JP5595922B2 - 高麗人参来由のメラニン合成阻害物質を含有する皮膚美白用化粧料組成物 - Google Patents

Description

本発明は、酸、塩基、又は酵素やこの酵素を生産する微生物を利用して、人参抽出物から得られたジンセノサイドＦ１、及びこれを含有する化粧料組成物の美白用途に関する。

ヒトの皮膚色を決定するにあたって、多様な要因が関与するが、それらのうちメラニン色素を作るメラノサイトの活動性、血管の分布、皮膚の厚さ、及びカロチノイドやビリルビン等のヒト内外の色素含有有無等の要因が重要である。特に最も重要な要因は、ヒト内のメラノサイトでチロシナーゼ等の様々な酵素が作用して生成されるメラニンという黒色色素である。このメラニン色素の形成には、遺伝的要因、ホルモン分泌、ストレス等と関連された生理的要因及び紫外線の照射等のような環境的要因等が影響を及ぼす。

ヒト皮膚のメラニン細胞で生成されるメラニン色素は、黒い色素とタンパク質の複合体形態を有するフェノール系高分子物質であって、太陽から照射される紫外線を遮断して、真皮以下の皮膚器官を保護すると同時に、皮膚生体内で発生した自由ラジカル等を制御するなど、皮膚内タンパク質と遺伝子を保護する有用な役目を担当する。このように皮膚内・外部のストレス刺激によって生じたメラニンは、ストレスが消えても、皮膚の角質化を通じて外部に排出される前までは消えない安定した物質である。しかしながら、メラニンが必要以上に多く生成されれば、染み、そばかす及び斑点等のような過色素沈着症を誘発し、美容上、良くない結果をもたらすようになり、また、レジャー人口の増加に伴い、外部活動を好む人が多くなり、紫外線によるメラニン色素沈着を防止しようとする要求が増加している。このような要求に応じて、従来、アスコルビン酸、コウジ酸、アルブチン、ヒドロキノン、グルタチオン又はこれらの誘導体、又はチロシナーゼ阻害活性を有する物質を化粧料や医薬品に配合して使用してきたが、これらの不十分な美白効果、皮膚に対する安全性問題、化粧料への配合時に現われる剤形及び安定性の問題等に起因してその使用が制限されている。

これより、本発明者らは、天然来由の有効物質のうち、皮膚に安全で且つ美白効果に優れていて、製品としての安定性に優れた美白化粧料を製造するために鋭意研究したところ、植物類、特に人参から得た抽出物を酸、アルカリ、又は酵素との反応を通じて得たジンセノサイドＦ１のメラニン生合成量の減少効果に非常に優れていることを知見し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、植物の抽出物から酸、アルカリ、又は酵素との反応を通じて得られたジンセノサイドＦ１のメラニン生合成抑制効果を調査し、美白効果に優れた化粧料及び治療用組成物を提供することにある。

本発明は、下記化学式１で表されるジンセノサイドＦ１を有効成分として含有する皮膚美白用化粧料組成物を提供する。

以下、本発明を詳しく説明する。
上記ジンセノサイドＦ１は、植物抽出物から得る。特に、本発明の化粧料組成物に含有されるジンセノサイドＦ１は、人参、紅参、白参、水参、尾参、人参の葉、又は人参の実から得られる。

本発明で用いられる抽出物は、次のようにして製造される。植物の重量に対して約１乃至６倍、好ましくは約３倍の有機溶媒を植物に入れ、常温で１乃至５回撹拌しながら抽出し、脱脂させる。脱脂された植物には、その重量に対して約１乃至８倍、好ましくは約４倍の水又は有機溶媒を植物に入れ、１乃至５回還流抽出する。得られた抽出物は、１０乃至２０℃で１乃至３日間熟成させ、次いで濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液とに分離される。分離した濾液を減圧濃縮し、得られた濃縮物を水に懸濁させた後、エタノール等を利用して色素を除去する。その後、有機溶媒を使用して水層を１乃至５回抽出した後、得られた有機溶媒層を減圧濃縮して有機溶媒抽出物を得る。この有機溶媒抽出物を少量のメタノール等に溶解した後、大量のエチルアセテート等を添加し、生成された沈殿物を乾燥させて、本発明の抽出物を得る。上記で使用される有機溶媒としては、好ましくは、無水メタノール、含水メタノール、無水エタノール、及び含水エタノールよりなる群から選択された１種の純粋溶媒であるか、又は、上記メタノールの１種と上記エタノールの１種との混合溶媒である。

上記抽出物を酸、塩基、酵素又は上記酵素を生産する微生物を利用して加水分解し、ジンセノサイドＦ１を製造する。

酸を利用する場合、酸としては、塩酸、硫酸及び硝酸よりなる群から選択された１種以上の酸を使用するか、又は上記酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１種以上のアルコールとの混合溶媒を使用することができる。酸とアルコールの混合溶媒において使用されるアルコールは、50%-エタノールであることが好ましい。上記抽出物に０．１〜２N濃度、好ましくは１N濃度の酸、又は酸とアルコールの混合溶媒を加えた後、５０〜１００℃、好ましくは８０℃水浴で０．５〜２時間加熱還流させて加水分解させる。

塩基を利用する場合、塩基としては、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選択された１種以上の塩基を使用するか、又は上記塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１種以上のアルコールとの混合溶媒を使用することができる。塩基とアルコールの混合溶媒において使用されるアルコールは、50%-ブタノールであることが好ましい。上記抽出物に０．１〜２N濃度、好ましくは１N濃度の塩基、又は塩基とアルコールの混合溶媒を加えた後、５０〜１００℃、好ましくは１００℃水浴で１〜１２時間加熱還流させて加水分解させる。

酵素を利用する場合、酵素としては、β-グルコシダーゼ（β-glucosidase）、α,β-アラビノシダーゼ（α,β-arabinosidase）、α,β-ラムノシダーゼ（α,β-rhamnosidase）、β-グルクロニダーゼ（β-glucuronidase）、β-ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）及びアミログルコシダーゼ（amyloglucosidase）よりなる群から選択された１種以上を使用することができる。上記抽出物を５〜２０倍、好ましくは約１０倍の酸性緩衝溶液に溶解させた後、上記酵素を添加して約３７℃水浴で約１〜６０時間撹拌しながら、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失されれば、熱水（80〜100℃）中で５〜１５分間加熱して加水分解反応を終了させ、反応液を収得することができる。

微生物を利用する場合、微生物としては、上記酵素を生産する微生物を使用することができ、さらに詳しくは、アスペルギルス（aspergillus）属、バチルス（bacillus）属、ペニシリウム（penicillium）属、リゾパス（rhizopus）属、リゾムコール（rhizomucor）属、タラロミセス（talaromyces）属、ビフィドバクテリウム（bifidobacterium）属、モルチエレラ（mortierella）属、クリプトコッカス（cryptococcus）、ミクロバクテリウム（microbacterium）属等を使用することができる。上記抽出物を５〜１０倍、好ましくは約１０倍のイオン水に溶解させた後、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却する。予め培養された微生物を抽出溶液の重量対比で５〜１０重量%接種し、３０℃で２乃至５日間培養させた後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失されれば反応を終了させ、５，０００乃至１０，０００rpmで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後、遠心分離して沈殿物を得る。

上記のように、酸、塩基又は酵素やこの酵素を生産する微生物を利用して加水分解した後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にメタノール、エタノール、ブタノール等から選ばれた１種のアルコールを加えて１〜５回撹拌させた後、沈殿された塩を濾過して除去し、濾過された濾液を減圧濃縮して、ジンセノサイドＦ１を収得することができる。

本発明の美白化粧料組成物は、上記ジンセノサイドＦ１を組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量%含有する。含量が０．０００１重量%未満の場合、上記成分による美白効果等を得ることができず、含量が１０重量%超過する場合、含量増加に比べて効果の増加が大きくないからである。

本発明の美白化粧料組成物は、ＵＶや炎症によって誘導された皮膚のメラニン生成を抑制し、生成された色素沈着を改善させる。

本発明の美白化粧料組成物は、その剤形において特に限定されるものではないが、例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディーローション、ボディークリーム、ボディーオイル、及びボディーエッセンス等の化粧料に剤形化されることができる。

本発明によって提供される人参来由のジンセノサイドＦ１（20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサトリオール）は、メラニン生成を抑制する効能及び色素沈着を改善する効能を有している。このような効果によって、ジンセノサイドＦ１（20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサトリオール）は、メラニン生成を抑制し、ＵＶによって生成された色素沈着を改善するための化粧料組成物に有用に使用されることができる。

以下、実施例及び実験例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明がこれらの例にのみ限定されるものではない。

［参考例１］人参抽出物の製造
人参２kgに８０%メタノール水溶液４Lを入れ、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾過布濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して得た抽出物を水に懸濁した後、エタノール１Lで５回抽出して色素を除去し、水層を1-ブタノール５００mLで３回抽出した。得られた全体1-ブタノール層を減圧濃縮して1-ブタノール抽出物を得て、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加して、生成された沈殿物を乾燥することによって、人参抽出物１００gを収得した。

［実施例１］酸加水分解方法によるジンセノサイドＦ１の製造
上記参考例１で得られ人参抽出物１０gに２０倍（v/w）の1N-ＨＣｌ-50%メタノール溶液（v/v）を加え、８０℃水浴で８時間加熱還流させて加水分解させた。その後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（200mL）を加えて撹拌した後（３回）、沈殿した塩を濾過して除去し、濾過して得られた濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8:1〜4:1）で分離し、１．２５gのジンセノサイドＦ１を得た。

［実施例２］塩基加水分解方法によるジンセノサイドＦ１の製造
上記参考例１で得られた人参抽出物１０gを乾燥ピリジン（500mL）に溶解し、これにナトリウムメトキシド（粉末、10g）を加えて水浴で８時間加熱還流させて加水分解させた。その後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（200mL）を加えて撹拌した後（３回）、沈殿した塩を濾過して除去した。濾過して得られた濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8:1〜4:1）で分離し、０．８５gのジンセノサイドＦ１を得た。

［実施例３］酵素加水分解方法によるジンセノサイドＦ１の製造
上記参考例１で得られた人参抽出物１０gを１００mLの０．１Ｍ酢酸緩衝溶液（pH4.5）中に溶解し、これに酵素（ヘスペリジナーゼ0.5g、ナリンギナーゼ0.5g、セルラーゼ0.5g、β-グルクロニダーゼ0.2g、β-ガラクトシダーゼ0.5g、アミログルコシダーゼ0.3g；Sigma社製）２．５gを添加して３７℃水浴で４８時間撹拌し、熱水（80〜100℃）中で１０分間加熱して反応を終了させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣にエタノール（200mL）を加えて撹拌した後（３回）、沈殿物を濾過して除去し、濾過して得られた濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8:1〜4:1）で分離し、０．９１gのジンセノサイドＦ１を得た。

［実施例４］微生物を利用したジンセノサイドＦ１の製造
上記参考例１で得られた人参抽出物１０gを１００mLのイオン水に溶解し、１２１℃で３０分間滅菌して３０℃に冷却した後、予め培養されたアスペルギルス ニゲル（Aspergillus niger）KCCM 11885を抽出溶液の重量基準で５〜１０重量%接種して３０℃で５日間培養させた。その後、薄層クロマトグラフィーで基質の消去率を確認し、基質が完全に消失したときに反応を終了させた。培養液を５，０００乃至１０，０００rpmで遠心分離して回収した沈殿物を蒸留水で３回洗浄した後、遠心分離して沈殿物として反応液を得た。得られた沈殿物にエタノール（200mL）を加えて撹拌した後（３回）、沈殿物を濾過して除去し、濾過して得られた濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝8:1〜4:1）で分離し、０．６２gのジンセノサイドＦ１を得た。

［試験例１］ねずみの色素細胞を利用したメラニンの生成抑制効果測定
C57BL／6マウス来由のねずみの色素細胞（Mel-Ab cell）をＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's media）に10%ウシ胎仔血清、１００nMの2-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート及び１nMのコレラ毒素を添加した培地で３７℃、5%-ＣＯ₂の条件で培養した。培養したMel-Ab細胞を0.25%トリプシン-ＥＤＴＡで剥離し、２４ウェル培養プレートに１０⁵細胞／ウェルの濃度で細胞を培養した後、二日目から３日連続して１０ppmの試験物質（コウジ酸、参考例１、実施例１乃至４）を加えて培養した。ここで、本発明のジンセノサイドＦ１に対するメラニンの生成抑制効果を比較するために、対照群としてコウジ酸を使用した。

培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、１N水酸化ナトリウムで細胞を溶解し、４００nmで吸光度を測定した後、下記数式１によってメラニンの生成抑制率を計算した。その結果を下記表８に示す（Dooleyの方法）。

［数式１］
メラニン生成抑制率(%)＝１００−（各試験物質の吸光度／対照群の吸光度×100）

上記表１から明らかなように、本発明によるジンセノサイドＦ１は、従来の美白剤であるコウジ酸よりメラニンの生成抑制率に優れていることが判明した。また、人参抽出物からジンセノサイドＦ１を得る加水分解法によるメラニンの生成抑制率は、ほぼ類似していることが分かる。

［試験例２］ヒト皮膚に対する美白効果試験
元気な１２名の男性を対象にして被検者の上膊部位に直径１．５cmの穴があいた不透明テープを付着した後、各被検者の最小紅斑量（Minimal Erythema Dose）の約１．５〜２倍の紫外線（UVB）を照射し、皮膚の黒化を誘導した。

紫外線の照射後、試験物質を各々１重量%（溶媒は、1,3-ブチレングリコール：エタノール＝7:3）ずつ塗布し、対照群としてコウジ酸３重量%及び溶媒のみ塗布し、１ヶ所は何も塗布せずに、１０週間状態変化を観察した。１週間の単位で皮膚の色を色差計CR2002（日本国、ミノルタ社）で測定した。塗布開始時点と完了時点での皮膚色の差異（△Ｌ^*）を下記数式２によって計算した。

ここで、美白効果は、試料塗布部位と対照群部位の△Ｌ^*の比較として判定するが、△Ｌ^*値が２程度の場合は、沈着された色素の美白化が顕著な場合であり、約１．５以上なら美白効果があると判定することができる。結果を表２に示す。

［数式２］
ΔＬ^*＝塗布完了時点でのＬ＊値−塗布開始時点でのＬ^*値

上記表２から明らかなように、本発明によるジンセノサイドＦ１を使用する場合、△Ｌ^*値が１．６以上と美白効果に優れていて、美白効果に優れたと知られたコウジ酸に比べて美白効果に優れていることを確認することができた。

人参から抽出したジンセノサイドＦ１は、メラニン生成を抑制し、ＵＶによって生成された色素沈着を改善する効果に優れているので、これを有効成分として含有することによって、美白効果に優れた化粧料組成物を提供することができる。

Claims (10)

1. ジンセノサイドＦ１（20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサトリオール）を有効成分として含有する皮膚美白用化粧料組成物。
2. ジンセノサイドＦ１（20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサトリオール）を有効成分として含有する皮膚美白用化粧料組成物であって、上記ジンセノサイドＦ１は、組成物の全体重量に対して０．０００１〜１０重量%含有されることを特徴とする皮膚美白用化粧料組成物。
3. 上記ジンセノサイドＦ１（20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサトリオール）は、人参、紅参、白参、水参、ミサム、人参の葉、又は人参の実の抽出物から得られたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の皮膚美白用化粧料組成物。
4. 上記ジンセノサイドＦ１は、上記抽出物から酸、塩基又は酵素やこの酵素を生産する微生物を利用した反応により得られたものであることを特徴とする請求項３に記載の皮膚美白用化粧料組成物。
5. 上記酸は、塩酸、硫酸及び硝酸よりなる群から選択された１種以上の酸、又は上記酸とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１種以上のアルコールとの混合溶媒であることを特徴とする請求項４に記載の皮膚美白用化粧料組成物。
6. 上記塩基は、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムよりなる群から選択された１種以上の塩基、又は上記塩基とエタノール、メタノール及びブタノールよりなる群から選択された１種以上のアルコールとの混合溶媒であることを特徴とする請求項４に記載の皮膚美白用化粧料組成物。
7. 上記酵素は、β-グルクロニダーゼ（β-glucuronidase）、β-ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）及びアミログルコシダーゼ（amyloglucosidase）を含むことを特徴とする請求項４に記載の皮膚美白用化粧料組成物。
8. 上記微生物は、アスペルギルス（aspergillus）属であることを特徴とする請求項４に記載の皮膚美白用化粧料組成物。
9. 上記組成物は、メラニンの生成を抑制するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の皮膚美白用化粧料組成物。
10. 上記組成物は、生成された色素沈着を改善させることを特徴とする請求項１又は２に記載の皮膚美白用化粧料組成物。