CN109641063A

CN109641063A - 用于增强pklr的基因表达的组合物和方法

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Publication number: CN109641063A
Application number: CN201780037995.0A
Authority: CN
Inventors: J·C·塞格维亚; M·G·戈梅兹; S·纳瓦罗; N·麦扎; J·布埃伦; M·G·布莱沃
Original assignee: Himenis Diaz Health Research Foundation Institute; Mp Center Of Biomedical Network Research Consortium; Research Center For Energy Environment And Technology Oa Mp
Current assignee: Himenis Diaz Health Research Foundation Institute; Mp Center Of Biomedical Network Research Consortium; Research Center For Energy Environment And Technology Oa Mp
Priority date: 2016-04-20
Filing date: 2017-04-20
Publication date: 2019-04-16
Anticipated expiration: 2037-04-20
Also published as: AU2017254665B2; AU2021200872B2; CN109641063B; JP7045362B2; KR102440880B1; MX2018012872A; PT3445406T; JP2019514422A; KR20190053136A; AU2017254665C1; AU2021200872A1; JP2022101543A; WO2017184903A1; BR112018071695A2; RU2018140783A3; EP3445406A1; EP3445406A4; RU2018140783A; IL262459A; EP3445406B1

Abstract

本公开提供了用于在哺乳动物细胞中表达基因以便为丙酮酸激酶缺乏症提供基因疗法的多核苷酸盒、表达载体和方法。

Description

用于增强PKLR的基因表达的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年4月20日提交的美国临时申请号62/325,397的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及丙酮酸激酶缺乏症的基因疗法。

发明背景

丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是由PKLR基因突变引起的单基因代谢疾病，其导致可变症状的溶血性贫血，并且在新生儿期可能是致命的。PKD隐性遗传性状及其通过同种异体骨髓移植的治愈性治疗为开发基因治疗方法提供了理想的方案。

在影响红细胞的许多其他遗传性酶缺乏中，丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是引起慢性非球形红细胞性溶血性贫血(chronic nonspherocytic hemolytic anemia，CNSHA)的最常见因素(Zanella等，2007)。PKD的发作和严重性变化很大，范围从轻微到严重的新生儿贫血，在最严重的病例中在童年期间变得致命(Pissard等2006)。新生儿期间的生长迟缓、胎儿水肿和死亡也以低频率有过报道(Gilsanz等，1993)。一般高加索人群中PKD患病率估计为1:20,000(Beutler等，2000)，到目前为止，在PKLR基因中已鉴定出超过195种不同的突变(http://www.lovd.nl/pklr)。同种异体骨髓移植(BMT)已被成功用于治愈严重PKD患者(Tanphaichitr等2000)，但组织相容性供体的低可得性和与这些患者的BMT相关的严重并发症(即移植物抗宿主病、机会性感染等)使得定期输血和脾切除术成为大多数PKD的严重形式的主要治疗选择(Zanella等2005)，这大大提高了患者的发病率和死亡率(Hilgard等2005)。对于严重PKD患者及其隐性遗传性状的治疗选择的有限功效和副作用使得PKD成为通过基因疗法治疗的合适疾病。

PKD是由丙酮酸激酶(PK)中的缺陷引起的(Zanella 2005)，该酶催化所有细胞中糖酵解途径的最后ATP产生反应。在成熟的红细胞中，PK变得必不可少，因为RBC仅表达R型特异性同种型(RPK)(Kanno等1992)，这归因于PKLR基因座的红系特异性替代启动子的调节(Noguchi等1987)。因此，任何RPK活性的丧失都会损害RBC代谢和寿命(Zanella 2005)，导致CNSHA。

治疗和预防遗传和其他疾病和病症的一种有希望的方法是用基因治疗载体递送治疗剂。目前，病毒载体在基因转移中表现出最大的效率，并且为了校正遗传疾病而使得需要持久的基因表达，疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或基于AAV的载体因病毒生命周期的整合性质而为理想的载体。

单基因疾病，特别是那些影响造血系统的疾病的基因疗法，已经提供了令人信服的证据，即自体造血干细胞(HSC)的遗传校正是对同种异体HSCT的替代治疗选择，避免了其主要并发症(Cartier等2009；Cavazzana-Calvo等2010；Cartier等2012；Aiuti等2013；Biffi等2013)。对影响红细胞的疾病(例如β地中海贫血和镰状细胞病)的遗传校正已在动物模型(Pestina等2009l Breda等2012)以及也在人(Cavazzana-Calvo等2010)中得到解决。然而，遗传性红系代谢缺陷诸如PKD的基因治疗方法仍然有限。已经在小鼠(Tani等1994；Meza等2009)和狗RPK缺陷型实验模型(Trobridge等2012)中证实了HSC基因疗法治疗PKD的可行性，鉴于缺乏供体基因校正的HSC的选择优势，这些实验结果显示了供体嵌合和转导水平是实现溶血表型的高效校正的关键点(Richard等，2004)。先前使用PKD小鼠模型的工作表明，当移植超过25％的遗传修正细胞时，逆转录病毒来源的人RPK表达能够完全校正PKD表型(Meza等2009)。最近在一只注入体内扩增和泡沫载体校正的HSC的PKD Basenji狗中报道了校正细胞的相似治疗阈值(Trobridge等，2012)。

在设计用于基因疗法的多核苷酸盒和表达载体方面仍然存在许多挑战。一个重要的挑战是在靶细胞中获得足够的转基因表达。本领域中一个长期未满足的需求是基因转移后转基因的足够稳健的表达。在一些情况下，某些载体(例如质粒DNA载体)的功效需要更高效的表达。在其他情况下，需要更高效的基因表达盒以允许具有更有利的安全性谱或较低侵入性施用途径的较低治疗剂量。

当使用γ逆转录病毒(γ-RV)载体时，由于治疗性转基因表达受其LTR序列调节的事实，可以实现高水平的转基因表达。然而，基于此类型载体的首次临床试验引起了安全性问题，因为几个患者出现了意外的白血病(Hacein-Bey-Abina等2008)。LTR序列的强启动子活性可通过激活原癌基因启动子或通过抑制肿瘤抑制基因(从而导致插入诱变)影响周围基因的调节(Ott等2006；Howe等2008；Stein等2010；Braun等2014)。这些发现突出了使用比γ逆转录病毒载体更安全和更高效的载体进行PKD基因治疗的必要性。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了包含多核苷酸序列的表达盒，所述多核苷酸序列包含：a)启动子序列；b)编码基因产物的序列；c)核糖核酸(RNA)输出信号，其中启动子序列与编码丙酮酸激酶多肽的序列可操作地连接，并且任选地，其中a)-c)以5'至3'的顺序存在于表达盒中。在某些实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，基因产物是治疗性基因产物。在一些实施方案中，治疗性基因产物是丙酮酸激酶(PK)多肽，任选地丙酮酸激酶肝和红细胞(PKLR)多肽。在某些实施方案中，编码所述基因产物的序列是密码子优化的。在特定的实施方案中，RNA输出信号是土拨鼠肝炎病毒的突变的转录后调控元件(Wpre)。在某些实施方案中，突变的Wpre是嵌合Wpre，其包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，表达盒还包含一种或多种增强子序列。在一些实施方案中，表达盒还包含多嘌呤区(polypurine tract,PPT)或多腺苷酸化(polyA)信号序列。在一些实施方案中，表达盒还包含以下序列中的一种或多种：i)包装信号序列；ii)截短的Gag序列；iii)Rev响应元件(RRE)；iv)中央多嘌呤区(cPPT)；v)中央末端序列(CTS)；和vi)上游序列元件(USE)，任选地来自猿猴病毒40(SV40-USE)。在一些实施方案中，表达盒还包含5'和3'长末端重复序列。

在一个相关实施方案中，本发明提供了重组基因递送载体，其包含本文公开的表达盒。在某些实施方案中，重组基因递送载体是病毒或病毒载体。在某些实施方案中，病毒或病毒载体是慢病毒(LV)。

在另一相关实施方案中，本发明提供了包含本文公开的表达盒或基因递送载体的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是血细胞。在一些实施方案中，所述细胞是红系细胞。在一些实施方案中，所述细胞是骨髓细胞，例如谱系贫化的骨髓细胞(lineage depletedbone marrow cell)。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是CD34+造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是定型的造血红系祖细胞。

在另一个相关的实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和本文公开的重组基因递送载体或细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗或预防有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，包括向受试者提供本文公开的表达盒、基因递送载体或药物组合物。在一个实施方案中，所述疾病或病症是丙酮酸激酶缺乏症(PKD)，并且所述基因产物是丙酮酸激酶(PK)多肽，任选地丙酮酸激酶肝和红细胞(PKLR)多肽。在某些实施方案中，药物组合物包含重组基因递送载体。在其他实施方案中，药物组合物包含细胞。在一个实施方案中，所述细胞对受试者是自体的。在另一个实施方案中，所述细胞对受试者是同种异体的。

在一个相关的实施方案中，本发明提供了用于在红系细胞中表达转基因的方法，其包括使一种或多种红系细胞与有效量的重组病毒载体接触，其中所述载体包含人磷酸甘油酸激酶启动子、密码子优化形式的人丙酮酸激酶肝和红细胞(PKLR)cDNA转基因，以及土拨鼠肝炎病毒的突变的转录后调控元件，其中在所述接触后，PKLR在所述一种或多种红系细胞中以可检测的水平表达。

附图简述

在所附权利要求中具体地阐述了本公开的新颖特征。通过参考以下详细描述以及附图将获得对本发明的特征和有利方面的更好理解，所述详细描述阐述了利用本发明原理的说明性实施例，其中附图中：

图1描绘了反映存在于慢病毒载体骨架中的不同的描述元件的位置的示意图。

图2A是在整个基因疗法实验中使用的自我失活型慢病毒载体的示意图，所述自我失活型慢病毒载体含有调节对照载体中的EGFP转基因(上图)的表达或治疗性载体中的PKLR基因cDNA的密码子优化序列(coRPK)(下图)的表达的人PGK启动子。

图2b是为解决所开发的PGK-coRPK慢病毒载体的功能而进行的示意性基因治疗方案。

图3a-d描绘了显示在遗传校正后初次接受者的外周血中PKD表型的校正的数据。图3a RBC和图3b是健康(黑色条，n＝5)和PKD贫血小鼠(灰色条，n＝6)，以及用EGFP(白色条，n＝9)或coRPK转导(划痕条(scratched bar)，n＝17)的细胞移植的PKD贫血小鼠的网织红细胞水平。数据表示为平均值±SEM，并通过非参数Kruskal-Wallis检验进行分析。图3c显示用于在整个时间内检测生物素标记的RBC的流式细胞术策略，图3d健康(黑线，n＝2)、贫血(灰线，n＝2)和遗传校正的小鼠(不连续线，n＝4)中的RBC存活动力学。数据表示为平均值±SEM，并通过双因素ANOVA检验进行分析。健康，非移植的对照小鼠；PKD，非移植的PKD小鼠；coRPK，表达治疗性转基因的PKD小鼠。

图4a-c显示二次移植小鼠中的多谱系造血重建。图4a是用于通过用CD3-PE、B220-PE、B220-PECy5、Gr1-生物素和Mac1-生物素抗体加SAV-PE-Cy5标记来鉴定不同造血谱系的流式细胞术策略的图示。图4b描绘了代表性的点图，而图4c描绘了移植后140天PB中每个谱系的百分比。条代表健康(n＝2，黑色条)和PKD小鼠(n＝2，灰色条)对照和表达coRPK治疗性转基因的二次移植小鼠(n＝4，斜线条)的平均百分比±SEM。

图5a-d描绘了二次移植小鼠中的PKD表型校正。图5a显示来自非移植小鼠和次级接受者的血涂片的亮甲酚蓝染色，以鉴定网织红细胞群(以蓝色显示的)。图5b是外周血中网织红细胞水平的流式细胞术分析。图5c表示RBC百分比，图5d表示表达coRPK转基因的二次移植小鼠(斜线条，n＝4)、健康小鼠(黑色条，n＝3)和贫血对照小鼠(灰色条，n＝3)中的网织红细胞百分比。数据表示为平均值±SEM，并通过非参数双尾Mann-Whitney检验进行分析。

图6a-c显示前病毒整合的定量。图6a显示移植后120至170天来自个体移植小鼠的以BM CFU表示的每个细胞的载体拷贝数。还显示了转导和嵌合百分比。图6b显示来自不同造血区室的细胞中的前病毒拷贝数。柱代表不同组移植小鼠的平均值±SEM。图6c显示来自移植的表达EGFP的小鼠个体(灰线)和携带coRPK转基因的小鼠(黑线)的BM细胞中前病毒整合的动力学。

图7a-c描绘经遗传校正的小鼠中红系细胞分化模式的标准化。图7a显示移植后140天骨髓和脾中不同红系亚群的百分比。图7b描绘了所用流式细胞术策略的代表性点图。CD71和Ter119标志物的表达强度允许鉴定四个红系亚群。群体I：早期前成红细胞(Ter119^中CD71^高)，群体II：嗜碱性成红细胞(Ter119^高CD71^高)，群体III：晚期嗜碱性和嗜多染性成红细胞(Ter119^高CD71^中)和群体IV：嗜正染色幼红细胞(orthochromatophilic erythroblasts)、网织红细胞和成熟红系细胞(Ter119^high CD71^low)。图7c显示在非移植和移植小鼠中通过ELISA测量的血浆Epo水平。点代表个体小鼠的值。线代表平均值±SEM，并通过非参数Kruskal-Wallis检验进行分析。健康，非移植的对照小鼠；PKD，非移植的PKD小鼠；EGFP，表达EGFP转基因的PKD小鼠；coRPK，表达治疗性转基因的PKD小鼠。

图8a-b显示对照小鼠和具有转导细胞的移植小鼠中的造血祖细胞测定。数据显示移植后140天来自脾(图8a)和骨髓(图8b)的总CFU。点代表分析的每只小鼠的集落数，线代表每组的平均值±SEM。通过非参数Kruskal-Wallis检验对数据进行统计学分析。

图9a-c显示在移植后140天在遗传校正的小鼠中脾肿大和器官病理学的逆转。图9a是代表性脾的图片。图9b显示来自原代和第二代移植PKD小鼠的脾重量与总体重的比率。点代表个体小鼠的值。线代表每组的平均值±SEM。通过非参数Kruskal-Wallis检验分析数据。图9c显示来自原代移植的PKD小鼠的脾和肝的组织学研究。第一和第二栏显示用苏木精-伊红染色的脾和肝的代表性组织切片，并在光学显微镜下分别使用4x和10x物镜拍照。箭头指向指示髓外红细胞生成的红系细胞团簇(erythroid cell cluster)。第三列显示肝切片的普鲁士蓝染色(Fe)以检测箭头指示的铁沉积物。照片是使用20倍物镜拍摄的。组图图例说明例如图7所示。2^nd coRPK，第二代受者。

图10a-g描绘移植有遗传修饰细胞的小鼠的RBC样品中的代谢谱分析。通过在两个独立实验中与PKD动物比较，分析健康和移植小鼠中显著的代谢谱变化。图10a显示通过非靶向谱分析获得的完整RBC热图，其中较高和较低代谢物水平分别以红色和蓝色表示。列出的代谢物具有至少一个使用以下标准判断为显著的比较：绝对倍数变化>1.5；最小信号>2000；调整后的p值<0.01。黑框突出了在组间具有不同谱的代谢物变化的聚簇。图10b、10c和10d分别描绘了通过在移植后140天与PKD小鼠比较的非靶向谱分析所测量的RBC中的ATP、ADP和丙酮酸水平。测定1：健康小鼠(黑色条)n＝1，PKD(灰色条)n＝1，hPGK-EGFP(白色条)n＝2，hPGK-coRPK(划痕条)n＝3。测定2：健康小鼠n＝2，PKD n＝2，hPGK-EGFP n＝6，hPGK-coRPK n＝10。图10e、10f和10g描绘了在移植后280天，参与糖酵解途径(分别为PEP、3-磷酸甘油酸和D-乳酸)的选定数量的代谢物的RBC靶向代谢谱分析。点代表个体小鼠的值。线代表平均值±SEM，并通过非参数Kruskal-Wallis检验进行分析。测定2：健康小鼠n＝7，PKD n＝5，hPGK-EGFP n＝3，hPGK-coRPK n＝5。

图11a-c描绘丙酮酸激酶活性。图11b描绘己糖激酶活性，图11c描绘来自对照小鼠和用转导细胞移植的小鼠的RBC中丙酮酸激酶对己糖激酶酶促活性的比率。通过纤维素柱从血液样品中纯化RBC以避免白细胞PK活性污染并进行酶活性评估。黑条，健康小鼠(n＝2)；白条，移植了用表达EGFP的载体转导的细胞的小鼠(n＝3)；划痕条，移植了用coRPK表达载体转导的细胞的小鼠(n＝3)。方格条表示来自健康志愿者的值(n＝1)。数据代表每组的平均值±SEM。

图12a-d显示来自移植有遗传修饰细胞的小鼠的WBC样品中的非靶向代谢谱分析。图12a表示对照和移植小鼠中RBC(红点；左和中)和WBC(蓝点；右边上的聚簇)中的非靶向代谢物谱的主成分分析。图12b、12c和12d分别描绘通过与PKD小鼠比较获得的WBC中的ATP、ADP和丙酮酸水平。测定1：健康小鼠(黑色条)n＝1，PKD(灰色条)n＝1，hPGK-EGFP(白色条)n＝2，hPGK-coRPK(划痕条)n＝3。测定2：健康小鼠n＝2，PKD n＝2，hPGK-EGFP n＝6，hPGK-coRPK n＝10。数据代表每组的平均值±SEM，并通过非参数Kruskal-Wallis检验进行分析。

图13显示对于在不同时间点和组织从所有小鼠收获的样品用Tsp509I酶产生的LAM-PCR产物的凝胶图像。通过3’LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增鉴定了载体整合位点。使用MultiNA自动化系统，产生以几个带为特征的模式。载体骨架衍生的Tsp509I内部对照条带(IC)用箭头表示。

图14显示对于在不同时间点和组织从所有小鼠收获的样品用HpyCH4IV5酶产生的LAM-PCR产物的凝胶图像。通过3'载体LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增鉴定了载体整合位点。使用MultiNA自动化系统，产生以几个带为特征的模式。载体骨架来源的HpyCH4IV5内部对照条带(IC)用箭头表示。

图15描绘在移植有遗传修饰的造血祖细胞的小鼠中进行的整合位点作图的分析的一般方案。如补充方法中所述，按照显示的管道分析来自属于两个独立实验(表3)的移植小鼠并在移植后的不同时间点收获的骨髓和白细胞样品。

图16a-b显示沿着移植小鼠的基因组的LV整合的分布。图16a描绘最近的RefSeq基因的转录起始位位点(TSS)周围(其跨越TSS的上游和下游500Kb)的整合位点(IS)频率分布。顶部的数字是针对所有样本和时间点检测到的IS的数量。图16b描绘表达EGFP转基因(黑色条)或coRPK治疗性转基因(灰色条)的移植小鼠中LV整合位点的染色体分布，未显示向任何特定染色体的偏斜。

图17a-c显示coRPK-LV转导细胞的克隆丰度分析。来自测定1(图17a)和2(图17b和17c)的每只小鼠中汇集的整合的克隆丰度的点图表示。每个整合位点的相对百分比(y轴)是相对于在每个数据集中获得的序列读数的总数。IS，整合位站；BM，骨髓；PB，外周血；coRPK1-14，移植有用治疗性载体转导的造血细胞的小鼠。

图18呈现携带治疗性PGK-coRPK LV载体的原代与第二代受者小鼠之间的跟踪共享整合(tracked shared integration)。合并在任何器官和任何时间在任一小鼠中检测到的整合。第二代受者接受来自移植的小鼠coRPK11至14的合并的BM。检测到的其余IS被检测到或存在于原代或第二代受者中。方框中的数字表示提及的小鼠中相应整合的百分比的代表性。除了在整合分析中应用≥5％的滤波器(filter)外，还消除了序列计数<3的所有整合。

图19显示了EGFP-LV转导的细胞的克隆丰度分析。骨髓中每只小鼠的合并整合的克隆丰度的点图表示。每个整合位点的相对百分比(y轴)是相对于在每个数据集中获得的序列读数的总数。与共-RPK转导的细胞类似(图17)，该图表明绝大多数移植的小鼠显示出造血再生群体的多克隆模式。IS，整合位点。

图20描绘了LV基因组整合概况。使用GREAT软件对来自移植小鼠的样品进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析。从该研究中检索到的所有整合(N＝2220)显示在图的左侧部分指示的基因功能的过度展示。为了阐明最丰富的整合是否在特定基因类别上富集，选择具有>5％的整个数据集的相对序列计数的所有整合位点(如图17所示)，显示没有GO基因类别被过度展示。

图21描绘了药物产品(PGK-coRPK LV)的示意图。

图22a-b描绘药物产品的作用机理。图22a描绘了PGK-coRPK LV药物产品的异位表达将拯救PKD红细胞的野生型表型，否则不能产生功能性RPK蛋白质来产生足以执行其功能的能量。图22b显示PKD患者的基因治疗策略，其基于利用药物产品对RPK缺陷型CD34⁺造血祖细胞进行离体转导并随后移植入患者体内。将在离体转导后将携带治疗性人PKLR基因cDNA的开发的医疗产品整合到患者CD34⁺细胞基因组中。然后将这些经遗传校正的细胞输注回患者体内，在那里它们将产生表达治疗性转基因的RBC，从而产生可校正PKD病理表型的功能性RPK蛋白。图片修改自波士顿儿童医院博客。

发明详述

定义

如本文所用的“载体”是指大分子或大分子的缔合物，其包含多核苷酸或与多核苷酸缔合，并且可用于介导多核苷酸向细胞的递送。示例性的载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。

术语“LV”是慢病毒的缩写，并且可以用于指病毒本身或其衍生物。除非另有要求，否则该术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式。

如本文中所用，术语“基因”或“编码序列”是指编码基因产物的体外或体内核苷酸序列。在某些情况下，该基因由编码序列(即编码基因产物的序列)组成或基本上由其组成。在其他情况下，该基因包含另外的非编码序列。例如，基因可以包括或不包括编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾随”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

如本文所用，“治疗性基因”是指这样的基因，其在表达时对其所存在的细胞或组织或其中表达该基因的哺乳动物赋予有益作用。有益作用的实例包括改善病况或疾病的体征或症状，预防或抑制病况或疾病，或赋予所需特征。治疗性基因包括校正细胞或哺乳动物中的遗传缺陷的基因。

如本文中所用，转基因是通过载体递送至细胞的基因。

如本文中所用，术语“基因产物”是指多核苷酸序列的所需表达产物(诸如多肽、肽、蛋白质或干扰RNA，包括短干扰RNA(siRNA)、miRNA或小发夹RNA(shRNA)。

如本文中所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸聚合物。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化或与标记组分的缀合。

“包含”意指所述元素在例如组合物、方法、试剂盒等中是所需的，但可包括其他元素以形成例如在权利要求的范围内的组合物，方法，试剂盒等。例如，“包含”编码与启动子可操作地连接的治疗性多肽的基因的表达盒是这样的表达盒，其可包括除了基因和启动子以外的其他元件，例如多腺苷酸化序列、增强子元件、其他基因，接头结构域等。

“基本上由......组成”是指对例如针对指定的材料或步骤所描述的组合物、方法、试剂盒等的范围的限制，所述材料和步骤对于例如组合物、方法、试剂盒等的一个或多个基本和新颖的特征没有实质影响。例如，组合物，方法，试剂盒等的表达盒。例如，“基本上由与启动子和多腺苷酸化序列可操作地连接的编码治疗性多肽的基因组成”的表达盒可包括另外的序列，例如接头序列，只要它们不会实质上影响基因的转录或翻译。作为另一个实例，“基本上由所述序列组成”的变体或突变体多肽片段具有基于其所源自的全长天然多肽，在所述序列的边界处加上或减去约10个氨基酸残基的所述序列的氨基酸序列，例如比所述边界氨基酸残基少10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个残基，或比所述边界氨基酸残基多10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个残基。

“由......组成”是指从所述组合物、方法或试剂盒中排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。例如，“由与启动子可操作地连接的编码治疗性多肽的基因和转录后调控元件组成”的表达盒仅由启动子、编码治疗性多肽的多核苷酸序列和转录后调控元件组成。作为另一个实例，“由所述序列组成”的多肽仅含有所述序列。

本文使用的“表达载体”涵盖如上论述或如本领域已知的载体，例如质粒、微环、病毒载体、脂质体等，其包含编码目的基因产物的多核苷酸，并用于实现基因产物在预期靶细胞中的表达。表达载体还包含与编码区可操作地连接的控制元件，以促进基因产物在靶中的表达。控制元件例如启动子、增强子、UTR、miRNA靶向序列等与与它们可操作地连接以进行表达的一种或多种基因的组合有时称为“表达盒”。许多这样的控制元件是本领域已知的和可获得的或者可由在本领域可获得的组件容易地构建。

本文所用的“启动子”涵盖指导RNA聚合酶结合从而促进RNA合成的DNA序列，即足以指导转录的最小序列。启动子和相应的蛋白质或多肽表达可以是普遍存在的，意味着在广泛的细胞、组织和物种或细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性中具有强活性。启动子可以是“组成型的”，意指具有持续活性，或“诱导型的”，意指启动子可通过生物或非生物因子的存在或不存在而被激活或失活。还包括在本发明的核酸构建体或载体中的是增强子序列，其可以与或不与启动子序列邻接。增强子序列影响启动子依赖性基因表达，并且可位于天然基因的5'或3'区域。

本文使用的“增强子”包括刺激或抑制相邻基因转录的顺式作用元件。抑制转录的增强子也被称为“沉默子”。增强子可以在任一方向上，在距编码序列多达数千碱基对(kb)的距离上和从转录区下游的位置起作用(即，可以与编码序列相关)。

本文使用的“终止信号序列”涵盖导致RNA聚合酶终止转录的任何遗传元件，诸如例如多腺苷酸化信号序列。

如本文中所用，术语“可操作地连接”或“可操作地连接的”是指遗传元件例如启动子、增强子、终止信号序列、多腺苷酸化序列等的并置，其中所述元件处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子与编码区可操作地连接。只要保持这种功能关系，在启动子与编码区之间可能存在间插残基。

如本文中所用，术语“异源的”意指源自与其进行比较的实体的其余部分的来源在基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术引入到源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。作为另一个实例，从其天然编码序列中取出并与在自然界中未发现与其连接的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。因此，例如，包含编码异源基因产物的异源核酸的LV载体是这样的LV载体，其包括通常不包含在天然存在的野生型LV中的核酸，并且编码的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型LV编码的基因产物。

如本文中所用，关于核苷酸分子或基因产物的术语“内源的”是指天然存在于宿主病毒或细胞中或与之相关的核酸序列，例如基因或遗传元件，或基因产物，例如RNA、蛋白质。

如本文所用的术语“天然的”是指存在于野生型病毒或细胞中的核苷酸序列，例如基因或基因产物，例如RNA、蛋白质。

如本文中所用的术语“变体”是指参考多核苷酸或多肽序列例如天然多核苷酸或多肽序列的突变体，即与参考多核苷酸或多肽序列具有小于100％的序列同一性。换句话说，变体相对于参考多核苷酸序列(例如天然多核苷酸)或多肽序列包含至少一个氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)。例如，变体可以是与全长天然多核苷酸序列具有70％或更高的序列同一性，与全长天然多核苷酸序列具有75％或80％或更高，诸如85％、90％或95％或更高，例如98％或99％的同一性的多核苷酸。作为另一个实例，变体可以是与全长天然多肽序列具有70％或更高的序列同一性，例如与全长天然多肽序列具有75％或80％或更高，诸如85％、90％或95％或更高，例如98％或99％的同一性的多肽。变体还可包括参考(例如天然)序列的变体片段，其与参考(例如天然)序列的片段共有70％或更高的序列同一性，例如与天然序列共有75％或80％或更高，诸如85％、90％或95％或更高的同一性，例如98％或99％的同一性。

如本文中所用，术语“生物活性”和“生物活性的”是指归因于细胞中特定生物元件的活性。例如，“免疫球蛋白”、“抗体”或其片段或变体的“生物活性”是指结合抗原决定簇从而促进免疫功能的能力。作为另一个实例，多肽或其功能性片段或变体的生物活性是指多肽或其功能性片段或变体实现其天然功能例如结合、酶促活性等的能力。作为第三实例，基因调控元件(例如启动子、增强子、kozak序列等)的生物活性是指调控元件或其功能性片段或变体调控(即分别促进、增强或激活)与其可操作地连接的基因的翻译、表达的能力。

如本文中所用，术语“施用”或“引入”是指将重组蛋白表达的载体递送至细胞、受试者的细胞和/或器官，或受试者。此类施用或引入可以在体内、体外或离体进行。可通过转染将用于表达基因产物的载体引入细胞中，这通常意味着通过转染(其通常意指物理手段(例如，磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂质转染)将异源DNA插入细胞中)、感染(其通常是指通过传染因子(即病毒)的方式引入)或转导(其通常是指用病毒稳定感染细胞或通过病毒剂(例如噬菌体)的方式将遗传物质从一种微生物转移到另一种微生物)将用于基因产物表达的载体引入细胞。

“转化”通常用于指包含异源DNA的细菌或表达癌基因、从而已被转化成连续生长模式的细胞(诸如肿瘤细胞)。用于“转化”细胞的载体可以是质粒、病毒或其他媒介物。

通常，细胞被称为“转导的”、“感染的”、“转染的”或“转化的”，这取决于用于向细胞施用、引入或插入异源DNA(即载体)的手段。无论引入异源DNA的方法如何，术语“转导的”、“转染的”和“转化的”在本文中可互换使用。

如本文中所用，术语“宿主细胞”是指已用载体转导、感染、转染或转化的细胞。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。培养条件诸如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。应理解，术语“宿主细胞”是指原始转导、感染、转染或转化的细胞及其后代。

术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等在本文中通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，效果可以是预防性的，例如降低疾病或其症状在受试者中发生的可能性，和/或就疾病的部分或完全治愈和/或可归因于疾病的不利影响而言可以是治疗性的。本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。当治疗稳定或减少患者的不希望的临床症状的情况时，现有疾病的该治疗特别令人感兴趣。期望在受影响的组织中完全丧失功能之前进行此类治疗。主题疗法理想地将在疾病的症状阶段期间施用，在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，包括但不限于人和非人灵长类动物，包括猿猴和人；哺乳类运动动物(例如马)；农场哺乳类动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；和啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。

本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而无意限制本发明。如本文中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”也意欲包括复数形式。此外，在详述和/或权利要求中使用术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“带有(with)”或其变化形式的程度上，此类术语以类似于术语“包含(comprising)”的方式意图为内含式的。

术语“约”或“大约”是指对于由本领域普通技术人员确定的特定数值在可接受的误差范围内，其将部分地取决于如何测量或确定该数值，即测量系统的限度。例如，按照本领域中的实践，“约”可表示在1个或多于1个标准差内。或者，“约”可表示给定数值的不超过20％、优选地不超过10％、更优选地不超过5％、仍更优选地不超过1％的范围。或者，尤其是有关生物系统或方法，该术语可表示在数值的数量级内，优选地在5倍内，更优选地在2倍内。当在本申请和权利要求书中描述特定数值时，除非另外指明，否则应假设术语“约”对特定数值表示在可接受的误差范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有术语具有与本领域技术人员对其所理解的含义相同的含义，并且本发明的实践将采用微生物学的常规技术和重组DNA技术，所述技术在本领域技术人员的知识范围内。

除非另有说明，否则本发明的实践采用细胞生物学、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的范围内。此类技术在文献中有充分解释，所述文献为诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第2版(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait，编辑，1984)；“AnimalCell Culture”(R.I.Freshney，编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”(D.M.Weir&C.C.Blackwell，编辑)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M.Miller&M.P.Calos，编辑1987)；Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等，编辑，1987)；“PCR:ThePolymerase Chain Reaction”,(Mullis等，编辑，1994)和“Current Protocols inImmunology”(J.E.Coligan等，编辑，1991)，其中的每一个都通过引用明确地并入本文。

在某些实施方案中，本公开提供了用于在细胞中表达基因的多核苷酸、多核苷酸盒和表达载体。还提供了药物组合物和使用所述组合物中的任何组合物促进基因在细胞中表达(例如在个体中，例如用于治疗或预防病症)的方法。本领域技术人员在阅读下面更全面描述的组合物和方法的细节后，本发明的这些和其它目的、有利方面和特征将变得显而易见。

本发明总体上涉及分子生物学和病毒学领域，尤其涉及遗传表达盒，以及包含它们的载体，所述载体可用于将编码所选治疗性构建体(包括例如肽、多肽、核酶和催化性RNA分子)的核酸区段递送至脊椎动物的所选细胞和组织。特别地，这些遗传构建体可用于开发基因治疗载体，包括例如慢病毒载体，用于治疗哺乳动物(特别是人)的疾病、病症和功能障碍。

所公开的组合物可用于多种研究、诊断和治疗方案，包括预防和治疗多种人疾病。下面描述本发明的各种组合物和方法。

尽管本文举例说明了特定的组合物和方法，但应理解，许多替代组合物和方法中的任何一种都是适用的并适合用于实施本发明。还应理解，可使用本领域的标准方法进行本发明的表达构建体和方法的评估。

在某些实施方案中，提供了用于制备基因治疗载体组合物(例如，病毒载体)的方法和组合物，所述基因治疗载体组合物包含用于制备药剂的这些基因表达盒，所述药剂可用于动物(特别是人)的疾病、病症和功能障碍的中枢和靶向基因疗法。

在一些实施方案中，本发明提供了基于含有驱动PKLR cDNA表达的hPGK真核启动子的慢病毒载体的PKD的基因疗法。该治疗性载体可用于转导小鼠PKD造血干细胞(HSC)，随后移植到清髓性PKD小鼠中。异位RPK表达使红系区室正常化，从而校正血液学表型并恢复器官病理学。代谢组学研究证明了源自经遗传校正的PKD HSC的RBC中糖酵解途径的功能性校正，白细胞中没有代谢紊乱。对移植的造血细胞基因组中的慢病毒插入位点的分析表明，在任何移植的动物中都没有遗传毒性的证据。总体而言，该结果强调了慢病毒载体的治疗潜力，并且对PKD和其他红系代谢遗传病的基因疗法提供了高期望。

在某些实施方案中，本发明提供用于PKD遗传校正的RPK慢病毒载体(LV)。用该载体对小鼠PKD-HSC进行遗传修饰可以高效地校正移植的PKD小鼠中的溶血表型和RBC代谢物谱。值得注意的是，没有观察到白细胞中代谢紊乱和源自载体整合的遗传毒性的证据，支持了PGK-coRPK LV载体的治疗潜力。总体而言，结果提供了利用设计用于临床应用的LV对PKD进行基因疗法的可行性的令人鼓舞的证据。

本发明的某些实施方案包含表达人PKLR基因的密码子优化形式的自我失活型慢病毒载体。表达载体包含启动子区、编码序列和转录后调控元件。

本发明的多核苷酸盒的某些实施方案包含启动子区，其包含启动子序列或其功能性片段。在一个实施方案中，启动子是人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

本发明的一些实施方案包括用于增强丙酮酸激酶表达的多核苷酸盒。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含人PKLR cDNA(coRPK)的密码子优化形式，以在转录时增加mRNA稳定性。为了优化，可以使用软件，增加GC含量并去除隐蔽的剪接位点以避免转录沉默并因此增加转基因表达。coRPK优化的序列与人PKLR基因显示出80.4％的同源性，蛋白质的氨基酸序列没有变化。或者，可使用本领域已知的任何优化方法。

在一些实施方案中，多核苷酸盒包含在第二增强子下游的RNA输出信号。RNA输出信号可包括土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)序列。在一些实施方案中，还包括缺少任何残留开放阅读框架的土拨鼠肝炎病毒的突变的转录后调控元件(Wpre)(Schambach，Bohne等，2006)，以提高治疗性基因的表达水平和稳定性。

在本发明的一些方面，提供了包含本发明的多核苷酸盒的基因递送载体。在一些实施方案中，基因递送载体是慢病毒。

在本发明的一些方面，提供了药物组合物，其包含本发明的多核苷酸盒和药物赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含本发明的基因递送载体和药物赋形剂。

在本发明的一些方面，提供了用于在哺乳动物细胞中表达转基因的方法。在一些实施方案中，该方法包括使一种或多种哺乳动物细胞与有效量的本发明的多核苷酸盒或本发明的基因递送载体接触，其中转基因在所述一种或多种哺乳动物细胞中以可检测的水平表达。在一些实施方案中，该方法包括使一种或多种哺乳动物细胞与有效量的本发明的多核苷酸盒或本发明的基因递送载体接触，其中转基因在所述一种或多种哺乳动物细胞中以治疗水平表达。在一些实施方案中，该方法是体外的。在其他实施方案中，该方法是体内的。

在本发明的一些方面，提供了用于治疗或预防需要治疗或预防疾病或病症的哺乳动物中的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，该方法包括向哺乳动物施用有效量的本发明的药物组合物，其中编码序列编码治疗性基因产物。

组合物

在本公开的一些方面，提供了用于在真核细胞中表达转基因的组合物。在一些方面，真核细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，哺乳动物细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是骨髓细胞，例如谱系贫化的骨髓细胞。在一些方面，哺乳动物细胞是定型的造血红系祖细胞。

在本公开的一些实施方案中，组合物是多核苷酸盒。“多核苷酸盒”是指包含通常彼此可操作地连接的两个或更多个功能性多核苷酸序列(例如，调控元件、翻译起始序列、编码序列和/或终止序列等)的多核苷酸序列。同样地，“用于在哺乳动物细胞中表达转基因的多核苷酸盒”是指两种或更多种功能性多核苷酸序列(例如，启动子、增强子、5'UTR、翻译起始序列、编码序列和/或终止序列等)的组合，其促进转基因在细胞中的表达。

例如，在一些实施方案中，多核苷酸盒包含：人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、人PKLR cDNA的密码子优化形式(coRPK)和土拨鼠肝炎病毒的突变的转录后调控元件(Wpre)。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，人PKLR启动子包含以下序列、其功能性片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列，或由所述序列组成：

ATTATGGTAAATCCACTTACTGTCTGCCCTCGTAGCCATCGAGATAAACCCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCC(SEQ ID NO:4)。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，人PKLR启动子包含以下序列、其功能性片段或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列，或由所述序列组成：

TCCACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTCGTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGGCGCCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG(SEQ IDNO:8)。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，RPE序列包含以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的序列，或由所述序列组成：

TCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCT(SEQ ID NO:3)。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的具体实施方案中，psi序列是HIV-1psi序列，或psi序列包含与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列，或由下述序列组成：

TCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAG(SEQ IDNO:5)。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，5'LTR包含以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性，或由所述序列组成：TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGT(SEQ ID NO:6)。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的具体实施方案中，3'LTR包含以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列，或由所述序列组成：

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAG(SEQ ID NO:7).

在一些实施方案中，本公开的多核苷酸盒增强转基因在哺乳动物细胞中的表达。如本公开的工作实施例所证明的，本发明人已发现许多多核苷酸元件，即与本领域已知的那些相比改进的元件，其单独地和协同地增强转基因在哺乳动物细胞中的表达。在某些实施方案中，本公开的多核苷酸盒内的两种或更多种功能性多核苷酸序列的排列增强转基因在哺乳动物细胞中的表达。“增强的”是指转基因的表达在携带本公开的多核苷酸盒的细胞中相对于在携带与可比较的调控元件(例如，如本领域中已知的)可操作地连接的转基因的细胞而言得以增加、增强或更强。换句话说，相对于来自不包含本公开所述的一种或多种优化元件的多核苷酸盒(即参考对照)的表达，来自本公开的多核苷酸盒的转基因表达增加、增强或更强。在某些实施方案中，增强的表达特异于或限于一种或多种所需的细胞类型。

例如，与在携带可操作地与不同启动子(例如，如本领域中已知的)连接的转基因的细胞中相比，在包含含有本文公开的启动子的多核苷酸盒的细胞中，转基因的表达可得以增加或增强或更强。作为另一个实例，与在携带与不同增强子序列可操作地连接的转基因的细胞中相比，在包含本文公开的增强子序列的多核苷酸盒的细胞中，转基因的表达可以增强，或增加，加强或更强。

启动子和增强子元件可以是组织特异性的或阶段特异性的。例如，组织特异性启动子或增强子优先驱动一种或多种特定细胞类型中的表达(或更高水平的表达)。细胞类型的实例包括但不限于：造血干细胞、长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、造血CD34+细胞和CD34+群体内的任何簇分化亚群。阶段特异性启动子或增强子优先在细胞周期或发育的一个或多个特定阶段期间驱动表达(或更高水平的表达)。这些包括但不限于β-珠蛋白基因座控制区、血影蛋白启动子和红系特异性启动子。

不希望受理论束缚，细胞中转基因的增强表达被认为归因于细胞中基因产物的更快积累或细胞中更稳定的基因产物。因此，可以以多种方式观察本公开的多核苷酸盒增强的转基因表达。例如，与在转基因与可比较的调控元件(例如，如本领域中已知的)可操作地连接的情况下检测到的表达相比，可通过在多核苷酸盒与细胞接触后检测转基因的表达，更早地，例如提前2天、提前7天、提前2周、提前3周、提前4周、提前8周、提前12周或更早观察到增强的表达。还可将增强的表达观察为每个细胞的基因产物的量的增加。例如，每个哺乳动物细胞的基因产物的量可增加2倍或更多，例如增加3倍或更多，增加4倍或更多，增加5倍或更多，或增加10倍或更多。还可将增强的表达观察为表达可检测水平的多核苷酸盒携带的转基因的哺乳动物细胞数量的增加。例如，表达可检测水平的转基因的哺乳动物细胞数量可增加至2倍或更多，例如增加至3倍或更多，增加至4倍或更多，增加至5倍或更多，或增加至10倍或更多。作为另一个实例，与常规多核苷酸盒相比，本发明的多核苷酸可在更大百分比的细胞中促进可检测水平的转基因；例如，当常规盒可在某个区域中在例如少于5％的细胞中促进可检测水平的转基因表达时，本发明的多核苷酸在该区域中在5％或更多的细胞中促进可检测水平的表达；例如10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多，30％或更多，35％或更多，40％或更多，或45％或更多，在一些情况下50％或更多，55％或更多，60％或更多，65％或更多，70％或更多，或75％或更多，例如80％或更多，85％或更多，90％或更多，或95％或更多的被接触的细胞将表达可检测水平的基因产物。还可将增强的表达观察为细胞活力和/或功能的改变。

本公开的多核苷酸盒通常包含启动子区域。其中任何合适的启动子区或启动子序列可用于主题多核苷酸盒中，只要启动子区促进真核细胞中编码序列的表达即可。在某些实施方案中，启动子区启动子促进哺乳动物细胞中编码序列的表达。在某些情况下，启动子是遍在启动子，即其为在广泛的细胞、组织和物种中具有活性的启动子。在其他情况下，启动子是人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

在一些实施方案中，多核苷酸包含一种或多种增强子。增强子是本领域已知的增强转录的核酸元件，并且可以位于与它们调节的基因相关的任何位置(例如上游、下游、内含子内等)。任何增强子元件均可用于本公开的多核苷酸盒和基因治疗载体中，只要其在与启动子组合使用时增强基因的表达即可。

待在细胞中表达的编码序列可以是任何多核苷酸序列，例如编码基因产物例如多肽或基于RNA的治疗剂(siRNA、反义、核酶、shRNA等)的基因或cDNA。编码序列对于与其可操作地连接的启动子序列可以是异源的，即不与其天然地可操作地连接。或者，编码序列对于与其可操作地连接的启动子序列可以是内源的，即与该启动子天然连接。基因产物可以在哺乳动物细胞中固有地起作用，或者其可外源地起作用，例如其可被分泌。例如，当转基因是治疗性基因时，编码序列可以是编码所需基因产物或其功能性片段或变体的任何基因，所述基因产物或其功能性片段或变体可用作治疗疾病或病症的治疗剂。在各种优选的实施方案中，转基因编码人PKLR。

在本发明的一个实施方案中，对转基因编码序列进行修饰或“密码子优化”以通过用更频繁表现的密码子替换不频繁表现的密码子来增强表达。编码序列是用于翻译的编码氨基酸的mRNA序列的一部分。在翻译过程中，61个三核苷酸密码子中的每一个都被翻译成20种氨基酸中的一种，导致遗传密码中的简并性或冗余。然而，不同的细胞类型和不同的动物物种利用以不同频率编码相同氨基酸的tRNA(每个携带反密码子)。当基因序列包含不常被相应tRNA表现的密码子时，核糖体翻译机器可能减慢，阻碍高效翻译。通过对特定物种的“密码子优化”可以改善表达，其中编码序列被改变以编码相同的蛋白质序列，但利用被高度表达的人蛋白质高度表现的和/或利用的密码子(Cid-Arregui等，2003；J.Virol.77:4928)。在本发明的一个方面，修饰转基因的编码序列以用在灵长类动物中频繁表达的密码子替换在哺乳动物或灵长类动物中不常表达的密码子。例如，在一些实施方案中，由转基因编码的编码序列编码与上文或本文中公开的序列编码的多肽具有至少85％序列同一性，例如至少90％的序列同一性，至少95％的序列同一性，至少98％的同一性，至少99％的同一性的多肽，其中编码序列的至少一个密码子在人中具有比上文或本文中公开的序列中的相应密码子更高的tRNA频率。

在本发明的另外的实施方案中，对转基因编码序列进行修饰以通过终止或去除不编码所需转基因的开放阅读框(ORF)来增强表达。开放阅读框(ORF)是起始密码子之后并且不含终止密码子的核酸序列。ORF可以是正向或反向定向的，并且与目标基因相比可以是“框内”或“框外”的。此类开放阅读框具有在目标基因旁边的表达盒中表达的潜力，并且可能导致不希望的副作用。在本发明的一个方面，通过进一步改变密码子使用(codon usage)来修饰转基因的编码序列以除去开放阅读框。这通过消除起始密码子(ATG)并以反向取向或在ORF的框外中引入终止密码子(TAG、TAA或TGA)，同时保留氨基酸序列并维持目标基因中高度利用的密码子(即，避免频率<20％的密码子)来实现。在本发明中，转基因编码序列可以通过密码子优化和去除非转基因ORF或使用这两种技术来优化。对于本领域普通技术人员显而易见的是，优选地在密码子优化后除去或最小化非转基因ORF，以除去密码子优化期间引入的ORF。

在一些实施方案中，本发明的多核苷酸盒还包含RNA输出信号。示例性RNA输出序列包括但不限于来自土拨鼠肝炎病毒转录后元件(WPRE)的序列。土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调控元件(Wpre)通过以不依赖于转基因、启动子和载体的方式增加RNA稳定性来显著增加靶细胞中的转基因表达(Zuffrey等，1999)。然而，其可表达源自参与肝癌的WHV X基因的截短的60个氨基酸的蛋白质(Kingsman等，2005)。因此，大多数临床前方案和临床试验包括Wpre元件的突变形式(Zanta-Boussif等，2009)。在另一方面，已经发现在SIN-LV载体中使用两个SV40-USE元件在抑制转录通读方面比WPRE序列更有效(Schambach等，2007)。更确切地说，本文公开的WPRE是嵌合的WPRE，其携带来自由Axel Schambach进行修饰的WPRE的589个核苷酸(核苷酸1-589)(WO 2008136670A2；[5])和来自前WPRE的88个核苷酸(核苷酸590-677)(Zuffrey等，1999)。本文公开的数据显示该嵌合Wpre比之前的WPRE更好地起作用。嵌合WPRE序列包含下表中列出的序列。

表1.经修饰的WPRE序列

本发明还包括核酸，例如多核苷酸序列，其包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9所示序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％的同一性的序列。在特定实施方案中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9所示的序列。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，Wpre序列包含SEQID NO:1的序列或与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列，或由所述序列组成。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，Wpre序列包含以下序列或与以下序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列或由所述序列组成：

CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG(SEQ ID NO:9).

在某些实施方案中，表达盒或基因递送载体，例如慢病毒，包含以5'至3'顺序包含以下序列的多核苷酸序列：

(a)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；

(b)编码丙酮酸激酶多肽的序列，任选地密码子优化的RPK编码序列或cDNA序列；和

(c)突变的Wpre序列，任选地包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成。

在某些实施方案中，表达盒或基因递送载体(例如慢病毒)包含以5'至3'顺序包含以下序列的多核苷酸序列：

(a)cPPT序列；

(b)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；

(c)编码丙酮酸激酶多肽的序列，任选地密码子优化的RPK编码序列或cDNA序列；和

(d)突变的Wpre序列，任选地包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成。

(a)5'LTR，任选地经修饰的5'LTR；

(b)cPPT序列；

(c)PGK启动子序列，任选地人PGK启动子序列；

(d)编码丙酮酸激酶多肽的序列，任选地密码子优化的RPK编码序列或cDNA序列；

(e)突变的Wpre序列，任选地包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成；和

(f)3’LTR，任选地经修饰的3'LTR。

在某些实施方案中，基因递送载体是PGK-coRPK LV，或包含图21中描绘的元件。

在本文所述的任何表达盒和基因递送载体的特定实施方案中，密码子优化的RPKcDNA或编码序列编码PKLR多肽，其包含GenBank登录号XP_016856982.1、XP_011507942.1、XP_006711449.1、NP_870986.1或NP_000289.1中的任一个中公开的序列或这些序列中的任一个的功能性片段或与这些序列中的任一个具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列，或由所述序列组成。

本领域普通技术人员将容易理解本文公开的或本领域已知的元件的其他组合。

另外，如本领域普通技术人员将认识到的，多核苷酸盒可任选地含有其他元件，包括但不限于促进克隆的限制性位点和特定基因表达载体的调控元件。

在本发明的一些方面，主题多核苷酸盒用于将基因递送至动物的细胞，例如以确定基因对细胞活力和/或功能的影响，以治疗细胞病症等。因此，在本发明的一些方面，提供在哺乳动物细胞中表达转基因的组合物是基因递送载体，其中基因递送载体包含本公开的多核苷酸盒。

本公开的基因递送载体涵盖用于将多核苷酸序列递送至哺乳动物细胞的任何方便的基因治疗载体。例如，载体可包含单链或双链核酸，例如，单链或双链DNA。例如，基因递送载体可以是DNA，例如裸DNA，例如质粒、微环等。载体可包含单链或双链RNA，包括RNA的经修饰的形式。在另一个实例中，基因递送载体可以是RNA，例如mRNA或经修饰的mRNA。

作为另一个实例，基因递送载体可以是源自病毒(例如，腺病毒、腺相关病毒、慢病毒(LV)、疱疹病毒、α病毒或逆转录病毒，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)，莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、Friend小鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳氏肉瘤病毒(RSV))或慢病毒)的病毒载体。虽然下面更详细地描述了包含慢病毒用途的实施方案，但预期普通技术人员将理解，本领域的类似知识和技能也可以用于非LV基因治疗载体。在一些实施方案中，基因递送载体是自限性慢病毒。

在此类实施方案中，主题多核苷酸盒的5'和3'末端连接有功能性长末端重复(LTR)序列。在一个实施方案中，存在于慢病毒载体骨架中的不同元件的位置如图1所示。两种LTR序列均已被修饰以产生自我失活型(SIN)LV载体。SIN载体在3'-LTR中具有400bp的缺失，覆盖来自U3区的启动子/增强子元件。因此，转基因的表达依赖于内部启动子，降低了RCL的风险并降低了启动子干扰(Ginn等，2003)。这种3'LTR缺失去除了TATA盒，阻止了转录起始(Miyoshi等1998；Zuffrey等1998)；因此使载体失活。5'-LTR的U3区已被其他异源启动序列(即CMV或RSV)取代，以实现不依赖于Tat的转录并增加基因组RNA合成，导致病毒滴度的增加。因为5'-U3区域驱动初级转录物的表达，其修饰将不存在于转导的细胞中(Schambach等2009)。外源元件，诸如β-珠蛋白或SV40多腺苷酸化信号(Iwakuma等，1999)或来自猿猴病毒40的上游序列元件(USE)(SV40-USE)(Schambach等，2007)，也被包括在病毒3'LTR的R区域中以减少来自内部启动子的转录通读(Zaiss等，2002)或来自SIN-LV载体的缺失的U3区域的残余物(Almarza等2011)，以防止下游基因的潜在转录激活。前导区包含包装信号(Ψ)，并且认为LV载体在该区域中需要Gag基因的约300bp。目前，这种Gag序列已减少到仅40bp(图1)。Rev响应元件(RRE)也被包括在内以提高基因转移的效率，尽管其包含周围的Env残余物。促进整合前复合物的核转位的中心多嘌呤区(cPPT)以及参与逆转录酶分离的中心末端序列(CTS)，已被视为提高病毒滴度(Zennou等2000；Follenzi等，2000)。在具体的实施方案中，存在于本文所述的任何表达盒或基因递送载体中的cPPT包含或由以下序列组成：TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT(SEQ ID NO:2)，或与SEQ ID NO:2具有具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的序列。

dNEF/PPT信号对于逆转录是必需的，并且其掺入显著改善了LV载体的产生。

可使用标准方法产生包封本公开的多核苷酸盒的基因治疗载体。例如，在LV病毒体的情况下，可以将根据本发明的LV表达载体引入生产者细胞中，然后引入LV辅助构建体，其中辅助构建体包括能够在生产者细胞中表达并且补充在LV载体中不存在的LV辅助功能的LV编码区。然后将辅助病毒和/或另外的载体导入生产者细胞，其中所述辅助病毒和/或另外的载体提供能够支持高效LV病毒产生的辅助功能。然后培养生产者细胞以产生LV。这些步骤使用标准方法进行。

可使用用于产生用于递送主题多核苷酸盒的病毒颗粒的任何合适方法，包括但不限于以下实例中描述的那些。可以制备适于高效转导哺乳动物细胞的任何浓度的病毒颗粒，用于在体外或体内接触哺乳动物细胞。例如，可以以每毫升10⁸个载体基因组或更多个载体基因组，例如，5x10⁸个载体基因组/mL、10⁹个载体基因组/mL、5x10⁹个载体基因组/mL、10¹⁰个载体基因组/mL、5x10¹⁰个载体基因组/mL、10¹¹个载体基因组/mL、5x10¹¹个载体基因组/mL、10¹²个载体基因组/mL、5x10¹²个载体基因组/mL、10¹³个载体基因组/mL、1.5x10¹³个载体基因组/mL、3x10¹³个载体基因组/mL、5x10¹³个载体基因组/mL、7.5x10¹³个载体基因组/mL、9x10¹³个载体基因组/mL、1x10¹⁴个载体基因组/mL、5x10¹⁴个载体基因组或更多个载体基因组，但通常不超过1x10¹⁵个载体基因组/mL的浓度配制病毒颗粒。

在制备主题LV组合物中，可以使用任何用于产生LV病毒体的宿主细胞，包括例如哺乳动物细胞(例如，293细胞)、昆虫细胞(例如，SF9细胞)、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞，其中LV rep和cap基因被稳定地保持在其中LV载体基因组被稳定地维持和包装的宿主细胞或生产者细胞中。示例性包装和生产者细胞源自SF-9、293、A549或HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制LV载体。

在某些实施方案中，本发明包括含有本文公开的表达盒或基因递送载体的细胞。在相关的实施方案中，用包含本文公开的表达盒的病毒载体转导细胞，或者将本文公开的表达盒整合到细胞的基因组中。在某些实施方案中，细胞是用于产生病毒基因递送载体的细胞。在其他实施方案中，细胞是待递送至受试者，以向受试者提供由表达盒编码的基因产物的细胞。因此，在某些实施方案中，细胞对于待治疗的受试者是自体的，或者获自待治疗的受试者。在其他实施方案中，细胞对于待治疗的受试者是同种异体的，或者获自除待治疗的受试者外的供体。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在某些实施方案中，细胞是血细胞、红细胞、造血祖细胞、骨髓细胞，例如谱系贫化的骨髓细胞、造血干细胞(例如CD34+)或定型的造血红系祖细胞。

本发明包括药物组合物，其包含本文所述的多核苷酸盒、基因递送载体或细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。主题多核苷酸盒、基因递送载体或细胞可以与药学上可接受的载体、稀释剂和试剂组合，所述载体、稀释剂和试剂可用于制备通常安全、无毒和期望的制剂，并且包括对于灵长类动物用途是可接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体或者在气溶胶组合物的情况下可以是气态的。此类赋形剂、载体或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可将补充的活性化合物掺入到制剂中。用于制剂的溶液或悬浮液可包括无菌稀释剂诸如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌化合物，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合化合物，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；防止聚集的去垢剂诸如Tween 20；和用于调节张力的化合物诸如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱调节pH，诸如盐酸或氢氧化钠。在特定的实施方案中，药物组合物是无菌的。

适用于本发明的药物组合物还包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。

通过以下方式制备无菌可注射溶液剂：将在合适溶剂中的活性化合物以要求的量与上文列举的成分之一或组合一起混合，根据需要，随后过滤消毒。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。

在一个实施方案中，用载体制备组合物，所述载体将保护基因盒或表达载体免于从体内快速消除，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。所述材料也可以从商业上获得。

以剂量单位形式配制口服、眼用或肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单元含有经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的说明书由活性化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及配制此类用于治疗个体的活性化合物的领域中的固有限制决定和直接取决于其。

可将药物组合物和施用说明书一起包含在容器、包装或分配器(例如，注射器，例如预装注射器)中。

本发明的药物组合物包括任何药学上可接受的盐、酯、此类酯的盐，或任何其它化合物，所述化合物在向动物(包括人)施用时能够(直接或间接)提供生物活性代谢物或其残留物。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理学上和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物的所需生物活性并且不赋予其不期望的毒理学作用的盐。多种药学上可接受的盐是本领域已知的并且描述于例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第17版，Alfonso R.Gennaro(编辑),Mark Publishing Company,Easton,PA,USA,1985(及其更新版本),“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”，第3版，JamesSwarbrick(编码),Informa Healthcare USA(Inc.),NY,USA,2007中和J.Pharm.Sci.66:2(1977)中。另外，关于合适的盐的综述，参见Stahl和Wermuth的Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(Wiley-VCH，2002)。

用金属或胺(诸如碱金属和碱土金属或有机胺)形成药学上可接受的碱加成盐。用作阳离子的金属包括钠、钾、镁、钙等。胺包括N-N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、二环己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因(参见，例如，Berge等，“PharmaceuticalSalts,”J.Pharma Sci.,1977,66,119)。所述酸性化合物的碱加成盐通过使游离酸形式与足量的所需碱接触以常规方式产生盐来制备。通过使盐形式与酸接触并以常规方式分离游离酸，可以再生游离酸形式。游离酸形式在某些物理性质(诸如在极性溶剂中的溶解度)与它们各自的盐形式稍微不同，但是对于本发明的目的而言，在其它方面盐与它们各自的游离酸等同。

可以将主题多核苷酸盒、基因递送载体，例如重组病毒(病毒体)或细胞(例如，用本文公开的基因递送载体转导的)掺入药物组合物中，以用于向哺乳动物患者，特别是灵长类动物，更特别地人施用。可在无毒、惰性、药学上可接受的含水载体(优选pH范围为3至8，更优选范围为6至8)中配制主题多核苷酸盒、基因递送载体(例如病毒体)或细胞。此类无菌组合物将含有包含编码治疗性分子的核酸的载体或病毒体，所述载体或病毒体在重构时溶解在具有可接受pH的水性缓冲液中。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的与药学上可接受的载体和/或赋形剂(例如盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐和氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、防腐剂和其他蛋白质)混合的本文公开的细胞、载体或病毒体。示例性氨基酸、聚合物和糖等是辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇单硬脂酸酯化合物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇、葡聚糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人血清白蛋白、柠檬酸盐、乙酸盐、林格氏和汉克氏溶液、半胱氨酸、精氨酸、肉毒碱、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯和二醇类。优选地，该制剂在4℃下稳定至少六个月。

在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸钠/硫酸钠、tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、无菌水和本领域普通技术人员已知的其他缓冲液，诸如Good等(1966)Biochemistry 5:467描述的那些。其中药物组合物含有包含在腺病毒载体递送系统中的肿瘤抑制基因的缓冲液的pH可以在6.5至7.75，优选7至7.5，最优选7.2至7.4的范围内。

在某些实施方案中，病毒载体可以配制成任何合适的单位剂量，包括但不限于1x10⁸个载体基因组或更多，例如，1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²或1x10¹³个载体基因组或更多，在某些情况下，1x10¹⁴个载体基因组，但通常不超过4x10¹⁵个载体基因组。在一些情况下，单位剂量至多为约5x10¹⁵个载体基因组，例如，1x10¹⁴个载体基因组或更少，例如1x10¹³、1x10¹²、1x10¹¹、1x10¹⁰或1x10⁹个载体基因组或更少，在某些情况下1x10⁸个载体基因组或更少，并且通常不少于1x10⁸个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1x10¹至1x10¹¹个载体基因组。在一些情况下，单位剂量为1x10¹⁰至3x10¹²个载体基因组。在一些情况下，单位剂量是1x10⁹至3x10¹³个载体基因组。在一些情况下，单位剂量是1x10⁸至3x10¹⁴个载体基因组。在一个实施方案中，该范围是约5x10¹⁰至约1x10¹¹个载体基因组。在一些实施方案中，该范围是约1x10⁹至约1x10¹⁰个载体基因组。

在一些情况下，可以使用感染复数(MOI)测量药物组合物的单位剂量。MOI是指载体或病毒基因组与核酸可被递送至的细胞的比例或倍数。在一些情况下，MOI可以是1x10⁶。在一些情况下，MOI可以是1x10⁵-1x10⁷。在某些情况下，MOI可以是1x10⁴-1x10⁸。在一些情况下，本公开的重组病毒为至少约1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷和1x10¹⁸MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒是1x10⁸至3x10¹⁴MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒至多约1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷和1x10¹⁸MOI。在一些实施方案中，该范围为约20至约400MOI。

在一些方面，药物组合物的量包含约1x 10⁸至约1x 10¹⁵个重组病毒，约1x 10⁹至约1x 10¹⁴个重组病毒，约1x 10¹⁰至约1x 10¹³个重组病毒，或约1x 10¹¹至约1x 10¹²个重组病毒。

方法

如本文中所公开的，本发明统称为“主题组合物”的主题多核苷酸盒和基因递送载体可用于在动物细胞中表达转基因。例如，主题组合物可用于研究，例如测定基因对细胞活力和/或功能的影响。作为另一个实例，主题组合物可用于药物，例如治疗或预防疾病或病症。因此，在本发明的一些方面，提供了用于在细胞中表达基因的方法，该方法包括使细胞与本公开的组合物接触。在一些实施方案中，接触在体外或离体发生。在一些实施方案中，接触在体内发生，即向受试者施用主题组合物。

对于其中哺乳动物细胞在体外或离体与主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体接触的情况，细胞可以来自任何哺乳动物物种，例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、松鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛、灵长类动物、人。细胞可以来自已建立的细胞系，或者它们可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用，指的是源自受试者并且允许在体外生长有限次数的培养物传代(即分裂)的细胞和细胞培养物。例如，原代培养物是可以已经传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次，但次数不足以经历危象期(crisis stage)的培养物。通常，本发明的原代细胞系在体外维持少于10次传代。

本发明的实施方案包括用病毒递送载体(例如含有人肝和红系丙酮酸激酶(PKLR)基因的慢病毒载体)转导的哺乳动物细胞(例如，CD34+细胞)。因此，本发明包括转导哺乳动物细胞(例如，本文所述的人造血干细胞或其他细胞)的方法，其包括使细胞与包含本文所述的表达盒的病毒递送载体(例如，慢病毒载体)接触。在某些实施方案中，细胞先前从待治疗的受试者或另一供体获得。在特定的实施方案中，受试者被诊断为患有PKD，并且用包含编码丙酮酸激酶的表达盒(例如密码子优化的RPK编码区或cDNA)的LV转导细胞。应理解，所公开的方法，例如用于将丙酮酸激酶基因产物(例如，使用coPRK cDNA序列)递送至受试者的那些方法也可用于治疗溶血性贫血，和/或使红系分化正常化，增加功能性成熟红细胞的数量，减少髓外红细胞生成，减少脾肿大和溶血性贫血或PKD的其他继发效应。

为了促进转基因的表达，将主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体与细胞接触约30分钟至24小时或更长时间，例如1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时、24小时等。

可向受试细胞提供主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体一次或多次，例如一次、两次、三次或三次以上，并且在每次接触事件之后允许细胞与一种或多种药剂一起孵育一段时间(例如16-24小时)，之后，用新鲜培养基更换培养基，进一步培养细胞。接触细胞可以在任何培养基中和在促进细胞存活的任何培养条件下发生。培养物可含有细胞有响应的生长因子。如本文所定义的生长因子是能够通过对跨膜受体的特异性作用促进培养中或完整组织中的细胞的存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。

通常，提供有效量的主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体以在细胞中产生转基因的表达。如本文其他地方所讨论的，有效量可以根据经验容易地确定，例如通过检测转基因的基因产物的存在或水平，通过检测对细胞活力或功能的影响等。通常，相较于相同量的本领域已知的多核苷酸盒，有效量的主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体将促进转基因在细胞中更多地表达。通常，相对于来自参考或对照多核苷酸盒(例如，如本领域中已知的)的表达，表达将增强2倍或更多，例如3倍、4倍或5倍或更多，在某些情况下为10倍、20倍或50倍或更多，例如100倍。

对于其中细胞与主题多核苷酸盒或包含主题多核苷酸盒的基因递送载体在体内接触的情况，受试者可以是任何哺乳动物，例如啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠)、兔、猫、犬、山羊、绵羊、猪、马、牛或灵长类动物。在另外的优选实施方案中，灵长类动物是人。在另外的实施方案中，细胞是CD34+细胞。

本公开的方法和组合物可用于例如治疗丙酮酸激酶缺乏症。

在另一个实施方案中，本发明包括治疗有此需要的受试者中的疾病的方法，其包括向受试者提供有效量的用在细胞中表达治疗性基因产物的基因递送载体(例如，病毒载体)转导的细胞。在特定的实施方案中，细胞对于受试者是自体的。在某些实施方案中，细胞是红系细胞，例如造血干细胞或定型的造血红系祖细胞。在一些实施方案中，细胞是骨髓细胞，例如谱系贫化的骨髓细胞。在特定的实施方案中，该方法用于治疗PKD，并且病毒载体是包含本文公开的表达构建体的LV，其包含与密码子优化的人PKLR基因cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子，和本文公开的突变的Wpre。在特定的实施方案中，肠胃外地(例如通过静脉内注射)向受试者提供细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括在有此需要的受试者中治疗PKD的方法，其包括向受试者提供有效量的用慢病毒载体转导的自体C34+干细胞，所述慢病毒载体在细胞中表达密码子优化的PKLR cDNA，其中慢病毒载体包含与密码子优化的人PKLR cDNA或编码序列可操作连接的人PGK启动子，和本文公开的突变的Wpre序列。在特定的实施方案中，细胞是造血干细胞或定型的造血红系祖细胞，例如骨髓细胞。在特定的实施方案中，肠胃外地例如通过静脉内注射向受试者提供细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗有需要的受试者中的疾病的方法，其包括向受试者提供有效量的在受试者中表达治疗性基因产物的基因递送载体，例如病毒载体。在特定的实施方案中，该方法用于治疗PKD，并且病毒载体是包含本文公开的表达构建体的LV，所述表达构建体包含与密码子优化的人PKLR基因cDNA或编码序列可操作地连接的人PGK启动子，和本文公开的突变的Wpre。在特定的实施方案中，向受试者肠胃外(例如通过静脉内注射)提供基因递送载体。

在特定实施方案中，将细胞或基因递送载体以药物组合物形式提供给受试者。

在一些实施方案中，主题方法产生治疗益处，例如阻止疾病的发展，停止疾病的进展，逆转疾病的进展等。在一些实施方案中，主题方法包括检测已经实现治疗益处的步骤。本领域普通技术人员将理解，此类治疗功效的测量将适用于被修饰的特定疾病，并且将认识到用于测量治疗功效的适当检测方法。

预期使用主题转基因的转基因的表达是稳健的。因此，在一些情况下，转基因的表达(例如，如通过测量基因产物的水平，通过测量治疗功效等所检测的)可以在施用后两个月或更短时间(例如，施用后4周、3周或2周或更短时间，例如，施用主题组合物后1周)观察到。预计转基因的表达也会随时间而持续存在。因此，在某些情况下，可以在施用主题组合物后2个月或更长时间，例如4个月、6个月、8个月或10个月或更长时间，在某些情况下1年或更长时间，例如2年、3年、4年或5年，在某些情况下，超过5年观察到转基因的表达(例如，如通过测量基因产物的水平，通过测量治疗功效等所检测的)。

在某些实施方案中，该方法包括检测转基因在细胞或受试者中的表达的步骤，其中相对于不包含本公开的一种或多种改进的元件的多核苷酸盒的表达，表达得以增强。通常，相对于来自参考(即对照多核苷酸盒)(例如，如领域已知的)的表达，表达将增强2倍或更多，例如3倍、4倍或5倍或更多，在某些情况下为10倍、20倍或50倍或更多倍，例如100倍，如通过例如更早的检测、更高的基因产物水平、对细胞的更强的功能影响等所证明的。

通常，如果主题组合物是包含本公开的主题多核苷酸盒的LV，则实现变化的有效量将为约1x10⁸个载体基因组或更多，在一些情况下1x10⁹个、1x10¹⁰个、1x10¹¹个、1x10¹²个或1x10¹³个载体基因组或更多，在某些情况下，1x10¹⁴个载体基因组或更多，并且通常不超过1x10¹⁵个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量最多为约1x10¹⁵个载体基因组，例如1x10¹⁴个载体基因组或更少，例如1x10¹³个、1x10¹²个、1x10¹¹个、1x10¹⁰个或1x10⁹个载体基因组或更少，在某些情况下为1x10⁸个载体基因组，并且通常不少于1x10⁸个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量是1x10¹⁰个至1x10¹¹个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量是1x10¹⁰个至3x10¹²个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量是1x10⁹个至3x10¹³个载体基因组。在一些情况下，递送的载体基因组的量是1x10⁸个至3x10¹⁴个载体基因组。

在一些情况下，可以使用感染复数(MOI)来测量待施用的药物组合物的量。在一些情况下，MOI可以指载体或病毒基因组与核酸被递送至的细胞的比率或倍数。在一些情况下，MOI可以是1x10⁶。在一些情况下，MOI可以是1x10⁵-1x10⁷。在一些情况下，MOI可以是1x10⁴-1x10⁸。在一些情况下，本公开的重组病毒是至少约1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷和1x10¹⁸MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒为1x10⁸至3x10¹⁴MOI。在某些情况下，本发明的重组病毒至多为约1x10¹、1x10²、1x10³、1x10⁴、1x10⁵、1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸、1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³、1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶、1x10¹⁷和1x10¹⁸MOI。

在一些方面，药物组合物的量包含约1x 10⁸个至约1x 10¹⁵个重组病毒颗粒，约1x10⁹个至约1x 10¹⁴个重组病毒颗粒，约1x 10¹⁰个至约1x 10¹³个重组病毒颗粒，或约1x 10¹¹个至约3x 10¹²个重组病毒颗粒。

可以向哺乳动物施用适合于提供适当的细胞转导以赋予所需效应或治疗疾病的任何总数量的病毒颗粒。在各种优选实施方案中，注射至少10⁸、5x10⁸、10⁹、5x 10⁹,10¹⁰,5x10¹⁰,10¹¹,5x10¹¹、10¹²、5x10¹²、10¹³、1.5x10¹³、3x10¹³、5x10¹³、7.5x10¹³、9x10¹³、1x10¹⁴个病毒颗粒，或5x 10¹⁴个病毒颗粒或更多颗粒，但通常不超过1x10¹⁵个病毒颗粒。可对哺乳动物或灵长类动物眼睛进行任何合适次数的载体施用。在一个实施方案中，该方法包括单次施用；在其他实施方案中，随时间进行如由主治临床医生认为是适当的多次施用。在一些实施方案中，在单次施用(24小时转导)中需要至少2x 10⁸VG/ml的5x 10⁵个细胞/ml来产生高转导效率。

单独剂量通常不小于对受试者产生可测量的效应所需的量，并且可以基于主题组合物或其副产品的吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)的药代动力学和药理学，从而基于受试者内组合物的处置来确定。这包括考虑施用途径和剂量。剂量的有效量和/或剂量方案可凭经验根据临床前测定、安全性以及按比例放大和剂量范围试验、临床医师个体-患者关系以及体外和体内测定(诸如本文所述和实施例中说明的那些测定)来容易地测定。

本文中参考用于说明的示例应用来描述本发明的若干方面。应该理解，列出了许多具体细节、关系和方法以提供对本发明的完全理解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到，可以没有一种或多种具体细节而实践本发明或以其它方法实践本发明。本发明不限于行为或事件的顺序，因为一些行为可以不同顺序进行和/或与其它行为或事件同时进行。而且，并非所有列举的行为或事件都是实施根据本发明的方法所需的。

还应指出，可撰写权利要求来排除任何可选元素。这样，该陈述意图用作在先基础与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语“单独地”、“仅仅”等或使用“否定(negative)”限制。

本文所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开内容而提供。此处的任何信息都不应解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于这些出版物。另外，所提供的公开日可以不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。

本说明书中提及的和/或在申请数据表中列出的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文，例如以公开和描述与所引用的出版物结合的方法和/或材料。应当理解，在有矛盾时本公开内容将超越所并入的出版物的任何公开内容。

从前述内容可以理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了本发明的特定实施方案，但在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此，除了所附权利要求书之外，本发明不受限制。

实施例

提出下列实施例以为本领域普通技术人员提供如何产生和使用本发明的完整公开内容和描述，所述实施例不旨在限制发明人视为它们的发明的范围，也不旨在表示下文的实验是所执行的全部或唯一实验。已试图确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数均为重量份，分子量均为重均分子量，温度单位均为摄氏度，以及压力均为大气压或接近大气压。

实验方法

载体和慢病毒上清液的产生。如本文所述产生LV。使用软件设计CoRPK序列以增加序列的GC含量并防止隐蔽的剪接位点。使用由Dr.Naldini(HSR-TIGET,San Raffaele Telethon Institute,Milano,Italy)慷慨提供的pCCL.sin.ppt.hPGK-EGFP-Wpre*构建体作为骨架开发载体。如先前所述[Follenzi A等(2000).Nat Genet 25:217-222]，通过在293T细胞(ATCC:CRL-1573,Rockeville,MD,USA)中进行3-质粒磷酸钙介导的转染来制备VSVG假型化LV的载体原液。如其他地方所述[Charrier S等(2005).GeneTher 12:597-606]，通过qPCR在HT1080细胞(ATCC:CCL-121)中测定感染性LV的滴度。常规地获得10⁷-10⁸个病毒颗粒(vp)/mL滴度的慢病毒原液。

鼠HSC的纯化和转导。从腿骨收获来自8-14周龄雄性PKD小鼠的BM，并使用Lin-Cell Depletion试剂盒(Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany)纯化谱系阴性细胞(Lin^-)，获得70-90％纯度。用100ng/mL重组人IL-11(Peprotech EC Ltd.,London,UK)和100ng/mL重组鼠SCF(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN)在IMDM-Glutamax培养基(其补充有20％FBS和0.5％抗生素(50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素，(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))中预刺激Lin^-细胞24小时，然后以1-10vp/细胞的MOI在两轮转导中用携带EGFP或coRPK的LV进行转导。在上述细胞因子存在的情况下在预先用CH-296纤连蛋白片段(2μg/cm²；Retronectin,TakaraShuzo,Otsu,Japan)在4℃下包被过夜的平板上进行每次转导，持续24小时。

体内RBC存活。通过生物素3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯钠盐(50mg/kg)(SigmaAldrich,Saint Louis,MO)的三次连续静脉内注射(间隔12小时)来注射携带coRPK转基因的移植小鼠。在最后一次注射后12小时，收获尾静脉血并用2μg/mL抗小鼠Ter119-PE(BDBioscience,San Jose,CA)和链霉抗生物素蛋白-FITC(50μg/mL，BD Biosciences,SanJose,CA)在4℃标记30分钟。在注射后每2-4天在EPICS XL流式细胞仪(Beckman Coulter,Brea,CA)中分析样品，持续40天。通过总RBC群体内生物素化细胞的百分比测量RBC存活动力学。

CFC测定。根据Methocult培养基GF M3434(Stem Cell Technologies,Vancouver,Canada)的制造商的方法，在来自对照和移植小鼠的BM和脾中进行CFC测定。在移植后不同的时间点从所有组的小鼠中收获BM细胞，并且在接种后7天在Nikon Diaphot-TMD显微镜中对CFU(30个或更多个细胞的簇)进行评分。

造血谱系的鉴定。从移植动物的尾静脉获得PBMC并用一小组抗体标记以检测不同的造血细胞。用抗GR-1和抗Mac-1生物素化抗体(BD Bioscience,San Jose,CA,5μg/mL)检测髓样细胞，而使用抗CD3-PE抗体(对于T细胞)和抗B220-PE和抗B220-PECyS抗体(对于B细胞)(BD Bioscience,San Jose,CA,10μg/mL)与SAV-TRC第二抗体(Invitrogen,ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)一起检测淋巴样细胞。在BD LSR Fortessa细胞计数器(BD Bioscience,San Jose,CA”USA)中分析样品，加入DAPI(Boehringer,Ingelheim,Germany,2μg/mL)以排除死亡细胞。

结构和组织学研究。收集脾，拍照并以精密刻度称重以确定脾肿大的存在。按照常规组织学方法对获得的脾和肝切片进行组织学研究，并用苏木精(Gill-2苏木精，Thermo,Pittsburgh,USA)和曙红(曙红醇，Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)染色。根据制造商的说明，还通过普鲁士蓝或Perls染色(Sigma Aldrich,Saint Louis,MO)研究脾中的铁沉积物。使用Olympus BX40光学显微镜检查所有切片，并用Olympus DP21相机拍照，最终放大倍数为100x或200x。

红系分化。如其他地方所述[Socolovsky M等(2001).Blood 98:3261-3273]，使用4μg/mL抗小鼠Ten 19-PE抗体(BD Bioscience,San Jose,CA,)、10μg/mL生物素化抗CD71抗体(BD Bioscience,San Jose,CA)和链霉抗生物素蛋白-三色(Invitrogen,Thermo FisherScientific,Waltham,MA)，利用BM和脾中的Ter119和CD71标志物强度的流式细胞术分析来鉴定不同的红系亚群。然后使用碘化丙锭(IP，2μg/mL)在EPICS XL流式细胞仪(BeckmanCoulter,Brea,CA)中分析细胞以检测活细胞。

原病毒的定量。使用针对包装原病毒序列(Ψ)和小鼠Titin管家基因的互补引物完成每细胞的整合原病毒的检测和定量。定期收集总BM和外周血样品，并使用DNeasyBlood&Tissue试剂盒(Qiagen,Venlo,Limburg,The Netherlands)分离来自有核细胞的基因组DNA。使用7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)和先前描述的引物和探针[Charrier S等(2011).Gene Ther 18:479-487]，通过多重qPCR扩增20至50ng基因组DNA(gDNA)。

嵌合体。通过qPCR检测Y染色体SRY基因和小鼠β-肌动蛋白管家基因来定量供体细胞的存在。使用先前描述的引物和探针[Navarro S等(2006).Mol Ther 14:525-535]并使用7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)扩增来自移植小鼠的PB的基因组DNA。使用来自含有0％至100％来自雄性/雌性小鼠混合物的BM细胞的样品的gDNA提取物制备标准曲线，并将嵌合体计算为：供体植入的％＝100x 2^{(CtβAct-CtSRY)}。

LAM-PCR程序。为了鉴定载体整合位点，按照Schmidt等2007[Nat Methods 4:1051-1057]公布的方法，通过LAM-PCR扩增3'载体LTR基因组接口。使用生物素化的LTR特异性引物和高达100ng的gDNA(作为模板)进行起始线性扩增(100个循环)。使用链霉抗生物素蛋白磁珠纯化线性扩增产物，然后进行互补链合成，用2种不同的限制酶(Tsp509I和HpyCH4IV)平行消化，并使用与酶切割留下的末端互补的接头盒进行两次连接反应。产生的片段通过两个额外的指数PCR步骤扩增。在MultiNA自动化系统(Shimadzu)上通过凝胶电泳分离和定量LAM-PCR产物。

用于Illumina MiSeq测序的LAM-PCR产物的设置。按照Parazynski等[ParuzynskiA等(2010).Nat Protoc 5:1379-1395]公布的方法，使用含有特异性序列的融合引物重新扩增40ng由Tsp5091和HpyCH4IV酶产生的第二指数PCR产物，所述特异性序列允许在Illumina MiSeq测序仪上进行配对末端测序。通过融合PCR添加Roche 454GS-FLX衔接子使LAM-PCR样品适应454-焦磷酸测序：将衔接子A加上8个核苷酸的条形码添加到LAM-PCR扩增子的LTR末端；将衔接子B加入到接头盒侧。按5'-3'方向，最终扩增子组成如下：衔接子A、条形码、LTR序列、未知基因组序列、接头盒序列和引物B。将纯化的融合引物PCR产物在MultiNA自动电泳系统上运行和定量，汇总在一起，以获得10nM的最终等摩尔浓度库。然后使用用于Illumina测序平台的KAPA文库定量试剂盒(Kapa Biosystems,Wilmington,MA)在Viia7实时PCR系统(Applied Biosystems,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)上重新定量最终文库，获得估计的浓度为16.35nM。最后，使用Illumina MiSeq试剂盒对文库进行测序。

生物信息学分析。为了从高通量测序平台中提取载体整合位点(IS)，设计了接收行数据(通常采用FastQ文件格式)的Roche 454和Illumina MiSeq/HiSeq管道，提供了可靠的IS和最近的基因的列表。使用Excel、GraphPad Prism(TM)和可用的在线工具进行克隆丰度定量和基因本体学富集的高级分析。

NGS数据处理和管线使用。NGS数据处理的步骤涉及来自Illumina MiSeq测序平台的高通量数据的管理，目的在于鉴定IS，其中将所有有效序列读数与参考基因组对齐。数据处理包括两个主要活动：1.数据质量检查和分析，其中修剪慢病毒载体序列和其他污染物。2.整合位点识别，其中将所有有效序列读数与参考基因组对齐并且检索有效IS。

数据质量分析。为了从Illumina MiSeq原始数据中鉴定IS，开发了生物信息学管线。标准LAM-PCR产物含有LTR序列、侧翼人基因组序列和接头盒(LC)序列。459技术允许检索长度范围为10bp至900bp的LAM-PCR序列。从Illumina MiSeq配对末端读数中检索到类似的结果。这些长度边界是质量分析过程中要考虑的重要参数，因为它们影响后续的比对过程和载体组分鉴定(vector components identification)的算法。丢弃序列太短而不能与参考基因正确比对的序列，以及超过利用NSG技术可读取的最大大小的序列，以避免缺失部分或全部LC序列。一旦针对每个池管道结束，所有整合位点都被收集在文件中(存档在TIGET网络附属文件存储-NAS-中)和内部数据库中，并在跟踪修改后的副本的存储服务器中进行维护。

整合地点鉴定。为了鉴定独特的整合位点并提取excel文件(其中所有IS在行中，并且每个样品在具有最接近的基因注释的列中(IS矩阵)中)，我们执行以下步骤：1.使用名为create_matrix的程序创建IS矩阵，启用项目间碰撞检测(collision detection interprojects)。该程序将生成制表符分隔文件(tab-separated file)(TSV)；2.使用程序annotate_bed对IS矩阵文件进行注释，将对每个池如下使用输入TSV文件：awk'{print"chr"$1"\t"$2"\t"$2}'TSV_FILE|tail-n+2>TSV_FILE.bed；annotate_bed–a/opt/genome/mouse/mm9/annotation/mm9.refGene.TIGET.gtf-b TSV_FILE.bed-o TSV_FILE.annotated.bed调用所述注释；3.将注释和矩阵文件输入到新的Excel工作表中，此处称为XLS。

碰撞检测。为了从每个移植的小鼠中获得可靠的IS数据集，我们根据序列计数过滤潜在污染/碰撞和假阳性的数据。需要额外的数据标准化步骤来组合由不同实验产生的整合位点。

术语“碰撞”用于鉴定独立样品中相同IS的存在。在我们的实验设置中，将载体整合到不同细胞中的正好相同的基因组位置是非常低概率的事件。因此，独立样品中相同IS的检测可能源自污染，所述污染可发生在湿实验室程序的不同阶段(样品纯化、DNA提取、LAM-PCR和测序)。虽然我们的工作管道(working pipeline)被设计来在最大限度地减少样本间接触的发生，但IS的高通量分析本质上会带来一定程度的背景污染。鉴定样品之间的污染程度至关重要也因为在后续步骤中使用从相同小鼠获得的不同样品中的相同IS的检索来推断载体标记的造血细胞的生物学特性(即多谱系潜能和持续的克隆形成活性)。因此，我们必须能够区分不同样品(来自同一只小鼠)中相同IS的实际存在与污染/碰撞。为了解决这些问题，我们将来自不同测试项目和小鼠的样品之间的共享IS的程度评估为在我们的分析中测量碰撞程度的方式，然后设计规则来从每只小鼠的数据集中弃除可归因于碰撞的那些IS，并且使得在相同小鼠的样品之间寻找共享IS时评分为假阳性的可能性最小化。我们设计了碰撞检测方法，其允许验证每个整合基因座。总体结果应该是，给定整合基因座的集合I，在I中的整合基因座i被分类为碰撞的情况下，从I中丢弃i。我们在3个独立的移植组之间应用碰撞检测方法：1.coPKR170：来自测定1的小鼠在用表达coRPK的LV载体(coRPK1-3)转导的Lin^-细胞移植后170天时实施安乐死。2.EGFP：将携带表达EGFP的LV载体(EGFP1-6)的Lin^-细胞移植到来自测定2的小鼠中。3.coPKR-TC：将用表达coPKR的LV载体转导的Lin^-细胞移植到来自测定2的小鼠(coRPK 1-14)(包括用来自一个亚组的原代移植小鼠的合并的BM移植的次级受者(coRPK11-14))中，在不同的时间点对其血液和BM进行分析。

每个相同的IS在不同小鼠间具有不同的序列读数(序列计数)。序列计数可用于基于丰度标准确定来自一只小鼠的样品是否污染了另外的小鼠的样品。在我们的基本原理中，在两只小鼠中发现的整合将被分配给显示最高丰度的那只小鼠，而在另一只小鼠中其将被认为是污染物。因此，我们可以确定差异序列计数的阈值，该阈值允许将给定的碰撞分配给小鼠并将其从其他小鼠中移除。我们从我们的数据中获取阈值，获得为10的值，这意味着对于每个IS，在所有TI中，如果IS获得为另外的TI的最高丰度值(百分比序列计数)的1/10的丰度值(百分比序列计数比率)，则将其从当前的TI中丢弃。我们在TI和所选组中应用了这些规则，并且将Excel文件用于通过应用以下规则(此处详细介绍了TI过滤，但也扩展到了组过滤)来计算碰撞检测：1.隔离每个TI，通过对序列计数求和，将同一TI的所有样本组合在一起。2.对于获得的三个TI，对于每个IS，计算IS序列计数对比TI的总读取总和的百分比。3.然后，应用以下规则来计算阈值为10的决策步骤，该决策步骤允许将每个IS分配给可靠的TI。

一旦IS被检测到要移除，就从该组中删除该IS的读数，以使得其不再被分配给该组。将上述过滤应用于移植有不同离体转导的细胞群的小鼠(来自测定2的表达EGFP的小鼠的一个群组，和属于两个独立移植实验的coPKR小鼠的两个群组)。此外，对于coPKR-TC组(测定2)，以两种方式对上述过滤方法进行了修改：a)为了更好地突出克隆丰度分析背景下时间点之间的整合共享，我们添加了以下规则：如果在一只或多只小鼠之间共享一个整合，则即使它们的序列计数小于小鼠中最大序列计数的10％，也将保持所有时间点的整合；b)对于谱系跟踪关系，我们通过消除序列计数低于3的IS和10％序列计数过滤器来应用更严格的过滤器，以便在时间点之间进行共享。意味着两个时间点之间共享的整合只有在分别比另一个更多或更少的情况下才会被保留或丢弃。

基因本体分析。所有基因本体分析均使用GREAT在线软件(http://bejerano.stanford.edu/great/public/html/)进行。该网页允许上传每个数据集组的整合的基因组坐标，并通过使位置信息(基于用于p值计算的二项分布分析)与最接近整合位点的基因的基因的注释功能(基于p值计算的超几何分布分析)相关联来计算测试数据集中的富集水平[Groeschel S等(2011).J Inherit Metab Dis 34:1095-1102]。选择基因本体数据库的生物过程和分子功能进行富集分析。仅考虑了对于两种统计分析假发现率均<0.05的基因类别(图20)。

数据存储。所有数据(包括行数据和结果)都存储在根文件夹中的TIGET网络附属文件存储(NAS)中，其中来自管线的所有比对都是可用的，丰度矩阵和图也是可用的。NAS存储通过身份验证和授权策略来保证安全，并使用冗余磁盘阵列RAID 5构建在可靠且可扩展的基础架构上，并且将其在我们在TIGET中注册的CrashPlan软件上备份。

实施例1

PGK-coRPK治疗性慢病毒载体导致遗传校正的PKD小鼠的贫血表型的稳定和长期校正。

通过转导和移植来自PKD小鼠的谱系贫化的BM细胞(Lin^-细胞)来测定PGK-coRPKLV(图2a)的体内功效(图2b)。图2a是在整个遗传疗法实验中使用的自我失活型慢病毒载体的示意图，所述慢病毒载体含有调控对照载体(上图)中的EGFP转基因的表达或治疗性载体(下图)中的PKLR cDNA(coRPK)的密码子优化序列的表达的人PGK启动子。coRPK序列显示与人PKLR cDNA具有80.4％的同源性，与小鼠Pklr cDNA具有76.5％的同源性，氨基酸序列没有变化。图2b是为解决所开发的PGK-coRPK慢病毒载体的功能而进行的基因治疗方案的示意图。通过血液学分析和代谢谱分析，在PB和BM中移植后研究PKD表型的校正4至9个月。在来自所有小鼠的不同组织和时间点进行整合分析以处理LV载体安全性问题。在移植后280天，将携带coRPK转基因的原代移植小鼠的总BM再次移植到经致死照射的雌性PKD小鼠(次级受者)中以测试植入物的稳定性和安全性。当与非移植的PKD同窝出生小鼠或移植了用EGFP LV转导的细胞的小鼠相比时，利用用coRPK LV转导的缺陷型细胞移植的经致死性照射的PKD小鼠显示出所有测试的血红系参数的显著改善(图3和表2)。

表2.外周血中移植后140天记录的血液学变量。

数据表示平均值±SEM，并且通过使用Kruskal-Wallis非参数检验与表达EGFP的小鼠比较来对所述数据进行统计学分析。*P<0.05；**P<0.01。

一旦移植后到达40天，RBC计数就增加(图3a)，并且作为PKD最常见的体征之一的组成型网状细胞增多症在携带PGK-coRPK转基因的小鼠中显著恢复，达到接近在健康对照中观察到的水平，该水平在移植后持续至少9个月(图3b)。相反，在所有分析的时间点，移植了EGFP LV转导细胞的PKD动物与PKD小鼠平行地显示贫血和显著的网状细胞增多症。当与未移植的PKD同窝出生小鼠相比时，在移植了慢病毒校正的细胞的小鼠中也校正了血红蛋白水平(HGB)、血细胞比容指数(HTC)、平均血细胞容积(mean corpuscular volume)(MCV)和平均血细胞血红蛋白(MCH)值(表2)。实现了该血液学校正，其中供体嵌合体为用63.66±4.45％，转导效率为60％至90％(表3)。

表3移植了遗传修饰细胞的小鼠中的相关分子参数。

数据表示平均值±SEM，n.d，未确定的。^a通过在从实验1建立的线性回归中插值获得的估计转导百分比(X轴：VCN/WBC，Y轴：原病毒⁺CFU％)。

转导细胞显示平均1.65±0.08个整合载体拷贝/细胞，表明PGK-coRPK LV-载体提供了足够的人RPK转基因表达以恢复溶血性贫血。值得注意的是，当与未移植的PKD小鼠相比时，coRPK转基因的表达导致红系细胞半衰期的延长(图3c，d)。平均而言，PKD小鼠显示为19天的RBC半衰期，而在遗传校正的小鼠中，这被延长至25天(延长6天)，达到接近野生型RBC半衰期的值(图3d)。因此，表达coRPK的小鼠的RBC显示出在健康与缺陷型对照小鼠之间的中间存活动力学(图3c)，最可能是因为在这些动物中未实现完全嵌合(表3)。

移植后9个月，将来自原代受者的造血祖细胞移植到第二代受者中，所述第二代受者保持植入水平(62.89±5.61％)和VCN(1.44±0.08个拷贝)(表3)。次级移植受者在移植后长达5个月内显示出多谱系造血重建(图4)，并且所有PB红系参数均显著改善(图5和表2)。图4a是用于通过用CD3-PE、B220-PE、B220-PECy5、Gr1-生物素和Mac1-生物素抗体加SAV-PE-Cy5标记来鉴定不同造血谱系的流式细胞术策略的图。图4b描绘了移植后140天PB中每个谱系的代表性点图和百分比(图4c)。条代表健康(n＝2，黑色条线)和PKD小鼠(n＝2，灰色条)对照和表达coRPK治疗性转基因的次级移植小鼠(n＝4，划痕条)的平均百分比±SEM。另外，在不同地定型的造血祖细胞中检测到原病毒整合(图6a，b)，并且其数量随时间保持恒定(图6c)，证明了遗传校正的稳定性并突出了PGK-coRPK LV的安全性。图6a显示移植后120天至170天来自个体移植小鼠的以BM CFU表示的每个细胞的载体拷贝数。还显示了转导和嵌合百分比。图6b显示来自不同造血区室的细胞中的原病毒拷贝数。柱代表不同组的移植小鼠的平均值±SEM。图6c显示来自个体移植的表达EGFP的小鼠(灰线)和携带coRPK转基因的小鼠(黑线)的BM细胞中原病毒整合的动力学。

实施例2

慢病毒来源的RPK表达使红细胞分化正常化并允许产生功能性成熟红细胞。

PKD小鼠显示由补偿性红细胞生成机制(Min-oo等2004)引起的红系区室(erythroid compartment)的特征性扩张。对移植小鼠的红细胞分化模式的研究表明，异位RPK表达恢复了这种机制(图7a，b)。表达PKD和EGFP的小鼠在BM和脾中显示出未成熟的红系前体(亚群I：前成红细胞(proerythroblast)和亚群II：嗜碱性成红细胞)占优势，并且晚期红系细胞(群体IV：网织红细胞和成熟红细胞)显著下降，而移植有用coRPK LV转导的细胞的小鼠显示在BM和脾中未成熟的红系前体(亚群I和II)显著减少，并且相当于健康小鼠的最新红系区室(亚群IV)显著增加(图7a，b)。另外，与表达PKD和EGFP的小鼠不同，携带coRPK转基因的小鼠显示血浆中促红细胞生成素(Epo)水平显著降低(图7c)。图8a显示来自脾的总CFU，图8b显示移植后140天的骨髓。点代表每只分析的小鼠的集落数，线代表每组的平均值±SEM。通过非参数Kruskal-Wallis检验对数据进行统计学分析。用治疗性载体处理的PKD小鼠中红细胞生成的正常化伴随着脾祖细胞含量数量减少至正常水平(图8a)，尽管未观察到BM CFU含量的变化(图8b)。

实施例3

用coRPK慢病毒载体转导的细胞的移植恢复了髓外红细胞生成和器官病理学。

由于RPK缺陷型红细胞的活性破坏，当与健康对照相比时，表达PKD和EGFP的小鼠表现出急性脾肿大，其中脾重量和大小增加超过200％(图9a，b)。在这些动物中也观察到脾组织的无组织结构和脾红髓的扩张，表明在表达PKD和EGFP的肝切片中红系细胞团簇的存在也支持强烈的髓外红细胞生成(图9c)。值得注意的是，coRPK转基因的异位表达在遗传校正的小鼠中完全恢复了脾和肝病状，减少了RBC积累并使脾组织结构和大小恢复正常(图9)。另外，组织学研究显示遗传校正的小鼠的肝中完全没有铁沉积，而来自非移植组或移植了用携带EGFP的载体转导的HSC的组中的PKD小鼠表现出由于连续溶血过程而导致的强烈的铁过载(图9c)。总体而言，遗传修正的HSC在PKD小鼠中的移植恢复了红细胞生成的正常状态以及由溶血性贫血引起的所有继发效应。

实施例4

PGK-coRPK LV来源的表达恢复RBC中的糖酵解途径而不改变WBC代谢平衡。

接下来，我们对所有移植和对照小鼠进行了广泛的代谢组学分析，以研究RPK酶促活性的功能校正。在非靶向谱分析策略(untargeted profiling strategy)之后，我们观察到不同组中RBC中糖酵解中间体的显著变化，鉴定了具有不同趋势的三个代谢物模式的广泛簇(图10a)。来自表达coRPK的小鼠的RBC显示来自簇1的代谢物增加，类似于健康对照，但不同于携带EGFP转基因的移植小鼠。同样地，簇3反映了经遗传校正的小鼠中类似于野生型小鼠的减少的代谢物的趋势，并且不同于表达EGFP的小鼠。然而，来自测定1的簇2显示移植小鼠组(表达EGFP和coRPK的小鼠)之间的代谢物谱没有差异(图10a)。非靶向代谢谱分析还表明，遗传修饰能够修饰一些重要的糖酵解中间体，在从移植了PGK-coRPK LV转导的HSC的小鼠分离的红细胞中实现了ATP(图10b)、ADP(图10c)和丙酮酸(图10d)水平的升高。考虑到这些代谢趋势，我们然后使用靶向谱分析方法分析了更靠近PK催化的反应的其他代谢物。位于PK催化反应上游的直接PK底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)(图10e)和3-磷酸甘油酸(3-PG)(图10f)的水平接近健康对照小鼠的水平。当与表达PKD和EGFP的小鼠相比时，表达coRPK转基因的缺陷型红细胞也产生D-乳酸(厌氧糖酵解的最终产物)的增加(图10g)。为了测试糖酵解代谢物中的补偿是否是成熟红细胞中PK活性正常化的结果，我们测量了该酶的活性并将其相对于己糖激酶活性标准化以避免缺陷型动物中大量网织红细胞的影响。通过纤维素柱纯化RBC以防止白细胞PK活性污染。在表达coRPK的动物中观察到PK活性的完全补偿，其达到与从野生型健康动物和从正常健康献血志愿者获得的比率相似的比率(图11)。图11a显示丙酮酸激酶活性，图11b显示己糖激酶活性，图11c显示来自对照小鼠和移植了转导细胞的小鼠的RBC中丙酮酸激酶与己糖激酶酶活性的比率。通过纤维素柱从血液样品中纯化RBC以避免白细胞PK活性污染并进行酶活性评估。黑色条，健康小鼠(n＝2)；白色条，移植了用表达EGFP的载体转导的细胞的小鼠(n＝3)；划痕条，移植了用表达coRPK的载体转导的细胞的小鼠(n＝3)。方格条表示来自健康志愿者的值(n＝1)。数据代表每组的平均值±SEM。

主成分分析显示RBC的代谢物模式根据组而不同，并且与WBC谱显著不同(图12a)。相反，WBC亚组聚集在一起，组间差异很小，表明当表达异位coRPK时白细胞的代谢平衡没有变化(图12a)。另外，在WBC中不存在在RBC非靶向谱分析中观察到的特定代谢物变化(图12b-d)。

实施例5

PGK-coRPK LV转导的细胞使得多克隆造血重建并且不具有载体遗传毒性的迹象。

在移植小鼠中分析携带coRPK或EGFP转基因的LV的整合谱。由于LV的全基因组整合谱，每次插入都产生独特的遗传标记，其可用于追踪个体转导细胞中的克隆行为。基因组DNA(gDNA)获自WBC和BM细胞以及原代和二代移植小鼠，以及移植前的转导细胞库(Lin细胞)。线性扩增介导的PCR(LAM-PCR)(图13和14)用于扩增载体/基因组连接，并用于鉴定载体插入位点(IS)。图13显示了通过3’载体LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增鉴定了载体整合位点。使用MultiNA自动化系统，产生以几个条带为特征的模式。载体骨架来源的Tsp509I内部对照带(IC)用箭头表示。图14演示通过3'载体LTR-基因组连接的LAM-PCR扩增鉴定了载体整合位点。使用MultiNA自动化系统，产生以几个条带为特征的图案。载体骨架来源的HpyCH4IV5内部对照条带(IC)用箭头表示。

通过MiSeq Illumina平台对PCR产物进行测序，并通过生物信息学管道将获得的序列定位到小鼠基因组上，并如上文方法部分中所述过滤碰撞(图15)。图15是在移植有遗传修饰的造血祖细胞的小鼠中进行的整合位点作图分析的一般方案。如在所示管道之后的补充方法中所述，分析来自属于两个独立实验的移植小鼠(表3)并在移植后不同时间点收获的骨髓和白细胞样品。

总体而言，我们将5,173,892个测序读数定位在移植的小鼠基因组上，产生了2,220个独特的载体整合位点。来自两个独立实验的IS的基因组分布与先前报道的LV对在转录单位内(特别是在转录起始位点-TSS-下游的前50Kb内)整合的偏好相匹配(图16a)，显示对小鼠基因组中的任何特定染色体没有偏斜(图16b)。图16a显示了最近的RefSeq基因的转录起始位点(TSS)周围跨越TSS的上游和下游500Kb的整合位点(IS)频率分布。顶部的数字是针对所有样品和时间点检测到的IS的数量。图16b显示表达EGFP转基因(黑色条)或coRPK治疗性转基因(灰色条)的移植小鼠中LV整合位点的染色体分布，显示对任何特定染色体没有偏斜。

通过克隆丰度估计，计算每个IS(克隆标记)的序列计数相对于数据集组的序列总数的百分比来研究基于PGK-coRPK LV的基因疗法的安全性。对每只小鼠检索的每个IS的相对丰度的点图和热图图示(图17、18和19)显示不同小鼠和体外培养的Lin^-细胞的克隆组成的强烈波动。图17是携带治疗性PGK-coRPK LV载体的原代与第二代受者小鼠之间的跟踪共享整合图。将在任一小鼠中在任何器官和任何时间检测到的整合合并。次级受者接受来自移植小鼠coRPK11至14的合并的BM。检测到的其余IS被检测到或存在于原代或第二代受者中。框中的数字表示所指示的小鼠中的相应整合的百分比的代表性。除了在对整合分析应用≥5％的滤波以外，还消除序列计数<3的所有整合。图19显示了每只小鼠中的骨髓中的合并整合的克隆丰度的点图表示。每个整合位点的相对百分比(y-轴)是相对于在每个数据集组中获得的序列读数的总数。与共-RPK转导的细胞类似(图17)，该图表明绝大多数移植小鼠显示出造血细胞再增殖的多克隆模式。

此外，可能理解，对于几个样品，少量整合有助于大量序列读取(图17和18)，揭示了转导的HSC再增殖的多克隆模式。另外，携带治疗性PGK-coRPK LV的原代小鼠和随后移植的第二代小鼠之间的跟踪共享整合显示组之间没有强烈的整合共享，证实没有克隆优势(图18)。

为了确定移植小鼠中是否存在插入诱变的标志物，我们评估了与目前正在进行的LV介导的临床试验类似的常见插入位点(CIS)的发生。CIS是插入热点，其可由转导或体内选择具有赋予生长优势的载体整合的克隆时的整合偏倚性产生。使用基于Abel和cols的算法鉴定CIS，并且异常值的Grubbs检验没有发现CIS，因此通过该读出没有发现遗传毒性的警示体征。此外，基因本体论(GO)分析显示，在通过种群重建造血细胞克隆的组织分布、时间点或丰度排序的任何整合数据集组中，对参与癌症、细胞增殖或细胞凋亡调节的基因类别没有偏倚性(图20)。图20表示LV基因组整合谱。使用GREAT软件对来自移植小鼠的样品进行基因本体论(GO)分析。从该研究中检索到的所有整合(N＝2220)显示在图的左侧部分指示的基因功能的过度表达。为了确定最丰富的整合是否在特定基因类别上富集，选择相对序列计数整个数据集组的>5％的所有整合位点(如图17所示)，显示没有过度展示的GO基因类别。

这些结果表明载体整合的中性，并证明了PGK-coRPK LV在临床前环境中的安全性。

实施例6

人体临床试验

在具有脾切除术难以治愈的严重的输血依赖性贫血史的丙酮酸激酶缺乏症患者中，使用EU/3/14/1130医疗产物(用含有RPK基因的慢病毒载体转导的自体CD34+造血干细胞)进行临床试验以评估自体造血干细胞移植(HSCT)的安全性和初步功效。

ODD EU/3/14/1130包含表达治疗性人PKLR基因的密码子优化形式的自我失活型慢病毒载体(图21)。

自我失活型慢病毒载体(SIN-LV)提供更稳健的表达(Ellis 2005)并且比γ-逆转录病毒载体更不易受转录沉默的影响(Pfeifer，Ikawa等2002)。它们还显示出安全得多的整合谱(Schroder，Shinn等2002年)(Mitchell，Beitzel等2004年)(Wu，Li等2003年)，并且由于它们在3'LTR序列中携带了400bp的缺失(Miyoshi，Blomer等1998)(Zufferey，Dull等1998)，因此转基因表达受内部启动子调节，增加了基于LV的遗传修饰的安全性。

所接受的慢病毒载体的载体序列还包括若干修饰以改善靶细胞中的转基因表达和安全性。

一种修饰是使用人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，所述启动子的特征在于与基因疗法中使用的其他启动子相比，其具有稳定的体内活性和改善的安全性质(Montini，Cesana等2006，Modlich，Navarro等2009，Montini，Cesana等2009，Biffi，Montini等2013)。PGK导致转基因的更加生理性表达和对转录沉默的较低易感性(Gerolami，Uch等2000，Zychlinski，Schambach等2008)。

另一种修饰是人PKLR cDNA(coRPK)的密码子优化形式，以在转录时增加mRNA稳定性。为了优化，已使用了软件，增加了GC含量并去除了隐蔽的剪接位点，以避免转录沉默，从而增加转基因表达。coRPK优化的序列与人PKLR基因显示出80.4％的同源性，蛋白质的氨基酸序列没有变化。

另一种修饰是土拨鼠肝炎病毒的突变的转录后调控元件(Wpre)，缺少任何残留的开放阅读框(Schambach，Bohne等2006)也被包括在内以改善治疗性基因的表达水平和稳定性。该慢病毒载体(PGK-coRPK LV)的骨架、启动子和Wpre*序列与相应于医疗产品“用于Fanconi贫血A型患者的疗法的含有Fanconi贫血A(FANCA)基因的慢病毒载体”(参考文献141/2000)的骨架、启动子和Wpre*序列，以及目前正在进行的异染性脑白质营养不良(MLD)的临床试验中使用的载体骨架(Biffi，Montini等，2013)相同。

作用方式

在从PKD患者(从骨髓(BM)或动员的外周血细胞)收获CD34⁺祖细胞后，将用医疗产物离体转导它们，并且治疗性载体将被整合到细胞的基因组中。一旦整合，治疗性人基因(coRPK)将在缺陷型细胞内转录和翻译，以产生在PKD成熟红细胞中缺失或减少的治疗性RPK蛋白。然后将转导的PKD造血祖细胞进行遗传校正，从而能够产生具有足量ATP的RBC以实现其功能(图22)。然后将这些经遗传修正的造血祖细胞(其将构成医疗产物)移植回患者体内，一旦移植，将产生正常的红细胞，终生治愈疾病。

活性成分将包括经校正的造血干细胞(CD34⁺)细胞的细胞悬液，其中治疗性慢病毒载体PGK.coRPK.wpre由欧盟委员会(ODD EU/3/14/1130)设计为孤儿药，用于治疗丙酮酸激酶缺乏症。因此，这种新药应该包括在基因治疗小类中的高级疗法开发组中。

活性成分将由至少2x10⁶个CD34⁺细胞/Kg体重的经遗传修饰的细胞悬浮液组成，其中每个细胞具有至少0.1个拷贝的治疗性载体。将细胞悬浮在含有2％HSA的盐水缓冲液中。

最终的治疗性产品将根据GMP规则生产，因此其在患者中的释放和其在患者中的输注的产品要求将与产品的质量相关。与此相关，这些规格将是细胞活力≥30％、无菌(药典中的革兰氏测试和无菌)、支原体的不存在、复制型竞争性慢病毒颗粒的不存在以及通过检测(通过定量PCR)每个细胞至少0.1个载体拷贝的存在来证明治疗潜力的效力。另外，还将进行造血祖细胞含量和这些细胞中载体拷贝数的调查和研究。将使用健康的对照细胞进行三次独立验证，以确保该程序达到上述要求。

最终产品将被包装在通过加热密封的转移袋中，并特别地进行冷冻和储存直至将其输注给患者；之前，将收集样品以进行精确的相应质量控制。

动员

将在各自的医院动员患者，尽管将在Hospital del Niiio Jesus,Madrid(Spain)动员两名首批患者。动员过程包括以12mg/kg的剂量(每天两次，持续从出生起最多8天)施用重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF，Neupogen,Amgen,Thousand Oaks,CA,USA)，第4天施用普乐沙福(240mg/kg/天(Genzyme Europe BV,Naarden,Netherlands)，达4个皮下剂量，持续连续4天)。从动员的第5天开始通过细胞分离器并根据Hospital NiiioJesus in Madrid中的标准方案，通过大容量白细胞单采术收集来自外周血的造血祖细胞。所有仪器和溶液均带有CE标志，并符合医疗器械法规的规定。

CD34⁺细胞的纯化

与动员过程一致，单采血液成分术将在动员患者的医院进行。通过MACS“磁性细胞分选”技术(Miltenyi Biotec,Germany)立即处理单采血液成分以选择造血祖细胞(CD34⁺细胞)，该技术允许通过强磁场梯度，通过强大的永磁体和具有铁磁性基质的分离柱分离细胞。C1iniMACS(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)系统包括计算机(plus Instrument)、特定的CD34⁺选择软件、一套无菌管(C1iniMACSTubing Sets)、磁控反应性无菌仪器(C1iniMACS CD34Reagent)和无菌缓冲液(C1iniMACSPBS/EDTA缓冲液)。使用的仪器和试剂将带有CE标志，并符合医疗器械法规的规定。在该阶段期间和随后的洗涤中，使用非特异性免疫球蛋白(静脉内Flebogamma 5％0.5gr，Grifols)和人白蛋白(人白蛋白20％,Grifols)，随后将其在离心后通过洗涤除去。然后对CD34⁺细胞进行定量。对获得的产品的微生物控制将通过遵照特定方案采用标准真菌、需氧细菌和厌氧菌样品进行培养来进行。

CD34⁺的转导

在从患者中提取细胞(单采血液成分术)后48小时内的时间窗内在GMP条件下利用ODD EU/3/14/1130转导纯化的CD34⁺细胞。细胞的离体培养将持续不到48小时，并将根据已建立的标准进行培养，包括使用适当配制的培养基X-vivo-20(Lonza)，添加造血生长因子(100ng/ml hrSCF，100ng/ml hrFlt-3，100ng/ml TPO和20ng/mL IL-3(均来自Prepotech))，1μg/ml阿法链道酶(Pulmozyme)和受控的5％O₂浓度。转导将使用由VIVEbiotech(San Sebastian,Spain)生产的ODD EU/3/14/1130的GMP慢病毒批次进行。转导后，将在X-vivo-20(Lonza)中洗涤细胞，最后将其包装在适合冷冻保存的转移袋中。将收集特定样品以确定最终产品是否满足所有针对其最终释放已提及的规范。将进行三次独立验证以评估产品的稳定性。所有产品和溶液，包括载体，都将符合医疗器械和临床使用法规的规范。在生产之前，所有原材料(包括消耗品、生物试剂和化学粉末)将由CliniStem的质量控制(QC)部门根据标准操作程序(SOP)进行检查。

调理(Conditioning)

根据考虑用于试验的标准化的特定方案对患者进行调理。为了考虑患者的调理，一个替代方案是将2x10⁶个未操作的CD34⁺细胞/kg的备份保持冷冻，以便在所制备的产品不能完全重建受治疗患者的造血功能的情况下使用。

输注

在输注之前，将检查患者资格以确保它们符合研究要求。将记录输注日、术前用药和预防性用药。

实施例7

非临床开发

先前的研究表明当移植超过25％的经遗传校正的细胞时，HSC基因治疗小鼠PKD是可行的。这些结果表明需要大量供体基因校正的HSC(Zaucha，Yu等2001)和高水平的转基因表达以在PKD中实现治疗效果。我们已开发了拟议用于该临床试验的新的治疗性慢病毒载体，其包含驱动PKLR cDNA表达的hPGK真核启动子，该载体在2014年8月被指定为孤儿药(EU/3/14/1130)。使用该载体，我们在该疾病的小鼠模型中进行了PKD的临床前基因治疗方案。使用基于临床标准的慢病毒剂量，异位RPK表达能够使红系区室正常化，校正血液学表型并恢复器官病状。代谢组学研究证实了经遗传校正的RBC中糖酵解途径的功能校正，在白细胞中没有观察到代谢紊乱。显然，并行分析的白细胞显示，当RPK在遍在启动子诸如PGK的活性下异位表达时，白细胞中的代谢平衡没有改变，排除了白细胞代谢优势作为可能的安全问题，并加强了EU/3/14/1130载体的治疗潜力。

在BM再移植诱导的增殖应激后，第二代受者中多谱系重建和缺乏任何白血病事件或克隆扩增证明了基于PGK-coRPK LV载体的方案的长期稳定性和安全性。人PGK真核启动子(其i)可能导致RPK转基因的更加生理的表达，ii)已被证明是弱反式激活因子，iii)目前用于异染性脑白质营养不良(MLD)的临床试验)的使用，也可能导致了整个程序的安全性。

为了通过分析载体整合位点来评估HSC基因疗法的长期安全性，使用下一代测序来预测HSC中插入性肿瘤发生的风险。将超过5,173,892个序列读数在小鼠基因组上映射到总共2220个独特的载体IS，没有发现体内扩增或选择携带IS的克隆的证据。相反，我们的数据显示了转导的HSC在小鼠中移植后的克隆组成和造血动力学，表明HSC随时间推移的真实和稳定的遗传体内修饰。总体而言，载体整合模式的分析强调了PGK-coRPK LV载体的安全性质，其提供PKD遗传校正而没有遗传毒性的迹象。

实施例8

临床开发

迄今为止，尚未对该医疗产品进行临床研究。这是第一次向监管机构提出协议辅助。我们的目标是进行由欧盟委员会资助的临床试验。由欧洲的不同临床医生和基础研究人员组成的ForGeTPKD联盟已经建立，专注于PKD研究和新治疗策略的开发。ForGeTPKD临床试验将是在人中首次施用该医疗产物。其被设计为评估用慢病毒载体(其含有红细胞型丙酮酸激酶(RPK)基因)(EU/3/14/1130)离体转导的自体CD34+细胞的移植在严重丙酮酸激酶缺乏症患者中的安全性和有效性的国际性、多中心、I/II期开放标签研究。

监管状况

目前，医疗产物没有上市许可。PKD联盟的目标是推进药品的临床开发，以便最终获得上市许可。

上述最终产品将使用慢病毒载体生产，所述病毒载体已获得与以下相关的孤儿药物资格认定：

适应症：治疗丙酮酸激酶缺乏症

标准：PKD的唯一治愈性治疗是同种异体BMT，其已被用于其他措施难以治疗的输血依赖性严重贫血患者。然而，同种异体BMT并不是被广泛接受的PKD治疗方法(文献只报道了一名患者(Tanphaichitr，Suvatte等2000))，因为其与与通过化学疗法或化学-放射疗法进行的强化的前同种异体BMT调理相关的严重并发症以及急性和慢性移植物抗宿主病(GVHD)相关。我们的假设是，使用由ODD EU/3/14/1130提供的含有野生型基因的病毒载体转导的自体造血干细胞的基因疗法可以为这些患者提供潜在治愈机会，避免了GVHD(造血祖细胞移植失败的主要原因)的风险。

活性物质：自体CD34⁺造血干细胞(用含有红细胞型丙酮酸激酶(RPK)基因(ODDEU/3/14/1130)的慢病毒载体转导的，表达该蛋白的野生型形式)

成品：含有至少2x10⁶活性物质(悬浮在含2％HAS的盐水缓冲液中)/kg患者体重的冷冻袋

实施例9

药理学

完成的研究：开发的药品在其序列中包括若干修饰，所述修饰为PKD的基因疗法提供了一些优势：1)SIN-LV载体设计的使用允许相对容易和安全地生产病毒原液，能够高效转导HSC；2)不易被甲基化沉默的弱真核启动子诸如hPGK的使用(Gerolami，Uch等2000)，导致转基因的更加生理的表达，用在临床标准内的病毒剂量(1.65VCN)实现了治疗水平(Matrai，Chuah等，2010)；以及3)密码子优化的转基因序列和突变的Wpre序列的存在增强了转基因mRNA的稳定性：治疗性载体序列中未包含报告基因，避免了可能的免疫原性问题(Morris，Conerly等2004)；(Stripecke，Carmen Villacres等1999)。

所开发的hPGK-coRPK LV药品在用ODD EU/3/14/1130转导和校正的祖细胞移植的原代和第二代缺陷型小鼠中均高效地恢复PKD病状。用平均每一个细胞携带1.65个拷贝治疗性转基因的细胞实现了校正。

人PGK启动子的效力足以表达临床相关水平的coRPK蛋白，恢复移植小鼠的溶血表型。

遗传校正能够：延长红细胞半衰期；使血液学变量和网织红细胞水平正常化；恢复PKD小鼠组成型激活的代偿性红细胞生成；拯救脾和肝的病状，显著减少铁过载(这是PKD危及生命的并发症之一)。另外，人RPK的异位表达校正了RBC中的能量缺乏而不改变白细胞中的代谢平衡，强调了该药品的功效和安全性。

实施例10

正在进行的研究

来自健康供体和PKD患者的人造血祖细胞的转导用于以下研究：1)ODD EU/3/14/1130在人细胞中的转导效率；2)获得RPK治疗性蛋白的高效和治疗性表达的最佳载体拷贝数/细胞的确定；3)获得治疗性转导水平而不丧失造血干细胞能力的最佳条件的确定。

计划研究包括在GMP设施中建立用于大规模转导的条件，以及预验证和3次验证研究，以建立达到针对最终治疗产品所定义的所需规格的最佳条件。

毒理学

完成的研究包括1)人RPK的异位表达校正了RBC中的能量缺乏，而没有改变白细胞中的代谢平衡；2)载体的基因组整合分析表明(i)对特定细胞克隆的相对丰度的分析揭示了一些小鼠的寡克隆造血重建，显示对于任何原代和第二代移植小鼠没有克隆优势；(ii)被认为是插入诱变的标志的共同整合位点(CIS，定义的基因组区间中载体整合的密集簇)未显示出任何遗传毒性的迹象，CIS随时间推移的异常富集以及从两个独立的在小鼠中进行的基因疗法实验中检测到的CIS均未由高序列计数表示，并且不优先靶向癌基因；(iii)慢病毒整合靶向的基因的基因本体论(GO)分析和基因组特定区域中载体整合位置的研究表明，对参与癌症、细胞增殖或凋亡调控的基因类别没有偏倚性；以及(iv)总体而言，药品整合分析未显示任何遗传毒性的证据。

计划研究包括1)重组感受态慢病毒(RCL)产生的分析：来自健康供体和PKD患者的人T淋巴细胞将用ODD EU/3/14/1130转导并在体外培养延长的时期。将通过ELISA分析病毒p24蛋白在上清液中的存在以评估潜在的产生或RCL和2)药品的生物分布：小鼠造血祖细胞将用ODD EU/3/14/1130转导并移植到致死性照射的受者中。移植后一个月将处死动物并分析不同器官(性腺、肝、肾、脑、骨髓、脾和外周血)中载体DNA的存在；3)人细胞中的载体整合组(Vector integrome)：将来自健康供体和PKD患者的造血祖细胞将用ODD EU/3/14/1130进行转导并移植到严重免疫缺陷型小鼠中以允许人造血细胞的植入和增殖。在不同的时间点(移植后1、2和3个月)，将采集血液和BM移植物，对人细胞进行分选，并对其进行载体整合组分析，如已用小鼠细胞进行的。

实施例11

人临床试验

为了测试临床效果，将进行ForgetPKD试验。拟议的临床试验旨在丙酮酸激酶缺乏症患者中评估使用EU/3/14/1130药品(用含有红细胞型丙酮酸激酶(RPK)基因的慢病毒载体转导的自体CD34⁺造血干细胞)的自体造血干细胞移植(HSCT)的安全性和初步功效，所述患者具有脾切除术难以治疗的严重输血依赖性贫血病史。

主要目标是评估治疗安全性和耐受性/可行性。以下终点将根据以下方面进行测量：1)不良事件(AE)(包括：与转导细胞的输注相关的AE、在细胞输注之前从调理获得的AE以及源自与转导细胞相关的克隆进化的AE)的发生率和表征；和2)移植后30天具有干细胞植入的患者数量。

次要目标是评估初步治疗功效。以下终点将根据以下方面进行测量：在研究结束时成为“输血独立(transfusion independent)”的患者的数量；在治疗后仍需要输血的患者中，研究期(1年)内所需输血的平均次数相对于基线评估前最后1.5年中的平均输血次数之间的比率；贫血的临床显著减少，定义为研究结束时血红蛋白水平从基线开始上升2gr/dL的患者数量；网状细胞增多症的临床显著减少，定义为在研究结束时从基线评估减少50％的患者数量；以及具有干细胞植入(其中在细胞输注后6个月和12个月以及研究结束时可检测到1％的转导细胞)的患者的数量。

探索性目标是评估治疗对患者生活质量的影响。以下终点将根据以下方面进行测量：使用生活质量问卷(成人SF-36或儿童PEDSQL)及其以参与者国家(意大利、荷兰和西班牙)语言翻译的有效版本获得的在研究结束时相对于基线的生活质量的改善。

ForGetPKD试验是一项多中心国际试验，其将在3个欧盟成员国西班牙、意大利和荷兰进行。参与中心包括进行PKD诊断和治疗的参考国家调查员和机构(ReferenceNational Investigators and Institutions)。

该试验将代表所述产品对人的首次施用。其被设计为非比较性、开放标签、单剂量I/II期研究。

整个研究持续时间将为2年(从第一位患者的第一次就诊至最后一位患者的最后一次就诊)。这包括1年的招募期和1年的治疗期和早期(立即)随访。在试验结束后，将要求包括的受试者参加随后的随访研究，该研究将监测移植后长达5年的安全性和有效性。

根据疾病发病率和研究设计，我们计划在一年内包括6名患者。考虑到已经确定了3名潜在参与者，已经确定了这一估计数。

研究程序包括筛选期、治疗期和随访期。每个阶段的就诊细节和相关的研究程序详述如下，并总结在表4中。

表4.

筛选期

就诊-1：筛选前就诊

潜在候选人将被告知试验的目的和特征，并且由患者(或法定代表，如果是未成年人的话)将获取、填书和签署书面知情同意书(一式两份)。为了有资格参加该研究，患者必须满足所有纳入标准，并且不符合任何一个排除标准，这将被检查。这包括动员和获得活的CD34⁺细胞的预处理程序，A.储存2x10⁶个CD34⁺细胞/kg体重以用作非植入情况下的备用，B.用EU/3/14/1130载体转导至少6x10⁶个CD34⁺细胞/kg体重以产生药品并执行药品释放所需的所有质量控制。只有在药品释放后具有足够转导细胞(2x10⁶个转导的CD34⁺细胞/kg体重)可用的患者将被包括在该研究中。

还将在此次就诊中执行以下程序：

·相关医疗或手术史的登记。

·人口统计数据和临床相关的体检结果的登记

·相关伴随医药的登记。

·常规细胞血细胞计数(CBC)的外周血检测，生物化学，凝固测定和血清学

·超声心动图，肺功能检查和胸部X射线检查

·生活质量问卷(SF-36或PEDSQL)

·PKD的基因诊断

为了有资格参加该研究，患者必须满足以下所有纳入标准，并且不符合任何一个排除标准。

纳入标准是在招募时年龄>2岁的男性或女性患者，所述患者愿意签署知情同意书(在18岁以下的孩子的情况下，将由其父母或法定代表人签字)，具有之前通过基因检测证实为PKD的诊断，严重输血依赖性贫血的病史，对脾切除术无反应，为自体造血干细胞移植的候选者，≥2x10⁶个转导的CD34⁺细胞/kg体重可用，并且在保持详细的医疗记录(包括输血史)的专业中心接受治疗并在至少过去2年中接受随访。

排除标准对于以下情况呈阳性：存在1型或2型人免疫缺陷病毒(HIV 1和HIV 2)、未校正的出血性疾病、存在其他溶血原因，任何先前或当前的恶性肿瘤或骨髓增生性或免疫缺陷疾病、直系亲属患有已知或疑似的家族性癌症综合征(包括但不限于遗传性乳腺癌和卵巢癌综合征、遗传性非息肉病结直肠癌综合征和家族性腺瘤性息肉病)、在具有先前的同种异体移植物的患者中、存在供体来源的残留细胞、具有严重并发症的患者(在医学评估后被认为患有III/IV级心、肺、肝或肾功能异常、不受控制的癫痫发作、一氧化碳扩散能力(DLco)<预测的50％(针对血红蛋白校正的))、在研究者看来保证要排除的严重的铁过载的任何其它证据、参与另一项临床研究(其中在筛选的30天内使用研究药物)、用于同种异体骨髓移植的HLA相合家族供体的可得性、孕妇或哺乳期妇女、按研究者的标准将无法理解研究目的、益处和风险和/或顺从研究程序，机能状态差(如通过卡莫夫斯基指数≤80(在成人中)或Lansky≤80(在儿童中)证明的)的患者。

该研究的统计分析将是描述性的。定性终点将通过频率和百分比来描述。定性终点包括不良事件、干细胞植入患者的数量、成为“输血独立”的患者的数量、贫血在临床上显著减少的患者的数量、网状细胞增多症在临床上显著减少的患者的数量、其中可检测到转导细胞的存在的干细胞植入患者的数量，以及通过SF-36或PEDSQL问卷测量相较于基线由有生活质量的改善。定量终点将通过平均值和标准偏差或通过中值和四分位数来描述。定量终点包括相较于基线而言贫血和网状细胞增多症的减少、相对于基线评估前最近一年中的输血次数而言在研究期内所需的输血次数，以及外周血和骨髓中的载体拷贝数。所有终点将在研究结束时进行描述。

先前的工作证明了当移植超过25％的经遗传校正的细胞时，PKD的HSC基因疗法在小鼠中是可行性的。这些结果表明需要大量供体基因校正的HSC(Zaucha，Yu等2001)和高水平的转基因表达来对PKD实现治疗效果。我们已经开发了新的治疗性慢病毒载体，用于该临床试验，其包含驱动PKLR cDNA表达的hPGK真核启动子，该载体在2014年8月被指定为孤儿药(EU/3/14/1130)。使用该载体，我们在该疾病的小鼠模型中进行了PKD的临床前基因治疗方案。使用基于临床标准的慢病毒剂量，异位RPK表达能够使红系区室正常化，校正血液学表型并恢复器官病状。代谢组学研究证实了经遗传校正的RBC中糖酵解途径的功能校正，在白细胞中没有观察到代谢紊乱。显然，并行分析的白细胞显示，当RPK在遍在启动子诸如PGK的活性下异位表达时，白细胞中的代谢平衡没有改变，排除了白细胞代谢优势作为可能的安全问题，并加强了EU/3/14/1130载体的治疗潜力。

在BM再移植诱导的增殖应激后，第二代受者中多谱系重建和任何白血病事件或克隆扩增的不存在证明了基于PGK-coRPK LV载体的方案的长期稳定性和安全性。人PGK真核启动子(其可能导致RPK转基因的更加生理的表达，已被证明是弱反式激活因子，并且目前用于异染性脑白质营养不良(MLD)的临床试验)的使用也可能与整个程序的安全性有关。

为了通过分析载体整合位点来评估HSC基因疗法的长期安全性，使用下一代测序来预测HSC中插入性肿瘤发生的风险。将超过5,173,892个序列读数在小鼠基因组上映射到总共2220个独特的载体IS，没有发现体内扩增或选择携带IS的克隆的迹象。相反，我们的数据显示了转导的HSC在小鼠中移植后的克隆组成和造血动力学，表明HSC随时间推移的真实和稳定的遗传体内修饰。总体而言，载体整合模式的分析强调了PGK-coRPK LV载体的安全性质，其提供PKD遗传校正而没有遗传毒性的迹象。

Claims

1.一种包含多核苷酸序列的表达盒，所述多核苷酸以5'至3'顺序包含以下序列：

a)启动子序列；

b)编码基因产物的序列；和

c)核糖核酸(RNA)输出信号，

其中所述启动子序列与编码丙酮酸激酶多肽的序列可操作地连接。

2.权利要求1的表达盒，其中所述启动子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

3.权利要求1或2的表达盒，其中所述基因产物是治疗性基因产物。

4.权利要求3的表达盒，其中所述治疗性基因产物是丙酮酸激酶(PK)多肽，任选地丙酮酸激酶肝和红细胞(PKLR)多肽。

5.权利要求1-4中任一项的表达盒，其中所述编码基因产物的序列是密码子优化的。

6.权利要求1-5中任一项的表达盒，其中所述RNA输出信号是土拨鼠肝炎病毒的突变的转录后调控元件(Wpre)。

7.权利要求6的表达盒，其中所述突变的Wpre是嵌合的Wpre，其包含与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的序列。

8.权利要求1-7中任一项的表达盒，其还包含一种或多种增强子序列。

9.权利要求1-8中任一项的表达盒，其还包含多嘌呤区(PPT)或多腺苷酸化(polyA)信号序列。

10.权利要求1-9中任一项的表达盒，其还包含以下序列中的一种或多种：

i)包装信号序列；

ii)截短的Gag序列；

iii)Rev响应元件(RRE)；

iv)中心多嘌呤区(cPPT)；

v)中心末端序列(CTS)；和

vi)上游序列元件(USE)，任选地来自猿猴病毒40(SV40-USE)。

11.权利要求1-10中任一项的表达盒，其还包含5'和3'长末端重复序列。

12.一种重组基因递送载体，其包含权利要求1-11中任一项的表达盒。

13.权利要求12的重组基因递送载体，其中所述重组基因递送载体是病毒或病毒载体。

14.权利要求13的重组基因递送载体，其中所述病毒或病毒载体是慢病毒(LV)。

15.一种细胞，其包含权利要求1-11中任一项的表达盒或权利要求12-14中任一项的基因递送载体。

16.权利要求15的细胞，其中所述细胞是造血干细胞。

17.权利要求15的细胞，其中所述细胞是定型的造血红系祖细胞。

18.一种药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和权利要求12-14中任一项的重组基因递送载体或权利要求15-17中任一项的细胞。

19.一种治疗或预防有此需要的受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者提供权利要求18的药物组合物。

20.权利要求19的方法，其中所述疾病或病症是丙酮酸激酶缺乏症(PKD)，并且所述基因产物是丙酮酸激酶(PK)多肽，任选地丙酮酸激酶肝和红细胞(PKLR)多肽。

21.权利要求19或20的方法，其中所述药物组合物包含所述重组基因递送载体。

22.权利要求19或20所述的方法，其中所述药物组合物包含所述细胞。

23.权利要求22的方法，其中所述细胞对所述受试者是自体的。

24.权利要求22的方法，其中所述细胞对所述受试者是同种异体的。

25.一种在红系细胞中表达转基因的方法，其包括使一种或多种红系细胞与有效量的重组病毒载体接触，其中所述载体包含人磷酸甘油酸激酶启动子、人丙酮酸激酶肝和红细胞(PKLR)cDNA转基因的密码子优化形式和土拨鼠肝炎病毒的突变的转录后调控元件，其中在所述接触后，PKLR在所述一种或多种红系细胞中以可检测的水平表达。