MX2010011797A - Proceso de fermentacion mejorado el cual usa melazas. - Google Patents

Abstract

Se describen en la presente composiciones y métodos para fermentación mejorada de melazas usando transglucosidasa.

Description

PROCESO DE FERMENTACION MEJORADO EL CUAL USA MELAZAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos para utilizar por lo menos una enzima transglucosidasa para incrementar la cantidad de azúcares fermentables en procesos de fermentación de melazas. La enzima transglucosidasa puede ser usada sola o en combinación con otras enzimas de procesamiento de carbohidratos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las melazas se refieren típicamente a un subproducto a partir de la caña de azúcar y el procesamiento de remolacha. ,Las melazas se producen globalmente en cantidades muy grandes. Por ejemplo, en el año 2005, se estimó la producción de melazas globalmente en 50.7 millones de toneladas. Aproximadamente 48% de las melazas totales se produce en Asia, y la parte principal de esto se produce en India, China y Tailandia. Las melazas producidas de la caña y remolachas cada una tiene una composición de azúcar similar. Ambos tipos de melazas contienen tanto azúcares fermentables y no fermentables. Sin embargo, las melazas de remolacha contienen una concentración menor de azúcares fermentables y una concentración superior de azúcares no fermentables que las melazas de caña. Las fermentaciones industriales usan predominantemente la glucosa y la sacarosa como alimentación REF.:214333 para la producción de una multitud de proteínas, enzimas, aminoácidos, alcoholes, ácidos orgánicos, farmacéuticos y otros bioquímicos. Sin embargo, en muchas aplicaciones, las melazas pueden también ser usadas en fermentaciones.

Típicamente, la composición total de las melazas a partir de la caña de azúcar o azúcar de remolacha (azúcares, proteínas, etc) contiene cantidades significativas de proteínas, almidón no fermentable y oligosacáridos no fermentables como la rafinosa, un trisacárido (galactosil-glucosil-fructosa) , y estaquiosa, un tetrasacárido (galactosil-galactosil-glucosil-f uctosa) . Estos azúcares no fermentables no pueden ser usados en el proceso de fermentación ya que las enzimas usadas en procesos previos no han hidrolizado la rafinosa y estaquiosa a azúcares fermentables. Mientras que la alfa-galactosidasa, se reporta para tener la capacidad de hidrolizar azúcares no fermentables (Ver por ejemplo, Suzuki et al., USP 3,767,526, 1973; y Meguro et al, USP, 4,036,694, 1977), no hidroliza la rafinosa y estaquiosa. La dextranasa es usada también para hidrolizar dextrinas en soluciones de azúcar (Murtaugh, J. E., 1999 Molasses as a feedstock for alcohol production. In: The Alcohol Textbook, 3rd Ed. K.A. Jacques, T.P. Lyons and D.R. Kelsall, eds . Nottingharn University Press, UK) pero solamente trabajan en dextrinas de cadena corta y no hidrolizan azúcares no fermentables. De esta forma, se necesitan mejores métodos para mejorar la fermentación de melazas .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona procesos novedosos para incrementar el rendimiento de fermentación de melazas usando una transglucosidasa durante o antes a la fermentación. Los procesos se basan en el descubrimiento sorprendente que la adición de una enzima transglucosidasa a fermentaciones de melazas incrementan el rendimiento de alcohol . Pruebas adicionales muestran inesperadamente que la transglucosidasa hidroliza los azúcares no fermentables en melazas, tales como rafinosa y estaquiosa. Esto es inesperado ya que las transglucosidasas son generalmente conocidas para convertir los malto-oligosacáridos en isomalto-oligosacáridos tales como isomaltosa y panosa los cuales son menos fermentables. De esta forma, no se espera que la adición de una transglucosidasa a melazas pueda resultar en hidrólisis de rafinosa y estaquiosa (tri-sacáridos) ni se espera que puedan ser hidrolizadas a monosacáridos fermentables.

De esta forma, las modalidades del proceso incluyen métodos para poner en contacto las melazas en un medio de fermentación o reacción de fermentación con composiciones de enzima que incluyen por lo menos una transglucosidasa lo cual resulta en la hidrólisis de azúcares no fermentables como rafinosa y estaquiosa. El método puede también incluir la adición de enzimas secundarias para hidrolizar, por ejemplo, almidón granular, proteínas y almidón residual en melazas. La invención también se relaciona a la conversión de los azúcares fermentables a partir de melazas para obtener productos finales, tales como alcohol (por ejemplo, etanol) , ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido láctico o ácido cítrico), y especialmente bioquímicos (por ejemplo, aminoácidos, glutamato monosódico, etc.) .

Algunos aspectos de la invención incluyen métodos para incrementar los azúcares fermentables en melazas por poner en contacto las melazas con por lo menos una enzima transglucosidasa para obtener azúcares fermentables. Lós métodos pueden también incluir fermentar los azúcares fermentables a productos finales en la presencia de microorganismos de fermentación. El poner en contacto y fermentar pueden ocurrir simultáneamente o el estar en contacto puede ser un pretratamiento. En algunas modalidades, los oligosacáridos no fermentables son rafinosa y/o estaquiosa. En algunas modalidades, las melazas comprenden un almidón no fermentable, por ejemplo, un almidón granular y el estar en contacto, pretratamiento y/o fermentación ocurre en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización del almidón no fermentable (por ejemplo, almidón granular) . En algunas modalidades, los métodos también incluyen poner en contacto las melazas con por lo menos una enzima que hidroliza el almidón granular (GSHE por sus siglas en inglés) . La GSHE puede ser una alfa amilasa o una glucoamilasa. En algunas modalidades, los métodos además comprenden poner en contacto las melazas con por lo menos una alfa amilasa y por lo menos una glucoamilasa, en donde por lo menos una alfa amilasa y/o la glucoamilasa tiene actividad de hidrolización de almidón granular. En algunas modalidades, los métodos además comprenden poner en contacto las melazas con por lo menos otra enzima, como las hemicelulasas , una celulasa, una pectinasa, una proteasa (por ejemplo, una proteasa fúngica ácida) , beta-glucosidasa, una alfa amilasa no GSHE, y/o una glucoamilasa no GSHE. En algunas modalidades, la proteasa fúngica ácida es de las especies Aspergillus o Trichoderma. En algunas modalidades, los métodos incluyen poner en contacto las melazas con una alfa amilasa la cual tiene actividad GSH, una GA la cual tiene actividad GSH, una hemicelulasa, y una proteasa fúngica ácida. En algunas modalidades, la fermentación y/o pretratamiento ocurren en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular en melazas. En algunas modalidades, la temperatura de poner en contacto y/o de pretratamiento está abajo de aproximadamente 52 °C. en algunas modalidades, la temperatura de poner en contacto y/o pretratamiento está abajo de aproximadamente 80°C. En algunas modalidades, la temperatura de fermentación es de aproximadamente 15 a 40°C. En algunas modalidades, la temperatura de fermentación, el poner en contacto y de pretratamiento es de aproximadamente 15 a 40°C. En algunas modalidades el poner en contacto y/o pretratamiento es realizado en un pH de aproximadamente 2.0 a 7.0 o alternativamente 3.5 a 7. En algunas modalidades la fermentación se realiza en un pH de aproximadamente 2.0 a 7.0 o alternativamente 3.5 a 7.0.

Aspectos adicionales de la invención son métodos para producir etanol a partir de melazas, por poner en contacto las melazas con por lo menos una enzima transglucosidasa y fermentar las melazas en la presencia de un organismo de fermentación para producir etanol. En algunas modalidades, el poner en contacto y fermentación ocurren simultáneamente. En algunas modalidades el poner en contacto ocurre como un pretratamiento. En algunas modalidades, el poner en contacto, fermentación y/o pretratamiento ocurre en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización de almidón del almidón granular en las melazas. En algunas modalidades, el pretratamiento ocurre en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular en las melazas, pero en una temperatura más cercana a la temperatura óptima para la transglucosidasa y/u otras enzimas usadas en el proceso. Aspectos adicionales de la invención son composiciones de azúcares fermentables hechas por los métodos descritos anteriormente.

Aspectos adicionales de la invención incluyen el uso de por lo menos una transglucosidasa para incrementar los azúcares fermentables en melazas. En algunas modalidades el uso además comprende fermentar los azúcares fermentables para producir etanol. En algunas modalidades por lo menos una GSHE es incluida tal como una alfa-amilasa y/o glucoamilasa .

Aspectos adicionales de la invención son composiciones para fermentación de melazas, las cuales comprenden por lo menos una transglucosidasa en una cantidad efectiva para hidrolizar la rafinosa y/o estaquiosa en las melazas. En algunas modalidades, la composición también incluye por lo menos una GSHE. En algunas modalidades, la por lo menos GSHE es una glucoamilasa y/o una alfa amilasa. En algunas modalidades, la composición además comprende por lo menos otra enzima elegida de: una celulasa, una beta-glucosidasa, una beta-glucanasa, una proteasa fúngica ácida, una dextrinasa y una alfa-galactosidasa . En algunas modalidades, la composición comprende por lo menos una TG, una alfa amilasa, hemicelulasas , glucoamilasa y proteasa fúngica ácida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1A es un diagrama de la reacción química que toma lugar para producir el cromatograma en la Figura IB. La Figura IB es un cromatograma HPLC de rafinosa incubada con transglucosidasa L-500, pH 4.5, 60°C.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA- INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento que la transglucosidasa hidroliza azúcares no fermentables en azúcares fermentables. Esto es identificado cuando una variedad de enzimas son probadas en melazas para la capacidad para incrementar el rendimiento de alcohol en fermentaciones de melazas. Mientras que algunas enzimas que son probadas incrementan el rendimiento de alcohol moderadamente, la adición de TRANSGLUCOSIDASE L-500 (un producto comercial de Danisco US, Inc., Genencor División) a la fermentación, resulta en un incremento significativo en el rendimiento del alcohol. Pruebas adicionales en · la presente muestran que la transglucosidasa es capaz de hidrolizar oligosacáridos no fermentables como la rafinosa y estaquiosa en azúcares fermentables. Esto es inesperado ya que las transglucosidasas son generalmente conocidas para convertir los malto-oligosacáridos en isomalto-oligosacáridos como la isomaltosa y panosa las cuales son menos fermentables. De esta forma, no se espera que la adición de una transglucosidasa a melazas puede resultar en hidrólisis de rafinosa y estaquiosa (tri-sacáridos) ni se espera que puedan ser hidrolizadas a monosacáridos fermentables.

La invención proporciona procesos novedosos para incrementar el rendimiento de fermentación de melazas usando una transglucosidasa durante o antes a la fermentación. Algunas modalidades del proceso incluyen métodos para poner en contacto las melazas con una composición de enzimas o mezcla la cual incluye por lo menos una transglucosidasa. En algunas modalidades, esto resulta en la hidrólisis de azúcares no fermentables como rafinosa y estaquiosa en azúcares fermentables. En algunas modalidades, el poner en contacto ocurre en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización de almidón del almidón granular en las melazas. El método puede también incluir la adición de enzimas secundarias para hidrolizar, por ejemplo, almidón granular, proteínas y almidón residual en melazas. La invención también se relaciona a la conversión de los azúcares fermentables a partir de melazas para obtener productos finales, como alcohol (por ejemplo, etanol) , ácidos orgánicos (ácido láctico, ácido cítrico) y especialmente bioquímicos (aminoácidos, glutamato monosódico, etc) .

Como se muestra en los ejemplos en la presente, el descubrimiento inicial de que la transglucosidasa incrementa el rendimiento de etanol en fermentación de melazas puede ser explicado por la hidrólisis de rafinosa y estaquiosa (dos azúcares no fermentables en las melazas) en azúcares fermentables. Además, otras enzimas de hidrolización de almidón, tales como enzimas de hidrolización de almidón sin purificar a la fermentación de levadura de melazas también incrementan la cantidad de azúcares fermentables en el proceso. Por ejemplo, la adición , de alfa amilasa y glucoamilasa con propiedades de hidrolización de almidón granular (GSHE) también produce más azúcares fermentables. Las enzimas secundarias, como las proteasas también mejoran la fermentación. Por ejemplo, la proteasa fúngica ácida (FERMGEN™, GC 106 de Danisco US, Inc., Genencor División), se encuentra para mejorar efectivamente la fermentación por hidrolizar la proteína en melazas, produciendo nitrógeno de amino libre (FAN por sus siglas en inglés) y péptidos funcionales los cuales incrementan la disponibilidad de nitrógeno y mejora el crecimiento de levadura. Las enzimas como las celulasas, hemicelulasas , beta-glucosidasas , beta-glucanasas, dextranasas y pectinasas pueden también ser usadas en la hidrólisis de polisacáridos sin almidón y goma en melazas. La presente invención proporciona métodos y composiciones para mejorar el rendimiento y eficiencia de fermentaciones de melazas a etanol .

En algunas modalidades, el método implica incubar y/o fermentar la melaza en una temperatura que conduce a la fermentación por un organismo de fermentación (por ejemplo, 28-38°C) en la presencia de transglucosidasa , lo cual resulta en un rendimiento de fermentación superior que una fermentación sin la transglucosidasa. En algunas modalidades, la temperatura está abajo de la temperatura de gelatinización de almidón del almidón granular en las melazas. En otras modalidades las enzimas secundarias pueden ser incluidas, como las GSHE, proteasas, pectinasas, beta-glucanasas , xilanasas y celulasas con por lo menos una transglucosidasa . En algunas modalidades, la transglucosidasa y opcionalmente por lo menos una enzima secundaria se agrega en una etapa de pretratamiento y entonces se realiza la fermentación.

Definiciones A menos que se indique de otra forma, la práctica de la invención implica técnicas convencionales usadas comúnmente en biología molecular, modificación de proteínas, técnicas de ADN recombinantes , microbiología, biología celular, cultivo celular, biología transgénica, inmunología, y purificación de proteína, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Las técnicas son conocidas para aquellos de experiencia en la técnica y están descritas en numerosos textos y palabras de referencia. Todas las patentes, solicitudes de patente, artículos y publicaciones mencionados en la presente, tanto supra e infra, son expresamente incorporadas en la presente para referencia.

A menos que se defina de otra forma en la presente, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes para aquellos descritos en la presente pueden ser usados en la práctica o prueba de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Por consiguiente, los términos definidos inmediata y posteriormente son más totalmente descritos por referencia a la especificación como un todo. También, como se usa en la presente, el singular "un", "una", "uno" y "el, la" incluye la referencia plural a' menos que el contexto indique claramente otra cosa. Los intervalos numéricos son inclusive de los números que definen el intervalo. De esta forma, por ejemplo, con referencia a una composición la cual contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos . Debe también ser notado que el término "o" es generalmente empleado en su sentido el cual incluye "y/o" a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. A menos que se indique de otra forma los aminoácidos son escritos de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi , respectivamente. Es para ser entendido que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos ya que estos pueden variar, dependiendo del contexto en que son usados por aquellos de experiencia en la técnica. Adicionalmente, los títulos proporcionados en la presente no son limitaciones de los varios aspectos o modalidades de la invención los cuales pueden ser tenidos por referencia a la especificación como un todo. Por consiguiente los términos definidos inmediata y posteriormente son más totalmente definidos por referencia a la especificación como, un todo. Sin embargo, con el fin de facilitar el entendimiento de la invención, un número de términos son definidos posteriormente. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la presente especificación y reivindicaciones.

Como se usa en la presente, "melazas se refiere a un jarabe producido como un producto secundario del procesamiento de caña de azúcar u otros productos vegetales . Hay muchos tipos de melazas, incluyendo por ejemplo, melazas de Blackstrap, un producto secundario de producción de azúcar a partir de caña de azúcar; melazas de alta prueba (caña) , un producto primario extraído a partir de la caña de azúcar; melazas de caña refinada, un producto secundario de la refinación del azúcar morena sin purificar para producir azúcar blanca; melazas de remolacha, un producto secundario de producción de azúcar a partir de remolachas de azúcar, y melazas cítricas; jugos extraídos de la fabricación de pulpa de cítricos secos, por nombrar unos cuantos.

Como se usa en la presente, "azúcares fermentables" son azúcares que pueden ser digeridos por organismos de fermentación (por ejemplo levadura) . Algunos ejemplos de azúcares fermentables incluyen fructosa, maltosa, glucosa, sacarosa y galactosa.

Como se usa en la presente "Azúcares no fermentables" son azúcares que no pueden ser digeridos directamente por organismos de fermentación (por ejemplo, levadura) . Algunos ejemplos de azúcares no fermentables incluyen rafinosa y estaquiosa.

Como se usa en la presente "alfa amilasas son alfa-1, 4 -glucan-4 -glucanohxdrolasas (E.C. 3.2.1.1) y tienen la capacidad para escindir o hidrolizar los enlaces alfa-1,4-glicosídicos internos en el almidón (por ejemplo, polímeros de amilopectina o amilosa) .

Las "dextrinas" son usadas en la presente para referirse a polímeros de cadena corta de glucosa (por ejemplo, 2 a 10 unidades) .

Como se usa en la presente el término "almidón" se refiere a cualquier material el cual comprende los carbohidratos de polisacárido complejos de plantas, que comprenden amilosa y amilopectina con la fórmula (C6Hi0O5)x, en donde x puede ser cualquier número.

Como se usa en la presente, el término "almidón granular" significa almidón sin purificar, es decir, almidón el cual no ha sido sujeto a temperaturas de gelatinización.

Como se usa en la presente, los términos "enzima de hidrolización de almidón granular (GSH) (GSHE)" y "enzimas que tienen actividad de hidrolización de almidón granular (GSH) se refieren a enzimas las cuales tienen la capacidad para hidrolizar el almidón en forma granular.

Como se usa en la presente, el término "glucoamilasa (por ejemplo E.C. 3.2.1.3.)" se refiere a cualquier enzima que es capaz de catalizar la liberación de D-glucosa a partir de los extremos no reductores de almidón y oligo y polisacáridos relacionados.

Como se usa en la presente, el término "transglucosidasa" se refiere a enzimas que son capaces de realizar las reacciones de transferencia de glicosilo. Las transglucosidasas pueden ser divididas en alfa-1,6, alfa-1,4, alfa-1,3, alfa- 1 , 2 -glicosil transíerasas . Algunas transglucosidasas son D-glucosiltransferasas (ver por ejemplo, E.C. 2.4.1) y catalizan tanto las reacciones de transferencia y algunas hidrolíticas en incubación con alfa-D-gluco-malto-oligosacáridos . La transferencia ocurre más frecuentemente para HO-6, la cual produce isómaltosa a partir de D-gucosa, y panosa a partir de maltosa. La enzima puede también formar kojibiosa o nigerosa o maltosa. Como un resultado de las reacciones de transglucosidasa, los malto- oligosacáridos son convertidos a isomalto-oligosacáridos lo cual resulta en una nueva clase de polisacáridos los "cuales contienen altas proporciones de residuos de glucosilo enlazados por un enlace alfa-D-1,6 a partir del extremo no reducto .

Como se usa en la presente, el término "oligosacáridos" se refiere a cualquier compuesto el cual tiene 2 a 10 unidades de monosacárido unidas en enlaces glicosídicos . Estos polímeros de cadena corta de azúcares simples incluyen dextrinas .

Como se usa en la presente, el término "DE" o "equivalente de dextrosa" es un estándar industrial para medir la concentración de azúcares reductores totales, calculados como D-glucosa en una base de peso seco. El almidón granular no hidrolizado tiene un DE que es esencialmente 0 y D-glucosa tiene un DE de 100.

Como se usa en la presente, el término "jarabe de glucosa" se refiere a una composición acuosa la cual contiene glucosa. El jarabe de glucosa tendrá típicamente un DE de por lo menos 20. En algunas modalidades, el jarabe de glucosa no contendrá más de 21% de agua. En algunas modalidades, el jarabe de glucosa no contendrá menos de 25% de azúcar reductor calculado como dextrosa. En algunas modalidades, el jarabe de glucosa incluirá por lo menos aproximadamente 90% de D-glucosa y en otra modalidad el jarabe de glucosa incluirá por lo menos aproximadamente 95% de D-glucosa. En algunas modalidades los términos jarabe y jarabe de glucosa son usados intercambiablemente.

Como se usa en la presente, el término "contenido de azúcar total" se refiere a la cantidad total de azúcar presente en una composición de almidón.

Como se usa en la presente, el término "sólidos secos" se refiere a los sólidos totales de una suspensión en % en una base de peso seco.

Como se usa en la presente, el término "gelatinización" significa solubilización de una molécula de almidón, generalmente por cocido, para formar una suspensión viscosa .

Como se usa en la presente, el término "temperatura de gelatinización" se refiere a la temperatura en la cual inicia la gelatinización de un substrato el cual contiene almidón. La temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico y puede variar dependiendo de factores tales como especies vegetales y condiciones ambientales y de crecimiento. La temperatura de gelatinización de almidón inicial está en el intervalo para un número de almidones granulares, por ejemplo, que incluyen cebada (52°C a 59°C) , trigo (58°C a 64°C) , centeno (57°C a 70°C) , maíz (62°C a 72°C) , maíz concentrado en amilosa (67°C á 80°C) , arroz (68°C a 77°C) , sorgo (68°C a 77°C) , papa (58°C a 68°C) , tapioca (59°C a 69°C) y papa dulce (58°C a 72°C) . (Ver, por ejemplo, J.J.M Swinkels página 32-38 en STARCH CONVERSIÓN TECHNOLOGY, Eds, Van Beynum et al., (1985) Marcel Dekker Inc., New York, y The Alcohol Textbook 3a ED. A Reference for the Beverage, Fuel and industrial Alcohol Industries, eds, Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK) .

Como se usa en la presente, el término "abajo de la temperatura de gelatinización" se refiere a una temperatura que es menor que la temperatura de gelatinización.

Como se usa en la presente, el término "fermentación" se refiere al rompimiento enzimático y anaeróbico de substancias orgánicas por microorganismos para producir compuestos orgánicos más simples. Mientras que la fermentación ocurre bajo condiciones anaeróbicas no se propone que el término sea únicamente limitado a condiciones anaeróbicas estrictas, ya que la fermentación también ocurre en la presencia de oxígeno.

Como se usa en la presente, el término "producto final" se refiere a cualquier producto derivado de una fuente de carbono el cual es enzimáticamente convertido a un substrato fermentable. En algunas modalidades, el producto final es un alcohol (por ejemplo, etanol) .

Como se usa en la presente, el término "derivado" comprende los términos "originado de" , "obtenido" , u "obtenible de" y "aislado de" y en algunas modalidades como se usa en la presente significa que un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos se produce a partir de una célula en la cual el nucleótido está naturalmente presente o en el cual se ha insertado el nucleótido.

Como se usa en la presente los términos "organismo de fermentación" y "microorganismo de fermentación" se refiere a cualquier microorganismo o célula, - el cual es adecuado para usar en la fermentación por producir directa o indirectamente un producto final.

Como se usa en la presente el término "productor de etanol" o "microorganismo productor de etanol" se refiere a un organismo de fermentación que es capaz de producir etanol a partir de un mono- u oligosacárido .

Como se usa en la presente, los términos "recuperado", "aislado" y "separado", como se usa en la presente se refiere a una proteína, célula, ácido nucleico o aminoácido que se remueve a partir de por lo menos un componente con el cual se asocia naturalmente.

Como se usa en la presente, los términos "proteína" y "polipéptido" son usados intercambiablemente en la presente. En la presente descripción y reivindicaciones, los códigos de una letra y tres letras convencionales para residuos de aminoácidos son usados. El código de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con la IUPAC- IUB Joint Comisión on Biochemical Nomenclatura (JCBN) . Es también entendido que un polipéptido puede ser codificado por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

Como se usa en la presente, el término "poner en contacto" se refiere a colocar por lo menos una enzima en proximidad suficientemente cercana a su substrato respectivo para permitir a las enzimas convertir el substrato a por lo menos un producto final. En algunas modalidades, el producto final es un "producto de interés" (es decir, un producto final que es el resultado deseado de la reacción de fermentación) . Aquellos expertos en la técnica reconocerán que mezclar por lo menos una solución la cual comprende por lo menos una enzima con el substrato de enzima respectivo resulta en "poner en contacto" .

Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden ser usados en la práctica o prueba de la presente invención, métodos y materiales de ejemplo y preferidos son ahora descritos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente son incorporadas en la presente para referencia para describir y narrar los métodos y/o materiales en conexión con las cuales se citan las publicaciones.

Donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor de intervención, a la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto claramente dicte otra cosa, entre los límites superior e inferior de ese intervalo es también específicamente descrito. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor de intervención en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o de intervención en aquel intervalo establecido está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden ser incluidos o excluidos independientemente en el intervalo, y cada intervalo donde ninguno, cualquiera o ambos límites son incluidos en los intervalos más pequeños están también comprendidos dentro de la invención, sometido a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo establecido. Donde el intervalo establecido incluye uno o ambos los límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de aquellos límites incluidos son también incluidos en la invención.

Las publicaciones discutidas en la presente son proporcionadas únicamente para su descripción antes a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente es para ser construido como una admisión que la presente invención no está titulada para antefechar la publicación por virtud de la invención anterior.

Modalidades de Ejemplo Se ha descubierto en la presente que la adición de una transglucosidasa a fermentación de melazas y/o como un pretratamiento de las melazas proporciona ventajas sobre la ¦fermentación de melazas sin adición de una transglucosidasa. Además, la adición de una enzima de hidrolización de almidón granular (GSHE) como alfa amilasa (AA por sus siglas en inglés) y/o una glucoamilasa (GA por sus siglas en inglés) proporciona ventajas adicionales. La adición de cualquiera de las siguientes enzimas sola o en combinación con la transglucosidasa y opcionalmente GSHE, proporciona ventajas adicionales: una glucoamilasa, una celulasa, una hemicelulasa, una beta-glucanasa, una beta-glucosidasa, una pectinasa, y/o una proteasa fúngica ácida. En algunas modalidades, por lo menos una alfa amilasa y/o por lo menos una glucoamilasa se agrega. En algunas modalidades, la por lo menos AA y /o GA tiene actividad de hidrolización de almidón granular (GSH) .

En un aspecto, la presente invención se relaciona a una mezcla de enzimas o composición la cual comprende una transglucosidasa en combinación con por lo menos una enzima secundaria elegida de: una glucoamilasa, una alfa-amilasa, una enzima de hidrolización de almidón granular, una celulasa, una hemicelulasa, una beta-glucanasa, una beta-glucosidasa, una pectinasa y una proteasa fúngica ácida. La invención también se relaciona al uso de la mezcla o composición en la producción de azucares fermentables en melazas y la producción de productos finales (por ejemplo, etanol) . En aspectos adicionales la invención se relaciona a una mezcla o composición de enzimas la cual comprende una transglucosidasa y por lo menos una GHSE . La GSHE puede ser una alfa amilasa y/o glucoamilasa. En modalidades adicionales, la invención se relaciona a una mezcla de enzima o composición la cual comprende una transglucosidasa, una alfa amilasa con actividad de GHSE, y una glucoamilasa con actividad de GSHE. En modalidades adicionales, la combinación de la transglucosidasa, la AA, y la GA, además comprende por lo menos una de las siguientes enzimas secundarias, una proteasa fúngica ácida (AFP por sus siglas en inglés) , una celulasa, una hemicelulasa, una beta-glucanasa , una beta-glucosidasa, y una pectinasa. Una ventaja de la mezcla o composición la cual comprende TG y opcionalmente GSHE es que resulta en una mayor cantidad de etanol con relación a la cantidad de etanol producido por solo fermentación bajo substancialmente las mismas condiciones. En algunos aspectos, el incremento es mayor a 0.1%, con relación a la fermentación sola, incluyendo más de 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.5%, 2%, y 2.5%.

Transglucosidasa Cualquier transglucosidasa adecuada encuentra uso en los métodos de la invención. El tipo de transglucosidasa no es crítico para la invención. En algunas modalidades, la transglucosidasa es una enzima que es capaz de realizar las reacciones de transferencia de glicosilo. En otras modalidades, la transglucosidasa es también capaz de hidrolizar los ázucares no fermentables como la rafinosa y estaquiosa a azúcares fermentables. Típicamente las transglucosidasas (ver por ejemplo E.C. 2.4.1) son enzimas que son capaces de realizar las reacciones de transferencia de glicosilo. Las transglucosidasas pueden ser divididas en a-1,ß, OC-1,4, -1,3, a-1,2 glicosil transíerasas . Algunas transglucosidasas útiles en la invención son D-glucosiltransferasas (ver por ejemplo, E.C. 2.4.1.25) y catalizan tanto las reacciones de transferencia y algunas reacciones hidrolíticas en incubación con OC-D-gluco-oligosacáridos . La transferencia ocurre más frecuentemente a HO-6, produciendo isomaltosa a partir de D-glucosa, y panosa a partir de maltosa. La enzima puede también formar koj ibiosa o nigerosa o maltosa. Como un resultado de las, reacciones de transglucosidasa , los malto-oligosacáridos son convertidos a isomalto-oligosacáridos lo cual resulta en una nueva clase de polisacáridos los cuales contienen altas proporciones de residuos glucosilo enlazados por un enlace oc-D-1,6 a partir del extremo no reductor. La actividad de la transglucosidasa es medida como las unidades transglucosidasa (TGU por sus siglas en inglés) . Las transglucosidasas pueden ser derivadas de expresión de proteína heteróloga o endógena de fuentes de bacterias, plantas y fúngicas . Algunas transglucosidasas útiles en la invención son producidas por varias cepas de hongos filamentosos y levaduras, en particular, transglucosidasas secretadas de cepas de Aspergillus . Las enzimas transglucosidasas que pueden ser empleadas en las composiciones sujeto son generalmente descritas en Barker et al. (Studies of Aspergillus Níger. Parte II. Transglycosidation by Aspergillus niger. J. Chem. Soc . 1953 3588-3593) ; Pazur ét al (The glycoprotein nature and antigenicity of a fungal D-glucosyltransferasa . Carbohydr . Res. 1986 149:137-47) y Nakamura et al (Cloning and sequencing of an alpha-glucosidase gene from Aspergillus niger and its expression in A. nidulans J. Biotechnol . 1997 53:75-84). En modalidades particulares, la enzima transglucosidasa que puede ser empleada puede ser comprada de Megazyme (Co. Wicklow, Ireland) o Danisco US, Inc. Genencor División (Palo Alto, CA bajo la marca comercial TRANSGLUCOSIDASE L-500) . En algunas modalidades, la enzima puede ser una enzima transglucosidasa de Aspergillus Níger producida en las células de Trichoderma reesei. En ciertos casos, la enzima transglucosidasa puede ser una transglucosidasa fúngica del tipo silvestre (por ejemplo, una transglucosidasa fúngica la cual tiene una secuencia de aminoácido depositada en la base de datos Genbanck de NCBI como números de acceso: D45356 (GID : 2645159 ; Aspergillus Níger), BAD060061.1 (GID : 4031328 ; Aspergillus awamori) , BAA08125.1 (GID : 1054565 ; Aspergillus oryzae) , XP_001210809.1 (GID: 115492363; Aspergillus terreus) , XP_001271891.1 (GID:121707620; Aspergillus clavatus) , XP_001266999.1 (GID:119500484; iVeosartorya fischeri) , XP_751811.1 (GID:70993928; Aspergillus fumigatus) , XP_659621.1 (GID: 67523121; Aspergillus nidulans) , XP_001216899.1 (GID-.115433524 ; Aspergillus terreus) y XP_001258585.1 (GID : 119473371 ; Neosartorya fischeri) , o una variante de la misma que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70% idéntica, por ejemplo, por lo menos 80% idéntica, por lo menos 85% idéntica, por lo menos 90% idéntica, por lo menos 95% idéntica, o por lo menos 98% idéntica a una transglucosidasa fúngica del tipo silvestre. No se propone que la presente invención sea limitada a ninguna transglucosidasa específica, ya que cualquier transglucosidasa adecuada encuentra uso en los métodos de la presente invención. En efecto, no se propone que la presente invención sea limitada a la transglucosidasa específicamente descrita y enzimas comerciales.

Enzimas Secundarias Glucoamilasas Varias glucoamilasas (GA) (E . C .3.2.1.3. ) encuentran uso en la presente invención. En algunas modalidades, la glucoamilasa la cual tiene uso en la invención tiene actividad de hidrolización de almidón granular (GSH) o es una variante que ha sido modificada para tener actividad GSH. En algunas modalidades, la actividad GSH es ventajosa ya que las enzimas actúan para descomponer más del almidón en las melazas, particularmente cualquier almidón granular. En algunas modalidades, las glucoamilasas son expresadas endógenamente por bacterias, plantas y/u hongos, mientras que en algunas modalidades alternativas, las glucoamilasas son heterólogas para las células huésped (por ejemplo, bacterias, plantas y/u hongos). En algunas modalidades, las glucoamilasas útiles en la invención son producidas por varias cepas de hongos y levaduras filamentosos. Por ejemplo, las glucoamilasas comercialmente disponibles producidas por cepas de Aspergillus y Trichoderma encuentran uso en la presente invención. Las glucoamilasas adecuadas incluyen glucoamilasas del tipo silvestre que se encuentran en forma natural así como también glucoamilasas mutantes genéticamente modificadas y variantes (por ejemplo, glucoamilasas híbridas) . Las glucoamilasas híbridas incluyen, por ejemplo, glucoamilasas que tienen un dominio catalítico a partir de GA a partir de un organismo (por ejemplo, GA de Talaromyces) y un dominio de enlace de almidón (SBD por sus siglas en inglés) a partir de un organismo diferente (por ejemplo; GA de Trichoderma) . En algunas modalidades, el enlazador es incluido con el dominio de enlace de almidón (SBD) o el dominio catalítico. Las siguientes glucoamilasas son ejemplos no limitantes de glucoamilasas que encuentran uso en los procesos comprendidos por la invención. La glucoamilasa Gl y G2 de Aspergillus Niger (ver por ejemplo, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; solicitud WO 92/00381, WO 00/04136 y USP 6,352,851); glucoamilasas de Aspergillus awamori (ver por ejemplo, la solicitud WO 84/0291; glucoamilasas de Aspergillus oryzae (ver por ejemplo Hata et al., (1991) Agrie. Biol . Chem. 55:941-949) y Aspergillus shirousami . (ver por ejemplo, Chen et al., (1996) Prot . Eng. 9:499-505; Chen et al. (1995) Prot. Eng. 8 :575-582 ; y Chen et al., (1994) Biochem J. 302 :275-281).

Las glucoamilasas secundarias que encuentran uso en la presente invención también incluyen aquellas obtenidas a partir de cepas de Talaromyces ((por ejemplo, glucoamilasas de T. emersonil , T. leycettanus, T. duponti y T. thermophilus (ver por ejemplo, la solicitud WO 99/28488; USP No. RE:32,153; USP No. 4,587,215)), cepas de Trichoderma (por ejemplo, T. reesei) y glucoamilasas que tienen por lo menos aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% y aproximadamente 95% de identidad de secuencia a la SEQ ID NO : 4 descrita en la publicación de patente de los Estados Unidos de Norteamérica 2006-0094080; cepas de Rhizopus, (por ejemplo, R. niveus y R. oryzae) ; cepas de Mucor y cepas de Humicola ( (por ejemplo, H. grísea (ver, por ejemplo, Boel et al., (1984) EMBO J. 3:1097-1102; solicitud WO 92/00381; solicitud WO 00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Engl . 9:499- 505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61:301-308; USP. 4,514,496, USP 4,092,434 ; USP 4,618,579 ; Jensen et al., (1988) Can. J. Microbiol . 34 :218-223 y SEQ ID NO :3 de la solicitud WO 200/052148)). En algunas modalidades, la glucoamilasa útil en la invención tiene por lo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 92%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, y aproximadamente 99%, de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 de la solicitud WO 05/052148. Otras glucoamilasas útiles en la presente invención incluyen aquellas obtenidas de At el a rolfsii y variantes de la misma (ver por ejemplo, solicitud WO 04/111218) y Penicillium spp . (por ejemplo, Penicillium chrysogenum) .

Las glucoamilasas comercialmente disponibles útiles en la invención incluyen pero no se limitan a DISTILLASE®, OPTIDEX® L-400 y G ZYME® G990 4X, GC480, G-ZYME® 480, FERMGEN® 1-400 (Danisco US, Inc., Genencor División), CU.CONC® (Shin Nihon Chemicals, Japón), GLUCZYME® (Amano Pharmaceuticals , Japón (Ver, por ejemplo Takahashi et al., (1985) J. Biochem. 98:663-671)). Las enzimas secundarias que encuentran uso en la invención incluyen tres formas- de glucoamilasas (por ejemplo, E.C.3.2.1.3.) producida por Rhizopus sp.r es decir "Glucl" (MW 74,000), "Gluc2" (MW 58,600) y "Gluc3" (MW 61,400). No se propone que la presente invención sea limitada a ninguna glucoamilasa específica ya que cualquier glucoamilasa adecuada encuentra uso en los métodos de la presente invención. En efecto, no se propone que la presente invención sea limitada a las glucoamilasas y enzimas comerciales específicamente descritas.

Alfa amilasas Las varias alfa amilasas encuentran uso en los métodos de la invención. En algunas modalidades, la alfa amilasa la cual tiene uso en la invención tiene actividad de hidrolización de almidón granular (GSH) o es una variante que ha sido modificada para tener actividad GSH. En algunas modalidades, la actividad GSH es ventajosa ya que las enzimas actúan para descomponer más del almidón en las melazas, particularmente cualquier almidón granular (sin purificar) . Las alfa amilasas las cuales tienen actividad GSHE incluyen, pero no se limitan a: aquellas obtenidas de Aspergillus kawachi (por ejemplo, AkAA) , Aspergillus Níger (por ejemplo, AnAA) , y Trichoderma reesei (por ejemplo, TrAA) . En algunas modalidades, la alfa amilasa es una alfa amilasa estable al ácido, la cual, cuando se agrega en una cantidad efectiva, tiene actividad en el intervalo de pH de 3.0 a 7.0.

Además, en algunas modalidades, la alfa amilasa puede ser una alfa amilasa del tipo silvestre, una variante o fragmento de la misma o una alfa amilasa híbrida la cual se deriva de por ejemplo un dominio catalítico de una fuente microbiana y un dominio de enlace de almidón a partir de otra fuente microbiana. Los ejemplos no limitantes de otras alfa amilasas que pueden ser útiles en combinación con la mezcla son aquellas derivadas de Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus, Fusarium, Penicillium, Neurospora y Humicola .

Algunas amilasas usables como GSHE o enzimas secundarias en los procesos son comercialmente disponibles, por ejemplo, ver, TERMA YL® 120-L, LC y SC SAN SUPER®, SUPRA® y LIQUEZYME® SC disponible de Novo Nordisk A/S, FUELZYME® LF de Verenium, y CLARASE® L, SPEZYME® FRED, SPEZYME® XTRA, GC626, y GZYME® G997 disponible de Danisco, US, Inc., Genencor División.

No se propone que la presente invención sea limitada a ninguna alfa amilasa específica, ya que cualquier alfa amilasa adecuada encuentra uso en los métodos de la presente invención. En efecto, no se propone que la presente invención sea limitada a la alfa amilasa y enzimas comerciales específicamente descritas.

Celulasas, Hemicelulasas y Beta-glucosidasas Las varias celulasas encuentran uso en los métodos de acuerdo a la invención. Las celulasas son composiciones de enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta-1, 4-D-glucano) y/o derivados de la misma, tales como la celulosa hinchada con ácido fosfórico. Las celulasas incluyen la clasificación de exocelobiohidrolasas (CBH) , endoglucanasas (EG) y beta-glucosidasas (BG) (ver por ejemplo, EC3.2.1.91, EC3.2.1.4 y EC3.2.1.21 para clasificación de estas enzimas). Ejemplos de celulasas incluyen celulasas de Penicillium, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thermomonospora, Cellulomonas, Hypocrea, Clostridium, Thermomonospore, Bacillus, Cellulomonas y Aspergillus . Ejemplos no limitantes de celulasas comercialmente disponibles vendidas para aplicaciones alimenticias son beta-glucanasas como ROVABIO® (Adisseo) , NATUGRAIN® (BASF), MULTIFECT® BGL (Danisco US, Inc., Genecor División) y ECONASE® (AB Encimes) . Una celulasa comercial de ejemplo incluye ACCELLERASE® . Las celulasas y endoglucanasas descritas en US20060193897A1 también pueden ser usadas. Las beta-glucosidasas (celobiasas) hidrolizan la celobiosa en monosacáridos individuales.

Las hemicelulasas son enzimas que descomponen la hemicelulosa . La hemicelulosa categoriza una amplia variedad de polisacáridos que son más complejos que los azúcares y menos complejos que la celulosa, y se encuentran en las paredes vegetales.

Numerosas celulasas han sido descritas en la literatura científica, ejemplos de las cuales incluyen de Trichoderma reesei: Shoemaker, S. et al., Bio/Technology, 1:691-696, 1983, la cual describe CBHI ; Teeri, T. et l . , Gene, 51:43-52, 1987, la cual describe CBHII; Penttila, M. et al., Gene, 45:253-263, 1986, la cual describe EGI; Saloheimo, M. et al., Gene, 63:11-22, 1988, la cual describe EGII; Okada, M. et al., Appl . Environ, Microbiol., 64:555-563, 1988, la cual describe EGIII; Saloheimo, M. et al., Eur. J.

Biochem., 249:584-591, 1997, la cual describe EGIV; Saloheimo, A. et al., Molecular Microbiology, 13:219-228, 1994, la cual describe EGV; Barnett, C. C, et al., Bio/Technology, 9:562-567, 1991, la cual describe BGL1 y Takashima, S. et al . , J. Biochem., 125:728-736, 1999, la cual describe BGL2. Las celulasas de especies diferentes a Trichoderma han sido también descritas por ejemplo, Ool et al., 1990, la cual describe la secuencia de ADNc que codifica para la endoglucanasa Fl-CMC producida por Aspergillus aculeatus; Kawaguchi T. et al. 1996, la cual describe la clonación y secuenciación de la ADNc que codifica la beta-glucosidasa 1 de Aspergillus aculeatus; Sakamoto et al., 1995, la cual describe la secuencia ADNc que codifica la endoglucanasa CMCase-1 de Aspergillus kawachii IFO 4308; Saarilahti et al., 1990 la cual describe una endoglucanasa de Erwinia carotovara; Spilliaert R. et al., 1994, la cual describe la clonación y secuenciación de bglA, que codifica para una beta-glucanasa termoestable de Rhodothermus marinu; y Halldorsdottir S et al., 1998, la cual describe la clonación, secuenciación y sobre expresión de un gen de Rhodothermus marinus que codifica una celulasa termoestable de glicosil hidrolasa de la familia 12. No se propone que la presente invención sea limitada a ninguna celulasa específica, ya que cualquier celulasa adecuada encuentra uso en los métodos de la presente invención. En efecto, no se propone que la presente invención sea limitada a las celulasas descritas específicamente y enzimas comerciales.

Beta-glucanasas Varias beta-glucanasas encuentran uso en la invención en combinación con las transglucosidasas . Las beta-glucanasas (endo-celulasa) también llamada endoglucanasa I, II y III, son enzimas que atacan la fibra de celulosa para liberar los fragmentos más pequeños de celulosa la cual es además atacada por la exo-celulasa para liberar la glucosa. Las beta-glucanasas pueden también ser usadas en los métodos de acuerdo a la invención. Las beta-glucanasas comerciales útiles en los métodos de la invención incluyen OPTIMASH® BG y OPTIMASH® TBG (Danisco, US, Inc. Genencor División) . No se propone que la presente invención sea limitada a ninguna beta-glucanasa específica, ya que cualquier beta-glucanasa adecuada encuentra uso en los métodos de la presente invención .

Proteasas Fúngicas Acidas Varias proteasas fúngicas ácidas (AFP por sus siglas en inglés) encuentran uso en los métodos de la invención. Las proteasas fúngicas ácidas incluyen por ejemplo, aquellas obtenidas de Aspergillus, Trichoder a, Mucor y Rhizopus, tales como A. níger, A. awamori, A. oryzae Y M. miehei . La AFP puede ser derivada de expresión de proteína heteróloga o endógena de fuentes de bacterias, plantas y hongos. En particular, la AFP secretada a partir de las cepas de Trichoderma encuentran uso en la invención. La AFP adecuada incluye AFP del tipo silvestre la cual se encuentra en forma natural así como también AFP mutante modificada genéticamente y variante. Algunas enzimas AFP comerciales útiles en la invención incluyen . FERMGEN® (Danisco US, Inc., Genencor División) y FORMASE® 200.

En algunas modalidades, la proteasa fúngica ácida útil en la invención tendrá por lo menos aproximadamente 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica 11/312,290, presentada el 20 de Diciembre de 2005. No se propone que la presente invención sea limitada a ninguna proteasa fúngica ácida específica, ya que cualquier proteasa fúngica ácida adecuada encuentra uso en los métodos de la presente invención. En efecto, no se propone que la presente invención sea limitada a la proteasa fúngica ácida y enzimas comerciales descritas específicamente.

Otras Enzimas Secundarias Mientras que algunas modalidades de la invención incluyen una composición o mezcla de por lo menos una transglucosidasa, y opcionalmente una alfa amilasa, una glucoamilasa, una AFP, una celulasa, una beta-glucanasa, y una pectinasa, la mezcla o composición puede opcionalmente incluir otras enzimas secundarias. Por ejemplo, cuando las mezclas son usadas en varias aplicaciones (por ejemplo aplicaciones de procesamiento de melazas) otras enzimas secundarias pueden ser incluidas. La mezcla o composición de acuerdo a la invención puede ser usada en una etapa de pretratamiento y/o la etapa de fermentación junto con el microorganismo de fermentación y otros componentes y otras enzimas secundarias. Las otras enzimas secundarias incluyen sin limitación: xilanasas, otras proteasas (diferentes a AFP) , fitasas, pectinasas, pululanasas, beta-amilasas , lipasas, cutinasas, esterasas, ciclodextrina transglicosiltransferasas (CGTasas) , alfa galactosidasas , dextrinasas, beta-amilasas y combinaciones de las mismas.

Cualesquiera fitasas son útiles como enzimas secundarias en los métodos de la invención. Las fitasas son enzimas capaces de liberar por lo menos un fosfato inorgánico a partir de hexafosfato de inositol. Las fitasas son agrupadas de acuerdo a su preferencia para una posición específica del grupo éster fosfato en la molécula de fitato en la cual se inicia la hidrólisis (ver, por ejemplo, 3- fitasas (EC 3.1.3.8) o 6-fitasas (EC 3.1.3.26)). Un ejemplo típico de fitasa es mio-inositol-hexaquifosfato-3- fosfohidrolasa . Las fitasas pueden ser obtenidas de microorganismos como los organismos fúngicos y bacterianos (por ejemplo Aspergillus (por ejemplo, A. Níger, A. terreus, y A. fumigatus) , Myceliophthora ( . thermophila) , Talaromyces (T. thermophilus) Trichoderma spp (T. reesei) y Thermomyces (Ver por ejemplo, la solicitud 99/49740)). También las fitasas están disponibles de especies de Penicillium (por ejemplo, P. hordei (ver, por ejemplo ATCC No. 22053) , P. piceum (ver, por ejemplo, ATCC No. 10519) / o P. brevicompactum (ver por ejemplo, ATCC NO. 48944) (ver, por ejemplo USP 6,475,762). Las fitasas adicionales que encuentran uso en la invención son obtenibles de Peniophora, E. coli, Citrobacter, Enterbacter y Buttiauxella (ver por ejemplo, la solicitud WO2006/043178 , presentada el 17 de octubre de 2005) . Las fitasas adicionales útiles en la invención pueden ser obtenidas comercialmente (por ejemplo NATUPHOS® (BASF) , RONOZYME® P (Novozymes A/S) , PHZYME® (Danisco A/S, Verenium) y FINASE® (AB Enzymes) . En algunas modalidades, la fitasa útil en la presente invención es una derivada de la bacteria Buttiauxiella spp. , tal como BP-wt y variantes (por ejemplo BP-17) (ver la solicitud de patente de los Estados Unidos de Norteamérica 12/027127, presentada el 6 de febrero de 2008) . No se propone que la presente invención sea limitada a ninguna fitasa específica, ya que cualquier fitasa adecuada encuentra uso en los métodos de la presente invención .

En algunas modalidades, las xilanasas encuentran uso como enzimas secundarias en los métodos de la invención.

Cualquier xilanasa adecuada puede ser usada en la invención. Las xilanasas (ver, por ejemplo, endo-beta-xilanasas (E . C .3.2.1.8) las cuales hidrolizan la cadena de estructura principal de xilano, pueden ser de fuentes bacterianas (por ejemplo, Bacillus, Streptomyces, Clostridium, Acidothermus, Microtetrapsora o Thermonospora) o de fuentes fúngicas {Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Humicola, Penicillium, o Fusarium (ver, por ejemplo, Patente Europea 473, 545; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 5,612,055, solicitud O 92/06209 y la solicitud 97/20920 para xilanasas a partir de algunas de estas fuentes) ) . Las xilanasas útiles en la invención incluyen mezclas comerciales (por ejemplo, MULTIFECT® y FEEDTREAT® Y5 (Danisco, US, Inc. Genencor División) , RONOZYME® WX (Novozymes A/S) y NATUGRAIN® WHEAT (Basf) . En algunas modalidades la xilanasa es de Trichoderma reesei o una xilanasa variante de Trichoderma reesei, o la xilanasa termoestable inherentemente descrita en EP1222256B1, así como también otras xilanasas de Aspergillus Niger, Aspergillus kawachii , Aspergillus tubigensis, Bacillus circulans, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Neocallimastix patriciarum, Penicillium species, Streptomyces lividans, Streptomyces thermoviolaceus, Thermomonospora fusca, Trichoderma harzianum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride .

Las proteasas adicionales pueden también ser usadas con las mezclas y/o composiciones de acuerdo a la invención diferentes a AFP. Cualquier proteasa adecuada puede ser usada. Las proteasas pueden ser derivadas de fuentes bacterianas o fúngicas. Las fuentes de proteasas bacterianas incluyen proteasas de Bacillus (por ejemplo, B . amyloliquefaciens, B. lentus, B. licheniformis y B. subtilis) . Las proteasas de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, subtilisina tal como subtilisina obtenible de B. amyloliquefaciens y mutantes de los mismos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,760,025). La proteasa comercial adecuada incluye MULTIFECT® P 3000 (Danisco US Inc., Genencor División) y SUMIZYME® FP (Shin Nihon) . Fuentes de. proteasas fúngicas incluyen, pero no se limitan a, Trichoderma, Aspergillus, Humicola y Penicillium, por ejemplo.

Mezclas/Composiciones Las mezclas y composiciones de la invención incluyen por lo menos una transglucosidasa . En algunas modalidades, la transglucosidasa es usada en combinación con por lo menos una enzima hidrolizante de almidón granular (GSHE) . En otras modalidades, la enzima hidrolizante de almidón granular es una glucoamilasa o una alfa-amilasa . En otras modalidades, las mezclas o composiciones de la invención incluyen por lo menos una transglucosidasa, por lo menos una alfa amilasa con actividad GSH, y por lo menos una glucoamilasa. En algunas modalidades tanto la glucoamilasa y la alfa amilasa tienen actividad GSH. En otras modalidades ya sea AA o GA tiene actividad GSH. En algunas modalidades, las mezclas y/o composiciones incluyen una transglucosidasa y una GSHE en combinación con por lo menos otra enzima, tal como por lo menos una celulasa, por lo menos una pectinasa, por lo menos una beta-glucanasa, por lo menos una beta glucosidasa, y por lo menos una proteasa fúngica ácida (AFP) . En algunas modalidades, las mezclas y composiciones comprenden una transglucosidasa, una glucoamilasa, una alfa-amilasa, y una proteasa fúngica ácida. Los componentes de enzimas pueden ser usados como una formulación de mezcla la cual comprende dos o tres componentes de enzimas mezclados entre sí o los componentes de enzimas pueden ser individualmente agregados durante una etapa de proceso para resultar en una composición comprendida por la invención. La composición de la invención es usada durante una etapa en una conversión de almidón de tal forma que se mantiene la formulación. Esto puede implicar agregar los componentes separados de la composición en una forma de sincronización de tiempo de tal forma que la formulación es mantenida, por ejemplo agregando los componentes simultáneamente. Una formulación es la mezcla o composición de las enzimas de tal forma que son incluidas en un cierto porcentaje. Algunas formulaciones son proporcionadas posteriormente.

Una composición la cual comprende una glucoamilasa y una alfa-amilasa, la cual es útil de acuerdo a la invención es STARGEN™ 001, la cual es una mezcla de un alfa amilasa de Aspergillus kawachi estable al ácido y una glucoamilasa de Aspergillus Níger (disponible comercialmente de Danisco US, Inc., Genencor División). Para esto puede ser agregada a una transglucosidasa como se describe posteriormente en la presente .

En algunas modalidades, la mezcla o composiciones de enzimas incluirán: a) Una TG, una AkAA y una GA; b) Una TG, una AA con actividad GSH y una GA la cual tiene actividad de GSH; c) Una TG, una AkAA, una GA y una AFP; d) Una TG, una AA, una GA la cual tiene actividad de GSH, y una celulasa. e) Una TG, una AA la cual tiene actividad de GSH, una GA la cual tiene actividad de GSH, una celulasa y una pectinasa; f) Una TG, un AA que tiene actividad GSH, una GA la cual tiene actividad GSH, una hemicelulasa , una beta- glucanasa, una beta glucosidasa, una pectinasa y una AFP; g) Una TG, una AA, una GA, una celulasa, una AFP; h) GC626, ACCELLERASE®, OPTIDEX® L-400, TG-L500 y FERMGEN® .

Algunas formulaciones de enzimas son definidas posteriormente en la presente. Sin embargo, en algunas modalidades, la formulación de enzimas es por lo menos aproximadamente 5% p/p de transglucosidasa, incluyendo por lo menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, ' 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% p/p. En algunas modalidades, la mezcla o composición contiene de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% p/p de transglucosidasa, preferentemente de aproximadamente 5% a aproximadamente 95%, preferentemente de aproximadamente 10% a aproximadamente 80% p/p transglucosidasa. Se entiende por el experto en la técnica que la cantidad de transglucosidasa puede ser variada dependiendo de la cantidad de rafinosa y estaquiosa en las melazas. Por ejemplo, si las melazas tienen una gran cantidad de rafinosa y/o estaquiosa, un porcentaje superior de transglucosidasa puede ser incluida. Además, la cantidad de cualquier enzima en la formulación puede ser variada dependiendo de la temperatura de pretratamiento y/o fermentación. Si el pretratamiento y/o fermentación está en una temperatura más cercana a la temperatura óptima de la enzima, menos de la enzima puede ser usada. En algunas modalidades, la formulación de enzima tiene por lo menos aproximadamente 5% p/p de alfa amilasa (opcionalmente GSHE) , incluyendo aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% p/p. En algunas modalidades, la formulación de enzimas tiene entre aproximadamente 5% y aproximadamente 95% p/p de alfa amilasa, preferentemente entre aproximadamente 10% y aproximadamente 50% p/p. En algunas modalidades, la formulación tiene por lo menos aproximadamente 5% de glucoamilasa (opcionalmente GSHE) , incluyendo por lo menos aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25% y 30% p/p. En algunas modalidades, la formulación de enzima tiene entre · aproximadamente 5% y 95% de glucoamilasa, preferentemente entre aproximadamente 10% y aproximadamente 50% p/p. En algunas modalidades, la formulación tiene aproximadamente 0-20% p/p beta-glucanasa . En algunas modalidades, la formulación tiene por lo menos aproximadamente 1% p/p de beta-glucanasa, incluyendo aproximadamente 2%, 3%, 5%, 10%, 15% y 20% p/p. En algunas modalidades, la formulación tiene aproximadamente 0-15% p/p de xilanasa, en algunas modalidades por lo menos aproximadamente 5% de xilanasa, incluyendo aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25%, y 30% p/p. En algunas modalidades, la formulación tiene de aproximadamente 0-20% p/p de pectinasa. En algunas modalidades, la formulación tiene por lo menos aproximadamente 5% p/p de pectinación, incluyendo aproximadamente 10%, 15%, 20%, 25% p/p, y 30% p/p. En algunas modalidades, la formulación tiene de aproximadamente 0-10% p/p de lisozima. En algunas modalidades, la mezcla o formulación de enzima o formulación incluirá: 1) TG (aproximadamente 50% p/p) + alfa amilasa fúngica con actividad GSHE (aproximadamente 30% p/p) + GA (aproximadamente 10% p/p) + proteasa fúngica ácida (aproximadamente 10% p/p) . 2) TG (aproximadamente 40% p/p) + alfa amilasa fúngica con actividad GSHE (aproximadamente 20% p/p) + GA (20% p/p) + beta-glucanasa (aproximadamente 10% p/p) + beta-glucosidasa (aproximadamente 10% p/p) , 3) TG (aproximadamente 30% p/p) + alfa amilasa fúngica con actividad GSHE (aproximadamente 30% p/p) + GA (20% p/p) + pectinasa (aproximadamente 20% p/p) . 4) TG (aproximadamente 25% p/p) + alfa amilasa fúngica con actividad GSHE (aproximadamente 30% p/p) + GA (aproximadamente 30% p/p) + xilanasa (aproximadamente 15% p/p) . 5) TG (60% p/p) + alfa amilasa fúngica con actividad GSHE (aproximadamente 20% p/p) + GA (aproximadamente 10% p/p) + lisozima (aproximadamente 10% p/p) .

Otras mezclas y formulaciones serán fácilmente . aparentes a partir de la descripción de la presente.

Melazas Históricamente, el término melazas se refiere específicamente al efluente final obtenido en la preparación de sacarosa por evaporación, cristalización y centrifugación repetidas de jugos a partir de azúcar de caña y de remolacha de azúcar. Varios tipos de melazas son reconocidas y, en general, cualquier ingrediente alimenticio líquido que contiene exceso de 43% de azúcares es nombrado melazas (ver, por ejemplo Curtin, L.V. "Molasses - General Considerations" Molasses in Animal Nutrition, 1983, pág. 2-11, National feed Ingredients Association, West Des Moines, Iowa) . Una variedad de tipos de melazas son actualmente producidas, incluyendo melazas de caña, melazas de remolacha, melazas cítricas, extracto de hemicelulosa, y melazas de almidón. Las melazas de caña es un producto lateral de la fabricación o refinación de sacarosa a partir de caña de azúcar (melazas de caña de azúcar) . Las melazas de remolacha es un subproducto de la fabricación de sacarosa a partir de remolachas de azúcar. Las melazas cítricas son los jugos parcialmente deshidratados obtenidos de la fabricación de pulpa cítrica seca. El extracto de hemicelulasa es un subproducto de la fabricación de lana presionada, y melazas de almidón es un subproducto de fabricación de dextrosa a partir del almidón derivado de sorgos de maíz o grano donde el almidón es hidrolizado por enzimas y/o ácido.

El tipo de melazas utilizado en los métodos de la invención no es crítico. En algunas modalidades, el tipo de melazas usadas en los métodos de la presente invención puede ser cualesquiera melazas que contienen por lo menos uno de los azúcares no fermentables rafinosa y/o estaquiosa. Cualesquiera "melazas" o jarabe espeso producido como un subproducto del procesamiento de caña de azúcar u otros productos vegetales pueden ser usados, incluyendo, pero no limitados a: melazas de backstrap (a partir de la caña de azúcar) , melazas de alta prueba (caña) , refinación de melazas de caña o de remolacha (un subproducto de la refinación de azúcar morena sin purificar para producir azúcar blanca) , melazas de remolacha (a partir de remolachas de azúcar) , y melazas cítricas (jugos extraídos de pulpa cítrica seca) , para nombrar unos cuantos. En algunas modalidades, las melazas usadas en los métodos de la invención contienen estaquiosa y/o rafinosa en cantidades significativas. En algunas modalidades, las cantidades significativas incluyen por lo menos aproximadamente 0.1% ds , 0.5% ds, 1.0% ds , 2% ds , 3% ds, 4% ds y 5% ds . En algunas modalidades, la melaza es producida como un subproducto de producción de azúcar a partir de la caña de azúcar y/o remolachas.

Métodos de Uso En algunas modalidades, las melazas se ponen en contacto con la transglucosidasa durante la fermentación de las melazas. En algunas modalidades, las melazas se ponen en contacto con la transglucosidasa durante un pretratamiento de las melazas y antes de la fermentación de las melazas. En algunas modalidades, se agrega la transglucosidasa tanto durante un pretratamiento como y durante la fermentación de las melazas. En algunas modalidades, la transglucosidasa se pone en contacto con las melazas como parte de una mezcla o composición de enzimas. Las melazas pueden ser puestas en contacto con la transglucosidasa y/o mezcla o composición de enzimas de la invención en una dosis sencilla o una dosis dividida siempre y cuando la formulación de enzimas es mantenida. Algunas formulaciones de ejemplo son proporcionadas posteriormente. De esta forma, una dosis de división significa que la dosis total en la formulación deseada se agrega en más de una porción, incluyendo dos porciones o tres porciones. En algunas modalidades, una porción de la dosis total es agregada en el inicio y una segunda porción se agrega en un tiempo especificado en el proceso. En algunas modalidades, por lo menos una porción de la dosis es agregada como un pretratamiento. En algunas modalidades, la transglucosidasa y/o mezcla o composición de enzimas de la invención, particularmente la transglucosidasa sola puede ser inmovilizada en una columna o substrato sólido .

La mezcla o composición de enzimas puede ser agregada durante una o ambas del pretratamiento y fermentación o durante el pretramiento y fermentación combinados. En cualquier caso, la mezcla o composición de enzimas puede ser agregada en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular en las melazas. En algunas modalidades, el pretratamiento es realizado en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular. En algunas modalidades, el pretratamiento es realizado en la temperatura óptima de la transglucosidasa pero abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular. En algunas modalidades, el pretratamiento es realizado en la temperatura óptima de por lo menos una de las enzimas en la mezcla y/o composición de enzimas, pero abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular. Esto puede permitir el uso de una dosis inferior de enzima que puede ser necesaria si el método es realizado en la misma temperatura como la fermentación. En algunas modalidades, el pretratamiento es realizado en una temperatura óptima para la enzima pero, abajo de la temperatura de gelatinización de almidón granular.- La temperatura de gelatinización de almidón inicial está en el intervalo de un número de almidones granulares que incluyen: cebada (52°C a 59°C) , trigo (58°C a 64°C) , centeno (57°C a 70°C) , maíz (62°C a 72°C) , maíz concentrado en amilosa. (67°C a 80°C) , arroz (68°C a 77°C) , sorgo (68°C a 77°C) , papa (58°C a 68°C) , tapioca (59 a 69°C) y papa dulce (58°C a 72°C) . (Ver, por ejemplo, J. J.M. Swinkels pág. 32-38 en STARCH CONVERSIÓN TECHNOLOGY, Eds Van Beynum et al., (1985) Marcel Dekker Inc. New York and The Alcohol Textbook 3 a edición, ED. A Reference for the Beyerage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds, Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK) .

De esta forma, el pretramiento y/o fermentación pueden estar en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización de almidón del almidón granular. En algunas modalidades, esta temperatura es mantenida entre 45 °C y 70 °C; en otras modalidades, la temperatura es mantenida entre 50°C y 70°C; entre 55°C y 70°C; entre 60°C y 70°C, entre 60% y 65°C; entre 55°C y 65°C y entre 55°C y 68°C. En algunas modalidades, la temperatura es por lo menos 45°C, 48°C, 50°C, 53°C, 58°C, 60°C, 63°C, 65°C y 68°C. en otras modalidades, la temperatura no es mayor a 65°C, 68°C, 70°C, 73°C, 75°C y 80°C.

El pretratamiento y/o fermentación pueden ser realizadas en un intervalo de pH de pH 3.5 a 7.0; también en un intervalo de pH de 3.5 a 6.5; también en un intervalo de pH de 4.0 a 6.0 y en algunas modalidades en un intervalo de pH de 4.5 a 5.5.

En algunas modalidades la melaza pretratada es sometida a fermentación con microorganismos de fermentación. En algunas modalidades, la etapa de contacto (pretratamiento) y la etapa de fermentación puede ser realizada simultáneamente en el mismo recipiente de reacción o secuencialmente . En general, los procesos de fermentación son descritos en The Alcohol Textbook 3a edición, A Reference for the Beverage, Fuel and Industrial Alcohol Industries, Eds Jacques et al., (1999) Nottingham University Press, UK.

Durante la fermentación, los azúcares fermentables (dextrinas por ejemplo glucosa) en las melazas son usados en fermentaciones microbianas bajo las condiciones de fermentación adecuadas para obtener productos finales, tales como alcohol (por ejemplo, etanol) , ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido succínico, ácido láctico), alcoholes de azúcar (por ejemplo, glicerol) , intermediarios de ácido ascórbico (por ejemplo, gluconato, DKG, KLG) , y aminoácidos (por ejemplo, lisina) .

En algunas modalidades, los azúcares fermentables son fermentados con una levadura en temperaturas en el intervalo de 15 a 40°C, 20 a 38°C y también 25 a 35°C, en un intervalo de pH de pH 3.0 a 6.5; también pH 3.0 a 6.0; pH 3.0 a 5.5, pH 3.5 a 5.0 y también pH 3.5 a 4.5 por un periodo de tiempo de 5 horas a 120 horas, preferentemente 12 a 120 y más preferentemente de 24 a 90 horas para producir un producto de alcohol, preferentemente etanol.

Las células de levadura son generalmente suministradas en cantidades de 104 a 1012, y preferentemente una cuenta de 107 a 1010 levaduras viables por mi de caldo de fermentación. La fermentación incluirá además del microorganismo de fermentación (por ejemplo levadura) nutrientes, opcionalmente ácido y enzimas. En algunas modalidades, además de las materias primas sin purificar descritas anteriormente, el medio de fermentación contendrá suplementos los cuales incluyen pero no se limitan a vitaminas (por ejemplo biotina, ácido fólico, ácido nicotínico, riboflavina) , cofactores, y macro y micro nutrientes y sales (por ejemplo (NH4)2S04 K2HP04 ; NaCl, MgS04 ; Organismos de Fermentación Ejemplos de organismos de fermentación son microorganismos etanologénicos o microorganismos que producen etanol tales como bacterias etanologénicas las cuales expresan alcohol deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa y las cuales pueden ser obtenidas de Zymo onas moblis (ver por ejemplo, Las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,000,000; 5,028,539, 5,424,202; 5,514,583 y 5,554,520). En modalidades adicionales, los microorganismos etanologénicos expresan xilosa reductasa y xilitol deshidrogenasa, enzimas que convierten la xilosa a xilulosa. En modalidades adicionales, la xilosa isomerasa se usa para convertir xilosa a xilulosa. En algunas modalidades, se utiliza un microorganismo capaz de fermentar tanto las pentosas y hexosas a etanol. Por ejemplo, en algunas modalidades el microorganismo puede ser un microorganismo modificado no genéticamente o natural o' en otras modalidades el microorganismo puede ser un microorganismo recombinante .

En algunas modalidades, los microorganismos de fermentación incluyen cepas- bacterianas a partir de Bacillus, Lactobacillus, E. coli, Erwinia, Pantoea (por ejemplo, P. citrea) , Pseudomonas y Klebsiella (por ejemplo, K. Oxytoca) . (ver por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica 5,028,539, 5,424,202 y solicitud WO 95/13362). El microorganismo de fermentación usado en la etapa de fermentación dependerá del producto final a ser producido.

En modalidades adicionales, el microorganismo productor de etanol, es un microorganismo fúngico, tal como una levadura y específicamente Saccharomyces tales como cepas de S. cerevisiae (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica 4,316,956) . Una variedad de S. cerevisiae son comercialmente disponibles y estos incluyen pero no se limitan a FALI® (levadura de Fleischmann) , SUPERSTART® (Alltech) , FERMIOL® (DSM Specialties) , RED STAR® (Lesaffre) y levadura Angel Alcohol (Angel Yeast Company, China) .

Recuperación de Alcohol y otros Subproductos Finales Un producto final del presente proceso de fermentación es un producto de alcohol (por ejemplo etanol) . El producto final producido de acuerdo al proceso puede ser separado y/o purificado del medio de fermentación. Los métodos para separación y purificación son conocidos, por ejemplo por someter el medio a extracción, destilación y cromatografía de columna. En algunas modalidades, el producto final es identificado y/o purificado directamente por someter el medio a análisis de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) .

En modalidades adicionales, el puré puede ser separado por, por ejemplo, centrifugación en la fase líquida y fase sólida y productos finales tales como alcohol y sólidos recuperados. El alcohol puede ser recuperado por medio de la destilación y deshidratación de tamiz molecular o ultra filtración.

En algunas modalidades, el uso de una mezcla o composición de enzimas de acuerdo a la invención en un método de producción de etanol resultará en un rendimiento de etanol que es mayor a 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21% y 22% en volumen.

En modalidades adicionales, la fase acuosa después de la evaporación del etanol puede ser agregada total o parcialmente a las melazas para diluir o preparar las melazas para fermentación.

En modalidades adicionales, por uso de microorganismos de fermentación apropiados como es conocido en la técnica, el producto final de fermentación puede incluir sin limitación etanol, glicerol, 1 , 3 -propanodiol , gluconato, 2-ceto-d-gluconato, 2, 5-diceto-D-gluconato, ácido 2-ceto-L-gulónico, ácido succínico, ácido láctico, aminoácidos y derivados de los mismos. Más específicamente cuando el ácido láctico es el producto final deseado, puede ser usado Lactobacillus sp. (L. casei) ; cuando el glicerol o 1 , 3 -propanodiol son los productos finales deseados puede ser usado E. coli; y cuando 2-ceto-D-gluconato, 2 , 5-diceto-D-gluconato, y ácido 2-ceto-L-gulónico son los productos finales deseados, puede ser usado Panioea citrea como el microorganismo de fermentación. La lista enumerada anterior son solamente ejemplos y un experto en la técnica estará conciente de una variedad de microorganismos de fermentación que pueden ser usados apropiadamente para obtener un producto final deseado.

Experimental La presente invención se describe con detalle adicional en los siguientes ejemplos los cuales no son propuestos para limitar el alcance de la invención como se reclama. Las Figuras anexas son entendidas para ser consideradas como partes integrales de la especificación y descripción de la invención. Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas específicamente en la presente para referencia para todo lo que es descrito en las mismas. Los siguientes ejemplos son ofrecidos para ilustrar, pero no limitar la invención reclamada.

En la descripción y sección experimental la cual sigue, aplican las siguientes abreviaciones: % p/p (por ciento en peso) ; °C (grados centígrados) ; H20 (Agua) ; dH20 (agua deionizada) ; dIH20 (agua deionizada, filtración Milli-Q) ; g o gm (gramos) ; g (microgramos) ; mg (miligramos) ; kg (kilogramos) ; µ? (microlitros) ; mi y m (mililitros) ; mm (milímetros) ; l (micrómetro) ; M (molar) ; mM (milimolar) ; µ? (micromolar) ; U (unidades (MW (peso molecular) ; sec (segundos); min(s); (minuto/minutos); hr (hora/horas); DO (oxígeno disuelto) ; P/V (peso a volumen) ; P/P (peso a peso) ; V/V (volumen a volumen), Genencor (Danisco Us Inc. Genencor División, Palo alto, CA) ; Ncm (Newton centrímetro) ; ETOH (etanol) . Eq (equivalentes) ; N (normal) ; ds o DS (contenido de sólidos secos) ,· MT (toneladas métricas) .

En los siguientes ejemplos se usan los materiales y métodos : Método HPLC para análisis de caldo de fermentación. Usando el Agilent 1100 HPLC, un Bio-rad Aminex HPX-87H o Rezex RoA- se usa una columna de ácido orgánico. Se usa un método ESTD como sigue: la fase móvil es 0.005 mol/L H2S04. La muestra es extraída y diluida 10 veces, y filtrada usando una membrana de filtro 0.45 µ??. El volumen de inyección es 20 µ? , flujo de bomba es 0.6 ml/min, la temperatura de termostato de columna es 60 °C, RID y la temperatura de unidad óptica es 35 °C.

Método HPLC para análisis de melazas- método ESTD. El mismo dispositivo HPLC es usado para análisis de fermentación usando las siguientes condiciones: la fase móvil es agua destilada, la muestra es diluida 30X con agua destilada y se filtra usando una membrana de filtro de 0.45 um, el volumen de inyección es 20 µ? , el flujo de bomba es 0.4 ml/min, la temperatura de termostato de columna es 85°C, RID la temperatura de unidad óptica es 30°C y el método de análisis es ESTD .

Determinación de contenido de almidón de granos enteros. Los granos son mezclados con amortiguador MOPS (50 mM, pH 7.0) más cloruro de calcio (5 mM) y el pH ajustado con solución de ácido acético (2N) hidróxido de sodio (2N) ; amortiguador de acetato (pH 4.2) se prepara como a continuación: 200 mi de ácido acético 2N para 500 mi de agua. Usando un pHmetro estandarizado, agregar hidróxido de sodio 2N a la mezcla hasta que el amortiguador es 4.2 +/- 0.05, SPEZYME® FRED (Danisco US, Inc., Genencor División, alfa amilasa de Bacillus licheniformis) y OPTIDEX® L-400 (Danisco US, Inc., Genencor División, glucoamilasa de Aspergillus Níger) son agregados y el contenido de almidón es determinado por HPLC.

Análisis de Carbohidrato y de Alcohol por Cromatografía de Líquidos de Alta Presión (HPLC) :La composición de los productos de reacción de oligosacáridos se mide por HPLC (Beckman System Gold 32 Karat Fullerton, Ca equipado con una columna HPLC (Rezec 8 u8% H, monosacáridos) , mantenido en 50°C fijo con un detector de índice de refracción (RI) (ERC-7515A RI Detector, Anspec Company, Inc.) . Los sacáridos son separados en base al peso molecular. Una designación de DPI es un monosacárido, tal como glucosa, una designación de DP2 es un disacárido, tal como maltosa; una designación de DP3 es un trisacárido, tal como maltotriosa y la designación "DP4" es un oligosacárido el cual tiene un grado de polimerización (DP) de 4 ó más.

Actividad de transglucosid sa (TGU por sus siglas en inglés) se define como la actividad de enzima requerida para producir un micromol de panosa por minuto bajo las condiciones del ensayo. La producción de la actividad de transglucosidása puede ser ensayada como a continuación: La enzima es puesta en amortiguador de acetato de sodio 100 mM, pH 4.5, la cual contiene 4 mM de para-nitrofenil-alfa-glucosidasa y 1 mg/ml de BSA. Después de 30 minutos de incubación en 30°C se termina la reacción por la adición de un volumen igual de carbonato de sodio 1 M y se registra la OD405.

La actividad de alfa amilasa (AAU por sus siglas en inglés ) puede ser determinada por la proporción de hidrólisis de almidón, como se refleja en la proporción de disminución de capacidad de tinción de yodo medida espectrofotométricamente . Una AAU de actividad de alfa-amilasa bacteriana es la cantidad de enzima requerida para hidrolizar 10 mg de almidón por minuto bajo las condiciones estandarizadas .

La actividad de alfa-amilasa puede también ser determinada como unidad de almidón soluble (SSU por sus siglas en inglés) y se basa en el grado de hidrólisis de substrato de almidón de papa soluble (4% de DS) por una alícuota de la muestra de enzima en pH 4.5, 50 °C. El contenido de azúcar reductor es medido usando el método DNS como se describe en Miller, G. L. (1959) Anal. Chem. 31:426-428.

Las unidades de actividad de glucoamilasa .(GAU por sus siglas en inglés) se determina por usar el ensayo PNPG para medir la actividad de glucoamilasa. GAU es definida como la cantidad de enzima que producirá 1 g de azúcar reductor calculado como glucosa por hora a partir de un substrato de almidón soluble en pH 4.2 y 60°C.

La actividad de fitasa (FTU por sus siglas en inglés) es medida por la liberación de fosfato inorgánico. El fosfato inorgánico forma un complejo amarillo con molibdato ácido/reactivo de vandato y el complejo amarillo es medido en una longitud de onda de 415 nm en un espectrofotómetro y el fosfato inorgánico liberado es cuantificado con una curva estándar de fosfato. Una unidad de fitasa (FTU) es la cantidad de enzima que libera 1 micromol de fosfato inorgánico a partir de la fitasa por minuto bajo las condiciones de reacción dadas en el estándar europeo (CEN/TC 327 , 2005-TC327WI 00320XX) .

La actividad de celulasa (ECU por sus siglas en inglés) se determina en unidades de endocelulasa (ECU) por medir la capacidad de la enzima para reducir la viscosidad de una solución de carboximetilcelulosa (CMC por sus siglas en inglés) . El ensayo de ECU cuantifica la cantidad de actividad catalítica presente en la muestra por medir la capacidad de la muestra para reducir la viscosidad de una solución de carboximetilcelulosa (CMC) . El ensayo es realizado en un viscosímetro de vibración (por ejemplo, MIVI 3000 de Sofrasor, Francia) en 40°C; pH 7.5; amortiguador de fosfato 0.1 M, tiempo=30 minutos, usando un estándar de enzima relativa para reducir la viscosidad del substrato CHIC (Hercules 7 LED) , concentración de enzima aproximadamente 0.15 ECU/ml) . El estándar arch es definido para 8200 ECU/g. Una ECU es a cantidad de enzima que reduce la viscosidad a la mitad bajo estas condiciones.

La actividad de proteasa SAPU (por sus siglas en inglés) (unidad de proteasa de ácido espectrofotométrico) se mide por el rompimiento de caseína en donde en 1 SAPU es la cantidad de actividad de enzima de proteasa que libera un micromol de tirosina por minuto a partir de un substrato de caseína bajo condiciones del ensayo.

Materiales- melazas. Las melazas de caña de azúcar se obtienen de Myanmar Great Goldon Glory and Siam Chemical Tailandia. La caracterización de las melazas se determina El contenido de almidón de las melazas usado en los siguientes experimentos es determinado para ser 0.5 % p/p.

Materiales-enzimas . Las siguientes enzimas son usadas en los ejemplos: TRASGLUCOSIDASE L-50, GC626 (alfa amilasa) , GA-L (glucoamilasa) , MULTIFECT® (pectinasa) , GC220 (celulasa) , ACCELLERASE® (hemicelulasa) , y FERMGEN® (AFP) . Todos obtenidos de" Danisco US, Inc., Genencor División.

En los siguientes ejemplos se prueba el efecto de transglucosidasa en melazas para identificar cómo la enzima está incrementando el rendimiento de etanol y para elucidar cuánto rendimiento de etanol es incrementado. Pruebas adicionales son realizadas para identificar enzimas secundarias que pueden incrementar la eficiencia de fermentación de etanol en la presencia de transglucosidasa.

EJEMPLO 1 Efecto de transglucosidasa en rafinosa En el ejemplo 1, se prueba el efecto de° transglucosidasa (TRANSGLUCOSIDASE L-500 de Danisco US, Inc., Genencor División) en rafinosa y estaquiosa.

Las transglucosidasas son generalmente conocidas como transferasas más que como enzimas que hidrolizan azúcares. Más específicamente, las transglucosidasas son conocidas para convertir los maltooligosacáridos en isomalto-oligosacáridos tales como isomaltosa y panosa los cuales son azúcares menos fermentables. De esta forma, para probar la teoría que la transglucosidasa es capaz de hidrolizar oligosacáridos no fermentables tales como rafinosa y estaquiosa en azúcares fermentables, la transglucosidasa es probada directamente en rafinosa y estaquiosa como a continuación.

Una solución de rafinosa al 1% y estaquiosa al 1% (de Sigma) es cada una incubada separadamente con TRANSGLUCOSIDASE L-500 en pH 4.5, 60°C y se extraen las muestras para análisis de HPLC. Los resultados en la Figura 1 muestran que la glucosa, sacarosa, galactosa y fructosa (azúcares fermentables) son producidos de la hidrólisis de rafinosa por la TRASGLUCOSIDASE L-500 agregada. Los resultados para estaquiosa son similares ya que los azúcares producidos a partir dE la hidrólisis son los mismos (glucosa, sacarosa, galactosa y fructosa) , mientras que la proporción o cantidades de cada uno difiere. De esta forma, las transglucosidasas actúan para hidrolizar los azúcares no fermentables tales como rafinosa y estaquiosa en azúcares fermentables.

En el ejemplo 2, se prueba el efecto de transglucosidasa en fermentación de melazas de caña de azúcar.

EJEMPLO 2 Efecto de Transglucosidasa en Fermentación de Melazas Quinientos gramos de melazas de caña de azúcar (Myanmar Great Golden Glory and Siam Chemicals, Tailandia) se diluyen con 1000 gramos de agua corriente a un DS final de 25% y entonces se ajusta a pH a 4.8 usando 20% de ácido sulfúrico (la mezcla de melazas) . Se prepara la levadura por usar 1 gramo de levadura seca activa (Dry Angel, Angel Alcohol Company) y se mezcla con 10 gramos de agua corriente y 0.1-0.2% (p/p) de sacarosa, y se mantiene en 30°C por 2 horas para permitir que se propague la levadura. 7 mi de la levadura resultante se agrega por 32.7 gramos de la mezcla de melazas anterior con y sin transglucosidasa. Sé realizan las fermentaciones en 150 mi de matraz Erlenmeyer en un baño de 32°C con una velocidad de agitación de 150 rpm. Las fermentación son terminadas en 42 horas por remover las muestras de la remolacha y realizar una destilación. Algunas de las muestras son usadas para análisis de HPLC.

Tabla 2. Efecto de transglucosidasas en rendimiento de fermentación melazas de Myanmar TG Tiempo % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % v/v EtOH (h) DP>3 DP-3 DP-2 Gluc Fruc ácido ácido Glyc ácido EtOH Rend. suc lac acet /MT - 41.0 2.23 0.05 0.08 0.41 0.69 0.25 0.37 1.47 0.25 9.88 258.8 TG- 41.00 2.04 0.02 0.08 0.37 0.71 0.23 0.36 1.37 0.24 9.93 271.2 L500 Tabla 3: Efecto de transglucosidasa en rendimiento de fermentación melazas de Tailandia TG Tiempo % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % w/v % v/v EtOH <h) DP>3 DP-3 DP-2 Gluc Fruc ácido ácido Glyc ácido EtOH Rendimiento Suc Lac acet /MT 5 - 41.0 1.73 0.02 0.15 0.31 0.75 0.03 0.36 1.06 0.20 8.32 227.8 TG- 41.0 1.60 0.18 0.14 0.32 0.79 0.06 0.35 1.26 0.22 8.61 233.0 L500 10 15 Los resultados en la Tabla 2 y Tabla 3 confirman el descubrimiento inicial que la adición de TRANSGLUCOSIDASA® L-500 a melazas resulta en un incremento en rendimiento de alcohol en fermentaciones de melaza. Además, el incremento en rendimiento de alcohol es visto independientemente del origen de las melazas. De esta forma, la capacidad de la TRANSGLUCOSIDASA® L-500 para hidrolizar los azúcares no fermentables en las melazas en glucosa, sacarosa, galactosa y fructosa (azúcares fermentables) , proporciona más azúcares fermentables para la producción de alcohol. Esto resulta en un rendimiento de alcohol superior.

EJEMPLO 3 El efecto de enzimas de hidrolización de almidón sin purificar en fermentaciones de melazas Se prueba el efecto de la adición de enzimas de hidrolización de almidón sin purificar durante la fermentación de melazas por levadura. Las fermentaciones de levadura son realizadas como en el Ejemplo 2 en melazas a partir de Tailandia. La enzima de hidrolización de almidón sin purificar, GC 626 (alfa amilasa de Danisco US, Inc., Genencor División) se agrega a la fermentación de levadura en 6 ppm . GC 626 es una enzima de hidrolización de almidón granular (GSHE) . Se analiza el caldo de fermentación en 41.5 horas por HPLC y se destila para contenido de alcohol (Tabla 4) . En la tabla 4 el rendimiento de alcohol es dado con respecto a las melazas de IMT a 95.5% de etanol (L) en 20°C. Las abreviaciones usadas en las Tablas son como a continuación: TG (transglucosidasa) ; Gluc (glucosa) ; Fruc (fructosa) ; ácido suc (ácido succínico) ; ácido Lac (ácido láctico) ; Glyc (glicerol) ; ácido acet (ácido acético) ; EtOH (etanol) .

Tabla 4; Efecto de artillas a de hidrolización de almidón sin purificar durante la fermentación de levadura que contiene melazas en el rendimiento de alcohol final Los resultados en la Tabla 4 muestran que adición de la enzima de hidrolización de almidón granular (GSH) a la fermentación de melazas incrementa la producción de alcohol. Esto es probable ya que la hidrólisis del almidón granular en melazas resulta en azúcares fermentables incrementadas .

EJEMPLO 4 Formulación con GC626 y otras enzimas secundarias Se usan las melazas a partir de Tailandia en las fermentaciones. Las fermentaciones son realizadas como en el Ejemplo 2. Dos formulaciones de enzimas secundarias identificadas como las formulaciones C y D en la Tabla 5 son preparadas. Las cantidades de las enzimas que son incluidas en cada formulación son fijadas en la Tabla 5, sin embargo, las formulaciones incluyen típicamente mezclas de las siguientes enzimas: glucoamilasa (GA-L® de Danisco US, Inc., Genencor División) ; pectinasa (MULTIEFECT® Pectinase de Danisco US, Inc. , Genencor División) ; celulasa (GC220 celulasa de Danisco US, Inc., Genencor División) ; y hemicelulasa ( ACCELLERASE® de Danisco US, Inc. , Genencor División) . Estas enzimas son agregadas a una fermentación de melazas usando el método en el Ejemplo 2. Se analiza el efecto en la fermentación de melazas con y sin 3 ppm de proteasa fúngica ácida. Ya que hay mucha proteína en las melazas, se hipotetiza que la proteasa puede incrementar la eficiencia de la fermentación por incrementar el acceso de enzimas a las moléculas de almidón. De esta forma, la formulación C+ en la tabla 6 incluye 3 ppm de FERMGEN® una proteasa fúngica ácida de Danisco US, Inc., Genencor División en mezcla con 3 ppm de formulación C. En la tabla 6 el rendimiento de etanol es dado con respecto a melazas 1MT a 95.5% de etanol (L) en 20°C. Las abreviaciones usadas en la Tabla son como a continuación: TG (transglucosidasa) ; Gluc (glucosa) ; Fruc (fructosa) ; ácido suc (ácido succínico) ; ácido Lac (ácido láctico) ; Glyc (glicerol) ; ácido acet (ácido acético) ; EtOH (etanol) .

Tabla 5: Información en la formulación de enzimas C y D GC626 (g) GA-L- (g) PECTINASA ACELARASA Suma (g) (g) (g) c 30.352 5.0888 5.0157 5.98 46.4365 D 15.1495 7.6856 1.351 7.3383 45.5244 Tabla 6; Resultados de fermentación por HPLC y destilación La Tabla 6 muestra los resultados de análisis de HPLC y destilación. Como se observa en la tabla, cada una de las mezclas de enzimas (C, D y C+ FERMGEN) resultan en una fermentación más efectiva y eficiencia de fermentación incrementada. Sin ayuda de una teoría particular, la alfa amilasa (GC626) probablemente hidroliza el residuo de almidón sin purificar en las melazas, mientras que la glucoamilasa hidroliza los azúcares superiores y oligosacáridos , la proteasa fúngica ácida hidroliza probablemente la proteína en las melazas, generando nitrógeno de amino libre, el cual ayuda al crecimiento de la levadura.

Es de interés analizar el efecto combinado de la adición de transglucosidasa con estas enzimas en fermentación de melazas. De esta forma, en el Ejemplo 5, se prueba la transglucosidasa con estas enzimas secundarias en fermentaciones de melazas .

Ej emplo 5 Formulación de TG con otras enzimas Se usan las melazas de Tailandia en las fermentaciones. Las fermentaciones son realizadas como en el Ejemplo 2. Las mezclas son preparadas las cuales contienen mezclas de transglucosidasa, enzimas de hidrolización de almidón granular (GC626), glucoamilasa (GA) , pectinasa, celulasas y hemicelulasas para crear la formulación E y F como se enlista en la Tabla 7 posterior. Además, la proteasa fúngica ácida de Danisco US, Inc., Genencor Divisioin, FERMGEN®, se agrega también a las formulaciones E y F en 6 ppm. En la tabla 8, los valores ppm dados en las columnas E y F son para la enzima total en la formulación. Por ejemplo, E+FERMGEN contiene 3 ppm E y 3 ppm de FERMGEN. En la tabla 9 el rendimiento de etanol es dado con respecto a melazas IMT a 95.5% de etanol (L) en 20°C. Las abreviaciones usadas en la Tabla son como a continuación: T(h) (tiempo en horas); TG (transglucosidasa) ; Gluc (glucosa) ; Fruc (fructosa) ; ácido suc (ácido succínico) ; ácido Lac (ácido láctico) ; Glyc (glicerol) ; ácido Acet (ácido acético); EtOH (etanol.

Tabla 7 : Formulaciones TG TG -L500 GC626 GA (g) Acelerasa Pectinasa Suma (G) (g) (g) (g) (g) E 5. 0289 30.0386 5.1415 5.11 5.1931 50.5121 F 15 .0848 15.4977 7.2614 8.0705 15.0686 60.983 Tabla 8: Adición de proteasa füngica ácida (FERMGEN) Mezclas FERMGEN E F 1# Testigo / / / 3# E / 6 ppm / 4# E+FERMGEN 3 ppm 3 ppm / 5# F / / 6' ppm 6# F+FERMGEN 3 ppm / 3 ppm Tabla 9. Resultados de Fermentación por HPLC y destilación 10 La Tabla 9 muestra los resultados de tanto HPLC y destilaciones usando las formulaciones E y F en la presencia o ausencia de FER GEN. Los resultados muestran que hay un incremento en la cantidad de etanol producido durante la fermentación para tanto las formulaciones E y F. Sin embargo, la proteasa adicional no ayuda además a incrementar el contenido de alcohol, esto puede ser debido a la dilución de las enzimas más efectivas en las formulaciones E y F.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior son incorporadas en la presente para referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos descritos y sistema de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica sin alejarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con modalidades preferidas específicas, debe ser entendido que la invención como se reclama no debe ser limitada indebidamente a ninguna modalidad específica. En efecto, las varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención las' cuales son obvias para aquellos expertos en la técnica debe estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (32)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para incrementar el rendimiento de fermentación de melazas en un medio de fermentación caracterizado porque comprende poner en contacto las melazas con una composición de enzimas la cual comprende por lo menos una transglucosidasa capaz de hidrolizar azúcares no fermentables como la rafinosa y/o estaquiosa.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la adición de una o más enzimas secundarias para hidrolizar el almidón granular, proteínas y/o almidón residual en las melazas.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los azúcares fermentables a partir de melazas en la reacción de fermentación son convertidos para obtener productos finales, como un alcohol, un ácido orgánico o un bioquímico de especialidad.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el alcohol es etanol .

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el ácido orgánico es ácido láctico o ácido cítrico.

6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el bioquímico de especialidad es un aminoácido .

7. Un método para incrementar los azúcares fermentables en melazas, caracterizado porque comprende poner en contacto melazas con por lo menos una enzima transglucosidasa para obtener azúcares fermentables.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende fermentar los azúcares fermentables a productos finales en la presencia de microorganismos de fermentación.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el poner en contacto y la fermentación . ocurren simultáneamente o en donde el poner en contacto es un pretratamiento.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque las melazas comprenden almidón no fermentable y el poner en contacto, pretratamiento y/o fermentación ocurren en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el almidón no fermentable es almidón granular .

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la temperatura de poner en contacto y/o pretratamiento está abajo de aproximadamente 52 °C.

13. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la temperatura de fermentación es de aproximadamente 15 a 40 °C.

14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la fermentación, poner en contacto y temperatura de pretratamiento es de aproximadamente 15 a 40°C.

15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el poner en contacto y/o pretratamiento se realiza en un pH de aproximadamente 2.0 a 7.0.

16. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la fermentación es realizada en un pH de aproximadamente 3.5 a 7.0.

17. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende poner en contacto las melazas con por lo menos una enzima hidrolizante de almidón granular (GSHE) .

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la GSHE es una alfa amilasa o una glucoamilasa .

19. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende poner en contacto las melazas con por lo menos otra enzima, tal como hemicelulasa, una celulasa, una pectinasa, una proteasa, beta-glucosidasa , una alfa amilasa no GSHE, y/o una glucoamilasa no GSHE.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteasa es una proteasa fúngica ácida .

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la proteasa fúngica ácida es de las especies Aspergillus o Trichoderma.

22. Un método para producir etanol a partir de melazas, caracterizado porque comprende poner en contacto las melazas con por lo menos una enzima transglucosidasa -y fermentar las melazas en la presencia de un organismo de fermentación para producir etanol .

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el poner en contacto y la fermentación ocurren simultáneamente o el poner en contacto ocurre como un pretratamiento .

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las melazas comprenden almidón granular y el poner en contacto, fermentación y/o pretratamiento ocurre en una temperatura abajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular.

25. Una composición de azúcar fermentable caracterizada porque comprende azúcares fermentables hechas por cualquiera de los métodos de conformidad con las reivindicaciones precedentes.

26. Un método para incrementar el rendimiento de fermentación de melazas en una reacción de fermentación, caracterizado porque comprende poner en contacto las melazas con una composición de enzima la cual comprende por lo menos una transglucosidasa para incrementar los azúcares fermentables en las melazas.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque además comprende fermentar los azúcares fermentables para producir etanol.

28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además poner en contacto las melazas con por lo menos una' GSHE, tal como alfa amilasa y/o una glucoamilasa.

29. Una composición para fermentación de melazas caracterizada porque comprende por lo menos una transglucosidasa en una cantidad efectiva para hidrolizar rafinosa y/o estaquiosa en melazas.

30. La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque además comprende por lo menos una GSHE como glucoamilasa y/o alfa amilasa.

31. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque además comprende por lo menos otra enzima como la celulasa, una beta-glucosidasa , una beta-glucanasa, una proteasa fúngica ácida, una dextrinasa o una alfa galactosidasa.

32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque comprende una alfa amilasa, una hemicelulasa, una glucoamilasa, una proteasa fúngica ácida.