CN106794260A - 治疗血红蛋白病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文的实施方式提供了用于RNA聚合酶II表达的专门设计的合成的BCL11A靶向microRNA；以及通过增加胎儿血红蛋白水平的表达水平而用于治疗血红蛋白病(例如镰状细胞疾病或地中海贫血)的方法。在具体的说明性实施方式中，本发明部分提供了用于在造血细胞和造血前体细胞(包括红细胞、红系祖细胞和胚胎干细胞)中实现基因治疗的改进的组合物和方法。本发明进一步提供了用于治疗与造血相关的紊乱的改进的基因治疗方法。

Description

治疗血红蛋白病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请是根据35U.S.C.§119(e)要求下述专利申请的优先权的国际申请：2014年4月25日提交的美国临时申请号61/984,247以及2014年10月21日提交的美国临时申请号62/066,783；以引用的方式将各申请的内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的基金号5U01HL117720-03的政府支持下作出的。美国政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本文公开的实施方式涉及用于治疗血红蛋白病的组合物和方法。更具体地，所述实施方式涉及通过选择性敲减内源BCL11A来增加细胞中的胎儿血红蛋白的组合物和方法。
背景技术
血红蛋白病，包括镰状细胞疾病/贫血(SCD)和地中海贫血(THAL)，是人类最常见的遗传性单基因紊乱。大约5％的世界人口携带珠蛋白基因突变。世界卫生组织估计，每年约有30万婴儿出生时患有重型血红蛋白紊乱。由于杂合的镰状β-珠蛋白(βS)突变赋予的对于疟疾传播的生存优势，SCD已分隔至来自撒哈拉以南非洲、印度、沙特阿拉伯和地中海国家的人群，其中所有儿童中高达2％出生时具有该病症(WHO关于镰状细胞性贫血的报道-A59.9，第五十九届世界卫生大会-临时议程项目114：联合国；2006:1-5)。由于历史性和/或近来的迁徙，现可在发达国家中发现越来越多的患者群，SCD的公共健康影响很显著(Kauf等，American Journal of Hematology.2009；84:323-327；Amendah等，American Journalof Preventive Medicine.2010；38:S550-556)。在美国，1994年估计的患有血红蛋白病的患者的中位生存期为男性42岁、女性48岁(Platt等，New England Journal ofMedicine.1994；330:1639-1644)。在分子水平上，SCD是与分子改变相关的第一种疾病(Pauling等，Science.1949；110:543-548)。单核苷酸突变导致谷氨酸在β-珠蛋白6位发生缬氨酸置换。这种修饰导致分子在脱氧条件下的聚合以及随后的红细胞“镰状化(sickling)”，最终通过溶血以及急性和慢性血管闭塞性缺血并发症造成贫血，影响多个器官(包括肾、脑、肺以及其它)。尽管预防措施(包括化学预防试剂羟基脲)已经使得所选患者组的负担适度降低，但目前唯一可用的SCD治愈性疗法是异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)(Hsieh等，New EnglandJournal of Medicine.2009；361:2309-2317；Hsieh等，Blood；Electronic pre-publication，2011年6月31日)。不幸地，HSCT与具有显著死亡率和发病率的SCD和THAL有关，这尤其是部分由于与HSCT前的输血相关的铁过载、移植物抗宿主病以及宿主的移植前调节所需的高剂量化疗/放疗等。
正在开发新的分子疗法。例如，美国专利号8,383,604描述了BCL11A在发育期间是珠蛋白基因的关键调节剂。具体而言，BCL11A在胎儿发育期间促进从胎儿血红蛋白基因表达到成体血红蛋白基因表达的过渡性转换(transitional switch)。抑制BCL11A降低了这种过渡性转换，并在胎儿发育后使胎儿血红蛋白基因保持显著更高的表达。所表达的更高量的胎儿血红蛋白基因改善了与各种血红蛋白病相关的症状。
发明内容
在具体的说明性实施方式中，本发明部分提供了用于在造血细胞和造血前体细胞(包括红细胞、红系祖细胞和胚胎干细胞)中实现基因治疗的改进的组合物和方法。本发明进一步提供了用于治疗与造血相关的紊乱的改进的基因治疗方法。
目标是在源自于转导的、可移入的(engraftable)造血干细胞的细胞中有效地敲减BCL11A。γ-珠蛋白的诱导成功和由此而来的HbF的同步增加以及突变体HbS的同步减少取决于BCL11A转录物和蛋白的定量减少。发明人已在mir223环中嵌入了BCL11A shRNA。这种方法使得能够经由聚合酶II(PolII)启动子(而非聚合酶III启动子)来转录BCL11AshRNA。这使得能够开发microRNA-生物发生途径，以在可移入的HSC中产生靶向BCL11A表达的siRNA。对慢病毒转基因进行工程化，以表达模拟初级microRNA(pri-miRNA)的shRNA，该shRNA经由内源微处理器和Dicer复合物被连续加工，产生与BCL11A信使RNA(mRNA)具有序列互补性的小干扰RNA(siRNA)。
在一个方面，提供了在源自于转导的、可移入的造血干细胞的细胞中有效地敲减BCL11A的组合物和方法。在一个实施方式中，BCL11A转录物和蛋白的定量减少诱导γ-珠蛋白产生以及由此而来的HbF的同步增加和突变体HbS的同步减少。在具体的实施方式中，在mir223环中嵌入BCL11A shRNA。在具体的实施方式中，对慢病毒进行工程化，以表达模拟pri-miRNA的shRNA，该shRNA经由内源微处理器和Dicer复合物被连续加工，产生与BCL11AmRNA具有序列互补性的siRNA。
因此，在各种说明性实施方式中，本说明书部分提供了合成的BCL11A microRNA，所述BCL11A microRNA包含在5’至3’方向以串联方式(in tandem)排列的第一BCL11A片段、环片段和第二BCL11A片段，其中，环片段处于第一BCL11A片段和第二BCL11A片段之间并直接连接至第一BCL11A片段和第二BCL11A片段；以及其中，第二BCL11A片段与第一BCL11A片段互补，从而使得第一BCL11A片段和第二BCL11A片段碱基配对以形成发夹环，环片段形成由此形成的发夹环的环部分。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段和第二BCL11A片段为约18个至25个核苷酸长。第一BCL11A片段源自于BCL11A序列并在shRNA加工成双链siRNA期间产生随从链，并且第二BCL11A片段与第一BCL11A片段互补，其中，第二BCL11A片段产生引导链，所述引导链并入RNA干扰特异性复合物(RISC)中，用于RNA干扰或BCL11A基因沉默。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段和第二BCL11A片段包含源自于BCL11A mRNA序列的序列。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端以-GCGC-起始；第二BCL11A片段在3’端以-GCGC-结束。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端进一步由-GCGC-组成；第二BCL11A片段在3’端以-GCGC-结束。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端以-GCGA-、-TCTG-或-TG-起始；第二BCL11A片段与第一BCL11A片段互补。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端进一步由-GCGA-、-TCTG-或-TG-组成。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第二BCL11A片段在3’端以-TTTT-结束。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，合成的BCL11A microRNA包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，合成的BCL11A microRNA包含本公开中描述的核苷酸序列或其片段。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，合成的BCL11A microRNA由选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列组成。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，合成的BCL11A microRNA基本上由选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列组成。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段选自于由以下所组成的组：CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:46；源自于本文所述的BCL11A miR1寡核苷酸)、CCAGAGGATGACGATTGTTTA(SEQ.ID.NO:47；源自于本文所述的BCL11A miR2寡核苷酸)、TCGGAGACTCCAGACAATCGC(SEQ.ID.NO:48；源自于本文所述的BCL11A E3寡核苷酸或shRNA1或E3)、CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC(SEQ.ID.NO:49；源自于本文所述的shRNA2或B5)、TCAGGACTAGGTGCAGAATGT(SEQ.ID.NO:50；源自于本文所述的shRNA4或B11)、TTCTCTTGCAACACGCACAGA(SEQ.ID.NO:51；源自于本文所述的BCL11A D8寡核苷酸或shRNA3或D8)、GATCGAGTGTTGAATAATGAT(SEQ.ID.NO:52；源自于本文所述的shRNA5或50D12或D12)、CAGTACCCTGGAGAAACACAT(SEQ.ID.NO:53；源自于本文所述的shRNA5或50A5)、CACTGTCCACAGGAGAAGCCA(SEQ.ID.NO:54；源自于本文所述的shRNA7或50B11)、ACAGTACCCTGGAGAAACACA(SEQ.ID.NO:55；源自于本文所述的BCL11A XLC4、shRNA8和50C4)、CAACAAGATGAAGAGCACCAA(SEQ.ID.NO:56；源自于本文所述的BCL11A非靶向寡核苷酸)、gcgcCGCACAGAACACTCATG(SEQ.ID.NO:57；源自于本文所述的miR1G5寡核苷酸)、GCGCTCGGAGACTCCAGACAA(SEQ.ID.NO:58；源自于本文所述的E3G5或E3 mod寡核苷酸或shRNA1mod)、gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAA(SEQ.ID.NO:59；源自于本文所述的B5G5或shRNA2mod)、gcgcTCAGGACTAGGTGCAGA(SEQ.ID.NO:60；源自于本文所述的B11G5或shRNA4mod)、gcgcGATCGAGTGTTGAATAA(SEQ.ID.NO:61；源自于本文所述的50D12G5、D12G4或shRNA5mod)、gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC(SEQ.ID.NO:62；源自于本文所述的50A5G5或shRNA6mod)、gcgcCACTGTCCACAGGAGAA(SEQ.ID.NO:63；源自于本文所述的50B11G5或shRNA7mod)、GCGCTTCTCTTGCAACACGCA(SEQ.ID.NO:64；源自于本文所述的BCL11A D8G5或D8mod或shRNA3mod)、GCGCACAGTACCCTGGAGAAA(SEQ.ID.NO:65；源自于本文所述的BCL11AC4G5或C4 mod或shRNA8mod)、CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:66；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)以及ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:67；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，环片段源自于microRNA。在一个实施方式中，microRNA是造血特异性microRNA。例如，miR-142、miR-155、miR-181和miR-223。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，microRNA是miR223。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，环片段是ctccatgtggtagag(SEQ ID NO:68)。
因此，在一个方面，本说明书提供了分离的核酸分子或本文所述的合成的BCL11AmicroRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
因此，在一个方面，本说明书提供了包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA的组合物，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
因此，在一个方面，本说明书提供了包含至少一种载体的组合物，所述载体包含核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:38的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:39的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列。
在本文所述的任何分离的核酸分子的一个实施方式中，所述分子包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
在一个方面，本说明书提供了包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11AmicroRNA的载体，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在本文所述的任何载体的一个实施方式中，载体进一步包含脾病灶形成病毒启动子、四环素诱导型启动子或β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子。所述启动子为其中的核酸分子或其中的合成的BCL11A microRNA提供靶向表达。
在一个方面，本说明书提供了包含载体的宿主细胞，所述载体包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在本文所述的任何宿主细胞的一个实施方式中，宿主细胞是胚胎干细胞、体干细胞(somatic stem cell)、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。在一个实施方式中，宿主细胞分离自受试者。在一个实施方式中，宿主细胞分离自已诊断患有血红蛋白病的受试者。可通过本领域已知的任何方法进行诊断。例如，通过基因测试、通过RT-PCR以及通过血液细胞学。
在本文所述的任何宿主细胞的一个实施方式中，宿主细胞是红细胞。
在一个方面，本说明书提供了包含载体或细菌的宿主细胞，所述载体或细菌包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在一个方面，本说明书提供了包含病毒的宿主细胞，所述病毒包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在本文所述的任何病毒或载体的一个实施方式中，病毒是慢病毒。
在本文所述的任何载体或病毒的一个实施方式中，慢病毒选自于由以下病毒所组成的组：人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
因此，本说明书的一个方面提供了用于增加细胞表达的胎儿血红蛋白水平的方法，所述方法包括以下步骤：使胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞与有效量的本文所述的组合物或有效量的本文所述的至少一种分离的核酸分子接触，由此，相对于该接触之前的细胞，所述细胞或其后代中的胎儿血红蛋白表达增加。在一些实施方式中，所述组合物包含至少一种载体或细胞，所述载体或细胞包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述方法进一步包括提供用于接触的干细胞或祖细胞的试样。在一个实施方式中，细胞的试样包括CD34+选择的细胞。在一个实施方式中，所述组合物包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列的混合物。例如，所述组合物具有选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的2种-5种不同的核苷酸序列。例如，所述组合物包含SEQ ID NO:34、37、39、41和43。
在一个方面，本说明书提供了治疗受试者中的血红蛋白病(例如SCD和THAL)或降低其发展风险的方法。所述方法可包括在受试者或个体的造血干细胞中选择性敲减BCL11A基因。这些受试者处于发展为血红蛋白病的风险中。
在所述任何方法的一个实施方式中，在造血干细胞中选择性敲减BCL11A基因包括：使用分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列；或使用包含核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA的载体(例如病毒载体)，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的任一种。
在所述任何方法的一个实施方式中，在造血干细胞中选择性敲减BCL11A基因包括：使造血干细胞与包含至少一种分离的核酸分子的组合物接触，所述核酸分子包含SEQID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列；或者与包含至少一种载体(例如病毒载体)的组合物接触，所述载体包含核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的任一种。在一个实施方式中，在接触前分离造血干细胞。
在所述任何方法的一个实施方式中，在造血干细胞中选择性敲减BCL11A基因在体内(in vivo)、体外(in vitro)或离体(ex vivo)发生。在进一步的实施方式中，作为选择性敲减靶标的造血祖细胞是红系细胞谱系。
在所述任何方法的一个实施方式中，造血干细胞与本文所述的任何组合物的接触在体内、体外或离体发生。在进一步的实施方式中，所接触的造血祖细胞是红系细胞谱系。
在所述任何方法的一个实施方式中，造血干细胞与本文所述的任何组合物的接触在体内、体外或离体发生。
在所述任何方法的其它实施方式中，除造血干细胞或造血祖细胞之外，还在胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞中发生BCL11A基因的选择性敲减。在一个实施方式中，使胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞或骨髓细胞与所述组合物接触。在接触之前分离胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞或骨髓细胞。在一个实施方式中，胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞或骨髓细胞与本文所述的任何组合物的接触在体内、体外或离体发生。
在所述任何方法的其它实施方式中，造血干细胞收集自外周血、脐带血、绒膜绒毛、羊水、胎盘血或骨髓。
在所述任何方法的其它实施方式中，胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞或骨髓细胞收集自外周血、脐带血、绒膜绒毛、羊水、胎盘血或骨髓。
在一个方面，本说明书提供了治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：向受试者给予治疗有效量的一种或多种本文所述的分离的核酸分子、本文所述的病毒或载体、或本文所述的细胞，从而治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险，其中，所述病毒、载体或细胞包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11AmicroRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。例如，将有效量的一种或多种本文所述的分离的核酸分子、本文所述的病毒或载体、或本文所述的细胞直接注入受试者的骨髓。
在一个方面，本说明书提供了治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：使造血干细胞群与本文所述的组合物或与至少一种或多种本文所述的分离的核酸分子、本文所述的病毒或载体体外或离体接触；以及将接触的造血干细胞或其后代细胞植入(implanting)或给予受试者。在一个实施方式中，将接触的造血干细胞或后代细胞移入(engraft)受试者。在一个实施方式中，将接触的造血干细胞或其后代细胞与前列腺素E2和/或抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)一起植入，以促进接触的细胞的移入(engraftment)。
在一个方面，本说明书提供了治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：在受试者的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述表达是离体的或体外的；以及将所述细胞植入或给予受试者。
在一个方面，本说明书提供了增加细胞表达的胎儿血红蛋白水平的方法，所述方法包括：在受试者的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述表达是离体的或体外的或体内的。在一个实施方式中，所述表达是通过使细胞与有效量的本文所述的组合物或有效量的本文所述的至少一种分离的核酸分子接触。
在一个方面，本说明书提供了用于降低细胞表达的BCL11A水平的方法，所述方法包括：在受试者的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述表达是离体的或体外的或体内的。在一个实施方式中，所述表达包括以下步骤：使胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞与有效量的本文所述的组合物或有效量的本文所述的至少一种分离的核酸分子接触，由此，相对于该接触之前的细胞，所述细胞或其后代中的胎儿血红蛋白表达增加。在一些实施方式中，所述组合物包含至少一种载体或细胞，所述载体或细胞包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在本文所述的任何方法的进一步的实施方式中，所接触的造血干细胞或造血祖细胞是红系细胞谱系。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，造血干细胞或造血祖细胞收集自外周血、脐带血、绒膜绒毛、羊水、胎盘血或骨髓。
在本文所述的任何方法的进一步的实施方式中，在植入接触或转染的细胞之前，用化疗和/或放疗对受体受试者进行治疗。
在一个实施方式中，化疗和/或放疗用于减少内源干细胞，以促进植入细胞的移入。
在一个方面，本说明书提供了治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：提供来自受试者的造血干细胞；使造血干细胞与本文所述的组合物或与至少一种或多种本文所述的分离的核酸分子、本文所述的病毒或载体体外或离体接触；以及将接触的造血干细胞植入或重新给予回相同的受试者。在一个实施方式中，将接触的造血干细胞或后代细胞移入受试者。
在任何方法的一个方面，用前列腺素E2和/或抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)对接触的造血干细胞、胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞或它们的后代细胞进行离体处理，以促进随后移入受体受试者。
在任何方法的一个方面，造血干细胞群或宿主细胞群获得自处于发展为血红蛋白病风险中或已诊断患有血红蛋白病的受试者。
在任何方法的一个方面，造血干细胞群对于受试者而言是自体的(autologous)或同种异体(allogeneic)的。
在任何方法的一个方面，在与本文所述的组合物或与至少一种或多种本文所述的分离的核酸分子、本文所述的病毒或载体接触之前，在培养中对造血干细胞群或宿主细胞群进行离体扩增。
在任何方法的一个方面，在与本文所述的组合物或与至少一种或多种本文所述的分离的核酸分子、本文所述的病毒或载体接触之后，在培养中对造血干细胞群或宿主细胞群进行离体扩增。
在任何方法的一个方面，在植入受试者之前，在培养中对接触的造血干细胞群或宿主细胞群进行离体预分化(pre-differentiated)。
在任何方法的一个方面，在给予受试者之前，对接触的造血干细胞进行体外或离体扩增。在任何方法的一个方面，在给予受试者之前，对接触的造血干细胞进行冷冻保存(cryopreserved)。在任何方法的另一方面，在给予受试者之前，对接触的造血干细胞进行体外或离体扩增并冷冻保存。在任何方法的另一方面，在给予受试者之前，在冷冻保存后对接触的造血干细胞进行体外或离体扩增。
在任何方法的一个方面，受试者是人。在任何方法的一个方面，受试者诊断患有血红蛋白病。
在任何方法的一个方面，所述方法进一步包括对诊断患有血红蛋白病的受试者或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行选择。
在任何方法的一个方面，血红蛋白病是镰状细胞疾病(SCD)或地中海贫血(THAL)。例如，β-地中海贫血。
在所述方法的一个方面，所述方法进一步包括向受试者给予包含氧、羟基脲、叶酸或血液输注的治疗。
在一个方面，本说明书提供了治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括在受试者中体内表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA。
在任何方法的一个方面，体内表达发生在胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中。
在任何方法的一个方面，胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞对于受试者而言是自体的或同种异体的。
在任何方法的一个方面，在给予受试者之前，对表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞进行体外或离体扩增。在进一步的实施方式中，祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞和造血祖细胞是红系细胞谱系。
在任何方法的一个方面，在给予受试者之前，对表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞进行冷冻保存。
在任何方法的另一方面，在给予受试者之前，对表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞进行体外或离体扩增并冷冻保存。
在任何方法的另一方面，在给予受试者之前，在冷冻保存后对表达至少一种本文所述的合成的BCL11A microRNA的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞进行体外或离体扩增。
在任何方法的一个方面，将至少一种合成的BCL11A microRNA可操作地连接至启动子并构建在载体中以用于真核细胞中的表达。
在任何方法的一个方面，至少一种合成的BCL11A microRNA从RNA II聚合酶表达。
在任何方法的一个方面，至少一种合成的BCL11A microRNA不从RNA III聚合酶表达。
在任何方法的一个方面，启动子选自于由以下启动子所组成的组：脾病灶形成病毒启动子、四环素诱导型启动子或β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子、或造血特异性启动子。
在任何方法的一个方面，载体是病毒。
在任何方法的一个方面，病毒是慢病毒。
在任何方法的一个方面，慢病毒选自于由以下病毒所组成的组：人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在任何方法的一个方面，受试者是动物、人或非人动物以及啮齿动物或非啮齿动物。例如，受试者可以是任何哺乳动物，例如人、其它灵长类动物、猪、啮齿动物(如小鼠或大鼠、兔、豚鼠、仓鼠)、牛、马、猫、狗、绵羊或山羊，或者可以是非哺乳动物(如鸟)。
在任何方法的一个方面，所述方法包括从受试者获得胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞的群或试样。
在一个实施方式中，将胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞、造血祖细胞从宿主受试者分离、转染、培养(任选)、并移植回相同宿主，即自体细胞移植。在另一实施方式中，胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞分离自供体，所述供体与诊断患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的宿主(受体)的HLA-类型匹配。供体-受体抗原类型匹配是本领域公知的。HLA类型包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-D。这些代表了移植所需的细胞表面抗原匹配的最小数量。也就是说，将转染的细胞移植到不同宿主中，即对于受体宿主受试者而言是同种异体的。可用包含本文所述的核酸分子的核酸或载体对供体或受试者的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞进行转染，将转染的细胞培养扩增，然后移植到宿主受试者中。在一个实施方式中，将移植的细胞移入宿主受试者。也可在转染后将转染的细胞冷冻保存并储存，或在细胞扩增后冷冻保存并储存。
本文所使用的治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险意为改善血红蛋白病的至少一种症状。在一个方面，本发明的特征在于治疗受试者中的血红蛋白病(例如降低其严重程度或进展)的方法。在另一方面，所述方法还可用于降低受试者发展为血红蛋白病的风险、延迟受试者中血红蛋白病症状的发作或增加患有血红蛋白病的受试者的寿命。在一个方面，所述方法可包括基于受试者患有血红蛋白病、或处于发展为血红蛋白病的风险中但还未患血红蛋白病来选择受试者，或包括选择具有潜在的(underlying)血红蛋白病的受试者。受试者的选择可包括检测血红蛋白病的症状、血液测试、基因测试或临床记录。如果测试结果表明受试者患有血红蛋白病，所述方法还包括给予本文所述的组合物，从而治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险。例如，通过电泳而诊断为是具有基因型HbSS的SCD、HbS/β0地中海贫血、HbSD或HbSO和/或HbF<10％的受试者。
本文所使用的术语“血红蛋白病”是指涉及血液中存在异常血红蛋白分子的状况。血红蛋白病的实例包括但不限于SCD和THAL。还包括血液中存在异常血红蛋白的组合的血红蛋白病(例如，镰状细胞/Hb-C疾病)。这种疾病的示例性实例包括但不限于SCD和THAL。SCD和THAL及它们的症状在本领域中是公知的，并且在下文对其进行进一步详细描述。可通过识别、了解、告知、确定、推断、认为或决定受试者患有血红蛋白病的医疗保健提供者、医疗护理人员、医生、护士、家庭成员或熟人来将受试者诊断为患有血红蛋白病。
本文所定义的术语“SCD”包括由红细胞镰状化所引起的任何症状性的贫血状况。SCD的表现包括：贫血；疼痛；和/或器官功能障碍，例如肾衰竭、视网膜病、急性胸部综合征、局部缺血、阴茎异常勃起(priapism)和中风。本文所使用的术语“SCD”是指伴随SCD的各种临床问题，尤其是HbS中的镰状细胞置换为纯合子的那些受试者中的问题。本文通过使用术语SCD提及的原发性表现(constitutional manifestations)为：生长和发育延缓、发展为严重感染的趋势增加(具体地由于肺炎球菌)、脾功能显著损伤、循环细菌的有效清除受到阻止，并伴有复发性梗死以及脾组织的最终毁坏。术语“SCD”还包括肌肉骨骼疼痛的急性发作，其主要影响腰椎、腹部和股骨干，并且机制和严重程度类似。在成体中，这种发作通常表现为每隔几周或几个月的短期轻度或中度发作，并穿插有平均约每年一次的持续5至7天的极度痛苦的发作。已知引发此类危机的事件包括酸中毒、缺氧和脱水，所有这些事件均加强了HbS的细胞内聚合(J.H.Jandl，Blood:Textbook of Hematology，第二版，Little，Brownand Company，Boston，1996，第544-545页)。
本文所使用的“THAL”是指以血红蛋白的缺陷型生产为特征的遗传性紊乱。在一个实施方式中，该术语涵盖了由于影响血红蛋白合成的突变而发生的遗传性贫血。在其它实施方式中，该术语包括由地中海贫血病症所引起的任何症状性贫血，例如重度(severe)或β-地中海贫血、重型地中海贫血(thalassemia major)、中间型地中海贫血、α-地中海贫血(如血红蛋白H疾病)。β-地中海贫血由β-珠蛋白链中的突变引起，并能够以重度形式或轻度形式发生。在重度形式的β-地中海贫血中，儿童在出生时正常，但在生命的第一年发展为贫血。轻度形式的β-地中海贫血产生小的红细胞。α-地中海贫血是由来自珠蛋白链的基因的删除所引起的。
短语“发展为疾病的风险”意为相比对照受试者或群(例如健康受试者或群)，受试者将来发展为血红蛋白病的相对概率。例如，携带与SCD相关的基因突变(β-珠蛋白基因的A至T突变)的个体，以及对于该突变而言个体是杂合或纯合的是否增加该个体的风险。
术语“抑制性RNA”意为包括含有与靶核酸(例如靶microRNA)互补的序列的核酸分子，其介导靶核酸水平或活性的降低。抑制性RNA的非限制性实例包括干扰RNA、shRNA、siRNA、核酶、antagomir和反义寡核苷酸。本文描述了制备抑制性RNA的方法。制备抑制性RNA的额外方法是本领域已知的。在一个实施方式中，本文所述的BCL11A microRNA是引起BCL11A mRNA活性降低的抑制性RNA。
本文所使用的“干扰RNA”是指能够通过介导RNA干扰直接或间接(即在转化后)抑制或下调基因表达的任何双链或单链RNA序列。干扰RNA包括但不限于小干扰RNA(“siRNA”)和小发夹RNA(“shRNA”)。“RNA干扰”是指序列相容性信使RNA转录物的选择性降解。
本文所使用的“shRNA”(小发夹RNA)是指包含反义区域、环部分和正义区域的RNA分子，其中，正义区域具有与反义区域碱基配对以形成双链茎的互补核苷酸。在转录后加工之后，通过酶Dicer(RNase III家族的成员)介导的切割事件，将小发夹RNA转化为小干扰RNA。本文所使用的短语“转录后加工”是指转录后发生的mRNA加工，且该加工由例如酶Dicer和/或Drosha介导。
本文所使用的“小干扰RNA”或“siRNA”是指能够通过介导RNA干扰以序列特异性方式来抑制或下调基因表达的任何小RNA分子。小RNA可为例如约18至21个核苷酸长。每个siRNA双链由引导链和随从链形成。核酸内切酶Argonaute 2(Ago 2)催化siRNA双链解旋。一旦解旋，引导链并入RNA干扰特异性复合物(RISC)，而随从链被释放。RISC使用引导链来发现具有互补序列的mRNA，导致靶mRNA的内切核苷酸切割。
逆转录病毒是在其复制周期期间采用逆转录酶的RNA病毒。术语“逆转录病毒”是指任何已知的逆转录病毒(例如c型逆转录病毒，如Moloney鼠肉瘤病毒(MoMSV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳房肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、Friend、鼠干细胞病毒(MSCV)和Rous肉瘤病毒(RSV))。本发明的“逆转录病毒”还包括人T细胞白血病病毒、HTLV-1和HTLV-2、以及慢病毒家族的逆转录病毒，例如人免疫缺陷病毒、HIV-1、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SW)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)和其它类型的逆转录病毒。
通过逆转录酶将逆转录病毒基因组RNA转化为双链DNA。病毒的这种双链DNA形式能够整合到受感染的细胞的染色体中；一旦整合，其被称为“原病毒(provirus)”。原病毒作为RNA聚合酶II的模板，并指导编码产生新病毒颗粒所需的结构蛋白和酶的RNA分子的表达。
原病毒的各端是称为“长末端重复”或“LTR”的结构。术语“长末端重复(LTR)”是指位于逆转录病毒DNA末端的碱基对的结构域，在其天然序列的情况中，该结构域直接重复并包含U3区域、R区域和U5区域。LTR通常为逆转录病毒基因的表达(例如基因转录物的促进、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制提供基本功能。LTR包含病毒基因组复制和整合所需的许多调节信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号和序列。病毒LTR分为被称作U3、R和U5的三个区域。U3区域包含增强子和启动子元件。U5区域是引物结合位点和R区域之间的序列，并包含聚腺苷酸化序列。R(重复)区域以U3区域和U5区域作为侧翼。在病毒基因组的5’端和3’端处均出现由U3、R和U5区域所组成的LTR。在本发明的一个实施方式中，LTR内的启动子(包含5’LTR)被异源启动子替换。可使用的异源启动子的实例包括例如脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、四环素诱导型(TET)启动子、β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子(LCR)以及巨细胞病毒(CMV)启动子。
术语“慢病毒”是指引起缓慢发展的疾病的逆转录病毒组(或属)。该组中包括的病毒包括HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)、人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体(etiologic agent)；visna-maedi(在绵羊中引起脑炎(visna)或肺炎(maedi))、山羊关节炎-脑炎病毒(在山羊中引起免疫缺陷、关节炎和脑病)；马传染性贫血病毒(在马中引起自身免疫性溶血性贫血和脑病)；猫免疫缺陷病毒(FIV)(在猫中引起免疫缺陷)；牛免疫缺陷病毒(BIV)(在牛中引起淋巴结病、淋巴细胞增多症和可能的中枢神经系统感染)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)(在非人灵长类动物中引起免疫缺陷和脑病)。这些病毒引起的疾病的特征在于长潜伏期和迁延期。通常，病毒潜伏地感染单核细胞和巨噬细胞，并从单核细胞和巨噬细胞扩散到其它细胞。HIV、FIV和SIV也易于感染T淋巴细胞，即T细胞。
术语“R区域”是指逆转录病毒LTR内的区域，该区域在封端基团起始(即转录起始)处开始并在poly A束(poly A tract)起始之前立即结束。还将R区域定义为以U3区域和U5区域作为侧翼。在逆转录期间，R区域在允许新生DNA从基因组的一端转移到另一端中起到重要作用。
术语“启动子/增强子”是指包含能够同时提供启动子和增强子功能的序列的DNA片段。例如，逆转录病毒的长末端重复同时包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可为“内源”、“外源”或“异源”。“内源”增强子/启动子是与基因组中的给定基因天然连接的增强子/启动子。“外源”或“异源”增强子/启动子是通过基因操控(即分子生物学技术)的方式被置于与基因并列位置中(in juxtaposition to)的增强子/启动子，从而使得该基因的转录由所连接的增强子/启动子指导。
除非另有定义，本文所使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的，并不旨在进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以引用的方式整体并入本文。倘若有冲突，本说明书(包括定义)将会起主导作用。从以下的详细描述和附图以及权利要求书中，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1是公开的合成的BCL11A microRNA的两个实施方式的图：BCL11A miR1和BCL11A miR2寡核苷酸。茎/环结构由寡核苷酸中的BCL11A靶向序列(粗体大写字母核苷酸碱基)的互补序列产生。BCL11A靶向序列是BCL11A片段。然后将茎/环结构克隆到miR-223/miR-30背景(microRNA背景)中。然后将整个miRNA/shRNA结构克隆到含有SIN慢病毒载体(含有转基因报告子(Venus))的SFFV/LCR/TET盒中。
图2是具有SFFV、TET和LCR启动子的慢病毒载体原病毒的示意图。
图3是显示SFFV-LV有效敲减BCL11A并诱导εγ-珠蛋白表达的两组条形图。
图4是描绘LCR/TET-LV有效敲减BCL11A并诱导εγ-珠蛋白表达的两组条形图。
图5是显示转导的CD34+HSC离体分化成红细胞并表达HbF的一组显微照片和图。
图6是描绘移植到NSG小鼠中的来自SCD患者的转导LCR-LV的CD34+HSC的一组散点图。
图7是显示研究BCL11A在淋巴发育中的潜在毒性的一组显微照片和图。
图8A-图8E显示在pol III和pol II表达系统中对靶向BCL11A的shRNA进行的筛选和评价。
图8A.分别为RNA聚合酶III(pol III，U6启动子，左侧)和RNA聚合酶II(pol II，SFFV启动子，右侧)驱动的shRNA盒和嵌入miRNA(223)的shRNA盒的示意图。将两种表达盒工程化到慢病毒载体中。如所标示的，各个框代表随从链、引导链和环结构。用虚线框代表miRNA223支架。在这两个骨架中表达靶向BCL11A的不同shRNA序列，并评价其敲减效率。
图8B.使用基于pol III的慢病毒载体，针对敲减效率对靶向BCL11A mRNA中多个区域(如所标示的，XL/L-共享异形体(isoform)序列、XL-独特编码序列和XL异形体的3’-UTR)的多个shRNA序列进行的高通量筛选。将通过qPCR的ε-γ诱导以及通过FACS的mCherry报告子诱导(在报告子细胞系中作为ε-γ诱导的替代物)用作BCL11A敲减的功能性读出。将相对于非靶向对照的ε-γmRNA的归一化表达绘制在y轴上，并将相对于未转导对照的mCherry表达的平均荧光强度(MFI)绘制在x轴上。用圆圈标记进一步测试的11种shRNA。
图8C和图8D.在基于pol III和基于pol II的系统中对选择的shRNA的敲减效率进行比较。用LKO载体或用LEGO载体转导MEL细胞，以表达所标示的shRNA，并在嘌呤霉素存在下(LKO)或对Venus表达进行分选(LEGO)，来对转导细胞进行选择。Sankaran等先前报道了miR1shRNA。用β-肌动蛋白作为对照，通过免疫印迹示出了BCL11A蛋白水平(图8C)。XL和L示出了BCL11A蛋白各异形体的位置。(图8D)使用ImageJ软件对条带强度进行分析。
图8E.通过qPCR对相对于非靶向对照的ε-γ的归一化表达的诱导倍数(foldinduction)进行测量。使用转导非靶向shRNA的MEL细胞，并将表达设置为1。数据表示来自三次独立实验(平行进行三次)的代表性实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图9A-图9F是收集自小RNA测序分析的数据，其揭示了pol III转录物vs pol II转录物之间的差异加工。
图9A和图9B.总RNA分离自转导的、分选的或嘌呤霉素选择的MEL细胞，该细胞表达miR1或C4 shRNA。然后对所得RNA进行RNA深度测序。将转录自(图9A)pol III(LKO)或(图9B)pol II(LEGO)的加工的最终引导链和随从链序列表示在x轴上，并将每条链总读取(reads)的相应的每百万读取数绘制在y轴上。
图9C-图9F.将转录自(图9C)pol III启动子或(图9D)pol II启动子的miR1的加工变体引导链的序列绘制在y轴上，将总读取数绘制在x轴上。将转录自(图9E)pol III启动子或(图9F)pol II启动子的C4种类的加工变体引导链的序列绘制在y轴上，将总读取数绘制在x轴上。
图10A-图10D示出了shRNA序列的修饰导致敲减增加以及引导链vs随从链的比例提高。
图10A.对mIR1和C4shRNA进行修饰，使得删除4个5’碱基并在3’端添加GCGC，以产生修饰的shRNA(称为miR1G5和C4G5)。
图10B.修饰shRNA序列和母本shRNA序列的敲减效率的比较。用LEGO转导MEL细胞以经由pol II启动子表达所标示的shRNA，并对转导细胞的Venus表达进行分选。用β-肌动蛋白作为上样对照，通过免疫印迹对BCL11A蛋白水平进行测量。XL和L代表这些BCL11A蛋白异形体的位置。
图10C.使用ImageJ软件分析免疫印迹条带强度。
图10D.通过qPCR测量的相对于非靶向对照的修饰/未修饰shRNA序列的ε-γ的归一化表达的诱导倍数。数据表示来自显示类似结果的三次独立实验(平行进行三次)的代表性实验的平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01。
图11A-图11C示出了四个碱基对修饰的shRNA的RNA测序分析表现出准确加工。
图11A.从转导的、分选的MEL(表达修饰的miR1和修饰的C4 shRNA)分离总小RNA并测序。将转录自pol II启动子的修饰miR1(miR1-G5和C4G5)的加工引导链种类的频率分布绘制在y轴上，将总读取的每百万读取比例绘制在x轴上。
图11B和图11C.在y轴上显示mIR1-G5和C4-G5的加工变体引导链种类的序列，并在x轴上显示读取频率。
图12A.来自使用pLKO载体的靶向BCL11A的shRNA筛选的候选物。
图12B.PLKO中引导链序列的组成和分布。对于pLKO构建体而言，在5’端总是存在移位(shift)，这可能是由于在3’端的富T序列的延伸。添加的T是pol III终止序列的一部分。成熟shRNA序列中的这种移位表明在Dicer介导的加工期间，3’计数规则是主导的，意味着shRNA的切割从3’-端的21nt起始。这导致5’端的3个或4个碱基对移位，还导致同样移位的用于目标识别的种子区域(引导链的碱基2-7)。
图13.LEGO中引导链序列的组成和分布。小RNA深度测序分析揭示了pol III转录物vs pol II转录物之间的差异加工。对于lego构建体而言，在5’端不存在移位，引导链被dicer准确加工，产生预测产物。因此，最终的引导链在pol III和pol II驱动的构建体之间是不同的。
图14A.设计新shRNA以模拟在pLKO载体中产生的成熟引导链。修饰所有shRNA，以将5’上的四个碱基删除并在3’端添加GCGC，以产生修饰的shRNA(称为miR1G5、E3G5、B5G5、D8G5、B11G5、50D12G5、50B11G5、50A5G5、50C4G5)。通过并入这种移位，观察到E3G5、D8G5和C4G5在BCL11A敲减和ε-γ诱导方面有显著改进。“xxxx”表示4碱基对(bp)读框移位的位置，该移位导致4个碱基从未修饰的miR1、E3、B5、D8、B11、50D12(也称为D12)、50B11、50A5(也称为A5)和50C4(也称为C4)移除。
图14B.修饰的LEGO中引导链序列的组成和分布。修饰的shRNA的RNA深度测序分析示出了具有4bp移位的准确加工，这表明通过引入移位，我们能够完全模拟pLKO载体的产物。由于pLKO载体被用于筛选有效shRNA，当将shRNA盒转移到pol II驱动的骨架中时，这种修饰模拟了精确的成熟产物引导序列。
图15.修饰的引导序列的BCL11A敲减的比较。修饰的shRNA序列和母本shRNA序列的敲减效率的比较。显示BCL11A表达的Western印迹(XL和L异形体，上方子图)。红色圆圈表示在引入4bp移位后其中实现改善的BCL11A敲减的shRNA。下方子图：如qPCR所测量的，将修饰/未修饰的shRNA序列的ε-γ的归一化表达的诱导倍数与非靶向对照进行比较。
图16.修饰的引导序列的miR表达的比较。与敲减效率和ε-γ诱导的增加一致，相比未修饰的构建体(尤其是E3G5、D8G5和C4G5)，当在修饰的构建体中进行Northern时，引导链表达高(其导致敲减效率增加)。
图17.LEGO载体的BCL11A敲减效率和ε-γ诱导。在基于pLKO pol III的系统和基于pLEGO pol II的系统中对选择的shRNA的敲减效率进行比较。用pLKO载体或pLEGO载体中的标示的shRNA对MEL细胞进行转导，并在嘌呤霉素存在下(pLKO)或对Venus表达进行分选(pLEGO)，来对转导细胞进行选择。用β-肌动蛋白作为对照，通过免疫印迹对BCL11A蛋白水平进行测量。通过qPCR对相对于非靶向对照的归一化的ε-γ的诱导倍数进行测量。将转导非靶向shRNA的MEL细胞用作阴性对照。读框移位对敲减效率和ε-γ诱导都有强烈影响。靶向XL异形体的shRNA单独对ε-γ诱导具有强烈影响。数据表示来自三次独立实验(各自平行进行三次)的平均值±SD。*P<0.05。
图18示出了在pol-III shRNA载体和pol-II microRNA改造shRNA载体中的差异加工。
图19A-图19D示出了在pol III和pol II表达系统中对靶向BCL11A的shRNA进行的筛选和评价。
图19A.LKO-U6-BCL11A-shRNA(左侧)和LEGO-SFFV-BCL11A-shRNAmiR(右侧)的示意图。如材料和方法中所述，将两种表达盒工程化到慢病毒载体中。浅灰色框代表正义链；白色框代表反义链；深灰色框代表环结构；miRNA223支架由虚线表示。发夹结构示于下方。在这两个骨架中表达靶向BCL11A的不同shRNA序列，并评价其敲减效率。
图19B.使用基于pol III的慢病毒载体，针对敲减效率对靶向BCL11A mRNA的多个shRNA序列进行的高通量筛选。将通过qRT-PCR的Hbb-y mRNA诱导以及通过FACS的mCherry报告子诱导(在报告子细胞系中作为ε-γ诱导的替代物)用作BCL11A敲减的功能性读出。将相对于非靶向对照的Hbb-y mRNA的归一化表达绘制在y轴上，并将相对于未转导对照的mCherry表达的诱导倍数(通过平均荧光强度，MFI)绘制在x轴上。进一步测试从筛选分离的八个最佳表现的shRNA，并标记为1至8。
图19C.在基于pol III(U6)的系统和基于pol II(SFFV)的系统中对选择的shRNA的敲减效率的比较。用U6-载体(上方子图)或用SFFV-载体(下方子图)转导MEL细胞，以表达所标示的shRNA，并在嘌呤霉素存在下(pol III)或对Venus表达进行分选(pol II)，来对转导细胞进行选择。用β-肌动蛋白作为对照，通过免疫印迹示出了BCL11A蛋白水平。子图左侧的XL和L表示BCL11A蛋白各异形体的位置。
图19D.通过qPCR测量的相对于非靶向对照的Hbb-y的归一化表达的诱导倍数。将转导非靶向(NT)shRNA的MEL细胞中的表达设置为1。黑色棒代表U6启动子驱动的shRNA的相对表达，白色棒代表SFFV启动子驱动的shRNA的相对表达。数据表示来自三次独立实验(平行进行三次)的代表性实验的平均值±SD。*P<0.05。
图20A和图20B示出了小RNA测序分析，其揭示了pol III转录物与pol II转录物之间的差异加工。用U6-shRNA和SFFV-shRNAmiR1、2、3、4、7或8转导的MEL细胞的小RNA测序结果。将RNA序列与相应的参考引导链序列(在每个子图的上部以粗体示出，侧翼序列以灰色示出)进行比对。将产生自(图20A)U6-shRNA或(图20B)SFFV-shRNAmiR的引导链的不同变体绘制在y轴上。将基于与参考shRNA序列匹配的读取总数所计算的每个变体的相对％贡献表示在x轴上。
图21A-图21E示出了shRNA序列的修饰导致MEL细胞中的敲减增加以及引导链vs随从链的比例提高。
图21A.通过从引导序列删除前四个碱基并将GCGC添加到3’端来修饰SFFV-shRNAmiR(修饰的shRNA)。
图21B.在MEL细胞中从SFFV-pol II启动子表达的修饰shRNAmiR序列和母本shRNAmiR序列的敲减效率的比较。用β-肌动蛋白作为上样对照，通过免疫印迹在FACS分选的转导细胞中对BCL11A蛋白水平进行测量。上方子图左侧的XL和L表示这些BCL11A蛋白异形体的位置。PIII：pol III启动子载体；PII：pol II启动子载体；PIIM：含有修饰的shRNAmiR序列的pol II启动子载体。
图21C.通过qRT-PCR测量的相对于非靶向对照的未修饰(白色棒)和修饰(阴影棒)的shRNAmiR序列的Hbb-y的诱导倍数。数据表示平均值±SD。**P<0.01。
图21D.从用多种shRNA和shRNAmiR转导的细胞中提取的总RNA的Northern印迹分析。采用与引导链和随从链(从shRNA和shRNAmiR的位置1至20)互补的探针(20nt)来测量加工的小RNA的丰度。将与5S RNA互补的探针用作内部对照，以确定RNA上样。PIII：pol III启动子载体；PII：pol II启动子载体；PIIM：含有修饰的shRNAmiR序列的pol II启动子载体。
图21E.表达shRNA1、2、3、4、7或8的转导的MEL细胞均质群的RNA测序结果。将这些RNA的序列与示于每个子图上部的相应的参考引导链序列进行比对。在y轴上显示不同引导链种类的序列，在x轴上显示作为比对读取百分比的频率。
图22A-图22E示出了在源自于人CD34+的红系细胞中，修饰的shRNAmiR导致BCL11A敲减效率和γ珠蛋白诱导增加。
图22A.在嘌呤霉素存在下(pol III)或对Venus表达进行分选(pol II和pol II修饰的)，来对用表达不同shRNA(经修饰和未经修饰)的pol III载体或pol II载体转导的CD34+细胞进行选择。在分化的第11天，用β-肌动蛋白作为上样对照，通过免疫印迹对BCL11A表达进行测量。
图22B.通过qRT-PCR在分化第18天对γ-珠蛋白mRNA的诱导进行测定。数据表示对于pol III(黑色棒)、pol II(白色棒)和修饰的pol II(灰色棒)的总β-基因座输出(γ+β-珠蛋白)的γ-珠蛋白的百分比。*p>0.05；***p>0.001。
图22C.通过流式细胞术对去核以及红系细胞分化标志物(CD71、GpA)的定量和统计分析进行评估。CTRL：对照载体SFFV-shRNAmiRNT和SEW；PIII：pol III载体；PII：pol II载体；PIIM：含有修饰的shRNAmiR序列的pol II载体。数据表示来自三次独立实验的平均值±SD。***p>0.001。
图22D.通过HPLC在分化第18天对细胞裂解物的血红蛋白F进行测量。箭头表示HbF峰，色谱图下方示出了总血红蛋白的HbF百分比。
图22E.通过qRT-PCR评估的γ-珠蛋白mRNA表达与通过HPLC评估的HbF的相关图。黑色圆圈代表pol III载体，开放圆圈和灰色圆圈分别代表pol II或修饰的shRNAmiR。示出了对所有数据而言的相关系数(r2)。
图23A-图23I示出了通过限制红系细胞的表达阻止了BCL11A敲减对HSC的体内负面影响。
图23A.用表达shRNAmiR*(靶向BCL11A)的LeGO载体或非靶向对照载体(SFF-shRNAmiRNT)对分离自β-YAC小鼠(CD45.2)的谱系阴性骨髓细胞进行离体转导，并将其移植到致死辐照的BoyJ受体(CD45.1)中。移植未转导的对照细胞作为对照。在移植后4周、8周和12周，分别在外周血和骨髓中进行移入分析。(n＝每组4只小鼠)
图23B.在移植后4周、8周和12周，在外周血和骨髓中测定这些小鼠中的基因修饰细胞(Venus+细胞)的分数。
图23C.使用经所标示的载体转导的CD45.1和CD45.2供体细胞进行竞争性移植，并移植到CD45.1/2杂合小鼠中(上方子图)中。或者，使用编码蓝色荧光蛋白的中性载体(SFFV-BFP)对进入CD45.2受体环境的CD45.1供体中的竞争群进行识别(下方子图)。示出了转导后三天的用于移植的不同混合群的代表性点印迹。在各子图上方标示出两个竞争载体，第一个分别表示CD45.2或SFFV-BFP转导的群。
图23D.在移植后4周和8周的外周血(PB)中或在移植后12周的骨髓(BM)和脾(Spl)中，对基因修饰细胞在竞争性再增殖(competitively repopulated)小鼠中的贡献进行分析。示出了用两种竞争载体转导的基因修饰细胞的相对贡献。所提及的第一载体主导了造血输出。每个点代表受体小鼠个体。
图23E.在BCL11A靶向载体与对照载体(SFF-shRNAmiRNT和SFFV-BFP，左侧子图)之间对细胞转导部分中的骨髓B细胞部分进行的成对比较(pairwise comparison)。类似地，对转导细胞部分中的LSK含量进行分析。每个点代表受体个体。*和**分别表示p值≤0.05和p值≤0.01。
图23F.用于红系细胞特异性表达的LCR-shRNAmiR载体的结构(详见于文本)。
图23G.在移植后12周，在各种造血谱系中对LCR载体的体内表达谱进行分析。将每只小鼠中Venus+细胞的百分比根据CD71+/Ter119+红系细胞归一化(n＝4)。
图23H.使用表达shRNAmiR*的LCR或SFFV载体进行如图23C和图23D中所述的竞争性移植实验。每个点代表受体个体。
图23I.用LCR-shRNAmiR*、LCR-shRNAmiR 3和LCR-shRNAmiR 8或SFFV-GFP mock载体对动员外周血CD34+细胞进行转导，并对其进行体外红系细胞分化。在转导后第7天，对不同红系细胞亚群中SFFV-GFP和LCR载体的启动子活性进行评估。示出了代表性流程图。所有图中的误差棒＝SD。统计分析：t-检验。
图24A-图24F示出了由修饰的shRNAmiR进行的谱系特异性BCL11A敲减和γ珠蛋白诱导。
图24A.对用LCR-shRNAmiR 3、LCR-shRNAmiR 8或SFFV-GFP mock载体转导的CD34+HSPC进行荧光报告子表达FACS分选；并在分化第11天，用β-肌动蛋白作为上样对照，通过免疫印迹对BCL11A表达进行测量。
图24B.通过qRT-PCR在分化第18天对γ-珠蛋白mRNA的诱导进行测定。数据表示γ/(γ+β)珠蛋白的百分比。
图24C.通过流式细胞术分析对去核以及红系细胞分化标志物(CD71、GpA)进行的定量和统计分析。CTRL：SFFV-GFP对照载体；LCRM：经由LCR启动子表达的图23A所示的修饰的shRNAmiR。数据表示来自三次独立实验的平均值±SD。
图24D.通过HPLC在分化第18天对细胞裂解物的HbF水平进行测量。箭头表示HbF峰，色谱图下方示出了总血红蛋白的HbF百分比。
图24E.通过qRT-PCR评估的γ-珠蛋白诱导与通过HPLC评估的HbF的相关图。误差棒表示来自三次独立实验的±SD。
图24F.用LCR-shRNAmiR3或NT转导骨髓CD34+HSPC，并将其移植到亚致死辐照的NSG-小鼠(每组n＝3)中。将未转导的细胞用作对照。14周后，从移植动物的骨髓分离CD34细胞，并对其进行14天的体外红系细胞分化。在进行Venus报告子表达分选的细胞中对γ-珠蛋白和β-珠蛋白表达进行评估。
图25示出了四种细胞系中247种加工的TRC shRNA产物的深度测序。
图26示出了LCR-shRNAmiR载体的体内表达谱。
图27A是源自于转导的CD34+细胞(来自健康供体)的体外分化的红系细胞的Western印迹，示出了BCL11A异形体(L和XL)以及作为上样对照的β-肌动蛋白，并表明BCL11A XL的有效敲减。将DNA PCR测定的VCN示于各道(lane)下方。
图27B示出了红系细胞中BCL11A敲减的定量。数据源自于如图27A所示的Western印迹。数据总结了使用来自单一供体的细胞的三次独立实验(误差棒：SD)。
图27C示出了通过RT-qPCR评估的红系细胞中的γ珠蛋白的诱导以及通过HPLC评估的血红蛋白(HbF)(误差棒：SD)。
图28示出了通过RT-qPCR评估的红系细胞中的γ珠蛋白的诱导。红系细胞中的γ珠蛋白诱导量是细胞中的体内BCL11A敲减的量度。误差棒：SD。示出了来自每组三只移植动物的数据。
图29A示出了显示BCL11A(L和XL异形体)和作为上样对照的β-肌动蛋白的Western印迹，并表明了BLC11A-XL的有效敲减。每个子图(道下方标记1-6)表示使用来自单一供体的细胞的独立实验。
图29B示出了红系细胞中BCL11A敲减的定量。数据源自于如图29A所示的Western印迹(误差棒：SD)。
图29C示出了通过HPLC评估的产生的HbF诱导(误差棒：SD)。
图30示出了在CD34+分化的红系细胞中对于BCL11A敲减在SFFV和LCR骨架中所使用的序列。
图31示出了在CD34+分化的红系细胞中BCL11A敲减的Western印迹。
具体实施方式
本文所述的公开部分地基于慢病毒基因治疗载体的开发，所述载体在造血干细胞(HSC)的后代中选择性表达靶向BCL11A的shRNA。因此，本公开涵盖了用于调节红系细胞中γ-珠蛋白表达的新方法。更具体地，可通过经由抑制BCL11A基因产物而诱导γ-珠蛋白，在用于治疗血红蛋白病(包括SCD和THAL)的方法中利用这些活性。在具体实施方式中，提供了慢病毒基因治疗载体，所述载体在HSC、造血祖细胞或其它干细胞(例如胚胎细胞)的后代中选择性表达靶向BCL11A的shRNA。
正常成体血红蛋白包含四种珠蛋白，其中两种是alpha(α)蛋白，两种是beta(β)蛋白。在哺乳动物胎儿发育期间(特别是在人中)，胎儿产生胎儿血红蛋白，其包含两种gamma(γ)-珠蛋白而不包含两种β-珠蛋白。在胎儿发育期间的某一时刻，发生珠蛋白胎儿转换，在该时刻胎儿中的红细胞从主要制造γ-珠蛋白转换成主要制造β-珠蛋白。从主要产生胎儿血红蛋白或HbF(α2γ2)到产生成体血红蛋白或HbA(α2β2)的发育转换起始于妊娠的约28-34周，并在出生后短暂地持续，直至HbA成为主导。这种转换主要是由γ-珠蛋白基因转录的减少以及β-珠蛋白基因转录的增加而引起。尽管在健康成体中的残留HbF水平具有超过20倍的差异，但通常正常成体的血液中仅含有约2％的HbF(Atweh，Semin.Hematol.38:367-73(2001))。
血红蛋白病涵盖了许多种基因起因的贫血，其中，存在有减少的红血细胞(RBC)产生和/或增加的红血细胞破坏(溶血)。这些还包括导致伴随有保持氧浓度的能力受损的异常血红蛋白产生的遗传缺陷。一些此类紊乱包括不能产生足够量的正常β-珠蛋白，而另一些紊乱包括完全不能产生正常β-珠蛋白。与β-珠蛋白相关的这些紊乱通常被称作血红蛋白病。例如，SCD由(导致异常(镰状)血红蛋白(HbS)产生的)β-珠蛋白结构基因中的点突变造成。HbS RBC比正常RBC更脆弱，并且更容易发生溶血，最终导致贫血(Atweh，Semin.Hematol.38(4):367-73(2001))。THAL由(导致HbA缺陷或缺失的)β-珠蛋白基因表达的部分缺陷或完全缺陷造成。
旨在降低血红蛋白病患者中的珠蛋白链失衡的治疗研究已集中在胎儿HbF的药理学操控上。此类方法的治疗潜力由以下结果表明：相比具有正常成体HbF水平的患者，具有β链异常且HbF水平高于正常水平的成体患者的特定群体具有较轻微的疾病临床过程。例如，表达20％-30％HbF的沙特阿拉伯镰状细胞贫血患者组仅具有轻微的疾病临床表现(Pembrey等，Br.J.Haematol.40:415-429(1978))。现在认可了血红蛋白病(如SCD和THAL)通过增加HbF的产生而得到改善(Jane等，Br.J.Haematol.102:415-422(1998)；Bunn，N.Engl.J.Med.328:129-131(1993))。
转录阻遏物BCL11A代表了β-血红蛋白病的治疗靶标。使用pol III启动子表达的短发夹RNA(shRNA)实施RNA干扰，以减少造血细胞中的BCL11A表达。鼠造血干细胞(HSC)中的BCL11A敲减使长期移入受损。为了避免HSC毒性，经由pol II启动子表达的microRNA改造shRNA(shRNAmiR)来选择性抑制红系细胞中的BCL11A表达。对于相同的靶标匹配序列，由于系统之间引导链中的3-5nt差异(该差异强烈影响靶标敲减)，使用pol II载体观察到敲减显著降低。将相应的4nt移位工程化到shRNAmiR的引导链中，其令人惊讶和出乎意料地改善了BCL11A的敲减和Hbb-y(鼠红系细胞细胞系中的人γ-珠蛋白基因的功能性同源物)的去阻遏。修饰的shRNAmiR以红系细胞特异性方式表达，以避免对鼠HSC移入的不良影响，而且这在源自于人CD34的红系细胞中导致有效的BCL11A敲减和高水平的HbF。为源自于pol III表达的shRNA筛选的shRNAmiR的前瞻性设计开发了策略。在需要基因沉默序列的谱系特异性表达的血红蛋白病和其它疾病中，该策略构成了基因治疗的改进方法。
逆转录病毒载体和慢病毒载体
在一些实施方式中，本公开提供了使用基于逆转录病毒(如基于慢病毒)的基因递送载体以用于治疗血红蛋白病的改进的组合物和方法，所述载体在红系细胞或红系前体细胞中实现了转移的治疗基因的持续高水平表达。在本发明的一个实施方式中，所述载体包含人工miRNA，该miRNA含有克隆到内源miR-223序列的茎环中的BCL11A的靶向序列(Amendola等，Mol Ther 17:1039-52，2009)。本发明载体的茎/环结构由本文所公开的SEQID NO:1-18和SEQ ID NO:25-44的寡核苷酸的互补序列产生。参见图1、图12A、图14A、图21A和实施例11。将该茎/环结构克隆到miR-223/miR-30背景中。然后将整个miRNA/shRNA结构克隆到具有SFFV、TET或LCR启动子的盒(含有自失活(SIN)载体)中。本发明的具体慢病毒载体由Pawliuk等(2001)Science 294:2368和Imren等(2002)PNAS 99:14380描述，以引用的方式将它们并入本文。
因此，在一个方面，本文提供了合成的BCL11A microRNA，所述BCL11A microRNA在5’至3’方向包含以串联方式排列的第一BCL11A片段、环片段和第二BCL11A片段，其中，环片段处于第一BCL11A片段和第二BCL11A片段之间并直接连接至第一BCL11A片段和第二BCL11A片段；以及其中，第二BCL11A片段与第一BCL11A片段互补，从而使得第一BCL11A片段和第二BCL11A片段碱基配对以形成发夹环，环片段形成由此形成的发夹环的环部分。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段和第二BCL11A片段为约18个至25个核苷酸长。第一BCL11A片段源自于BCL11A序列并在shRNA加工成双链siRNA期间产生随从链，并且第二BCL11A片段与第一BCL11A片段互补，其中，第二BCL11A片段产生引导链，所述引导链并入RNA干扰特异性复合物(RISC)中，用于RNA干扰或BCL11A基因沉默。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段和第二BCL11A片段源自于BCL11A mRNA序列。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端以-GCGC-起始；第二BCL11A片段在3’端以-GCGC-结束。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端进一步由-GCGC-组成；第二BCL11A片段在3’端以-GCGC-结束。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端以-GCGA-、-TCTG-或-TG-起始；第二BCL11A片段与第一BCL11A片段互补。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段在5’端进一步由-GCGA-、-TCTG-或-TG-组成。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第二BCL11A片段在3’端以-TTTT-结束。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，合成的BCL11A microRNA包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，合成的BCL11A microRNA由选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列组成。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，合成的BCL11A microRNA基本上由选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列组成。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，第一BCL11A片段选自于由以下所组成的组：CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ ID NO:46；源自于本文所述的BCL11A miR1寡核苷酸)、CCAGAGGATGACGATTGTTTA(SEQ.ID.NO:47；源自于本文所述的BCL11A miR2寡核苷酸)、TCGGAGACTCCAGACAATCGC(SEQ.ID.NO:48；源自于本文所述的BCL11A E3寡核苷酸或shRNA1或E3)、CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC(SEQ.ID.NO:49；源自于本文所述的shRNA2或B5)、TCAGGACTAGGTGCAGAATGT(SEQ.ID.NO:50；源自于本文所述的shRNA4或B11)、TTCTCTTGCAACACGCACAGA(SEQ.ID.NO:51；源自于本文所述的BCL11A D8寡核苷酸或shRNA3或D8)、GATCGAGTGTTGAATAATGAT(SEQ.ID.NO:52；源自于本文所述的shRNA5或50D12或D12)、CAGTACCCTGGAGAAACACAT(SEQ.ID.NO:53；源自于本文所述的shRNA5或50A5)、CACTGTCCACAGGAGAAGCCA(SEQ.ID.NO:54；源自于本文所述的shRNA7或50B11)、ACAGTACCCTGGAGAAACACA(SEQ.ID.NO:55；源自于本文所述的BCL11A XLC4、shRNA8和50C4)、CAACAAGATGAAGAGCACCAA(SEQ.ID.NO:56；源自于本文所述的BCL11A非靶向寡核苷酸)、gcgcCGCACAGAACACTCATG(SEQ.ID.NO:57；源自于本文所述的miR1G5寡核苷酸)、GCGCTCGGAGACTCCAGACAA(SEQ.ID.NO:58；源自于本文所述的E3G5或E3 mod寡核苷酸或shRNA1mod)、gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAA(SEQ.ID.NO:59；源自于本文所述的B5G5或shRNA2mod)、gcgcTCAGGACTAGGTGCAGA(SEQ.ID.NO:60；源自于本文所述的B11G5或shRNA4mod)、gcgcGATCGAGTGTTGAATAA(SEQ.ID.NO:61；源自于本文所述的50D12G5、D12G4或shRNA5mod)、gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC(SEQ.ID.NO:62；源自于本文所述的50A5G5或shRNA6mod)、gcgcCACTGTCCACAGGAGAA(SEQ.ID.NO:63；源自于本文所述的50B11G5或shRNA7mod)、GCGCTTCTCTTGCAACACGCA(SEQ.ID.NO:64；源自于本文所述的BCL11A D8G5或D8mod或shRNA3mod)、GCGCACAGTACCCTGGAGAAA(SEQ.ID.NO:65；源自于本文所述的BCL11AC4G5或C4 mod或shRNA8mod)、CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:66；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)以及ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:67；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，环片段源自于microRNA。在一个实施方式中，microRNA是造血特异性microRNA。例如，miR-142、miR-155、miR-181和miR-223。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，microRNA是miR223。
在本文所述的任何一种合成的BCL11A microRNA的一个实施方式中，环片段是ctccatgtggtagag(SEQ ID NO:68)。
在一个方面，本说明书提供了分离的核酸分子或本文所述的合成的BCL11AmicroRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
因此，在一个方面，本说明书提供了包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA的组合物，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
因此，在一个方面，本说明书提供了包含至少一种载体或细菌的组合物，所述载体或细菌包含核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在一个方面，本说明书提供了包含载体或病毒的宿主细胞，所述载体或病毒包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在一个方面，本说明书提供了包含载体、病毒或细菌的宿主细胞，所述载体、病毒或细菌包含至少一种核酸分子或本文所述的合成的BCL11A microRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在一个实施方式中，载体是病毒载体或病毒。
由短干扰RNA(siRNA)或microRNA(miRNA)介导的RNA干扰(RNAi)是用于基因表达的转录后调节的有力方法。RNAi已被广泛用于研究哺乳动物细胞中的生物学过程，并可构成人类疾病的治疗方法，其中基因表达的选择性调控是期望的。取决于miRNA和靶mRNA序列之间的互补程度，通过诱导同源mRNA的降解或通过翻译衰减来发生基因表达的损失。将内源miRNA转录为初级转录物，并随后由RNAse III酶Drosha加工，(1)以创建茎环结构。核输出和Dicer切割产生成熟的短双链分子(siRNA)，其被分成引导链和随从链。引导链被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中，该效应复合物介导靶mRNA的切割，功能性引导链结合至RISC蛋白(2)，而随从链被降解[(3)中评述]。虽然哺乳动物细胞中的精确调节尚未被完全了解，但引导链与随从链加载到RISC中主要取决于siRNA的5’端稳定性，较不稳定的链优先并入RISC(4、5)。引导链5’端包含“种子区域”，该区域对于靶标识别而言很关键(6、7)。Drosha和Dicer的精确切割对于产生具有限定种子区域的引导RNA而言很关键，所述种子区域介导有效结合至适当的靶mRNA。不准确的加工导致结合至脱靶分子，但切割位点的移位也改变了双链末端的核苷酸组成，这可能对链加载到RISC中具有深远影响(8)。
通过使用RNA干扰试剂来抑制选择的靶多肽的表达。RNA干扰(RNAi)使用靶向信使RNA(编码靶多肽)的小干扰RNA(siRNA)双链以用于选择性降解。siRNA依赖性的基因表达的转录后沉默参与在siRNA指导的位点处对靶信使RNA分子的切割。RNAi是进化保守的过程，其中，引入或表达与靶基因相同或高度相似的序列的RNA导致转录自该靶基因的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)(参见Coburn,G.和Cullen,B.(2002)J.Virology 76(18):9225)，从而抑制靶基因的表达。在一个实施方式中，RNA是双链RNA(dsRNA)。已在植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中对这一过程进行了描述。在自然界中，RNAi通过dsRNA特异性核酸内切酶Dicer起始，Dicer促进长dsRNA持续切割为双链片段(称为siRNA)。siRNA被并入识别和切割靶mRNA的蛋白复合物(称为“RNA诱导沉默复合物”或“RISC”)。RNAi还可通过引入核酸分子(例如，合成的siRNA或RNA干扰试剂)起始，以抑制或沉默靶基因的表达。本文所使用的“抑制靶基因表达”包括与其中未诱导RNA干扰的情况相比，由靶基因编码的蛋白或靶基因的水平、或蛋白活性、或表达中的任何降低。与由未被RNA干扰试剂靶向的靶基因编码的蛋白的水平或活性、或该靶基因的表达相比，所述降低将为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％或更多。
本文所使用的术语“RNA干扰试剂”和“RNA干扰”旨在涵盖由双链RNA介导的那些基因沉默形式，而不管RNA干扰试剂包含的是siRNA、miRNA、shRNA还是其它双链RNA分子。将siRNA定义为例如通过RNAi来发挥抑制靶基因表达功能的RNA试剂。siRNA可化学合成、可通过体外转录产生、或者可在宿主细胞内产生。在一个实施方式中，siRNA是长度为约15至约40个核苷酸、优选约15至约28个核苷酸、更优选约19至约25个核苷酸、更优选约19、20、21、22或23个核苷酸的双链RNA(dsRNA)，并可在每条链上含有长度为约0、1、2、3、4或5个核苷酸的3’和/或5’垂悬(overhang)。垂悬的长度在两条链之间是独立的，即，一条链上的垂悬长度不依赖于第二条链上的垂悬长度。优选地，siRNA能够通过靶信使RNA(mRNA)的特异性转录后基因沉默(PTGS)或降解来促进RNA干扰。
siRNA还包括小发夹(亦称为茎环)RNA(shRNA)。在一个实施方式中，此类shRNA由短(例如，约19个-约25个核苷酸)反义链、接着是约5个-约9个核苷酸的核苷酸环、以及类似的正义链构成。或者，正义链可先于核苷酸环结构，反义链可在其后。此类shRNA可包含于质粒、逆转录病毒和慢病毒中，并从例如pol III U6启动子或另一启动子表达(参见例如Stewart等(2003)RNA April，9(4):493-501，通过引用的方式将其整体并入本文)。RNA干扰试剂的靶基因或序列可以是细胞基因或基因组序列，例如BCL11A序列。siRNA可基本上与靶基因或基因组序列或它们的片段同源。将此上下文中使用的术语“同源(homologous)”定义为与靶mRNA或其片段基本上相同、充分互补或类似，以实现靶标的RNA干扰。除了天然RNA分子之外，适于抑制或干扰靶序列表达的RNA还包括RNA衍生物和类似物。优选地，siRNA与其靶标相同。siRNA优选只靶向一个序列。可通过例如表达谱对每种RNA干扰试剂(例如siRNA)的潜在脱靶效应进行筛选。此类方法是本领域技术人员已知的，并例如在Jackson等，Nature Biotechnology 6:635-637，2003中进行了描述。除表达谱外，还可在序列数据库中对潜在靶序列的类似序列进行筛选，以识别可能具有脱靶效应的潜在序列。例如，15个或也许少至11个邻接核苷酸的序列同一性足以指导非靶向转录物的沉默。因此，可通过任何已知的序列比较方法(例如BLAST)，使用序列同一性分析对提议的siRNA进行初步筛选，以避免潜在的脱靶沉默。对siRNA序列进行选择，以使siRNA的反义(引导)链向RISC中的摄取最大化，从而使RISC靶向BCL11A mRNA以用于降解的能力最大化。这可通过筛选在反义链的5’末端处具有最低的结合自由能的序列来完成。较低的自由能使得siRNA双链的反义链的5’-端的解旋增强，从而确保反义链被RISC摄取并指导人BCL11A mRNA的序列特异性切割。siRNA分子不必限于仅包含RNA的分子，而是例如进一步涵盖了化学修饰的核苷酸和非核苷酸，还包括其中的核糖分子被另一糖分子或执行类似功能的分子取代的分子。此外，可在核苷酸残基之间使用非天然连接，例如硫代磷酸连接。可用报告子基团(例如荧光团)的反应性官能团将RNA链衍生化。特别有用的衍生物是在RNA链的末端(通常在正义链的3’末端)进行修饰。例如，可用多种基团容易地和选择性地将3’末端处的2’-羟基衍生化。其它有用的RNA衍生物并入了具有修饰的碳水化合物部分的核苷酸，例如2’O-烷基化残基或2’-O-甲基核糖基衍生物和2’-O-氟代核糖基衍生物。还可对RNA碱基进行修饰。可使用对抑制或干扰靶序列表达有用的任何修饰的碱基。例如，可并入诸如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶的卤化碱基。碱基还可被烷基化，例如，可并入7-甲基鸟苷以取代鸟苷残基。还可并入产生成功抑制作用的非天然碱基。最优选的siRNA修饰包括：2’-脱氧-2’-氟尿苷或锁核酸(LNA)核苷酸以及含有磷酸二酯或不同数量的硫代磷酸连接的RNA双链。此类修饰是本领域技术人员已知的，并例如在Braasch等，Biochemistry，42:7967-7975，2003中有所描述。siRNA分子的大部分有用修饰可使用基于反义寡核苷酸技术建立的化学来引入。优选地，修饰涉及最小的2’-O-甲基修饰，优选排除此类修饰。修饰还优选排除siRNA的游离5’-羟基基团的修饰。本文的实施例提供了RNA干扰试剂的具体实例，例如有效靶向BCL11A mRNA的shRNA分子。
聚合酶(pol)III驱动的短发夹RNA(shRNA)最常用于生物实验环境中。shRNA模拟miRNA前体中间体的结构，因此绕过了Drosha介导的第一切割步骤。可大量表达shRNA以提供有效的敲减。然而，在高感染复数(MOI)下，已在与归因于内源miRNA失调的细胞毒效应相关的一些情况中报道了内源RNAi机构的过饱和(9-11)。microRNA加工的两个组分Exportin5和Ago2似乎限制了这一通路的能力，而且这些蛋白的过表达导致敲减能力增加(12-15)。此外，由小RNA以序列特异性方式以及非特异性方式引发的先天性免疫应答的活化可介导细胞毒副作用(16、17)，在(18)中评述。这些作用已在一些实验转基因模型系统中导致小鼠死亡率增加，被报道为shRNA过表达的直接副作用(14、19)。
对于基于RNAi的疗法的临床转化，可能需要采用聚合酶II启动子的替代表达系统。对于谱系特异性表达或甚至细胞类型特异性表达而言，这类启动子允许采用适当的调节元件。相比pol III启动子，这还可提供较低水平的表达，其可消除已在以高MOI转导的细胞中报道的加工机构的过饱和。合并利用pol II启动子进行shRNA表达需要将shRNA序列嵌入通常源自于内源miRNA前体的侧翼序列，以用于有效加工。以miRNA支架作为侧翼的shRNA模拟了内源miRNA的结构(10、20)。迄今为止，已将源自于人miRNA-30和miRNA-223的侧翼区域广泛用于并入重组shRNA，以在哺乳动物细胞中进行表达，并且已经进行了许多努力以更好地理解和改进这一表达策略(21)。对于造血细胞中的shRNA表达而言，已经显示后一种miRNA在用作支架时特别有效，并且，由于多种造血细胞类型中的有效加工和低随从链活性，后一种miRNA介导了靶mRNA的实质性敲减(21、22)。
在本公开中，本发明人采用BCL11A作为靶标来研究shRNAmiR的加工和优化，以用于潜在的治疗应用。在重型血红蛋白病、镰状细胞疾病(SCD)和β-地中海贫血中，BCL11A对于γ-珠蛋白基因再活化以及由此的HbF表达而言是经证实的治疗靶标。BCL11A的下调或基因删除缓解了γ-珠蛋白阻遏(23)，并且红系细胞谱系中BCL11A的失活防止了基因工程化小鼠中的SCD表型和器官毒性(24)。小鼠胚胎Hbb-y基因是人γ-珠蛋白基因的功能性同源物，因此在鼠红白血病(MEL)细胞中作为用于评估BCL11A敲减作用的方便替代物。最初，我们观察到相比使用基于pol III的载体，在使用基于pol II的载体表达shRNA后，BCL11A的敲减效率显著降低。Pol III和pol II shRNAmiR设计通常在回文发夹茎中并入21个碱基的靶位点匹配序列，但预期对来自这两种类型的表达盒的转录物进行差异加工(25)。pol IIshRNAmiR转录物进入Drosha加工上游的RNAi加工通路，而短得多的pol III产物预期进入Drosha下游的通路并且仅在环末端被Dicer切割。基于源自于pol III和pol II启动子的加工的小RNA的序列，我们观察到在21个碱基的靶标匹配序列的相对定位方面，pol IIIshRNA盒和pol II shRNAmiR盒产生不同的加工shRNA。重新设计的shRNAmiR(该shRNAmiR模拟了由有效pol III驱动的shRNA所产生的成熟引导链序列)导致靶mRNA抑制和加工效率提高。将这些修饰并入红系细胞特异性的哺乳动物表达载体导致了显著的BCL11A蛋白敲减和胎儿血红蛋白再诱导。这一策略还在造血干细胞和B细胞谱系区室中避免了伴随泛造血shRNA表达的毒性。总之，数据表明了与在不同载体上下文中使用shRNA相关的RNA加工的关键特征，还提供了用于谱系特异性基因敲减的策略，该策略避免了广泛表达的不良后果。我们的研究结果对于嵌入microRNA的shRNA的设计及其在基于RNAi的基因治疗方法中的应用而言具有重要意义。
在一个实施方式中，在药学上可接受的载体中对RNA干扰试剂进行递送或给予。可向药学上可接受的载体加入诸如脂质体的额外的载体试剂。在另一实施方式中，在药学上可接受的载体中通过编码小或短发夹RNA(shRNA)的载体将RNA干扰试剂递送至个体器官中的细胞。在转录后，shRNA通过细胞转换成能够靶向例如BCL11A的siRNA。
在一个实施方式中，RNA干扰试剂是核酸分子或本文所述的合成的BCL11AmicroRNA，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-18和25-44所组成的组中的核苷酸序列。
在一个实施方式中，载体是可调节的载体，例如四环素诱导型载体。可使用例如在Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.100:5103-5106中描述的使用pTet-On载体(BD BiosciencesClontech，Palo Alto，Calif.)的方法。在一个实施方式中，在静脉内注射(例如水流动力学(hydrodynamic)注射)后，本文所述方法中使用的RNA干扰试剂在体内被细胞主动摄取，无需使用载体，说明RNA干扰试剂有效的体内递送。递送siRNA的一种方法是靶器官的血液供给血管的导管插入术。还可采用递送RNA干扰试剂(例如本发明方法中使用的siRNA或shRNA)的其它策略，诸如例如通过载体(例如质粒或病毒载体，例如慢病毒载体)递送。可按照例如Xiao-Feng Qin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，100:183-188中所描述的使用此类载体。其它递送方法包括通过使RNA干扰试剂与碱性(basic)肽(例如，TAT肽片段)缀合或混合、与阳离子脂质混合或配制成颗粒，使用碱性肽递送RNA干扰试剂(例如，本发明的shRNA或siRNA)。RNA干扰试剂(例如靶向BCL11A mRNA的siRNA)可单独递送或与其它RNA干扰试剂(例如，siRNA，诸如例如针对其它细胞基因的siRNA)联合递送。BCL11A siRNA也可以与用于治疗或预防与氧化应激相关的疾病或紊乱(特别是呼吸系统疾病、更特别是哮喘)的其它药物试剂联合给予。可使用本领域技术人员已知的多种技术来获得合成的siRNA分子，包括shRNA分子。例如，可使用本领域已知的方法(例如，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成器)化学合成或重组生产siRNA分子(参见例如Elbashir，S.M.等(2001)Nature 411:494-498；Elbashir，S.M.,W.Lendeckel和T.Tuschl(2001)Genes&Development15:188-200；Harborth,J.等，(2001)J.Cell Science 114:4557-4565；Masters,J.R.等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国98:8012-8017；以及Tuschl,T.等，(1999)Genes&Development 13:3191-3197)。或者，存在一些可用的商业RNA合成供应商，包括但不限于Proligo(Hamburg，德国)、Dharmacon Research(Lafayette，Colo.，美国)、PierceChemical(Perbio Science的部分，Rockford，Ill.，美国)、Glen Research(Sterling，Va.，美国)、ChemGenes(Ashland，Mass.，美国)以及Cruachem(Glasgow，UK)。因此，siRNA分子并不过于难以合成且易于以适合于RNAi的质量提供。另外，可使dsRNA作为由质粒载体、逆转录病毒和慢病毒编码的茎环结构表达(Paddison,P.J.等(2002)Genes Dev.16:948-958；McManus,M.T.等(2002)RNA 8:842-850；Paul,C.P.等(2002)Nat.Biotechnol.20:505-508；Miyagishi,M.等(2002)Nat.Biotechnol.20:497-500；Sui,G.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国99:5515-5520；Brummelkamp,T.等(2002)Cancer Cell 2:243；Lee,N.S.等(2002)Nat.Biotechnol.20:500-505；Yu,J.Y.等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国99:6047-6052；Zeng,Y.等(2002)Mol.Cell 9:1327-1333；Rubinson,D.A.等(2003)Nat.Genet.33:401-406；Stewart,S.A.等(2003)RNA 9:493-501)。此类载体通常在dsRNA上游具有polIII启动子，并且可分别表达正义RNA链和反义RNA链和/或将其表达为发夹结构。在细胞中，Dicer将短发夹RNA(shRNA)加工成有效的siRNA。本发明的siRNA分子的靶向区域可选自于给定的靶基因序列(例如，BCL11A编码序列)，该靶基因序列开始于起始密码子下游的约25个至50个核苷酸、约50个至75个核苷酸、或约75个至100个核苷酸。核苷酸序列可包含5’UTR或3’UTR和起始密码子附近的区域。设计本发明的siRNA分子的一种方法涉及识别23个核苷酸序列基序，并对具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％G/C含量的命中(hits)进行选择。或者，如果没有发现此类序列，可使用基序NA(N21)来扩展搜索，其中N可以是任何核苷酸。在这种情况下，可将正义siRNA的3’末端转换为TT，以使能够在关于正义和反义3’垂悬的序列组成方面产生对称的双链。然后，反义siRNA分子可作为23个核苷酸序列基序的1位至21位核苷酸的互补物进行合成。使用对称的3’TT垂悬可有利于确保以近似等比例的正义和反义靶RNA切割小干扰核糖核蛋白颗粒(siRNP)形成siRNP(上文Elbashir等(2001)和上文Elbashir等，2001)。还可将序列数据库(包括但不限于NCBI、BLAST、Derwent和GenSeq)的分析以及诸如的商业可得的寡合成公司用于针对EST文库来选择siRNA序列，以确保只靶向一个基因。
本发明的慢病毒载体包括但不限于人免疫缺陷病毒(例如HIV-1、HIV-2)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。可使用本领域公认的技术对这些载体进行构建和工程化以增加它们在治疗中使用的安全性，并包含合适的表达元件和治疗基因，例如下文所述的编码siRNA的表达元件和治疗基因，以用于治疗包括但不限于血红蛋白病的病症。
考虑到慢病毒的潜在毒性，可通过不同的方式设计载体以增加它们在基因治疗应用中的安全性。例如，可通过将所需的慢病毒基因(例如gag和pol)分离到例如美国专利号6,365,150(通过引用的方式将其内容并入本文)中所述的独立的载体上，来使载体更安全。因此，可对重组逆转录病毒进行构建，以使逆转录病毒编码序列(gag、pol、env)被感兴趣的基因替换，使逆转录病毒复制产生缺陷。然后通过使用辅助病毒或包装细胞系，通过标准技术将复制缺陷型逆转录病毒包装到病毒粒子中。用于产生重组逆转录病毒以及用此类病毒体外或体内感染细胞的方案可见于Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等(编)Greene Publishing Associates，(1989)，第9.10-9.14节以及其它标准实验室手册。
使用病毒作为基因递送载体的主要先决条件是确保其使用的安全性，特别是关于野生型病毒在细胞群中散播的可能性。仅产生复制缺陷型逆转录病毒的包装细胞系的开发增加了逆转录病毒用于基因治疗的效用，并且缺陷型逆转录病毒在出于基因治疗目的的基因转移用途方面得到了充分表征(参见Miller,A.D.(1990)Blood 76:271的综述)。因此，在本发明的一个实施方式中，将包装细胞系用于扩增(propagate)本发明的载体(例如慢病毒载体)，以增加载体病毒的滴度。包装细胞系的使用也被认为是扩增病毒的安全方式，因为该系统的使用降低了发生重组以产生野生型病毒的可能性。此外，为了减少由包装蛋白的表达所引起的对细胞的毒性，可使用包装系统，其中，通过例如化学方法来仅瞬时转染编码病毒的包装功能的质粒。
在另一实施方式中，通过用非慢病毒序列替换一些慢病毒序列可使载体更安全。因此，本公开的慢病毒载体可包含部分(例如断裂(split))基因慢病毒序列和/或非慢病毒序列(例如来自其它逆转录病毒的序列)，只要其功能(例如病毒滴度、感染性、整合以及使治疗基因高水平表达和长时间表达的能力)基本上不被降低。可克隆到病毒载体中的元件包括但不限于启动子、包装信号、LTR、聚嘌呤束和反向响应元件(RRE)。
在本公开的一个实施方式中，通过用异源启动子替换病毒LTR启动子来修饰LTR区域。在一个实施方式中，用异源启动子替换5’LTR的启动子。可使用的异源启动子的实例包括但不限于脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、四环素诱导型(TET)启动子、β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子(LCR)以及巨细胞病毒(CMV)启动子。
在一些实施方式中，本公开的慢病毒载体还包括已进行修饰来改进载体在基因治疗中作为基因递送试剂使用的安全性的载体。在本发明的一个实施方式中，在U3和/或U5区域中修饰载体的LTR区域(例如3’LTR)，其中创建SIN载体。此类修饰有助于提高用于基因递送目的的载体的安全性。在一个实施方式中，本发明的SIN载体包含3’LTR中的删除，其中，用绝缘子元件(insulator element)替换U3区域的一部分。绝缘子防止了载体内的增强子/启动子序列影响附近基因组中基因的表达，反之亦然，也防止了附近的基因组序列影响载体内基因的表达。在本发明进一步的实施方式中，对3’LTR进行修饰，以例如用理想的poly(A)序列将U5区域替换。应当注意的是，本发明还包括对LTR的修饰，例如对3’LTR、5’LTR的修饰或对3’LTR和5’LTR这二者的同时修饰。
慢病毒载体的启动子可以是与具体基因的5’侧翼区域天然(即如同发生在体内细胞中的情况)或非天然相关的启动子。启动子可源自于真核生物基因组、病毒基因组或合成序列。可将启动子选择为非特异性的(在所有组织中有活性)(例如SFFV)、组织特异性的(例如LCR)、由天然调节过程调节的、由外源施用的药物(例如TET)调节的、或由特定生理状态调节的(例如在急性期应答期间活化的那些启动子或仅在复制细胞中活化的那些启动子)。本发明中的启动子的非限制性实例包括脾病灶形成病毒启动子、四环素诱导型启动子、β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子(LCR)、巨细胞病毒(CMV)启动子、逆转录病毒LTR启动子、巨细胞病毒立即早期启动子(cytomegalovirus immediate early promoter)、SV40启动子和二氢叶酸还原酶启动子。启动子也可选自于在选择的细胞类型中显示特异性表达的启动子，所述细胞类型可发现与包括但不限于血红蛋白病的病症相关。在本发明的一个实施方式中，启动子是细胞特异性的，以将基因表达限制于红细胞。通过使用人β-珠蛋白启动子区域和基因座控制区域(LCR)来实现红细胞特异性表达。
本领域技术人员将认识到，选择启动子来表达感兴趣的多核苷酸将取决于载体、核酸盒、待靶向的细胞类型以及期望的生物效应。本领域技术人员还将认识到，在启动子的选择中，参数可包括：实现足够高水平的基因表达以实现生理效应；保持基因表达的临界水平；实现基因表达的时序调节；实现细胞类型特异性表达；实现基因表达的药理学、内分泌、旁分泌或自分泌调节；以及防止不适当或不期望的表达水平。选择要求的任何给定集合将取决于病症，但是一旦确定了具体要求，就可容易地确定所述集合。在本发明的一个实施方式中，启动子是细胞特异性的，以将基因表达限制于红细胞。通过使用人β-珠蛋白启动子区域和基因座控制区域(LCR)来实现红细胞特异性表达。
用于构建适合本发明使用的表达载体的标准技术是本领域普通技术人员所公知的，并可见于诸如Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y的出版物中。多种策略可用于连接DNA片段，对策略的选择取决于DNA片段末端的性质，本领域技术人员可容易地进行此类选择。
可将本发明的基因治疗载体(例如前述的慢病毒载体)用于在转化的红系细胞中表达多种治疗性siRNA。在一个实施方式中，待在载体中表达的感兴趣的siRNA源自于可用于治疗血红蛋白病的基因，例如针对BCL11A的siRNA。
本发明的具体基因治疗构建体包括但不限于图2所示的构建体。示意性地示出了本文所述的三种慢病毒载体，shRNA的茎包含BCL11A mRNA靶向序列，环是miR223特异性的。所有载体均含有荧光染料标志物(Venus)，并被构建到自失活(SIN)delta-U3LEGO骨架(Ferhse Lab，德国)中。将组成型敲减慢病毒(其中经由非常有效的、普遍表达的SFFV启动子来表达靶向shRNA)用于评估靶向shRNA的功能性和毒性。将诱导型敲减慢病毒(其中经由PGK四环素诱导型启动子来表达shRNA)用于评估靶向shRNA的功能效应、剂量依赖效应和方案依赖(schedule-dependent)效应。谱系特异性慢病毒(其中经由β-珠蛋白LCR启动子图谱(landscape)(HS2/3DNA超敏感位点，Naldini Lab，意大利)来表达shRNA)是在体内系统中进行验证的治疗选择。LTR区域进一步包含U3区域和U5区域以及R区域。可一起修饰或独立修饰U3区域和U5区域以创建自失活载体，从而增加载体在基因递送中使用的安全性。可将U3区域和U5区域进一步修饰为包含绝缘子元件。
在细胞中促进感染性病毒颗粒产生的步骤可使用常规技术(例如标准细胞培养生长技术)进行。如果本领域技术人员需要，可使用本发明的载体和方法制备慢病毒原液。制备病毒原液的方法是本领域已知的，并由例如Y.Soneoka等(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633以及N.R.Landau等(1992)J.Virol.66:5110-5113进行了说明。在本发明生产原液的方法中，用本发明的载体系统对慢病毒受纳细胞(本文称为生产细胞)进行转染。然后使细胞在合适的细胞培养条件下生长，并从如上所述的细胞本身或细胞培养基收集慢病毒颗粒。合适的生产细胞系包括但不限于人胚胎肾细胞系293、马真皮细胞系NBL-6和犬胎儿胸腺细胞系Cf2TH。
收集感染性病毒颗粒的步骤还可使用常规技术进行。例如，如本领域已知的，可通过细胞裂解或收集细胞培养物的上清液来收集感染性颗粒。可选地，如果需要的话，可将收集的病毒颗粒纯化。合适的纯化技术是本领域技术人员公知的。
涉及在基因治疗中使用病毒载体的其它方法可见于例如Kay,M.A.(1997)Chest111(6Supp.):1385-1425；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81；Shiratory,Y.等，(1999)Liver 19:265-74；Oka,K.等，(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)Gene Ther.7:1744-52；Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56；Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101；Strayer,D.S.(1999)ExpertOpin.Investig.Drugs 8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.和Bartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49；以及Lee,H.C.等，(2000)Nature 408:483-8。
如本领域所公知的，如上所述的逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)或含有所述逆转录病毒载体的细胞可通过任何合适的途径体内给予受试者。术语“给予”是指将配制的载体引入体内的途径。例如，给予可为血管内给予、动脉内给予、静脉内给予、肌内给予、局部给予、口服给予或通过基因枪或无痛皮下注射器(hypospray)仪器操作给予。因此，给予可为直接针对靶组织或通过系统递送来给予。给予可为直接注射到骨髓中。直接给予至靶组织可涉及针注射、无痛皮下注射器、电穿孔或基因枪。参见例如WO 93/18759，通过引用的方式将其并入本文。
或者，可使用本领域公知的标准转染技术将本发明的逆转录病毒载体离体或体外给予细胞或组织。
在一个实施方式中，还可将本发明的逆转录病毒载体转导到宿主细胞(包括胚胎干细胞、体干细胞或祖细胞)中。可通过本发明的逆转录病毒载体转导的宿主祖细胞的实例包括红细胞和造血干细胞的前体。在另一实施方式中，宿主细胞是红细胞。在血红蛋白病的治疗中，可将转导的宿主细胞用作实现感兴趣的基因的红系细胞特异性表达的方法。
本发明的另一方面涉及本发明的慢病毒载体的药物组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含足以治疗或降低发展风险(例如改善血红蛋白病的症状)的治疗有效量的慢病毒载体以及药学上可接受的载体。“治疗有效量”是指以必需的剂量和时间段实现期望的治疗结果(例如血红蛋白病病症的治疗或预防)的有效量。慢病毒载体的治疗有效量可根据以下因素变化：例如，个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及慢病毒载体在该个体中引发期望应答的能力。可对剂量方案进行调整，以提供最佳的治疗应答。治疗有效量也是其中的治疗有益作用超过慢病毒载体的任何毒性作用或有害作用的量。可使用基于细胞的分析或本领域公认的动物模型对本发明的慢病毒载体的潜在毒性进行分析，并可对未表现出显著毒性的治疗有效的调控剂进行选择。在优选的实施方式中，治疗有效量的慢病毒载体足以治疗血红蛋白病。
无菌可注射溶液可通过将所需量的慢病毒载体加入适当的溶剂(根据需要具有以上列举的成分的一种或组合)中、接着进行过滤灭菌而制备。通常，通过将活性化合物加入无菌辅料(包含基础(basic)分散介质和来自以上列举成分的所需其它成分)来制备分散体(dispersions)。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法产生活性成分加上任何额外的期望成分(来自其先前无菌过滤的溶液)的粉末。
应注意的是，剂量值可随待减轻的病症的严重程度而变化。应进一步理解的是，对于任何具体受试者而言，具体剂量方案可根据个体需要和管理或指导组合物给予的人的专业判断而随时间进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性，并不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。在一个实施方式中，剂量范围为103个-108个病毒颗粒/50kg体重。在其它实施方式中，剂量范围为103个-105个病毒颗粒/50kg体重、104个-106个病毒颗粒/50kg体重、105个-107个病毒颗粒/50kg体重、103个-108个病毒颗粒/50kg体重。在一个实施方式中，剂量为约104个病毒颗粒/50kg体重。
组合物中的病毒载体的量可根据以下因素变化：例如，个体的疾病状态、年龄、性别和体重。可对剂量方案进行调整，以提供最佳的治疗应答。例如，根据治疗情况的迫切需求所指明的，可单次大剂量(single bolus)给予，可在一段时间内给予数个分次剂量，或者可将剂量按比例减少或增加。特别有利的是将胃肠外组合物配制成单位剂量形式(dosageunit form)，从而易于给予并使剂量均一。本文所使用的单位剂量形式是指用于待治疗的哺乳动物受试者的适合作为单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包含经计算与所需的药物载体组合产生期望治疗效果的预定量的活性化合物。对本发明单位剂量形式的规定由以下方面决定并直接取决于以下方面：(a)活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果；以及(b)本领域中将这种活性化合物配制用于在个体中进行敏感性治疗的固有限制。然而，对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可仅使用常规实验方法来确定适当的“有效量”。
在具体的实施方式中，本发明考虑了经基因修饰以表达本文所考虑的治疗性多肽和抑制性RNA的细胞，以用于治疗血红蛋白病。如本文所使用的术语“基因工程化”或“基因修饰”是指细胞中的遗传物质的添加、删除或修饰。术语“基因修饰的细胞”、“修饰的细胞”和“重定向的(redirected)细胞”可互换使用。在具体的实施方式中，对用本文所考虑的载体转导的细胞进行基因修饰。如本文所使用的术语“基因治疗”是指将处于DNA或RNA形式的额外遗传物质引入细胞的总遗传物质中，所述基因治疗恢复、校正或修饰细胞的生理学以提供期望的治疗结果。
在各种实施方式中，用本发明的载体体外或离体转导本文所考虑的基因修饰的细胞，并任选地对其进行离体扩增。然后，将转导的细胞给予需要基因治疗的受试者。
适用于本文所考虑的基因治疗方法中的转导和给予的细胞包括但不限于干细胞、祖细胞和分化细胞。在一些实施方式中，转导的细胞是胚胎干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、红系祖细胞和红系细胞。
造血干细胞(HSC)产生定向(committed)造血祖细胞(HPC)，该细胞能够在生物体的整个生命周期中产生整体谱序(entire repertoire)的成熟血细胞。术语“造血干细胞”或“HSC”是指产生生物体的所有血细胞类型的多能干细胞，所述血细胞类型包括骨髓谱系(例如单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)和淋巴谱系(例如T细胞、B细胞、NK细胞)以及本领域已知的其它细胞(参见Fei,R.等，美国专利号5,635,387；McGlave等，美国专利号5,460,964；Simmons,P.等，美国专利号5,677,136；Tsukamoto等，美国专利号5,750,397；Schwartz等，美国专利号5,759,793；DiGuisto等，美国专利号5,681,599；Tsukamoto等，美国专利号5,716,827)。当移植到致死辐照的动物或人中时，造血干细胞和祖细胞可使红系细胞、中性粒细胞-巨噬细胞、巨核细胞和淋巴造血细胞池再增殖。
在一些实施方式中，转导的细胞是分离自骨髓、脐带血或外周循环的造血干细胞和/或祖细胞。在具体的实施方式中，转导的细胞是分离自骨髓、脐带血或外周循环的造血干细胞。
在一个实施方式中，造血细胞是CD34+细胞。
在一个实施方式中，造血细胞是红系祖细胞。
在一个实施方式中，造血细胞是红系细胞。
本发明的细胞可以是自体的(“autologous/autogeneic”)(“自身的”)或非自体的(“非自身的”，例如同种异体的、同基因的(syngeneic)或异基因的(xenogeneic))。本文所使用的“自体的”是指来自相同受试者的细胞。本文所使用的“同种异体的”是指与相比较的细胞在遗传上不同的相同物种的细胞。本文所使用的“同基因的”是指与相比较的细胞在遗传上相同的不同受试者的细胞。本文所使用的“异基因的”是指与相比较的细胞的物种不同的细胞。在优选的实施方式中，本发明的细胞是同种异体的。“分离的细胞”是指已从体内组织或器官获得并且基本上不含细胞外基质的细胞。
适用于本文所考虑的基于细胞的疗法的基因修饰细胞的说明性实例包括但不限于：胚胎干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、髓系祖细胞、红系祖细胞和其它红系细胞。
在优选的实施方式中，适用于本文所考虑的基于细胞的疗法的细胞包括但不限于：造血干细胞或祖细胞、原成红细胞(proerythroblast)、嗜碱性成红细胞(basophilicerythroblast)、多染性成红细胞(polychromatic erythroblast)、正染性成红细胞(orthochromatic erythroblast)、多染性红细胞(polychromatic erythrocyte)以及红细胞(RBC)或它们的任何组合。
治疗血红蛋白病或降低其发展风险的方法
本发明提供了通过给予抑制BCL11A表达的载体而用于增加细胞中的HbF产生的改进的组合物和方法。数据表明，BCL11A的抑制导致来自γ-珠蛋白基因的表达增加。如本文所公开的，本发明的一个目的是提供用于增加细胞中胎儿血红蛋白水平的组合物和方法。在一些实施方式中，所述细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞、造血祖细胞或它们的后代。
因此，本发明的一个方面提供了用于增加细胞表达的胎儿血红蛋白水平的方法，该方法包括以下步骤：使胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血细胞与有效量的包含至少一种病毒或载体(包含本文所述的核酸分子)的组合物接触，由此，相对于该接触之前的细胞，所述细胞或其后代中的BCL11A表达降低且胎儿血红蛋白表达增加。在一个实施方式中，载体或病毒表达RNA干扰试剂，从而降低BCL11A的表达，所述RNA干扰试剂是抑制BCL11A的BCL11A microRNA。
关于使细胞与BCL11A抑制剂接触，在细胞中“增加胎儿血红蛋白水平”表示相比不存在BCL11A抑制剂的可比的对照群，用BCL11A抑制剂处理的群中HbF高至少5％。优选地，相比可比尺寸和培养条件的对照处理群，BCL11A抑制剂处理群中HbF表达的百分比高至少10％、高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少1倍、高至少2倍、高至少5倍、高至少10倍、高至少100倍、高至少1000倍或高更多。术语“对照处理群”在本文中用于描述除非靶向寡核苷酸这一例外，用相同的培养基、病毒诱导、核酸序列、温度、汇合、烧瓶尺寸、pH等处理的细胞群。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，受试者疑似患有血红蛋白病、处于患血红蛋白病的风险中或患有血红蛋白病，例如SCD或THAL。识别出患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者完全在本领域普通技术人员的能力范围内。
受试者还可以是经历任何的各种额外治疗处理的受试者。因此，例如，受试者可以是用氧、羟基脲、叶酸或血液输注治疗的受试者。
将RNA干扰试剂(例如siRNA)或包含RNA干扰试剂的载体递送至靶细胞(例如，红细胞或其它期望的靶细胞)以用于摄取的方法包括：注射含有RNA干扰试剂(例如，siRNA)的组合物、或直接使细胞(例如，红细胞)与含有RNA干扰试剂(例如，siRNA)的组合物接触。在另一实施方式中，可经由例如水流动力学注射或导管插入术将RNA干扰试剂(例如，siRNA)直接注入任何血管，如静脉、动脉、小静脉或小动脉。可通过单次注射或两次以上注射进行给予。在药学上可接受的载体中递送RNA干扰试剂。可同时使用一种或多种RNA干扰试剂。在一个优选的实施方式中，仅使用靶向人BCL11A的一种siRNA。在一个实施方式中，用RNA干扰靶向特定细胞，限制了由RNA干扰的非特异性靶向引起的RNA干扰的潜在副作用。该方法可使用例如用于将RNA干扰有效递送到细胞中的包含细胞靶向部分以及RNA干扰结合部分的融合分子或复合物。例如，当与siRNA混合时，抗体-鱼精蛋白融合蛋白与siRNA结合，并选择性将siRNA递送到表达被抗体识别的抗原的细胞中，仅在表达抗原的此类细胞中导致基因表达的沉默。siRNA或RNA干扰诱导分子的结合部分是蛋白或核酸结合结构域或蛋白的片段，且该结合部分被融合至靶向部分的一部分。靶向部分的位置既可处于构建体的羧基末端或氨基末端，也可处于融合蛋白中间。如在Xia,H.等((2002)Nat Biotechnol 20(10):1006)中描述的，还可采用病毒介导的递送机制来将siRNA体外和体内递送至细胞。如在Rubinson,D.A.等((2003)Nat.Genet.33:401-406)和Stewart,S.A.等((2003)RNA 9:493-501)中描述的，还可采用shRNA的质粒介导的递送机制或病毒介导的递送机制来将shRNA体外和体内递送至细胞。可连同执行下列活性中的一种或多种的组分一起引入RNA干扰试剂(例如siRNA或shRNA)：增强细胞(例如淋巴细胞或其它细胞)对RNA干扰试剂(例如siRNA)的摄取；抑制单链退火；稳定单链；或以其它方式促进向靶细胞的递送以及增加靶基因(例如BCL11A)的抑制。特定RNA干扰试剂的剂量是实现特定靶基因的RNA干扰(例如翻译后基因沉默)所需的量，从而导致靶基因表达的抑制或由该靶基因编码的蛋白的水平或活性的抑制。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，对胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞或造血祖细胞或造血干细胞(HSC)进行离体或体外接触。在具体实施方式中，所接触的细胞是红系细胞谱系的细胞。在一个实施方式中，组合物抑制BCL11A表达。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，将胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞或造血祖细胞或HSC从受试者分离后，使其与本文所述的组合物接触、或与携带含有核酸序列(选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组)的核酸分子的病毒或载体接触、或与表达本文所述的合成的BCL11A microRNA的病毒或载体接触。
成熟血细胞的寿命有限，必须在整个生命中将其连续替换。血细胞由非常小的多能造血干细胞(HSC)群的增殖和分化产生，多能造血干细胞群也具有通过自我更新以补充自身的能力。HSC是从中胚层成血管细胞(hemangioblast)发育而来的多能、自我更新的祖细胞。HSC是产生所有其它血细胞的血细胞，包括来自红系细胞谱系、淋巴谱系和骨髓谱系的所有分化的血细胞。HSC位于成体骨髓、外周血和脐带血中。
在分化期间，HSC的后代在达到成熟前经历各种中间成熟阶段，产生多能造血祖细胞和谱系定向造血祖细胞。骨髓(BM)是人体内血细胞生成的主要部位，在正常条件下，仅有少量HSC和造血祖细胞可见于外周血(PB)。用细胞因子(特别是粒细胞集落刺激因子；G-CSF)、用于癌症治疗的骨髓抑制药物以及破坏造血细胞和BM基质细胞之间的相互作用的化合物进行处理可快速动员大量干细胞和祖细胞进入循环。
本文所使用的术语“造血祖细胞”是指产生所有血细胞类型的造血干细胞谱系的细胞，所述血细胞类型包括骨髓谱系(单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突细胞)以及淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。“红系细胞谱系的细胞”表示接触的细胞为经历红细胞生成从而在最终分化中形成红细胞或红血细胞(RBC)的细胞。此类细胞属于起源于骨髓造血祖细胞的三个谱系(红系细胞谱系、淋巴谱系和骨髓谱系)之一。在暴露于特定生长因子和造血微环境的其它成分后，造血祖细胞可以经过一系列中间分化细胞类型(红系细胞谱系的所有中间体)而成熟变为RBC。因此，本文所使用的术语“红系细胞谱系”的细胞包括造血祖细胞、原红细胞(rubriblasts)、早幼红细胞(prorubricytes)、成红细胞、晚幼红细胞(metarubricytes)、网织红细胞和红细胞。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，造血祖细胞具有造血祖细胞特征性细胞表面标志物中的至少一种：CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-和C-kit/CD117+。优选地，造血祖细胞具有这些标志物中的数种。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，红系细胞谱系的造血祖细胞具有红系细胞谱系特征性细胞表面标志物：CD71和Ter119。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，HSC具有造血祖细胞特征性细胞表面标志物中的至少一种：CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-和C-kit/CD117+。
HSC(类似于造血祖细胞)能够增殖并生成具有能够生产大量母细胞的能力的更多祖细胞，所述母细胞转而可生成分化的子细胞或可分化的子细胞(daughter cells)。子细胞本身可被诱导增殖，并产生后续分化成一种或多种成熟细胞类型的后代，同时还保留了具有亲代发育潜力的一个或多个细胞。然后，术语“干细胞”是指在特定环境下具有分化为更特化的表型或更分化的表型的能力或潜力、并在某些环境下保留其增殖而基本上不分化的能力的细胞。在一个实施方式中，术语祖细胞或干细胞是指广义的(generalized)母细胞，其子代(后代)通过分化(例如，通过获得完全个体特征)发生特化(通常向不同的方向)，如在胚胎细胞和组织的逐步分异(progressive diversification)中所发生的。细胞分化是复杂的过程，通常通过许多细胞分裂而发生。分化的细胞可能来源于专能细胞(multipotent cell)，所述专能细胞本身来源于专能细胞等。虽然这些专能细胞中的每个均可被认为是干细胞，各自可产生的细胞类型的范围可发生极大变化。一些分化的细胞仍具有生成具有更大发育潜能的细胞的能力。这种能力可以是天然的，或者可以通过用各种因子处理来人工诱导。在许多生物学情况中，干细胞也是“专能的”，因为它们可以产生多于一种的不同细胞类型的后代，但这并不是“干性(stem-ness)”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一经典部分，并且当用于本文中时，这一点很关键。从理论上讲，自我更新可以通过两种主要机制中的任一种而发生。干细胞可不对称地分裂，一个子代保持干(stem)的状态，而另一子代表达一些不同的其它特定功能和表型。或者，群中的一些干细胞可对称地分裂成两个干细胞，从而在群中保留作为整体的一些干细胞，而群中的其它细胞仅生成分化的后代。通常，“祖细胞”具有更原始的细胞表型(即，相比完全分化的细胞，祖细胞在发育途径或进程中处于更为早期的步骤)。通常，祖细胞也具有显著或非常高的增殖潜能。祖细胞可生成多个不同的分化细胞类型或生成单一的分化细胞类型，这取决于发育途径以及细胞发育和分化的环境。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，造血干细胞或造血祖细胞收集自外周血、脐带血、绒膜绒毛、羊水、胎盘血或骨髓。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞或骨髓细胞收集自外周血、脐带血、绒膜绒毛、羊水、胎盘血或骨髓。
由于技术上易于收集以及移入所需时间更短，外周血祖细胞(PBPC)已成为用于同种异体和自体移植的造血祖细胞的优选来源。传统上，已将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)用于刺激更多的PBPC并从骨髓释放造血祖细胞。虽然使用G-CSF的方案通常成功地从健康供体收集足够数量的PBPC，但5％-10％动员干细胞的效果很差，并且可能需要多次大体积单采血液成分(apheresis)或骨髓采集。
在本文所述的任何方法的一些实施方式中，在接触之前，对胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、或造血祖细胞或HSC进行CD34+表面标志物选择。
因此，在本文所述的任何方法的一个实施方式中，使分离的CD34+胚胎干细胞、分离的CD34+体干细胞、分离的CD34+祖细胞、分离的CD34+骨髓细胞、分离的CD34+造血祖细胞或分离的CD34+HSC与本文所述的组合物接触、或与携带含有核酸序列(选自于由SEQ IDNO:1-10、13-18、25-44所组成的组)的核酸分子的病毒或载体接触、或与表达本文所述的合成的BCL11A microRNA的病毒或载体接触。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，在与本文所述的组合物、或与携带含有核酸序列(选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组)的核酸分子的病毒或载体、或与表达本文所述的合成的BCL11AmicroRNA的病毒或载体进行任何接触之前，将胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、或造血祖细胞或HSC冷冻保存。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，接触是体外、离体或体内接触。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，将接触重复至少一次。也就是说，在使胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞或造血祖细胞或HSC与本文所述的组合物、或与携带含有核酸序列(选自于由SEQ IDNO:1-10、13-18、25-44所组成的组)的核酸分子的病毒或载体、或与表达本文所述的合成的BCL11A microRNA的病毒或载体进行首次接触后，对细胞进行洗涤，然后使洗涤的细胞与本文所述的组合物、或与携带含有核酸序列(选自于由SEQID NO:1-10、13-18、25-44所组成的组)的核酸分子的病毒或载体、或与表达本文所述的合成的BCL11A microRNA的病毒或载体进行二次接触。
在其它实施方式中，在首次接触后将接触重复至少两次。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，在接触后，在使用(例如离体扩增和/或移植到受试者中)之前，对接触的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞或造血祖细胞或HSC进行冷冻保存。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，在接触后，在使用(例如冷冻保存和/或移植/移入到受试者中)之前，对接触的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞或造血祖细胞或HSC进行离体培养扩增。
在本文所述的任何方法的一个实施方式中，在接触后，在使用(例如冷冻保存和/或移植/移入到受试者中)之前，对接触的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞或造血祖细胞或HSC进行离体培养分化。
在细胞个体发生的背景下，形容词“分化的(differentiated/differentiating)”是相对的概念。“分化细胞”是比与它进行比较的细胞的发育途径进展更深远的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制的前体细胞(如造血祖细胞)，其转而可进一步向深远的途径分化为其它类型的前体细胞(如红细胞前体)，然后分化为终末期分化细胞(如红细胞)，其在特定组织类型中起特征性作用，并可能会或可能不会保留进一步增殖的能力。
在一个实施方式中，BCL11A表达的抑制剂是BCL11A特异性RNA干扰试剂或编码所述BCL11A特异性RNA干扰试剂的载体。在一个具体实施方式中，RNA干扰试剂包含SEQ IDNO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种。
本文所述的“核酸”可为RNA或DNA，可为单链的或双链的，并例如可选自于包括以下物质的组：编码感兴趣的蛋白的核酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如肽核酸(PNA)、伪互补PNA(pseudo-complementary PNA，pc-PNA)以及锁核酸(locked nucleic acid，LNA)。例如，此类核酸序列包括但不限于编码蛋白(例如，用作转录阻遏物的蛋白)的核酸序列、反义分子、核酶、小抑制性核酸序列，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、microRNAi(miRNA)以及反义寡核苷酸。
如本文所公开的，本发明的一个目的是提供用于增加受试者中的胎儿血红蛋白水平的方法。
因此，本发明的一个方面提供了用于增加有需要的受试者中的胎儿血红蛋白水平的方法，所述方法包括以下步骤：使受试者中的造血祖细胞或HSC与有效量的包含BCL11A抑制剂的组合物接触，由此，相对于该接触之前的表达，HbF表达增加。在一个实施方式中，BCL11A抑制剂是RNA干扰试剂，所述RNA干扰试剂包含SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种或本文所述的合成的BCL11A microRNA。
关于使受试者中的细胞与BCL11A抑制剂接触，“增加受试者中的HbF水平”表示相比不存在BCL11A抑制剂的可比的对照群，用BCL11A抑制剂处理的群中受试者中的HbF高至少5％。优选地，相比可比对照处理的受试者，BCL11A抑制剂处理的受试者中的胎儿血红蛋白表达高至少10％、高至少20％、高至少30％、高至少40％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少1倍、高至少2倍、高至少5倍、高至少10倍、高至少100倍、高至少1000倍或高更多。术语“可比对照处理的受试者”在本文中用于描述除添加非靶向寡核苷酸这一例外，进行了相同处理的受试者。
因此，在一个实施方式中，受试者已诊断患有血红蛋白病。在进一步的实施方式中，血红蛋白病是SCD。如本文所使用的，SCD可以是镰状细胞贫血、镰状血红蛋白C疾病(HbSC)、镰状β加上地中海贫血(HbS/β+)或镰状β-0-地中海贫血(HbS/β0)。在另一优选的实施方式中，血红蛋白病是THAL。
根据本发明的治疗通过增加个体中胎儿血红蛋白的量而使与紊乱相关的一个或多个症状得到改善。通常与血红蛋白病有关的症状包括例如贫血、组织缺氧、器官功能障碍、异常血细胞比容值、无效的红细胞生成、异常网织红细胞(红细胞)计数、异常铁负荷、存在环状铁粒幼红细胞(ring sideroblasts)、脾肿大、肝肿大、受损的外周血流、呼吸困难、增加的溶血、黄疸、贫血性疼痛危机(anemic pain crises)、急性胸部综合征、脾隔离症(splenic sequestration)、阴茎异常勃起、中风、手足综合征以及疼痛(如心绞痛)。
在一个实施方式中，对造血祖细胞或HSC进行离体或体外接触，并将所述细胞或其后代给予受试者。在进一步的实施方式中，造血祖细胞是红系细胞谱系的细胞。
在一个实施方式中，使造血祖细胞或HSC与包含BCL11A抑制剂和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物接触。在一个实施方式中，通过注射、输注、滴注或摄食(ingestion)来给予组合物。在一个实施方式中，通过直接注射到骨髓中来给予组合物。
在所述任一种方法的一个实施方式中，将基因治疗方法用于治疗、预防或改善血红蛋白病，所述血红蛋白病选自于由以下疾病所组成的组：血红蛋白C疾病、血红蛋白镰状细胞疾病(SCD)、镰状细胞贫血、遗传性贫血、地中海贫血、β-地中海贫血、重型地中海贫血、中间型地中海贫血、α-地中海贫血和血红蛋白H疾病。
在所述任一种方法的各种实施方式中，通过直接注射将逆转录病毒载体体内给予需要基因治疗的受试者的细胞、组织或器官。在所述任一种方法的各种其它实施方式中，用本发明的载体对细胞进行体外或离体转导，并任选地进行离体扩增。然后，将转导的细胞给予需要基因治疗的受试者。
本文所使用的“受试者”包括表现出可用本文其它地方所公开的基因治疗载体、基于细胞的疗法以及方法治疗的单基因疾病、紊乱或病症的症状的任何动物。在优选的实施方式中，受试者包括表现出可用本文所考虑的基因治疗载体、基于细胞的疗法以及方法治疗的造血系统的疾病、紊乱或病症(例如血红蛋白病)的症状的任何动物。合适的受试者(例如患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人灵长类动物，优选人患者。典型的受试者包括表现出可通过基因治疗调控的异常量(低于或高于“正常”或“健康”受试者的量)的一种或多种生理活动的动物。
在一个实施方式中，本文所使用的“治疗(treating/treatment)”包括对疾病或病理病症的症状或病理的任何有益或期望的效果，可包括治疗的疾病或病症的一个或多个可测量的标志物中甚至最低限度的降低。在另一实施方式中，治疗可涉及任选地减轻或改善疾病或病症的症状、或延迟疾病或病症的进展。“治疗”并不必然表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。
在一个实施方式中，本文所使用的“预防”(“prevent”以及类似的诸如“prevented”、“preventing”等词语)表示用于预防、抑制或降低疾病或病症发生或复发可能性的方法。在另一实施方式中，该术语是指延迟疾病或病症发作或复发、或延迟疾病或病症的症状发生或复发。在另一实施方式中，本文所使用的“预防”以及类似的词语包括在疾病或病症发作或复发之前，降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
在所述任一种方法的一个实施方式中，所述方法进一步包括选择需要所述基因治疗的受试者。例如，表现出血红蛋白病的症状或细胞学的受试者，所述血红蛋白病选自于由以下疾病所组成的组：血红蛋白C疾病、血红蛋白镰状细胞疾病(SCD)、镰状细胞贫血、遗传性贫血、地中海贫血、β-地中海贫血、重型地中海贫血、中间型地中海贫血、α-地中海贫血和血红蛋白H疾病。或者，受试者携带与血红蛋白病相关的基因突变(本文所述的基因突变)。例如，通过电泳而诊断为是具有基因型HbSS的SCD、HbS/β0地中海贫血、HbSD或HbSO和/或HbF<10％的受试者。
在所述任一种方法的各种实施方式中，将含有有效量的本文所考虑的基因修饰细胞的细胞群给予需要基因治疗的受试者。即表达SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种或本文所述的合成的BCL11A microRNA的基因修饰细胞。
本文所使用的术语“量”是指实现有益的或期望的预防或治疗结果(包括临床结果)的病毒或转导的治疗细胞的“有效量”。
“预防有效量”是指有效实现期望的预防结果的病毒或转导的治疗细胞的量。通常但不是必需的，由于预防剂量是在疾病的早期阶段之前或在疾病的早期阶段在受试者中使用，因此预防有效量小于治疗有效量。
病毒或转导的治疗细胞的“治疗有效量”可根据以下因素变化：例如，个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在该个体中引发期望应答的能力。治疗有效量也是其中的治疗有益作用超过病毒或转导的治疗细胞的任何毒性作用或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如患者)的量。
在一个实施方式中，本发明提供了向受试者提供转导细胞的方法，所述方法包括将用本文所考虑的载体转导的一种或多种细胞例如胃肠外给予受试者。在一个实施方式中，载体是携带SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种或本文所述的合成的BCL11A microRNA的载体。
在具体的实施方式中，提供了预防、改善或治疗受试者中的血红蛋白病的方法。该方法包括给予包含用本文所考虑的载体转导的造血细胞的细胞群。在一个实施方式中，载体是携带SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种或本文所述的合成的BCL11A microRNA的载体。
在具体的实施方式中，给予受试者的细胞群包括：造血干细胞或祖细胞、原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞、多染性红细胞和红细胞(RBC)或它们的任何组合，可通过本文所考虑的载体对任意比例的所述细胞进行基因修饰。在一个实施方式中，载体是携带SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种或本文所述的合成的BCL11A microRNA的载体。
可将基因修饰细胞作为骨髓或脐带血移植的一部分给予已经历或尚未经历骨髓消融治疗的个体。在一个实施方式中，将本文所考虑的基因修饰细胞在骨髓移植中给予已经历化学消融或放射消融骨髓治疗的个体。
在一个实施方式中，将一定剂量的基因修饰细胞静脉内递送至受试者。在一个实施方式中，将基因修饰的造血细胞静脉内给予受试者。
在具体的实施方式中，患者在单次静脉内剂量中接受以下剂量的基因修饰细胞(例如造血干细胞)：约1×105个细胞/kg、约5×105个细胞/kg、约1×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6×106个细胞/kg、约7×106个细胞/kg、约8×106个细胞/kg、约9×106个细胞/kg、约1×107个细胞/kg、约5×107个细胞/kg、约1×108个细胞/kg或更多。在一些实施方式中，患者在单次静脉内剂量中接受以下剂量的基因修饰细胞(例如造血干细胞)：至少1×105个细胞/kg、至少5×105个细胞/kg、至少1×106个细胞/kg、至少2×106个细胞/kg、至少3×106个细胞/kg、至少4×106个细胞/kg、至少5×106个细胞/kg、至少6×106个细胞/kg、至少7×106个细胞/kg、至少8×106个细胞/kg、至少9×106个细胞/kg、至少1×107个细胞/kg、至少5×107个细胞/kg、至少1×108个细胞/kg或更多。
在额外的实施方式中，患者接受以下剂量的基因修饰细胞(例如造血干细胞)：约1×105个细胞/kg至约1×108个细胞/kg、约1×106个细胞/kg至约1×108个细胞/kg、约1×106个细胞/kg至约9×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg至约8×106个细胞/kg、约2×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg至约4×108个细胞/kg，或任何干扰剂量的细胞/kg。
在各种实施方式中，本发明的方法提供了相比现有方法而言更健全和更安全的基因治疗，并包括给予受试者包含约5％转导细胞、约10％转导细胞、约15％转导细胞、约20％转导细胞、约25％转导细胞、约30％转导细胞、约35％转导细胞、约40％转导细胞、约45％转导细胞或约50％转导细胞的细胞群或细胞剂量。
在一个实施方式中，本发明提供了具有扩增或增加红系细胞群的潜能的基因修饰细胞，例如干细胞，如造血干细胞。在具体的实施方式中，将造血干细胞用本发明的载体进行转导并给予需要治疗血红蛋白病的个体。造血干细胞是红系细胞的起源，因此是优选的。在一个实施方式中，载体是携带SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种或本文所述的合成的BCL11A microRNA的载体。
当涉及组合物、载体、稀释剂和试剂时，本文所使用的术语“药学上可接受的”及其语法变体可互换使用，并表示该材料能够给予至受试者或施用在受试者上而不产生不期望的生理效应(如恶心、眩晕、胃不适等)。每种载体在与制剂的其它成分相容的意义上也必须是“可接受的”。药学上可接受的载体不会促使引发针对与其混合的试剂的免疫应答，除非希望如此。包含溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备/制剂在本领域中是众所周知的，并且不必根据配方(formulation)作出限制。药物制剂包含本发明的化合物与一种或多种药学上可接受的成分的组合。载体可处于固体、半固体或液体稀释剂、霜或胶囊的形式。通常，可将此类组合物制备为可注射的液体溶液剂或混悬剂，然而，也可以制备适于在使用前在液体中形成溶液剂或混悬剂的固体形式。也可以将制剂乳化为脂质体组合物或以脂质体组合物提供。可以将活性成分与药学上可接受的并与该活性成分相容的赋形剂以适合用于本文所述的治疗方法的量相混合。合适的赋形剂例如为水、盐水、葡聚糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。此外，如果需要的话，组合物可以包含增强活性成分效力的少量辅助物质，例如，润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。本发明的治疗组合物可包含其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的盐)。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱(例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)和有机碱(如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等)。生理上可耐受的载体在本领域中是众所周知的。示例性液体载体是不包含除活性成分和水以外的物质的无菌水溶液，或是含有缓冲剂(例如处于生理pH值的磷酸钠)、生理盐水或这两者(例如磷酸盐缓冲盐水)的无菌水溶液。更进一步而言，水性载体可以含有多于一种的缓冲盐，以及盐(例如氯化钠和氯化钾)、葡聚糖、聚乙二醇和其它溶质。液体组合物还可以在水的基础之上和在排除水的情况下包含液相。示例性的此类另外的液相为甘油、植物油(如棉籽油)和水-油乳剂。本发明中使用的将在特定紊乱或病症的治疗中有效的活性试剂的量将取决于所述紊乱或病症的性质，并可以通过标准临床技术来确定。短语“药学上可接受的载体或稀释剂”意为涉及将主题试剂从身体的一个器官或部分携带或运输到身体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或辅料，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。
在所述任何方法的一个实施方式中，本文所使用的“给予/给药”是指通过使得BCL11A抑制剂至少部分定位至期望位点的方法或途径将该抑制剂置于受试者中。抑制BCL11A的试剂可通过在受试者中实现有效治疗的任何适当途径给予，即给予导致递送至受试者中的期望位点，其中，所递送的抑制BCL11A的组合物的至少一部分(即至少一种试剂)在期望位点上一段时间内具有活性。给予受试者后，抑制剂的活性时间段取决于体内半衰期，可为短短几小时(如至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时)至数天、乃至长达数年。给予模式包括注射、输注、滴注或摄食。“注射”包括但不限于：静脉内注射和输注、肌内注射和输注、动脉内注射和输注、鞘内注射和输注、室内注射和输注、囊内注射和输注、眶内注射和输注、心内注射和输注、皮内注射和输注、腹膜内注射和输注、经气管注射和输注、皮下注射和输注、表皮下注射和输注、关节内注射和输注、囊下注射和输注、蛛网膜下注射和输注、脊柱内注射和输注、脑脊髓内注射和输注以及胸骨内注射和输注。
在一个实施方式中，将本文所述的组合物、或携带含有核酸序列(选自于由SEQ IDNO:1-10、13-18、25-44所组成的组)的核酸分子的病毒或载体、或表达本文所述的合成的BCL11A microRNA的病毒或载体注射到骨髓中。
在一个实施方式中，使来自需要治疗的受试者的造血祖细胞或HSC与抑制BCL11A表达的组合物接触。在其它实施方式中，组合物包含携带含有核酸序列(选自于由SEQ IDNO:1-10、13-18、25-44所组成的组)的核酸分子的病毒或载体、或表达本文所述的合成的BCL11A microRNA的病毒或载体。需要治疗的受试者是诊断患有血红蛋白病(例如SCD或THAL)的受试者。
“抑制BCL11A表达”意为相比其中不存在BCL11A抑制剂的可比对照群，用BCL11A抑制剂处理的群中BCL11A的表达量低至少5％。优选地，相比其中未添加BCL11A抑制剂的可比对照处理群，BCL11A抑制剂处理的群中BCL11A表达的百分比低至少10％、低至少20％、低至少30％、低至少40％、低至少50％、低至少60％、低至少70％、低至少80％、低至少90％、低至少1倍、低至少2倍、低至少5倍、低至少10倍、低至少100倍、低至少1000倍或低更多。
在一个实施方式中，核酸是BCL11A特异性RNA干扰试剂或编码RNA干扰试剂的载体。在一个实施方式中，RNA干扰试剂包含SEQ ID NO:1-10、13-18、25-44的核苷酸序列中的一种或多种。
作为治疗受试者或降低受试者中血红蛋白病发展风险的方法的实例，所述方法包括给予受试者含有修饰的工程化细胞的组合物，所述细胞包含携带选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11A microRNA的载体。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行识别。在另一实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的经识别的受试者进行选择。
作为治疗受试者或降低受试者中血红蛋白病发展风险的方法的另一实例，所述方法包括以下步骤：动员受试者中的造血干细胞和造血祖细胞；从所述受试者采集和收集外周血，从外周血中阳性选择CD34+细胞，用携带选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11A microRNA的载体体外转导或转染CD34+选择的细胞；洗涤转导的CD34+选择的细胞；以及将所述细胞给予受试者。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行识别。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行选择。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养扩增。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养分化。
作为治疗受试者或降低受试者中血红蛋白病发展风险的方法的另一实例，所述方法包括以下步骤：动员供体受试者中的造血干细胞和造血祖细胞；从供体受试者采集和收集外周血，从外周血中阳性选择CD34+细胞，用携带选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11A microRNA的载体体外转导或转染CD34+选择的细胞；洗涤转导的CD34+选择的细胞；以及将所述细胞给予受体受试者。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受体受试者进行选择。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受体受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养扩增。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受体受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养分化。
作为治疗受试者或降低受试者中血红蛋白病发展风险的方法的另一实例，所述方法包括以下步骤：从受试者的骨髓采集和收集血液，从骨髓血中阳性选择CD34+细胞，用携带选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11AmicroRNA的载体体外转导或转染CD34+选择的细胞；洗涤转导的CD34+选择的细胞；以及将所述细胞给予受试者。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行识别。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行选择。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养扩增。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养分化。
作为治疗受试者或降低受试者中血红蛋白病发展风险的方法的另一实例，所述方法包括以下步骤：从供体受试者的骨髓采集和收集血液，从骨髓血中阳性选择CD34+细胞，用携带选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11A microRNA的载体体外转导或转染CD34+选择的细胞；洗涤转导的CD34+选择的细胞；以及将所述细胞给予受体受试者。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受体受试者进行识别。在一个实施方式中，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受体受试者进行选择。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受体受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养扩增。在另一实施方式中，所述方法进一步包括在给予受体受试者之前，对洗涤、转导的CD34+选择的细胞进行体外培养分化。
在一个实施方式中，本公开提供了修饰的工程化细胞，所述细胞包含选自于由SEQID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11A microRNA。
在一个实施方式中，本公开提供了已用载体转导或转染的修饰的工程化细胞，所述载体包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11A microRNA。在一个实施方式中，载体是慢病毒。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗受试者或降低受试者中血红蛋白病发展风险的方法，所述方法包括给予已用载体转导或转染的修饰的工程化细胞，所述载体包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11AmicroRNA。在一个实施方式中，载体是慢病毒。
在一个实施方式中，本公开提供了治疗受试者或降低受试者中血红蛋白病发展风险的方法，所述方法包括给予修饰的工程化细胞，所述细胞包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核酸序列或本文所述的BCL11A microRNA。
在一个实施方式中，修饰的工程化细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
在一个实施方式中，修饰的工程化细胞是已从胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞分化的细胞。
在一个实施方式中，修饰的工程化细胞是已分化为红系细胞谱系的细胞。
在一个实施方式中，修饰的工程化细胞是已分化为红细胞的细胞。
在一个实施方式中，修饰的工程化细胞是CD34+细胞。
本发明可在任何下述编号段落中进行定义。
1.一种合成的BCL11A microRNA，所述合成的BCL11A microRNA包含在5’至3’方向以串联方式排列的第一BCL11A片段、环片段；以及第二BCL11A片段，其中，所述环片段处于所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段之间并直接连接至所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段；以及其中，所述第二BCL11A片段与所述第一BCL11A片段互补，从而使得所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段碱基配对以形成发夹环，所述环片段形成由此形成的所述发夹环的环部分。
2.如段落1所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段为约18个至25个核苷酸长。
3.如段落1或2所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段含有源自于BCL11A mRNA序列的序列。
4.如段落1-3中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段与所述第二BCL11A片段互补。
5.如段落1-4中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段在5’端以-GCGC-起始；所述第二BCL11A片段在3’端以-GCGC-结束。
6.如段落1-5中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段选自于由以下所组成的组：
CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:46；源自于本文所述的BCL11A miR1寡核苷酸)、CCAGAGGATGACGATTGTTTA(SEQ.ID.NO:47；源自于本文所述的BCL11A miR2寡核苷酸)、TCGGAGACTCCAGACAATCGC(SEQ.ID.NO:48；源自于本文所述的BCL11A E3寡核苷酸或shRNA1或E3)、CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC(SEQ.ID.NO:49；源自于本文所述的shRNA2或B5)、TCAGGACTAGGTGCAGAATGT(SEQ.ID.NO:50；源自于本文所述的shRNA4或B11)、TTCTCTTGCAACACGCACAGA(SEQ.ID.NO:51；源自于本文所述的BCL11A D8寡核苷酸或shRNA3或D8)、GATCGAGTGTTGAATAATGAT(SEQ.ID.NO:52；源自于本文所述的shRNA5或50D12或D12)、CAGTACCCTGGAGAAACACAT(SEQ.ID.NO:53；源自于本文所述的shRNA5或50A5)、CACTGTCCACAGGAGAAGCCA(SEQ.ID.NO:54；源自于本文所述的shRNA7或50B11)、ACAGTACCCTGGAGAAACACA(SEQ.ID.NO:55；源自于本文所述的BCL11A XLC4、shRNA8和50C4)、CAACAAGATGAAGAGCACCAA(SEQ.ID.NO:56；源自于本文所述的BCL11A非靶向寡核苷酸)、gcgcCGCACAGAACACTCATG(SEQ.ID.NO:57；源自于本文所述的miR1G5寡核苷酸)、GCGCTCGGAGACTCCAGACAA(SEQ.ID.NO:58；源自于本文所述的E3G5或E3 mod寡核苷酸或shRNA1mod)、gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAA(SEQ.ID.NO:59；源自于本文所述的B5G5或shRNA2mod)、gcgcTCAGGACTAGGTGCAGA(SEQ.ID.NO:60；源自于本文所述的B11G5或shRNA4mod)、gcgcGATCGAGTGTTGAATAA(SEQ.ID.NO:61；源自于本文所述的50D12G5、D12G4或shRNA5mod)、gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC(SEQ.ID.NO:62；源自于本文所述的50A5G5或shRNA6mod)、gcgcCACTGTCCACAGGAGAA(SEQ.ID.NO:63；源自于本文所述的50B11G5或shRNA7mod)、GCGCTTCTCTTGCAACACGCA(SEQ.ID.NO:64；源自于本文所述的BCL11A D8G5或D8mod或shRNA3mod)、GCGCACAGTACCCTGGAGAAA(SEQ.ID.NO:65；源自于本文所述的BCL11AC4G5或C4 mod或shRNA8mod)、CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:66；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)以及ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:67；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)。
7.如段落1-6中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述环片段源自于microRNA。
8.如段落7所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述microRNA是造血特异性microRNA。
9.如段落8所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述microRNA是miR223。
10.如段落9所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述环片段是ctccatgtggtagag。
11.如段落1-10中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述microRNA包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核苷酸序列。
12.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括在所述受试者中体内表达至少一种如段落1-11中任一项所述的合成的BCL11A microRNA。
13.如段落12所述的方法，其中，所述体内表达发生在所述受试者中的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中。
14.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：在所述受试者的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中表达至少一种如段落1-11中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述表达是离体表达；以及将所述细胞植入所述受试者。
15.一种增加细胞表达的胎儿血红蛋白水平的方法，所述方法包括在细胞中表达至少一种如段落1-11中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
16.如段落12-15中任一项所述的方法，其中，将至少一种所述合成的BCL11AmicroRNA可操作地连接至启动子，并构建在载体中以用于真核细胞中的表达。
17.如段落12-16中任一项所述的方法，其中，至少一种所述合成的BCL11AmicroRNA从RNA II聚合酶表达。
18.如段落12-17中任一项所述的方法，其中，至少一种所述合成的BCL11AmicroRNA不从RNA III聚合酶表达。
19.如段落18所述的方法，其中，所述启动子选自于由以下启动子所组成的组：
脾病灶形成病毒启动子、四环素诱导型启动子、或β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子。
20.如段落16-19中任一项所述的方法，其中，所述载体是病毒。
21.如段落20所述的方法，其中，所述病毒是慢病毒。
22.如段落21所述的方法，其中，所述慢病毒选自于由以下病毒所组成的组：
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
23.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核苷酸序列。
24.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
25.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
26.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
27.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
28.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
29.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
30.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
31.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
32.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
33.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
34.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
35.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
36.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
37.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
38.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
39.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
40.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
41.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
42.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列。
43.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列。
44.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
45.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列。
46.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列。
47.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
48.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列。
49.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列。
50.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列。
51.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
52.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:38的核苷酸序列。
53.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:39的核苷酸序列。
54.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。
55.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
56.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列。
57.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列。
58.如段落23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
59.包含如段落23所述的分离的核酸分子的载体。
60.如段落59所述的载体，其中，所述载体进一步包含脾病灶形成病毒启动子、四环素诱导型启动子、或β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子。
61.包含如段落59或60所述的载体的宿主细胞。
62.如段落61所述的细胞，其中，所述细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
63.如段落61所述的细胞，其中，所述细胞是红细胞。
64.包含如段落23所述的分离的核酸分子的细菌。
65.包含如段落23所述的分离的核酸分子的病毒。
66.如段落65所述的病毒，其中，所述病毒是慢病毒。
67.如段落66所述的病毒，其中，所述慢病毒选自于由以下病毒所组成的组：
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
68.一种组合物，所述组合物包含：如段落1-58中任一项所述的分离的核酸分子、如段落59或60所述的载体、如段落61-63中任一项所述的宿主细胞或如段落65-67中任一项所述的病毒。
69.一种组合物，所述组合物包含：如段落59或60所述的载体、如段落61-63中任一项所述的宿主细胞或如段落65-67中任一项所述的病毒。
70.如段落68或69所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
71.用于治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的如段落68-70中任一项所述的组合物。
72.用于制造治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的药物的如段落68-70中任一项所述的组合物。
73.用于增加细胞表达的胎儿血红蛋白水平的如段落68-70中任一项所述的组合物。
74.如段落73所述的组合物，其中，所述细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
75.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：给予所述受试者治疗有效量的如段落1-58中任一项所述的分离的核酸分子、如段落59或60所述的载体、如段落61-63中任一项所述的宿主细胞或如段落65-67中任一项所述的病毒，从而治疗所述受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险。
76.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：给予所述受试者治疗有效量的如段落68-74中任一项所述的组合物，从而治疗所述受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险。
77.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括增加所述受试者中的细胞表达的胎儿血红蛋白水平。
78.如段落75-77中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行选择。
79.如段落78所述的方法，其中，所述血红蛋白病是镰状细胞疾病或地中海贫血。
80.如段落75-80中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予所述受试者包含氧、羟基脲、叶酸或血液输注的治疗。
在以下实施例中对本发明进行进一步描述，以下实施例并不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
材料和方法
典型的PCR反应条件如下：1×反应缓冲液(由1.5mM、3.0mM、4.5mM(终浓度)MgCl2组成)；各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP；25pmol的各引物；50ng模板DNA；总体积为100μl的3％-10％(v/v)DMSO以将结构溶解(这是任选的)。
以下是热循环仪上用于PCR反应的典型反应条件或设置：94℃3min-5min，在此期间添加1U DNA聚合酶或在冰上建立反应，然后当上升至94℃时将管置于PCR仪中；接着是94℃1min、60℃1min和70℃1min进行25个循环；以及结束于4℃，直到使用PCR试样为止。
实施例1
制造合成的miR
构建了三种不同的合成的miR，其中两种在不同位点靶向BCL11A，第三种(非靶向)用作对照。将这些miR的每个插入组成型表达载体、TET诱导型载体和红系细胞特异性载体中。
通过使互补的寡核苷酸退火来制备miR，所述寡核苷酸具有4个碱基对的5’重叠，该重叠对应于BbsI限制性消化留下的粘性末端。
BCL11A miR1寡核苷酸：
正义链
ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGAG(SEQID NO：1)
反义链
CGCACTCGCACAGAACACTCATGGATTctctaccacatggagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGA(SEQID NO：2)
BCL11A miR2寡核苷酸：
正义链
ACCCTCCAGAGGATGACGATTGTTTActccatgtggtagagTAAACAATCGTCATCCTCTGGag(SEQID NO：3)
反义链
CGCActCCAGAGGATGACGATTGTTTActctaccacatggagTAAACAATCGTCATCCTCTGGa(SEQID NO：4)
非靶向寡核苷酸：
正义链
ACGCTCAACAAGATGAAGAGCACCAActccatgtggtagagTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGAG(SEQID NO：11)
反义链
CGCACTCAACAAGATGAAGAGCACCAActctaccacatggagTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGA(SEQID NO：12)
使寡核苷酸对变性，然后重新退火(对于LM-PCR方案中的寡核苷酸盒)，随后使用微量离心浓缩装置纯化该盒。同时，将质粒O.6.pBKS(miR223)用BbsI消化，并通过在琼脂糖凝胶上跑胶将其纯化(未用碱性磷酸酶处理)。然后将各寡核苷酸盒连接到消化的O.6.pBKS构建体中，并转化到感受态细菌(Stb13)中。挑取细菌克隆并少量制备(mini-prepped)，以制备分离的载体。使用引物miR223 SEQ FOR和miR223 SEQ REV，用DMSO将结构溶解，对合成的miR进行测序。
miR223 SEQ FOR TAAGCTTGATATCGAATTCC(SEQ ID NO：19)
miR223 SEQ REV GCTCTAGAACTAGTGGATCC(SEQ ID NO：20)
实施例2
组成型miR载体的制造
将每个miR克隆到LeGO-V2慢病毒骨架中，从而使Venus-miR表达通过组成型SFFV启动子来驱动。
Venus cDNA的修饰。经由PCR对Venus cDNA进行扩增，以在5’端添加NaeI限制性位点(以及保持良好的Kozak共有序列)并在3’端添加NotI位点。
Venus NaeI FOR：TTgccggcATGGTGAGCAAGGGCGAGG(SEQ ID NO：21)
Venus NotI REV：TAgcggccgcTTACTTGTACAGCTGGTCC(SEQ ID NO：22)
使PCR产物在琼脂糖凝胶上跑胶，然后纯化。使用TA克隆试剂盒将纯化的PCR产物TA克隆到载体PCR 2.1 TOPO(INVITROGENTM)中。挑取细菌克隆并少量制备DNA。使用限制性消化分析来选择以下克隆：a)包含Venus PCR产物(EcoRI消化)；以及b)包含处于一定方向的克隆，其中，所添加的NotI邻近多接头(polylinker)中的NotI位点(即，以使NotI消化不切除PCR片段，而是仅使载体线性化)。然后使用M13正向引物和反向引物对这些克隆进行测序。
将miR序列插入Venus-PCR 2.1 TOPO质粒中。将Venus-PCR 2.1 TOPO质粒用NotI消化，用小牛肠碱性磷酸酶处理，然后在琼脂糖凝胶上跑胶并纯化。通过用NotI和PspOMI双重消化来将合成的miR构建体从O.6.pBKS质粒切除，接着通过琼脂糖凝胶提取纯化。将消化的miR插入物连接到Venus-PCR 2.1 TOPO质粒中，并使用连接产物来转化感受态细菌(Stb13)。挑取单个细菌克隆并少量制备。对包含处于正确方向的miR插入物(即当用NotI和NaeI消化时产生完整片段)的质粒进行选择。
将Venus-miR盒插入LeGO-V2中。通过用NotI和NaeI双重消化来将Venus-miR盒从PCR 2.1 TOPO切除，接着用Klenow大片段处理以钝化NotI突出(overhang)。通过琼脂糖凝胶提取纯化该盒。用BamHI和EcoRI消化LeGO-V2或LeGO G2，该消化释放Venus/eGFP cDNA。用Klenow大片段处理该线性化载体以钝化EcoRI和BamHI突出，接着通过琼脂糖凝胶电泳纯化载体。将纯化的Venus-miR盒和LeGO载体连接在一起，并将产物用于转化感受态细菌。挑取单个细菌克隆并少量制备DNA。对包含处于正确方向的插入物的克隆进行选择，对其进行培养并用于大量制备，以制造病毒上清液。
实施例3
红系细胞特异性miR载体的制造
将聚腺苷酸化信号连接至上述制造的Venus-miR盒。将所得的Venus-miR-PolyA盒以反义方向插入红系细胞特异性pRRL-HS3-HS2-B-珠蛋白慢病毒载体(Guilianna Ferrari提供)中。
BGH聚腺苷酸化信号的修饰。经由PCR对BGH polyA信号进行扩增，以在5’端保持PspOMI限制性位点，并在3’端添加NaeI和NotI位点。
BGHpA PspOMI FOR：CGCTCGAGCATGCATCTAGAGG(SEQ ID NO：23)
BGHpA NaeI/NotI REV：
TTgcggccgccggcCGCGCTTAATGCGCCGCTACAG(SEQ ID NO：24)
使PCR产物在琼脂糖凝胶上跑胶，然后纯化。使用TA克隆试剂盒将纯化的PCR产物TA克隆到载体PCR 2.1 TOPO(INVITROGENTM)中。挑取细菌克隆并少量制备DNA。使用限制性消化分析，选择含有BGHpA PCR产物(EcoRI消化和/或NotI/PspOMI双重消化)的克隆。使用M13正向引物和反向引物对这些克隆进行测序。
将BGHpA序列插入上述制造的Venus-miR-PCR 2.1 TOPO质粒中。通过用PspOMI和NotI消化来将BGHpA盒从PCR 2.1 TOPO切除，接着通过琼脂糖凝胶提取来将插入物纯化。将上述步骤B2中制造的Venus-miR-PCR 2.1 TOPO构建体用NotI消化，随后用小牛肠碱性磷酸酶处理。通过在琼脂糖凝胶上跑胶来纯化线性化的Venus-miR-PCR 2.1 TOPO载体。将BGHpA插入物连接到Venus-miR-PCR 2.1 TOPO载体中，并将产物用于转化感受态细菌(Stb13)。挑取单个细菌克隆并少量制备。对包含以正确方向插入的BGHpA序列(在用NaeI消化后产生整个插入物)的质粒进行选择。
将Venus-miR-BGHpA盒插入pRRL-HS3-HS2-B-珠蛋白载体中。通过用NaeI消化来将Venus-miR-BGHpA盒从PCR 2.1 TOPO切除。通过琼脂糖凝胶电泳纯化这些插入物。将pRRL-HS3-HS2-B-珠蛋白载体用EcoRV消化并用小牛肠碱性磷酸酶处理。通过琼脂糖凝胶电泳来纯化线性化的载体。将Venus-miR-BGHpA盒连接到pRRL-HS3-HS2-B-珠蛋白中，并将连接产物用于转化感受态细菌。挑取单个细菌克隆并少量制备。对在pRRL-HS3-HS2-B-珠蛋白载体中包含处于正确方向的Venus-miR-BGHpA盒的质粒进行培养以用于大量制备，以使它们可用于产生慢病毒上清液。
实施例4
体外细胞RNA干扰实验如下进行。
用SFFV-LV(NT＝乱序shRNA，miR-2＝靶向shRNA)以MOI＝2在纤连蛋白上转导在含有FCS的IMDM中培养的鼠红白血病细胞，并对其进行Venus荧光分选。转导后的分析时间点为第7天。细胞为>95％Venus阳性，收集106个细胞并提取RNA，通过逆转录获得cDNA，并用Gapdh作为内部对照转录物，对BCL11A和ε-γ珠蛋白mRNA进行实时qPCR(图3)。采用标准曲线法使表达定量。
小鼠中的体内RNA干扰实验如下进行。
在用SFFV-LV(NT＝乱序shRNA，miR-1＝靶向shRNA)以MOI＝2在纤连蛋白上转导后，将源自于BojJ供体的LSK HSC移植到致死辐照的C57/BL6小鼠中。注射的细胞剂量为每只小鼠100,000个细胞。在4个月时将Venus阳性WBC携带动物合并(n＝2)，并在存活力染色(7-AAD)后对骨髓进行Venus荧光分选(图3)。如上进行RNA提取和qPCR。
实施例5
LCR-LV
用LCR-LV(NT＝乱序shRNA，miR-1＝靶向shRNA)以MOI＝2和MOI＝100在纤连蛋白上转导在含有FCS的IMDM中培养的鼠红白血病细胞，并对其进行Venus荧光分选。转导后的分析时间点为第7天。细胞为>95％Venus阳性，收集106个细胞并提取RNA，通过逆转录获得cDNA，并用Gapdh作为内部对照转录物，对BCL11A和ε-γ珠蛋白mRNA进行实时qPCR(图4)。采用标准曲线法使表达定量。
TET-LV
用TET-LV(NT＝乱序shRNA，miR-1＝靶向shRNA)以MOI＝2在纤连蛋白上转导在含有FCS的IMDM中培养的鼠红白血病细胞，并在暴露至不同浓度的强力霉素之后，对其进行Venus荧光分选。转导后的分析时间点为第7天。细胞为>95％Venus阳性，收集106个细胞并提取RNA，通过逆转录获得cDNA，并用Gapdh作为内部对照转录物，对ε-γ珠蛋白mRNA进行实时qPCR(图4)。采用标准曲线法使表达定量。
实施例6
从废弃的单采血液成分材料(apheresis material)(约200ml，106个CD34+细胞)中分级分离(fractionated)源自于外周血SCD患者的CD34+循环HSC。用SFFV-LV(NT＝乱序shRNA，miR-1＝靶向shRNA)以MOI＝2在纤连蛋白上转导细胞，并如由Giarratana等(NatBiotech 2005)所修改的进行分化。通过流式细胞术对细胞的红系细胞表面标志物(GPA、CD71)的成熟获得(maturational acquisition)进行分析。红系细胞连续获得成红细胞和红细胞形态，并表达Venus荧光。在终末分化阶段收集细胞，进行RNA提取和qPCR分析，以评价相比乱序(NT)对照而言由miR-1SFFV-IV进行的γ-珠蛋白mRNA诱导(图5)。
实施例7
从废弃的单采血液成分材料(约200ml，106个CD34+细胞)中分级分离源自于外周血SCD患者的CD34+循环HSC。用LCR-LV(NT＝乱序shRNA，miR-1＝靶向shRNA)以MOI＝2在纤连蛋白上转导细胞，并在未经预先分选的条件下以30,000个细胞/动物注射到亚致死辐照的NSG小鼠中。在注射后4周将动物放血、固定RBC并透化处理。进行HbF染色并识别出具有10％人HbF水平的LCR-LV-miR-1动物(图6)。
实施例8
用SFFV-LV(NT＝乱序shRNA，miR-1＝靶向shRNA)以MOI＝2在纤连蛋白上转导源自于脐带血的CD34+人HSC，并对其进行Venus荧光分选。还通过荧光显微镜在MS-5基质上对细胞进行可视化。通过由Luo等(Blood 2009)所修改的方法，使细胞沿B淋巴细胞生成通路分化。每周对细胞中成熟B淋巴细胞表面标志物的获得以及未成熟祖细胞标志物的损失进行分析，以识别经由SFFV-LV的BCL11A敲减所引起的分化中的阻断。以每周的时间点收集细胞，提取RNA以验证经由SFFV-LV-miR-1的shRNA靶向引起的BCL11A mRNA敲减(图7)。
实施例9
优化慢病毒载体RNA聚合酶II驱动的microRNA嵌入的shRNA，用于增强加工和BCL11A的高效敲减，从而诱导红系细胞中的胎儿血红蛋白。
使用经由pol III启动子表达的短发夹RNA(shRNA)的RNA干扰(RNAi)技术已被广泛用于调控各种哺乳动物细胞类型中的基因表达。为了实现mRNA的谱系特异性靶向，需要经由pol II启动子来表达shRNA，使得将shRNA嵌入哺乳动物microRNA(shRNAmiR)序列以用于表达和加工成为必需。此处，为了在造血细胞中实现BCL11A转录因子的敲减(在血红蛋白病中具有直接的转化应用)，我们对经由基于pol III vs pol II的慢病毒载体的mRNA调控效率进行了比较。BCL11A蛋白的阻遏可代表镰状细胞疾病和β-地中海贫血的治疗靶标，因为BCL11A蛋白的敲减已显示诱导胎儿HBG(γ-珠蛋白)基因的表达，最终导致胎儿血红蛋白四聚体(HbF,α2γ2)的水平增加。在小鼠中，BCL11A是代表鼠HBG同源物的鼠Hbb-y基因的关键阻遏物。本发明人表明，由于使用shRNAmiR vs pol III介导的shRNA载体骨架的降低的BCL11A敲减效率，Hbb-y诱导降低高达100-1000倍。为了理解这些差异的分子基础，本发明人对用多种shRNA-shRNAmiR对转导的细胞进行了小RNA序列分析。本发明人示出了相比polII驱动的(shRNAmiR)成熟引导链序列，经由U6pol III启动子表达的shRNA产生了具有4bp移位差异的引导链序列。RNA测序表明构成pol III终止信号一部分的尿苷延展段(stretch)被转录，并被包含在pol III载体骨架中成熟shRNA的3’端处。这些额外序列的缺失与dicer切割位点中的相应移位相关，由此产生具有替代的种子序列(在基于pol II的载体中影响靶基因敲减效率)的不同成熟shRNA。此外，在用基于pol II或pol III的载体转导的细胞中，引导链与随从链的比例和绝对丰度都显著不同。在shRNAmiR的引导链中并入4bp移位产生准确加工(与U6驱动的sh-RNA相同的成熟引导链序列)的shRNA序列，并在蛋白水平上使BCL11A敲减效率提高50％-70％，而且与鼠红白血病细胞中Hbb-y诱导的100-300倍的增强相关。发明人已经发现了用于前瞻性设计shRNAmiR载体骨架以实现靶基因的谱系特异性调节的改进策略。
实施例10
miRNA嵌入的shRNA的优化，用于谱系特异性BCL11A敲减和血红蛋白F诱导。
材料和方法
shRNA的设计和筛选
从Broad研究所(Cambridge，MA)获得表达靶向BCL11A/BCL11A mRNA的不同shRNA的U6启动子驱动的慢病毒载体(pol III-puro)。pol III-puro具有hPGK启动子驱动的嘌呤霉素选择标志物。使用Qiagen Turbocapture板在处于96孔形式的MEL细胞中对靶向XL/L形式两者或仅XL形式和3’UTR区域的超过100种shRNA进行筛选，并使用多重Taqman qRT-PCR反应测量Gapdh和Hbb-y。
shRNAmiR构建体的构建
通过将具有侧翼mir223序列的shRNA序列克隆到含有SFFV驱动的Venus报告子的慢病毒LeGO-V2载体(28)中来构建shRNAmiR载体。具有mir223环的shRNAmiR序列由genscript USA Inc.(NJ，美国)合成，并使用Xba1和BamH1位点将所得的shRNAmiR克隆到Venus编码序列下游的pol II骨架中。图21A中列出了shRNA的全部序列。设计非靶向对照shRNA序列，并将其命名为SFFV-shRNAmiRNT或缩略形式NT。将不含任何shRNA盒并经由SFFV启动子表达GFP的SFFV-GFP载体用作mock对照(33)。
病毒生产和滴定
在10cm培养皿中，通过使用磷酸钙试剂(INVITROGENTM)将10μg慢病毒转移载体、10μg gag-pol、5μg rev和2μg VSVG包装质粒共转染到HEK293T细胞中来产生慢病毒载体上清液。在转染后24h和48h收集上清液，通过0.4微米膜NY，美国)过滤，随后通过在Beckmann XL-90离心机(使用SW-28摆动桶(swinging buckets))中以23000rpm超速离心2h进行浓缩。为了测定滴度，在聚凝胺(8μg/ml)存在下用病毒感染NIH3T3细胞，并在转导后48h通过FACS的Venus表达测定(pol II构建体)或通过嘌呤霉素选择(1mg/ml，pol III构建体)进行分析。
细胞培养
将3T3、293T和MEL细胞分别维持在补充有10％胎牛血清、2％青霉素-链霉素和2mM谷氨酰胺的DULBECCO改良Eagle培养基或RPMI培养基中。
体外红系细胞分化培养
根据BCH机构审查委员会(BCH Institutional Review Board)批准的方案，从健康供体的动员外周血(Center of Excellence in Molecular Hematology at FredHutchinson Cancer Research Center，Seattle或Flow Core at Boston Children'sHospital)获得原代人CD34+细胞的冷冻储液。所使用的红系细胞分化方案基于改编自(48)的3阶段方案。在基于IMDM(Iscove改良DULBECCO培养基)的红系细胞分化培养基(EDM)中培养细胞，所述培养基补充有稳定谷氨酰胺、330μg/mL全人转铁蛋白10μg/mL重组人胰岛素2IU/mL肝素Choay和5％溶剂/去污剂病毒灭活(S/D)血浆。在扩增的第一阶段(第0天至第7天)，在10M-6M氢化可的松(HC)100ng/mL SCF(R&D SYSTEMSTM)、5ng/mL IL-3(R&D SYSTEMSTM)以及3IU/mLEpo存在下，在EDM(红系细胞分化培养基)中培养CD34+细胞。在第4天，将细胞重悬于含有SCF、IL-3、Epo和HC的EDM中。在第二阶段(第7天至第11天)，将细胞重悬于补充有SCF和Epo的EDM中。在第三阶段(第11天至第18天)中，在仅补充有Epo的EDM中培养细胞。将所述培养维持在37℃下、5％CO2的空气中。
用于体外培养的转导和流式细胞术
在聚凝胺(8μg/ml)Corp.St.Louis，MO，US)(对于MEL细胞而言)以及10μM前列腺素E2和2μg/ml聚凝胺(对于CD34+细胞而言)存在下，用表达U6-shRNA或SFFV-shRNAmiR的慢病毒载体对MEL细胞和CD34+细胞进行转导，并在室温下离心(2000rpm)2小时。在转导后48小时通过使用BD FACS Aria II(BD对活细胞进行Venus表达分选(pol II载体)或在嘌呤霉素存在下对细胞进行选择(1mg/ml，polIII构建体)。对于FACS分析，作为死细胞标志物包含7AAD(INVITROGENTM)。用别藻蓝蛋白(APC)、藻红蛋白(PE)和PE-Cyanine7缀合的抗体标记CD34+细胞。将抗CD235(血型糖蛋白A)-PE、抗CD71-APC或抗CD71-PE-Cyanine7抗体和DRAQ-5(均为用于表型分析。使用Diva或FloJoX(TREESTARTM)软件在LSR-II流式细胞仪(BECTON上进行分析。
用于小鼠移植实验的分离、转导和流式细胞术
通过冲洗CD45.1 BoyJ(B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)和CD45.2B6小鼠(C57BL/6J)的股骨、胫骨和髋部，接着使用小鼠谱系细胞耗竭试剂盒(Miltenyi，Biotec Inc.，SanDiego，美国)进行谱系耗竭，来分离谱系阴性小鼠骨髓细胞。将细胞以0.2×106个细胞/ml-1×106个细胞/ml的密度培养在100ng/ml mSCF、20ng/ml mIL-3(两者均为Rocky Hill，美国)、100ng/ml hFlt3-L和100ng/ml hTPO(两者均为Portsmouth，美国)的STEMSPANTM SFEM培养基Technologies，Vancouver，CA)中。24h预刺激后，以1×106个细胞/ml的密度以MOI 40转导细胞，并在分离后三天移植到致死辐照(7+4Gy，分次剂量)的受体中。对于竞争性再增殖实验，在移植到CD45.2或杂合CD45.1/CD45.2双阳性受体之前，将来自不同转导组的相等数量的细胞混合(每只动物0.4×106个-1×106个)。经由流式细胞术对细胞混合物进行分析，以确认两种竞争细胞部分的贡献相等，如果需要则重新调整。使用以下抗体以及可固定的存活力染料在多个时间点进行外周血、骨髓和脾的分析：CD45.1、CD45.2、B220、CD11b、CD3、CD71、Ter119。对于红系细胞谱系的分析，将红细胞裂解省略。在LSR-II或LSRFortessa流式细胞仪(BECTON和Diva或FloJoX(TreestarTM)软件上进行分析。使用Excel和GRAPHPAD5进行数据分析和统计分析。
对于hCD34细胞的移植而言，用2.7Gy照射约10周龄的雌性NSG小鼠(NOD/LtSz-scid Il2rg-/-)(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)，接着在分离后三天每只动物注射～106个细胞。用补充有的水喂食照射的小鼠14天。
RNA提取和qRT-PCR
使用RNA Plus微量试剂盒(Valencia，CA)，从分选后/用嘌呤霉素选择后第7天的MEL细胞或从CD34+细胞的红系细胞分化第18天的新鲜分选的细胞提取总RNA。使用随机六聚体引物和superscript III(INVITROGENTM，Carlsbad，CA)产生cDNA。使用Green PCRmaster mix(APPLIEDWarrington UK)以如下引物进行定量PCR：跨内含子小鼠Hbb-y和Gapdh引物(Hbb-y正向5’-TGGCCTGTGGAGTAAGGTCAA-3’、反向5’-GAAGCAGAGGACAAGTTCCCA-3’(SEQ.ID.NO:69))，(Gapdh正向5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’(SEQ.ID.NO:70)、反向5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’(SEQ.ID.NO:71))；以及人HBG、HBB和GAPDH引物(HBG正向5’-TGGATGATCTCAAGGGCAC-3’(SEQ.ID.NO:72)、反向5’-TCAGTGGTATCTGGAGGACA-3’(SEQ.ID.NO:73))，(HBB正向5’-CTGAGGAGAAGTCTGCCGTTA-3’(SEQ.ID.NO:74)、反向5’-AGCATCAGGAGTGGACAGAT-3’(SEQ.ID.NO:75))以及(GAPDH正向5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’(SEQ.ID.NO:76)、反向5’-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3’(SEQ.ID.NO:77))。PCR扩增条件为：95℃10min；接着95℃15秒和60℃1min进行40个循环。在7500仪(APPLIEDFoster City，CA)上进行qPCR。将使用连续稀释的cDNA的标准曲线用于测定每个反应的精确扩增效率。将Hbb-y和γ-珠蛋白表达水平根据作为内部对照的GAPDH进行归一化，并将相对基因表达(ΔΔCt法)用于PCR数据的分析，包括差异扩增效率的校正。
Northern印迹分析
在嘌呤霉素选择培养7天后，分选并收集用U6-shRNA和SFFV-shRNAmiR转导的MEL细胞。使用1ml试剂分离总RNA，并在15％丙烯酰胺凝胶上对15μg总RNA进行解析。使用Decade LadderAustin，TX)测定小转录物尺寸。将RNA转移至HYBONDTM-XL膜(AMERSHAMTM，Piscataway，NJ)并进行UV交联。将印迹在35℃下用UltraHyb-OligoAustin，Tx)预杂交，在37℃下用γ-32P标记的寡核苷酸(4个多核苷酸激酶；AMERSHAMTM，Piscataway，NJ)探测1小时，在30℃-35℃下在2×柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠中洗涤，并暴露至膜。用于检测成熟miRNA的探针序列如下：
shRNA1，5’CGGAGACTCCAGACAATCGC 3’(SEQ.ID.NO：78)；shRNA2，5’
CTCCAGGCAGCTCAAAGATC 3’(SEQ.ID.NO：79)；shRNA3，5’
TCTCTTGCAACACGCACAGA3’(SEQ.ID.NO：80)；shRNA4，5’
CAGGACTAGGTGcAGAATGT 3’(SEQ.ID.NO：81)；shRNA5，5’
ATCGAGTGTTGAATAATGAT3’(SEQ.ID.NO：82)；shRNA6，5’
GTACCCTGGAGAAACACAT 3’(SEQ.ID.NO：83)；shRNA7，5’
ACTGTCCACAGGAGAAGCCA 3’(SEQ.ID.NO：84)；shRNA8，5’
CAGTACCCTGGAGAAACACA 3’(SEQ.ID.NO：85)
Western印迹分析
将转导的MEL细胞和CD34+细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(SANTA CRUZ胃蛋白酶抑制剂和亮抑酶肽(SIGMA)的裂解缓冲液(RIPA)中裂解。通过BCA蛋白分析(THERMO SCIENTIFIC)对蛋白裂解物进行评估。将25μg蛋白悬浮于2×Laemmli试样缓冲液中，煮沸并加载到8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，随后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在含有0.1％Triton-X100和5％脱脂奶粉的PBS中封闭后，将PVDF膜用单克隆小鼠抗BCL11A抗体或小鼠抗β-肌动蛋白孵育。通过化学发光试剂和20×过氧化物(CELL将HRP连接的抗小鼠IgG二抗(CELL用于检测。
HPLC分析
使用水中渗透裂解和三个快速冻融循环，在分化的第18天从细胞制备溶血产物(hemolysates)。在布莱根妇女医院(Brigham and Women’s Hospital)的临床实验室中，使用临床校正的人血红蛋白标准，对裂解物进行血红蛋白电泳(使用醋酸纤维素)和高效液相色谱(HPLC)。
RNA测序和分析
根据制造商说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒(INVITROGENTM)从6×106个MEL细胞中提取小RNA，并送去进行使用Hiseq2000的深度RNA测序。将自主开发的PERL脚本用于移除接头(adaptor)序列，将19nt-25nt的小RNA用于进一步分析。将BOWTIE软件(获得自互联网网站bowtie-bio.sourceforge.net)用于比对，并允许1个错配。将小RNA表达水平根据每个文库一百万个总读取归一化，以用于不同试样之间的比较。对于在4种细胞系中使用250种TRC shRNA的实验，Broad研究所使用高通量病毒制备方案制备了慢病毒，在96孔板的每孔中用单个shRNA以高MOI将细胞感染(该方案获得自Broad研究所(Cambridge，MA，美国)的互联网网站的RNAi公共资源部分的“嘌呤霉素”下)，在感染后1天加入，并在感染后4天将细胞在中裂解。对于各细胞系，将所有裂解物合并，接着进行总RNA提取和小RNA文库制备(49)。将读取修剪(trimmed)、折叠(collapsed)成带计数的独特读取(>17nt)，并映射到TRC shRNA表达载体序列，不允许错配。对每个shRNA的成熟shRNA序列分布进行计算，然后在shRNA中进行平均。
统计分析
使用GRAPHPAD5.0软件包进行统计分析。将结果表示为平均值±标准差(SD)。通过t-检验对统计显著性进行评估。
结果
嵌入microRNA支架的shRNA(shRNAmiR)相比简单的茎环shRNA而言的降低的BCL11A敲减效率
为了识别介导BCL11A有效敲减的候选shRNA，在MEL细胞中对靶向在人和小鼠之间保守的BCL11A mRNA编码序列的118个shRNA的慢病毒文库进行了筛选。在含有用于选择的嘌呤霉素抗性基因的LKO慢病毒骨架(26)中从基于pol III的U6启动子表达shRNA(图19A，左子图)(命名为LKO-U6-BCL11A-shRNAmiR(以下称为U6-shRNA))。用表达shRNA的慢病毒载体以2的感染复数(MOI)转导MEL细胞(用于珠蛋白基因调节研究的常用细胞系)。胚胎小鼠Hbb-y mRNA(作为人γ-珠蛋白基因的功能性同源物(27))的归一化表达提供了BCL11A敲减的间接读出(图19B，y轴)。作为第二读出，还使用在Hbb-y基因座处携带mCherry敲入的MEL-报告子细胞系(D.Bauer，未公开)对shRNA池进行了筛选。通过流式细胞术对荧光报告子诱导进行分析(图19B，x轴)。将在MEL细胞中持续诱导Hbb-y和mCherry报告子表达的8种shRNA(图19B中标记并命名为shRNA1至shRNA8)克隆到人microRNA223(miR-223)侧翼和环序列中，从而创建合成的microRNA(shRNAmiR)，其目的在于开发用于BCL11A敲减的谱系特异性表达载体。对于初始分析，将该盒并入处于强且普遍表达的脾病灶形成病毒(SFFV)启动子/增强子控制下的pLeGO慢病毒载体(28)(图19A，右子图)中的Venus荧光报告子的3’非翻译区域(命名为LEGO-SFFV-BCL11A-shRNAmiR(以下称为SFFV-shRNAmiR))。
对并入相同的21个碱基的靶标匹配序列的shRNA的敲减效率进行直接比较，在MEL细胞中的pol III和pol II表达盒(即U6-shRNA vs SFFV-shRNAmiR)的情况下使用非靶向(NT)shRNA作为阴性对照。在来自以MOI 2转导的MEL细胞的细胞裂解物中，通过免疫印迹对BCL11A蛋白进行检测(图19C)。相比U6-shRNA，在表达SFFV-shRNAmiR的细胞中，BCL11A敲减效率持续较低(图19C)。为了确认该差异的功能性意义，本发明人在通过嘌呤霉素选择或通过荧光活化细胞分选(FACS)获得的转导细胞的均质群中通过qRT-PCR对Hbb-y mRNA水平的诱导进行了测量(图19D)。SFFV-shRNAmiR相比U6-shRNA而言降低的敲减效率(参见图19C)转化为SFFV-shRNAmiR对Hbb-y诱导的显著减少(图19D)，并且Hbb-y诱导的差异比BCL11A敲减的差异更加明显。
SFFV-shRNAmiR和U6-shRNA产生不同的成熟引导链序列
为理解这些差异的分子基础，对来自用各种U6-shRNA以及它们相应的SFFV-shRNAmiR对应物转导的细胞的小RNA进行测序。假设Hbb-y诱导中的显著差异是由于从含有shRNA的不同转录物(产生自pol II和pol III背景)产生的不同的成熟引导链。因此，对来自U6-shRNA和SFFV-shRNAmiR背景这二者的加工的引导链序列进行评估(图20A和图20B)。从SFFV-shRNAmiR产生的最多发现的成熟引导RNA与计算机预测的成熟序列密切对应(图20B)。相比之下，大多数U6-shRNA产生与预测的Dicer产物相匹配的成熟引导链序列，所述Dicer产物由pol III转录物3’端的～22nt组成，包含源自于pol III终止信号的3nt-5nt延展段，但在5’端缺乏相应数量的靶标匹配序列的核苷酸。在A549、MCF7、Jurkat和U937细胞系中对247种不同U6-shRNA的大规模筛选中，观察到加工产物的类似分布，其中，占主导的引导链序列具有22nt的平均长度，该序列的5’端从恒定环序列的4个碱基起始。在这四种细胞系中对247种加工的TRC shRNA产物进行深度测序(图25)。结果表明，占主导的成熟引导链在shRNA反义序列的位置4处起始，并包含四个3’-末端U残基。在细胞系和不同shRNA序列之间的加工通常是一致的。尽管一些shRNA相比其它shRNA产生>1000倍的读取，但shRNA之间的每个成熟序列的平均读取频率权重相同。由于在文库制备期间的强RNA连接酶偏差，小RNA测序的半定量性质使得不可能对相对表达或加工水平进行比较，但细胞系和shRNA之间的一致趋势表明了可能占优势的引导链的类型(identity)。还检测到正义链读取(平均每个shRNA<30％)，绝大多数以‘GG’起始并延伸20nt成为正义链序列。这些成熟序列与初级hU6shRNA转录物的Dicer产物完全一致，不需要调用Drosha/DCGR8加工步骤。综合起来，这些发现表明了当在载体之间转移shRNA序列时对从pol II shRNAmiR和pol III shRNA转录物产生成熟序列的加工事件进行考虑的重要性。在所研究的四种细胞类型中观察到的成熟序列的极其类似的分布表明这些加工模式将在不同细胞背景中是普适性的。在基于polIII vs pol II的载体中产生的成熟引导链序列的差异对于所观察到的U6-shRNA相比SFFV-shRNAmiR的差异性BCL11A下调有很大贡献。这些数据表明，通过考虑相比pol IIIshRNA的Dicer切割而言的pol II shRNA的Drosha和Dicer切割，pol III和pol II载体之间的预测转化是可能的。
在基于pol II的载体中修饰shRNA序列导致敲减效率提高
基于这些发现，本发明人假设在将序列转移到SFFV-shRNAmiR中时，使用来自polIII shRNA载体的预测的成熟序列将导致敲减效率增加。因此，设计了在引导链序列5’端中含有4-核苷酸移位的一组SFFV-shRNAmiR(图21A)。在3’-端添加核苷酸GCGC以在siRNA双链中实现更高的3’端热力学稳定性，这应当促进目标引导链的优先RISC加载。在MEL细胞中，分别通过免疫印迹和qRT-PCR来评价修饰对敲减效率和Hbb-y诱导的影响。观察到SFFV-shRNAmiR1、SFFV-shRNAmiR3和SFFV-shRNAmiR8对BCL11A蛋白的敲减效率提高(图21B)。敲减增强与Hbb-y转录物200至400倍的诱导增加相关(图21C)。其它SFFV-shRNAmiR没有显示敲减效率的明显增加。为了更充分理解效率提高的潜在机制，对于修饰的SFFV-shRNAmiR1、SFFV-shRNAmiR3和SFFV-shRNAmiR8，通过Northern印迹对引导链和随从链小RNA的丰度及它们的比例进行了分析。首先，在所有情况下，pol III载体相对于pol II载体均观察到更高丰度的引导链。此外，相对于未修饰的shRNAmiR，特别是对于修饰的SFFV-shRNAmiR1和SFFV-shRNAmiR3而言，发现更高的丰度和更高的引导链随从链比例，而对于SFFV-shRNA8而言这些参数不受影响(图21D)。对小RNA进行深度测序，以评价修饰对引导链序列的影响以及将其与在BCL11A敲减中观察到的变化相关联。通常，所得到的加工序列反映了所引入的4nt移位，产生与从在LKO骨架中表达的pol III shRNA获得的序列类似的具有种子区域的引导链。对于SFFV-shRNAmiR1、SFFV-shRNAmiR3和SFFV-shRNAmiR8，发现了单一主导序列，与显示更宽序列分布的效率较低的SFFV-shRNAmiR形成对比。
在源自于原代人CD34+的红系细胞中修饰shRNAmiR对BCL11A敲减和γ-珠蛋白诱导的影响
BCL11A敲减引起的胎儿珠蛋白再活化对治疗镰状细胞疾病和β-地中海贫血具有治疗潜力。为了评价修饰的SFFV-shRNAmiR对原代人细胞中的BCL11A敲减效率和γ-珠蛋白诱导以及HbF表达的影响，将来自健康志愿者的G-CSF动员外周血(mPB)CD34+HSPC用表达U6-shRNA、SFFV-shRNAmiR和修饰的SFFV-shRNAmiR的载体进行转导，然后对其进行红系细胞分化。在培养11天后，经由western印迹测定BCL11A水平(图22A)。与MEL细胞中的发现一致，用修饰的SFFV-shRNAmiR1、SFFV-shRNAmiR3和SFFV-shRNAmiR8观察到敲减增强，还导致γ-珠蛋白转录物的诱导增加(图22B)。在培养的第18天，通过流式细胞术分析，针对CD71和GpA的表面表达及去核对红系细胞分化的状态进行评估。在SFFV-shRNAmiR和对照载体转导的试样之间没有观察到显著差异(图22C)。相比之下，U6-shRNA在成熟的后期导致分化标志物的获得轻度延迟，这可能指示了由于U6-启动子介导的shRNA过表达而产生的毒性。通过由高效液相色谱(HPLC)测量的增加的HbF蛋白确认观察到的γ-珠蛋白mRNA的高诱导。相比未修饰的SFFV-shRNAmiR，所有三种测试的修饰的shRNAmiR产生增加的HbF输出(图22D)，其中红系细胞中40％-50％的总血红蛋白是HbF。γ-珠蛋白mRNA和HbF蛋白之间的相关性高(r2＝0.96)，支持了分析的可靠性(图22E)。
总之，本发明人已表明，相比表达自U6启动子的siRNA，嵌入miRNA支架并经由polII启动子表达的shRNA在转导的细胞中被加工产生不同的成熟siRNA。源自于pol III启动子构建体的成熟shRNA中的靶标匹配序列在3’处被均一移位3nt-5nt，这种差异与靶转录物敲减效率中的显著差异相关。在BCL11A(潜在的治疗靶标)的情况中，这在γ-珠蛋白表达的再活化中产生明显差异。这些数据表明了当将shRNA序列转移到microRNA支架中以允许polII介导的表达时进行设计优化的重要性。
造血干细胞和祖细胞(HSPC)中BCL11A的普遍敲减损伤了造血重建，并可通过使shRNAmiR表达靶向红系细胞来避免
在HSPC转导和移植的小鼠模型中对SFFV-shRNAmiR体内表达的影响进行了评估。将来自表达CD45.2细胞表面标志物的β-YAC小鼠的骨髓的谱系阴性(lin-)HSPC用SFFV-shRNAmiR载体或非靶向载体(SFFV-shRNAmiRNT)进行离体转导，并移植到致死辐照的CD45.1 BoyJ受体小鼠中。将未转导的细胞移植到对照组中。β-YAC小鼠含有人β-珠蛋白基因座(该基因座在小鼠环境中作为受发育调节的转基因)，显示胎儿和成体β-珠蛋白基因的差异表达。为了验证目的并为了与先前公开的数据更好地比较，采用了充分描述的嵌入miRNA223侧翼序列的shRNA(23、27、29)(本文称为shRNAmiR*)。在移植后4周、8周和12周，基于CD45.1和CD45.2嵌合状态对供体细胞移入进行测定(图23A)。供体细胞移入遵循预期模式，在8周后几乎完全移入外周血(PB)和骨髓(BM)。然而，出乎意料地，基因修饰细胞的分数随时间急剧下降(图23B)。尽管使用BCL11A敲减载体的初始转导率为～40％，但在第12周的基因标记仅为源自于供体的总CD45细胞的2％-3％。SFFV-shRNAmiRNT的过表达也与基因修饰细胞的移入减少相关，但程度较低，表明了移入HSPC细胞中的序列特异性毒性和非特异性毒性。表达shRNA的供体细胞损失的时间点表明了对更原始的造血干细胞区室的影响。
为了进一步研究对造血重建的负面影响，进行了定量的竞争性再增殖实验(图23C-图23F)。用表达针对BCL11A的SFFV-shRNAmiR、shRNAmiRNT或仅表达处于普遍表达的SFFV启动子控制下的蓝色荧光蛋白(BFP)报告子(SFFV-BFP)的各种载体对来自CD45.1(BoyJ)和CD45.2(Bl\6)供体动物的谱系阴性细胞进行转导。将细胞移植到同类系(congenic)CD45.1/CD45.2动物中，使得能够对供体群和受体细胞两者进行识别。在采用SFFV-BFP载体的实验中，将CD45.1供体细胞移植到CD45.2动物中，并基于荧光对转导的供体细胞群进行识别和比较。在移植之前，将用竞争性载体转导的两个群的相等数量的细胞混合。经由流式细胞术对在移植群中用两种载体获得的基因修饰细胞的最终比例进行分析，这确认了55％-70％的可比转导率(图22C)。在移植后4周、8周和12周，在移植动物的外周血、骨髓和脾中对基因修饰细胞的贡献进行评估(图23D)，对于该分析而言，将输注的转导细胞比例中的微小差异考虑在内。在所有情况下以及在各时间点，用NT或SFFV-BFP载体转导的细胞均超过用靶向BCL11A的载体转导的细胞，表明BCL11A敲减的选择性缺点。当两种靶向BCL11A的载体彼此竞争时，相比初始移植群的比例，未观察到造血细胞重建的显著差异。与图23B中的发现一致，shRNAmiRNT的过表达也对造血重建具有负面影响，因为这一组被用仅表达SFFV-BFP而不表达shRNA的载体所转导的细胞超过。本发明人对骨髓细胞的转导部分内的B淋巴细胞和更原始的HSC区室进行了更详细的分析(图23E)。如从显示BCL11A-/-小鼠中缺乏B细胞的先前研究(30、31)中所预期的，B220阳性B细胞的数量在BCL11A敲减后显著减少。虽然没有达到显著性，但更原始的lin-,Sca-1+,c-kit+(LSK)细胞(含有移入HSC区室)存在损失趋势。
BCL11A的红系细胞特异性敲减能够潜在地避免BCL11A敲减对HSC和B细胞的不良影响，同时在红系细胞中保持了γ-珠蛋白诱导的治疗效果。为了使敲减选择性导向红系细胞，生产了慢病毒载体，在所述慢病毒载体中，shRNAmiR盒和Venus荧光报告子在最小β-珠蛋白近端启动子的控制下表达，所述启动子与β-珠蛋白基因座控制区域(LCR)的超敏感位点2和超敏感位点3(HS2和HS3)相连接(32)(图23F)，将其命名为LV-LCR-BCL11A-shRNAmiR(以下称为LCR-shRNAmiR)。在用转导的HSPC移植的小鼠中，首先对体内移入的造血细胞群中Venus报告子转基因的表达谱进行评估(图23G和图26)。在图26中，将谱系阴性细胞用LCR-shRNAmiR载体转导，并植入致死辐照的受体小鼠。12周后，使用表面标志物来识别供体细胞和不同造血细胞类型。本文显示的是代表性设门方案(gating scheme)和直方图印迹，示出了各种谱系中的Venus表达。印迹中的数值表示venus阳性细胞的百分比和平均荧光强度(MFI)。转基因的表达受到严格调节：在LSK和B细胞部分中没有可检测的表达；在T细胞中表达水平非常低；在一些动物的髓系细胞中表达水平低。相比之下，在红系细胞分化期间转基因表达强烈上调，开始于CD71+/Ter119-细胞(代表红系祖细胞和原成红细胞)并在CD71+/Ter119+双阳性阶段(代表嗜碱性成红细胞)达到顶峰。在红系细胞成熟的最后阶段，相比CD71+/Ter119+细胞，大部分CD71-/Ter119+细胞(代表网织红细胞和成熟红细胞)以类似的百分比表达该报告子。
接下来，为了确定LCR载体的使用是否避免了在普遍的SFFV-shRNAmiR过表达后观察到的重建缺陷，使用LCR-shRNAmiR和SFFV-shRNAmiR进行竞争性移植实验(图23H)。由于LCR载体在lin-细胞中是转录沉默的，对用于移植的细胞小份试样(aliquot)进行体外红系细胞分化，在转录容许(transcriptional permissive)的CD71+/Ter119+群中测量Venus+细胞的比例，并将该比例用于将SFFV vs LCR转导细胞的比例归一化。在红系细胞中对移植动物中的Venus表达进行比较，因为红系细胞是允许从两种载体平等地表达的唯一的群。移植小鼠的重建显示源自于用LCR载体转导的HSPC的细胞的明显优势，表明在HSPC中与LCR-shRNAmiR的红系细胞谱系特异性表达相关的毒性较小(图23H)。总之，这些数据表明，可通过红系细胞特异性miRNA表达来避免BCL11A敲减对HSC移入/功能的不良影响。
LCR载体介导的使用修饰的shRNAmiR的BCL11A红系细胞特异性敲减在人红系细胞中产生高水平的HbF
为了测试LCR介导的BCL11A红系细胞特异性敲减在人实验系统中的效率，用含有修饰的shRNAmiR3或shRNAmiR8的LCR-shRNAmiR载体对CD34+细胞进行转导(图23F)。在人mPB CD34+细胞的体外红系细胞分化期间，本发明人首先在人细胞中确认了几种LCR-shRNAmiR载体(LCR-shRNA*、LCRshRNAmiR3和LCRshRNAmiR8)的表达谱。如CD71和GpA染色所定义的，在红系细胞成熟的不同阶段对LCR载体和SFFV驱动的对照载体(不含shRNAmiR盒(SFFV-GFP))(33)的Venus表达进行了评价(图23I)。与图23G所示的小鼠细胞中的发现一致，在CD71-/GpA-未成熟红系细胞中观察到低水平的表达。在CD71+单阳性细胞中存在强表达上调，而在更成熟的CD71+/GpA+双阳性细胞中具有最高水平的转基因表达。如预期的，SFFV-GFP对照在所有亚群中驱动高水平的组成型表达。遵循先前所述的分化方案，在培养的第11天测量BCL11A蛋白水平，并将其与非靶向载体和mock对照载体(LCR-shRNAmiRNT和SFFV-GFP)进行比较。相比表达非靶向载体(NT)和对照载体(SEW)的细胞，在表达修饰的shRNAmiR的细胞中观察到BCL11A显著减少(图24A)。在用表达shRNAmiR3和shRNAmiR8的载体转导的源自于CD34+细胞的细胞中，γ-珠蛋白mRNA分别构成总β-样珠蛋白的40％和70％(图24B)。在用LCR-shRNAmiR或对照载体转导的细胞之间没有观察到细胞生长的差异。通过去核以及通过CD71、GpA的表面表达所评价的红系细胞分化与对照无法区分(图24C)，表明BCL11A敲减对BCL11A shRNAmiR的谱系特异性表达没有负面影响。在γ-珠蛋白mRNA水平(qRT-PCR)和通过HPLC评估的HbF水平之间观察到强相关性(图24D)。HbF在用LCR-shRNAmiR3和LCR-shRNAmiR8转导的细胞中贡献了总血红蛋白的35％和55％，代表与SFFV启动子介导的表达可比的水平(图22D和图24E)。最后，为了从原理循证角度显示LCR-shRNAmiR介导的敲减允许有效的hCD34+细胞移入和γ-珠蛋白诱导，将用LCR-shRNAmiR3或NT载体转导的源自于骨髓的CD34+HSPC移植到亚致死辐照的NSG小鼠中。由于该异种移植模型中的人红系细胞发育不良，移植后14周，将CD34+HSPC从移植动物的骨髓分离，并对其进行体外红系细胞分化。通过FACS富集Venus+细胞，并通过RT-PCR测定γ-珠蛋白和β-珠蛋白的表达(图24F)。与先前的数据一致，与由未转导的细胞或LCR-shRNAmiRNT转导的细胞所组成的两个对照组中的～9％±0.5％相比，用LCR-shRNAmiR3转导的细胞的总β-珠蛋白基因座输出的γ-珠蛋白分数为44.9％±5.5％。
shRNA已被广泛用于分析生物学研究中的基因功能，并且对出于治疗目的而使用RNAi的兴趣逐渐增加。BCL11A代表了基于RNAi的调控的有吸引力的治疗靶标。BCL11A是γ-珠蛋白表达的阻遏物，因此在红系细胞中作为胎儿血红蛋白与成体血红蛋白转换的主要调节剂。重要的是，高水平的胎儿血红蛋白与镰状细胞疾病(SCD)和β-地中海贫血中较轻微的疾病表型相关，并已证实BCL11A的谱系特异性敲除为SCD模型中的治疗策略。在本文报道的研究中，我们的目标是开发临床适用的载体，以通过RNAi介导的BCL11A抑制使胎儿血红蛋白表达再活化。使用含有miRNA改造shRNA(shRNAmiR)(表达自红系细胞谱系特异性pol II启动子)的优化慢病毒载体，本发明人在源自于原代红系细胞的转导的CD34+HSPC中实现了>50％的总血红蛋白的HbF水平。这种HbF诱导水平可能是临床有效的，且与先前公开的载体(23、27、29)比较是有利的，先前公开的载体采用pol III驱动的表达盒，其缺乏本文报道的SIN慢病毒载体的谱系特异性和安全性谱。
可以用造血干细胞移植(HSCT)来实现SCD的治愈性治疗。SCD中的有利结果主要取决于匹配同胞供体的可用性。少于10％的SCD患者具有未受影响的HLA匹配的同胞潜在供体(34)。血红蛋白病的基因治疗通过使用自体细胞提供了消除GVHD风险的明显优势。我们的研究的长期目标是调控血红蛋白转换，以导致保护性HbF的内源和生理诱导以及镰状珠蛋白的抑制。本发明人假设这种表达的双重操控将是预防SCD中的毒性(包括突变的聚合血红蛋白的终末端器官损伤和溶血)的最有效的治疗方法。为了实现治疗益处的目标，必须发生每个细胞基础上的足够的BCL11A敲减和HbF诱导，而且必须移入足够数量的基因修饰的长寿命HSC，从而使红细胞区室嵌合以减弱疾病表型。因此，本文所示的优化BCL11A敲减和保留转导的HSCP的重建能力对于SCD中基因治疗的长期成功而言很关键。关于第二点，本发明人认为这是目前可实现的，因为来自导致混合嵌合的同种异体移植的先前数据已表明低至10％的骨髓区室嵌合与80％-100％的外周血红细胞嵌合相关(35)。相比镰状细胞，移入后红细胞团块的偏移(skewing)最可能归因于正常红细胞的存活增强。在采用慢病毒载体的人试验中(包括在β-地中海贫血(39)中)，近来已达到了这种长寿命髓系细胞的标记(marking)水平(36-38)。
Pol III驱动的shRNA是最常用的通过RNAi来实现基因敲减的载体系统，但这些载体介导了可能与以下两种毒性相关的普遍表达：来自高表达水平的非特异性毒性和某些细胞类型中的序列特异性毒性。此处，本发明人表明HSC中的BCL11A敲减减弱了这些细胞在移植环境中的移入和B细胞的体内发育。尽管在缺乏BCL11A的情况下移入降低是未被报道的现象，但本文报道的数据与BCL11A在早期HSPC中的已知表达一致，并且与BCL11A基因删除后的小鼠中约两倍的HSC含量降低的报道一致(31、40、41)。在本文报道的分析中，由于存在于这一实验环境中的选择压力增高，BCL11A敲减对移入HSC的负面影响可能更明显。在离体培养和转导这些细胞后通常存在限制数量的HSC，而且与本文所用分析中所采用的对照HSC的竞争可以增强HSC水平上的毒性检测。在红系细胞谱系中，BCL11A是非必要的(24)。在本文所报道的数据中，红系细胞特异性LCR载体(含有源自于β-珠蛋白基因座的调节序列(32、42))的使用避免了BCL11A敲减对HSC移入的负面作用。在靶向BCL11A的shRNAmiR的表达中，LCR载体表现出高度的谱系保真度。此外，当用于表达其它转基因时，已表明这种载体结构降低了相邻细胞基因的反式活化的风险(临床转化的重要特征)(43)。因此，在BCL11A的情况中，shRNAmiR的转录靶向似乎是关键的，凸显了开发有效的基于pol II的敲减载体的重要性。这种方法绕过了BCL11A敲减对HSPC以及淋巴细胞发育的负面影响(30、31)，避免了与shRNA过表达相关的毒性(9、11、19)，并改进了载体系统的安全性谱，同时保持了治疗效力。
使用pol II启动子来表达shRNA需要将shRNA嵌入microRNA序列。由于大多数先前证实的有效shRNA序列均源自于使用pol III启动子进行的分析，并且大多数可商购得到的敲减系统均基于pol III启动子，因此将shRNA序列转化到pol II结构中是重要的。尽管在该领域是重要研究，用于将源自于有效的基于pol III的载体的shRNA序列转化到基于polII的shRNAmiR载体中的指南仍是缺乏的。本文通过对来自用两种类型的载体平行转导的细胞的RNA加工结果进行比较，本发明人确认了在靶标匹配序列方面产生了不同的小RNA产物，导致经由基于pol II的载体的靶标敲减的效率显著降低。从含有相同靶mRNA匹配序列的pol II与pol III系统产生的成熟引导链序列通常相对于彼此移位3nt-5nt。来自polIII终止信号的3个-5个U残基添加到shRNA转录物的3’端导致Dicer切割位点的相应移位，证明3’-计数规则对Dicer切割的主导作用(44、45)。pol III相对于pol II中的引导链移位对敲减效率具有主要影响，因为种子区域被改变，并且小RNA双链的热力学性质和末端核苷酸类型发生变化，从而影响引导链并入到RISC效应复合物中(4、5、46、47)。对shRNAmiR进行重新工程化以模拟由pol III驱动的shRNA产生的成熟引导链序列导致靶mRNA改进的敲减和增强的加工。这种方法应该适用于开发使用pol II启动子的靶向其它基因的载体，包括其它谱系特异性表达盒。
总之，数据表明了在不同载体背景中与shRNA使用相关的RNA加工的关键特征，还提供了谱系特异性基因敲减的策略，避免了广泛表达的不良后果。这些发现对嵌入microRNA的shRNA的设计及其在基于RNAi的基因治疗方法中的应用具有重要意义。
实施例11
健康供体人CD34+细胞中BCL11A shRNAmiR转导的效力研究。
转录阻遏物BCL11A代表β-血红蛋白病的治疗靶标。经由pol II启动子表达的microRNA改造shRNA(shRNAmiR)对红系细胞中的BCL11A的选择性抑制在鼠细胞和人细胞中均导致BCL11A的有效敲减。在鼠异种移植中的修饰的CD34+细胞完全移入后，在源自于原代人CD34的红系细胞中以及在体外分化的人红系细胞中，以红系细胞特异性方式表达修饰的shRNAmiR避免了对鼠HSC移入和B细胞发育的不良影响(参见上文实施例10)，并导致有效的BCL11A敲减和高水平的HbF。本发明人还表明了在源自于转导的CD34细胞的红系细胞中HbF的有效诱导，所述CD34细胞获得自患有镰状细胞疾病的供体。
在一系列实验中，用表达非靶向shRNA(LCR-NT)或BMS11-D12G5的载体对来自健康供体的GCSF动员CD34进行转导，并对其进行红系细胞体外分化。
BCL11A D12G5-2 shRNA：正义链
ACGCTCGCACACAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGAG(SEQ.ID.NO：43)
反义链
CGCACTCGCACAGAACACTCATGGATTctctaccacatggagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGA(SEQ.ID.NO：44)
图27A是体外分化的红系细胞(源自于转导的CD34细胞)的Western印迹，示出了BCL11A异形体(L和XL)和作为上样对照的β-肌动蛋白，并表明BCL11A XL的有效敲减。图27B示出了红系细胞中BCL11A敲减的定量。数据源自于如图27A所示的Western印迹。数据总结了使用来自单一供体的细胞的三次独立实验(误差棒：SD)。
图27C显示通过RT-qPCR评估的红系细胞中的γ珠蛋白诱导以及通过HPLC评估的血红蛋白(HbF)。
实施例12
红系细胞中BCL11A敲减的定量。
对转导的CD34+细胞在NSG免疫缺陷小鼠中的移入进行了研究，包括BCL11A表达的体内敲减的有效性。将人CD34用LCR-NT或BMS11-D8G5转导，并注射到亚致死辐照的NSG-受体小鼠中。14周后分离骨髓CD34+，并对其进行红系细胞体外分化。图28示出了通过RT-qPCR评估的红系细胞中的γ珠蛋白诱导。
实施例13
在源自于转导的CD34细胞(来自镰状细胞患者)的红系细胞中的BCL11A敲减和胎儿血红蛋白诱导。
从接受HU治疗并具有高基线HBF的SCD患者中分离骨髓CD34。将该细胞用LCR-NT或LCR-D12G5转导，并对其进行红系细胞体外分化。
在镰状细胞患者细胞中研究BCL11A敲减。从镰状细胞患者分离骨髓CD34，将该细胞用LCR-NT或LCR-D12G5-2转导(未转导的细胞用作额外对照)，并对其进行红系细胞体外分化。图29A示出了显示BCL11A(L和XL异形体)和作为上样对照的β-肌动蛋白的Western印迹，并表明了BLC11A-XL的有效敲减。每个子图(各道下方标记1-6)代表使用来自单一供体的细胞的独立实验。图29B示出了红系细胞中BCL11A敲减的定量。数据源自于如图29A中所示的Western印迹。图29C示出了通过HPLC评估的产生的HbF诱导。该患者正在接受羟基脲治疗，该治疗解释了高基线HbF水平。
实施例14
治疗方案的实施方式
初始评价
根据机构规章，使患者接受自体骨髓移植的标准诊断检查，然后以至少4周的间隔接受两次骨髓采集，将其用作备用骨髓(最少2×106个CD34+细胞/kg)并用作基因转移的自体骨髓的采集(目标为5×106个CD34+细胞/kg，最少4×106个CD34+细胞/kg)。
备用自体移植物的采集
如果在基因操控的细胞注射后6周没有观察到造血恢复、或者操控的细胞不能满足发布标准(release criteria)，在治疗之前从患者收集造血细胞，以作为补救程序(“备用移植物”)。在基因治疗前至少4周，通过多次穿刺从全身麻醉下的患者两侧的髂后嵴(posterior iliac crests)中采集骨髓(至多20cc/kg)。根据用于自体骨髓收集的标准临床程序，将含有2×106个CD34+细胞/kg的部分骨髓冷冻并储存(未经处理)在液氮蒸气(-162℃和-180℃)中，以构成备用移植物。将剩余的采集物选择用于CD34+细胞(如下所述)并用于进行基因修饰(如下所述)。
骨髓采集
将超出所需备用骨髓的第一次骨髓采集的剩余部分与第二次骨髓采集一起用于基因转移。在初次采集后不早于4周进行第二次采集(如上所述)。对于第二次采集，通过多次穿刺从全身麻醉下的患者两侧的髂后嵴中再次采集骨髓。收集的骨髓量至多为20ml/kg体重。这将使总有核细胞计数大于～4×108个细胞/kg。这转而应该在CD34+细胞选择后产生大于4×106个细胞/kg的CD34+细胞剂量。
两次采集所估计的CD34+计数<4×106个细胞/kg的受试者将不接受调节(conditioning)。在至少6周的时间段后，如果受试者希望继续保持研究，可再次对他进行采集。如果受试者不希望再次采集，他将退出研究。
在给予转导的CD34+细胞之前从研究退出的受试者将恢复正常的临床护理(支持性护理和/或同种异体HSCT)。从退出点开始将不进行效力和安全性评估，并且将不为数据库收集数据。
CD34+细胞分离、预刺激和转导
CD34+细胞纯化。
为了有充足的时间来清除调节剂并使预刺激和培养时间最小化，使整个骨髓保持过夜。所有制造步骤均在DFCI的Connell&O’Reilly Families细胞操控核心设施(CellManipulation Core Facility)中进行。通过密度梯度离心法使骨髓的红细胞耗竭。使用CliniMACS试剂和仪器从骨髓单核细胞中阳性选择CD34+细胞。采取质量控制(QC)试样来评估纯度和无菌性。立即对纯化的细胞进行处理以用于预刺激和转导。
CD34+预刺激和转导
在一次或两次采集上进行转导。对来自第一次采集的、超出备用骨髓目标的细胞进行转导并冷冻以备将来使用。将第二次采集整体用于基因转移，并在调节后将第二次采集的转导产物与来自第一次采集的解冻的转导细胞一起进行输注。
以0.5×106/ml-1×106/ml的密度，将纯化的CD34+细胞接种在封闭培养袋中的补充有生长因子(IL-3、SCF、FLT3L、TPO)的无血清培养基中，并置于37℃、5％CO2的培养箱中。24小时-30小时后，对细胞进行采集并计数。额外的QC测试包括细胞存活力和集落形成单位(CFU)分析。将细胞转移到新的培养袋并用慢病毒上清液处理。对于该第一轮转导，将细胞孵育18小时-24小时。然后采集细胞、计数、并将细胞转移到新的袋中，用慢病毒上清液进行第二轮转导。
最终采集和制剂
在第二轮转导后，采集细胞，在plasmalyte中洗涤，并以50mL-100mL的体积重悬于其最终制剂(PLASMALYTE，1％HSA)中。去除QC试样后，将所有可用细胞输注到患者体内。QC包括细胞计数、存活力、洗涤上清液上的无菌性、支原体、上清液上的内毒素、表型、CFU、RCL(获取和存档的试样)、插入分析和由qPCR而得的平均载体拷贝数(培养细胞)。在递送给患者之前，将用于革兰氏染色的试样立即从产品中取出。
受试者再输注之前的测试
在进行以下程序期间和结束时收集试样：细胞计数和存活力(台盼蓝拒染法或等效方法)测试、无菌性测试、支原体测试、转导效率(载体拷贝数)测试、革兰氏染色测试、内毒素测试和RCL测试。在输注之前，这些测试中只有细胞存活力测量、无菌性(在过程中，72小时)测量、革兰氏染色测量和内毒素测量是可用的。
如果在72小时时通过革兰氏染色或阳性培养，微生物培养显示瞬态细菌污染，细胞操控核心设施工作人员将联系PI、医疗主任助理和主治医师来决定是否输注备用采集物或输注抗生素作用范围内的产品。如果输注了备用采集物，受试者将从该方案中退出。如果细胞存活力<70％、无菌性测试为阳性、或内毒素>5EU/kg/hr，则不将细胞返回，而是输注备用采集物，并且受试者将从该方案中退出。
在转导结束时，如果来自两次采集/转导的活细胞计数大于或等于4×106个CD34+细胞/kg，则输注细胞。在转导结束时，如果来自两次采集/转导的活细胞计数小于4×106个CD34+细胞/kg，则不输注细胞，并在48小时后输注备用采集物。
受试者调节方案
在输注转导细胞之前，受试者将接受白消安骨髓消融调节，在第-4天至第-2天每日静脉内给予约4mg/kg白消安，根据体重调整(每日一次给予超过3小时)。调节将与骨髓细胞的纯化和转导同时发生。在给予的全部3天中标注白消安水平，并将第1天和第2天的水平用于调整目标的曲线下面积。
根据波士顿儿童医院造血干细胞移植单位标准规章，在标准预水合和术前用药后静脉内输注细胞30分钟-45分钟。该标准要求患者在整个输注期间以及之后30分钟持续进行心脏监测、呼吸监测和氧饱和度监测。在输注前、输注15分钟、持续输注期间的每小时和输注结束时，对生命体征进行测量和记录。RN将在输注的前5分钟陪在患者身边。如果给予两种转导产物，在给予第一种转导产物后立刻给予第二种转导产物。
应当理解的是，虽然已经结合其详细描述对本发明进行了描述，但是前面的描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围所限定的本发明的范围。其它方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。
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合成的miR寡核苷酸列表
BCL11A miR1寡核苷酸：
正义链ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGag(SEQ ID NO：1)
反义链CGCActCGCACAGAACACTCATGGATTctctaccacatggagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGa(SEQ ID NO：2)
BCL11A miR2寡核苷酸：
正义链ACGCTCCAGAGGATGACGATTGTTTActccatgtggtagagTAAACAATCGTCATCCTCTGGag(SEQ ID NO：3)
反义链CGCActCCAGAGGATGACGATTGTTTActctaccacatggagTAAACAATCGTCATCCTCTGGa(SEQ ID NO：4)
BCL11A E3寡核苷酸：
正义链
ACGCTTCGGAGACTCCAGACAATCGCctccatgtggtagagGCGATTGTCTGGAGTCTCCGAag(SEQID NO：5)
反义链CGCActTCGGAGACTCCAGACAATCGCctctaccacatggagGCGATTGTCTGGAGTCTCCGAa(SEQ ID NO：6)
BCL11A D8寡核苷酸：
正义链
ACGCTTTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagagTCTGTGCGTGTTGCAAGAGAAag(SEQID NO：7)
反义链CGCActTTCTCTTGCAACACGCACAGActctaccacatggagTCTGTGCGTGTTGCAAGAGAAa(SEQ ID NO：8)
BCL11A XLC4或C4寡核苷酸：
正义链
ACGCTACAGTACCCTGGAGAAACACActccatgtggtagagTGTGTTTCTCCAGGGTACTGTag(SEQID NO：9)
反义链CGCActACAGTACCCTGGAGAAACACActctaccacatggagTGTGTTTCTCCAGGGTACTGTa(SEQ ID NO：10)
非靶向寡核苷酸：
正义链ACGCTCAACAAGATGAAGAGCACCAActccatgtggtagagTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGag(SEQ ID NO：11)
反义链CGCActCAACAAGATGAAGAGCACCAActctaccacatggagTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGa(SEQ ID NO：12)
BCL11A E3G5或E3 mod寡核苷酸：修饰的版本
正义链
ACGCTGCGCTCGGAGACTCCAGACAActccatgtggtagagTTGTCTGGAGTCTCCGAGCGCag(SEQID NO：13)
反义链
CGCActGCGCTCGGAGACTCCAGACAActctaccacatggagTTGTCTGGAGTCTCCGAGCGC a(SEQID NO：14)
BCL11A D8G5或D8 mod寡核苷酸：修饰的版本
正义链
ACGCTGCGCTTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAAGAGAAGCGCag(SEQID NO：15)
反义链
CGCActGCGCTTCTCTTGCAACACGCActctaccacatggagTGCGTGTTGCAAGAGAAGCGC a(SEQID NO：16)
BCL11A XLC4G5寡核苷酸：修饰的版本
正义链
ACGCTGCGCACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGTACTGTGCGCag(SEQID NO：17)
反义链
CGCActGCGCACAGTACCCTGGAGAAActctaccacatggagTTTCTCCAGGGTACTGTGCGCa(SEQID NO：18)
mIR1 CGCACAGAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTGTGCG(SEQ IDNO：25)
(shRNA1或E3)TCGGAGACTCCAGACAATCGCctccatgtggtagagGCGATTGTCTGGAGTCTCCGA(SEQ ID NO：26)
(shRNA2或B5)CCTCCAGGCAGCTCAAAGATCctccatgtggtagagGATCTTTGAGCTGCCTGGAGG(SEQ ID NO：27)
(shRNA3或D8)TTCTCTTGcAACACGCACAGActccatgtggtagagTCTGTGCGTGTTGcAAGAGAA(SEQ ID NO：28)
(shRNA4或B11)TCAGGACTAGGTGCAGAATGTctccatgtggtagagACATTCTGCACCTAGTCCTGA(SEQ ID NO：29)
(shRNA5或50D12或D12)GATCGAGTGTTGAATAATGATctccatgtggtagagATCATTATTCAACACTCGATC(SEQ ID NO：30)
(shRNA6或50A5或A5)CAGTACCCTGGAGAAACACATctccatgtggtagagATGTGTTTCTCCAGGGTACTG(SEQ ID NO：31)
(shRNA7或50B11)CACTGTCCACAGGAGAAGCCActccatgtggtagagTGGCTTCTCCTGTGGACAGTG(SEQ ID NO：32)
(shRNA8或50c4)ACAGTACCCTGGAGAAACACActccatgtggtagagTGTGTTTCTCCAGGGTACTGT(SEQ ID NO：33)
mIR1G5gcgcCGCACAGAACACTCATGctccatgtggtagagCATGAGTGTTCTGTGCGgcgc(SEQID NO：34)
(shRNA1mod或E3G5)gcgcTCGGAGACTCCAGACAActccatgtggtagagTTGTCTGGAGTCTCCGAgcgc(SEQ ID NO：35)
(shRNA2mod或B5G5)gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAActccatgtggtagagTTTGAGCTGCCTGGAGGgcgc(SEQ ID NO：36)
(shRNA3mod或D8G5)gcgcTTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAAGAGAAgcgc(SEQ ID NO：37)
(shRNA4mod或B11G5)
gcgcTCAGGACTAGGTGCAGActccatgtggtagagTCTGCACCTAGTCCTGAgcgc(SEQ ID NO：38)
(shRNA5mod或50D12G5或D12G5)
gcgcGATCGAGTGTTGAATAActccatgtggtagagTTATTCAACACTCGATCgcgc(SEQID NO：39)
(shRNA6mod或50A5G5)
gcgcCAGTACCCTGGAGAAACctccatgtggtagagGTTTCTCCAGGGTACTGgcgc(SEQ ID NO：40)
(shRNA7mod或50B11G5)
gcgcCACTGTCCACAGGAGAActccatgtggtagagTTCTCCTGTGGACAGTGgcgc(SEQID NO：41)
(shRNA8mod或50C4G5或C4G5)
gcgcACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGTACTGTgcgc(SEQ ID NO：42)
(BCL11A D12G5-2shRNA)：正义链
ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGAG(SEQ.ID.NO：43)
(BCL11A D12G5-2 shRNA)：反义链
CGCACTCGCACAGAACACTCATGGATTctctaccacatggagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGA(SEQ.ID.NO：44)
5′-CCGGCGCACAGAACACTCATGGATTCTCGAGAATCCATGAGTGTTCTGTGCGTTTTT-
3′(SEQ.ID.NO：86)
5′CGCTCGCACAGAACACTCATGGATTctccatgtggtagagAATCCATGAGTGTTCTGTGCGAGTG-3′(SEQ.ID.NO：87)
5′CGCTGCGCCGCACAGAACACTCATGctccatgtggtagagCATGAGTGTTCTGTGCGGCGCAGTG-3′(SEQ.ID.NO：88)
5′-CCGGACAGTACCCTGGAGAAACACACTCGAGTGTGTTTCTCCAGGGTACTGTTTTTT-
3′(SEQ.ID.NO：89)
5′-CGCTACAGTACCCTGGAGAAACACActccatgtggtagagTGTGTTTCTCCAGGGTACTGTAGTG-3′(SEQ.ID.NO：90)
5′CGCTGCGCACAGTACCCTGGAGAAActccatgtggtagagTTTCTCCAGGGTACTGTGCGCAGTG-3′(SEQ.ID.NO：91)
5′-CCGGTTCTCTTGCAACACGCACAGACTCGAGTCTGTGCGTGTTGCAAGAGAATTTTT-
3′(SEQ.ID.NO：92)
5′CGCTTTCTCTTGCAACACGCACAGActccatgtggtagagTCTGTGCGTGTTGCAAGAGAAAGTG-3′(SEQ.ID.NO：93)
5′CGCTGCGCTTCTCTTGCAACACGCActccatgtggtagagTGCGTGTTGCAAGAGAAGCGCAGTG-3′(SEQ.ID.NO：94)
5′-CCGGGATCGAGTGTTGAATAATGATCTCGAGATCATTATTCAACACTCGATCTTTTT-
3′(SEQ.ID.NO：95)
5′-CGCTGATCGAGTGTTGAATAATGATctccatgtggtagagATCATTATTCAACACTCGATCAGTG-3′(SEQ.ID.NO：96)
5′CGCTGCGCGATCGAGTGTTGAATAActccatgtggtagagTTATTCAACACTCGATCGCGCAGTG-3′(SEQ.ID.NO：97)

Claims (80)

1.一种合成的BCL11A microRNA，所述合成的BCL11A microRNA包含在5’至3’方向以串联方式排列的：
a)第一BCL11A片段、环片段；以及
b)第二BCL11A片段，
其中，所述环片段处于所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段之间并直接连接至所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段；以及
其中，所述第二BCL11A片段与所述第一BCL11A片段互补，从而使得所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段碱基配对以形成发夹环，所述环片段形成由此形成的所述发夹环的环部分。
2.如权利要求1所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段和所述第二BCL11A片段为约18个至25个核苷酸长。
3.如权利要求1或2所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段含有源自于BCL11A mRNA序列的序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段与所述第二BCL11A片段互补。
5.如权利要求1-4中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段在5’端以-GCGC-起始；所述第二BCL11A片段在3’端以-GCGC-结束。
6.如权利要求1-5中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述第一BCL11A片段选自于由以下所组成的组：
CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:46；源自于本文所述的BCL11A miR1寡核苷酸)、CCAGAGGATGACGATTGTTTA(SEQ.ID.NO:47；源自于本文所述的BCL11A miR2寡核苷酸)、TCGGAGACTCCAGACAATCGC(SEQ.ID.NO:48；源自于本文所述的BCL11A E3寡核苷酸或shRNA1或E3)、CCTCCAGGCAGCTCAAAGATC(SEQ.ID.NO:49；源自于本文所述的shRNA2或B5)、TCAGGACTAGGTGCAGAATGT(SEQ.ID.NO:50；源自于本文所述的shRNA4或B11)、TTCTCTTGCAACACGCACAGA(SEQ.ID.NO:51；源自于本文所述的BCL11A D8寡核苷酸或shRNA3或D8)、GATCGAGTGTTGAATAATGAT(SEQ.ID.NO:52；源自于本文所述的shRNA5或50D12或D12)、CAGTACCCTGGAGAAACACAT(SEQ.ID.NO:53；源自于本文所述的shRNA5或50A5)、CACTGTCCACAGGAGAAGCCA(SEQ.ID.NO:54；源自于本文所述的shRNA7或50B11)、ACAGTACCCTGGAGAAACACA(SEQ.ID.NO:55；源自于本文所述的BCL11A XLC4、shRNA8和50C4)、CAACAAGATGAAGAGCACCAA(SEQ.ID.NO:56；源自于本文所述的BCL11A非靶向寡核苷酸)、gcgcCGCACAGAACACTCATG(SEQ.ID.NO:57；源自于本文所述的miR1G5寡核苷酸)、GCGCTCGGAGACTCCAGACAA(SEQ.ID.NO:58；源自于本文所述的E3G5或E3mod寡核苷酸或shRNA1mod)、gcgcCCTCCAGGCAGCTCAAA(SEQ.ID.NO:59；源自于本文所述的B5G5或shRNA2mod)、gcgcTCAGGACTAGGTGCAGA(SEQ.ID.NO:60；源自于本文所述的B11G5或shRNA4mod)、gcgcGATCGAGTGTTGAATAA(SEQ.ID.NO:61；源自于本文所述的50D12G5、D12G4或shRNA5mod)、gcgcCAGTACCCTGGAGAAAC(SEQ.ID.NO:62；源自于本文所述的50A5G5或shRNA6mod)、gcgcCACTGTCCACAGGAGAA(SEQ.ID.NO:63；源自于本文所述的50B11G5或shRNA7mod)、GCGCTTCTCTTGCAACACGCA(SEQ.ID.NO:64；源自于本文所述的BCL11A D8G5或D8mod或shRNA3mod)、GCGCACAGTACCCTGGAGAAA(SEQ.ID.NO:65；源自于本文所述的BCL11AC4G5或C4mod或shRNA8mod)、CGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:66；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)以及ACGCTCGCACAGAACACTCATGGATT(SEQ.ID.NO:67；源自于本文所述的BCL11A D12G5-2)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述环片段源自于microRNA。
8.如权利要求7所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述microRNA是造血特异性microRNA。
9.如权利要求8所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述microRNA是miR223。
10.如权利要求9所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述环片段是ctccatgtggtagag。
11.如权利要求1-10中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述microRNA包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核苷酸序列。
12.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括在所述受试者中体内表达至少一种如权利要求1-11中任一项所述的合成的BCL11A microRNA。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述体内表达发生在所述受试者中的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中。
14.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：在所述受试者的胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞中表达至少一种如权利要求1-11中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述表达是离体表达；以及将所述细胞植入所述受试者。
15.一种增加细胞表达的胎儿血红蛋白水平的方法，所述方法包括在细胞中表达至少一种如权利要求1-11中任一项所述的合成的BCL11A microRNA，其中，所述细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中，将至少一种所述合成的BCL11AmicroRNA可操作地连接至启动子，并构建在载体中以用于真核细胞中的表达。
17.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其中，至少一种所述合成的BCL11AmicroRNA从RNA II聚合酶表达。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其中，至少一种所述合成的BCL11AmicroRNA不从RNA III聚合酶表达。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述启动子选自于由以下启动子所组成的组：
脾病灶形成病毒启动子、四环素诱导型启动子、或β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中，所述载体是病毒。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述病毒是慢病毒。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述慢病毒选自于由以下病毒所组成的组：
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
23.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含选自于由SEQ ID NO:1-10、13-18和25-44所组成的组中的核苷酸序列。
24.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
25.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
26.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
27.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
28.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
29.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
30.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。
31.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
32.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
33.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
34.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
35.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
36.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
37.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
38.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
39.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
40.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
41.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
42.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列。
43.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列。
44.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
45.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列。
46.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列。
47.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:33的核苷酸序列。
48.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:34的核苷酸序列。
49.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:35的核苷酸序列。
50.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:36的核苷酸序列。
51.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:37的核苷酸序列。
52.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:38的核苷酸序列。
53.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:39的核苷酸序列。
54.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:40的核苷酸序列。
55.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列。
56.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列。
57.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列。
58.如权利要求23所述的分离的核酸分子，其中，所述分子包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。
59.包含如权利要求23所述的分离的核酸分子的载体。
60.如权利要求59所述的载体，其中，所述载体进一步包含脾病灶形成病毒启动子、四环素诱导型启动子、或β-珠蛋白基因座控制区域和β-珠蛋白启动子。
61.包含如权利要求59或60所述的载体的宿主细胞。
62.如权利要求61所述的细胞，其中，所述细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
63.如权利要求61所述的细胞，其中，所述细胞是红细胞。
64.包含如权利要求23所述的分离的核酸分子的细菌。
65.包含如权利要求23所述的分离的核酸分子的病毒。
66.如权利要求65所述的病毒，其中，所述病毒是慢病毒。
67.如权利要求66所述的病毒，其中，所述慢病毒选自于由以下病毒所组成的组：
人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2型(HIV-2)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
68.一种组合物，所述组合物包含：如权利要求1-58中任一项所述的分离的核酸分子、如权利要求59或60所述的载体、如权利要求61-63中任一项所述的宿主细胞或如权利要求65-67中任一项所述的病毒。
69.一种组合物，所述组合物包含：如权利要求59或60所述的载体、如权利要求61-63中任一项所述的宿主细胞或如权利要求65-67中任一项所述的病毒。
70.如权利要求68或69所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体或稀释剂。
71.用于治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的如权利要求68-70中任一项所述的组合物。
72.用于制造治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的药物的如权利要求68-70中任一项所述的组合物。
73.用于增加细胞表达的胎儿血红蛋白水平的如权利要求68-70中任一项所述的组合物。
74.如权利要求73所述的组合物，其中，所述细胞是胚胎干细胞、体干细胞、祖细胞、骨髓细胞、造血干细胞或造血祖细胞。
75.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：给予所述受试者治疗有效量的如权利要求1-58中任一项所述的分离的核酸分子、如权利要求59或60所述的载体、如权利要求61-63中任一项所述的宿主细胞或如权利要求65-67中任一项所述的病毒，从而治疗所述受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险。
76.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括：给予所述受试者治疗有效量的如权利要求68-74中任一项所述的组合物，从而治疗所述受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险。
77.一种治疗受试者中的血红蛋白病或降低其发展风险的方法，所述方法包括增加所述受试者中的细胞表达的胎儿血红蛋白水平。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对患有血红蛋白病或处于发展为血红蛋白病风险中的受试者进行选择。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述血红蛋白病是镰状细胞疾病或地中海贫血。
80.如权利要求75-80中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给予所述受试者包含氧、羟基脲、叶酸或血液输注的治疗。
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