JP2017513505A - 異常ヘモグロビン症を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2014年4月25日に提出された米国仮出願第61/984,247号、および2014年10月21日に提出された米国仮出願第62/066,783号の恩典を主張している国際出願であり、各出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金番号:5U01HL117720-03の下で、米国政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本明細書において開示される態様は、異常ヘモグロビン症の治療のための組成物および方法に関する。より詳細には、これらの態様は、内因性BCL11Aの選択的ノックダウンによって細胞内の胎児型ヘモグロビンを増加させる組成物および方法に関する。
鎌状赤血球症/鎌状赤血球貧血(SCD)およびサラセミア(THAL)を含む異常ヘモグロビン症は、ヒトにおいて最も有病率の高い遺伝性単一遺伝子病である。世界人口のおよそ5%が、グロビン遺伝子の突然変異を保有している。世界保健機構(World Health Organization)は、毎年約300,000人の幼児が重大なヘモグロビン障害を伴って生まれると推定している。SCDはサハラ以南アフリカ、インド、サウジアラビアおよび地中海諸国出身の集団に分離しており、これらの地域では全小児の最大2%がこの病状を伴って生まれるが、これはヘテロ接合性鎌状β-グロビン(βS)突然変異によって付与される、マラリア伝染に対する生存優位性のためである(WHO Report on Sickle-cell anaemia - A59.9. Fifty-ninth World Health Assembly - Provisional agenda item 114: United Nations; 2006:1-5(非特許文献1))。長い歴史のある移住および/または最近の移住が原因となって、今では先進諸国で見いだされる患者集団の数が増加しており、SCDの公衆衛生面での影響は重大である(Kauf et al., American Journal of Hematology. 2009;84:323-327(非特許文献2);Amendah et al., American Journal of Preventive Medicine. 2010;38:S550-556(非特許文献3))。米国では1994年に、異常ヘモグロビン症を有する患者の生存期間中央値が男性では42年、女性では48年であると推定されている(Piatt et al., New England Journal of Medicine. 1994;330:1639-1644(非特許文献4))。分子レベルでは、SCDは分子変更と関連づけられることになった最初の疾患である(Pauling et al., Science. 1949;10:543-548(非特許文献5))。単一ヌクレオチドの突然変異により、β-グロビンタンパク質の位置6にあるグルタミン酸のバリンへの置換がもたらされる。この改変は、脱酸素条件下でのこの分子の重合およびそれに続く赤血球の「鎌状化」をもたらし、これは最終的には、溶血による貧血、ならびに腎臓、脳、肺などを含む複数の臓器に影響を及ぼす急性および慢性の血管閉塞性および虚血性合併症を招く。予防的手段(化学的予防薬であるヒドロキシ尿素を含む)により、特定の患者群では苦難の中程度の減少が得られているものの、現時点でSCDに対して利用しうる根治療法は同種異系造血幹細胞移植(HSCT)のみである(Hsieh et al., New England Journal of Medicine. 2009;361:2309-2317(非特許文献6);Hsieh et al., Blood;Electronic pre-publication June 31, 2011(非特許文献7))。HSCTは残念ながら、SCDおよびTHALの状況では有意な死亡および病的状態を伴い、それは一部には、とりわけ、HSCT前の輸血に関連した鉄過剰、移植片対宿主病、および宿主の移植前状態調節のために必要な高用量の化学療法/放射線照射に起因する。
特に例示的な態様において、本発明は、一部には、赤血球、赤血球始原細胞および胚性幹細胞を含む造血細胞および造血前駆細胞における遺伝子治療を達成するための改良された組成物および方法を提供する。本発明はさらに、造血関連障害を治療するための改良された遺伝子治療方法を提供する。
;本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来)、
;本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来)、
;本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来)、
;本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来)、
;本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来)、
;本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来)、
;本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来)、
;本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来)、
;本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)、および
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)からなる群より選択される。
本明細書に記載の本開示は、一部には、造血幹細胞(HSC)の子孫においてBCL11A標的指向性shRNAを選択的に発現するレンチウイルス遺伝子治療ベクターの開発に基づく。したがって、本開示は、赤血球系細胞におけるγ-グロビン発現の調節のための新規方法を範囲に含む。より具体的には、これらの活性を、BCL11A遺伝子産物の阻害を介したγ-グロビンの誘導により、SCDおよびTHALを含む異常ヘモグロビン症の治療のための方法に利用することができる。特定の態様において、HSC、造血始原細胞、または胎児細胞などの他の幹細胞の子孫においてBCL11A標的指向性shRNAを選択的に発現するレンチウイルス遺伝子治療ベクターが提供される。
いくつかの態様において、本開示は、赤血球系細胞または赤血球前駆細胞における移入された治療用遺伝子の持続的な高レベル発現を達成する、レトロウイルスに基づく、例えばレンチウイルスに基づく遺伝子送達ベクターを用いて、異常ヘモグロビン症を治療するための改良された組成物および方法を提供する。本発明の1つの態様において、ベクターは、内因性miR-223配列のステムループ内にクローニングされた、BCL11Aに対する標的指向性配列を含む人工的miRNAを含む(Amendola et al., Mol Ther 17:1039-52, 2009)。本ベクターのステム/ループ構造は、本明細書に開示されたSEQ ID NO:1〜18および25〜44オリゴヌクレオチドの相補的配列によって生成される。図1、12A、14A、21A、および実施例11を参照されたい。このステム/ループ構造を、miR-223/miR-30バックグラウンド中にクローニングした。続いて、このmiRNA/shRNA構造全体を、自己不活性化(SIN)ベクターの、SFFV、TETまたはLCRプロモーターを有するカセット内にクローニングした。本発明の具体的なレンチウイルスベクターは、参照により本明細書に組み入れられる、Pawliuk et al. (2001) Science 294:2368およびImren et al. (2002) PNAS 99: 14380に記載されている。
;本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来)、
;本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来)、
;本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来)、
;本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来)、
;本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来);
;本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来);
;本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来);
;本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来);
;本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来);
;本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)、および
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)からなる群より選択される。
本発明は、BCL11Aの発現を阻害するベクターを投与することによってHbF産生を増加させるための改良された組成物および方法を提供する。データから、BCL11Aの阻害がγ-グロビン遺伝子からの発現増大を招くことが実証されている。本明細書に開示される通り、細胞内の胎児型ヘモグロビンレベルを高めるための組成物および方法を提供することが、本発明の1つの目的である。いくつかの態様において、細胞は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、造血始原細胞、またはそれらの子孫である。
[1]
a)第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント;および
b)5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメント
を含む合成BCL11AマイクロRNAであって、
ループセグメントが第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、かつ
第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように第2のBCL11Aセグメントが第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、ループセグメントがそのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成している、
前記合成BCL11AマイクロRNA。
[2]第1および第2のBCL11Aセグメントが約18〜25ヌクレオチド長である、項1記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[3]第1のBCL11Aセグメントが、BCL11A mRNA配列に由来する配列を含む、項1または2記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[4]第1のBCL11Aセグメントが第2のBCL11Aセグメントに対して相補的である、項1〜3のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[5]第1のBCL11Aセグメントが5'末端にて-GCGC-で始まり、第2のBCL11Aセグメントが3'末端にて-GCGC-で終わる、項1〜4のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[6]第1のBCL11Aセグメントが、
;本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来)、
;本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来)、
;本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来)、
;本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来)、
;本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来)、
;本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来)、
;本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来)、
;本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来)、
;本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)、および
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)からなる群より選択される、
項1〜5のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[7]ループセグメントがマイクロRNAに由来する、項1〜6のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[8]マイクロRNAが造血特異的マイクロRNAである、項7記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[9]マイクロRNAがmiR223である、項8記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[10]ループセグメントがctccatgtggtagagである、項9記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[11]SEQ ID NO:1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項1〜10のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
[12]対象において項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAをインビボで発現させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
[13]インビボ発現が、対象における胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において起こる、項12記載の方法。
[14]項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを、対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって発現がエクスビボである段階、および該細胞を対象に移植する段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
[15]細胞において項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現させる段階を含む、細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる方法であって、該細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、前記方法。
[16]少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAが、真核細胞における発現のためにプロモーターと機能的に連結されてベクター中に構築されている、項12〜15のいずれか一項記載の方法。
[17]少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIポリメラーゼから発現される、項12〜16のいずれか一項記載の方法。
[18]少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIIポリメラーゼからは発現されない、項12〜17のいずれか一項記載の方法。
[19]プロモーターが、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターからなる群より選択される、項18記載の方法。
[20]ベクターがウイルスである、項16〜19のいずれか一項記載の方法。
[21]ウイルスがレンチウイルスである、項20記載の方法。
[22]レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)、ヒト免疫不全ウイルス2型(HIV-2)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)からなる群より選択される、項21記載の方法。
[23]SEQ ID NO:1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
[24]SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[25]SEQ ID NO:2のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[26]SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[27]SEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[28]SEQ ID NO:5のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[29]SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[30]SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[31]SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[32]SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[33]SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[34]SEQ ID NO:13のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[35]SEQ ID NO:14のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[36]SEQ ID NO:15のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[37]SEQ ID NO:16のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[38]SEQ ID NO:17のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[39]SEQ ID NO:18のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[40]SEQ ID NO:25のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[41]SEQ ID NO:26のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[42]SEQ ID NO:27のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[43]SEQ ID NO:28のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[44]SEQ ID NO:29のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[45]SEQ ID NO:30のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[46]SEQ ID NO:31のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[47]SEQ ID NO:33のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[48]SEQ ID NO:34のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[49]SEQ ID NO:35のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[50]SEQ ID NO:36のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[51]SEQ ID NO:37のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[52]SEQ ID NO:38のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[53]SEQ ID NO:39のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[54]SEQ ID NO:40のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[55]SEQ ID NO:41のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[56]SEQ ID NO:42のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[57]SEQ ID NO:43のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[58]SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列を含む、項23記載の単離された核酸分子。
[59]項23記載の単離された核酸分子を含むベクター。
[60]脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターをさらに含む、項59記載のベクター。
[61]項59または60記載のベクターを含む宿主細胞。
[62]胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、項61記載の細胞。
[63]赤血球である、項61記載の細胞。
[64]項23記載の単離された核酸分子を含む細菌。
[65]項23記載の単離された核酸分子を含むウイルス。
[66]レンチウイルスである、項65記載のウイルス。
[67]レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)、ヒト免疫不全ウイルス2型(HIV-2)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)からなる群より選択される、項66記載のウイルス。
[68]項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、項59もしくは60記載のベクター、項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
[69]項59もしくは60記載のベクター、項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
[70]薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、項68または69記載の組成物。
[71]対象における異常ヘモグロビン症の治療またはそれを発症するリスクを減少させるために用いるための、項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
[72]対象における異常ヘモグロビン症の治療またはそれを発症するリスクを減少させるために用いるための医薬の製造に用いるための、項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
[73]細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるのに用いるための、項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
[74]細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、項73記載の組成物。
[75]項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、項59もしくは60記載のベクター、項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または項65〜67のいずれか一項記載のウイルスの治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
[76]項68〜74のいずれか一項記載の組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
[77]対象において細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
[78]異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、項75〜77のいずれか一項記載の方法。
[79]異常ヘモグロビン症が鎌状赤血球症またはサラセミアである、項78記載の方法。
[80]酸素、ヒドロキシ尿素、葉酸または輸血を含む治療法を対象に施す段階をさらに含む、項75〜80のいずれか一項記載の方法。
典型的なPCR反応条件は以下の通りである:総容積100μl中、1×反応緩衝液(MgCl2 1.5mM;3.0mM;4.5mM(最終濃度)からなる);各0.2mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP;25pmolの各プライマー;50ngのテンプレートDNA;構造を融解させるための3〜10%(v/v)DMSO(これは任意である)。
合成miRの作製
3種類の合成miRを構築した。これらのうち2種類はBCL11Aの異なる部位を標的とし、かつ第3の非標的指向性のものは対照としての役を果たすためのものであった。これらのmiRのそれぞれを、構成的発現ベクター、TET誘導性ベクター、および赤血球系特異的ベクター中に挿入した。
構成的miRベクターの作製
Venus-miR発現が構成的SFFVプロモーターによって駆動されるように、各miRをLeGO-V2レンチウイルスバックボーン中にクローニングした。
Venus-PCR 2.1 TOPOプラスミドをNotIで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した上で、アガロースゲルで泳動させて、精製した。合成miR構築物を、NotIおよびPspOMIによる二重消化によってO.6.pBKSプラスミドから切り出し、その後にアガロースゲル抽出によって精製した。消化されたmiRインサートをVenus-PCR 2.1 TOPOプラスミド中にライゲートし、連結産物をコンピテント細菌(Stbl3)の形質転換に用いた。個々の細菌クローンを採取してミニプレップを行った。miRインサートを正しい向きで含む(すなわち、NotIおよびNaeIで消化した時に完全断片が生じる)プラスミドを選択した。
NotIおよびNaeIによる二重消化によってVenus-miRカセットをPCR 2.1 TOPOから切り出し、その後にKlenowラージ断片で処理して、NotIオーバーハングを平滑末端化した。このカセットをアガロースゲル抽出によって精製した。LeGO-V2またはLeGOG2をBamHIおよびEcoRIで消化し、Venus/eGFP cDNAを遊離させた。この線状化ベクターをKlenowラージ断片で処理して、EcoRIおよびBamHIオーバーハングを平滑末端化し、その後にアガロースゲル電気泳動によるベクターの精製を行った。精製されたVenus-miRカセットおよびLeGOベクターをライゲートして1つにし、その産物をコンピテント細菌の形質転換に用いた。個々の細菌クローンを採取し、DNAのミニプレップを行った。インサートを正しい向きで含むクローンを選択し、増殖させた上で、ウイルス上清の作製のためのマキシプレップに用いた。
赤血球系特異的miRベクターの作製
上記のように作製したVenus-miRカセットにポリアデニル化シグナルを結びつけた。その結果得られたVenus-miR-ポリAカセットを、Guilianna Ferrariにより提供された赤血球系特異的pRRL-HS3-HS2-B-グロビンレンチウイルスベクター中にアンチセンスの向きで挿入した。
PspOMIおよびNotIによる消化によってBGHpAカセットをPCR 2.1 TOPOから切り出し、その後にアガロースゲル抽出によってインサートを精製した。上記のB2で作製したVenus-miR-PCR 2.1 TOPO構築物をNotIで消化し、その後に子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。線状化されたVenus-miR-PCR 2.1 TOPOベクターをアガロースゲルでの泳動によって精製した。BGHpAインサートをVenus-miR-PCR 2.1 TOPOベクター中にライゲートし、産物をコンピテント細菌(Stbl3)の形質転換に用いた。個々の細菌クローンを採取し、ミニプレップを行う。正しい向きで挿入された(NaeIによる消化後にインサート全体が得られる)BGHpA配列を含むプラスミドを選択した。
NaeIによる消化によってVenus-miR-BGHpAカセットをPCR 2.1 TOPOから切り出した。これらのインサートをアガロースゲル電気泳動によって精製した。pRRL-HS3-HS2-B-グロビンベクターをEcoRVで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。線状化ベクターをアガロースゲル電気泳動によって精製した。Venus-miR-BGHpAカセットをpRRL-HS3-HS2-B-グロビン中にライゲートし、連結産物をコンピテント細菌の形質転換に用いた。個々の細菌クローン採取し、ミニプレップを行った。pRRL-HS3-HS2-B-グロビンベクター中にVenus-miR-BGHpAカセットを正しい向きで含むプラスミドを、それらをレンチウイルス上清の作製に用いる目的でマキシプレップ用に増殖させた。
インビトロ細胞RNA干渉実験は以下の通りに行う
FCSを加えたIMDM中で培養下に保ったマウス赤白血病細胞に対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-2=標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行い、Venus蛍光に関して選別した。形質導入後に分析した時点は第7日であった。細胞はVenus陽性が95%超であり、106個の細胞を収集してRNAを抽出し、逆転写によってcDNAを入手して、BCL11A mRNAおよびε-γグロビンmRNAに関するリアルタイムqPCRを、内部対照転写物としてのGapdhとともに行った(図3)。発現の定量には標準曲線法を使用した。
BojJドナー由来のLSK HSCを、フィブロネクチン上でSFFV-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1=標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行った後に、致死的な放射線照射を行ったC57/BL6マウスに移植した。注入する細胞用量はマウス1匹当たり細胞100,000個とした。4カ月時点でVenus陽性WBCを保有する個体をプールし(n=2)、生存性染色(7-AAD)の後に骨髄をVenus蛍光に関して選別した(図3)。RNA抽出およびqPCRは上記の通りに行った。
LCR-LV
FCSを加えたIMDM中で培養下に保ったマウス赤白血病細胞に対して、フィブロネクチン上でLCR-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1=標的指向性shRNA)によりMOI=2およびMOI=100で形質導入を行い、Venus蛍光に関して選別した。形質導入後に分析した時点は第7日であった。細胞はVenus陽性が95%超であり、106個の細胞を収集してRNAを抽出し、逆転写によってcDNAを入手して、BCL11A mRNAおよびε-γグロビンmRNAに関するリアルタイムqPCRを、内部対照転写物としてのGapdhとともに行った(図4)。発現の定量には標準曲線法を使用した。
FCSを加えたIMDM中で培養下に保ったマウス赤白血病細胞に対して、フィブロネクチン上でTET-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1=標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行い、種々の濃度のドキシサイクリンへの曝露後にVenus蛍光に関して選別した。形質導入後に分析した時点は第7日であった。細胞はVenus陽性が95%超であり、106個の細胞を収集してRNAを抽出し、逆転写によってcDNAを入手して、ε-γグロビンmRNAに関するリアルタイムqPCRを、内部対照転写物としてのGapdhとともに行った(図4)。発現の定量には標準曲線法を使用した。
末梢血SOD患者由来のCD34+循環HSCを、廃棄されたアフェレーシス材料から分画した(およそ200ml、106個のCD34+細胞)。細胞に対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1=標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行い、一部変更したGiarratana et al.(Nat Biotech 2005)のように分化させた。細胞を赤血球系表面マーカー(GPA、CD71)の成熟獲得に関してフローサイトメトリーによって分析した。赤血球系細胞は赤芽球および赤血球形態を逐次的に獲得し、Venus蛍光を発現するようになる。細胞を終末分化段階で収集してRNAを抽出し、miR-1 SFFV-IVによるγ-グロビンmRNA誘導をスクランブル(NT)対照と比較して評価するためのqPCR分析を行った(図5)。
末梢血SCD患者由来のCD34+循環HSCを、廃棄されるアフェレーシス材料から分画した(およそ200ml、106個のCD34+細胞)。細胞に対して、フィブロネクチン上でLCR-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行い、致死量以下の放射線照射を行ったNSGマウスに事前選別を行わずに細胞30,000個/匹を注入した。マウスを注入後4週間飼育し、RBCを固定して透過処理を行った。HbF染色を行い、ヒトHbFレベルが10%であるLCR-LV-miR-1マウスを同定した(図6)。
臍帯血由来CD34+ヒトHSCに対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1=標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行い、Venus蛍光に関して選別した。細胞をMS-5ストローマ上で蛍光顕微鏡検査によっても可視化した。細胞を、Luo et al.(Blood 2009)を一部変更した方法により、Bリンパ球生成経路に沿って分化させた。SFFV-LVを介したBCL11Aのノックダウンによって引き起こされる分化阻止を同定するために、細胞を、成熟Bリンパ球表面マーカーの獲得および未熟始原マーカーの喪失に関して毎週分析した。細胞を毎週の時点で収集し、SFFV-LV-miR-1を介したshRNAターゲティングによるBCL11A mRNAノックダウンを検証するためにRNAを抽出した(図7)。
赤血球系細胞における胎児型ヘモグロビンの誘導を目的とするBCL11Aのプロセシング強化および効率的ノックダウンのための、レンチウイルスベクターRNAポリメラーゼIIで駆動するマイクロRNAに埋め込まれたshRNAの最適化
pol IIIプロモーターを介して発現される短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を用いるRNA干渉(RNAi)技術は、種々の哺乳動物細胞型における遺伝子発現をモジュレートするために広く利用されている。mRNAの系列特異的ターゲティングを達成するためには、pol IIプロモーターを介したshRNAの発現が必要であり、これは発現およびプロセシングのためにshRNAを哺乳動物マイクロRNA(shRNAmiR)配列に埋め込むことを必要とする。ここでは、異常ヘモグロビン症に直接的に移行適用しうる、造血細胞におけるBCL11A転写因子のノックダウンを達成する目的で、本発明者らはpol IIIベースおよびpol IIベースのレンチウイルスベクターを介したmRNAモジュレーションの効率を比較した。BCL11Aタンパク質の抑制は、そのノックダウンによって最終的に胎児型ヘモグロビンテトラマー(HbF、α2γ2)のレベルの強化を招く胎児HBG(γ-グロビン)遺伝子の発現が誘導されることが示されていることから、鎌状赤血球症およびβ-サラセミアの治療標的になりうると考えられる。マウスでは、BCL11Aは、マウスのHBGホモログであるマウスHbb-y遺伝子の重要なリプレッサーである。本発明者らは、shRNAmiRを用いると、pol IIIにより媒介されるshRNAベクターバックボーンを用いた場合と比較して、BCL11Aノックダウン効率の低下が原因で、Hbb-y誘導が最大で100〜1000分の1に低下することを実証する。これらの差異の分子的基盤を解明する目的で、本発明者らは、複数のshRNA-shRNAmiR対による形質導入を受けた細胞の低分子RNA配列分析を実施した。本発明者らは、U6 pol IIIプロモーターを介して発現されたshRNAでは、pol IIで駆動する(shRNAmiR)成熟ガイド鎖配列と比較して4bpシフトの違いのあるガイド鎖配列が生じることを示す。RNAシークエンシングにより、pol III終止シグナルの一部を構成するウリジンの連鎖が転写されて、pol IIIベクターバックボーン内の成熟shRNAの3'末端に含められることが実証された。これらの付加的な配列が存在しないことに伴って、ダイサー切断部位に対応するシフトが生まれ、それによって、pol IIベースのベクターにおける標的遺伝子ノックダウンの有効性に影響を及ぼす代替的なシード配列を有する異なる成熟shRNAが生じる。加えて、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の絶対存在量およびそれらの比は両方とも、pol IIベースまたはpol IIIベースのベクターのいずれが細胞に形質導入されるかによって有意に異なる。shRNAmiRのガイド鎖に4bpシフトが組み入れられることにより、高い忠実度でプロセシングされた(U6で駆動されるsh-RNAと同一の成熟ガイド鎖配列)shRNA配列がもたらされ、BCL11Aのノックダウン効率はタンパク質レベルで50〜70%向上し、それに伴ってマウス赤白血病細胞におけるHbb-y誘導が100〜300倍強化された。本発明者らは、標的遺伝子の系列特異的調節を達成するためのshRNAmiRベクターバックボーンの前向きデザインのための改変された戦略を発見した。
系列特異的BCL11AノックダウンおよびヘモグロビンF誘導のためのmiRNAに埋め込まれたshRNAの最適化
材料および方法
shRNAの設計およびスクリーニング
BCL11A/BCL11A mRNAを標的とする種々のshRNAを発現する、U6プロモーターで駆動されるレンチウイルスベクター(pol III-puro)を、Broad Institute(Cambridge, MA)から入手した。pol III-puroは、hPGKプロモーターで駆動されるピューロマイシン選択マーカーを有する。XL/L型の両方またはXL型のみのいずれか、および3'UTR領域を標的とする100種を上回るshRNAを、Qiagen Turbocaptureプレートを用いる96ウェル形式でMEL細胞において、GapdhおよびHbb-yを測定する多重Taqman qRT-PCR反応を用いてスクリーニングした。
shRNA配列を、隣接mir223配列とともに、SFFVで駆動されるVenusレポーターを含むレンチウイルスLeGO-V2ベクター中にクローニングすることによって、shRNAmiRベクターを構築した(28)。mir223ループを有するshRNAmiR配列はgenscript USAInc.(NJ, USA)によって合成され、その結果得られたshRNAmiRを、pol IIバックボーン中のVenusコード配列の下流に、Xba1部位およびBamH1部位を用いてクローニングした。shRNAのすべての配列を図21Aに列記している。非標的指向性対照shRNA配列を設計して、SFFV-shRNAmiRNTまたは短縮形でNTと命名した。いずれのshRNAカセットも含まず、GFPをSFFVプロモーターを介して発現するSFFV-GFPベクターを、モック対照として用いた(33)。
レンチウイルスベクター上清は、10μgのレンチウイルス移入ベクター、10μgのgag-pol、5μgのrev、および2μgのVSVGパッケージングプラスミドを、10cm培養皿の中のHEK293T細胞にリン酸カルシウム試薬(INVITROGEN(商標))を用いてコトランスフェクトすることによって作製した。上清をトランスフェクションから24時間後および48時間後に収集し、0.4ミクロン膜(CORNING(登録商標), NY, USA)に通して濾過し、その後にSW-28スイングバケットを用いてBeckmann XL-90遠心分離機で23000rpm、2時間の超遠心を行うことによって濃縮した。力価を決定するには、NIH3T3細胞をポリブレン(8μg/ml)の存在下でウイルスに感染させて、形質導入から48時間後に、Venus発現に関するFACによって(pol II構築物)、またはピューロマイシン選択(1mg/ml、pol III構築物)によって分析した。
3T3細胞、293T細胞およびMEL細胞を、10%ウシ胎仔血清、2%ペニシリン-ストレプトマイシンおよび2mMグルタミンをそれぞれ加えたダルベッコ変法イーグル培地またはRPMI培地中で培養した。
初代ヒトCD34+細胞の凍結ストックを、健常ドナーの動員末梢血(Center of Excellence in Molecular Hematology at Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle or the Flow Core at Boston Children's Hospital)から、BCHの施設内審査委員会により承認されたプロトコールに従って入手した。用いた赤血球系分化プロトコールは(48)から採用した3相プロトコールである。細胞を、安定化グルタミン、330μg/mLのホロ-ヒトトランスフェリン(SIGMA(登録商標))、10μg/mLの組換えヒトインスリン(SIGMA(登録商標))、2 IU/mLのヘパリンChoay(SIGMA(登録商標))および5%溶媒/界面活性剤ウイルス不活化(S/D)血漿を加えたIMDM(イスコーブ変法ダルベッコ培地)(CELLGRO(登録商標))を基にした赤血球系分化培地(EDM)中で培養した。第1の拡大相(第0日〜第7日)では、CD34+細胞を、10-6Mヒドロコルチゾン(HC)(SIGMA(登録商標))、100ng/mLのSCF(R&D SYSTEMS(商標))、5ng/mLのIL-3(R&D SYSTEMS(商標)))および3 IU/mLのEpo(AMGEN(登録商標))の存在下で、EDM(赤血球系分化培地)中で培養した。第4日に、細胞を、SCF、IL-3、EpoおよびHCを含むEDM中に再懸濁させた。第2の相(第7日〜第11日)では、細胞を、SCFおよびEpoを加えたEDM中に再懸濁させた。第3の相(第11日〜第18日)では、細胞を、Epoのみを加えたEDM中で培養した。培養物は5% CO2を含む空気中で37℃に保った。
MEL細胞およびCD34+細胞に対して、U6-shRNAまたはSFFV-shRNAmiRを発現するレンチウイルスベクターによる形質導入を、MEL細胞の場合はポリブレン(8μg/ml)(SIGMA-ALDRICH(登録商標)Corp. St. Louis, MO, US)の存在下で、CD34+細胞の場合は10μMのプロスタグランジンE2および2μg/mlのポリブレンの存在下で行い、室温で2時間(2000rpm)遠心分離を行った。生細胞を形質導入から48時間後にBD FACS AriaII(BD BIOSCIENCES(登録商標))を用いてVenus発現に関して選別するか(pol IIベクター)、または細胞をピューロマイシンの存在下で選択した(1mg/ml、pol III構築物)。FACS分析のために、7AAD(INVITROGEN(商標))を死細胞マーカーとして含めた。CD34+細胞を、アロフィコシアニン(APC)結合抗体、フィコエリトリン(PE)結合抗体およびPE-シアニン7結合抗体で標識した。抗CD235(グリコホリンA)-PE抗体、抗CD71-APC抗体または抗CD71-PE-シアニン7抗体およびDRAQ-5(いずれもEBIOSCIENCE(登録商標))を表現型分類のために用いた。分析は、LSR-IIフローサイトメーター(BECTON DICKINSON(登録商標))で、DivaまたはFloJoX(TREESTAR(商標))ソフトウェアを用いて行った。
CD45.1 BoyJマウス(B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ)およびCD45.2 B6マウス(C57BL/6J)の大腿骨、脛骨および股関節のフラッシングによって系列陰性マウス骨髄細胞を単離し、その後にマウス系列細胞除去キット(Miltenyi,Biotec Inc., San Diego, USA)を用いて系列除去を行った。細胞を、100ng/mLのmSCF、20ng/mLのmIL-3(両方ともPEPROTECH(登録商標)、Rocky Hill, USA)、100ng/mLのhFlt3-Lおよび100ng/mLのhTPO(両方ともCELLGENIX(登録商標)、Portsmouth, USA)を含むSTEMSPAN(商標)SFEM培地(STEMCELL(登録商標)Technologies, Vancouver, CA)中で0.2〜1×106個/mlの密度で培養した。24時間の予備刺激後に、細胞に対して1×106個/mlの密度にてMOI 40で形質導入を行い、単離から3日後に、致死的な放射線照射を行った(7Gy+4Gy、分割照射)レシピエントに移植した。競合的再増殖実験に関しては、種々の形質導入群からの同数の細胞を混合した後に、CD45.2またはヘテロ接合性CD45.1/CD45.2二重陽性レシピエントに移植した(0.4〜1×106個/匹)。細胞混合物を、両方の競合性細胞画分の寄与が等しいことを確かめるためにフローサイトメトリーによって分析し、必要に応じて再調整した。末梢血、骨髄および脾臓の分析を、以下の抗体を用いて複数の時点で行った:CD45.1、CD45.2、B220、CD11b、CD3、CD71、Ter119および定着性生存性色素EFLUOR780(登録商標)。赤血球系列赤血球溶解の分析は省いた。分析は、LSR-IIまたはLSRFortessaフローサイトメーター(BECTON DICKINSON(登録商標))およびDivaまたはFloJoX(Treestar(商標))ソフトウェアを用いて行った。データの分析および統計処理はExcel(MICROSOFT(登録商標))およびGRAPHPAD PRISM(登録商標)5を用いて行った。
選別/ピューロマイシンによる選択から7日後のMEL細胞から、またはCD34+細胞の赤血球系分化第18日に新たに選別した細胞から、QIAGEN(登録商標)RNA Plus microキット(Valencia, CA)を用いて全RNAを抽出した。CDNAは、ランダムヘキサマープライマーおよびsuperscriptIII(INVITROGEN(商標), Carlsbad, CA)を用いて作製した。定量的PCRは、SYBR(登録商標)Green PCR master mix(APPLIED BIOSYSTEMS(登録商標), Warrington UK)を、イントロンスパニング性のマウスHbb-yプライマーおよびGapdhプライマー
ならびにヒトHBG、HBBおよびGAPDHプライマー
を用いて行った。PCR増幅条件は以下とした:95℃を10分間、その後に95℃ 15秒間および60℃ 1分間を40サイクル。qPCRは、ABI(登録商標)7500機器(APPLIED BIOSYSTEMS(登録商標), Foster City, CA)で行った。DNAの系列希釈物を用いた標準曲線を、各反応に関する厳密な増幅効果を判定するために用いた。Hbb-yおよびγ-グロビンの発現レベルは内部対照としてのGAPDHに対して規格化し、増幅効率の差に対する補正を含め、PCRデータの分析には相対的遺伝子発現(ΔΔCt法)を用いた。
U6-shRNAおよびSFFV-shRNAmiRにより形質導入されたMEL細胞を選別し、7日間のピューロマイシン選択培養後に収集した。1mlのTRIZOL(登録商標)試薬(AMBION(登録商標))を用いて全RNAを単離し、15μgを15%アクリルアミドゲルで分離した。低分子転写物のサイズはDecade Ladder(AMBION(登録商標)、Austin, TX)を用いて決定した。RNAをHYBOND(商標)-XL膜(AMERSHAM(商標)、Piscataway, NJ)に移して、UV架橋させた。ブロットのプレハイブリダイゼーションをUltraHyb-Oligo(AMBION(登録商標)、Austin, Tx)を35℃で用いて行い、γ-32P標識オリゴヌクレオチド(4ポリヌクレオチドキナーゼ;AMERSHAM(商標)、Piscataway, NJ)を37℃で1時間用いてプローブ探索した上で、30〜35℃の2×クエン酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムで洗浄し、フィルムに露出させた。成熟miRNAを検出するためのプローブ配列は以下の通りとした。
形質導入されたMEL細胞およびCD34+細胞を、プロテアーゼ(ROCHE(登録商標))およびホスファターゼ阻害薬(SANTA CRUZ BIOTECHNOLGY(登録商標))、ペプスタチンおよびロイペプチン(SIGMA)を含む溶解緩衝液(RIPA)中で溶解させた。タンパク質溶解物をBCAタンパク質アッセイ(THERMO SCIENTIFIC)によって推定した。タンパク質25μgを2×Laemmli試料緩衝液中に再懸濁させて沸騰させた上で、8% SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、その後にフッ化ポリビニリデン(PVDF)膜(MILLIPORE(登録商標))に移行させた。0.1% Triton-X100および5%脱脂粉乳を含むPBS中でブロックした後に、PVDF膜をモノクローナルマウス抗BCL11A抗体(ABCAM(登録商標))またはマウス抗β-アクチン(SIGMA(登録商標))とともにインキュベートした。抗マウスIgG HRP結合二次抗体(CELL SIGNALING(登録商標))を、化学発光20×LUMIGLO(登録商標)試薬および20×Peroxide(CELL SIGNALING(登録商標))による検出のために用いた。
分化第18日の細胞から、水中での浸透圧溶解および3回の急速凍結解凍サイクルを用いて溶血産物を調製した。溶解物を用いる酢酸セルロースによるヘモグロビン電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を、Brigham and Women's Hospitalの臨床検査室でヒトヘモグロビンの臨床的に較正した標準値を用いて実施した。
mirVana miRNA単離キット(INVITROGEN(商標))を製造元の指示に従って用いて低分子RNAを6×106個のMEL細胞から抽出し、ILLUMINA(登録商標)Hiseq2000を用いるディープRNAシークエンシングのために搬送した。自らの開発によるPERLスクリプトを用いてアダプター配列を取り出し、19〜25ntの低分子RNAをさらなる分析に用いた。BOWTIEソフトウェア(インターネットのウェブサイト、bowtie-bio period sourceforge period netから入手)をアラインメントのために用い、1つのミスマッチは許容することとした。種々の試料の比較のために、低分子RNAの発現レベルを各ライブラリーの100万の総リードに対して規格化した。4種の細胞株で250種のTRC shRNAを用いる実験のためには、ハイスループットウイルス調製プロトコールを用いてBroad Instituteによってレンチウイルスが調製され、96ウェルプレート内の1ウェル当たり単一のshRNAを高MOIで細胞に感染させ(そのプロトコールは、Broad Institute at Cambridge, MA, USAのインターネットのウェブサイトにあるRNAi public resourcesの「ピューロマイシン」の項から入手可能である)、感染から1日後に添加し、感染から4日後に細胞をTRIZOL(登録商標)で溶解させた。各細胞株について溶解物をすべてプールし、その後に全RNAの抽出および低分子RNAライブラリーの調製を行った(49)。ILLUMINA(登録商標)のリードはトリミングし、一意的なリード(>17nt)となるように収束させてカウント数を付し、ミスマッチを許容しないTRC shRNA発現ベクター配列へとマッピングした。shRNA全体の平均をとる前に、各shRNAについて成熟shRNA配列分布を計算した。
GRAPHPAD PRISM(登録商標)5.0ソフトウェアパッケージを統計分析に用いた。結果は平均±標準偏差(SD)として表現する。統計的有意性はt検定によって評価した。
単純なステム-ループshRNAとの比較による、マイクロRNAスカフォールドに埋め込まれたshRNA(shRNAmiR)によるBCL11Aのノックダウン効率の低下
BCL11Aの有効なノックダウンを媒介するshRNA候補を同定するために、ヒトとマウスとの間で保存されているBCL11A mRNAのコード配列を標的とする118種のshRNAのレンチウイルスライブラリーを、MEL細胞においてスクリーニングした。LKO-U6-BCL11A-shRNAmiR(本明細書では以下、U6-shRNA)と命名した、選択用のピューロマイシン耐性遺伝子を含むLKOレンチウイルスバックボーン(26)内にあるpol IIIベースのU6プロモーターから、ShRNAを発現させた(図19A、左のパネル)。グロビン遺伝子調節の研究のためによく用いられる細胞株であるMEL細胞に対して、shRNAを発現するレンチウイルスベクターにより感染多重度(MOI)2で形質導入を行った。ヒトγ-グロビン遺伝子の機能的ホモログとしての役を果たす胎児型マウスHbb-y mRNA(27)の規格化された発現により、BCL11Aノックダウンの間接的読み取りが得られる(図19B、y軸)。第2の読み取りとして、Hbb-y遺伝子座にmCherryノックインを有するMEL-レポーター細胞株(D. Bauer、未発表)を用いて、shRNAプールもスクリーニングした。蛍光レポーター誘導はフローサイトメトリーによって分析した(図19B、x軸)。BCL11Aのノックダウン用の系列特異的発現ベクターを開発することを目的として、MEL細胞におけるHbb-yおよびmCherryレポーター発現を一貫して誘導した8種のshRNA(図19Bでラベル表示され、shRNA1から8まで命名されている)を、ヒトマイクロRNA223(miR-223)隣接配列およびループ配列中にクローニングして、合成マイクロRNA(shRNAmiR)を作り出した。初期分析については、このカセットをpLeGOレンチウイルスベクター(28)(図19A、右のパネル)中の、強くかつ遍在性に発現される脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーター/エンハンサーの制御下にあるVenus蛍光性レポーターの3'非翻訳領域に組み入れて、LEGO-SFFV-BCL11A-shRNAmiRと命名した(本明細書では以下、SFFV-shRNAmiR)。
これらの差異の分子的基盤を解明するために、さまざまなU6-shRNAによる形質導入を受けた細胞由来の低分子RNA、およびその対応するSFFV-shRNAmiR対応物のシークエンシングを行った。Hbb-y誘導の有意な違いは、pol II環境およびpol III環境から産生される別個のshRNA含有転写物からの異なる成熟ガイド鎖の産生に起因するという仮説を立てた。このため、U6-shRNA環境およびSFFV-shRNAmiR環境の両方由来のプロセシングされたガイド鎖配列を評価した(図20AおよびB)。SFFV-shRNAmiRから産生された最も多量に見いだされた成熟ガイドRNAは、インシリコで予想された成熟配列と厳密に対応していた(図20B)。対照的に、U6-shRNAのほとんどは、pol III転写物の3'末端のほぼ22ntからなる予想されるダイサー産物と一致する成熟ガイド鎖配列であり、これはpol III終止シグナルに由来する3〜5ntの連鎖を含むが、5'末端にある標的と一致する配列の対応する数のヌクレオチドは欠いていた。プロセシングされた産物の同様の分布は、A549、MCF7、JurkatおよびU937細胞株における247種のU6-shRNAの大規模スクリーニングでも観察されており、その場合には主たるガイド鎖配列の平均長は22ntであり、その5'末端は定常ループ配列からの4塩基から始まっていた。これらの4種の細胞株における247種のプロセシングされたTRC shRNA産物のディープシークエンシングを行った(図25)。その結果、主たる成熟ガイド鎖がshRNAのアンチセンス配列の位置4で始まり、3'末端U残基を4つ含むことが指し示されている。プロセシングは一般に複数の細胞株間で一貫しており、異なるshRNA配列間でも一貫していた。各成熟配列に関する平均リード頻度にはどのshRNAにも同じ重みづけを行ったが、いくつかのshRNAは他のものよりも1,000倍を上回るリードを生じた。ライブラリー調製中のRNAリガーゼのバイアスが強いことが原因で、低分子RNAシークエンシングには半定量的性質があり、そのため相対的発現またはプロセシングレベルの比較は不可能であるが、細胞株間およびshRNA間の一貫した傾向からは、主たるガイド鎖の同一性の可能性が高いことが実証される。センス鎖のリードも検出され(平均でshRNA当たり30%未満)、その大多数は「GG」で始まってセンス鎖配列中に20nt伸びていた。これらの成熟配列は初期hU6 shRNA転写物のダイサー産物と正確に一致しており、ドローシャ/DCGR8プロセシング段階を誘発する必要がない。以上を総合すると、これらの知見は、shRNA配列をベクター間で移行させる場合に、pol II shRNAmiRおよびpol III shRNA転写物から成熟配列を生じさせるプロセシングイベントを考慮することの重要性を指し示している。試験した4種の細胞型で観察された成熟配列の分布が非常に類似していたことは、これらのプロセシングパターンを種々の細胞環境に対して一般化しうる可能性を示唆する。pol IIIベースおよびpol IIベースのベクターで生成された成熟ガイド鎖配列の違いは、SFFV-shRNAmiRと比較してU6-shRNAで観察されたBCL11Aダウンレギュレーションの差異の実質的な一因である。これらのデータは、pol IIIベクターとpol IIベクターとの間で予想される変換が、pol III shRNAのダイサー切断と比較した、pol II shRNAのドローシャおよびダイサー切断を考慮することによって可能になりうることを示唆する。
これらの知見に基づいて、本発明者らは、配列をSFFV-shRNAmiRに移入する場合に、pol III shRNAベクターからの予想される成熟配列を用いると、ノックダウン効率の強化を招くであろうという仮説を立てた。このため、ガイド鎖配列の5'末端に4ヌクレオチドのシフトを含むSFFV-shRNAmiRのセットを設計した(図21A)。siRNA二重鎖における3'末端のより高い熱力学的安定性を達成するために3'末端にヌクレオチドGCGCを付加し、それは意図するガイド鎖の選好的RISC-ローディングを促進するはずである。ノックダウン効率およびHbb-y誘導に及ぼす改変の影響を、それぞれイムノブロットおよびqRT-PCRによってMEL細胞において評価した。BCL11Aタンパク質のノックダウン効率の向上が、SFFV-shRNAmiR1、3および8で観察された(図21B)。ノックダウンの強化は、Hbb-y転写物の誘導の200〜400倍の増加と相関した(図21C)。他のSFFV-shRNAmiRは認知しうるノックダウン効率の増大を示さなかった。改変SFFV-shRNAmiR 1、3および8の効率向上の基礎にある機序をさらに十分に解明するために、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖低分子RNAの存在量ならびにそれらの比をノーザンブロット法によって分析した。まず、いずれの場合にもpol IIIベクターの方がpol IIベクターとの比較でガイド鎖の存在量が多いことが認められた。その上、特に改変SFFV-shRNAmiR 1および3については、非改変shRNAmiRとの比較でガイド鎖の方が存在量が多く、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との比が高いことが見いだされたが、これらのパラメーターはSFFV-shRNA8については影響がみられなかった(図21D)。ガイド鎖配列に対する改変の影響を評価するため、およびそれをBCL11Aノックダウンについて観察された変化と相関づけるために、低分子RNAのディープシークエンシングを行った。一般に、結果的に生じたプロセシングされた配列は、導入された4ntシフトを反映しており、その結果、LKOバックボーンで発現されたpol III shRNAから得られる配列に類似したシード領域を有するガイド鎖が生じた。SFFV-shRNAmiR 1、3および8については、単一の優位な配列が認められ、このことはより有効性の低いSFFV-shRNAmiRで配列のより幅広い分布が示されたのと対照的である。
BCL11Aノックダウンによる胎児型グロビンの再活性化は、鎌状赤血球症およびβ-サラセミアの治療に対する治療可能性がある。初代ヒト細胞におけるBCL11Aのノックダウン効率ならびにγ-グロビンおよびHbF発現の誘導に対する改変SFFV-shRNAmiRの効果を評価するために、健常志願者由来のG-CSF動員末梢血(mPB)CD34+ HSPCに対して、U6-shRNA、SFFV-shRNAmiRおよび改変SFFV-shRNAmiRを発現するベクターによる形質導入を行い、続いて赤血球系分化を行わせた。培養11日後に、BCL11Aレベルをウエスタンブロットによって判定した(図22A)。MEL細胞における所見と一致して、改変SFFV-shRNAmiR 1、3および8ではノックダウンの強化が観察され、それはγ-グロビン転写物の誘導の増加ももたらした(図22B)。赤血球系分化の状態を評価した。培養第18日に、CD71およびGpAの表面発現ならびに核除去に関して、フローサイトメトリー分析によって分析した。SFFV-shRNAmiRおよび対照ベクターにより形質導入を行った試料の間に有意差は観察されなかった(図22C)。対照的に、U6-shRNAは、成熟の後期相において分化マーカー獲得の軽度の遅れを招き、それはU6-プロモーターにより媒介されるshRNA過剰発現に起因する毒性を示す可能性がある。γ-グロビンmRNAの高度の誘導という観察所見は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定したHbFタンパク質の増加によって確かめられた。試験した3種の改変shRNAmiRはすべて、非改変SFFV-shRNAmiRと比較してHbF産生量の増加を生じさせ(図22D)、赤血球系細胞における総ヘモグロビンの40〜50%がHbFであった。γ-グロビンmRNAとHbFタンパク質との相関は高度であり(r2=0.96)、このことは分析の信頼性を裏づける(図22E)。
インビボでのSFFV-shRNAmiR発現の影響を、HSPC形質導入および移植のマウスモデルにおいて評価した。CD45.2細胞表面マーカーを発現するβ-YACマウスの骨髄由来の系列-陰性(lin-)HSPCに対して、SFFV-shRNAmiRベクターまたは非標的指向性ベクター(SFFV-shRNAmiRNT)によってエクスビボで形質導入を行い、致死的な放射線照射を受けたCD45.1 BoyJ-レシピエントマウスに移植した。対照群では非形質導入細胞を移植した。β-YACマウスは、マウス環境において発生的に調節されるヒトβ-グロビン遺伝子座を導入遺伝子として保有しており、胎児型および成人型のβ-グロビン遺伝子の発現の差異を示す。検証の目的、および以前発表されたデータとより優れた比較を行うために、miRNA223隣接配列に埋め込まれた、十分に記載のあるshRNA(23,27,29)(本明細書ではshRNAmiR*と名づける)を使用した。移植から4、8および12週後に、ドナー細胞の生着をCD45.1およびCD45.2キメリズムに基づいて判定した(図23A)。ドナー細胞の生着は予想されたパターンに従い、8週後には末梢血(PB)および骨髄(BM)においてほぼ完全に生着した。しかし、予想外のことに、遺伝子改変細胞の画分は時間経過とともに急激に減少した(図23B)。BCL11Aノックダウンベクターを用いた初期形質導入率はほぼ40%であったにもかかわらず、第12週での遺伝子標識はドナー由来のCD45細胞全体の2〜3%に過ぎなかった。SFFV-shRNAmiR NTの過剰発現にも、より少ない程度ではあるが遺伝子改変細胞の生着低下がみられ、このことは生着中のHSPC細胞における配列特異的毒性および非特異的毒性の両方を指し示す。shRNAを発現するドナー細胞の喪失の時期からは、より原始的な造血幹細胞区画に対する影響が示唆される。
ヒト実験系においてLCRにより媒介されるBCL11Aの赤血球系特異的ノックダウンの有効性を検討するために、CD34+細胞に対して、改変shRNAmiR 3または8を含むLCR-shRNAmiRベクターによる形質導入を行った(図23F)。本発明者らはまず、ヒトmPB CD34+細胞のインビトロ赤血球系分化における、いくつかのLCR-shRNAmiRベクター(LCR-shRNA*、LCRshRNAmiR3および8)の発現プロフィールを確かめた。LCR-ベクター、およびshRNAmiR-カセットを含まずSFFVで駆動される対照ベクター(SFFV-GFP)(33)によるVenus発現を、CD71およびGpA染色によって定義されるような、赤血球系成熟の種々の段階で評価した(図23I)。図23Gに示されたマウス細胞における所見と一致して、CD71-/GpA-未熟赤血球系細胞では低レベルの発現が観察された。CD71+単一陽性細胞では発現の強いアップレギュレーションがみられ、より成熟したCD71+/GpA+二重陽性細胞では最も高レベルの導入遺伝子発現がみられた。予想された通り、SFFV-GFP対照はすべての部分集団において高レベルの構成的発現を生じさせた。以前に記載された分化プロトコールに従って、BCL11Aタンパク質レベルを培養第11日に測定して、非標的指向性ベクターおよびモック対照ベクター(LCR-shRNAmiRNTおよびSFFV-GFP)と比較した。改変shRNAmiRを発現する細胞では、非標的指向性(NT)および対照ベクター(SEW)を発現する細胞と比較して、BCL11Aの有意な減少が観察された(図24A)。shRNAmiR3および8を発現するベクターによる形質導入を受けたCD34+細胞に由来する細胞内のβ様グロビン全体のうち、γグロビンmRNAはそれぞれ40%および70%を占めた(図24B)。LCR-shRNAmiRまたは対照ベクターによる形質導入を受けた細胞間で、細胞増殖については差が観察されなかった。CD71、GpAの表面発現、および核除去によって評価した赤血球系分化は、対照と識別不能であり(図24C)、このことはBCL11A shRNAmiRの系列特異的発現によるBCL11Aノックダウンに悪影響がないことを示唆する。γ-グロビンmRNAのレベル(qRT-PCR)とHPLCによって評価したHbFのレベルとの間には強い相関が観察された(図24D)。HbFは、LCR-shRNAmiR3およびLCR-shRNAmiR8による形質導入を受けた細胞において総ヘモグロビンの35%および55%の寄与であり、これはSFFV-プロモーターにより媒介される発現と同等なレベルである(図22Dおよび図24E)。さらに、LCR-shRNAmiRにより媒介されるノックダウンによってhCD34+細胞の効率的な生着およびγ-グロビンの誘導が可能になるという原理証明を示すために、LCR-shRNAmiR3またはNTベクターによる形質導入を行った骨髄由来CD34+ HSPCの移植を、致死量以下の放射線照射を行ったNSGマウスに行った。この異種移植モデルではヒト赤血球系細胞の発生が不良であることから、移植14週後に移植動物の骨髄からCD34+ HSPCを単離し、インビトロで赤血球系分化に供した。Venus+細胞をFACSによって濃縮し、RT-PCRによってγ-およびβ-グロビンの発現を判定した(図24F)。以前のデータと一致して、β-グロビン遺伝子座の産生量全体のうちγ-グロビンの画分は、LCR-shRNAmiR3による形質導入を受けた細胞では44.9%±5.5%であり、これに対して、非形質導入細胞またはLCR-shRNAmiRNT形質導入細胞からなる2つの対照群ではほぼ9%±0.5%であった。
健常ドナーのヒトCD34+細胞におけるBCL11A shRNAmiRの形質導入の有効性試験
転写リプレッサーBCL11Aはβ-異常ヘモグロビン症の治療標的となる。pol IIプロモーターにより発現されるマイクロRNA適合shRNA(shRNAmiR)を介した赤血球系細胞におけるBCL11Aの選択的抑制は、マウス細胞およびヒト細胞の両方においてBCL11Aの有効なノックダウンをもたらした。改変shRNAmiRを赤血球系特異的な様式で発現させることにより、マウスHSCの生着およびB細胞の発生に対する有害作用が回避され(実施例10、前記を参照)、初代ヒトCD34由来赤血球系細胞、ならびにマウス異種移植における改変CD34+細胞の完全生着後にインビトロで分化させたヒト赤血球系細胞における、効率的なBCL11Aノックダウンおよび高レベルのHbFをもたらした。本発明者らはまた、鎌状赤血球症を有するドナーから入手した形質導入CD34細胞に由来する赤血球系細胞におけるHbFの有効な誘導も実証した。
赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンの定量
BCL11A発現のインビボでのノックダウンの有効性を含めて、形質導入CD34+細胞のNSG免疫不全マウスにおける生着を調査した。ヒトCD34に対してLCR-NTまたはBMS11-D8G5による形質導入を行い、致死量以下の放射線照射を行ったNSG-レシピエントマウスに注入した。骨髄CD34+を14週後に単離し、赤血球系インビトロ分化に供した。図28は、RT-qPCRによって評価した、赤血球系細胞におけるγグロビンの誘導を示している。
鎌状細胞患者由来の形質導入CD34細胞に由来する赤血球系細胞におけるBCL11Aのノックダウンおよび胎児型ヘモグロビンの誘導
HU治療を受けたベースラインHBF値が高いSCD患者から、骨髄CD34を単離した。細胞にLCR-NTまたはLCR-D12G5による形質導入を行って、赤血球系インビトロ分化に供した。
治療プロトコールの態様
初期評価
患者に施設ガイドラインに従って自己由来骨髄移植のための標準的な精密検査を行い、続いてバックアップ用骨髄として用いるため(最小限2×106個のCD34+細胞/kg)、および遺伝子移入のための自己由来骨髄の採取のために(目標は5×106個のCD34+細胞/kg、最小限は4×106個のCD34+細胞/kg)、2回の骨髄採取を最短で4週間を隔てて行う。
治療に先立ち、患者からサルベージ手順(「バックアップ移植片」)として役立てる造血細胞を収集するが、その際、遺伝的に操作された細胞の注入後6週間は造血回復が観察されないこと、または操作された細胞が放出基準を満たさないこととする。骨髄(最大20cc/kg)の採取は、遺伝子治療の少なくとも4週間前に、全身麻酔下にある患者の両側の後腸骨稜から複数回の穿刺によって行う。2×106個のCD34+細胞/kgを含む骨髄の部分を、バックアップ移植片を構成するために自己由来骨髄収集のための標準的な臨床手順に従って、液体窒素蒸気(162℃および-180℃)中で、操作しないまま凍結させた。採取物の残りは、CD34+細胞用に選択し(下記)、かつ遺伝子改変用に利用する(下記)。
第1の骨髄採取物のうち、必要なバックアップ骨髄から余った残りを、遺伝子移入のための第2の骨髄採取物とともに利用する。第2の採取は、初回採取(上記)から4週後以降に行う。第2の採取のためには、骨髄を再び全身麻酔下にある患者の両側の後腸骨稜から複数回の穿刺によって採取する。収集する骨髄の量は最大で20ml/kg体重とする。これにより、有核細胞の総数はほぼ4×108個/kgを上回ることになる。これはひいては、CD34+細胞選択後に4×106個/kgを上回る用量のCD34+細胞が得られることになるはずである。
CD34+細胞の精製
前処置用薬剤の排出のために十分な時間がとられ、予備刺激および培養の時間が最小限となるように、骨髄全体を一晩保存する。作製段階はすべて、DFCIのConnell & O'Reilly Families Cell Manipulation Core Facilityで行う。骨髄は、密度勾配遠心によって赤血球が除去されたものとする。CliniMACS試薬および装置を用いて、骨髄単核細胞からCD34+細胞を陽性選択する。純度および無菌性を評価するために、品質管理(QC)用試料を採取する。精製された細胞は、予備刺激および形質導入のために直ちに処理する。
形質導入は、一方または両方の採取時に実施する。第1の採取物からのバックアップ骨髄目標物から余った細胞に形質導入を行い、以後に用いるために凍結する。第2の採取物は全体を遺伝子移入に用い、第2の採取物の形質導入産物を、前処置後の第1の採取物からの融解させた形質導入細胞とともに注入する。
2回目の形質導入後に、細胞を採取し、プラズマライト(plasmalyte)中で洗浄して、それらの最終的な製剤中に容量50〜100mLとして再懸濁させる(PLASMALYTE、1% HSA)。QC試料を取り出した後の利用可能なすべての細胞を患者に注入する。QCには、細胞数、生存性、洗浄上清の無菌性、マイコプラズマ、上清のエンドトキシン、表現型、CFU、RCL(採取されて保管された試料)、挿入分析、およびqPCRによる平均ベクターコピー数(培養細胞)が含まれる。グラム染色用の試料は患者への送達直前に生成物から採取する。
手順の間および終了時に、試料を、細胞数および生存性(トリパンブルー排除または同等のもの)、無菌性、マイコプラズマ、形質導入効率(ベクターコピー数)、グラム染色、エンドトキシンおよびRCL試験のために収集する。これらのうち、細胞生存性、無菌性(過程の間、72時間)、グラム染色およびエンドトキシン測定値は注入前に得られるようにする。
対象に対して、形質導入細胞の注入前に、第-4日から第-2日まで、ブスルファン(ほぼ4mg/kg静脈内を毎日、体重補正を行い、1日1回、3時間かけて)の投与による骨髄破壊的前処置を行う。前処置は、骨髄細胞の精製および形質導入と同時並行的に行う。3日間の投与日すべてで採血によりブスルファンレベルを評価し、第1日および第2日のレベルを用いて、目標とする曲線下面積に調整する。
Boston Children's Hospital Hematopoietic Stem Cell Transplantation Unitの標準的ガイドラインに従って、標準的な予備水分補給および予備投薬の後に、細胞を30〜45分間かけて静脈内に注入する。この基準では、注入中すべておよびその後30分間にわたって、患者の心臓、呼吸および酸素飽和度を連続的にモニターすることを求めている。バイタルサインの測定および記録は、輸注の前、輸注を開始する15分間、注入期間中は1時間毎、および輸注終了時に行う。輸注の最初の5分間は、登録看護婦(RN)が付き添うこととする。2種の形質導入産物を投与する場合には、第2の形質導入産物は第1のものの後に間を置かずに投与する。
Claims (80)
- a)第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント;および
b)5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメント
を含む合成BCL11AマイクロRNAであって、
該ループセグメントが第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、かつ
第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように第2のBCL11Aセグメントが第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、該ループセグメントがそのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成している、
前記合成BCL11AマイクロRNA。 - 第1および第2のBCL11Aセグメントが約18〜25ヌクレオチド長である、請求項1記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが、BCL11A mRNA配列に由来する配列を含む、請求項1または2記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが第2のBCL11Aセグメントに対して相補的である、請求項1〜3のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが5'末端にて-GCGC-で始まり、第2のBCL11Aセグメントが3'末端にて-GCGC-で終わる、請求項1〜4のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが、
;本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来)、
;本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来)、
;本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来)、
;本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来)、
;本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来)、
;本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来)、
;本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来)、
;本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来)、
;本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)、および
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)からなる群より選択される、
請求項1〜5のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。 - ループセグメントがマイクロRNAに由来する、請求項1〜6のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 前記マイクロRNAが造血特異的マイクロRNAである、請求項7記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 前記マイクロRNAがmiR223である、請求項8記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- ループセグメントがctccatgtggtagagである、請求項9記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- SEQ ID NO:1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 対象において請求項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAをインビボで発現させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
- インビボ発現が、対象における胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において起こる、請求項12記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを、対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって発現がエクスビボである段階、および該細胞を対象に移植する段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
- 細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる方法であって、細胞において請求項1〜11のいずれか一項記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを発現させる段階を含み、該細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、前記方法。
- 少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAが、真核細胞における発現のためにプロモーターと機能的に連結されてベクター中に構築されている、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIポリメラーゼから発現される、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAがRNAIIIポリメラーゼからは発現されない、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法。
- プロモーターが、脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- ベクターがウイルスである、請求項16〜19のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスがレンチウイルスである、請求項20記載の方法。
- レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)、ヒト免疫不全ウイルス2型(HIV-2)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
- SEQ ID NO:1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:2のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:5のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:13のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:14のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:15のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
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- SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列を含む、請求項23記載の単離された核酸分子。
- 請求項23記載の単離された核酸分子を含むベクター。
- 脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターをさらに含む、請求項59記載のベクター。
- 請求項59または60記載のベクターを含む宿主細胞。
- 胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、請求項61記載の細胞。
- 赤血球である、請求項61記載の細胞。
- 請求項23記載の単離された核酸分子を含む細菌。
- 請求項23記載の単離された核酸分子を含むウイルス。
- レンチウイルスである、請求項65記載のウイルス。
- レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)、ヒト免疫不全ウイルス2型(HIV-2)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)からなる群より選択される、請求項66記載のウイルス。
- 請求項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項59もしくは60記載のベクター、請求項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
- 請求項59もしくは60記載のベクター、請求項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項65〜67のいずれか一項記載のウイルスを含む組成物。
- 薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項68または69記載の組成物。
- 対象における異常ヘモグロビン症の治療にまたはそれを発症するリスクを減少させるために用いるための、請求項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
- 対象における異常ヘモグロビン症の治療におけるまたはそれを発症するリスクを減少させるための医薬の製造に用いるための、請求項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
- 細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるのに用いるための、請求項68〜70のいずれか一項記載の組成物。
- 細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、請求項73記載の組成物。
- 請求項1〜58のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項59もしくは60記載のベクター、請求項61〜63のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項65〜67のいずれか一項記載のウイルスの治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
- 請求項68〜74のいずれか一項記載の組成物の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、それによって対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
- 対象において細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させる段階を含む、対象における異常ヘモグロビン症を治療するかまたはそれを発症するリスクを減少させる方法。
- 異常ヘモグロビン症を有するかまたは異常ヘモグロビン症を発症するリスクがある対象を選択する段階をさらに含む、請求項75〜77のいずれか一項記載の方法。
- 異常ヘモグロビン症が鎌状赤血球症またはサラセミアである、請求項78記載の方法。
- 酸素、ヒドロキシ尿素、葉酸または輸血を含む治療法を対象に施す段階をさらに含む、請求項75〜80のいずれか一項記載の方法。
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