상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 미백 화장료 조성물은 rhaponticin 및 rhapontigenin을 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, rhaponticin 및 rhapontigenin은 상기 화장료 조성물 총 중량에 대하여 각각 0.0001 ~ 10중량%의 양으로 함유함을 특징으로 한다. 0.0001 중량% 미만이 되면 기대하는 효과를 나타낼 수 없고, 반면에 10 중량%를 초과하더라도 더 이상의 효과 증대를 기대할 수 없기 때문이다.
본 발명에 따른 rhaponticin은 건조된 대황을 물, 물을 포함한 유기용매 또는 유기용매로 1차 추출하고, 이를 물에 유기용매가 20 ~ 500%(v/v) 함유된 혼합 용매로 2차 추출하고 정제하여 제조한다.
또한, 본 발명의 rhapontigenin은 위의 rhaponticin을 산, 알칼리 또는 효소를 이용하여 가수분해하는 방법으로 제조한다. 이때 사용되는 효소는 엑소 당결합 분해효소 및 이들을 함유하고 있는 복합효소제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용한다. 상기의 엑소 당결합 분해효소는 β-글루코시다제(β-glucosidase), α,β-아라비노시다제(α,β-arabinosidase), α,β-라모시다제(α,β-rhamosidase), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이다. 또한, 상기 복합효소제는 펙티나제(pectinase), 나린지나제(naringinase) 및 셀루라제(cellulase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
대황은, 금문대황 (Rheum palmatum Linne), 당고특대황 (Rheum tanguticum Maximowicz), 약용대황 (Rheum officinale Baillon), 국산대황 (Rheum coreanum Nakai), 또는 그것들의 종간 잡종(Polygonaceae)의 뿌리줄기이며, 중국, 한반도에 분포하는 다년생의 초본이다. 또한 마디풀과의 여러해살이풀 약용대황 (Rheum officinale BAILLON), 장엽대황 (Rheum palmarum LINNE var. palmatum), 대황 (Rheum undulatum LINNE)의 뿌리이다.
주요 성분으로 에모딘(Emodin), 크리소파몰(Chrysophamol), 레인(Rhein), 알로에-에모딘(Aloe-emodin), 글루코갈린(Glucogallin) 및 라폰티신(Rhaponticin) 등을 포함하고 있으며, 항균 작용, 항바이러스 작용, 면역 복합체 정화 촉진 작용, 간세포 장해 억제 작용, 토끼혈청 콜레스테롤 정상화작용, 이뇨작용, 세균성 콜라겐 분해효소 저해 작용, angiotensin 변환효소 저해작용 등의 약리 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 rhaponticin의 분리 정제 방법을 하기에 나타낸다.
먼저, 건조된 대황에 물, 물을 포함한 유기용매(에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 크로로포름 등) 또는 유기용매를 1∼10 배 (w/v%)를 넣고상온에서 하루동안 방치하여 추출한다. 위 공정을 2회 반복하여 추출액을 얻으며, 추출액을 여과한 후 그 여과액을 진공 농축기에서 농축하여 대황추출물의 건고물을 얻는다. 상기 건고물에 물에 유기용매, 예를 들어, 에틸아세테이트가 20∼500%(v/v)양으로 혼합된 혼합용액을 가하고 상온에서 2시간동안 교반한 후 정치하여 층 분리를 시킨다. 층 분리가 된 후 경계층 혹은 유기용매 층에 생성된 결정화물 만을 얻기 위해, 물 층을 제거한 후 유기용매를 추가로 첨가한다. 위의 공정을 2회 반복하여 충분히 세척하고 여과한 후 여과물을 진공오븐에서 건조하여 rhaponticin을 얻는다.
본 발명에 의한 rhapontigenin의 제조 방법에는 세 가지가 있으며 하기에 나타낸다.
첫째, 산 가수분해 방법에 의한 rhapontigenin의 제조 방법이다. 먼저, 라폰티신에 산과 알코올의 혼합물을 가하고 수욕조에서 가열 환류시켜 라폰티신에 결합된 당결합을 가수분해시킨다. 이어, 용매를 제거하고, 잔사를 현탁한 후 유기용매를 이용하여 추출한다. 추출물이 포함된 유기용매 층을 탈수, 농축하여 라폰티제닌을 얻는다.
예를 들어, rhaponticin에 20배(v/w)의 7% 황산/50% 에탄올 용액(v/w)을 가하여, 100℃ 수욕조에서 6시간 동안 가열 환류시켜, rhaponticin에 결합된 당결합을 가수분해시킨다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출한다. 총 에테르층을 증류수로 세척한뒤, 무수황산마그네슘(MgSO4)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물로 rhapontigenin을 얻는다.
둘째, 염기 가수분해 방법에 의한 rhapontigenin의 제조 방법이다. 먼저, 라폰티신을 건조 피리딘에 녹이고, 여기에 강알칼리, 바람직하게는, 금속나트륨, 수산화칼륨, 수산화나트륨, sodium methoxide 등을 가해 유욕상에서 환류반응시켜 사포닌의 당결합을 가수분해시킨다. 이어, 반응액의 용매를 제거하고, 잔사를 현탁시킨 후 유기용매를 이용하여 추출한다. 추출물이 포함된 유기용매 층을 탈수, 농축하여 라폰티제닌을 얻는다.
예를 들어, rhaponticin을 건조 피리딘에 녹이고, 여기에 sodium methoxide(powder)를 가해 유욕상에서 6∼24시간동안 환류 반응시킴으로써, 사포닌의 당결합을 가수분해시킨다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO4)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물로 rhapontigenin을 얻는다.
셋째, 효소 가수분해 방법을 통한 rhapontigenin의 제조 방법이다. 먼저, 라폰티신을 산완충용액에 용해시키고, 여기에 효소 또는 효소 혼합물을 첨가하여 수욕상에서 교반시키면서, 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 유기용매를 이용하여 추출, 여과, 농축하여 생성물 rhapontigenin을 얻는다.
예를 들어, rhaponticin을 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 단일 효소 (pectinase, naringinase, cellulase, β-glucuronidase, β-galactosidase, amyloglucosidase 등) 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 30∼50℃ 수욕상에서 24∼72시간동안 교반시키면서, 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 에테르로 3회 추출, 여과, 농축하여 생성물 rhapontigenin을 얻는다.
본 발명에서 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기 rhaponticin 및 rhapontigenin을 화장료 조성물 총 중량에 대하여 각각 0.0001 ~ 10중량%의 양으로 함유된다.
본 발명의 미백 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바는 없으나, 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다.
<제조예 1> 대황추출물 제조
건조된 대황 1㎏에 물, 물을 포함한 유기용매(에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 크로로포름 등) 또는 유기용매 4L를 넣고 상온에서 하루동안방치하여 추출한다. 위 공정을 2회 반복하여 추출액을 얻으며, 추출액을 여과한 후 그 여과액을 진공 농축기에서 농축하여 건고물 400g을 얻었다.
<실시예 1> Rhaponticin 분리 정제 방법
제조예 1에서 얻은 건고물 400g에 물 1L와 에틸아세테이트 2L(2volumn)을 가하고 상온에서 2시간 교반한 후 정치하여 층 분리를 시킨다. 층 분리가 된 후 경계층 혹은 에틸아세테이트 층에 생성된 결정화물 만을 얻기 위해, 물 층을 제거한 후 에틸아세이트를 추가로 2L 첨가한다. 위의 공정을 2회 반복하여 충분히 세척하고 여과한 후 여과물을 진공오븐에서 건조하여 Rhaponticin 약 30g을 얻었다.
<실시예 2> 효소 가수분해 방법을 통한 rhapontigenin의 제조
실시예 1에서 얻은 rhaponticin 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 혼합물 2.5g(pectinase 0.5g, naringinase 0.5g, cellulase 0.5g, β-glucuronidase 0.2g, β-galactosidase 0.5g, amyloglucosidase 0.3g )을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 에테르로 3회 추출, 여과, 농축하여 생성물로 rhapontigenin 4.8g을 얻었다.
<실시예 3> 산 가수분해 방법에 의한 rhapontigenin의 제조
실시예 1에서 얻은 rhaponticin 10g을 20배(v/w)의 7% 황산/50% 에탄올 용액(v/w)을 가하여, 100℃ 수욕조에서 6시간 동안 가열 환류시켜, rhaponticin에 결합된 당결합을 가수분해시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수(1,000㎖)를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO4)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물로 rhapontigenin 3.4g을 얻었다.
<실시예 4> 염기 가수분해 방법에 의한 rhapontigenin의 제조
실시예 1에서 얻은 rhaponticin 10g을 건조피리딘(500㎖)에 녹이고, 여기에 sodium methoxide(powder, 10g)를 가해 유욕상에서 8시간동안 환류 반응시킴으로써, 사포닌의 당결합을 가수분해시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 증류수(1,000㎖)를 가해 현탁시킨 후, 동량의 에테르로 3회 추출하였다. 총 에테르층을 증류수로 세척한 뒤, 무수황산마그네슘(MgSO4)으로 탈수, 여과, 농축하여 생성물로 rhapontigenin 2.5g을 얻었다.
<시험예 1> 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정
C57BL/6 마우스 유래의 쥐의 색소세포(Mel-Ab cell)를 Dulbeccos modified Eagles media(DMEM)에 10% 우태반 혈청, 100nM 12-O-테트라데카노일포르빌(tetradecanoyphorbol)-13-아테이트, 1nM 콜레라독소(cholera toxin)을 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 배양된 Mel-Ab세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24-웰 플레이트에 105세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하고 이틀째부터 3일 연속으로 10ppm의 시험물질(코지산, 제조예 1, 실시예 1, 실시예 2)을 가하여 배양하였다. 여기서, 본 발명의 rhaponticin 또는 rhapontigenin의 멜라닌 생성 억제 효과를 비교하기 위하여 코지산을 사용하였다.
배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 표 1에 나타내었다(Dooley의 방법).
멜라닌 생성 억제 효과
시험물질 |
멜라닌 생성 억제율(%) |
제조예 1(대황추출물) |
8.6 |
실시예 1(rhaponticin) |
32.1 |
실시예 2(rhapontigenin) |
64.5 |
코지산 |
30.5 |
상기 표 1에 의해, 본 발명에 의한 rhaponticin 또는 rhapontigenin은 코지산과 동일하거나 또는 더욱 우수한 정도의 멜라닌 생성 억제율을 보일 만큼 우수한천연물 유래의 미백제 임을 알 수 있다.
<시험예 2> 인체 피부에 대한 미백 효과 시험
건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose))의 1.5 ~ 2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.
조사 후 시험물질(제조예 1, 실시예 1, 실시예 2) 각 1%(용매는 1,3-부틸렌그리콜:에탄올=7:3), 대조군으로 코지산 3%, 용매(vehicle)만을 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 10 주 동안 상태변화를 관찰했다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다. 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 2에 따라 계산하고, 이를 표2에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하는데, △L*값이 2정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다. 그 결과를 아래의 표 2에 나타내었다.
△L* = 도포완료시점에서의L*값 - 도포개시 할 때L*값
인체피부에 대한 미백효과
시험물질 |
피부색 밝기 정도(△L*) |
용매(Vehicle) |
0.50±0.15 |
코지산 |
0.99±0.11 |
제조예 1(대황추출물) |
0.72±0.13 |
실시예 1(rhaponticin) |
1.11±0.17 |
실시예 2(rhapontigenin) |
1.68±0.25 |
상기 표 1 및 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 대황추출물보다는 rhaponticin이, rhaponticin 보다는 rhapontigenin의 미백효과가 우수하며, 특히 rhapontigenin은 미백효과가 우수하다고 알려진 코지산에 비해서도 미백효과가 월등히 뛰어남을 알 수 있다.
<제형예 1, 2> 영양크림
하기 표 3에 나타낸 바와 같이 제형예 1, 2를 제조하였다.
배합성분 |
중량% |
제형예 1 |
제형예 2 |
Rhaponticin(실시예 1) |
5.0 |
- |
Rhapontigenin(실시예 2) |
- |
5.0 |
폴리솔베이트 |
1.5 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올리에이트 |
0.5 |
0.5 |
PEG60 경화피마자유 |
2.0 |
2.0 |
유동파라핀 |
10.0 |
10.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
5.0 |
카프릴릭/카프락트리글리세라이드 |
5.0 |
5.0 |
글리세린 |
5.0 |
5.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
3.0 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
0.2 |
방부제 |
적량 |
적량 |
색소 |
적량 |
적량 |
향료 |
적량 |
적량 |
정제수 |
To 100 |
To 100 |
<시험예 3> 피부흡수량 측정
피부 흡수는 기네아피그 피부를 대상으로 프란츠 투과셀을 이용하여 측정하였다. 시험 직전, 기네아피그의 복부 부분 피부를 채취하여, 평방 1㎠의 면적으로 절단한 후, 이를 투과경의 직경이 0.9㎝인 투과셀에 장치하고, 클램프로 고정하였다. 피부의 한쪽면(donor 용기)은 아래의 제형예 1, 2의 영양크림 0.5g를 도포하고, 반대쪽면(receptor 용기)은 정제수와 에탄올이 4:1의 중량비로 혼합된 용매와 접촉하도록 하였으며, 시험시 온도는 실제 피부 온도인 32℃를 유지하였다. 시험 시작 후, 일정 시간 간격으로 용매의 일부를 채취한 후, HPLC를 이용하여 피부에 흡수된 SDG와 SECO의 양을 측정하여, 도포 농도당 피부 흡수량(㎍/㎠/중량%)으로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
<HPLC 분석조건>
- Column : C18(ODS)
- Solvent Flow : 1㎖/min
- Detection UV : 280㎚
- Sample test concentration : 5㎎/㎖
- Sample injection amount : 10㎍
- Eluent : acetonitrile/10mM H3PO4 = 30/70
경과시간에 따른 경피 흡수량
시간 |
제형예 1 |
제형예 2 |
0 |
0 |
0 |
4 |
1.72 |
6.04 |
8 |
2.94 |
11.82 |
12 |
5.29 |
35.63 |
상기 표 4의 결과로부터, rhaponticin를 함유한 화장료에 비해 rhapontigenin를 함유한 화장료는 경피 흡수량이 최소 4배 이상 높음을 알 수 있다. 이 결과로부터 배당체의 구조로 이루어진 rhaponticin에 비해 당이 제거된 rhapontigenin이 피부 흡수에 훨씬 유리한 구조임을 알 수 있다.
하기 표에 나타낸 조성으로 통상의 방법에 따라 화장료로 사용되는 제형예를 제조하였다.
<제형예 3> 유연화장수(스킨로션)
배합성분 |
중량% |
Rhaponticin |
0.1 |
글리세린 |
3.0 |
부틸렌글리콜 |
2.0 |
프로필렌글리콜 |
2.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.1 |
PEG 12 노닐페닐에테르 |
0.2 |
폴리솔베이트 80 |
0.4 |
에탄올 |
10.0 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
방부제 |
적량 |
색소 |
적량 |
향료 |
적량 |
정제수 |
To 100 |
<제형예 4> 영양화장수(밀크로션)
배합성분 |
중량% |
Rhapontigenin |
0.5 |
스쿠알란 |
5.0 |
밀납 |
4.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
1.5 |
유동파라핀 |
0.5 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
5.0 |
글리세린 |
3.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.1 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
방부제 |
적량 |
색소 |
적량 |
향료 |
적량 |
정제수 |
To 100 |
<제형예 5> 마사지크림
배합성분 |
중량% |
Rhapontigenin |
5.0 |
밀납 |
10.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
PEG 60 경화피마자유 |
2.0 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.8 |
유동파라핀 |
40.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
4.0 |
글리세린 |
5.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
방부제 |
적량 |
색소 |
적량 |
향료 |
적량 |
정제수 |
To 100 |
<제형예 6> 팩
배합성분 |
중량% |
Rhapontigenin |
5.0 |
폴리비닐알콜 |
13.0 |
소듐카르복시메틸셀룰로오스 |
0.2 |
글리세린 |
5.0 |
알란토인 |
0.1 |
에탄올 |
6.0 |
PEG 12 노닐페닐에테르 |
0.3 |
폴리솔베이트 60 |
0.3 |
방부제 |
적량 |
색소 |
적량 |
향료 |
적량 |
정제수 |
To 100 |
<제형예 7> 젤
배합성분 |
중량% |
Rhaponticin |
1.0 |
에틸렌디아민초산나트륨 |
0.05 |
글리세린 |
5.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.3 |
에탄올 |
5.0 |
PEG 60 경화피마자유 |
0.5 |
트리에탄올아민 |
0.3 |
방부제 |
적량 |
색소 |
적량 |
향료 |
적량 |
정제수 |
To 100 |