CN110656102A - β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法 - Google Patents

β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，包括以下步骤：将预处理好的大孔树脂置于容器中，向容器中加入PBS缓冲液，平衡后再加入β‑葡萄糖苷酶原溶液，然后将容器置于恒温振荡培养箱中振荡吸附，吸附结束后，将大孔树脂与剩余液体分离，用PBS缓冲液将分离后的大孔树脂冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后再加入PBS缓冲液和戊二醛试剂进行交联，交联结束后，用PBS缓冲液清洗大孔树脂数次，减压干燥后即得β‑葡萄糖苷酶固定化酶。本发明的有益之处在于：该制备方法不仅工艺简单、成本低廉，而且制备得到的β‑葡萄糖苷酶固定化酶在使用过程中稳定性好、催化效率高、可重复和连续利用。

Description

β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种固定化酶的制备方法，具体涉及β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)又称β-D-葡萄糖苷水解酶，又名纤维二糖酶、龙胆酸酶和杏仁糖酶，其英文名称是β-glucosidase，属于水解酶类。
β-葡萄糖苷酶是一种普遍存在的酶，在苦杏仁汁中最早被发现，这种酶广泛分布于细菌、真菌和植物中，是芳香前体物质水解、结合态糖苷配基释放的有效催化剂，是一类可以催化水解芳香基或烃基与糖基之间糖苷键的酶，其广泛应用于医疗、食品、生物质转化等各个领域，也作为工业食品和生物加工应用的高稳定性和活性催化剂。
β-葡萄糖苷酶虽然具有催化效率高、专一性强、不污染环境等优点，但是其价格昂贵、稳定性差、不易回收，这些问题制约了该酶在工业上的广泛应用。
应用酶的固定化技术，将酶固定于固体载体上，使酶能够进行重复回收利用，由于能够保护酶的催化基团，进而保留酶的催化活性。相对于游离酶，固定化酶具有稳定性好、易与底物和产物分离、催化反应容易控制、可以反复连续使用等优点，可以降低酶催化成本，在工业生产中应用广泛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，该制备方法不仅工艺简单、成本低廉，而且制备得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶在使用过程中稳定性好、催化效率高、可重复和连续利用。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：将预处理好的大孔树脂置于容器中，向容器中加入PBS缓冲液，平衡后再加入β-葡萄糖苷酶原溶液，然后将容器置于恒温振荡培养箱中振荡吸附；
Step2：吸附结束后，将大孔树脂与剩余液体分离，用PBS缓冲液将分离后的大孔树脂冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后再加入PBS缓冲液和戊二醛试剂进行交联；
Step3：交联结束后，用PBS缓冲液清洗大孔树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶于4℃贮存备用。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step1中，前述大孔树脂选用的是带有伯胺基团的弱碱性阴离子交换树脂。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，前述带有伯胺基团的弱碱性阴离子交换树脂选用的是D315树脂或D914树脂。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在100mL磷酸盐反应体系中，D315树脂或D914树脂的加入量为0.1-0.4g。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step1中，前述恒温振荡培养箱的温度为常温，振荡时间为4-8h。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step2中，前述大孔树脂与戊二醛的用量比为100-500g：1mL。
前述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step2中，交联反应温度为30-40℃，反应时间为0.5-2h。
本发明的有益之处在于：
(1)利用先吸附后交联的方法，即先通过静电引力作用将β-葡萄糖苷酶吸附在大孔树脂表面，再通过戊二醛交联形成β-葡萄糖苷酶固定化酶，制备得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶在使用过程中稳定性好、催化效率高、可重复和连续利用，从而可以有效地降低工业成本；
(2)利用先吸附后交联的方法，工艺简单、成本低廉。
附图说明
图1是β-葡萄糖苷酶游离酶和固定化酶的温度稳定性曲线；
图2是β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能图；
图3是β-葡萄糖苷酶固定化酶的酶活力曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1
称取0.05g预处理好的D315树脂置于锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入49mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液，平衡后再加入1mLβ-葡萄糖苷酶原溶液，然后将锥形瓶置于恒温振荡培养箱中，常温振荡吸附8h。
将吸附完毕的D315树脂与剩余液体分离，将剩余液体于280nm下测OD值，计算其吸附量，将吸附完毕的D315树脂用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后加20mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液和1mL浓度为0.05％(v/v)的戊二醛试剂进行交联，交联反应温度为35℃，反应时间为1h。
交联结束后，用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液清洗D315树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶贮存于4℃备用。
实施例2
称取0.1g预处理好的D914树脂置于锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入39mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液，平衡后再加入0.5mLβ-葡萄糖苷酶原溶液，然后将锥形瓶置于恒温振荡培养箱中，常温振荡吸附6h。
将吸附完毕的D914树脂与剩余液体分离，将剩余液体于280nm下测OD值，计算其吸附量，将吸附完毕的D914树脂用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后加20mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液和1mL浓度为0.02％(v/v)的戊二醛试剂进行交联，交联反应温度为40℃，反应时间为2h。
交联结束后，用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液清洗树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶贮存于4℃备用。
实施例3
称取0.2g预处理好的D315树脂置于锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入49mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液，平衡后再加入2mLβ-葡萄糖苷酶原溶液，然后将锥形瓶置于恒温振荡培养箱中，于常温振荡吸附4h。
将吸附完毕的D315树脂与剩余液体分离，将剩余液体于280nm下测OD值，计算其吸附量，将吸附完毕的D315树脂用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后加40mL浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液和2mL浓度为0.02％(v/v)的戊二醛试剂进行交联，交联反应温度为30℃，反应时间为0.5h。
交联结束后，用浓度为0.05mol/L、pH＝8.0的PBS缓冲液清洗树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶贮存于4℃备用。
对β-葡萄糖苷酶固定化酶的热稳定性进行研究
取β-葡萄糖苷酶游离酶和实施例1制得的β-葡萄糖苷酶固定化酶，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保温30min，然后分别测定酶活力，以最高活力为100％，做β-葡萄糖苷酶固定化酶和游离酶的温度稳定性曲线，得到的曲线如图1所示。
由图1可知，在40℃-50℃温度范围内，β-葡萄糖苷酶游离酶的温度稳定性略高于β-葡萄糖苷酶固定化酶的温度稳定性，但在60℃以后，β-葡萄糖苷酶游离酶的温度稳定性远远低于β-葡萄糖苷酶固定化酶的温度稳定性。这说明：在高温环境中，β-葡萄糖苷酶固定化酶比β-葡萄糖苷酶游离酶更加稳定，更耐受高温环境。
对β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能进行研究
取实施例2制得的β-葡萄糖苷酶固定化酶，测定酶活力，然后按照1:1的质量比向β-葡萄糖苷酶固定化酶中添加底物pNPG，反应10min，反应完毕后，冲洗干净酶，第2次测定酶活力，之后再按照1:1的质量比向β-葡萄糖苷酶固定化酶中添加底物pNPG，再反应10min，反应结束后再测定酶活力，如此重复操作多次，测定10次酶活力，以第1次测得的酶活力值为100％，作β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能图，得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶的重复使用性能图如图2所示。
由图2可知，固定后的酶——β-葡萄糖苷酶固定化酶在连续使用6次后，酶活力基本稳定，变化不大，在连续使用10次后，酶活性仍能保持在50％以上。
这说明：固定化载体与酶的结合比较稳定且不容易脱落，且酶活性保持稳定，β-葡萄糖苷酶固定化酶可重复和连续利用。
β-葡萄糖苷酶固定化酶对实际样品——沙棘汁的生物转化效果的研究
将实施例3制得的β-葡萄糖苷酶固定化酶置于填充床反应器中，然后将沙棘汁也置于同一个填充床反应器中，在室温下，使沙棘汁在填充床反应器中进行连续反应，调整沙棘液的流速为2mL/10min，然后每10min收集1次酶解产物，连续操作1000min(相当于重复使用100次β-葡萄糖苷酶固定化酶)，之后测定酶解产物中还原糖的含量，并换算成β-葡萄糖苷酶固定化酶的酶活力，评价β-葡萄糖苷酶固定化酶对实际样品——沙棘汁的生物转化效果，具体的，以第1次测得的酶活力值为100％，以柱体积为横坐标，以相对酶活力为纵坐标，作β-葡萄糖苷酶固定化酶的酶活力曲线图，得到的酶活力曲线图如图3所示。
由图3可知，采用本发明提供的方法制备得到的β-葡萄糖苷酶固定化酶随反应时间的延长，酶活力在一定范围内呈小幅下降，但总体趋于稳定，且酶活较高，催化效率较高。
综上所述，采用本发明提供的方法制备得到的β-葡萄糖固定化酶稳定性好、易与底物分离、催化反应易于控制、可以多次重复利用，从而可以有效地降低工业成本。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：将预处理好的大孔树脂置于容器中，向容器中加入PBS缓冲液，平衡后再加入β-葡萄糖苷酶原溶液，然后将容器置于恒温振荡培养箱中振荡吸附；
Step2：吸附结束后，将大孔树脂与剩余液体分离，用PBS缓冲液将分离后的大孔树脂冲洗至冲洗液中检测不到蛋白，然后再加入PBS缓冲液和戊二醛试剂进行交联；
Step3：交联结束后，用PBS缓冲液清洗大孔树脂数次，减压干燥后即得β-葡萄糖苷酶固定化酶，将β-葡萄糖苷酶固定化酶于4℃贮存备用。
2.根据权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step1中，所述大孔树脂选用的是带有伯胺基团的弱碱性阴离子交换树脂。
3.根据权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，所述带有伯胺基团的弱碱性阴离子交换树脂选用的是D315树脂或D914树脂。
4.根据权利要求3所述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在100mL磷酸盐反应体系中，D315树脂或D914树脂的加入量为0.1-0.4g。
5.根据权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step1中，所述恒温振荡培养箱的温度为常温，振荡时间为4-8h。
6.根据权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step2中，所述大孔树脂与戊二醛的用量比为100-500g：1mL。
7.根据权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶固定化酶的制备方法，其特征在于，在Step2中，交联反应温度为30-40℃，反应时间为0.5-2h。
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