CN112961891B - 利用双相酶促反应制备淫羊藿苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种利用双相酶促反应制备淫羊藿苷的方法，其中，该反应使用酶将淫羊藿提取物中的朝藿定A/B/C转化为酶解产物淫羊藿苷，其步骤包括：‑制备淫羊藿提取物的步骤；‑进行双相酶促反应的步骤，其中，第一相为缓冲液相，且第一相对于淫羊藿提取物中的朝藿定A/B/C具有良好的溶解性，而第二相为有机相，且第二相对于作为酶解产物的淫羊藿苷具有良好的溶解性；‑对产物淫羊藿苷分离纯化的步骤；其中，用于该双相酶促反应的酶包裹有非水溶性淀粉，使得该酶在该双相酶促反应进行时处于第一相和第二相的相界面处。
Description
技术领域
本申请属于生物化工领域，具体涉及一种利用双相酶促反应由淫羊藿提 取物制备淫羊藿苷的方法。
背景技术
淫羊藿是我国传统中药，其具有补肾壮阳、强壮筋骨，增强免疫力等功 效，经常被用在治疗骨质疏松、促进心肌细胞再生和分化、延缓衰老等方面。 淫羊藿中发挥功效的主要活性成分为黄酮类化合物，这些化合物主要是以糖 苷的形式存在与淫羊藿中，其中淫羊藿苷是近些年来学者研究较多的具有上 述功效的黄酮类化合物之一。但是，由于淫羊藿生长地址环境、采摘期的不同，淫羊藿苷的含量差别很大，其基本含量通常在2％以下。相对而言，比 淫羊藿苷极性更大的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的含量在巫山淫羊藿中 含量丰富，可以达到2.5％～16.8％。淫羊藿苷分别可以通过朝藿定A脱去一 分子的rha和一分子的glc；朝藿定B脱去一分子的xyl和一分子的glc；朝藿定C脱去两分子的rha来得到。因此可以采用酶促反应法，将淫羊藿中含 量较高的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C完全转化为淫羊藿苷，从而大量制 得淫羊藿苷，为后期淫羊藿苷相关产品开发提供原料支持。
双相反应体系是一种温和的生物反应分离萃取体系，非常适合于反应产 物对酶活有抑制的反应体系。由于酶反应一般需要完全的水溶液环境下进 行，反应过程中产生的产物、副产物可能会抑制反应过程中的酶反应效率， 使得反应过程不能稳定、持续有效的进行，这也间接地浪费了很多酶资源。 为了解决上述问题，同时可以使得反应产物及时地得到分离和浓缩干燥，节省时间成本。我们可以利用缓冲液和有机溶剂双相体系，酶和反应底物在水 相中发生酶促反应，反应产物被不断的萃取到有机相中，进而可以将反应产 物及时地分离出去，并进行下一步的浓缩干燥。但是这个过程中需要对酶在 所采用的有机溶剂相中的耐受性，以及反应产物在有机相中的稳定性进行考 察和筛选。现有技术中，有将酶在喷雾干燥过程中与非水溶性的淀粉一起干 燥制粒的制备工艺；而我们将这种形式的酶应用于双相酶促反应体系，此时， 携带酶的非水溶性的淀粉颗粒处于两相界面，有效地减少了酶分子与有机相的接触，从而保证了酶活力的稳定。该双相酶促反应技术应用在工业化生产 淫羊藿苷领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本申请提供了下述技术方案：
1.一种利用双相酶促反应制备淫羊藿苷的方法，该反应使用酶将淫羊藿 提取物中的朝藿定A/B/C转化为酶解产物淫羊藿苷，其步骤包括：
-制备淫羊藿提取物的步骤；
-进行双相酶促反应的步骤，其中，在双相酶促反应中，第一相为缓冲 液相，且第一相对于朝藿定A/B/C具有良好的溶解性，而第二相为有机相， 且第二相对于淫羊藿苷具有良好的溶解性；
-从第二相分离纯化出产物淫羊藿苷的步骤。
2.如项1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，在制备淫羊藿提取物的步 骤中，取粉碎后的淫羊藿加入70％-90％的乙醇提取，淫羊藿和乙醇的质量比 为1:10-1:30，然后减压浓缩干燥得淫羊藿提取物。
3.如项1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，用于该双相酶促反应的酶 包裹有非水溶性淀粉，使得所述酶在该双相酶促反应进行时处于第一相和第 二相的相界面处；所述双相酶促反应中的酶为鼠李糖苷酶、木糖苷酶和/或葡 萄糖苷酶。
4.如项1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述有机相为三氯甲烷、 异丙醚或乙酸乙酯。
5.如项4所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述有机相为三氯甲烷且 有机相与缓冲液相的比例为1:1～1:10，优选1:3。
6.如项4所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述有机相为异丙醚且有 机相与缓冲液相的比例为1:1～1:10，优选1:3。
7.如项4所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述有机相为乙酸乙酯且 有机相与缓冲液相的比例为1:1～1:10，优选1:3。
8.如项1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述第一相为磷酸盐缓冲 液或柠檬酸钠缓冲液，且缓冲液浓度为10mM-100mM；缓冲液的pH值为4-6。
9.如项1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述酶促反应进行的条件 为：使用比活力为40000至60000活力单位/g，优选50000活力单位/g的酶 以及酶/淫羊藿提取物为1:10(g/g)的固相质量比，在40～60℃下反应2-24h； 优选55℃下反应12h。
10.如项1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，在对产物淫羊藿苷分离纯 化的步骤中，使用分液漏斗或蠕动泵分离第一相和第二相，并对第二相浓缩 干燥以得到产物淫羊藿苷。
11.如项1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，在所述双相酶促反应进 行期间对反应体系进行震荡或搅拌。
本申请的技术方案取得了下述有益技术效果：
本申请的技术方案与传统的双相酶促反应相比，由于有非水溶性的淀粉 颗粒的存在，可以最大限度地隔绝反应过程中酶分子与有机相的接触，使得 酶分子可以持续稳定、高效地发挥作用。而与常规的酶法水解淫羊藿制备淫 羊藿苷工艺相比，可以有效地抑制反应产物对酶活力的影响，使得反应过程 所需要的酶量大大减少，在最大程度节省酶成本的前提下，得到最高产率的淫羊藿苷。
附图说明
图1为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的分子结构式；
图2以实施例1为例，显示了处于不同酶解反应时间的酶促反应产物的 液相色谱图。
具体实施方式
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组 件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个 组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是 以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中 所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一 般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
在一个具体实施方式中，本申请提供了一种利用双相酶促反应制备淫羊 藿苷的方法，其中，该反应使用酶将淫羊藿提取物中的朝藿定A/B/C转化为 酶解产物淫羊藿苷，其步骤包括：
-制备淫羊藿提取物的步骤；
-进行双相酶促反应的步骤，其中，第一相为缓冲液相，且第一相对于淫羊藿提取物中的朝藿定A/B/C具有良好的溶解性，而第二相为有机相，且 第二相对于作为酶解产物的淫羊藿苷具有良好的溶解性；
-从第二相分离纯化出产物淫羊藿苷的步骤；其中，
用于该双相酶促反应的酶包裹有非水溶性淀粉，使得所述酶在该双相酶 促反应进行时处于第一相和第二相的相界面处。
在本说明书的上下文中，“淫羊藿苷”是存在于我国传统中药淫羊藿中 的一种有效成分，在传统中医理论中，淫羊藿具有补肾壮阳、强壮筋骨，增 强免疫力等功效，经常被用在治疗骨质疏松、促进心肌细胞再生和分化、延 缓衰老等方面。淫羊藿中发挥功效的主要活性成分为黄酮类化合物，这些化 合物主要是以糖苷的形式存在与淫羊藿中，其中淫羊藿苷是近些年来学者研究较多的具有上述功效的黄酮类化合物之一。由于淫羊藿生长地址环境、采 摘期的不同，其中存在的淫羊藿苷的含量差别很大，其基本含量通常在2％ 以下。相对而言，比淫羊藿苷极性更大的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的 含量在巫山淫羊藿中含量更丰富，可以达到2.5％～16.8％。淫羊藿苷分别可 以通过朝藿定A脱去一分子的rha和一分子的glc；朝藿定B脱去一分子的 xyl和一分子的glc；朝藿定C脱去两分子的rha来得到。本申请的技术方案 就是采用酶促反应法，将淫羊藿中含量较高的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定 C完全转化为淫羊藿苷，从而大量制得淫羊藿苷。
在本申请的上下文中，“酶”(enzyme)符合生物化工领域的一般定义， 即指，由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质 或RNA。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。它属于生物大分子，分子质量至 少在1万以上，大的可达到百万。从功能角度说，它是一类极为重要的生物 催化剂；由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效 和特异地进行。酶一般都在水相中发挥催化作用，但是，也有主要在两相(例 如固-液或者水-油)界面发挥催化作用的情况；从技术上来说，可以通过酶 本身的性质以及酶的制剂技术使酶在两相反应系统中维持在两相界面，从而 发挥催化作用。本申请的技术就是属于后者的情况。
在本说明书的上下文中，水相也被称为“缓冲液相”，水相中需要维持 一定的离子浓度和一定的pH值稳定性，这样是为了保护酶促反应所需的微 环境。而“有机相”的具体构成，会在下文详细说明。
酶的剂型即酶的成品形式。商售的酶制剂的剂型大体有以下四种:
1.液体酶:液体酶是发酵澄清滤液(或麸曲抽提液、细胞抽提液)经浓缩后 加入缓冲剂、防腐剂(苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、丙酯、食 盐等)和稳定及(甘油、山梨醇、氯化钙、亚硫酸盐、食盐等)而成,在阴凉处一 般可保存6～12个月。
2.粉状酶:发酵滤液或细胞、麸曲的抽提液,经过适当浓缩后加入硫酸铵、 硫酸钠进行盐析或在低温加入甲醇、丙酮、异丙醇使酶沉淀析出,将酶滤出, 经低温干燥后磨成粉状,拌入稳定剂或填料(乳糖、麦芽糊精、碳酸钙、淀粉 等)而成。也可将酶液超滤浓缩后,吸入淀粉或其他惰性材料,干燥后磨粉。粉 状酶的保存期更长。
3.试剂酶:试剂酶是将酶经过反复盐析、溶剂沉淀及例子交换法纯化后, 制成结晶或单一酶蛋白的纯酶,主要供分析试剂或医药行业应用。
4.固定化酶:将酶通过各种方法与不溶性的有机或无机载体相结合而固 定化,使之不溶于水,这样的固定化酶在完成催化反应后可以方便地从混合物 中回收而反复利用,工业上大量使用的葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶等都是固 定化形式的制品。
本申请的技术方案所采用的三种酶制剂的剂型都属于第二种情况，即 “粉状酶”，所使用的填料是非水溶性淀粉。选择这样的剂型的好处有两方 面：第一、剂型更加稳定，可以使酶的保存期更长；第二、特别针对本申请 所涉及的双相酶促反应，可以确保酶制剂在反应进行过程中维持在两相界 面，由此有利于酶活力的稳定以及酶促反应的进行。制备以淀粉为填料的“粉状酶”可以使用本领域公知的粉体制备技术，例如将半成品的液体酶物料采 用喷雾干燥工艺可以制成干燥的固体粉末状酶，或者用中性盐或有机溶剂将 液体中的酶蛋白沉淀后，再经过固液分离、干燥和粉碎后制成干燥的固体粉 末状酶。如果要制备颗粒酶产品，要把这固体粉末状酶与无机盐、淀粉、糊 精、蔗糖、麦麸或其它经过粉碎的植物材料等载体和粘结剂相混合，调节好物料混合比例和水分，用制粒机造粒、干燥和分筛后获得颗粒状的产品，也 可以采用流化床造粒/干燥设备，向处于流化状态的吸附载体连续喷酶液，进 行连续干燥的工艺，从液体酶中间品制造颗粒或固体粉末状酶产品。在此， 包裹并制粒的方式可以为，将鼠李糖苷酶单独制粒，将木糖苷酶单独制粒， 将葡萄糖苷酶单独制粒，将鼠李糖苷酶和木糖苷酶组合制粒，将木糖苷酶和葡萄糖苷酶组合制粒，将鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶组合制粒，将鼠李糖苷酶、 木糖苷酶和葡萄糖苷酶组合制粒。
在又一具体实施方式中，在制备淫羊藿提取物的步骤中，取粉碎后的淫 羊藿加入70％-90％的乙醇提取，料液比为1:10-1:30，然后减压浓缩干燥得 淫羊藿提取物。
具体地，上述用于提取的乙醇的质量浓度可以是70％、72％、74％、76％、 78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％；而上述淫羊藿与乙醇的料液比 可以为1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:22、1:24、1:26、1:28、1:30。
一般在化工的单元操作中，通过干燥过程获得产物有两种手段，一是加 温，二是减压，以及对两种手段的共同使用；其中，使用后者的好处是，可 以避免高温对产物中的有效成分造成破坏。本申请在从中药淫羊藿中提取朝 藿定A/B/C，以及在最后的分离纯化步骤中从有机相提取淫羊藿苷，都是采用减压浓缩干燥的技术手段，以防止高温对目标物质造成破坏，同时达到了 提纯的目的。
在再一具体实施方式中，酶为木糖苷酶、葡萄糖苷酶和/或鼠李糖苷酶。
在本说明书的上下文中，“葡萄糖苷酶”是糖苷水解酶(EC 3.2.1)中 的一大类酶，因其可以通过水解葡萄糖苷键并释放出一分子葡萄糖而得名。 葡萄糖苷酶来源广泛，几乎所有以碳水化合物为能源的具有细胞结构的生物 体内都有所存在。葡萄糖苷酶因为其特性，主要应用于两个方面：纤维素的 水解与利用：主要涉及各种β-葡萄糖苷酶与纤维素水解相关酶类，目的即将难溶的纤维素变为可溶的、易于利用的小分子寡糖；功能性低聚糖的合成： 主要涉及葡萄糖苷酶的转糖苷活力，目的即通过具有转苷活力的葡萄糖苷酶 合成功能性低聚葡聚糖、低聚麦芽寡糖、低聚纤维寡糖等可以作为益生元的功能性糖类。
在本说明书的上下文中，“鼠李糖苷酶”是一种水解酶,可以作用于α -1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键,广泛存在于自然界的细 菌和真菌中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构不同,其催化特性也不尽相 同。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。
在本说明书的上下文中，“木糖苷酶”是一种胞内酶；通常，双歧杆菌 中同时存在有木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。木糖苷酶的最适反应pH为5.6,最 适反应温度为45℃，在pH4.8～6.0之间酶活力稳定，55℃的半衰期(t1/2) 为1h。在本申请中，就是选择了对于所涉及三种酶都比较理想的温度、pH 值下进行反应。
在一个具体实施方式中，所述有机相为三氯甲烷、异丙醚或乙酸乙酯。
“三氯甲烷”的性质是：无色透明液体，有特殊气味。味甜。高折光， 不燃，质重，易挥发。纯品对光敏感，遇光照会与空气中的氧作用，逐渐分 解而生成剧毒的光气(碳酰氯)和氯化氢。可加入0.6％～1％的乙醇作稳定 剂。能与乙醇、苯、乙醚、石油醚、四氯化碳、二硫化碳和油类等混溶、25 ℃时1ml溶于200ml水。相对密度1.4840。凝固点-63.5℃。沸点61～62℃。 折光率1.4476。低毒。
“异丙醚”的性质是：无色液体，有醚样气味，遇光和空气不稳定；易 形成过氧化物，而在振摇时产生爆炸，因此使用前要对产生的过氧化物用亚 硫酸钠溶液处理。常加入对苄基氨基苯酚(p-Benzyl-AminophEnol)或对苯二 酚作稳定剂。能与乙醇和乙醚混溶，微溶于水。相对密度(d204)0.7258。折 光率(n23D)1.3678。闪点(开杯)-9℃。易燃。有刺激性。
“乙酸乙酯”的性质是：分子量88.11，低毒性，有甜味，浓度较高时 有刺激性气味，易挥发，是一种用途广泛的精细化工产品。具有优异的溶解 性、快干性，用途广泛，是一种重要的有机化工原料和工业溶剂。乙酸乙酯 对空气敏感，吸收水分缓慢水解而呈酸性。乙酸乙酯微溶于水；能与氯仿、乙醇、丙酮和乙醚混溶。选用上述三种有机溶剂，就是利用了它们与水的极 性差别，用来萃取酶解反应产物淫羊藿苷，根据分析，首先，淫羊藿苷在上 述三种有机相与水相的分配比可以达到9:1；这些有机相有效地起到了对反 应产物浓缩萃取的作用；第二，淫羊藿苷在上述三种有机相中比较稳定，可 以保证在24h小时内不发生降解；第三，上述三种有机相对于本申请所使用 的酶制剂没有破坏作用，本申请的酶剂型在本申请的反应体系油、水界面经 过20h小时后酶活性仍可以保持80％以上。
在又一具体实施方式中，所述第二相为三氯甲烷且第二相与第一相的比 例为1:1～1:10，优选1:3。
在一个具体实施方式中，所述第二相为异丙醚且第二相与第一相的比例 为1:1～1:10，优选1:3。
在再一具体实施方式中，所述第二相为乙酸乙酯且第二相与第一相的比 例为1:1～1:10，优选1:3。
在一个具体实施方式中，所述第一相为磷酸盐缓冲液或柠檬酸钠缓冲 液，且缓冲液浓度为10mM-100mM；缓冲液的pH值为4-6。
在本说明书的上下文中，“缓冲液”的定义符合下述描述：当往某些溶 液中加入一定量的酸和碱，或加少量水稀释时，溶液有阻碍溶液pH变化的 作用，这被称为缓冲作用，而这样的溶液叫做缓冲液。弱酸及其盐的混合溶 液(如HOAc与NaOAc)，弱碱及其盐的混合溶液(如NH3·H2O与NH4Cl) 等都是缓冲溶液。磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，简称PBS)是 常用的用于生物学研究的一个缓冲溶液。PBS可以为三种溶液的英文缩写， 分别是磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution)、磷酸盐缓冲盐水(phosphatebuffered saline)及磷酸盐缓冲钠(phosphate buffered sodium)， 其配制方法不同，pH值不同，发挥的生物学作用亦不完全相同。如无特殊 说明，生物学上常用的PBS是中性磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution)。它是一种水基盐溶液中含有氯化钠，磷酸盐，以及(在某些配方) 氯化钾和磷酸钾。缓冲液有助于保持恒定的pH值。溶液的渗透压和离子浓 度通常与人体pH相近(等渗)。柠檬酸盐缓冲液主要成分为柠檬酸和磷酸 氢钠，常用于免疫分析。医学词汇中还缩写为CPBS，pH＝5.5，常用于免疫 分析，如ELISA法，主要成分为柠檬酸和磷酸氢钠。本申请选用此两种缓 冲液，是由于它们具有比较适宜的渗透压和pH值，有利于酶促反应的进行。
在又一具体实施方式中，所述酶促反应进行的条件为：使用比活力为 40000至60000活力单位/g，优选50000活力单位/g的酶以及酶/淫羊藿提取 物为：1:10(g/g)的固相质量比；40～60℃下反应时间2-24h；优选55℃下反应时间12h。具体地，所述酶是鼠李糖苷酶、木糖苷酶和/或葡萄糖苷酶， 所述酶的比活力可以为40000活力单位/g、42000活力单位/g、44000活力单位/g、46000活力单位/g、48000活力单位/g、50000活力单位/g、52000活力 单位/g、54000活力单位/g、56000活力单位/g、58000活力单位/g、60000活 力单位/g。具体地，反应温度可以为40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、 46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、 57℃、58℃、59℃、60℃。具体地，反应时间可以为2小时、3小时、4小 时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时。
在再一具体实施方式中，在对产物淫羊藿苷分离纯化的步骤中，使用分 液漏斗或蠕动泵分离第一相和第二相，并对第二相浓缩干燥以得到产物淫羊 藿苷。在又一具体实施方式中，在所述双相酶促反应进行期间对反应体系进 行震荡或搅拌。
<实施例部分>
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了 本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被 这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解 本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
本专利中采用的酶制剂产品是通过真菌菌种经液体深层发酵纯化精制 而成，购买自sunson夏盛酶制剂有限公司。α-L-鼠李糖苷酶(α-L- rhamnosidase,EC 3.2.1.40)是一种水解酶，它主要作用于α-1,2、α-1,3、 α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键，能够水解结合于底物末端非还原性 的α-L-鼠李糖苷键，同时释放出鼠李糖和相应的配基。该酶符合GB1886. 174-2016《食品安全国家标准食品工业用酶制剂》标准。本品酶为浅黄褐 色粉末制剂，不含其它组分酶活力。本产品酶活力：见产品检验报告。酶 产品最适温度45℃--60℃，有效温度40℃--65℃。PH值：最适pH值 4.0-5.0，有效pH3.0—6.0。
(1)淫羊藿提取物的制备：取粉碎后的淫羊藿加入70％乙醇提取，料液 比为1:30，减压浓缩干燥得淫羊藿提取物；
(2)双相酶解反应：将裹有淀粉的酶/淫羊藿提取物以1:5(g/g)中，加 入三氯甲烷/缓冲液(1:10)反应体系中，固液比为1:10。震荡混匀后，进行 酶解反应。按反应时间取样检测，当朝藿定C转化率达到95％以上(原料本 身朝藿定C含量较高，所以为了数据的准确性，以朝藿定C的转化率作为 反应终点的判定)，结束反应，冷却至室温，通过分液漏斗分离出三氯甲烷相和缓冲液相，减压浓缩干燥三氯甲烷相，液相色谱检测淫羊藿苷含量。
其中转化率＝(初始原料含量-剩余反应原料含量)/原料初始含量(反 应原料指朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)；产物理论含量＝(初始原料含 量-剩余反应原料含量)/(原料分子量/目标产物分子量)。由于反应原料中本身还有一定含量的淫羊藿苷，计算产物理论含量时应再加上原料本身含有的 淫羊藿苷的含量。
各取样时间点的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量如下 表所示：
表1不同反应时点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量
| 反应时间 | 朝藿定A | 朝藿定B | 朝藿定C | 淫羊藿苷 |
| 0h | 1.31％ | 1.62％ | 12.84％ | 3.82％ |
| 6h | 0.72％ | 0.89％ | 5.74％ | 10.73％ |
| 12h | 0.21％ | 0.32％ | 0.31％ | 16.52％ |
各时间点反应原料朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及目标产 物淫羊藿苷的理论含量计算如下：
表2不同反应时间点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及转化 后的淫羊藿苷理论含量
原料中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C理论上完全转化为淫羊藿苷后， 淫羊藿苷的总含量应该为：16.9％。由上述反应数据数据可知，此实施例反 应在12h时朝藿定C的转化率为97.59％，生成的淫羊藿苷含量为16.52％， 与理论相符。
实施例2
本实施例与实施例1相比，区别仅在于去除“淀粉”这个保护剂。
(1)淫羊藿提取物的制备：取粉碎后的淫羊藿加入70％乙醇提取，料液 比为1:30，减压浓缩干燥得淫羊藿提取物；
(2)双相酶解反应：先将裹有淀粉的酶添加适量的缓冲液，在40℃水浴 锅搅拌30min后，5000rpm离心10min，以去除酶制剂中的淀粉，进行如下 反应。将酶/淫羊藿提取物以1:5(g/g)中，加入三氯甲烷/缓冲液(1:10)反 应体系中，固液比为1:10。震荡混匀后，进行酶解反应。按反应时间取样检 测，当朝藿定C转化率达到95％以上(原料本身朝藿定C含量较高，所以 为了数据的准确性，以朝藿定C的转化率作为反应终点的判定)，结束反应，冷却至室温，通过分液漏斗分离出三氯甲烷相和缓冲液相，减压浓缩干燥三 氯甲烷相，液相色谱检测淫羊藿苷含量。
其中转化率＝(初始原料含量-剩余反应原料含量)/原料初始含量(反 应原料指朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)；产物理论含量＝(初始原料含 量-剩余反应原料含量)/(原料分子量/目标产物分子量)。由于反应原料中本身还有一定含量的淫羊藿苷，计算产物理论含量时应再加上原料本身含有的 淫羊藿苷的含量。
各取样时间点的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量如下 表所示：
表1不同反应时点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量
| 反应时间 | 朝藿定A | 朝藿定B | 朝藿定C | 淫羊藿苷 |
| 0h | 1.31％ | 1.62％ | 12.84％ | 3.82％ |
| 6h | 1.02％ | 1.39％ | 9.59％ | 2.56％ |
| 12h | 0.95％ | 1.21％ | 9.78％ | 2.31％ |
各时间点反应原料朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及目标产 物淫羊藿苷的理论含量计算如下：
表2不同反应时间点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及转化 后的淫羊藿苷理论含量
原料中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C理论上完全转化为淫羊藿苷后， 淫羊藿苷的总含量应该为：16.9％。由上述反应数据数据可知，此实施例反 应在12h时朝藿定C的转化率为23.83％，生成的淫羊藿苷含量为2.31％。
本实施例与实施例1相比，由于去除了淀粉处于两相的界面对酶溶液酶活力 的保护，使得酶活下降，发现界面有酶蛋白变性后的絮状沉淀，说明酶已失 活。此时朝藿定A/B/C转化不成淫羊藿苷，因而导致淫羊藿苷含量低。
实施例3
本实施例与实施例1相比，区别仅在于使用不同的有机相。
(1)淫羊藿提取物的制备：取粉碎后的淫羊藿加入70％乙醇提取，料液 比为1:30，减压浓缩干燥得淫羊藿提取物；
(2)双相酶解反应：将裹有淀粉的酶/淫羊藿提取物以1:5(g/g)中，加 入正丁醇/缓冲液(1:10)反应体系中，固液比为1:10。震荡混匀后，进行酶解反应。按反应时间取样检测，当朝藿定C转化率达到95％以上(原料本身 朝藿定C含量较高，所以为了数据的准确性，以朝藿定C的转化率作为反 应终点的判定)，结束反应，冷却至室温，通过分液漏斗分离出正丁醇相和 缓冲液相，减压浓缩干燥正丁醇相，液相色谱检测淫羊藿苷含量。
其中转化率＝(初始原料含量-剩余反应原料含量)/原料初始含量(反 应原料指朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)；产物理论含量＝(初始原料含 量-剩余反应原料含量)/(原料分子量/目标产物分子量)。由于反应原料中本身还有一定含量的淫羊藿苷，计算产物理论含量时应再加上原料本身含有的 淫羊藿苷的含量。
各取样时间点的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量如下 表所示：
表1不同反应时点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量
| 反应时间 | 朝藿定A | 朝藿定B | 朝藿定C | 淫羊藿苷 |
| 0h | 1.31％ | 1.62％ | 12.84％ | 3.82％ |
| 6h | 1.16％ | 1.12％ | 7.43％ | 6.86％ |
| 12h | 1.05％ | 1.09％ | 7.28％ | 7.28％ |
各时间点反应原料朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及目标产 物淫羊藿苷的理论含量计算如下：
表2不同反应时间点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及转化 后的淫羊藿苷理论含量
原料中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C理论上完全转化为淫羊藿苷后， 淫羊藿苷的总含量应该为：16.9％。由上述反应数据数据可知，此实施例反 应在12h时朝藿定C的转化率为43.40％，转化率与实施例1中朝藿定C的 转化率97.59％相比，差别很大。因此有机相正丁醇与三氯甲烷相比，反应 效率极低，不符合生产需要。
实施例4
本实施例与实施例1对比，区别仅在于有机相(三氯甲烷)与水相(缓 冲液)的比例不一样。
(1)淫羊藿提取物的制备：取粉碎后的淫羊藿加入70％乙醇提取，料液 比为1:30，减压浓缩干燥得淫羊藿提取物；
(2)双相酶解反应：将酶/淫羊藿提取物以1:5(g/g)中，加入三氯甲烷 /缓冲液(1:5)反应体系中，固液比为1:10。震荡混匀后，进行酶解反应。 按反应时间取样检测，当朝藿定C转化率达到95％以上(原料本身朝藿定C 含量较高，所以为了数据的准确性，以朝藿定C的转化率作为反应终点的判 定)，结束反应。冷却至室温，通过分液漏斗分离出乙酸乙酯相和缓冲液相，减压浓缩干燥乙酸乙酯相，液相色谱检测淫羊藿苷含量。
其中转化率＝(初始原料含量-剩余反应原料含量)/原料初始含量(反 应原料指朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)；产物理论含量＝(初始原料含 量-剩余反应原料含量)/(原料分子量/目标产物分子量)。由于反应原料中本身还有一定含量的淫羊藿苷，计算产物理论含量时应再加上原料本身含有的 淫羊藿苷的含量。
各取样时间点的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量如下 表所示：
表1不同反应时点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量
| 反应时间 | 朝藿定A | 朝藿定B | 朝藿定C | 淫羊藿苷 |
| 0h | 1.3％ | 1.6％ | 12.84％ | 3.8％ |
| 6h | 0.81％ | 1.35％ | 9.54％ | 7.23％ |
| 12h | 0.52％ | 0.63％ | 5.54％ | 11.32％ |
| 24h | 0.17％ | 0.32％ | 0.64％ | 10.75％ |
各时间点反应原料朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及目标产 物淫羊藿苷的理论含量计算如下：
表2不同反应时间点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及转化 后的淫羊藿苷理论含量
朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C理论上完全转化为淫羊藿苷后，淫羊藿 苷的总含量应该为：16.9％。分析12h和24h数据可知，12h淫羊藿苷含量 为11.32％；24h淫羊藿苷含量为10.75％，并未达到预期理论值。但是从12h-24h 随着反应原料的减少，尤其是朝藿定C转化率为95.02％时，反应产物淫羊 藿苷含量并未增加，说明随着反应时间的延长，生成的淫羊藿苷发生降解。
实施例5
本实施例与实施例1相比，区别仅在于固相(酶、淫羊藿提取物)与液 相(三氯甲烷、缓冲液)比例不一样。
(1)淫羊藿提取物的制备：取粉碎后的淫羊藿加入70％乙醇提取，料液 比为1:30，减压浓缩干燥得淫羊藿提取物；
(2)双相酶解反应：将酶/淫羊藿提取物以1:10(g/g)(其中酶的比活 力为50000活力单位/g)的固相比加入三氯甲烷/缓冲液(1:10)反应体系中， 固液比为1:5。震荡混匀后，进行酶解反应。按反应时间取样检测，当朝藿 定C转化率达到95％以上(原料本身朝藿定C含量较高，所以为了数据的准确性，以朝藿定C的转化率作为反应终点的判定)，结束反应。冷却至室 温，通过分液漏斗分离出乙酸乙酯相和缓冲液相，减压浓缩干燥乙酸乙酯相， 液相色谱检测淫羊藿苷含量。
其中转化率＝(初始原料含量-剩余反应原料含量)/原料初始含量 (反应原料指朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)；产物理论含量＝(初始原 料含量-剩余反应原料含量)/(原料分子量/目标产物分子量)。由于反应原料 中本身还有一定含量的淫羊藿苷，计算产物理论含量时应再加上原料本身含 有的淫羊藿苷的含量。
各取样时间点的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量如下 表所示：
表1不同反应时点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量
| 反应时间 | 朝藿定A | 朝藿定B | 朝藿定C | 淫羊藿苷 |
| 0h | 1.3％ | 1.6％ | 12.84％ | 3.8％ |
| 6h | 1.11％ | 1.32％ | 10.62％ | 6.13％ |
| 12h | 0.62％ | 0.53％ | 7.32％ | 8.72％ |
| 24h | 0.34％ | 0.35％ | 0.61％ | 8.43％ |
各时间点反应原料朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及目标产 物淫羊藿苷的理论含量计算如下：
表2不同反应时间点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及转化 后的淫羊藿苷理论含量
朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C理论上完全转化为淫羊藿苷后，淫羊 藿苷的总含量应该为：16.9％。分析12h和24h数据可知，12h淫羊藿苷含 量为8.72％；24h淫羊藿苷含量为8.43％，并未达到预期理论值，但是此时 朝藿定C的转化率为95.25％。这说明，反应时间12h-24h之间生成的淫羊 藿苷随着时间的延长发生了降解。
实施例6
本实施例与实施例1相比区别在于酶/淫羊藿提取物的固相用量比例不 一样。
(1)淫羊藿提取物的制备：取粉碎后的淫羊藿加入70％乙醇提取，料液 比为1:30，减压浓缩干燥得淫羊藿提取物；
(2)双相酶解反应：将酶/淫羊藿提取物以1:10(g/g)中，加入三氯甲 烷/缓冲液(1:10)反应体系中，固液比为1:10(g/mL)。震荡混匀后，进行 酶解反应。按反应时间取样检测，当朝藿定C转化率达到95％以上(原料本 身朝藿定C含量较高，所以为了数据的准确性，以朝藿定C的转化率作为 反应终点的判定)，结束反应。冷却至室温，通过分液漏斗分离出乙酸乙酯相和缓冲液相，减压浓缩干燥乙酸乙酯相，液相色谱检测淫羊藿苷含量。
其中转化率＝(初始原料含量-剩余反应原料含量)/原料初始含量 (反应原料指朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C)；产物理论含量＝(初始原 料含量-剩余反应原料含量)/(原料分子量/目标产物分子量)。由于反应原料 中本身还有一定含量的淫羊藿苷，计算产物理论含量时应再加上原料本身含 有的淫羊藿苷的含量。
各取样时间点的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量如下 表所示：
表1不同反应时点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C以及淫羊藿苷含量
| 反应时间 | 朝藿定A | 朝藿定B | 朝藿定C | 淫羊藿苷 |
| 0h | 1.3％ | 1.6％ | 12.84％ | 3.8％ |
| 6h | 1.14％ | 1.22％ | 10.32％ | 6.42％ |
| 12h | 0.55％ | 0.72％ | 6.73％ | 10.12％ |
| 24h | 0.32％ | 0.43％ | 0.40％ | 10.72％ |
各时间点反应原料朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及目标产 物淫羊藿苷的理论含量计算如下：
表2不同反应时间点朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C的转化率以及转化 后的淫羊藿苷理论含量
朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C理论上完全转化为淫羊藿苷后，淫羊藿 苷的总含量应该为：16.9％。分析12h和24h数据可知，12h淫羊藿苷含量 为10.12％，与理论值基本相符；24h淫羊藿苷含量为10.72％，并未达到预期 理论值。而此时朝藿定C的转化率已经达到了96.88％这说明反应时间超过 12h后，生成的淫羊藿苷发生了降解。
按照实施例1的反应条件进行不同时间取样，真空干燥后，用高效液相 色谱检测反应产物的含量，其色谱图如图2所示，朝藿定A、朝藿定B、朝 藿定C的保留时间分别为11.2min、11.9min、12.2min，淫羊藿苷的保留时间 为13.1min。可以看出，随着反应时间的延长，原料中的朝藿定A、朝藿定 B、朝藿定C逐渐减少，尤其表现在朝藿定C上，反应时间为12h时，淫羊 藿苷的含量为16.52％，朝藿定C的转化率为97.59％。
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限 于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、 指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和 在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形 式，这些均属于本发明保护之列。
Claims (4)
1.一种利用双相酶促反应制备淫羊藿苷的方法，该反应使用酶将淫羊藿提取物中的朝藿定A/B/C转化为酶解产物淫羊藿苷，其步骤包括：
-制备淫羊藿提取物的步骤；
-进行双相酶促反应的步骤，其中，在双相酶促反应中，第一相为缓冲液相，且第一相对于朝藿定A/B/C具有良好的溶解性，而第二相为有机相，且第二相对于淫羊藿苷具有良好的溶解性；
-从第二相分离纯化出产物淫羊藿苷的步骤；
其中，用于该双相酶促反应的酶包裹有非水溶性淀粉，使得所述酶在该双相酶促反应进行时处于第一相和第二相的相界面处；
所述双相酶促反应中的酶为鼠李糖苷酶；
其中，所述有机相为三氯甲烷；所述缓冲液相为磷酸盐缓冲液；
其中，所述酶促反应进行的条件为：使用比活力为50000活力单位/g的酶以及酶/淫羊藿提取物为1:10(g/g)的固相质量比，在55℃下反应12h；
其中，在对产物淫羊藿苷分离纯化的步骤中，使用分液漏斗或蠕动泵分离第一相和第二相，并对第二相浓缩干燥以得到产物淫羊藿苷；
其中，在所述双相酶促反应进行期间对反应体系进行震荡或搅拌。
2.如权利要求1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，在制备淫羊藿提取物的步骤中，取粉碎后的淫羊藿加入70％的乙醇提取，淫羊藿和乙醇的质量比为1:30，然后减压浓缩干燥得淫羊藿提取物。
3.如权利要求1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述有机相为三氯甲烷且有机相与缓冲液相的比例为1:10。
4.如权利要求1所述的制备淫羊藿苷的方法，其中，所述磷酸盐缓冲液浓度为10mM-100mM；缓冲液的pH值为4-6。
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