLI16424-ssODN em doses que variam de 1,25 uM a 5 uM e OLI8394- RNP de 2 uM a 8 uM. Após três dias após a eletroporação, o DNA ge- nômico foi extraído e o sequenciamento de próxima geração foi reali- zado nos produtos de PCR de HBG. Um resultado de edição de genes melhorado, ou seja, uma frequência mais baixa de deleções de 4,9 kb entre os genes HBG1 e HBG2 e um nível mais alto de correção de ge- nes, foi alcançado com uma dose de RNP mais baixa combinada com uma dose de ssODN mais alta (Fig. 22A-C). Isso resultou no nível mais alto de expressão de gama-globina após a diferenciação eritroide (Fig. 22 D). Exemplo 10: A correção do gene em células progenitoras/tronco hema- topoéticas humanas pode ser alcançada com modelos ssODN curtos com braços de homologia simétricos e assimétricos
[0393] Para determinar se correção de gene pode ser conseguida utilizando modelos mais curtos do que os anteriormente testados, foi usado 180 nt de comprimento no Exemplo 9, ssODNs que codificam a deleção "4 nt" (HBGA-112: -115) foram concebidos e sintetizados com braços de homologia mais curtos simétricos ou assimétricos em relação à sequência deletada (OLI16419- OLI16423, e OLI16425 - OLIN16429, Tabela 11, Fig. 23A). Resumidamente, as células CD34* mPB foram pré-estimuladas por 2 dias com citocinas humanas em X-Vivo-10 e en- tão eletroporadas com uma mistura composta por um doador ssSODN (OLI16424, OLI16419 ou OLII6421) a 2,5 uM e proteína Cas9 pré-com- plexada para OLI8394 (OLI8394 -RNP) a 2 uM. Após três dias após a eletroporação, o DNA genômico foi extraído e o sequenciamento de pró- xima geração foi realizado nos produtos de PCR de HBG. A edição total e o nível de correção do gene foram semelhantes em ssODNs com bra- ços de homologia de 90 nt simétricos, braços de homologia de 50 nt simétricos ou braços de homologia de 40/80 assimétricos (Fig. 23B). Exemplo 11: A coentrega de doadores ssSODN com RNPs D10A-Cas9 emparelhados a células CD34* adultas suporta a correção de genes na caixa CCAAT distal de HBG
[0394] Para determinar se a correção de genes mediada por ssSODN para introduzir deleções de interrupção da caixa CCAAT (como a dele- ção "4nt") em células CD34* mPB poderia ser suportada por pares de nickase D10A, células CD34* foram eletroporadas com D10A Cas9 RNP'ss direcionados para HBG, com ou sem ssODN (OLI16424) (Tabela
11). Resumidamente, Sp37 e SpA gRNA foram sintetizados quimica- mente (OLI7075 e OLI7074, respectivamente, Tabela 12) e complexa- dos com a proteína mutante de nickase D10A-Cas9. Células CD34* mPB adultas humanas foram pré-estimuladas por 48h em meio suple- mentado com citocinas humanas.
Em seguida, o par DI0A-Cas9 RNP compreendendo Sp37+SpA (2 uM + 2 uM) foi entregue às células CD34*, sozinho ou em combinação com OLII6424, e o DNA genômico foi extraído 3 dias pós-eletroporação para análise de sequenciamento Illumina.
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Exemplo 12: Cpf1 RNP contendo gRNA direcionado à caixa CCAAT su- porta a edição de genes em células progenitoras/tronco hematopoiéti- cas humanas
[0396] Um RNA guia Cpf1, HBG1-1 (ou seja, OLI13620 (Tabela 13)), foi desenhado para direcionar para a caixa CCAAT. Para determi- nar a configuração de sinal de localização nuclear ideal para entrega Cpf1 ("AsCpf1") Acidaminococcus sp. em células CD34*, HBG1-1 gRNA foi complexado a duas variantes de sinal de localização nuclear (NLS) de AsCpf1, nomeadamente His-AsCpf1-nNLS (SEQ ID NO: 1000) e His- AsCpf1-sNLS-sNLS (SEQ ID NO:1001). "His" refere-se a uma sequên- cia de purificação de seis histidinas, "AsCpf1" refere-se à sequência da proteína Cpf1 Acidaminococcus sp.,"nNLS" refere-se à nucleoplasmina NLS, e "sNLS" refere-se a SV40 NLS.
[0397] Resumidamente, as células CD34* mPB foram pré-estimula- das por 2 dias com citocinas humanas em X-Vivo-10 e então eletropo- radas com os RNPs a 5 uM ou 20 uM. O DNA genômico foi extraído três dias após a eletroporação e o sequenciamento de próxima geração foi realizado nos produtos de PCR de HBG. HBG1-1 gRNA complexado com qualquer uma das variantes Cpf1 NLS testadas ("His-AsCpf1- SNLS-sSNLS HBG1-1 RNP" ou "His-AsCpf1-nNLS HBG1-1 RNP"), su- porta a edição de células CD34+ no sítio alvo de 13 nt. His-AsCpf1- SNLS-sSNLS HBG1-1 RNP gerou 60,6% dos alelos editados e His-As- Cpf1-nNLS HBG1-1 RNP gerou 51,1% dos alelos editados na dose mais alta testada (Fig. 25A).
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His-AsCpf1-sNLS-sNLS complexada com HBG1-1 gRNA ("His- AsCpf1- SNLS-sSNLS HBG1-1 RNP"), quer isoladamente, ou em combinação com 2,5 uM de um dos doadores ssSODNs (OLI16430, OLI164324, OLII6409, ou OLI16410). A coentrega de RNP e ssODN doador que codifica a deleção de 18 nt com braços de homologia de cadeia positiva (OLI16409) aumentou a frequência de edição de 39,5% sem doador para 73,3%, conforme determinado pela análise de sequenciamento do produto de PCR de HBG do DNA genômico extraído em 72 horas pós- eletroporação (Fig. 26A).
[0399] Uma análise mais aprofundada do tipo específico e tamanho das deleções no sítio alvo revelou que, na presença do doador de ca- deia positiva de 18 nt (OLI16409), 57,3% dos alelos carregavam a dele- ção de 18 nt em comparação com 7,5% dos alelos quando His-AsCpf1- SNLS-sSNLS HBG1-1 RNP foi entregue sozinho (Fig. 26B). A coentrega de ssODN mediou a reparação precisa de DSB de DNA, porque a elimi- nação 18 nt representado 71,2% de todos os indels gerados com coen- trega de ssSODN OLI16409 e His-AsCpf1-SNLs-sNLS HBG1-1 RNP, enquanto que a deleção de 18 nt representou apenas 19,0% de todos os indels gerados aquando da entrega de His-AsCpf1-SNLs- SNLS HBG1-1 RNP sozinho (Fig. 26C).
[0400] Embora os dados na Figuras 26A-26C originalmente suge- rem que a coentrega de Cpf1 RNP com doadores ssSODN aumenta a edição precisa de genes de DNA genômico resultando na deleção de 18 nt, subsequente teste repetindo a experiência do Exemplo 13, con- firmou que estes dados foram um artefato da experiência. No entanto, os dados adquiridos a partir das experiências repetidas subsequentes que testam RNP AsCpfi usando RNA guia de HBG1-1 e ssODN OLI6409 indicou que a coentrega de um doador ssODN suporta o au- mento da edição total, em células CD34* mPB humanas, embora não associadas a reparação precisa do DNA DSB para a "deleção de -18nt"
(ver Exemplo 21). Exemplo 14: Cpf1 RNP contendo gRNA direcionado à região da caixa CCAAT distal do promotor HBG suporta edição de genes em células- tronco hematopoiéticas humanas/células progenitoras que promovem a indução da expressão da proteína HbF na descendência eritroide
[0401] O RNA guia HBG1-1 (Tabela 14) tendo um domínio de dire- cionamento compreendendo SEQ ID NO: 1002 (Tabela 15), tem como alvo um sítio dentro do promotor de HBG (Fig. 27A). O HBG1-1 gRNA (SEQ ID NO: 1022) foi complexado a AsCpf1 tipo (ASCpf1-sNLS-sNLS, SEQ ID NO: 1001) para formar um RNP ("AsCpf1- HBG1-1-RNP", Ta- bela 14). Este complexo (5 uM ou 20 uM) foi então eletroporado em células CD34+ derivadas de sangue periférico mobilizado (MPB) usando o nucleofetor Amaxa (Lonza) ou o dispositivo de eletroporação MaxCyte GT (MaxCyte, Inc.). O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi analisado por sequenciamento Illumina (NGS) do sítio alvo amplifi- cado por PCR três dias após a eletroporação. ASCpf1-HBG1-1-RNP su- portou edição no alvo de 43% e 17%, respectivamente, nos sistemas de eletroporação Amaxa e MaxCyte (Figs. 28A (Amaxa) e 28B (MaxCyte)). Após a edição das células CD34+ mPB, a diferenciação ex vivo na li- nhagem eritroide foi realizada por 18 dias (Giarratana 2011). Em se- guida, níveis de expressão relativos das cadeias da gama-globina (so- bre o total de cadeias do tipo beta-globina) foram medidos por UPLC (Figs. 28A (Amaxa) e 28B (MaxCyte)). AsSCpf1-HBG1-1-RNP levou a um aumento da expressão de gama-globina em até 21% acima dos ní- veis detectados em células derivadas de células CD34+ mPB simuladas eletroporadas (Fig. 28A).
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Exemplo 15: Eficiência de edição Cpf1 RNP na região de caixa CCAAT do promotor HBG é aumentada quando coentregue com Cas9 RNP S. Pyogenes sem impacto na viabilidade
[0402] Foi formulada a hipótese de que a coentrega de Cpf1-RNP com Cas9 RNP S. pyogenes de direcionamento proximal, quer cataliti- camente inativa ou introduzindo cortes simples, poderia aumentar os ní- veis de edição no sítio alvo. Em uma tentativa de aumentar a edição mediada por Cpf1-RNP na região da caixa CCAAT distal do promotor HBG, HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP (composto de His-AsCpf1-sNLS- SNLS-H800A (SEQ ID NO: 1032) complexado com HBG1-1 gRNA com uma modificação 3' como mostrado na Tabela 14 (SEQ ID NO: 1041) foi coentregue em células CD34+ mPB com: (1) Cas9 D1I0A RNP S. Pyogenes contendo uma proteína Cas9 D10A (His-NLS -SpCas9D10A, SEQ ID NO:1034) complexada com um RNA guia de comprimento total (100mer) selecionado a partir de: (a) SpA gRNA (Tabelas 14, 15; Fig. 27B) ("SpA-D10A-RNP", Tabela 14) ou (b) SpG gRNA (Tabelas 14, 15; Fig. 27C) ("SpG-D10A-RNP", Tabela 14)); (2) Cas9 RNP TS S. Pyoge- nes contendo uma proteína Cas9 TS (SpCas9TS, SEQ ID NO:1033) complexada com um RNA guia morto truncado (95mer - com uma região protoespaçadora encurtada) selecionado a partir de (a) tSpA dgRNA (Tabelas 14, 15; Fig. 27E) ("t(SpA-Cas9-RNP", Tabela 14); (b) Sp182 dgRNA (Tabelas 14, 15; Fig. 27F) ('Sp182-Cas9-RNP", Tabela 14); ou (c) t(SpA-Cas9-RNP e Sp182-Cas9-RNP (Tabelas 14, 15, Fig. 27D). Os complexos RNP foram eletroporados usando o dispositivo MaxCyte GT (MaxCyte, Inc). O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi então analisado por sequenciamento lllumina (NGS) do sítio alvo amplificado por PCR três dias após a eletroporação. Em todas as combinações tes- tadas, independentemente da enzima Cas9 S. Pyogenes usada (D10A ou TS) e da orientação PAM, a edição total foi aumentada acima dos níveis observados após a entrega de Maxcyte de HBG1-1-As- Cpf1H800A-RNP sozinho (Fig. 29 e Tabela 16). Além disso, não houve efeito prejudicial na viabilidade das células CD34+ mPB quando Cas9 RNP S. Pyogenes foi coentregue (Fig. 30). Tabela 16: Sumário de indels e expressão de gama globina com cada combinação de RNP na dose máxima de RNP testada Gama Globina (sobre Cpf1 RNP Cas9 RNP1 Cas9 RNP2 o total de cadeias se- melhantes a beta) HBG1-1-As- o o cms 1 fee a HBG1-1-As- o o [Sides [comer am e HBG1-1-As- o o [Ssúve mamar fan des HBG1-1-As- o o [Silas lSmesme es em HBG1-1-As- Sp182-Cas9- o o L[cpmsanen Re es far HBG1-1-As- Sp182- o o) Exemplo 16: Perfil de edição Cpf1 pode ser manipulado com coentrega de Cas9-D10A-RNP S. Pyogenes
[0403] Além do aumento na edição total observada quando HBG1- 1-AsCpf1H800A-RNP foi coentregue às células CD34+ mPB com Cas9- D10A-RNP S. Pyogenes (Fig. 29), as alterações no perfil indel também foram observado. A introdução de uma quebra de cadeia única proximal ao sítio alvo Cpf1-RNP pela enzima D10A (Fig. 31A) alterou a direcio- nalidade, comprimento e/ou posição dos indels (Fig. 31B). Por exemplo, Sp182-D10A-RNP mudou fortemente o perfil em direção ao sítio de corte introduzido pelo D10A RNP, com deleções de vários comprimen- tos estendendo-se do sítio de corte Cpf1 em direção ao sítio de corte a montante (Sp182-D10A-RNP, Fig. 31B). Enquanto SpA-D10A-RNP também promoveu a geração de deleções estendendo-se do sítio de corte HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP para o sítio de corte introduzido pela enzima D10A (aqui localizada a jusante), neste caso, deleções adicio- nais aparentemente originadas do sítio de corte, mas não se esten- dendo totalmente ao sítio de corte HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP, tam- bém foram produzidas (SpA-D10A-RNP, Fig. 31B).
[0404] É provável que a orientação, a cadeia alvo e a distância do sítio alvo Cas9-D10A-RNP S. Pyogenes ao sítio alvo Cpf1-RNP leve a diferenças na posição e comprimento das mutações promovidas pelo corte de DNA adicional (Fig. 31A). Deve-se notar que em certas aplica- ções esta manipulação direcional do perfil indel, ou seja, um aumento na frequência de indels ocorrendo entre os sítios de ligação Cpf1-RNP e Cas9 D10A-RNP S. Pyogenes, poderia ser usada para favorecer um resultado da edição desejada, aumentar a taxa de indels produtivos (por exemplo, indels interrompendo um sítio direcionado). No caso estabele- cido dentro, para interromper a região alvo dCCAAT e induzir a expres- são da proteína HbF, a coentrega de HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP com D10A-RNP S. Pyogenes levou a um aumento dos níveis de gama glo- bina em 16,7% (SPG-D10A-RNP) ou 19,0% (SpA-D10A-RNP) acima dos níveis detectados em células eletroporadas simuladas, como detec- tado por análise de UPLC após 18 dias de diferenciação eritroide após eletroporação (Fig. 29 e Tabela 16). A frequência de indels produtivos foi maior ao emparelhar HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP com SpA-D10A- RNP (versus SpG-D10A-RNP) como um maior aumento nos níveis de HbF (19% com Cas9D10A-SpA-RNP vs 16,7% com SpG-D10A-RNP) foi obtido a partir de um nível de edição inferior (42,6% com SpA-D10A- RNP vs 88,6% com SpG- D10A- RNP) (Fig. 29 e Tabela 16). Exemplo 17: A edição Cpf1 é aumentada sem alterar o perfil de edição na presença de Cas9 TS RNP S. Pyogenes contendo um RNA guia morto
[0405] Ao coentregar HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP (a uma dose fixa de 6 uM) para células CD34+ mPB com doses crescentes de Sp182- Cas9-RNP (complexado com um gRNA morto 95mer truncado, Sp182), usando o dispositivo eletroporador MaxCyte, um aumento de edição foi observado até mais de 10 vezes (85,4% editando com a dose mais alta de Sp182-Cas9-RNP versus 8,0% quando HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP foi administrado sozinho) (Fig. 29). Os níveis de edição alcançados aqui por coentrega de Sp182-Cas9-RNP também ultrapassaram em muito os níveis de edição obtidos usando o dispositivo eletroporador MaxCyte quando HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP foi entregue sozinho em doses tão altas quanto 20 uM (Fig. 28B). Em contraste com os resultados obser- vados pela coentrega de um D10A-RNP (no Exemplo 16), o aumento na edição obtido pela coentrega de HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP com Sp182-Cas9-RNP (Cas9-TS complexada com um gRNA truncado) não foi associado a um impacto aparente no perfil indel.
Os indels detecta- dos em células eletroporadas foram centrados em torno do sítio de corte da Cpf1 de forma simétrica proximal e não foram detectados indels no sítio alvo Sp182-cas9-RNP (Fig. 32A). Note-se que, 96% do total de indels foram interromper a caixa CCAAT-distal, e 79,5% do total de in- dels interromperam 3 ou mais nucleotídeos d o motivo caixa CCAAT (Fig. 32B). Otimização de dosagem adicional usando HBG1-1-As- Cpf1H800A-RNP (composto de His-AsCpf1-sNLS-sNLS-H800A (SEQ ID NO: 1032) complexado com HBG1-1 gRNA (SEQ ID NO: 1022)) e Sp182-Cas9-RNP permitiu níveis de edição de até 92% em células mPB-CD34+ em 120 horas após a eletroporação utilizando o dispositivo MaxCyte, e levou a níveis de expressão da cadeia gama de 32% acima da base em células derivadas eritroides (41% de cadeias gama em cé- lulas tratadas, 8% em células simuladas tratadas) (Fig. 33). Esses re- sultados demonstram que um RNP composto de proteína Cas9 TS S.
Pyogenes complexada com um gRNA truncado pode aumentar a edição de um Cpf1-RNP de ligação proximal sem introduzir níveis detectáveis de edição em seu próprio sítio de ligação nem afetando visivelmente o com- primento nem a direcionalidade dos indels gerados pelo Cpf1-RNP. Aqui, o reforço de edição fornecido pelo Sp182-cas9-RNP permite alta edição do HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP no promotor HBG, com uma alta frequên- cia de indels interrompendo o motivo alvo da caixa CCAAT distal e que conduzem níveis terapeuticamente relevantes de expressão da cadeia gama nas células eletroporadas de descendência eritroide em massa. Exemplo 18: Distribuição clonal de HbF dentro da população de células editada com Cpf1 gRNA direcionado à caixa CCAAT distal
[0406] Uma experiência de célula única foi realizada em seguida para avaliar a distribuição dos níveis de expressão da cadeia gama em células eritroides derivadas de células CD34+ mPB eletroporadas com HBG1-1-AsCpf1H800A-RNP (composto de His-AsCpf1-sNLS-sNLS- H800A (SEQ ID NO: 1032) complexado com HBG1-1 gRNA com uma modificação 3' como mostrado na Tabela 14 (SEQ ID NO: 1041)) + com- binação Sp182-Cas9- RNP (Fig. 27F, Tabela 14). Depois de serem dei- xadas para se recuperar durante 48 horas pós-eletroporação, as células foram classificadas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) em 1 célula/poço em placas de 384 poços tratadas com cultura de não tecido. As células foram então diferenciadas e expandidas clo- nalmente por 18 dias na linhagem eritroide (adaptado de Giarratana 2011). A análise de UPLC foi realizada para determinar a distribuição dos níveis de expressão da cadeia gama (percentagem de cadeias gama/[cadeias tipo beta total]) na descendência eritroide clonal de célu- las derivadas da população total de células mPB-CD34+ inicialmente editadas. Considera-se que, para atingir um benefício funcional e aliviar os sintomas associados à doença falciforme, -30% das células eritroi- des deveriam ter níveis de hemoglobina fetal maiores que 30%. Dos clones analisados, 83,1% tinham níveis de cadeias gama acima do nível médio detectado em clones eritroides derivados de células mPB CD34+ simuladas eletroporadas (valor médio = 18,8%), 64,2% tinham níveis de cadeias gama superior a 30% do total de tipo beta e 35,8% tinham níveis de cadeias gama excedendo 48,8% do total tipo beta (30% + 18,8% do nível médio nas células de controle) (Fig. 34). Exemplo 19: Rastreamento de Cpf1 gRNAs direcionados à região pro- motora de HBG
[0407] Para identificar outro gRNA AsCpf1 que poderia ser usado como um componente de um único RNP ou em combinação com um "elemento de reforço" para aumentar a edição da região do promotor de HBG em células CD34+ e induzir a expressão de globina fetal nas célu- las modificadas de descendência eritroide, sequências de gRNA His- AsSCpf1-NLS-NLS ("AsCpf1," SEQ ID NO:1000); AsSCpf1 S542R/K607R ("ASCpf1 RR," SEQ ID NO:1036); ou ASsCpf1 S542R/K548V/N552R ("ASCpf1 RVR," SEQ ID NO:1037 direcionadas a vários domínios do promotor de HBG (Tabela 17) foram desenhadas (listadas na Tabela 18). ASCpf1 RR e ASCpf1 RVR são variantes projetadas de AsCpf1 que reconhecem TYCV/ACCC/CCCC e TATV/RATR PAMs, respectiva- mente (Gao 2017). Tabela 17: Subdomínios da região genômica de HBG Coordenada genô- | Nucleotídeos Nome da Região mica de HbG* Chr 11 TCCTAMAGCT TGGAACACTT TCCCTTCCTT | Região 1: A ju (NC 000011.10): AAGAACCATC CTTGCTACTC AGCTGCAATC | sante de HBG1 5,247,883-5,248,186 — | AATCCAGCCC CCAGGTCTTC ACTGAACCTT
TTCCCATCTC TTCCAMAACA TCTGTTTCTG AGAAGTCCTG TCCTATAGAG GTCTITCTTC CCACCGGATT TCTCCTACAC CATTTACTCC CACTTGCAGA ACTCCCGTGT ACAAGTGTCT TTACTGCTIT TATITGCTCA TCAAAATGCA CATCTCATAT AAAAATAMAT GAGGAGCATG
CACACACCAC AAACACAMAC AGGCATGCAG AAAT (SEQ ID NO:1118) Chr 11 ATAMAGATGA ACCCATAGTG AGCTGAGAGC | Região 2: Íntron 2 (NC 000011.10): TCCAGCCTGG CCTCCAGATA ACTACACACC | HBG1-A 5,248,509 - 5,249,173 | AAGCTTCCAC CCAGAATCAA GCCTATGTTA
ACTTCCCTCA AAGCCTGAGA TTTTGCCTTC CCATTAAATG CAGGTAGTTG TTCCCCTTCA AGCACTAGTC ACTGGCCATA ATTTAAATCT TGCTATCTTC TTGCCACCAT GAACCCTGTA
Coordenada genô- | Nucleotídeos Nome da Região mica de HbG*
TGTTGTAGGC TGAAGACGTT AAAAGAAACA CACGCTGACA CACACACACA CACGCGCGCG CGCACACACA CACACACACA CAGAGCTGAC TTTCAAAATC —TACTCCAGCC CAAATGTTTC AATTGTTCCT CACCCCTGGA CATACTTTGC CCCCATCTGG AATTAMAGGA TATAAGTTTG TAATGAAGCA TTAGCAGCAT TTTATATGTG TCCAGCTGAT ATAGGAATAG CCTTAGCAAT GTATGTTTGG —CCACCAAAGT TCCCCACTTT GACTGAGCCA ATATATGCCT TCTGCCTGCA TCTTTTTAAC — GACCATACTT GTCCTGCCTC CAGATAGATG —TTTTAMAACA ACAAAAATGA GGGAAAGATG AAAGTTCTIT CTACTGGAAT CTAATAMAGA —AAAGTCATTT TCCTCATTTC
CACCTCTCTT TTCTCAMAGT CAAAATTGTC CATCT (SEQ ID NO:1119) Chr 11 CCCTAAAACA TTACCACTGG GTCTCAGCCC | Região 3: Íntron 2 (NC 000011.10): AGTTAGTCCT CTGCAGTTTC TTCACCCCCA | HBG1-B 5,249,198 — 5,249,362 | ACCCCAGTAT CTTCAAACAG CTCACACCCT
GCTGTGCTCA GATCAATACT CCGTTGTCTA
AGTTGCCTCG AGACTAAAGG CAACAGGGCT GAAACATCTC CTGGA (SEQ ID NO:1120) Chr 11 CTGTGAGATT GACAAGAACA GTTTGACAGT | Região 4: Íntron 1 (NC 000011.10): CAGAAGGTGC CACAAATCCT GAGAAGCGAC | HBG1 5,249,591-5,249,712 | CTGGACTTTT GCCAGGCACA GGGTCCTTCC
TTCCCTCCCT TGTCCTGGTC ACCAGAGCCT AC (SEQ ID NO:1121) Chr 11 GCCGCCGGCC CCTGGCCTCA CTGG (SEQ ID | Região 5: Região - (NC 000011.10): NO:1122) 60 nt do Sítio de 5,249,904 — 5,249,927 Iniciação da Transcrição (TSS) HBG1 Chr 11 CCTTGTCAAG GCTATTGGTC AAGGCAAGGC | Região 6: Região - (NC 000011.10): TGG (SEQ ID NO:1123) 110 nt de TSS 5,249,955 — 5,249,987 HBG1 Chr 11 TGAGATAGTG TGGGGAAGGG GCCCCC | Região 7: Região - (NC 000011.10): AAGAGGATAC (SEQ ID NO:1124) 200 nt de TSS 5,250,040 — 5,250,075 HBG1 Chr 11 TATAGCCTTT GCCTTGTTCC GATTCAGTCA | Região 8: Região- (NC 000011.10): TTCCAGTTTT T (SEQ ID NO:1125) 250 nt de TSS 5,250,089 — 5,250, 129 HBG1 Chr 11 TCTTCCCTITT —AGCTAGTTTC CTTCTCCCAT | Região9: Região- (NC 000011.10): CATAGAGGAT ACCAGGACTT CTTTTGTCAG |333 nt de TSS 5,250,141 —5,250,254 | CCGTTTTITA CCTTCTIGTC TCTAGCTCCA | HBG1 GTGAGGCCTG TAGTTTAAAG CTAA (SEQ ID NO:1126) Chr 11 CCACAGTTTC AGCGCAGTAA TAGATTAGTG | Região 10: Região (NC 000011.10): TTACATAATA —TAAGACCTAA TGCTTACCTC |-650 nt de TSS 5,250,464 — 5,250,549 | AATATCTACT TATCCGTACC TATTTG (SEQ ID | HBG1 NO:1127)
Coordenada genô- | Nucleotídeos Nome da Região mica de HbG* (NC 000011.10): TGTGTATTTA CCACTGGATA AGTGTGTGTG |-800 nt de TSS 5,250,594 — 5,250,735/ | CTGGCTGATG ACCCAGGGTT TTGGCGTAGC | HBG1 TCTTCTATGC —TCAGTAMAGA TGATGGTAGA ATGTTCTTTIG GCAGGTACTG TG (SEQ |D NO:1128) Chr 11 CAATAAMAGAT GAACCCATAG TGAGCTGAGA | Região 12: Íntron (NC 000011.10): GCTCCAGCCT GGCCTCCAGA TAACTACACA |2HBG2-A 5,253,425 — 5,254,121 CCAAGCTTCC —ACCCAGAATC AAGCCTATGT
TAACTTCCCT CAAAGCCTGA GATTTTGCTT TCCCATTAMA TGCAGGTAGT TGTTCTTCTT GCAGCACTAG TCACTGGCCA TAATTTAAAT CTTGTTATCT TCTTGCCACC ATGAACCCTG TATGCTGTAG GCTGAAAACG TTAAAAGAAA CACACGCTCT CACACACACA CAAACACACG CGCGCACACA CACACACACA CACACAGAGC TGACTTTCAA —AATCTACTCC AGCCCAAATG TTTCAATTGT —TCCTCACCCC TGGACATACT TTGCCCCCAT CTGGAATTAA AGGATATAAG TTTGTAATGA —AGCATTAGCA GCATTTTATA TGTGTCCAGC TGATATAGGA ATAGCCTTAG CAATGTATGT TTGGCCACCA AAGTTCCCCA CTTTGACTGA GCCAATATAT GCCTTCTGCC TGCATCTTTT TAATGACCAT ACTTGTCCTG CCTCCAGATA GATGTTTTAA —AACGAATAAC AAAAATAGGG GAAAGGTGAA AGTTCTTTCT ACCGAAATCT —AATAAAGAAA AGTCATTTTC CTCATTTCCA CCTCTCTTITT CTCAAAGTCA
AAGTTGTCCA TCTAGATTTT CAGAGGCACT CCTTAGG (SEQ ID NO:1129) Chr 11 CCCTAAAACA TTGCCACTGG GTCTCAGCCC | Região 13: Íntron (NC 000011.10): AGTTAGTCCT CTGCAGTTTC TTCACTCCCA | 2HBG2-B 5,254,122 — 5,254,306 | ACCCCAGTAT CTTCAAACAG CTCACACCCT
GCTGTGCTCA GATCAATACT CAGTTGTCTA AGTTGCCTCG AGACTAAMAGG CAACAGTGCT
GAAACATCTC CTGGACTCAC CTTGAAGTTC TCAGG (SEQ ID NO:1130) Chr 11 AGCCTGTGAG ATTGACAAGA ACAGTTTGAC | Região 14: Íntron (NC 000011.10): AGTCAGAAGG TGCCACAAAT CCTGAGAAGC |1HBG2 5,254,511 — 5,254,648 | GACCTGGACT TTTGCCAGGC ACAGGGTCCT
TCCTTCCCTC CCTTGTCCTG GTCACCAGAG CCTACCTTCC CAGGGTT (SEQ ID NO:1131) Chr 11 CCGCCGGCCC CTGGCCTCAC TGGATACTCT | Região 15: Região (NC 000011.10): AAGACTAT (SEQ ID NO:1132) -60 nt de TSS 5,254,829 — 5,254,866 HBG2 Chr 11 CCTTGTCAAG GCTATTGGTC AAGGCAAGGC T | Região 16: Região (NC 000011.10): (SEQ ID NO:1133) -110 nt de TSS 5,254,879 — 5,254,909 HBG2 Chr 11 CAGGGACCGT TTCAGACAGA TATTTGCATT | Região 17: Região (NC 000011.10): GAGATAGTGT GGGGAAGGGG CCCCCAAGAG | -200 nt de TSS 5,254,935 5,255,009 GATACTGCTG CTTAA (SEQ ID NO:1134) HBG2
Coordenada genô- | Nucleotídeos Nome da Região mica de HbG* Chr 11 TTGCCTTGTT CCGATTCAGT CATTCCAAT (SEQ | Região 18: Região (NC 000011.10): ID NO:1135) -250 nt de TSS 5,255,025 — 5,255,053 HBG2 Chr 11 TTTAGCTAGT TTTCTTCTCC CACCATAGAA | Região 19: Região (NC 000011.10): GATACCAGGA CTTCTTITIGT CAGCCGTTTT |-330 nt de TSS 5,255,076 — 5,255,179 | TCACCTTCTT GTCTGTAGCT CCAGTGAGGC | HBG2 CTGTAGTTTA AAGT (SEQ ID NO:1136) Chr 11 GGACACGTCT TAGTCTCATT TAGTAAGCAT | Região 20:Região (NC 000011.10): TGGTTTCC (SEQ ID NO:1137) -500 nt de TSS 5,255,255 — 5,255,292 HBG2 Chr 11 TTIIITATAT TCAGGTATGT ATGTAGGCAC | Região 21: Região (NC 000011.10): CCGATGATGT GTATTITATCA CTGGATAAGT |-800 nt de TSS 5,255,518 —5,255,641 | GTATGTGCTG GCTGATGACC CAGGGTTTTG | HBG2
GTGTAGCTCT TCTATGCTCG GTAAAGATGA TGGT (SEQ ID NO:1138) *Sequência de Referência de Referência NCBI NC 000011, as coordenadas são relatadas usando o sistema de coordenadas baseado em Um, "Homo sapiens chromosome 11, GRCh38.p12 Primary Assembly," (Versão NC 000011.10).
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[0408] RNPs (5 uM) contendo proteína ASCpf1 (SEQ ID NO: 1000), proteína AsSCpf1 RR (SEQ ID NO: 1036), ou AsSCpf1 RVR (SEQ ID NO: 1037) complexados com gRNAs individuais compreendendo gRNA di- recionando para os domínios de Tabela 18 (ver nome de ID gRNA para a molécula Cpf1 particular usada) foram entregues a células CD34+ de sangue periférico mobilizado (MPB) usando o dispositivo eletroporador Amaxa (Lonza). Após 72 horas, o DNA genômico foi extraído das célu- las e o nível de inserções/deleções no sítio alvo foi então analisado por sequenciamento lIllumina (NGS) do sítio alvo amplificado por PCR. À percentagem de edição (indels = deleções e inserções) para cada gRNA é mostrada na Tabela 18 acima. Em certas modalidades, Cpf1 RNP compreendendo uma ou mais dos gRNAs estabelecidos na Tabela 18 podem ser utilizados para direcionar as regiões enumeradas na Tabela 17 para induzir a expressão de HbF e podem ser coentregues com um "elemento de reforço" para atingir níveis de edição mais elevados em comparação com o nível de edição de apenas Cpf1 RNP. Exemplo 20: A coentrega de HBG1-1-Cpf1 RNP direcionando para a caixa CCAAT com ssODN suporta um aumento na edição de genes em células progenitoras/tronco hematopoiéticas humanas
[0409] Tendo demonstrado que um modelo de doador de 100 nt sSsODN (homologia 50/50) que codifica a "deleção de 4 nt" (HBGA-112: -115) coentregue com Cas9 RNP gerou um resultado comparável aos modelos mais longos de 180 nt (Exemplo 10 e Fig. 23), um ssSODN de 100 nt gerando a "deleção de 18 nt" (HBG A-104: -121) (ou seja, sSODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040), Tabela 11) foi coentregue com Cpf1 RNP para investigar melhor o resultado da edição.
[0410] Resumidamente, as células mPB CD34+ adultas humanas pré-estimuladas durante dois dias em meio suplementado com citoqui- nas humanas foram eletroporadas com RNP compreendendo proteína
His-AsCpf1-sNLS-sNLS H800A (SEQ ID NO: 1032, Tabela 14) comple- xada com HBG1-1 gRNA modificada (SEQ ID NO: 1041, Tabela 14) ("His- AsCpf1-sNLS-sNLS H800A HBG1-1 RNP") sozinha a 6 UM ou em com- binação com OLI16431 (0,5-6 uM). A coentrega de RNP e ssODN doador que codifica a deleção de 18 nt com braços de homologia de cadeia posi- tiva (OLI16431) aumentou a frequência de edição de 8,0% sem doador para 75,6%, conforme determinado pela análise de sequenciamento do produto de PCR de HBG do DNA genômico extraído em 72 horas pós- eletroporação (Fig. 35A). Este nível de edição permitiu um aumento nos níveis de HbF de — 24% acima da base (Fig. 35A). Além disso, deve-se notar que não houve diminuição observada na viabilidade celular (Fig. 35B), conforme medido pela deleção de DAP! ou do potencial de forma- ção de colônia (Fig. 35C) em qualquer uma das doses testadas. Exemplo 21: Otimização de dosagem de HBG1-1-Cpf1 RNP e OLI16431 para maximizar a edição do sítio da caixa CCAAT distal de direciona- mento RNP
[0411] Tendo demonstrado edição aumentada ao coentregar SsSODN com RNP (Exemplos 9-11, 13, 20), a mesma metodologia foi usada para otimizar a dosagem de cada componente a fim de maximizar a edição total. Resumidamente, uma matriz de dosagem foi configurada com RNP compreendendo a proteína His-AsCpf1-sNLS-sSNLS H800A (SEQ ID NO: 1032, Tabela 14) complexada com HBG1-1 gRNA não mo- dificada (SEQ ID NO: 1022, Tabela 14) ("His- ASCpf1-sNLS-sNLS H800A HBG1-1 RNP") sendo coentregue a 0-12 uM com OLIN6431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) a 0-12 UM. Utilizando uma dose de 8 uM His AsCpf1- SNLs-SNLs H800A HBG1-1 RNP coentregue com 8 uM OLI16431, um máximo de 89,4% indels foi alcançado quando medido por análise de se- quenciamento do produto de PCR HBG a partir de DNA genômico extraído a partir de células após cultura eritroide de 14 dias (Fig. 36A). Isso coin- cidiu com um aumento nos níveis de HbF para > 32% acima da base sob essas condições de dosagem (Fig. 36A). A viabilidade desta amos- tra (His-ASCpf1-sNLS-sSNLS H800A HBG1-1 RNP [8 uM] + OLI16431 [8 uM]) foi comparável à da amostra de controle não tratada em 48 horas após a eletroporação e após 14 dias em cultura eritroide (Fig. 36B).
[0412] No entanto, como elucidado no Exemplo 13 foi observado um artefato quando > 8 uM OLI16431 foi eletroporado em células sozi- nhas, sem RNP. Sob estas condições, era um resultado de falso posi- tivo, quando a amplificação de PCR foi realizada 48 horas pós-eletropo- ração, provavelmente devido ao excessivo ssODN dentro do sistema (ver a Fig. 36A, 8 uM e 12 uM para OLI16431 sozinho às 48 horas (bar- ras pretas)). Em doses mais baixas de ssODN, e em pontos de tempo posteriores, este falso positivo não era mais aparente (Fig. 36A, 4 iM e 6 UM para OLI16431 sozinho em 48 horas (barras pretas) e 4 UM, 6 UM, 8 uM e 12 uM para OLI16431 sozinho em 14 dias (barras cinza claro)). Além disso, a diminuição na viabilidade celular observada com os gru- pos ssODN sozinho (Fig. 36B, caindo para — 57% com 12 uM OLI16431 sozinho em 48 horas (barras pretas)) pode ser um fator de composição. Não havia resultado de falso positivo em doses de ssODN de 41uM e 6 UM, o que sugere que este artefato pode ser devido a excessivo ssSODN. Estes fatores, juntamente com níveis de HbF observados na linha de base com grupos de 8 uM e 12 uM OLI16431sozinho (Fig. 36A, pontos a cinza, em comparação com o controle negativo), fornecem a confiança de que o aumento substancial e sustentado em edição RNP com a adi- ção de ssODN é real e não um artefcto. Exemplo 22: RNPs contendo vários Cpf1 e gRNA direcionando à região do promotor HBG suportam a edição de gene em células progenito- ras/tronco hematopoiéticas humanas que promove a indução da expres- são da proteína HbF na descendência eritroide
[0413] RNAs guia compreendendo SEQ ID NOs: 1022, 1023, 1041- 1093, 1098-1106 (Tabela 19) foram complexados com várias enzimas variantes Cpf1 (SEQ ID NOs: 1032, 1094-1097, 1107-1109, Tabela 20) para vários complexos RNP (Tabela 21). Os RNPs continham gRNAs com modificações para a extremidade 5' e/ou modificações para a ex- tremidade 3' do gRNA (Tabela 19). Os RNAs guia compreendendo SEQ ID NOs: 1022, 1023, 1041-1084, 1098-1106 (Tabela 19) têm o mesmo sítio de clivagem esperado na região alvo da caixa CCAAT distal, os domínios de direcionamento relacionados contêm as sequências esta- belecidas em SEQ ID NO:1002 (HBG1-1), SEQ ID NO:1254 (HBG1-1 — 21mer), SEQ ID NO:1256 (HBG1-1 — 22mer), SEQ ID NO:1258 (HBG1- 1 — 23mer), para gRNA compreendendo uma sequência de protoespa- çador de 20 mer, 21 mer, 22 mer ou 23 mer, respectivamente (Tabela 22, Tabela 23). Em alguns casos, gRNA direcionado a outras posições dentro do promotor de HBG também foi testado, incluindo RNAs guia SEQ ID NOs: 1085-1096, compreendendo domínios de direcionamento contendo as sequências estabelecidas em SEQ ID NOs:1260 (AsCpf1 HBG1 Promotor-1 (21mer)), SEQ ID NO:1262 (AsCpf1 HBG1 Promotor- 2 (21mer)) ou SEQ ID NO:1264 (AsCpf1 HBG1 Promotor-6 (21mer)) (Tabela 22, Tabela 23). A Tabela 21 fornece uma lista de cada RNP testado nos Exemplos 22-24 e a SEQ ID NO do gRNA e a SEQ ID NO da variante Cpf1 que formam cada complexo RNP. Informações adicio- nais sobre cada gRNA e variante Cpf1 podem ser encontradas na Ta- bela 19 e na Tabela 20, respectivamente.
[0414] Os gRNAs usados nos Exemplos 22 e 23 foram sintetizados quimicamente. Os produtos químicos para a síntese de oligonucleotí- deos foram adquiridos em BioAutomation, Glen Research, Millipore Sigma, Sigma-Aldrich, ChemGenes e Thermo Fisher Scientific. O su- porte sólido usado para a síntese foi uma resina Unylinker 2000 À CPG, uma resina 2-TBDMS rU 2000 À CPG ou uma resina 2'-O-metila ade- nosina (N-Bz) Icaa 2000 À CPG da ChemGenes. O RNA (protegido por TBDMS) e os fosforamiditos de DNA foram obtidos na Thermo Fisher
Scientific. Em certas modalidades, fosforotioatos foram introduzidos du- rante um passo de sulfurização com uma solução de DDTT (3-((dimeti- lamino-metilideno)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona) de Glen Research. Os oligonucleotídeos foram sintetizados usando a química de fosfora- midito de RNA e DNA padrão em um sintetizador BioAutomation Mer- Made 12 ou em um sintetizador GE Ákta OligoPilot 100. Após a síntese, os oligonucleotídeos foram clivados do suporte sólido e desprotegidos em um processo de dois passos usando hidróxido de amônio/metila- mina e TEA-3HF. Após dessalinização, os oligonucleotídeos foram pu- rificados usando cromatografia de fase reversa em uma HPLC prepara- tiva.
[0415] Em primeiro lugar, o efeito de edição utilizando RNP compre- endendo gRNAs com modificações para a extremidade 5' dos gRNAs foi testado. Resumidamente, complexos RNP (6,0 uM e 12 uM) foram entregues a células 1 x 10º mPB CD34+ por meio de eletroporação MaxCyte, após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 suple- mentado com SCF, TPO e FLT3. O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi analisado por sequenciamento Illumina (NGS) do sítio alvo am- plificado às 72 horas após a eletroporação. Os resultados demonstram que as RNPs compreendendo gRNAs com nenhuma modificação (RNP33, também referido como "HBG1-1-AsCpf1 RNP", Tabela 14) ou modificações para a extremidade 5' de gRNA incluindo a adição de 5 nt RNA (RNP37), 10 nt RNA (RNP38), 25 nt RNA (RNP39), 60 nt RNA (RNP40), 5 nt DNA (RNP41), 10 nt DNA (RNP42), 25 nt DNA (RNP43), e 60 nt DNA (RNP44) (Tabela 21) suportam a edição no alvo (Fig. 37).
[0416] Em seguida, o efeito da coentrega de Cpf1 RNP com Sp182 RNP morto (gRNA morto compreendendo SEQ ID NO: 1027 (Tabela 14) complexado com Cas9 S. Pyogenes (SEQ ID NO: 1033)) ou ssSODN OLII6431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) foi testado. Resumidamente, uma matriz de dosagem com complexos RNP33 (sem modificação 5' ou
3' de gRNA, Tabela 21) em concentrações variáveis (6 uM, 8 uM, 8 uM e 12 uM) foram coentregues com Sp182 RNP (8 uM, 8 uM, 6 uM e 4 UM) ou ssODN OLI16431 (8 uM, 8 UM, 6 uM e 4 UM) a 5,25 x 106 de células mPB CD34+ via eletroporação MaxCyte, após 48 horas de pré- estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura por mais 48 horas. Em seguida, uma fração das células CD34 foi divi- dida para extração de gDNA e quantificação de indel na população de células em massa. Além disso, para investigar a edição em progenitores fenotípicos e células-tronco hematopoéticas fenotípicas (HSCs), as sub- populações de HSPC foram caracterizadas (entre as células CD34 res- tantes) por imunofenotipagem (Notta 2011) e separadas por classifica- ção celular ativada por fluorescência (FACS). A fenotipagem imunoló- gica 48 horas após a eletroporação foi realizada pela coloração de cé- lulas com anticorpos contra hocD34, hoD38, hoeD45RA, hCD90, e hcD123. HSCs fenotípicos foram definidos como hocD34bright hoD38 hCD90+ hop45RA-, e os progenitores foram definidos como hoD34bri- ght CD38+. Estas duas populações foram classificadas por FACS e o DNA foi extraído para a determinação de níveis de edição nestas sub- populações. O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi analisado por sequenciamento Illumina (NGS) do sítio alvo amplificado. Resulta- dos demonstram que RNP33 coentregues com os "elementos de re- forço" Sp182 RNP ou ssODN OLI1I6431 suportam a edição no alvo (Figs. 38A-B) em níveis mais elevados do que os observados aquando da entrega RNP33 sozinho (Fig. 37).
[0417] Em seguida, foi testado o efeito da coentrega de RNP33 (sem modificação 5' ou 3' gRNA, Tabela 21), RNP43 (modificação +25 DNA 5' gRNA, Tabela 21) ou RNP34 (modificação 1xPS2-OMe + 1xOMe 3' gRNA, Tabela 21) com Sp182 dgRNA (Tabela 15) ou sSODN OLI6431 (Tabela 11). Resumidamente, os complexos RNP33, RNP34 ou RNP43 (8 uM) foram coentregues com Sp182 RNP (8 uM) ou ssSODN OLI16431 (8 uM) para células 5,25 x 10º mPB CD34+ via eletroporação MaxCyte, após 48 horas de pré-estimulação em Meio X-Vivo 10 suple- mentado com SCF, TPO e FLT3. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura durante mais 48 horas antes da separação em fracções HSC fenotípicas progenitoras e fenotípicas para quantifica- ção de indel. O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi analisado por sequenciamento Illumina (NGS) do sítio alvo amplificado às 48 ho- ras após a eletroporação. Os resultados demonstram que RNP con- tendo gRNAs s com modificações 5' ou 3' coentregues com os "elemen- tos de reforço" Sp182 RNP ou ssODN OLI16431 suportam a edição do alvo (Figs. 39). Ambos os elementos de reforço testados forneceram níveis de edição comparáveis a RNP34 e RNP33. Quando comparado aos níveis de edição obtidos sem o elemento de reforço, enquanto a edição de RNP33 foi melhorada por ambos os elementos de reforço, a edição de RNP43 foi, entretanto, apenas aumentada com a adição de Sp182 RNP (Figs. 37, 39).
[0418] Em seguida, o efeito de diferentes proteínas Cpf1 na edição RNP foi testado. Foi realizada uma comparação estequiométrica (gRNA: Cpf1) com RNPs compreendendo várias proteínas Cpf1. Resu- midamente, RNPs (RNP64, RNP63, RNP45, Tabela 21) foram entre- gues a uma estequiometria (razão de complexação gRNA:Cpf1) de 2 ou 4, em que o gRNA está em um excesso molar. Todos os RNPs foram entregues via eletroporação MaxCyte a 8 uM a 1 x 10º células CD34+ a seguir de 48 horas de pré-estimulação em X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura por mais 72 horas antes da quantificação de indel. Os resultados demonstraram que não houve diferença nas taxas de edi- ção com a estequiometria alterada na concentração testada (Fig. 40). RNP45 (compreendendo proteína Cpfl SEQ ID NO:1094) supera
RNP63 (compreendendo proteína Cpf1 SEQ ID NO: 1095) e RNP64 (compreendendo Cpf1 SEQ ID NO: 1109).
[0419] Em seguida, o efeito da coentrega de Sp182 RNP ou ssSODN OLI16431 com vários RNPs contendo diferentes proteínas Cpf1 foi tes- tado. Resumidamente, RNPs (RNP33, RNP64, RNP63, RNP45, Tabela 21) foram entregues sozinhos ou em combinação com Sp182 RNP ou ssODN OLI16431. Todos os reagentes foram entregues via eletropora- ção MaxCyte a 8 uM a 1 x 106 células CD34+ a seguir de 48 horas de pré-estimulação em X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura por mais 72 horas antes da quantificação de indel. Os resultados indi- cam os "elementos de reforço" Sp182 RNP ou ssODN OLI6431 e me- lhoram a edição para todos os RNPs testados (Fig. 41).
[0420] O efeito da edição usando RNPs contendo gRNAs com vá- rias extensões de DNA 5', ou RNP sem uma extensão de DNA 5' (RNP45) coentregue com ou sem ssODN OLI16431 foi testado. Resu- midamente, após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 su- plementado com SCF, TPO e FLT3, RNPs (RNP45 (sem modificação 5'), RNP46, RNP47, RNP48, RNP49, RNP50, RNP51, RNP52, RNP53, RNP54, RNP55, RNP56 e RNP57, Tabela 21) a uma concentração de 8 uM foram entregues sozinhos ou coentregues com 8 uM ssODN OLI16431 via eletroporação MaxCyte para 1 x 10º células CD34+. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura antes da quantificação de indel. Os resultados demonstram que todos os RNPs suportam a edição no alvo (Fig. 42).
[0421] O efeito da edição usando RNP's incluindo gRNAs com a mesma extensão de DNA 5', mas diferentes modificações de gRNA 3' foi testado para avaliar o impacto das modificações de gRNA 3'. Resu- midamente, RNPs compreendendo gRNAs com extremidades 5' corres- pondentes, mas diferentes modificações de gRNA 3' (RNP49 vs. RNP58 e RNP59 v. RNP60) foram entregues a uma concentração de 8 uM via eletroporação MaxCyte para 1 x 106 células CD34+ após 48 horas antes da estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cul- tura antes da quantificação de indel. Em ambas as comparações, os RNPs contendo gRNA com 3' PS-OMe superaram a versão 3' não mo- dificada 24 horas após a eletroporação (Fig. 43).
[0422] Em seguida, diferentes concentrações de Cpf1 e gRNA para RNP58 foram testadas. Resumidamente, RNP58 (modificação de +25 DNA 5' gRNA e modificação 1xPS-OMe 3' gRNA, Tabela 21) foi entre- gue via eletroporação MaxCyte para 1 x 10º células CD34+ após 48 horas de pré-estimulação em uma estequiometria (proporção comple- xação gRNA:Cpf1) de proporções molares de 2:1, 1:1 ou 0,5:1. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura antes da quantificação de indel. Em todas as doses testadas, a edição foi melhor quando RNP foi complexado em uma proporção de 2:1 (Figs. 44A-B).
[0423] O efeito da edição usando RNPs incluindo gRNAs com a mesma extensão de DNA 5', mas diferentes modificações de gRNA 3' foi ainda testado para avaliar o impacto das modificações de gRNA 3". Resumidamente, RNPs compreendendo gRNAs com extremidades 5' correspondentes, mas diferentes modificações de gRNA 3' (RNP58, RNP2, RNP3, RNP4, RNP5, RNP6, RNP7, RNP8, RNP9, RNP10) foram entregues em concentrações variáveis (1 uM, 2 uM, 4 UM) através de eletroporação MaxCyte para 1 x 10º células CD34+ após 48 horas de pré-estimulação. Após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura antes da quantificação de indel. Os resultados indicam que todos os RNPs suportam a edição no alvo (Figs. 45A-B).
[0424] Em seguida, foi testada a edição por RNPs que incluem gRNAs com modificações de gRNA 3' ou modificações 5' e 3' que dire- cionam para várias regiões do promotor de HBG. Esses incluem RNAs guia SEQ ID NOs: 1085-1096, compreendendo domínios de direciona- mento SEQ ID NOs: 1260 (AsCpf1 HBG1 Promotor-1 (21mer)), 1262 (ASCpf1 HBG1 Promotor-2 (21mer)), 1264 (AsCpf1 HBG1 Promotor-6 (21mer)) (Tabela 22, Tabela 23). Em vez da região alvo da caixa CCAAT distal, esses gRNAs são configurados para fornecer um evento de edição dentro das regiões selecionadas da Tabela 17. Resumida- mente, RNP'ss incluindo gRNAs contendo um 5' gRNA não modificado e uma modificação 1xPS-OMe 3' gRNA (RNP11, RNP 16, RNP19 e RNP22, Tabela 21), RNPs incluindo gRNAs contendo uma modificação +20 DNA + 2xPS 5' gRNA e uma modificação 1xPS-OMe 3' gRNA (RNP12, RNP21 e RNP24, Tabela 21), RNPs incluindo gRNAs con- tendo uma modificação de +25 DNA 5' gRNA e uma modificação de gRNA 1xPS-OMe 3' (RNP58 e RNP20, Tabela 21) foram entregues a uma concentração de 8 uM através eletroporação MaxCyte para 1 x 10º células CD34+, a seguir a 48 horas de pré-estimulação em X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após a edição de células CD34+ mPB;, diferenciação ex vivo na linhagem eritroide foi realizada durante 18 dias (Giarratana 2011), com gDNA sendo isolado no dia 14 da cultura para análise de indel.
Resumidamente, RNP foi entregue a células CD34+, tal como descrito acima.
Após 48 horas de recuperação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3, as células trata- das foram contadas e transferidas para meio de diferenciação eritroide, com contagens de células e alimentação ocorrendo nos dias 4, 7, 10 e 14, com coleta de eritroide no dia 18. Estas CD34+ derivadas da medula óssea foram então contadas e lisadas em água grau de pureza para HPLC antes da filtração para remover os resíduos celulares.
Em se- guida, os níveis de expressão relativa de cadeias de gama-globina (so- bre cadeias de globina tipo beta totais) foram medidos para cada amos- tra por UPLC, com a separação de proteínas sendo alcançada aumen-
tando gradualmente a proporção de acetonitrila com 0,1% de ácido tri- fluoroacético, para água com 0,1% ácido trifluoroacético (Figs. 46A-C). As Figs 46A-C mostraram todos os RNP com suporte para edição no alvo. No entanto, apenas a edição em certos sítios alvo dá origem a uma expressão de HBF aumentada. A mesma experiência foi realizada com concentrações variáveis (0, 1 uM, 2 uM, 4 uM) de RNP58 (Fig. 47).
[0425] Em seguida, o efeito de diferentes proteínas Cpf1 na edição RNP foi testado. Resumidamente, RNP58, RNP26, RNP27, e RNP28 (Tabela 21) incluindo gRNAs que compreende a SEQ ID NO: 1051 (mo- dificação +25 de DNA 5' gRNA e uma modificação 1XPS-OMEe 3' gRNA, Tabela 19) complexados com proteínas Cpf1 diferentes foram entre- gues via eletroporação MaxCyte a 8 uM a 1 x 105 células CD34+ após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Os resultados demonstraram que todos os RNPs suportam a edição no alvo (Fig. 48).
[0426] Em seguida, o efeito de diferentes RNPs contendo gRNAs com várias modificações de gRNA 5' e a mesma modificação 3' foi tes- tado. Resumidamente, RNPs (RNP58 (modificação +25 DNA 5' gRNA e uma modificação 1xPS-OMe 3' gRNA), RNP29 (modificação+25 DNA + 2xPS 5' gRNA e uma modificação 1xXPS-OMe 3' gRNA), RNP30 (modi- ficação RNA PoliA + 2xPS 5' gRNA e 1xPS-OMe 3' gRNA), e RNP31 (modificação PoliU RNA + 2xPS 5' gRNA e modificação 1xPS-OMe 3' gRNA ) (Tabela 21)) foram entregues via eletroporação MaxCyte em 1 UM, 2 UM ou 4 uM a 1 x 10º células CD34+ após 48 horas de pré-esti- mulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3 (RNP30 não foi testado a 1 uM devido à disponibilidade de células). Os resultados demonstraram que todos os RNPs suportam a edição no alvo (Fig. 49).
[0427] Em seguida, o efeito de diferentes proteínas Cpf1 na edição RNP foi testado. Resumidamente, RNP58, RNP27, e RNP26 (Tabela
21) incluindo gRNAs que compreende a SEQ ID NO: 1051 (modificação +25 de DNA 5' gRNA e uma modificação 1XPS-OMe 3' gRNA, Tabela 19) complexados com proteínas Cpf1 diferentes foram entregues via eletroporação MaxCyte a 2 uM ou 4 uM a 1 x 105 células CD34+ após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Para investigar a edição em CD34 em massa, pro- genitores fenotípicos e células-tronco hematopoéticas fenotípicas (HSCs), as subpopulações de HSPC foram caracterizadas. Assim, após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura por mais 48 horas antes da classificação em frações progenitoras e HSC para quantificação indel. O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi ana- lisado por sequenciamento Illumina (NGS) do sítio alvo amplificado às 48 horas após a eletroporação. Os resultados demonstraram que todos os RNPs suportam edição no alvo em CD34 em massa, progenitores fenotípicos e células-tronco hematopoéticas fenotípicas (Fig. 50).
[0428] Em seguida, foi testado o efeito da coentrega de RNP com Sp182 RNP (gRNA morto compreendendo SEQ ID NO: 1027 (Tabela 14) complexado com Cas9 S. Pyogenes (SEQ ID NO: 1033)) ou ssSODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) em RNP contendo diferentes proteínas Cpf1. Resumidamente, RNP61, RNP62, RNP34 (Tabela 21) foram coentregues a 8 uM com Sp182 RNP (8 uM) ou ssODN OLI16431 (8 UM) para células de 25 x 10º mPB CD34+ via eletroporação MaxCyte, após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Para investigar a edição em CD34 em massa, proge- nitores fenotípicos e células-tronco hematopoéticas fenotípicas (HSCs), as subpopulações de HSPC foram caracterizadas. Assim, após a eletropora- ção, as células foram colocadas de volta na cultura por mais 48 horas an- tes da classificação em frações progenitoras e HSC para quantificação in- del. O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi analisado por sequen-
ciamento Illumina (NGS) do sítio alvo amplificado às 48 horas após a ele- troporação. Os resultados demonstram que RNP coentregue com os "elementos de reforço" Sp182 RNP ou ssODN OLI16431 suportam a edição do alvo (Fig. 51). Uma fração dessas células também foi criopre- servada 24 horas após a eletroporação para ser posteriormente carac- terizada em um modelo de enxerto in vivo (ver Exemplo 23).
[0429] Em seguida, o efeito da edição RNP58 e RNP32 foi testado. Resumidamente, RNP58 e RNP32 (Tabela 21) foram entregues a 2 uM a 6 x 10º mPB células CD34+ por meio de eletroporação MaxCyte, após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Para investigar a edição em CD34 em massa, progenitores fenotípicos e HSCs fenotípicas, as subpopulações de HSPC foram carac- terizadas. Assim, após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura por mais 48 horas antes da classificação em frações pro- genitoras e HSC para quantificação indel. O nível de inserções/dele- ções no sítio alvo foi analisado por sequenciamento Illumina (NGS) do sítio alvo amplificado às 48 horas após a eletroporação. Os resultados demonstram que RNP58 e RNP32 suportam a edição no alvo (Fig. 52).
[0430] RNP58 e RNP1 (Tabela 21) foram entregues a concentra- ções de 2 uM a 8 uM a 25x10º mPB células CD34+ por meio de eletro- poração MaxCyte, após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo suplementado com SCF, TPO e FLT3. Para investigar a edição em CD34 em massa, progenitores fenotípicos e células-tronco hematopoé- ticas fenotípicas (HSCs), as subpopulações de HSPC foram caracteri- zadas. Assim, após a eletroporação, as células foram colocadas de volta na cultura por mais 48 horas antes da classificação em frações proge- nitoras e HSC para quantificação indel. O nível de inserções/deleções no sítio alvo foi analisado por sequenciamento Illumina (NGS) do sítio alvo amplificado às 48 horas após a eletroporação. Os resultados de- monstram que RNP suporta a edição no alvo (Fig. 53). Uma fração dessas células também foi criopreservada 24 horas após a eletropora- ção para ser posteriormente caracterizada em um modelo de enxerto in vivo (ver Exemplo 23). Exemplo 23: A infusão de células CD34* mPB editadas em camundon- gos NOD,B6.SCID Il2ry-/- Kit(W41/W41) resulta em enxerto de longo prazo e indução de HbF.
[0431] Para determinar se a entrega de RNP34 e RNP33 (Tabela 21) coentregue com ssODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) alcança edições em células-tronco hematopoiéticas de re-população a ongo prazo, células CD34* humanas adultas de sangue periférico mo- bilizado (MPB) foram infundidas em camundongos NOD,B6.SCID Il2ry- 1- Kit(W41/W41) não irradiado (nome de estoque do laboratório Jackson: NOD.Cg-Kit<W-41J> Tyr<+> Prkde<scid> II2rg<tm1Wil>/ThomJ) ("NBSGW"). Resumidamente, as células CD34* mPB a 62,5 x 10º/mL foram eletroporadas por meio de eletroporação MaxCyte com RNP a uma dose de 8 uM e 6 uM de ssODN OLI16431 após 48 horas de pré- estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após 24 horas, as células mCD34* foram criopreservadas. Cinco dias depois, as células CD34* mPB foram descongeladas e infundidas em ca- mundongos NBSGW a 1 milhão de células por camundongo por meio de injeção intravenosa na veia da cauda. Oito semanas depois, os camun- dongos foram sacrificados e a medula óssea (MO) foi coletada de fêmures, tíbias e ossos pélvicos. Subpopulações de células da medula óssea res- pectivamente identificadas como CD15+, CD19+, glicoforina A (GIyA, CD235a+) e CD34+ de linhagem negativa, foram isoladas por FACS, e o DNA foi extraído para determinar os níveis de edição em cada uma dessas frações. A Fig. 54 representa a frequência de indels, conforme determi- nado pelo sequenciamento de próxima geração, de MO não fracionado ou subpopulações individuais de MO classificadas por fluxo.
[0432] Em seguida, para determinar se a entrega de RNP34 ou
RNP33 (Tabela 21) coentregue com Sp182 RNP (gRNA morto compre- endendo SEQ ID NO: 1027 (Tabela 14) complexado com Cas9 S.pyo- genes (SEQ ID NO: 1033)) alcança edições em células-tronco hemato- poiéticas de re-população de longo prazo, células CD34+ humanas adultas do sangue periférico mobilizado (MPB) foram infundidas em ca- mundongos NBSGW não irradiados. Resumidamente, células CD34+ mPB a 62,5 x 10%/mL foram eletroporadas por meio de eletroporação MaxCyte com RNP em doses e doses variáveis de Sp182 RNP após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após 24 horas, as células mCD34* foram criopreservadas. Cinco dias depois, as células CD34* mPB foram descongeladas e infun- didas em camundongos NBSGW a 1 milhão de células por camundongo por meio de injeção intravenosa na veia da cauda. Oito semanas depois, os camundongos foram sacrificados e a medula óssea (MO) foi coletada de fêmures, tíbias e ossos pélvicos. Subpopulações de células da me- dula óssea respectivamente identificadas como CD15+, CD19+, glico- forina A (GIyA, CD235a+) e CD34+ de linhagem negativa, foram isola- das por FACS, e o DNA foi extraído para determinar os níveis de edição em cada uma dessas frações. A Fig. 55A representa a frequência de indels, conforme determinado pelo sequenciamento de próxima gera- ção, de MO não fracionada ou subpopulações individuais de MO classi- ficadas por fluxo.
[0433] Por último, a indução de HbF de longo prazo por células CD34+ derivadas de MO foi analisada. Uma alíquota de células MO foi cultivada em condições de diferenciação eritroide por 18 dias (Giarra- tana 2011), e avaliada quanto à expressão de HbF por UPLC. Resumi- damente, as células MO não fracionadas extraídas de camundongos 8 semanas após a infusão foram colocadas em condições de cultura eri- troide por 18 dias. Contagens de células e alimentações ocorreram nos dias 7, 10 e 14, com coleta de eritroides no dia 18. Estas células eritroi- des derivadas da medula óssea foram então contadas e lisadas em água grau de pureza para HPLC antes da filtração para remover os re- síduos celulares. Em seguida, os níveis de expressão relativa de ca- deias de gama-globina (sobre cadeias de globina tipo beta totais) foram medidos para cada amostra por UPLC, com a separação de proteínas sendo alcançada aumentando gradualmente a proporção de acetonitrila com 0,1% de ácido trifluoroacético, para água com 0,1% ácido trifluoro- acético (Fig. 54B). Estes dados demonstram que a indução robusta de HbF de longo prazo é alcançada por RNP34 e RNP33 coentregue com edição de RNP Sp182 de células CD34+ humanas.
[0434] Em seguida, para determinar se a entrega de RNP61 ou RNP62 (Tabela 21) coentregue com ssODN OLI16431 (SEQ ID NO: 1040, Tabela 11) alcança edições em células-tronco hematopoiéticas de re-população a longo prazo, células CD34* humanas adultas de mPB foram infundidas em camundongos NBSGW não irradiados. Resumida- mente, as células CD34* mPB a 62,5 x 10º/mL foram eletroporadas por meio de eletroporação MaxCyte com 8 uM RNP e 8 uM ssODN OLII6431 após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo 10 suple- mentado com SCF, TPO e FLT3. Após 24 horas, as células mCD34* foram criopreservadas. Quatro dias depois, as células CD34* mPB fo- ram descongeladas e infundidas em camundongos NBSGW a 1 milhão de células por camundongo por meio de injeção intravenosa na veia da cauda. Oito semanas depois, os camundongos foram sacrificados e a medula óssea (MO) foi coletada de fêmures, tíbias e ossos pélvicos. Subpopulações de células da medula óssea respectivamente identifica- das como CD15+, CD19+, glicoforina A (GIyA, CD235a+) e CD34+ de linhagem negativa, foram isoladas por FACS, e o DNA foi extraído para determinar os níveis de edição em cada uma dessas frações. A Fig. 56A representa a frequência de indels, conforme determinado pelo sequen- ciamento de próxima geração, de MO não fracionada ou subpopulações individuais de MO classificadas por fluxo.
[0435] Por último, a indução de HbF de longo prazo por células eri- troides CD235a+ (GIyA+) derivadas de MO foi analisada. Uma alíquota de células MO foi cultivada em condições de diferenciação eritroide por 18 dias, e avaliada quanto à expressão de HbF por UPLC. Resumida- mente, as células MO não fracionadas extraídas de camundongos 8 se- manas após a infusão foram colocadas em condições de cultura eri- troide por 18 dias. A Fig. 56B mostra a expressão de HbF, calculada como cadeias do tipo gama/beta (%) por células eritroides. Estes dados demonstram que a indução robusta de HbF de longo prazo é alcançada por RNP61 e RNP62 coentregue com edição de ssSODN OLI1I6431 de células CD34+ humanas.
[0436] Em seguida, para determinar se a entrega de RNP1 ou RNP58 (Tabela 21) alcança edições em células-tronco hematopoiéticas de re-população a longo prazo, células CD34* humanas adultas de mPB foram infundidas em camundongos NBSGW não irradiados. Resumida- mente, as células CD34* mPB a 62,5 x 10º/mL foram eletroporadas por meio de eletroporação MaxCyte com 4 uM ou 8 uM RNP1 ou 2 UM, 4 UM, ou 8 uM RNP58 após 48 horas de pré-estimulação em meio X-Vivo suplementado com SCF, TPO e FLT3. Após 24 horas, as células mCD34'* foram criopreservadas. Quatro dias depois, as células CD34* mPB foram descongeladas e infundidas em camundongos NBSGW a 1 milhão de células por camundongo por meio de injeção intravenosa na veia da cauda. Oito semanas depois, os camundongos foram sacrifica- dos e a medula óssea (MO) foi coletada de fêmures, tíbias e ossos pél- vicos. Quimerismo humano e reconstituição de linhagem (CD45+, CD14+, CD19+, glicoforina A (GIyA, CD235a+), linhagem e expressão do marcador CD34+ e CD45+ de camundongo) na MO foi determinada por citometria de fluxo e analisada (Fig. 57). A frequência de células GIyA+ foi calculada como células GIyA+/células totais na MO. Quime- rismo humano foi definido como CD45/(CD45+mCDA45 humano).
[0437] Quimerismo semelhante e distribuições de linhagem foram alcançadas 8 semanas após o transplante por células CD34+ mPB transfectadas com RNP em comparação com células CD34+ mPB fal- samente transfectadas demonstrando que a edição é comparável com a retenção do potencial de enxerto de células-tronco hematopoiéticas. A Fig. 58 representa os indels, conforme determinado pelo sequencia- mento de próxima geração, de MO não fracionada, 8 semanas após a infusão. A Fig. 59 mostra a frequência da taxa de indel em células MO, CD15+, CD19+, glicoforina A (GIyVA, CD235a+) e células lin-CD34+ com 2 uM, 4 uM ou 8 uM de RNP58.
[0438] A indução de HbF de longo prazo por células eritroides CD235a+ (GIyA+), derivadas de células CD34+ editadas, também foi analisada. As células GIyA+ obtidas da medula óssea, foram isoladas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS), coletadas e lisadas em água grau de pureza para HPLC. Os lisados foram então avaliados quanto à expressão de HbF por UPLC. A Fig. 60 representa a expressão de HbF, calculada como cadeias tipo gama/beta (%) por células GIyA+. Estes dados demonstram que a indução robusta de HbF de longo prazo é alcançada com a edição RNP58 de células CD34+ humanas em várias concentrações de RNP58.
[0439] É importante ressaltar que as células CD34* que foram ele- troporadas com concentrações variáveis de RNP1 ou RNP58 mantive- ram sua atividade hematopoiética ex vivo (ou seja, nenhuma diferença na quantidade ou diversidade de colônias eritroides e mieloides em comparação com o controle negativo de células CD34* correspondentes de doadores não tratados), conforme determinado nos ensaios de célu- las de formação de colônias hematopoiéticas (CFC) (Fig. 61).
Exemplo 24: Tratamento de B-hemoglobinopatia usando células-tronco hematopoiéticas editadas.
[0440] Os métodos e sistemas de edição de genoma divulgados neste documento podem ser usados para o tratamento de uma B-hemo- globinopatia, tal como doença falciforme ou beta-talassemia, em um pa- ciente em necessidade. Por exemplo, a edição do genoma pode ser re- alizada em células derivadas do paciente em um procedimento autó- logo. A correção das células do paciente ex vivo e reintrodução das cé- lulas no paciente pode resultar num aumento da expressão de HbF e tratamento da B-hemoglobinopatia.
[0441] Por exemplo, HSCs podem ser extraídas da medula óssea de um paciente com uma B-hemoglobinopatia usando técnicas que são bem conhecidas pelos versados na técnica. As HSCs podem ser modi- ficadas usando métodos aqui divulgados para edição do genoma. Por exemplo, RNPs constituídos por RNAs guia (gRNA) que têm como alvo uma ou mais regiões no gene HBG complexado com uma nuclease gui- ada por RNA podem ser usados para editar HSCs. Em certas modalida- des, a nuclease guiada por RNA pode ser uma proteína Cpf1. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 pode ser uma proteína Cpf1 modificada. Em certas modalidades, a proteína Cpf1 modificada pode ser codificada por uma sequência estabelecida em SEQ ID NOs: 1000, 1001, 1008- 1018, 1032, 1035-39, 1094-1097, 1107-09 (sequências polipeptídicas Cpf1) ou SEQ ID NOs: 1019-1021, 1110-17 (sequências polinucleotídi- cas Cpf1). Por exemplo, a proteína Cpf1 modificada pode ser codificada por a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097. Em certas modali- dades, o gRNA pode ser um gRNA modificado ou não modificado. Em certas modalidades, o gRNA pode compreender uma sequência apre- sentada na Tabela 13, Tabela 18 ou Tabela 19. Por exemplo, em certas modalidades, o gRNA pode compreender a sequência estabelecida na
SEQ ID NO: 1051. Em certas modalidades, o complexo RNP pode com- preender um complexo RNP estabelecido na Tabela 21. Por exemplo, o complexo RNP pode incluir um gRNA compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1051 e uma proteína Cpf1 modificada co- dificada pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 1097 (RNP32, Ta- bela 21). Em certas modalidades, HSCs modificadas têm um aumento na frequência ou nível de um indel no gene HBG71, HBG2 humano, ou am- bos, em relação a HSCs não modificadas.
Em certas modalidades, as HSCs modificadas podem se diferenciar em células eritroides que expres- sam um nível aumentado de HbF.
Uma população de HSCs modificadas pode ser selecionada para reintrodução no paciente por meio de transfu- são ou outros métodos conhecidos pelos versados na técnica.
A popula- ção de HSCs modificadas para reintrodução pode ser selecionada com base, por exemplo, no aumento da expressão de HbF da descendência eritroide de HSCs modificadas ou aumento da frequência indel das HSCs modificadas.
Em algumas modalidades, qualquer forma de ablação antes da reintrodução das células pode ser usada para melhorar o enxerto de HSCs modificadas.
Em outras modalidades, as células-tronco do sangue periférico (PBSCs) podem ser extraídas de um paciente com B-hemoglo- binopatia usando técnicas que são bem conhecidas dos versados (por exemplo, aférese ou leucaferese) e as células-tronco podem ser remo- vidas dos PBSCs.
Os métodos de edição do genoma descritos acima podem ser realizados nas células-tronco e as células-tronco modifica- das podem ser reintroduzidas no paciente como descrito acima.
Tabela 20: Variantes da Proteína Cpf1 Cpf1 SEQID NO Cpf1 SEQID NO H800A
ID de Variante Cpf1 Variante do Aminoácido | Variante do nucleotídeo ss aa Jamanta Tabela 21: Complexos de RNP
[RNPT sEaiDNO 1051 —[sEaíDNOt08 — | [ANP2 — sEaiDNO 108 —sEaiaNa ta | [ANP sEaiDNO 10 — sEaiaNa ta | [RNP4a sEaiDNO 1100 —sEaioNo tosa [ANP — seaiDNO 101 smaiaND ta | [RNPs — sEaiDNO 1068 —sEaíNo:to84 [RNPo — sEaiDNO 1082 — [sEaioNo tosa [ANPIO — (sEaiDNO 106s — sEaiaND ta | [ANT (sEaiDNO 1060 —sEaiaNA ta | [RANPIZ — sEaiDNO 1084 —sEaioNo tosa [ANPIS — sEaiDNO 108s —sEaiaND ta | [RNPIO — sEaiDNO 1088 —SsEaiNo:to8a [ANP2O — (sEGIDNO 100 — sEaiaNA ta | [ANP2t — [sEIDNO oo —sEaiaNA ta | [RNP22 — sEaiDNO 1001 —[sEaíoNO to [ANP2] — (sEGIDNO 1048 —sEaiaNa tar | [ANP24 — (sEGiDNO 10 — sEaiaNA ta | [RNP26 — sEiDNO 1051 —sEaíDNOt06 — | [ANP29 — sEiDNO 1103 sEaiaND ta | [ANPO — sEIDNO 1104 sEaiaNA ta | [RNP sEaiDNO 1105 —SsEaiNo tosa [ANP22 — sEIDNO fot sEaiaNa tar | [ANP33 — sEGiDNO 1022 — sEaiaNa tl | [RNP34 [sEaiDNo 101 [sean
[RNP39 — fsEaiDNO 1044 [sema fã [RNPT scaIDNO Toe —sEiDNC TZ | [RNP4Z — sEaiDNO 1047 fsEalDNO to [RNPas scaIDNO: Toe —sEaiDNC IA | [RNP4s — [sEaiDNO 1022 — fsEalDNo to [RNPSO — fsEaiDNO 1053 fsEalDNO to [RNPST scamDNO 1054 sEiDNC TM [RNPS2 — fsEaiDNO 1055 fsEalDNO to [RNPS3 fsEaiDNO 1056 —fsEalDNO to [RNPSa ssaIDNO:To57 sEiDNC TM [RNPSS fsEaIDNO 1058 — SsEalDNO to [RNPS6 —smaIDNO:Toso sEQiDNC TM [RNPSo ssaIDNO:T067 sEQiDNC TM [RNPT [sEaiDNO 1047 [sema IS [RNP62 “ssaiDNOT0T sEiDNC TM [RNP6s — [sEaiDNO 1022 [sEaiDNO tos *Ver Tabela 19 ou 8 sã s8º Ee
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Sequências
[0442] Componentes do sistema de edição de genoma de acordo com a presente divulgação (incluindo, sem limitação, nucleases guiadas por RNA, RNAs guia, ácidos nucleicos modelo de doador, ácidos nuclei- cos que codificam nucleases ou RNAs guia e porções ou fragmentos de qualquer um dos anteriores), são exemplificados pelas sequências de nucleotídeos e aminoácidos apresentadas na Listagem de Sequências. As sequências apresentadas na Listagem de Sequências não se desti- nam a ser limitativas, mas sim ilustrativas de certos princípios de siste- mas de edição de genoma e suas partes componentes, que, em combi- nação com a presente divulgação, informarão aqueles versados na téc- nica sobre implementações adicionais e modificações que estão dentro do escopo desta divulgação. Uma lista das sequências apresentadas é fornecida na Tabela 25 a seguir. Tabela 25: Sequências apresentadas na Listagem de Sequências: [satNos — Tpescrção 1-2, 4-6, Polipeptídeos Cas9 12,14 3,7-11,13 Sequências de codificação Cas9 15-23, Domínios semelhantes a Cas9 RuvC 52-123 24-28, Domínios semelhantes a Cas9 HNH 124-198 gRNAs modulares e unimoleculares de com- 29-31, 38-51 primento total 32-37 Domínios proximal e de cauda de gRNA Domínios de direcionamento de gRNA (RNA) 251-901, 1002 - ver Tabela 2, 19, 22, 23 Domínios de direcionamento de gRNA (DNA) 910-919, 943-945, 956-959, 1003 - ver Tabelas 7, 9 Domínios de direcionamento de gRNA mais 920-929, 946-948, 960-963, 1004 PAM (NGG) (RNA) - ver Tabelas 7, 9
[ssatNos — TpescRÇãÃo Domínios de direcionamento de gRNA mais 930-939, 949-951, 964-967, 1005 PAM (NGG) (DNA) - ver Tabelas 7, 9 Sequências de gRNA (DNA) - ver Tabelas 10, 970, 971, 996, 997 12 Sequências de gRNA (DNA) - ver Tabelas 10, 972, 973, 998, 999 12 Sequências do promotor humano HBG1 e 902, 903 HBG2 incluindo sítio de deleção HPFH Sequências de doadores de oligonucleotídeos 904-909, 974-995 e braços de homologia - ver Tabelas 8, 11 968-969 Sequências BCL11Ae 1006, 1007 Sequências de Sinal de Localização Nuclear 1000, 1001, 1008-1018 Ss o lipeptídi Com equências polipeptidicas 1032-1039 9 poipep Pp 1094-1097, 1107-1109 1019-1021 Sequências de nucleotídeos Cpf1 1110-1117 Incorporação por Referência
[0443] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui mencionados são aqui incorporados por referência na sua totalidade, como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por re- ferência. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo quaisquer definições aqui, irá controlar. Equivalentes
[0444] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas aqui descritos. Tais equivalen- tes se destinam a serem abrangidos pelas reivindicações seguintes. Referências Abhern et al., Br J Haematol 25(4):437-444 (1973)
Akinbami Hemoglobin 40:64-65 (2016) Aliyu et al.
Am J Hematol 83:63-70 (2008) Anders et al.
Nature 513(7519):569-573 (2014) Angastiniotis & Modell Ann N Y Acad Sci 850:251-269 (1998) Bae et al.
Bioinformatics 30(10):1473-1475 (2014) Barbosa et al.
Braz J Med Bio Res 43(8):705-711 (2010) Bouva Hematologica 91(1):129-132 (2006) Briner et al.
Mol Cell 56(2):333-339 (2014) Brousseau Am J Hematol 85(1):77-78 (2010) Caldecott Nat Rev Genet 9(8):619-631 (2008) Canvers et al.
Nature 527(12):192-197 (2015) Chang et al.
Mol Ther Methods Clin Dev 4:137-148 (2017) Chassanidis Ann Hematol 88(6):549-555 (2009) Chylinski et al.
RNA Biol 10(5):726—737 (2013) Cong et al.
Science 399(6121):819-823 (2013) Costa et al., Cad Saude Publica 18(5):1469-1471 (2002) Davis & Maizels 2 Proc Natl Acad Sci USA 111(10):E924-932 (2014) Fine et al.
Sci Rep. 5:10777 (2015) Frit et al.
DNA Repair (Amst) 17:81-97 (2014) Fu et al.
Nat Biotechnol 32:279-284 (2014) Gao et al.
Nat Biotechnol.: 35(8):789-792 (2017) Giarratana et al.
Blood:118, 5071115079 (2011) Guilinger et al.
Nat Biotechnol 32:577-—582 (2014) Heigwer et al.
Nat Methods 11(2):122-123 (2014) Hsu et al.
Nat Biotechnol 31(9):827-832 (2013) lyama & Wilson DNA Repair (Amst) 12(8):620-636 (2013) Jiang et al.
Nat Biotechnol 31(3):233-239 (2013) Jinek et al.
Science 337(6096):816-821 (2012) Jinek et al.
Science 343(6176):1247997 (2014) Kleinstiver et al.
Nature 523(7561):481-485 (2015a)
Kleinstiver et al.
Nat Biotechnol 33(12):1293—1298 (2015b) Kleinstiver et al.
Nature 529(7587):490-495 (2016) Komor et al.
Nature 533(7603):420—424 (2016) Lee et al.
Nano Lett 12(12):6322-6327 (2012) Lewis "Medical-Surgical Nursing: Assessment and Management of Cli- nical Problems" (2014) Li Cell Res 18(1):85-98 (2008) Makarova et al.
Nat Rev Microbiol 9(6):467—477 (2011) Mali et al.
Science 339(6121):823-826 (2013) Mantovani et al.
Nucleic Acids Res 16(16):7783-7797 (1988) Marteijn et al.
Nat Rev Mol Cell Biol 15(7):465-481 (2014) Martyn et al., Biochim Biophys Acta 1860(5):525-536 (2017) Nishimasu et al.
Cell 156(5):935-949 (2014) Nishimasu et al.
Cell 162:1113-1126 (2015) Notta et al.
Science 333(6039):218-21 (2011) Ran & Hsu Cell 154(6):1380-1389 (2013) Richardson et al.
Nat Biotechnol 34:339—344 (2016) Shmakov et al.
Molecular Cell 60(3):385—397 (2015) Sternberg et al.
Nature 507(7490):62-67 (2014) Superti-Furga et al.
EMBO J 7(10):3099-3107 (1988) Thein Hum Mol Genet 18(R2):R216-223 (2009) Tsai et al.
Nat Biotechnol 34(5): 483 (2016) Waber et al.
Blood 67(2):551-554 (1986) Wang et al.
Cell 153(4):910-918 (2013) Xiao et al.
Bioinformatics 30(8):1180-1182 (2014) Xu et al.
Genes Dev 24(8):783-798 (2010) Yamano et al.
Cell 165(4): 949—962 (2016) Zetsche et al.
Nat Biotechnol 33(2):139-42 (2015)

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Complexo RNP, caracterizado por compreender um CRISPR de nuclease guiada por RNA de Prevotella e Franciscella 1 (Cpf1) ou uma sua variante e um gRNA, em que o gRNA é capaz de se ligar a um sítio alvo em um promotor de um gene HBG em uma célula.
2. Complexo RNP, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado por o gRNA ser modificado ou não modificado.
3. Método de alteração de um promotor de um gene HBG em uma célula, caracterizado por compreender o contato da célula com o complexo RNP, como definido na reivindicação 1.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a alteração compreender um indel dentro de uma região alvo da caixa CCAAT do promotor de um gene HBG.
5. Complexo RNP, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado por o sítio alvo compreender nucleotídeos localizados entre Chr 11 (NC 000011.10) 5.249.904-5.249.927; Chr 11 (NC 000011.10)
5.254.879 —5.254.909; ou uma sua combinação.
6. Célula isolada, caracterizada por compreender uma alte- ração em um promotor do gene HBG gerado pela entrega de um com- plexo RNP à célula, como definido na reivindicação 1.
7. Método ex vivo para aumentar o nível de hemoglobina fe- tal (HDF) em uma célula humana por edição do genoma, caracterizado por usar um complexo RNP compreendendo um gRNA e uma nuclease guiada por RNA Cpf1i ou uma sua variante para afetar uma alteração em um promotor de um gene HBG, aumentando assim a expressão de HbF.
8. População de células CD34+ ou células-tronco hemato- poiéticas, caracterizada por uma ou mais células na população compre- enderem uma alteração em um promotor de um gene HBG, cuja altera- ção é gerada pela entrega de um complexo RNP compreendendo um gRNA e uma nuclease guiada por RNA Cpf1 ou uma sua variante para a população de células CD34 + ou células-tronco hematopoiéticas.
9. Método para aliviar um ou mais sintomas da doença falci- forme em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado por o método compreender: a) isolar uma população de células CD34+ ou células-tronco hematopoiéticas do indivíduo; b) modificar a população de células isoladas ex vivo através da entrega de um complexo RNP compreendendo um gRNA e uma nu- clease guiada por RNA Cpf1 ou uma sua variante à população de célu- las isoladas, afetando assim uma alteração em um promotor de um gene HBG em uma ou mais células na população; e c) administrar a população modificada de células ao indiví- duo, desse modo, para aliviar um ou mais sintomas da doença falciforme no indivíduo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a alteração compreender um indel dentro de uma região alvo da caixa CCAAT do promotor do gene HBG.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o complexo RNP ser entregue usando eletroporação.
12. População de células modificadas, como definida na rei- vindicação 9, caracterizada por pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, em pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% das células na população de células compre- enderem um indel produtivo.
13. gRNA, caracterizado por compreender uma extremidade 5' e uma extremidade 3', e compreendendo uma extensão de DNA na extremidade 5' e uma modificação 2'-O-metil-3'-fosforotioato na extremi- dade 3', em que o gRNA inclui um segmento de RNA capaz de hibridizar com um sítio alvo e um segmento de RNA capaz de se associar a uma nuclease guiada por RNA Cpf1.
14. gRNA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a extensão do DNA compreender uma sequência apresentada nas SEQ ID NOs: 1235-1250.
15. Complexo RNP, caracterizado por compreender uma nu- clease guiada por RNA Cpf1 e um gRNA, tal como definido na reivindi- cação 14.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3122880B1 (en) 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
JP2019500043A (ja) * 2015-12-28 2019-01-10 ノバルティス アーゲー 異常ヘモグロビン症の治療用組成物および方法
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018220210A1 (en) * 2017-06-02 2018-12-06 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant lentiviral vector for stem cell-based gene therapy of sickle cell disorder
WO2019014564A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Editas Medicine, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES
SG11202101290SA (en) * 2018-08-08 2021-03-30 Integrated Dna Technologies Inc Novel mutations that enhance the dna cleavage activity of acidaminococcus sp. cpf1
WO2020113112A1 (en) * 2018-11-29 2020-06-04 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
AU2020399638A1 (en) * 2019-12-08 2022-06-16 Editas Medicine, Inc. Modified cells and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP4103704A1 (en) * 2020-02-13 2022-12-21 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for engraftment of base edited cells
WO2021228944A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Base editing approaches for the treatment of betahemoglobinopathies
WO2022171783A1 (en) * 2021-02-11 2022-08-18 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Curing disease by transcription regulatory gene editing
EP4047095A1 (en) * 2021-02-22 2022-08-24 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Method and composition for a targeted gene knockout
CA3226886A1 (en) * 2021-08-02 2023-02-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
CN115851706A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 华东师范大学 一种碱基编辑系统及其应用
KR20230132341A (ko) 2022-03-07 2023-09-15 광주과학기술원 신속 DNA 진단을 위한 Cpf1 변이 단백질

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3066201T (lt) 2013-11-07 2018-08-10 Editas Medicine, Inc. Su crispr susiję būdai ir kompozicijos su valdančiomis grnr
EP3553176A1 (en) 2014-03-10 2019-10-16 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
WO2015148860A1 (en) 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
KR20240013283A (ko) * 2014-12-03 2024-01-30 애질런트 테크놀로지스, 인크. 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
WO2016094872A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
JP7030522B2 (ja) 2015-05-11 2022-03-07 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド 幹細胞における遺伝子編集のための最適化ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９システムおよび方法
WO2017077394A2 (en) * 2015-11-04 2017-05-11 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US20190233814A1 (en) * 2015-12-18 2019-08-01 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP3430142A1 (en) * 2016-03-14 2019-01-23 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta hemoglobinopathies
EP3445848A1 (en) 2016-04-19 2019-02-27 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2017191503A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3487523B1 (en) * 2016-07-19 2023-09-06 Duke University Therapeutic applications of cpf1-based genome editing
MX2020003339A (es) * 2017-10-02 2020-11-06 Genedit Inc Arn guía de cpf1 modificado.
JP2021505187A (ja) * 2017-12-11 2021-02-18 エディタス・メディシン、インコーポレイテッド 遺伝子編集のためのｃｐｆ１関連方法及び組成物
US20190241911A1 (en) * 2018-02-06 2019-08-08 Ohio State Innovation Foundation Engineered guide rna and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021518102A (ja) 2021-08-02
SG11202008956XA (en) 2020-10-29
WO2019178426A1 (en) 2019-09-19
MX2020009487A (es) 2020-12-10
AU2019236209A1 (en) 2020-10-01
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