JP2017513505A5 - - Google Patents
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Description
1つの局面において、本明細書は、本明細書に記載の少なくとも1種類の合成BCL11AマイクロRNAを対象の胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞において発現させる段階であって、発現がエクスビボまたはインビトロまたはインビボである段階を含む、細胞によって発現されるBCL11Aレベルを低下させるための方法を提供する。1つの態様において、発現は、胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞を、本明細書に記載の組成物の有効量、または少なくとも、本明細書に記載の単離された核酸分子の有効量と接触させ、それによって胎児型ヘモグロビンの発現が、細胞またはその子孫において、そのような接触の前の細胞に比して増加する段階を含む。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:1〜10、13〜18、25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む少なくとも1種類の核酸分子または本明細書に記載の合成BCL11AマイクロRNAを含む、少なくとも1種類のベクターまたは細胞を含む。
siRNAには、低分子ヘアピン(ステムループとも呼ばれる)RNA(shRNA)も含まれる。1つの態様において、これらのshRNAは、短い(例えば、約19〜約25個のヌクレオチドの)アンチセンス鎖と、これに続く約5〜約9個のヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。または、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行してもよく、アンチセンス鎖が後に続いてもよい。これらのshRNAをプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含めて、例えば、pol III U6プロモーターまたは別のプロモーターから発現させることができる(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるStewart, et al. (2003) RNA April;9(4):493-501を参照)。RNA干渉物質の標的遺伝子または配列は、細胞遺伝子またはゲノム配列、例えばBCL11A配列とすることができる。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはその断片と実質的に相同でありうる。これに関連して用いられる「相同」という用語は、標的のRNA干渉を生じさせるために、標的mRNAまたはその断片と、実質的に同一であること、十分に相補的であること、または類似していることとして定義される。標的配列の発現を阻害するかまたは発現に干渉するのに適したRNAには、ネイティブなRNA分子のほかに、RNA誘導体および類似体も含まれる。好ましくは、siRNAはその標的と同一である。siRNAはただ1つの配列を標的とすることが好ましい。siRNAなどのRNA干渉物質のそれぞれは、例えば、発現プロファイリングによって、可能性のあるオフターゲット効果についてスクリーニングすることができる。そのような方法は当業者に公知であり、例えば、Jackson et al. Nature Biotechnology 6:635-637, 2003に記載されている。発現プロファイリングに加えて、オフターゲット効果を有する可能性のある配列を同定するために、可能性のある標的配列を配列データベース中の類似配列についてスクリーニングすることもできる。例えば、配列同一性を有する15個の連続するヌクレオチド、またはおそらくは11個程度の短さの連続するヌクレオチドでも、標的としない転写産物のサイレンシングを導くのに十分である。このため、、可能性のあるオフターゲットサイレンシングを避けるために、BLASTなどの任意の公知の配列比較法による配列同一性分析を用いて、提案されたsiRNAを最初にスクリーニングすることができる。siRNA配列は、siRNAのアンチセンス(ガイド)鎖のRISCへの取り込みを最大にし、それによって分解のためにヒトGGT mRNAを標的とするRISCの能力を最大にするように選択される。これは、アンチセンス鎖の5'末端で最小の結合自由エネルギーを有する配列についてスキャニングを行うことによって達成することができる。より低い自由エネルギーはsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖の5'末端の巻き戻しの強化を招き、それにより、アンチセンス鎖がRISCに取り込まれてヒトBCL11A mRNAの配列特異的切断を導くことを確実にする。siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はなく、例えば、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに範囲に含み、また、リボース糖分子が別の糖分子にまたは同様の機能を果たす分子に置換されている分子も含む。さらに、ヌクレオチド残基間の非天然の結合、例えば、ホスホロチオエート結合を用いることもできる。RNA鎖は、フルオロフォアなどのレポーター基の反応性官能基によって誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の一端または両端において、典型的にはセンス鎖の3'末端において修飾されている。例えば、3'末端の2'-ヒドロキシルは種々の基で容易にかつ選択的に誘導体化することができる。他の有用なRNA誘導体は、2'O-アルキル化残基または2'-O-メチルリボシル誘導体および2'-O-フルオロリボシル誘導体といった修飾された糖質部分を有するヌクレオチドを組み入れている。RNA塩基を修飾することもできる。標的配列の発現を阻害するかまたは発現に干渉するために有用な任意の修飾塩基を用いることができる。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルなどのハロゲン化塩基を組み入れることができる。また、塩基をアルキル化することもでき、例えば、7-メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み入れることができる。好首尾な阻害を生じさせる非天然塩基を組み入れることもできる。最も好ましいsiRNA修飾には、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンまたはロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、およびホスホジエステルまたはさまざまな数のホスホロチオエート結合のいずれかを含むRNA二重鎖が含まれる。そのような修飾は当業者に公知であり、例えば、Braasch et al., Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003に記載されている。siRNA分子にとって有用な修飾のほとんどは、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術のために確立された化学反応を用いて導入することができる。好ましくは、修飾は2'-O-メチル修飾を最小限にしか含まず、好ましくはそのような修飾は除外される。修飾からは、好ましくはsiRNAの遊離5'-ヒドロキシル基の修飾も除外される。本明細書における実施例では、BCL11A mRNAを有効に標的とするshRNA分子といった、RNA干渉物質の具体的な例を提示している。
実施例6
末梢血SCD患者由来のCD34+循環HSCを、廃棄されたアフェレーシス材料から分画した(およそ200ml、106個のCD34+細胞)。細胞に対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1=標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行い、一部変更したGiarratana et al.(Nat Biotech 2005)のように分化させた。細胞を赤血球系表面マーカー(GPA、CD71)の成熟獲得に関してフローサイトメトリーによって分析した。赤血球系細胞は赤芽球および赤血球形態を逐次的に獲得し、Venus蛍光を発現するようになる。細胞を終末分化段階で収集してRNAを抽出し、miR-1 SFFV-IVによるγ-グロビンmRNA誘導をスクランブル(NT)対照と比較して評価するためのqPCR分析を行った(図5)。
末梢血SCD患者由来のCD34+循環HSCを、廃棄されたアフェレーシス材料から分画した(およそ200ml、106個のCD34+細胞)。細胞に対して、フィブロネクチン上でSFFV-LV(NT=スクランブルshRNA、miR-1=標的指向性shRNA)によりMOI=2で形質導入を行い、一部変更したGiarratana et al.(Nat Biotech 2005)のように分化させた。細胞を赤血球系表面マーカー(GPA、CD71)の成熟獲得に関してフローサイトメトリーによって分析した。赤血球系細胞は赤芽球および赤血球形態を逐次的に獲得し、Venus蛍光を発現するようになる。細胞を終末分化段階で収集してRNAを抽出し、miR-1 SFFV-IVによるγ-グロビンmRNA誘導をスクランブル(NT)対照と比較して評価するためのqPCR分析を行った(図5)。
ウイルス産生および用量設定
レンチウイルスベクター上清は、10μgのレンチウイルス移入ベクター、10μgのgag-pol、5μgのrev、および2μgのVSVGパッケージングプラスミドを、10cm培養皿の中のHEK293T細胞にリン酸カルシウム試薬(INVITROGEN(商標))を用いてコトランスフェクトすることによって作製した。上清をトランスフェクションから24時間後および48時間後に収集し、0.4ミクロン膜(CORNING(登録商標), NY, USA)に通して濾過し、その後にSW-28スイングバケットを用いてBeckmann XL-90遠心分離機で23000rpm、2時間の超遠心を行うことによって濃縮した。力価を決定するには、NIH3T3細胞をポリブレン(8μg/ml)の存在下でウイルスに感染させて、形質導入から48時間後に、Venus発現に関するFACSによって(pol II構築物)、またはピューロマイシン選択(1mg/ml、pol III構築物)によって分析した。
レンチウイルスベクター上清は、10μgのレンチウイルス移入ベクター、10μgのgag-pol、5μgのrev、および2μgのVSVGパッケージングプラスミドを、10cm培養皿の中のHEK293T細胞にリン酸カルシウム試薬(INVITROGEN(商標))を用いてコトランスフェクトすることによって作製した。上清をトランスフェクションから24時間後および48時間後に収集し、0.4ミクロン膜(CORNING(登録商標), NY, USA)に通して濾過し、その後にSW-28スイングバケットを用いてBeckmann XL-90遠心分離機で23000rpm、2時間の超遠心を行うことによって濃縮した。力価を決定するには、NIH3T3細胞をポリブレン(8μg/ml)の存在下でウイルスに感染させて、形質導入から48時間後に、Venus発現に関するFACSによって(pol II構築物)、またはピューロマイシン選択(1mg/ml、pol III構築物)によって分析した。
造血再構成に対する悪影響についてさらに調べるために、定量的競合的再増殖実験を行った(図23C〜23F)。CD45.1(BoyJ)およびCD45.2(Bl/6)ドナー動物由来の系列陰性細胞に対して、遍在性に発現されるSFFV-プロモーター(SFFV-BFP)の制御下で、BCL11Aに対するSFFV-shRNAmiR、shRNAmiRNT、または青色蛍光性タンパク質(BFP)レポーターのみを発現するさまざまなベクターによる形質導入を行った。ドナー集団およびレシピエント細胞の両方の同定が可能になるように、細胞をコンジェニックCD45.1/CD45.2動物に移植した。SFFV-BFPベクターを使用する実験では、CD45.1ドナー細胞をCD45.2動物に移植し、形質導入を行ったドナー細胞集団を蛍光に基づいて同定して比較した。移植の前に、競合性ベクターによる形質導入を行った2つの集団からの同数の細胞を混合した。移植された集団において両方のベクターを用いて得られた遺伝子改変細胞の最終的な比をフローサイトメトリーによって分析したところ、55〜70%の範囲にある同等な形質導入率が確かめられた(図23C)。移植の4、8および12週後に、移植された動物における遺伝子改変細胞の寄与を末梢血、骨髄および脾臓で評価し(図23D)、注入した形質導入細胞の比のわずかな違いもこの分析では考慮に入れた。すべての事例および各時点で、BCL11Aを標的とするベクターによる形質導入を受けた細胞は、NTまたはSFFV-BFPベクターによる形質導入を受けた細胞よりも競合性が劣っており、このことはBCL11Aノックダウンの選択的不利を指し示している。2種のBCL11A標的指向性ベクターが互いに競合する場合には、初期に移植された集団の比と比較して、造血細胞の再構成の有意差は観察されなかった。図23Bにおける所見と一致して、shRNAmiRNTの過剰発現は造血再構成にも悪影響を及ぼし、この群はSFFV-BFPのみを発現してshRNAを発現しないベクターによる形質導入を受けた細胞よりも競合性が劣っていた。本発明者らは、骨髄細胞の形質導入画分におけるBリンパ球およびより原始的なHSC区画に対してより詳細な分析を行った(図23E)。BCL11A-/-マウスにB細胞が存在しないことを示した以前の研究から予期されたように(30,31)、B220陽性B細胞の数はBCL11Aノックダウンによって有意に減少した。有意には達しなかったものの、生着するHSC区画を含む、より原始的なlin-、Sca-1+、c-kit+(LSK)細胞が減少する傾向がみられた。
BCL11Aノックダウンを鎌状細胞患者の細胞において調査した。骨髄CD34を鎌状細胞患者から単離し、細胞に対してLCR-NTまたはLCR-D12G5-2による形質導入を行い(非形質導入細胞を別の対照として用いた)、インビトロでの赤血球系分化に供した。図29Aは、BCL11Aアイソフォーム(LおよびXL)およびローディング対照としてのβ-アクチンを示しているウエスタンブロットであり、BCL11A XLの有効なノックダウンを実証している。各パネル(レーンの下方のラベル表示1〜6)は、単一ドナー由来の細胞を用いた独立した実験を表している。図29Bは、赤血球系細胞におけるBCL11Aノックダウンの定量を示している。データは、図29Aに示されたウエスタンブロットに由来する。図29Cは、HPLCによる、結果として起こるHbFの誘導を示している。この患者はヒドロキシ尿素治療を受けており、それがベースラインHb Fレベルの高さの一因であった。
Claims (63)
- a)第1のBCL11Aセグメント、ループセグメント;および
b)5'から3'への方向に直列に並んだ第2のBCL11Aセグメント
を含む、合成BCL11AマイクロRNAであって、
該ループセグメントが、第1および第2のBCL11Aセグメントの間にあってそれらと直接連結されており、かつ
第1および第2のBCL11Aセグメントが塩基対合してヘアピンループを形成するように、第2のBCL11Aセグメントが、第1のBCL11Aセグメントに対して相補的であり、該ループセグメントが、そのようにして形成されたヘアピンループのループ部分を形成している、
前記合成BCL11AマイクロRNA。 - 第1および第2のBCL11Aセグメントが約18〜25ヌクレオチド長である、請求項1記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが、BCL11A mRNA配列に由来する配列を含む、請求項1または2記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが第2のBCL11Aセグメントに対して相補的である、請求項1〜3のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが5'末端にて-GCGC-で始まり、第2のBCL11Aセグメントが3'末端にて-GCGC-で終わる、請求項1〜4のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 第1のBCL11Aセグメントが、
;本明細書に記載のBCL11A miR1オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A miR2オリゴに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A E3オリゴまたはshRNA1またはE3に由来)、
;本明細書に記載のshRNA2またはB5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA4またはB11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8オリゴまたはshRNA3またはD8に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50D12もしくはD12に由来)、
;本明細書に記載のshRNA5または50A5に由来)、
;本明細書に記載のshRNA7または50B11に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A XLC4、shRNA8および50C4に由来)、
;本明細書に記載のBCL11A非標的指向性オリゴに由来)、
;本明細書に記載のmiR1G5オリゴに由来)、
;本明細書に記載のE3G5またはE3 modオリゴまたはshRNA1modに由来)、
;本明細書に記載のB5G5またはshRNA2modに由来)、
;本明細書に記載のB11G5またはshRNA4modに由来)、
;本明細書に記載の50D12G5、D12G4またはshRNA5modに由来)、
;本明細書に記載の50A5G5またはshRNA6modに由来)、
;本明細書に記載の50B11G5またはshRNA7modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D8G5またはD8 modまたはshRNA3modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A C4G5またはC4 modまたはshRNA8modに由来)、
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)、および
;本明細書に記載のBCL11A D12G5-2に由来)
からなる群より選択される、
請求項1〜5のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。 - ループセグメントがマイクロRNAに由来する、請求項1〜6のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 前記マイクロRNAが造血特異的マイクロRNAである、請求項7記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- 前記マイクロRNAがmiR223である、請求項8記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- ループセグメントがctccatgtggtagagである、請求項9記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- SEQ ID NO:1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA。
- SEQ ID NO:1〜10、13〜18および25〜44からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:1のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:2のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:5のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:7のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:8のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:9のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:10のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:13のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:14のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:15のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:16のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:17のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:18のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:25のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:26のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:27のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:28のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:29のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:30のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:31のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:33のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:34のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:35のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:36のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:37のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:38のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:39のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:40のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:41のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:42のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:43のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:44のヌクレオチド配列を含む、請求項12記載の単離された核酸分子。
- 請求項12記載の単離された核酸分子を含むベクター。
- 脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、またはβ-グロビン遺伝子座制御領域およびβ-グロビンプロモーターをさらに含む、請求項48記載のベクター。
- 請求項48または49記載のベクターを含む宿主細胞。
- 胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、請求項50記載の細胞。
- 赤血球である、請求項50記載の細胞。
- 請求項12記載の単離された核酸分子を含む細菌。
- 請求項12記載の単離された核酸分子を含むウイルス。
- レンチウイルスである、請求項54記載のウイルス。
- レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)、ヒト免疫不全ウイルス2型(HIV-2)、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)からなる群より選択される、請求項55記載のウイルス。
- 請求項1〜11のいずれか一項記載の合成BCL11AマイクロRNA、請求項12〜47のいずれか一項記載の単離された核酸分子、請求項48もしくは49記載のベクター、請求項50〜52のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項54〜56のいずれか一項記載のウイルスを含む、組成物。
- 請求項48もしくは49記載のベクター、請求項50〜52のいずれか一項記載の宿主細胞、または請求項54〜56のいずれか一項記載のウイルスを含む、組成物。
- 薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む、請求項57または58記載の組成物。
- 対象における異常ヘモグロビン症の治療にまたはそれを発症するリスクを減少させるために用いるための、請求項57〜59のいずれか一項記載の組成物。
- 対象における異常ヘモグロビン症の治療におけるまたはそれを発症するリスクを減少させるための医薬の製造に用いるための、請求項57〜59のいずれか一項記載の組成物。
- 細胞によって発現される胎児型ヘモグロビンレベルを上昇させるのに用いるための、請求項57〜59のいずれか一項記載の組成物。
- 細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、始原細胞、骨髄細胞、造血幹細胞または造血始原細胞である、請求項62記載の組成物。
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