JP7480062B2 - ラパマイシン耐性細胞 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年4月27日に出願された「ラパマイシン耐性細胞」という名称の米国仮出願第62/663,562号の優先権の利益を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、SCRI186WOSEQLISTINGのファイル名で2019年4月25日に作成された約120kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、引用によりその全体が本明細書に援用される。
(i)デオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;
(ii)細胞の標的ゲノム遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA(gRNA)、または該gRNAをコードする核酸;および
(iii)ネイキッドなFKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインポリペプチドをコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型
を含むシステムであって、
前記DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAの会合により形成された複合体によって、細胞の前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの標的化された組み込みが促され、前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドを発現することができる遺伝子組換え細胞が作製されるように、前記DNAエンドヌクレアーゼ、前記gRNAおよび前記ドナー鋳型が構成されていることを特徴とするシステムについて述べる。
いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼはCas9エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、前記遺伝子組換え細胞における発現のためにコドン最適化されており;前記gRNAをコードする核酸は、前記遺伝子組換え細胞における発現のためにコドン最適化されており;かつ/または前記ドナーカセット内の1つ以上のコード配列は、前記遺伝子組換え細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの組み込みが相同組換え修復(HDR)によって行われるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記ドナー鋳型は、前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの組み込みが非相同末端結合(NHEJ)によって行われるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記DNAエンドヌクレアーゼまたは該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、リポソームまたは脂質ナノ粒子への内包化により製剤化される。いくつかの実施形態において、前記リポソームまたは前記脂質ナノ粒子は、前記gRNAまたは該gRNAをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記システムは、前記DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAの会合により形成されたリボ核タンパク質(RNP)複合体をさらに含む。
前記CISCのポリペプチド要素は、
(i)第1の細胞外結合ドメインまたはその機能性誘導体、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその機能性誘導体を含む第1のCISC構成要素;
ならびに
(ii)第2の細胞外結合ドメインまたはその機能性誘導体、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその機能性誘導体を含む第2のCISC構成要素
を含み、
第1のCISC構成要素と第2のCISC構成要素が細胞において発現されると、ラパマイシンまたはラパログの存在下で二量体化して、シグナル伝達能を有するCISCを形成することができるように、第1のCISC構成要素および第2のCISC構成要素が構成されている。
(i)デオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;
(ii)細胞の標的ゲノム遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA(gRNA)、または該gRNAをコードする核酸;および
(iii)ネイキッドなFKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインポリペプチドをコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型
を細胞に提供する工程を含み、
前記DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAの会合により形成された複合体によって、細胞の前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの標的化された組み込みが促され、前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドを発現することができる遺伝子組換え細胞が作製されるように、前記DNAエンドヌクレアーゼ、前記gRNAおよび前記ドナー鋳型が構成されていることを特徴とする方法を提供する。
(i)デオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;
(ii)細胞の標的ゲノム遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA(gRNA)、または該gRNAをコードする核酸;および
(iii)ネイキッドなFKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインポリペプチドをコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型
を細胞に提供する工程を含み、
前記DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAの会合により形成された複合体によって、細胞の前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの標的化された組み込みが促され、前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドを発現することができる遺伝子組換え細胞が作製されるように、前記DNAエンドヌクレアーゼ、前記gRNAおよび前記ドナー鋳型が構成されていることを特徴とする。
いくつかの実施形態において、前記ドナーカセットは、ネイキッドなFRBドメインポリペプチドを細胞内で発現するように構成されている。いくつかの実施形態において、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、前駆T細胞または制御性T細胞(Treg)である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、CD34+細胞、CD8+細胞またはCD4+細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD8+T細胞、セントラルメモリーCD8+T細胞、エフェクターメモリーCD8+T細胞およびバルクCD8+T細胞からなる群から選択されるCD8+細胞傷害性Tリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ナイーブCD4+T細胞、セントラルメモリーCD4+T細胞、エフェクターメモリーCD4+T細胞およびバルクCD4+T細胞からなる群から選択されるCD4+ヘルパーTリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ネイキッドなFRBドメインポリペプチドをコードする核酸がドナーカセットに含まれていない対照細胞と比較して、ラパマイシンまたはラパログの存在下での増殖が増強されている。いくつかの実施形態において、ラパマイシンまたはラパログの濃度は、0.1nM~100nMまたは約0.1nM~約100nMである。
ラパマイシンまたはラパログに混合細胞集団を接触させる工程を含み、
二量体化により活性化される化学誘導シグナル伝達複合体(dimerization activatable chemical-induced signaling complex:CISC)の構成要素およびネイキッドなFRBドメインを発現する遺伝子組換え細胞のインビトロまたはインビボにおける活性化および拡大増殖が、前記混合細胞集団中のその他の細胞よりも増強されることを特徴とする方法について述べる。
いくつかの実施形態において、前記ラパログは、エベロリムス、CCI-779、C20-メタリルラパマイシン、C16-(S)-3-メチルインドールラパマイシン、C16-iRap、AP21967、ミコフェノール酸ナトリウム、塩酸ベニジピン、AP1903、AP23573、ならびにこれらの代謝産物、誘導体および/または組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記混合細胞集団と接触させるラパマイシンまたはラパログの濃度は、0.1nM~100nMまたは約0.1nM~約100nMである。
別段の記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書で引用されたすべての特許、出願、公開出願およびその他の刊行物は、別段の記載がない限り、いずれも引用によりその全体が明示的に本明細書に援用される。本明細書に記載の用語に対して複数の定義がある場合には、別段の記載がない限り、この節に記載の定義を優先するものとする。
前記1つ以上のタンパク質配列は、第1の配列および第2の配列を有していてもよい。いくつかの実施形態において、第1の配列は、第1の細胞外結合ドメインまたはその機能性誘導体、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその機能性誘導体を含んでいてもよい第1のCISC構成要素をコードする。いくつかの実施形態において、第2の配列は、第2の細胞外結合ドメインまたはその機能性誘導体、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部を含んでいてもよい第2のCISC構成要素をコードする。いくつかの実施形態において、第1のCISC構成要素と第2のCISC構成要素は、発現された場合にリガンドの存在下で二量体化するように配置されていてもよい。いくつかの実施形態において、第1のCISC構成要素と第2のCISC構成要素は、発現された場合にリガンドの存在下で同時に二量体化するように配置されていてもよい。
形質導入および導入遺伝子の発現を効率的に行うために、様々なベクターの組み合わせを構築することができる。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。別の実施形態において、前記ベクターとして、ウイルスベクターとプラスミドベクターの組み合わせが挙げられる。別のウイルスベクターとして、フォーミーウイルス、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクターおよび/またはレンチウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、大腸菌などの細菌系におけるタンパク質発現用のベクターである。別の実施形態において、第1のベクターは、第1の細胞外結合ドメインまたはその機能性誘導体、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその機能性誘導体を含む第1のCISC構成要素をコードすることができ、第2のベクターは、第2の細胞外結合ドメインまたはその機能性誘導体、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインまたはその一部を含む第2のCISC構成要素をコードすることができる。
細胞内発現のためのネイキッドなFKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ネイキッドなFRBドメインポリペプチドは、本明細書においてより詳述されている第1のCISC構成要素および第2のCISC構成要素の1つ以上のタンパク質配列とともに共発現される。ネイキッドなFRBドメインポリペプチドは、配列番号1または2に示される配列と100%、99%、98%、95%、90%、85%もしくは80%の配列同一性、またはこれらのパーセンテージ内に含まれるすべての数値および範囲を含む配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。
細胞におけるゲノム編集用システムであって、ネイキッドなFRBドメインポリペプチドをコードし、さらに任意でCISCをさらにコードする核酸を細胞ゲノムへと標的化して組み込むことによって、本明細書に記載のネイキッドなFRBドメインポリペプチドを発現させ、かつ任意で本明細書に記載のCISCを発現させるゲノム編集用システムを提供する。また、本開示は、特に、遺伝子組換え細胞集団の選択的な活性化および/または拡大増殖において使用するためのシステムであって、たとえば、遺伝子組換え細胞が選択的に濃縮された細胞集団を調製するために使用されるシステムを提供する。
i)デオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;
ii)細胞の標的ゲノム遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA(gRNA)、または該gRNAをコードする核酸;および
iii)ネイキッドなFKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインポリペプチドをコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型
を含むシステムを提供する。
前記DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAの会合により形成された複合体によって、細胞の前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの標的化された組み込みが促され、前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドを発現することができる遺伝子組換え細胞が作製されるように、前記DNAエンドヌクレアーゼ、前記gRNAおよび前記ドナー鋳型が構成されている。
遺伝子編集を利用して宿主細胞または生物を遺伝子組換えする方法であって、本明細書に開示されるネイキッドなFRBドメインポリペプチドのいずれかを発現させ、かつ任意で、本明細書に開示される化学誘導シグナル伝達複合体ポリペプチドを発現させる方法を提供する。いくつかの態様では、遺伝子編集は、CRISPR/Casシステムを使用して行われる。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)のゲノム遺伝子座は、多くの原核生物(細菌や古細菌など)のゲノムに見出すことができる。原核生物では、CRISPR遺伝子座は、ウイルスやファージなどの外来侵入物からの原核生物の防御に有用な免疫系の一種として機能する生成物をコードする。CRISPR遺伝子座の機能には3つの段階があり、CRISPR遺伝子座への新たな配列の組み込み、CRISPR RNA(crRNA)の発現、および外来侵入核酸のサイレンシングからなる。5つの種類のCRISPRシステム(たとえば、I型、II型、III型、U型、およびV型)が同定されている。
自然界のII型CRISPRシステムにおけるcrRNAの生合成では、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)が必要とされる。tracrRNAは内在性RNaseIIIによって修飾され、次いでpre-crRNAアレイのcrRNA反復配列にハイブリダイズする。内在性RNaseIIIが、pre-crRNAの切断ために動員される。切断されたcrRNAは、エキソリボヌクレアーゼによりトリミングされ(たとえば、5’末端のトリミング)、成熟形態のcrRNAを生成する。tracrRNAは、crRNAにハイブリダイズしたまま残り、tracrRNAとcrRNAが、部位指向性ポリペプチド(たとえばCas9)と会合する。crRNA-tracrRNA-Cas9複合体では、crRNAがハイブリダイズできる標的核酸へと該複合体がcrRNAにより先導される。crRNAが標的核酸にハイブリダイズすることによって、Cas9が活性化されて、標的核酸を切断する。II型CRISPRシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる。実際、PAMは、標的核酸への部位指向性ポリペプチド(たとえばCas9)の結合を促すために必須である。II型システム(NmeniまたはCASS4とも呼ばれる)は、II-A型(CASS4)とII-B型(CASS4a)にさらに細分化される。Jinek, M. et al. (2012). Science, 337(6096):816-821では、RNAでプログラム可能なゲノム編集にCRISPR/Cas9システムが有用であることが示されており、さらに国際特許出願WO 2013/176772では、部位指向性遺伝子編集にCRISPR/Casエンドヌクレアーゼシステムを使用した多数の例と適用が記載されている。
V型のCRISPRシステムは、II型システムとはいくつかの重要な違いがある。たとえば、Cpf1は単鎖RNA誘導性エンドヌクレアーゼであるが、II型システムとは異なり、tracrRNAを欠く。実際、Cpf1と会合したCRISPRアレイは、トランス活性化されたtracrRNAをさらに必要とすることなく、成熟したcrRNAにプロセシングされる。V型CRISPRアレイは、42~44ヌクレオチド長の短い成熟crRNAにプロセシングされ、各成熟crRNAは、19ヌクレオチド長の直接反復配列から始まり、その後に23~25ヌクレオチド長のスペーサー配列が続く。これとは対照的に、II型システムの成熟crRNAでは、20~24ヌクレオチド長のスペーサー配列から始まり、その後に22ヌクレオチド長または約22ヌクレオチド長の直接反復配列が続く。また、Cpf1は、Tリッチのプロトスペーサー隣接モチーフを利用することにより、この短いTリッチPAMの後に続く標的DNAがCpf1-crRNA複合体によって効率的に切断される。これは、II型システムにおいて、標的DNAに続くGリッチのPAMが利用されることとは対照的である。したがって、V型システムはPAMから離れた位置で標的を切断し、II型システムはPAMに隣接する位置で標的を切断する。さらに、II型システムとは対照的に、Cpf1は、ずれた位置でDNA二本鎖を切断することから、4ヌクレオチド長または5ヌクレオチド長の5’末端突出を形成する。これに対して、II型システムによる二本鎖切断では、平滑末端が形成される。Cpf1は、II型システムと同様に、RuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含むと予測されているが、II型システムとは異なり、第2のHNHエンドヌクレアーゼドメインを持たない。
NHEJおよび/またはHDRによる標的DNAの修飾によって、たとえば、変異、欠失、変化、組み込み、遺伝子の修正、遺伝子の置換、遺伝子へのタグ付加、導入遺伝子の挿入、ヌクレオチドの欠失、遺伝子破壊、転座、および/または遺伝子変異が起こりうる。ゲノムDNAへの非天然核酸の組み込みは、ゲノム編集の一例である。
典型的なCRISPR/Casポリペプチドとして、Fonfara, I. et al. (2014). Nucl. Acids Res., 42(4):2577-2590(この文献は引用により本明細書に援用される)の図1に示されるCas9ポリペプチドが挙げられる。CRISPR/Cas遺伝子の命名システムは、Cas遺伝子が発見されて以来、大幅に改訂が重ねられている。Fonfaraら(2014)による図5で、様々な生物種に由来するCas9ポリペプチド用のPAM配列が示されている。
ゲノム標的化核酸またはガイドRNA
本開示は、関連するポリペプチド(たとえば、部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼ)の活性を標的核酸内の特定の標的配列(たとえば目的の遺伝子)に指向させることができるゲノム標的化核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記ゲノム標的化核酸は、RNAである。本明細書では、ゲノム標的化RNAを「ガイドRNA」または「gRNA」と呼ぶ。ガイドRNAは、目的の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列とCRISPR反復配列を少なくとも有する。II型のシステムでは、gRNAは、tracrRNA配列と呼ばれる第2のRNAをさらに有する。II型ガイドRNA(gRNA)は、CRISPR反復配列とtracrRNA配列が互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する。V型ガイドRNA(gRNA)では、CRISPR反復RNA(crRNA)が二本鎖を形成する。いずれのシステムにおいても、部位特異的ポリペプチドに前記二本鎖が結合して、ガイドRNAと部位特異的ポリペプチドの複合体が形成される。このゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドと会合することによって、形成される複合体に標的特異性を付与する。したがって、このゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性に指向性を付与する。
ゲノムを標的とした核酸の実施形態のいくつかにおいて、スペーサー伸長配列は、活性を調節し、安定性を付与し、かつ/またはゲノムを標的とした核酸を修飾するための場所を提供することができる。また、スペーサー伸長配列は、オンターゲット活性もしくはオフターゲット活性または特異性を調節することができる。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列を提供する。スペーサー伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長を超える長さ、5ヌクレオチド長を超える長さ、10ヌクレオチド長を超える長さ、15ヌクレオチド長を超える長さ、20ヌクレオチド長を超える長さ、25ヌクレオチド長を超える長さ、30ヌクレオチド長を超える長さ、35ヌクレオチド長を超える長さ、40ヌクレオチド長を超える長さ、45ヌクレオチド長を超える長さ、50ヌクレオチド長を超える長さ、60ヌクレオチド長を超える長さ、70ヌクレオチド長を超える長さ、80ヌクレオチド長を超える長さ、90ヌクレオチド長を超える長さ、100ヌクレオチド長を超える長さ、120ヌクレオチド長を超える長さ、140ヌクレオチド長を超える長さ、160ヌクレオチド長を超える長さ、180ヌクレオチド長を超える長さ、200ヌクレオチド長を超える長さ、220ヌクレオチド長を超える長さ、240ヌクレオチド長を超える長さ、260ヌクレオチド長を超える長さ、280ヌクレオチド長を超える長さ、300ヌクレオチド長を超える長さ、320ヌクレオチド長を超える長さ、340ヌクレオチド長を超える長さ、360ヌクレオチド長を超える長さ、380ヌクレオチド長を超える長さ、400ヌクレオチド長を超える長さ、1000ヌクレオチド長を超える長さ、2000ヌクレオチド長を超える長さ、3000ヌクレオチド長を超える長さ、4000ヌクレオチド長を超える長さ、5000ヌクレオチド長を超える長さ、6000ヌクレオチド長を超える長さ、もしくは7000ヌクレオチド長を超える長さ、またはそれ以上のヌクレオチド長を超える長さであってもよい。スペーサー伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長もしくは約1ヌクレオチド長、5ヌクレオチド長もしくは約5ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長もしくは約10ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長もしくは約15ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長もしくは約20ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長もしくは約25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長もしくは約30ヌクレオチド長、35ヌクレオチド長もしくは約35ヌクレオチド長、40ヌクレオチド長もしくは約40ヌクレオチド長、45ヌクレオチド長もしくは約45ヌクレオチド長、50ヌクレオチド長もしくは約50ヌクレオチド長、60ヌクレオチド長もしくは約60ヌクレオチド長、70ヌクレオチド長もしくは約70ヌクレオチド長、80ヌクレオチド長もしくは約80ヌクレオチド長、90ヌクレオチド長もしくは約90ヌクレオチド長、100ヌクレオチド長もしくは約100ヌクレオチド長、120ヌクレオチド長もしくは約120ヌクレオチド長、140ヌクレオチド長もしくは約140ヌクレオチド長、160ヌクレオチド長もしくは約160ヌクレオチド長、180ヌクレオチド長もしくは約180ヌクレオチド長、200ヌクレオチド長もしくは約200ヌクレオチド長、220ヌクレオチド長もしくは約220ヌクレオチド長、240ヌクレオチド長もしくは約240ヌクレオチド長、260ヌクレオチド長もしくは約260ヌクレオチド長、280ヌクレオチド長もしくは約280ヌクレオチド長、300ヌクレオチド長もしくは約300ヌクレオチド長、320ヌクレオチド長もしくは約320ヌクレオチド長、340ヌクレオチド長もしくは約340ヌクレオチド長、360ヌクレオチド長もしくは約360ヌクレオチド長、380ヌクレオチド長もしくは約380ヌクレオチド長、400ヌクレオチド長もしくは約400ヌクレオチド長、1000ヌクレオチド長もしくは約1000ヌクレオチド長、2000ヌクレオチド長もしくは約2000ヌクレオチド長、3000ヌクレオチド長もしくは約3000ヌクレオチド長、4000ヌクレオチド長もしくは約4000ヌクレオチド長、5000ヌクレオチド長もしくは約5000ヌクレオチド長、6000ヌクレオチド長もしくは約6000ヌクレオチド長、もしくは7000ヌクレオチド長もしくは約7000ヌクレオチド長、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。スペーサー伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長未満、5ヌクレオチド長未満、10ヌクレオチド長未満、15ヌクレオチド長未満、20ヌクレオチド長未満、25ヌクレオチド長未満、30ヌクレオチド長未満、35ヌクレオチド長未満、40ヌクレオチド長未満、45ヌクレオチド長未満、50ヌクレオチド長未満、60ヌクレオチド長未満、70ヌクレオチド長未満、80ヌクレオチド長未満、90ヌクレオチド長未満、100ヌクレオチド長未満、120ヌクレオチド長未満、140ヌクレオチド長未満、160ヌクレオチド長未満、180ヌクレオチド長未満、200ヌクレオチド長未満、220ヌクレオチド長未満、240ヌクレオチド長未満、260ヌクレオチド長未満、280ヌクレオチド長未満、300ヌクレオチド長未満、320ヌクレオチド長未満、340ヌクレオチド長未満、360ヌクレオチド長未満、380ヌクレオチド長未満、400ヌクレオチド長未満、1000ヌクレオチド長未満、2000ヌクレオチド長未満、3000ヌクレオチド長未満、4000ヌクレオチド長未満、5000ヌクレオチド長未満、6000ヌクレオチド長未満、7000ヌクレオチド長未満、またはそれ以上のヌクレオチド長未満であってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列の長さは、10ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列の長さは、10~30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、スペーサー伸長配列の長さは、30~70ヌクレオチド長である。
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列にハイブリダイズする。ゲノム標的化核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション(たとえば塩基対合)を介して配列特異的に標的核酸と相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変動する。
いくつかの実施形態において、CRISPRの最小反復配列は、参照CRISPR反復配列(たとえばS.pyogenes由来のcrRNA)と少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、少なくとも40%もしくは少なくとも約40%、少なくとも50%もしくは少なくとも約50%、少なくとも60%もしくは少なくとも約60%、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%、少なくとも70%もしくは少なくとも約70%、少なくとも75%もしくは少なくとも約75%、少なくとも80%もしくは少なくとも約80%、少なくとも85%もしくは少なくとも約85%、少なくとも90%もしくは少なくとも約90%、少なくとも95%もしくは少なくとも約95%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、tracrRNAの最小配列は、参照tracrRNA配列(たとえばS.pyogenes由来の野生型tracrRNA)と少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、少なくとも40%もしくは少なくとも約40%、少なくとも50%もしくは少なくとも約50%、少なくとも60%もしくは少なくとも約60%、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%、少なくとも70%もしくは少なくとも約70%、少なくとも75%もしくは少なくとも約75%、少なくとも80%もしくは少なくとも約80%、少なくとも85%もしくは少なくとも約85%、少なくとも90%もしくは少なくとも約90%、少なくとも95%もしくは少なくとも約95%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態において、3’tracrRNA配列は、参照tracrRNA配列(たとえばS.pyogenes由来のtracrRNA)と少なくとも30%もしくは少なくとも約30%、少なくとも40%もしくは少なくとも約40%、少なくとも50%もしくは少なくとも約50%、少なくとも60%もしくは少なくとも約60%、少なくとも65%もしくは少なくとも約65%、少なくとも70%もしくは少なくとも約70%、少なくとも75%もしくは少なくとも約75%、少なくとも80%もしくは少なくとも約80%、少なくとも85%もしくは少なくとも約85%、少なくとも90%もしくは少なくとも約90%、少なくとも95%もしくは少なくとも約95%、または少なくとも100%の配列同一性を有する配列を有する。
いくつかの実施形態において、ガイドRNAが単一分子ガイドまたは二分子ガイドである場合、tracrRNA伸長配列を提供する。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長~400ヌクレオチド長または約1ヌクレオチド長~約400ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長を超える長さ、5ヌクレオチド長を超える長さ、10ヌクレオチド長を超える長さ、15ヌクレオチド長を超える長さ、20ヌクレオチド長を超える長さ、25ヌクレオチド長を超える長さ、30ヌクレオチド長を超える長さ、35ヌクレオチド長を超える長さ、40ヌクレオチド長を超える長さ、45ヌクレオチド長を超える長さ、50ヌクレオチド長を超える長さ、60ヌクレオチド長を超える長さ、70ヌクレオチド長を超える長さ、80ヌクレオチド長を超える長さ、90ヌクレオチド長を超える長さ、100ヌクレオチド長を超える長さ、120ヌクレオチド長を超える長さ、140ヌクレオチド長を超える長さ、160ヌクレオチド長を超える長さ、180ヌクレオチド長を超える長さ、200ヌクレオチド長を超える長さ、220ヌクレオチド長を超える長さ、240ヌクレオチド長を超える長さ、260ヌクレオチド長を超える長さ、280ヌクレオチド長を超える長さ、300ヌクレオチド長を超える長さ、320ヌクレオチド長を超える長さ、340ヌクレオチド長を超える長さ、360ヌクレオチド長を超える長さ、380ヌクレオチド長を超える長さ、または400ヌクレオチド長を超える長さである。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、20ヌクレオチド長~5000ヌクレオチド長以上または約20ヌクレオチド長~約5000ヌクレオチド長以上である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1000ヌクレオチド長を超える。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1ヌクレオチド長未満、5ヌクレオチド長未満、10ヌクレオチド長未満、15ヌクレオチド長未満、20ヌクレオチド長未満、25ヌクレオチド長未満、30ヌクレオチド長未満、35ヌクレオチド長未満、40ヌクレオチド長未満、45ヌクレオチド長未満、50ヌクレオチド長未満、60ヌクレオチド長未満、70ヌクレオチド長未満、80ヌクレオチド長未満、90ヌクレオチド長未満、100ヌクレオチド長未満、120ヌクレオチド長未満、140ヌクレオチド長未満、160ヌクレオチド長未満、180ヌクレオチド長未満、200ヌクレオチド長未満、220ヌクレオチド長未満、240ヌクレオチド長未満、260ヌクレオチド長未満、280ヌクレオチド長未満、300ヌクレオチド長未満、320ヌクレオチド長未満、340ヌクレオチド長未満、360ヌクレオチド長未満、380ヌクレオチド長未満、400ヌクレオチド長未満またはそれ以上の個数未満である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、1000ヌクレオチド長未満であってもよい。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、10ヌクレオチド長未満である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、10~30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、tracrRNA伸長配列の長さは、30~70ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、CRISPR RNA最小配列とtracrRNA最小配列により形成される二本鎖に「バルジ」が存在する。バルジは、前記二本鎖内のヌクレオチド非対合領域である。いくつかの実施形態において、バルジは、部位特異的ポリペプチドへの前記二本鎖の結合に寄与する。バルジは、二本鎖の一方に、非対合配列5’-XXXY-3’を有し(Xは任意のプリン塩基であり、Yは、反対鎖のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成しうるヌクレオチドを有する)、二本鎖のもう一方に非対合ヌクレオチド領域を有する。二本鎖の各鎖にある非対合ヌクレオチドの数は異なる場合がある。
様々な実施形態において、3’tracrRNA配列中のtracrRNA最小配列の3’末端側に1つ以上のヘアピンが存在する。
いくつかの実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカー配列の長さは、3ヌクレオチド長~100ヌクレオチド長または約3ヌクレオチド長~約100ヌクレオチド長である。Jinek, M. et al. (2012). Science, 337(6096):816-821では、たとえば、4個のヌクレオチドからなる単純な「テトラループ」(-GAAA-)が使用された。前記リンカーの長さは、たとえば、3ヌクレオチド長(nt)~90ntもしくは約3nt~約90nt、3nt~80ntもしくは約3nt~約80nt、3nt~70ntもしくは約3nt~約70nt、3nt~60ntもしくは約3nt~約60nt、3nt~50ntもしくは約3nt~約50nt、3nt~40ntもしくは約3nt~約40nt、3nt~30ntもしくは約3nt~約30nt、3nt~20ntもしくは約3nt~約20nt、または3nt~10ntもしくは約3nt~約10ntである。たとえば、前記リンカーの長さは、3nt~5ntもしくは約3nt~約5nt、5nt~10ntもしくは約5nt~約10nt、10nt~15ntもしくは約10nt~約15nt、15nt~20ntもしくは約15nt~約20nt、20nt~25ntもしくは約20nt~約25nt、25nt~30ntもしくは約25nt~約30nt、30nt~35ntもしくは約30nt~約35nt、35nt~40ntもしくは約35nt~約40nt、40nt~50ntもしくは約40nt~約50nt、50nt~60ntもしくは約50nt~約60nt、60nt~70ntもしくは約60nt~約70nt、70nt~80ntもしくは約70nt~約80nt、80nt~90ntもしくは約80nt~約90nt、または90nt~100ntもしくは約90nt~約100ntであってもよい。いくつかの実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカーの長さは、4~40ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、前記リンカーの長さは、少なくとも100ヌクレオチド長もしくは少なくとも約100ヌクレオチド長、少なくとも500ヌクレオチド長もしくは少なくとも約500ヌクレオチド長、少なくとも1000ヌクレオチド長もしくは少なくとも約1000ヌクレオチド長、少なくとも1500ヌクレオチド長もしくは少なくとも約1500ヌクレオチド長、少なくとも2000ヌクレオチド長もしくは少なくとも約2000ヌクレオチド長、少なくとも2500ヌクレオチド長もしくは少なくとも約2500ヌクレオチド長、少なくとも3000ヌクレオチド長もしくは少なくとも約3000ヌクレオチド長、少なくとも3500ヌクレオチド長もしくは少なくとも約3500ヌクレオチド長、少なくとも4000ヌクレオチド長もしくは少なくとも約4000ヌクレオチド長、少なくとも4500ヌクレオチド長もしくは少なくとも約4500ヌクレオチド長、少なくとも5000ヌクレオチド長もしくは少なくとも約5000ヌクレオチド長、少なくとも5500ヌクレオチド長もしくは少なくとも約5500ヌクレオチド長、少なくとも6000ヌクレオチド長もしくは少なくとも約6000ヌクレオチド長、少なくとも6500ヌクレオチド長もしくは少なくとも約6500ヌクレオチド長、もしくは少なくとも7000ヌクレオチド長もしくは少なくとも約7000ヌクレオチド長、または少なくともそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、前記リンカーの長さは、最大でも100ヌクレオチド長もしくは最大でも約100ヌクレオチド長、最大でも500ヌクレオチド長もしくは最大でも約500ヌクレオチド長、最大でも1000ヌクレオチド長もしくは最大でも約1000ヌクレオチド長、最大でも1500ヌクレオチド長もしくは最大でも約1500ヌクレオチド長、最大でも2000ヌクレオチド長もしくは最大でも約2000ヌクレオチド長、最大でも2500ヌクレオチド長もしくは最大でも約2500ヌクレオチド長、最大でも3000ヌクレオチド長もしくは最大でも約3000ヌクレオチド長、最大でも3500ヌクレオチド長もしくは最大でも約3500ヌクレオチド長、最大でも4000ヌクレオチド長もしくは最大でも約4000ヌクレオチド長、最大でも4500ヌクレオチド長もしくは最大でも約4500ヌクレオチド長、最大でも5000ヌクレオチド長もしくは最大でも約5000ヌクレオチド長、最大でも5500ヌクレオチド長もしくは最大でも約5500ヌクレオチド長、最大でも6000ヌクレオチド長もしくは最大でも約6000ヌクレオチド長、最大でも6500ヌクレオチド長もしくは最大でも約6500ヌクレオチド長、もしくは最大でも7000ヌクレオチド長もしくは最大でも約7000ヌクレオチド長、またはそれ以上のヌクレオチド長である。
DNAエンドヌクレアーゼなどの部位指向性ポリペプチドは、核酸(たとえばゲノムDNA)に二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断により、細胞に内在するDNA修復経路(たとえば、相同性依存的修復(HDR)、非相同末端結合、代替非相同末端結合(A-NHEJ)またはマイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ))を刺激することができる。NHEJは、相同鋳型を必要とせずに、切断された標的核酸を修復することができる。これによって、切断部位の標的核酸に小さな欠失または挿入(indel)が生じることがあり、遺伝子発現の破壊または変化がもたらされる場合がある。相同性依存的修復(HDR)は相同組換え(HR)としても知られ、相同修復鋳型またはドナーが利用可能な場合に発生することがある。
いくつかの実施形態において、前述を踏まえれば、前記ゲノム編集方法および前記組成物において、部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列(またはオリゴヌクレオチド)を使用することができる。部位指向性ポリペプチドをコードする核酸配列は、DNAであってもよく、RNAであってもよい。部位指向性ポリペプチドをコードする核酸配列がRNAである場合、このRNA は、gRNA配列に共有結合することができるか、別個の配列として存在することができる。いくつかの実施形態において、部位指向性ポリペプチドまたはDNAエンドヌクレアーゼのペプチド配列を、これらの核酸配列の代わりに使用することができる。
別の一態様において、本開示は、本開示のゲノム標的化核酸をコードするヌクレオチド配列を有する核酸、本開示の部位指向性ポリペプチド、および/または本開示の方法の実施形態を実施するために必要な任意の核酸もしくはタンパク質分子を提供する。いくつかの実施形態において、このような核酸は、ベクター(たとえば組換え発現ベクター)である。
ゲノム標的化核酸は、部位指向性ポリペプチド(たとえばCas9などの核酸誘導性ヌクレアーゼ)と相互作用することにより、複合体を形成する。ゲノム標的化核酸(たとえばgRNA)は、部位指向性ポリペプチドを標的核酸に先導する。
本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、宿主細胞(たとえば哺乳動物細胞(たとえばリンパ球)にタンパク質配列または発現ベクターを導入することによって、ラパマイシンにより調節されるサイトカインのシグナル伝達を誘導し、かつ/または二量体化CISC構成要素と細胞内に発現されるネイキッドなFRBドメインポリペプチドとを発現する細胞を選択的に拡大増殖させることが望ましい場合がある。たとえば、二量体化CISCは、リガンドと接触すると、CISC構成要素が導入された細胞においてサイトカインのシグナル伝達を可能とし、細胞(哺乳動物細胞など)の内部でシグナルを伝達することができ、これに対して、細胞内で発現されるネイキッドなFRBドメインポリペプチドは、ラパマイシンの有害作用に対する耐性を細胞に付与することができる。さらに、本明細書に記載の2つの特定の遺伝子組換えイベント(たとえば、CRISPR/Casシステムを介した遺伝子組換えイベント)を起こした細胞のみが選択されるように、細胞(哺乳動物細胞など)の選択的な拡大増殖を制御することができる。このような細胞の調製は、本開示を踏まえ、当業者であれば容易に理解できる公知の技術に従って行うことができる。
一態様において、本開示は、細胞のゲノムを編集して、遺伝子組換え細胞を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、遺伝子組換え細胞集団を提供する。したがって、遺伝子組換え細胞は、ゲノム編集(たとえばCRISPR/Casシステムを使用したゲノム編集)によって導入された少なくとも1つの遺伝子組換えを有する細胞を含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換えされたリンパ球、たとえば、ヒトCD4+T細胞などのT細胞である。ネイキッドなFRBドメインポリペプチドをコードし、かつ任意でCISCをコードする核酸が組み込まれた遺伝子組換え細胞が、本明細書において想定される。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞の内部においてシグナルを活性化させる方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の細胞(哺乳動物細胞など)を提供する工程を含んでいてもよく、この細胞は、本明細書に記載のタンパク質配列または本明細書に記載の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の二量体化CISCをコードするタンパク質配列、または本明細書に記載の発現ベクターを発現させる工程さらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞(哺乳動物細胞など)をリガンドと接触させる工程を含み、これによって、第1のCISC構成要素と第2のCISC構成要素の二量体化が誘導され、その結果、細胞の内部へシグナルが伝達される。いくつかの実施形態において、前記リガンドはラパマイシンまたはラパログである。いくつかの実施形態において、二量体化を誘導するためリガンドの有効量として、0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、もしくは100nM、またはこれらの数値のいずれか2つによって定義される範囲内の濃度のリガンドが提供される。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞などの細胞からなる集団を選択的に拡大増殖させる方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に記載の細胞(哺乳動物細胞など)を提供する工程を含んでいてもよく、この細胞は、本明細書に記載のタンパク質配列または本明細書に記載の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載のネイキッドなFRBドメインポリペプチドおよび/もしくは二量体化CISCをコードするタンパク質配列、または本明細書に記載の発現ベクターを発現させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞(哺乳動物細胞など)をリガンドと接触させる工程を含み、これによって、第1のCISC構成要素と第2のCISC構成要素の二量体化が誘導され、その結果、細胞の内部へシグナルが伝達される。いくつかの実施形態において、前記リガンドは、ラパマイシンまたはラパログである(たとえば、本明細書に開示されるラパマイシンまたはラパログ化合物のいずれかである)。いくつかの実施形態において、二量体化を誘導するために提供されるリガンドの有効量は、0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM、もしくは100nM、またはこれらの数値のいずれか2つによって定義される範囲内の濃度である。
いくつかの実施形態において、細胞のゲノムを編集する方法を提供し、より具体的には、i)細胞の細胞質内においてネイキッドなFRBドメインポリペプチドを発現させ、任意でii)二量体化により活性化される化学誘導シグナル伝達複合体(CISC)の1つ以上のポリペプチド要素を発現させるための細胞ゲノムの編集方法であって、シグナル伝達能を有するCISCが、細胞の生存および/または増殖を促進するシグナル伝達経路において刺激シグナルを発生することができることを特徴とする方法を提供する。
i)デオキシリボ核酸(DNA)エンドヌクレアーゼ、または該DNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸;
ii)細胞の標的ゲノム遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサー配列を含むガイドRNA(gRNA)、または該gRNAをコードする核酸;および
iii)ネイキッドなFKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインポリペプチドをコードする核酸配列を含むドナーカセットを含むドナー鋳型
を細胞に提供する工程を含み、
前記DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAの会合により形成された複合体によって、細胞の前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの標的化された組み込みが促され、前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドを発現することができる遺伝子組換え細胞が作製されるように、前記DNAエンドヌクレアーゼ、前記gRNAおよび前記ドナー鋳型が構成されていることを特徴とする方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される方法によって、宿主ゲノム中の特定の位置に、ネイキッドなFRBドメインポリペプチドまたはその機能性誘導体をコードする配列を組み込むことができ、この方法を「標的化組み込み」と呼ぶ。いくつかの実施形態において、配列特異的なヌクレアーゼ、たとえば部位特異的なポリペプチド、たとえばDNAエンドヌクレアーゼ(たとえば、Cas9などの核酸誘導型ヌクレアーゼ)を使用した標的化組み込みによって、ゲノムDNA中に二本鎖切断を生じさせることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書で詳しく説明し、当技術分野でも知られているように、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、たとえば、活性、安定性もしくは特異性の増強、送達の変更、宿主細胞の自然免疫応答の低減またはその他の増強のための、個別または組み合わせて利用可能な1つ以上の修飾を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法で使用される核酸分子、たとえば、本開示のゲノム標的化核酸および/または部位指向性ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達用の送達担体の内部またはその表面にパッケージされる。想定される送達担体として、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、およびミセルが挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野で報告されているように、様々な標的化部分を使用して、このような担体と所望の細胞種または位置との選択的な相互作用を増強することができる。
一態様において、本明細書に記載の方法のいずれかに従って編集された細胞を用いた養子細胞療法により対象を治療するための遺伝子療法アプローチを提供する。たとえば、いくつかの実施形態において、前記障害または前記健康状態は、自己免疫疾患(たとえばIPEX症候群)または臓器移植に起因する障害(たとえばGVHD)であり、前記編集された細胞はTregの表現型を有する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子療法アプローチは、ネイキッドなFRBドメインポリペプチドおよびCISCをコードする配列を含む核酸を、対象の関連する種類の細胞のゲノムに組み込み、それによって、たとえば、前記障害または前記健康状態の1つ以上の症状を長期間にわたり緩和するような安定な治療を提供し、かつ/または前記障害または前記健康状態の根治もしくは緩和を提供する。いくつかの実施形態において、ネイキッドなFRBドメインポリペプチドおよびCISCをコードする配列が組み込まれる遺伝子療法アプローチの対象となる細胞種は、リンパ球細胞、たとえばCD4+T細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示のエクスビボでの方法は、このような方法を必要とする対象にゲノム編集された細胞を移植することを含む。この移植工程は、当技術分野で公知の移植方法であれば、どのような方法を使用しても行うことができる。たとえば、遺伝子組換え細胞を、対象の血液中に直接注射することができ、あるいはその他の方法で対象に投与することができる。
一態様において、本開示は、本明細書で開示された方法を実施するための組成物を提供する。組成物は、ゲノム標的化核酸(たとえばgRNA);部位指向性ポリペプチド(たとえばDNAエンドヌクレアーゼ)または該部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および本明細書で開示される方法による所望の遺伝子組換えを達成するために挿入されるポリヌクレオチド(たとえばドナー鋳型)のうちの1つ以上を含むことができる。
本明細書において提供および記載される細胞、発現ベクターおよびタンパク質配列と、これらを製造および使用するための説明書を含むキットおよびシステムを提供する。したがって、たとえば、本明細書に記載のタンパク質配列、本明細書に記載の発現ベクター、および/または本明細書に記載の細胞のうちの1つ以上を含むキットを提供する。また、ラパマイシン耐性細胞の内部へと選択的にシグナルを活性化させるシステムであって、本明細書に記載の細胞を含み、該細胞が、本明細書に記載の発現ベクターを含み、該発現ベクターが、本明細書に記載のタンパク質配列をコードする核酸を含むことを特徴とするシステムを提供する。
本実施例は、宿主細胞の細胞質内においてネイキッドな「デコイ」FRBドメインを細胞内で発現させるための、CISCをコードするレンチウイルスコンストラクトの作製および試験について述べる。
本実施例では、DISCコンストラクトのCISC構成要素の改変された受容体タンパク質の作製について述べる。コンピューターを使用したタンパク質のモデリングでは、DISCコンストラクトのCISC構成要素の2つの受容体タンパク質間の間隔が空いていると最適ではない可能性が予測されている。したがって、キメラ受容体タンパク質の特定のセクション(たとえば、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間の境界)の長さを変更することによって、増殖シグナルを増加させることができるか否かについて試験するためにさらなるコンストラクトをいくつか作製した。
遺伝子編集で生じうる問題の1つとして、送達ベクター(たとえばウイルス)にパッケージにすることが可能な物資の量に制限があることが挙げられる。本実施例では、ラパマイシンを用いた処理により増殖を制御するために、T細胞に組換え導入されるCISC結合ペアの一方のIL2Rβ細胞質内要素の改変について述べる。行った改変は、ラパマイシンに結合後のヘテロ二量体化に応答して下流のIL2のシグナル伝達イベントを活性化する能力が保持されたIL2Rβドメイン切断である。
本実施例は、CD4+T細胞の内在性FOXP3(フォークヘッドボックスP3)遺伝子座の上流に、DISCおよびプロモーターをコードするコンストラクトをノックインするための遺伝子編集技術の使用について説明する。図11は、この実験で使用した実験プロトコルを概略的に示す。簡潔に述べると、FOXP3のエキソン1の5’側の遺伝子座に特異的なガイドRNA(gRNA)を含むCRISPR/CAS9リボ核タンパク質を、FOXP3遺伝子編集用のアデノ随伴ウイルス6(AAV6)ドナー鋳型と組み合わせて使用した。このgRNAは、配列番号58の配列を有するスペーサーを含んでいた。内在性FOXP3の上流でDISCの発現を誘導するため、異所性MNDプロモーターを導入した。FOXP3の発現は、N末端のヘマグルチニン(HA)エピトープタグおよび核局在化配列とインフレームになるように設計し、キメラタンパク質を産生させた。
本実施例は、DISCコンストラクトを使用して、同じ培養物中の未編集細胞よりもedTreg細胞を選択的に拡大増殖させた実験について述べる。この実験は、ラパマイシンにより濃縮された集団が得られると、T細胞の拡大増殖が増強されることを原理とした。通常、DISC FOXP3 AAVドナー鋳型を使用して初代ヒトCD4+T細胞の編集を行うと、編集に成功した細胞(DISC edTreg)と編集されていない細胞の混合細胞集団が得られる。培養においてFOXP3発現Treg細胞は、通常のT細胞よりもゆっくりと増殖する。したがって、IL-2の存在下では、混合培養中のTreg細胞のパーセンテージは急速に減少する。ラパマイシンの存在下かつIL-2の非存在下で混合細胞集団を培養すると、編集された細胞を濃縮することができる。一方、TCRシグナルが存在しないと、総細胞数の増加は緩慢となる。したがって、拡大増殖中に抗CD3/CD28ビーズを加えることによって、TCRシグナルを発生させると有用であると考えられる。しかし、編集後にビーズを添加すると、培養物中に存在する未編集細胞も活性化してIL-2が分泌される可能性があり、したがって、組換えIL-2を含まない培地中でラパマイシン処理によりDISC edTregを選択できるという利点がなくなる。この状況下では、FOXP3を発現しない細胞は、FOXP3を発現するDISC edTregよりも早く増殖する。したがって、DISC edTregの数および濃縮率(%)を最適化するためにいくつかの試験を行った。以下で詳述するように、この最適化試験は、二相からなる拡大培養プロトコルおよび三相からなる拡大培養プロトコルの2種のプロトコルを使用して行った。
二相からなる拡大培養プロトコルでは、細胞の拡大増殖を二相で行った。第1相拡大培養では、回復培地中でIL-2(50ng/mL)の存在下または非存在下でラパマイシンによる選択を試験し、その後の第2相拡大培養では、抗CD3/CD28ビーズを添加し、培地からIL-2を除去した。通常、50μg/mLのIL-2および抗ヒトCD3/CD28ビーズを添加したT細胞培地中でヒトPBMCを培養し、-4日目にCD4 T細胞を単離する。-1日目に、CD3/CD28ビーズを除去した。第1相拡大培養(0~9日目)において、CRISPR/Cas9 RNPおよびAAV6を使用して遺伝子編集を行った(典型的なコンストラクトは図13Aに示す)。後述する3つの拡大増殖コホートに細胞を分割した。2日目にフローサイトメトリーにより、遺伝子編集を評価した。9日目に、さらに2つの拡大増殖コホートに細胞を分割し、ビーズおよびCD3/CD28抗体による刺激を試験した。第2相拡大培養(16日目)の完了後、フローサイトメトリーにより、編集された細胞の濃縮および拡大増殖を評価した。
三相の拡大培養プロトコルは、編集直後にIL-2を完全に排除するのではなく、IL-2の量を制限することによって濃縮および細胞収率を向上できるか否かを試験することを目的として設計した。前述した二相からなる拡大培養プロトコルとは異なり、編集直後に短い期間のさらなる拡大培養相(第0相拡大培養;0~3日目)が行われる三相からなる拡大培養プロトコルを設計し、様々な量のIL-2(またはラパマイシンもしくはラパログのみ)を含む培地中で細胞を回復させ、DISCを発現させた。第0相拡大培養後に回収した細胞をG-Rexフラスコに移し、ラパマイシンの存在下で拡大増殖させて(第1相拡大培養;3~10日目)DISC edTregを濃縮し、その後、抗CD3/CD28ビーズを添加した(第2相拡大培養;10~15日目)。図13Aに示したものと同じAAVコンストラクトをこの実験で使用した。
次の実験では、たとえばIPEX(免疫制御異常、多内分泌腺症、腸疾患およびX連鎖性を特徴とする症候群)を有する対象の治療に適用できる可能性のある別の編集用rAAV6ドナーコンストラクトを使用して、同様の三相拡大培養プロトコルを試験した。この実験で使用したrAAV6ドナーコンストラクトは、N末端からC末端の方向に、HAタグ-FOXP3 cDNA-μDISCをコードする配列を含んでいた。この挿入コンストラクトは、組み込まれた後、HA-FOXP3 cDNA融合タンパク質とμDISCを発現するように設計されたものである。短い期間のさらなる拡大培養相(第0相拡大培養;0~3日目)を編集の直後に行うようにプロトコルを設計して、細胞を回復させ、DISCを発現させた。第0相拡大培養後に回収した細胞をG-Rexフラスコに移し、10nMラパマイシンの存在下で拡大増殖させて、編集された細胞を選択して(第1相拡大培養;3~10日目)、DISC edTregを濃縮し、その後、2回目の刺激用の抗ヒトCD3/CD28を添加した(第2相拡大培養;10~17日目)。この実験では、細胞収率を改善するため、第2相拡大培養を17日目まで延長した。
次に、前記で検討した最適化された三相拡大培養プロトコルを使用して、臨床用AAVドナー候補を編集および拡大増殖に関して試験した。この試験は、三相拡大培養プロトコルの実施後に、未編集細胞の拡大増殖と比較することによって、DISC edTregの拡大増殖率を測定する目的で設計した。この実験のAAVドナーは、複数の自己免疫に使用できるように設計し、DISCエレメントの全長と内在性FOXP3を上流のMNDプロモーターの制御下に配置した。内在性FOXP3に融合されたHAタグを有するAAVドナー(AAVドナー鋳型#3187;配列番号38)、または内在性FOXP3にHAタグが融合されていないAAVドナー(AAVドナー鋳型#3195;配列番号39)を使用した。これらのAAVドナーを使用して編集すると、上流のMNDプロモーターの制御下でのDISCエレメントの全長の発現と内在性FOXP3の発現が認められた。最初の試験ベクター(AAVドナー鋳型#3187;試験1)は、内在性FOXP3に融合されたHAタグを含むAAVコンストラクトを利用しており、これに続く3つの試験(試験2、試験3および試験4)では、臨床的意義がより高いものとして、HAタグを持たないAAVドナー(AAVドナー鋳型#3195)を使用した。この実験では、短い期間のさらなる拡大培養相(第0相拡大培養;0~3日目;5ng/mLのIL-2の存在下)を編集の直後に行うようにプロトコルを設計して、細胞を回復させ、DISCを発現させた。第0相拡大培養後に回収した細胞をG-Rexフラスコに移し、10nMラパマイシンの存在下で拡大増殖させて、編集された細胞を選択して(第1相拡大培養;3~10日目)、DISC edTregを濃縮し、その後、フローサイトメトリーを実施し、抗CD3/CD28ビーズを添加した(第2相拡大培養;10~17日目;10nMのラパマイシンの存在下)。第2相拡大培養完了後の17日目に、フローサイトメトリーを実施して細胞を計数し、凍結した。
本実施例では、μDISCコンストラクトを発現するedTreg細胞のインビボでの拡大増殖能をラパマイシン処理により試験するために行った実験について述べる。組換えT細胞または拡大培養した天然のTregは、患者の体内で十分に拡大増殖しないことが多いため、前述の概念は重要である。また、たとえば、いくつかの感染症の症例では、Tregの拡大増殖が望ましくない状況もある。したがって、本明細書で提供されるTregの特徴を有した組換え細胞の有用な特徴の1つは、インビボで拡大増殖を制御できることである。免疫不全NOD-scid-IL2RgNULL(NSG)マウスにヒト細胞を移植したヒト化マウスモデルを使用して、インビボにおいてラパマイシンがμDISC edTregの数を増加させることができるか否かを調べるために実験を行った。これらの実験では、μDISCおよび内在性FOXP3の発現がMNDプロモーターによりシス作用性に誘導されるAAVドナーを使用して細胞の編集を行った。このAAVドナー鋳型には、内在性FOXP3のN末端にGFP融合タンパク質が組み込まれていた。GFPで標識されたFOXP3融合タンパク質を使用することにより、インビボの細胞試料中の遺伝子編集細胞の検出を容易とした。この検討で使用した三相拡大培養プロトコルでは、-4日目に、50ng/mLのIL-2の存在下で抗CD3/CD28エキスパンダービーズを添加してCD4+細胞を培養した。-1日目にビーズを除去した。編集直後、5ng/mLのIL-2の存在下で第0相拡大培養(0~3日目)を実施した。さらに、この実験で使用した三相拡大培養プロトコルでは、第0相拡大培養のフローサイトメトリーを実施するタイミングは2日目とした。第0相拡大培養後に回収した細胞をG-Rexフラスコに移し、10nMラパマイシンの存在下で拡大増殖させて、編集された細胞を選択して(第1相拡大培養;3~9日目)、DISC edTregを濃縮し、その後、フローサイトメトリーを実施し、抗CD3/CD28ビーズを添加した(第2相拡大培養;9~16日目;10nMのラパマイシンの存在下)。2日目、9日目、12日目および16日目にフローサイトメトリーを実施して、編集されたGFP+FOXP3+細胞の拡大増殖をモニターした。以下の表9に示すように、16日目までに最終細胞産物において80%を超えるGFP+編集細胞が観察され、編集細胞の拡大増殖は20倍を超えた。
本実施例では、(本発明者らの三相拡大培養プロトコルにおいて概説した細胞製剤の製造工程の一部として)ラパマイシンの存在下でインビトロにおいて拡大増殖させたDISC edTregが、インビボにおいて機能(たとえばエフェクターT細胞の免疫応答の抑制)を発揮できるか否かを試験した。この試験を行うために本発明者らが使用したモデルでは、最小限の放射線照射を行ったNSGマウスにヒトCD4エフェクターT細胞を注入し、このヒトT細胞を介したマウス組織に対する広範な炎症反応を起こした。この炎症反応はマウスのMHC-IIの発現に依存していることから、このモデルは、移植片対宿主病などで起こる同種T細胞応答を模倣していることが示唆された。天然の自家胸腺由来Treg製剤および新規edTreg製剤は、この免疫応答を抑制できることが過去に報告されている。これを踏まえ、本実験で使用するAAVドナー鋳型は、遺伝子編集に成功した細胞の追跡が可能となるHAエピトープをN末端に含むFOXP3融合タンパク質が産生されるように設計した。このAAVドナー鋳型は、MNDプロモーターの誘導により、HAタグ付加FOXP3タンパク質の上流にDISCエレメントを有するカセットを発現した(DISC HA ki edTregと略称する;ki=ノックイン)。相同組換え修復(HDR)が起こると、このカセットはFOXP3遺伝子座に挿入され、MNDプロモーターを介してDISCと内在性FOXP3の両方を発現する。以下のようにして、三相拡大培養プロトコルを使用して、ヒトT細胞の編集および拡大増殖を行った。-4日目に、50ng/mLのIL-2の存在下で抗CD3/CD28エキスパンダービーズを添加してCD4+細胞を培養した。-1日目にビーズを除去した。編集直後、5ng/mLのIL-2の存在下で第0相拡大培養(0~3日目)を実施した。第0相拡大培養後に回収した細胞をG-Rexフラスコに移し、10nMラパマイシンの存在下で拡大増殖させて、編集された細胞を選択して(第1相拡大培養;3~10日目)、DISC edTregを濃縮し、その後、フローサイトメトリーを実施し、抗CD3/CD28ビーズを添加した(第2相拡大培養;9~16日目;10nMのラパマイシンの存在下)。第2相拡大培養の完了後の16日目に、細胞を回収し、凍結した。以下の表12に示すように、14日目にフローサイトメトリーを行ったところ、細胞製剤が拡大増殖し、3日目から14日目までHA+FOXP3+細胞が18.4倍に増加し、最終的な細胞の純度は90%を超えたことが示された。
編集細胞を検出するための抗P2A染色
この実施例では、編集細胞に標識されたエピトープタグや蛍光タンパク質に依存せずに、DISC edTregを追跡でき、かつ混合集団中の編集に成功した細胞の割合を測定できる臨床的に意義のある方法の開発について述べる。GFPやHAなどのタグを使用することによって、培養物またはインビボにおいて編集細胞を高感度かつ定量的に検出することができるが、このようなタグは、タグ自体に対する免疫応答を仲介したり、かつ/またはFOXP3の機能を抑制する可能性があることから、臨床用の細胞製剤において使用すべきではない。
臨床用の細胞製剤では、たとえばフローサイトメトリーなどで測定された目的の遺伝子を発現する細胞の割合(%)と、DNAレベルで測定された相同組換え修復イベントの発生率(%)との間の相関性を検証することは有用である。これが有用となる一例として、FOXP3の発現は、遺伝子編集を行わなくても、TCRを刺激することによりエフェクターT細胞においてアップレギュレートされることがあり、さらに、「オフターゲットな」二本鎖切断に挿入されたAAV鋳型もP2A標識タンパク質を発現する可能性があることが挙げられる。これを踏まえ、本発明者らは、混合細胞集団中で相同組換え修復(HDR)イベントを起こしたFOXP3遺伝子のパーセンテージを定量するための高感度な方法を開発した。この節では、ゲノムDNA試料中のHDRイベントを定量するために開発したデジタルドロップレットPCR(ddPCR)アッセイについて説明する。バイオ・ラッド社製のQX200ドロップレットデジタルPCRシステムとバイオ・ラッド社製のddPCR Supermix for probesを使用して標的遺伝子座内のHDRの成功を検出することが可能なプライマーおよびプローブセットを設計した。使用したPCR配列およびプローブプライマーの配列を以下の表15に示す。アニール温度は63℃とした。
Claims (39)
- FK506結合タンパク質(FKBP)ドメインを含む第1の細胞外結合ドメイン、第1の膜貫通ドメインおよび第1のシグナル伝達ドメインを含む第1の化学誘導シグナル伝達複合体(CISC)構成要素をコードする第1のポリヌクレオチド;
FKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインを含む第2の細胞外結合ドメイン、第2の膜貫通ドメインおよび第2のシグナル伝達ドメインを含む第2のCISC構成要素をコードする第2のポリヌクレオチド;および
配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むネイキッドなFKBP-ラパマイシン結合(FRB)ドメインポリペプチドをコードする第3のポリヌクレオチド
を含むシステムであって、
該第1のCISC構成要素および該第2のCISC構成要素が、ラパマイシン、ラパログ、ラパマイシン代謝物またはIMID系薬物の存在下で二量体化して、シグナル伝達能を有するCISCを形成することを特徴とする、システム。 - 前記第1のポリヌクレオチド、前記第2のポリヌクレオチド、前記第3のポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含むベクターを含む、請求項1に記載のシステム。
- 前記ベクターが、前記第1のポリヌクレオチドおよび前記第3のポリヌクレオチドを含む、請求項2に記載のシステム。
- 前記ベクターが、前記第2のポリヌクレオチドおよび前記第3のポリヌクレオチドを含む、請求項2に記載のシステム。
- 前記ベクターが、ウイルスを使用しないベクターである、請求項2~4のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項2~4のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項6に記載のシステム。
- 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項6に記載のシステム。
- 前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドが、T2098L置換を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ネイキッドなFRBドメインポリペプチドが、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ラパログが、エベロリムス、CCI-779、C20-メタリルラパマイシン、C16-(S)-3-メチルインドールラパマイシン、C16-iRap、AP21967、ミコフェノール酸ナトリウム、塩酸ベニジピン、AP1903もしくはAP23573;または
前記IMID系薬物が、サリドマイド、ポマリドミド、レナリドミドもしくはIMID系薬物類似体である、
請求項1~12のいずれか一項に記載のシステム。 - 前記第1のCISC構成要素が第1のヒンジドメインを含み、前記第2のCISC構成要素が第2のヒンジドメインを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1のシグナル伝達ドメインが、IL-2受容体サブユニットγ(IL2Rγ)細胞質内ドメインを含み、前記第2のシグナル伝達ドメインが、IL-2受容体サブユニットβ(IL2Rβ)細胞質内ドメインを含む、
請求項1~14のいずれか一項に記載のシステム。 - 前記第1のシグナル伝達ドメインが、IL-2受容体サブユニットβ(IL2Rβ)細胞質内ドメインを含み、前記第2のシグナル伝達ドメインが、IL-2受容体サブユニットγ(IL2Rγ)細胞質内ドメインを含む、
請求項1~14のいずれか一項に記載のシステム。 - 前記第1の細胞外結合ドメインの前記FKBPドメインが、配列番号6に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2の細胞外結合ドメインの前記FRBドメインが、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~17のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1の膜貫通ドメインが、IL2Rγ膜貫通ドメインを含み、前記第2の膜貫通ドメインが、IL2Rβ膜貫通ドメインを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1のCISC構成要素が、FKBPドメイン、第1の膜貫通ドメインおよびIL2Rγドメインを含み、ならびに
前記第2のCISC構成要素が、FRBドメイン、第2の膜貫通ドメインおよびIL2Rβドメインを含む、
請求項1~15および19のいずれか一項に記載のシステム。 - 前記第1のCISC構成要素が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号23に示される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~15および19~20のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のCISC構成要素が、配列番号13、配列番号14、配列番号15または配列番号24に示される配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~15および19~21のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1のCISC構成要素が、配列番号12に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のCISC構成要素が、配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~15および19~22のいずれか一項に記載のシステム。
- 請求項1に記載の第1のポリヌクレオチド、第2のポリヌクレオチドおよび第3のポリヌクレオチドを含む、細胞。
- Tリンパ球または前駆T細胞である、請求項24に記載の細胞。
- 制御性T細胞である、請求項24または25に記載の細胞。
- FOXP3+制御性T細胞である、請求項24~26のいずれか一項に記載の細胞。
- CD4+T細胞またはCD8+T細胞である、請求項24~27のいずれか一項に記載の細胞。
- 疾患または障害の治療または緩和に使用するための、請求項24~28のいずれか一項に記載の細胞。
- 障害が、炎症性疾患、自己免疫疾患、FOXP3関連疾患またはFOXP3関連状態、および/または臓器移植に起因する障害である、請求項29に記載の細胞。
- インビトロまたはエクスビボにおいて遺伝子組換え細胞を作製するための方法であって、請求項1に記載の第1のポリヌクレオチド、第2のポリヌクレオチドおよび第3のポリヌクレオチドを細胞に導入する工程を含む、方法。
- 前記細胞が、Tリンパ球または前駆T細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞が、CD4+T細胞またはCD8+T細胞である、請求項31または32に記載の方法。
- 前記遺伝子組換え細胞が、制御性T細胞である、請求項31~33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子組換え細胞が、FOXP3+制御性T細胞である、請求項31~34のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ゲノム遺伝子座内の標的配列に相補的なスペーサーを含むガイドRNA(gRNA)、または該gRNAをコードする核酸
を細胞に導入する工程をさらに含み、
ここで前記第1のポリヌクレオチド、第2のポリヌクレオチドおよび第3のポリヌクレオチドからなる群から選択される1つ以上がドナーカセットを含むドナー鋳型に含まれる、請求項31~35のいずれか一項に記載の方法。 - 前記gRNAが、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44および配列番号45のいずれかに示される核酸配列を含む、請求項36に記載の方法。
- DNAエンドヌクレアーゼまたはDNAエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に導入する工程をさらに含み、
該DNAエンドヌクレアーゼと前記gRNAの会合により形成された複合体によって、前記細胞の前記標的ゲノム遺伝子座への前記ドナーカセットの標的化された組み込みが促されるように、前記DNAエンドヌクレアーゼ、前記gRNAおよび前記ドナー鋳型が構成されている、請求項36または37に記載の方法。 - ラパマイシンに前記遺伝子組換え細胞を接触させる工程をさらに含む、請求項31~38のいずれか一項に記載の方法。
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