KR20080025960A

KR20080025960A - 이카리시드 ⅰⅰ의 제조 방법 및 이를 함유하는 미백용조성물

Info

Publication number: KR20080025960A
Application number: KR1020060090795A
Authority: KR
Inventors: 박준성; 박혜윤; 노호식; 안수미; 김덕희
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2006-09-19
Filing date: 2006-09-19
Publication date: 2008-03-24
Also published as: JP5377312B2; US20100062492A1; WO2008035918A1; CN101516325A; CN101516325B; JP2010503728A

Abstract

본 발명은 이카리시드 II의 제조 방법 및 이를 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 타이로시나아제의 글라이코실레이션 과정에서 중요한 효소인 알파-글루코시다아제(alpha-glucosidase)의 효소 활성을 억제함으로써 당단백 효소인 타이로시나아제(tyrosinase)를 합성하는 글라이코실레이션(glycosylation)을 억제하는 하기 화학식 1로 표현되는 이카리시드 II의 제조 방법 및 이를 함유하는 미백용 조성물에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기에서, R1은 람노피라노오스이다.

에피메디움, 이카리시드 II, 이카린, 타이로시나아제, 알파-글루코시다아제, 미백, 화장료

Description

이카리시드 ⅠⅠ의 제조 방법 및 이를 함유하는 미백용 조성물{Method for preparing icariside ⅠⅠ and skin whitening composition containing the same}

도 1은 대조군(a), 데옥시노지리마이신(b), 이카린(c) 및 이카리시드 II(d)의 전기영동 사진이다.

본 발명은 이카리시드 II의 제조 방법 및 이를 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 타이로시나아제의 글라이코실레이션 과정에서 중요한 효소인 알파-글루코시다아제(alpha-glucosidase)의 효소 활성을 억제함으로써 당단백 효소인 타이로시나아제(tyrosinase)를 합성하는 글라이코실레이션(glycosylation)을 억제하는 하기 화학식 1로 표현되는 이카리시드 II의 제조 방법 및 이를 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기에서, R1은 람노피라노오스이다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드, 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.

이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나아제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은, 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미나 주근깨, 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

또한, 레저 인구의 증가로 외부에서 활동하는 것을 즐기는 사람들이 많아지면서 자외선에 의한 멜라닌 색소 침착을 막고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체들, 또는 타이로시나아제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

멜라닌을 생합성하는 효소인 타이로시나아제는 당단백질로서, 생체 내 당단백질 합성 과정인 글라이코실레이션(glycosylation) 과정을 통해 만들어진다. 이 글라이코실레이션 과정에 문제가 생겨 타이로시나아제의 당 부분에 이상이 생기면 타이로시나아제는 세포내 멜라닌 생합성 장소인 멜라노좀(melanosome)으로 이동하지 못하거나 이동을 하더라도 타이로시나아제의 활성을 나타내지 못하게 되고 따라서 멜라닌 생성이 이루어질 수 없게 된다(The Journal of Investigated Dermatology, 83, 196-201, 1984, The Journal of Biological Chemistry, 272(25), 15796-15803, 1997). 글라이코실레이션 과정에는 많은 효소가 관여하는데 그 중 중 요한 효소가 알파 글루코시다아제(alpha-glucosidase)이다(The Journal of Biological Chemistry, 272(25), 15796-15803, 1997). 만약 이 효소의 효소 활성을 억제할 수 있다면 타이로시나아제의 글라이코실레이션을 억제하여 미백 효과를 가져올 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고, 보다 우수한 미백제 원료를 찾고자 하는 연구의 일환으로 여러 천연물로부터 미생물의 알파-글루코시다아제 효소 활성 억제능을 검색해 본 결과, 에피메디움속 식물 추출물의 플라보노이드 성분인 이카리시드 II 가 우수한 알파-글루코시다아제 효소 활성 억제 효능을 보임으로써 미백제로서 효과가 우수함을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 화학식 1로 표현되는 이카리시드 II의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 이카리시드 II의 제조 방법 및 이를 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다:

상기에서, R1은 람노피라노오스이다.

이하, 본 발명에서 이카리시드 II를 제조하는 과정을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 함유되는 이카리시드 II는 하기의 두 가지방법으로 제조할 수 있다.

먼저, 이카리시드 II를 함유하는 식물로부터 직접 정제하여 제조할 수 있다.

본 발명에 의한 이카리시드 II를 함유하는 식물은 에피메디움속 유래의 식물 추출물임을 특징으로 하며, 보다 구체적인 예를 들면, Epimedium brevicornum Maxim., Epimedium grandiflorum Morr ., Epimedium koreanum Nakai , Epimedium pubescens Maxim ., Epimedium sagittatum Maxim . 및 Epimedium wushanense의 추출물을 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명에서는 유기용매로서 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명에서 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 이카리시드 II를 수득하는 방법은 다음과 같다. 즉, 식물에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3 배의 물; 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용매; 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매로서 유기용매의 비가 10 내지 50% (v/v)인 혼합용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5 회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8 배, 바람직하게는 약 4 배의 물 또는 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20℃에서 1 내지 3일간 침적시킨다.

상기 침적물을 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 부탄올 등을 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 부탄올 등의 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜 이카리시드 II를 포함하는 추출물을 수득할 수 있다. 이 추출물로부터 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1~4:1)로 분리하는 과정을 통해 이카리시드 II를 수득할 수 있다.

두번째로는, 이카린을 함유하는 식물 추출물을 수득하여 이카린의 글루코오스 부분을 제거하는 방법을 통해 얻을 수 있다. 이카린의 글루코오스 부분을 제거하는 방법은 람노오스에 작용하지 않고 글루코오스를 선택적으로 제거할 수 있는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하는 방법에 의하여 제조할 수 있 다.

본 발명에 의한 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물은 당 결합을 분해하는 효소 또는 상기 당 결합을 분해하는 효소를 생산하는 미생물을 사용할 수 있으며, 상기 효소는 이카린에서 람노오스를 분해하지 않고 글루코오스 부분만을 선택적으로 제거하여 이카리시드 II를 제조한다.

상기 효소로는 아밀라아제(amylase), 글루코시다아제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 효소를 생산하는 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

효소를 이용하는 경우, 이카린 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 5 내지 20 배, 바람직하게는 약 10 배의 산성 완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 첨가하여 약 37℃ 수용액 상에서 약 40 내지 55 시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 교반하면서, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80~100℃) 중에서 5 내지 15분 동안 가열하여 가수분해 반응을 종료시키고 반응 액을 수득할 수 있다.

상기에서 이카린 또는 이를 포함하는 식물 추출물은 본 발명에서 제시한 이카리시드 II 를 얻는 방법과 동일한 방법으로 획득할 수 있다.

상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하는 경우, 이카린 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 5 내지 10 배, 바람직하게는 약 10 배의 이온수에 용해시킨 후 약 121℃에서 30분간 멸균하여 약 30℃로 냉각한 다음 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5~10%로 접종하여 30℃에서 2 내지 5일, 바람직하게는 5일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 가수분해 반응을 종료시키고, 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척한 다음 원심분리하여 침전물로써 반응액을 수득할 수 있다.

상기와 같이 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해 한 후, 수득한 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하며, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1~4:1)로 분리하여 이카리시드 II를 수득할 수 있다.

본 발명에 의하여 제조된 이카리시드 II는 타이로시나아제 글라이코실레이션에 작용하는 알파-글루코시다아제 활성 억제 효능이 우수하고, 이를 통한 멜라닌 생성을 억제시키는 미백 효능이 우수하다

또한 본 발명에서는 상기 이카리시드 II를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 화장료로 제형화될 수 있으며, 조성물 내에서 상기 이카리시드 II의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~10 중량％로 함유될 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기 이카리시드 II 이외의 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당 업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 자세하게 설명한다. 그러나 이러한 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이지, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 추출법을 활용한 이카리시드 II 의 제조

에피메디움 속 식물인 삼지구엽초(Epimedium koreanumNakai )의 건조된 잎 2㎏에 헥산 6ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 삼지구엽초의 잎 1kg 에 80% 메탄올 4ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 다음, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1ℓ로 5회 추출하 여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500㎖로 1회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써 이카리시드 II가 함유된 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(실리카겔 500g 충진)로 정제하였다. 이 때, 전개용매로는 클로로포름과 메탄올을 사용하였고, 클로로포름과 메탄올의 비를 10:1에서 2:1까지 농도구배를 높여서 분획을 수득하였으며, 이들 분획으로부터 이카리시드 II 1.5 g을 수득하였다.

[실시예 2] 셀룰라제를 활용한 이카리시드 II 의 제조

이카린 10g을 500㎖의 0.1 M 초산 완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 셀룰라제 0.5g(Sigma사 제조)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48 시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 이카린이 완전히 소실되면 열수(80∼100℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올 200㎖를 가해 교반시킨 다음(3회), 여과하여 침전물을 제거한 후, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1∼4:1)로 분리하여 이카리시드 II 7 .5g을 수득하였다.

[실시예 3] 베타 글루코시다아제를 활용한 이카리시드 II 의 제조

이카린 10g을 500 ㎖의 0.1 M 초산 완충용액(pH 5.5)에 용해시키고, 여기에 베타글루코시다아제 0.5g(Sigma사 제조)을 첨가하여 25℃ 수욕상에서 48 시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 이카린이 완전히 소실되면 열수(80∼100℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올 200㎖를 가해 교반시킨 다음(3회), 여과하여 침전물을 제거한 후, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1∼4:1)로 분리하여 이카리시드 II 6.9g을 수득하였다.

[실시예 4] 아밀라아제를 활용한 이카리시드 II 의 제조

이카린 10g을 500 ㎖의 0.1 M 초산완충용액(pH 5.5)에 용해시키고, 여기에 아밀라아제 0.5g(Sigma사 제조)을 첨가하여 25℃ 수욕상에서 48 시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 이카린이 완전히 소실되면 열수(80∼100℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올 200㎖를 가해 교반시킨 다음(3회), 여과하여 침전물을 제거한 후, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1∼4:1)로 분리하여 이카리시드 II 7.3g을 수득하였다.

[실시예 5] 아스퍼질러스 니거를 활용한 이카리시드 II 의 제조

이카린 10g을 100㎖의 이온수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하여 30℃에서 5일 동안 배양시킨 다음, 박층 크로마토그래피로 이카린의 소거율을 확인하여 완전히 소실되면 반응을 종료시키고, 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척한 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 얻은 다음, 상기 침전물에 에탄올 200㎖를 가해 교반시킨 후(3회), 여과하여 침전물을 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였고, 상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1∼4:1)로 분리하여 이카리시드 II 6.5g을 수득하였다.

[시험예 1] 이카리시드 II의 동정

상기 실시예 1∼5에서 수득한 생성물들을 동정한 결과(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사), 하기와 같은 특성을 나타내었다:

< 이카리시드 II 물리화학적 성상 >

성상 : 연한 미황색의 미세결정

양성(Positive) FAB-MS : 515[M+H]

¹H NMR: (DMSO-d6) δ:0.79(3H, d, 6, Me-5''), 1.63 & 1.68(6H, br s, Me-11), 3.03(1H, qd, 6, 9.5, H5''), 3.14(1H, dd, 9, 9.5, H4''), ca 3.4(2H-9, overlaping with the signals of H2O), 3.47(1H, br, H3''), 3.85(3H, s, OMe-4'), 3.98(1H, br, H2''), 5.15(1H, br t, 7, H10), 5.26(1H, d, 1.5, H1''), 6.31(1H, s, H6), 7.12(2H, d, 9, H3',5'), 7.86(2H, d, 9, H2',6'), 12.52(1H, s, OH-5).

¹³C-NMR: (DMSO-d6) δ: 156.2, 133.8, 177.1, 103.6, 158.1, 97.8, 160.9, 105.4, 153.8, 21.0, 121.7, 130.3, 17.6, 25.2, 121.8, 129.7, 113.5, 160.5, 55.2, 101.4, 69.7, 70.0, 70.2, 70.8, 17.3.

산가수분해물: 이카리틴, 람노오스

[시험예 2] 이카리시드 II의 효능 시험

1. 알파 글루코시다아제 저해 효능 실험

알파-글루코시다아제(Sigma 제조)를 50 U/㎖의 조효소액 1㎖에 10mg/㎖로 제조한 이카린, 실시예 1∼5의 이카리시드 II 및 데옥시노지리마이신 0.01㎖를 가하여 5분간 방치하였다. 이때 데옥시노지리마이신은 양성 대조군으로 사용하였다. 각 샘플을 405nm에서 흡광도를 측정하여 초기의 흡광도를 구하고, 여기에 기질 5mM p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드 0.05㎖를 가하여 37℃에서 5분간 효소반응을 시킨 후 405nm에서 흡광도를 다시 측정하고 하기 수학식 1을 이용하여 효소 활성 저해율을 구하였다.

시험물질	활성 저해율(%)
비처리군	100.0
이카린	98.8
실시예 1	38.2
실시예 2	38.8
실시예 3	37.5
실시예 4	37.9
실시예 5	37.8
데옥시 노지리마이신	41.1

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1∼5에서 동정한 이카리시드 II는 데옥시노지리마이신과 유사한 정도의 알파글루코시다아제의 활성 억제 능이 있는 것을 확인하였다.

2. 인간 멜라노마 세포 타이로시나아제의 글라이코실레이션에 미치는 영향

인간 멜라노마 세포가 가지고 있는 타이로시나아제의 글라이코실레이션에 미치는 이카리시드 II 의 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 인간 멜라노마 세포인 HM3KO 세포(Y. Funasaka, Department of dermatology, Kobe university school of medicine, 5-1 Kusunoki-cho 7-chrome, Chuo-ku, Kobe 650, Japan)를 우태아혈청이 10% 들어간 MEM(Minimum Essential Medium) 배지에 넣어 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 세포수가 각 플라스크 당 3×10⁵ 이 되게 75cm² 플라스크에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 후, 다음날부터 이카린, 상기 실시예 1의 이카리시드 II 및 데옥시노지리마이신이 0.05% 들어 있는 새 배지로 각각 갈아주었다. 여기에서 데옥시노지리마이신은 양성 대조군으로 사용하였다. 시료가 들어 있는 새 배지는 1 내지 2일에 한 번씩 갈아주고 세포가 플라스크에 꽉 찰 때까지 배양하였다. 세포가 다 성장하면 세포를 모아 세포 용해액(lysis buffer: 2 % CHAPS in 50 mM Hepes 및 200mM NaCl, pH 7.5, 프로테아제 억제제(protease inhibitors))을 넣고 초음파로 파쇄한 다음 세포 파쇄액을 4℃, 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 깨어지지 않은 세포와 멜라닌(melanin)을 분리하여 제거하고, 상층액 만을 취한 후, 이 상층액(단백질 양: 20g)에 엔도글라이코시다제 H(endoglycosidase H, 125 units)를 넣고 37℃에서 1시간 동안 효소 반응시킨 후 전기 영동으로 상층액에 있는 단백질들을 크기 별로 분리하였다. 상기와 같이 전기 영동으로 분리한 단백질 중 타이로시나아제는 항체를 이용한 면역 반응으로 확인할 수 있었다. 즉, 당 잔기가 정상적으로 형성된 타이로시나아제는 엔도글라이코시다제 H에 의해 당 잔기가 효소 분해되지 않아 약 72kD 크기의 당단백질로 나타나고, 글라이코실레이션 과정에 관여하는 알파-글루코시다아제의 효소 활성이 억제되어 정상적인 당 잔기가 형성되지 못한 타이로시나아제는 엔도글라이코시다제 H에 의해 당 잔기가 가수분해되어 약 60kD의 크기로 단백질이 나타나게 된다.

도 1을 보면, 시료가 들어가지 않은 배지인 대조군(a)과 이카린(c)이 처리된 타이로시나아제는 엔도글라이코시다제에 의해 당이 분해되지 않아 큰 크기(약 72kD)로 나타나는데 비하여, 데옥시노지리마이신(b)과 이카리시드 II(d)를 처리한 멜라노사이트의 타이로시나아제는 당 부분이 엔도글라이코시다제에 의해 완전히 분해되어 작은(약 60kD) 크기로 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는, 이카리시드 II가 타이로시나아제의 당단백질 형성에 문제를 일으켜 타이로시나아제의 효소활성을 억제시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

3. 인체 피부에 대한 미백 효과 실험

본 발명에 의한 이카리시드 II의 인체 피부에 대한 미백 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

상기 자외선 조사 후 상기 실시예 1에서 동정한 이카리시드 II 1%(용매는 1,3-부틸렌글리콜:에탄올 = 7:3), 하이드로퀴논 1%, 용매(vehicle)(음성 대조군) 1% 만을 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 10주 동안 상태변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다.

그 다음 상기 각 시험물질의 도포 개시시점과 도포 완료시점에서의 피부색의 차이(ΔL*)를 하기 수학식 2에 따라 계산하고, 이를 하기 표 2에 나타내었다. 한편, 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 ΔL*의 비교로 판정하는데, ΔL* 값이 2정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

ΔL* = 도포 완료시점에서의 L*값 - 도포 개시시점에서의 L*값

시험물질	피부색 밝기 정도(ΔL*)
실시예 1의 이카리시드 II	1.97±0.25
하이드로 퀴논(양성 대조군)	1.90±0.11
용매(Vehicle)(음성 대조군)	0.50±0.15

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에서 동정한 이카리시드 II 는 하이드로퀴논과 유사한 정도의 피부색 밝기 정도를 보임을 확인하였다.

이하 상기 조성물의 제형화를 제제예를 통하여 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐 본 발명을 이에만 한정하는 것은 아니다.

[ 제제예 1] 비누 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 II 유지 수산화나트륨 염화나트륨 향료	1.00 적당량 적당량 적당량 소량

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비에 의해 비누를 제조하였다.

[ 제제예 2] 로션 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 II L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 수용성 콜라겐 (1% 수용액) 시트르산나트륨 시트르산 감초 엑기스 1,3-부틸렌글리콜	3.00 1.00 1.00 0.10 0.05 0.20 3.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)에 의해 로션을 제조하였다.

[ 제제예 3] 크림 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 II 폴리에틸렌글리콜모노스테아레이트 자기유화형모노스테아르산글리세린 세틸알코올 스쿠알렌 글리세롤 스핑고당지질 1.3-부틸렌글리콜	1.00 2.00 5.00 4.00 6.00 6.00 1.00 7.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 크림을 제조하였다.

[ 제제예 4] 팩 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 II 폴리비닐알코올 L-아스코르빈산-2-인산마그네슘염 라우로일히드록시프롤린 수용성 콜라겐 (1% 수용액) 1,3-부틸렌글리콜 에탄올	5.00 13.00 1.00 1.00 2.00 3.00 5.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 팩을 제조하였다.

[ 제제예 5] 미용액 제조

성분	함량(중량%)
이카리시드 II 히드록시에틸렌셀룰로오스(2% 수용액) 크산탄검(2% 수용액) 1,3-부틸렌글리콜 진한 글리세린 히알루론산나트륨 (1% 수용액)	2.00 12.00 2.00 6.00 4.00 5.00

상기 성분에 정제수를 채워 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(%)로 미용액을 제조하였다.

[ 제제예 6] 산제의 제조

성분	함량(단위:mg)
이카리시드 II 유당 탈크	300 100 10

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

[ 제제예 7] 정제의 제조

성분	함량(단위:mg)
이카리시드 II 옥수수전분 유당 스테아린산 마그네슘	50 100 100 2

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[ 제제예 8] 캅셀제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

[ 제제예 9] 주사제의 제조

성분	함량(단위:mg)
이카리시드 II 주사용 멸균 증류수 pH 조절제	50 적량 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

[ 제제예 10] 액제의 제조

성분	함량
이카리시드 II 이성화당 만니톨 정제수	100mg 10g 5g 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 에피메디움 속 식물 추출물로부터 분리되거나 또는, 이카린으로부터 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 생성된 이카리시드 II를 함유하는 화장료 조성물이 알파-글루코시다아제의 활성을 억제하고 이를 통해 타이로시나아제의 정상적인 글라이코실레이션을 방해하여 자외선(ultraviolet rays; UV)에 의해 생성된 색소 침착을 개선하는 효과에 기인한 미백효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의한 이카리시드 II는 미백용 화장료 조성물 또는 약학 조성물로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

에피메디움속 식물로부터 유기용매 또는 유기용매와 물의 혼합물을 용매로 이용하여 이카리시드 II를 추출하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표현되는 이카리시드 II의 제조 방법:

[화학식 1]

상기에서, R1은 람노피라노오스이다.
제1항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 이카리시드 II의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 에피메디움속의 식물은 Epimedium brevicornumMaxim., Epimedium grandiflorumMorr., Epimedium koreanumNakai, Epimedium pubescensMaxim., Epimedium sagittatumMaxim. 및 Epimedium wushanense로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 이카린에서 람노오스를 분해하지 않고 글루코오스 부분을 선택적으로 제거하여 하기 화학식 1로 표현되는 이카리시드 II를 제조하는 방법:

[화학식 1]

상기에서, R1은 람노피라노오스이다.
제 4항에 있어서, 상기 효소는 글루코시다아제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다아제(amyloglucosidase)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것임을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리 움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
하기 화학식 1로 표현되는 이카리시드 II를 유효성분으로 함유하는 미백용 조성물:

[화학식 1]

상기에서, R1은 람노피라노오스이다.
제 7항에 있어서, 상기 조성물은 피부 외용 또는 경구용인 것을 특징으로 하는 조성물.