CN104357426B - 一种用于甘蔗糖蜜发酵的复合酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于甘蔗糖蜜发酵的复合酶及其制备方法和应用，按重量份比计，该复合酶包括纤维素酶4～10份、木聚糖酶3～8份、β‑甘露聚糖酶2～8份、糖化酶3～10份、蛋白酶1～5份、植酸酶1～3份和右旋糖酐酶0.5～1份。制备方法为：将上述原料酶灭菌，然后按配比混合，最后通过均匀混料、真空包装即可。本发明复合酶应用于甘蔗糖蜜燃料乙醇的生产，复合酶稳定性好，可以增加发酵糖含量8％以上，减少20％外源营养素的添加，提高发酵醪的纯度，提高原料利用率，降低废液排放量及其对环境的影响，本发明不改变原有的糖蜜乙醇生产工艺，操作简单。

Description

一种用于甘蔗糖蜜发酵的复合酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，尤其涉及一种利用甘蔗糖蜜产燃料乙醇的复合酶及其制备方法和应用。
背景技术
糖蜜又称为废糖蜜(最终糖蜜)，糖蜜按来源可分为：甘蔗、甜菜、玉米和甜高粱等糖蜜。甘蔗糖蜜是甘蔗制糖厂在整个制糖工艺流程中产生的最主要的副产品，它是甘蔗经过压榨车间压榨提汁，混合蔗汁经过絮凝澄清，过滤处理之后，再对清汁进行蒸发浓缩，精炼结晶，分蜜处理后分离出来的带有苦涩味的褐色粘稠状液体，产量一般为甘蔗质量的3％左右，常被用来做生物燃料乙醇、酵母、饲料、氨基酸和焦糖色素等的生产原料。甘蔗糖蜜的组成成分十分复杂，因种植的甘蔗品种不同，收割时甘蔗成熟度不同，甘蔗的生长气候不同，土壤条件的差异，以及各个糖厂的加工方法不同，它的组成成分含量也会有所差异，但是这个差异并不大。甘蔗糖蜜的主要成分如下表1所示。
表1 甘蔗糖蜜的主要成分含量
在以往的工艺中，糖蜜用于乙醇生产不需要复合酶，因为其中所含的蔗糖分可直接被酵母所利用而发酵成乙醇。为了让酵母生长繁殖旺盛和缩短发酵时间，有些企业会在发酵阶段添加氮源、磷源、镁盐和生长素等营养成分，虽然发酵速度会提高很快，但是也导致醪液中杂菌增多，酸度提高，而致使原料利用率低等问题。随着原料成本的提高及企业对节能减排的需要，进一步提高糖蜜生产乙醇的生产效率问题尤为重要。酶制剂的应用可以把糖蜜中的一些不可被酵母直接利用的组分(如淀粉和非发酵糖)转化为发酵糖，也可以改善糖蜜的营养组成，减少外源营养素的添加，抑制杂菌的生长，从而提高原料的利用率，降低废液排放量及其对环境的影响。
中国发明专利“用于糖蜜发酵的复合酶及其制备方法和用途”(申请号：201210112376.2)公布了一种用于糖蜜发酵的复合酶制备方法，其配方包括：酸性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶以及少量的糖化酶。该发明用于糖蜜发酵，适用性较宽，目标原料针对性不强，未考虑不同来源糖蜜组分的差异而对复合酶系的组成配比也会有所不同。通常，来源不同的糖蜜，其组分会有所差异，如甘蔗糖蜜成分与甜菜糖蜜成分相比，甘蔗糖蜜所含的总糖分(蔗糖分、还原糖分)较多，达到46％～56％，尤其是还原糖含量要比甜菜糖蜜多得多(8～10％左右)，甜菜废蜜所含的总糖量相对少，且几乎全部是蔗糖，只有极少的还原糖(0～0.3％左右)和特有的棉籽糖。其次，甘蔗糖蜜成微酸性(pH 6.2)，甘蔗糖蜜中的总氮量即含氮化合物相对较低(0.5％左右)，而甜菜糖蜜则成微碱性(pH 7.4)，甜菜糖蜜中含有大量甜菜碱和谷氨酸等含氮物质(1.68～2.3％)。再者，甘蔗废糖蜜中钙与磷的含量相对甜菜废蜜也高得多。此外，甜菜中还含有3％～4％的可溶性胶体，主要为木糖胶、阿拉伯糖胶和果胶等，而甘蔗糖蜜中果胶含量极低，这些组成上的差异必定对复合酶的适用性提出更高要求。该发明并不能针对目标原料的差异性，对复合酶进行科学合理的配制。因此，该发明的酶组合必然导致成本过高(200ml稀糖蜜(25°Bx)添加0.1g复合酶)，缺乏实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于针对目前甘蔗糖蜜乙醇发酵过程中原料利用率低、发酵时间长及废醪液大等问题，提供一种用于甘蔗糖蜜发酵的复合酶，其作用于糖蜜中的非发酵性糖组分，将其水解成可发酵性糖，同时也改善酵母营养液组成，达到缩短发酵时间，提高原料利用率以及乙醇产量、质量等目的。同时提供该复合酶的制备方法。
本发明的另一目的是提供所述复合酶在甘蔗糖蜜乙醇发酵中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
一种甘蔗糖蜜发酵乙醇复合酶，按重量份比计，该复合酶包括纤维素酶4～10份、木聚糖酶3～8份、β-甘露聚糖酶2～8份、糖化酶3～10份、蛋白酶1～5份、植酸酶1～3份和右旋糖酐酶0.5～1份。
其中，对各种酶的优化：纤维素酶活力不低于50000U/g，木聚糖酶活力不低于10000U/g，β-甘露聚糖酶活力不低于10000U/g，糖化酶活力不低于3000U/g，蛋白酶活力不低于50000U/g，植酸酶活力不低于5000U/g，右旋糖酐酶活力不低于30000U/g。
优选地，该复合酶由纤维素酶8份、木聚糖酶5份、β-甘露聚糖酶4份、糖化酶6份、蛋白酶3份、植酸酶1份和右旋糖酐酶1份组成。
上述复合酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)将原料酶分别进行灭菌处理，然后按如下配比混合：
按重量份比计，纤维素酶4～10份、木聚糖酶3～8份、β-甘露聚糖酶2～8份、糖化酶3～10份、蛋白酶1～5份、植酸酶1～3份和右旋糖酐酶0.5～1份；
(2)然后通过均匀混料、真空包装即可。
所述的纤维素酶优选由内切葡聚糖酶(Cx)、外切葡聚糖酶(C1)、β～葡聚糖苷酶和纤维二糖酶组成的复合体。
所述的蛋白酶优选酸性蛋白酶。
上述复合酶在甘蔗糖蜜生产燃料乙醇的应用方法，包括如下步骤：(1)酵母培养液的制备：将供酵母培养用的甘蔗糖蜜进行连续稀释，先用60℃温水将糖蜜稀释至55～58°Bx，同时添加浓硫酸调整酸度pH 3.0～3.8，进行酸化，加热100℃后添加4～8ppm的聚丙烯酰胺，搅拌均匀，絮凝澄清，静止1小时，取上清液，再稀释到干固物含量为12％～14％的浓度，用于酵母培养液；将培养好的成熟酵母液中取出15-25％作为酒母种，其余送入发酵罐中；
(2)稀糖液的发酵：供发酵醪用的糖蜜经连续稀释器一次加水稀释至干固物含量30％～35％的浓度，然后与上述(1)制备的酵母培养液一同流入主发酵罐内，调整pH 4.0～4.5；所述复合酶加入储藏时的供发酵醪用的糖蜜中或加入发酵罐中，经发酵，最后得到乙醇产品。
所述流入发酵罐的酵母培养液占发酵醪总容量的15～40％；
所述发酵罐内还加入营养盐，营养盐的配方为：硫酸铵，用量为糖蜜重量的0.06％～0.12％；磷酸钙，用量为糖蜜重量的0.10～0.25；和硫酸镁，用量为糖蜜重量的0.04～0.05％；
所述复合酶的添加量为5～15mg/kg糖蜜。
本发明根据甘蔗糖蜜组分特点及理化特性，结合燃料乙醇生产工艺，强化增加可发酵性糖含量和改善发酵醪液营养性的作用，选用了适合甘蔗糖蜜发酵特性的纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶等酶制剂，通过纤维素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、糖化酶、蛋白酶、植酸酶和右旋糖酐酶的相应配比，能高效的降解糖蜜中的非发酵性糖为可发酵性糖。同时，也能显著提高发酵液的氮、磷等营养盐成分，利于酵母的茁壮生长。
根据本发明配方，加入甘蔗糖蜜以后，各种酶的协同复合作用体现在：
充足的纤维素酶：水解糖蜜溶液中的纤维素，破坏其链状结构及其半纤维素构成的网状细胞壁结构，释放出其中被包裹的淀粉颗粒，从β-1,4-糖苷键纤维素分子链的一端切断纤维素分子，并形成纤维二糖，而其中的纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成葡萄糖。因此，会使得纤维二糖的含量在发酵过程中处于低浓度水平，从而诱导纤维素酶降解纤维素。
适量的木聚糖酶、β-甘露聚糖酶：木聚糖结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，这些纤维构成了坚硬的细胞网络结构。通过木聚糖酶、β-甘露聚糖酶对木聚糖、甘露聚糖的协同水解作用，降低其和纤维素的链接，从而增加纤维素酶对纤维素吸附，提高纤维素的利用率，使发酵液中的半乳糖、葡萄糖、果糖和蔗糖含量有所增加。
充足的糖化酶：协同纤维素酶将糖蜜中的淀粉水解为酵母可发酵利用的葡萄糖。
适量的右旋糖酐酶：通过右旋糖酐酶和糖化酶的协同作用，降解制糖生产中因肠膜明串珠菌感染而形成的“蔗饭”。同时，还可以降低糖蜜粘度，使渗透压更趋于适宜的程度，利于酵母细胞质膜的吸收，酵母的生长更为迅速。
适量的植酸酶和蛋白酶：适量的植酸酶可以分解植酸，释放出磷离子、被植酸螯合的矿物元素及蛋白质和氨基酸等营养盐。另外，甘蔗糖蜜含氮约0.5％，其中能被酵母利用的氨基态氮及其它氮素仅为20％-25％，即150克糖蜜中含有能被利用的氮0.15克，适量的蛋白酶与植酸酶协同作用下，可以更有效的分解糖蜜中的蛋白质，提高酵母可利用的氮源。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明应用于甘蔗糖蜜燃料乙醇的生产，复合酶加入操作简单，稳定性好，可以增加发酵糖含量8％以上，提高发酵醪的纯度，提高原料利用率。
(2)本发明复合酶可有效的把糖蜜中的一些不可被酵母直接利用的组分(如淀粉和非发酵糖)转化为发酵糖，同时也改善了糖蜜的营养组成，减少20％外源营养素的添加，抑制杂菌的生长，降低酸度，减少了辅助原料的消耗和水、电、汽等动力消耗，发酵时间缩短10％，从而提高原料的利用率，降低废液排放量及其对环境的影响，本发明不改变原有的糖蜜乙醇生产工艺，操作简单易行。
(3)不增加生产成本，提高产品质量，酒精产量可以提高5％以上，每吨酒精生产中排放的废液量可以降低15％。
附图说明
图1是本发明糖蜜酒精发酵过程流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。常规市售发酵用的纤维素酶、蛋白酶以及植酸酶等类酶都可直接用于本发明。
实施例1
一种用于甘蔗糖蜜发酵的复合酶：
按重量份比计，原料配方如下：
纤维素酶10份、木聚糖酶8份、β-甘露聚糖酶8份、糖化酶10份、蛋白酶5份、植酸酶3份和右旋糖酐酶1份。
制备方法为：将原料酶分别经过灭菌处理，再按比例进入自动混合机复配，然后通过真空包装，成为产品。
实施例2
按重量份比计，原料配方如下：纤维素酶10份、木聚糖酶6份、β-甘露聚糖酶5份、糖化酶8份、蛋白酶4份、植酸酶3份和右旋糖酐酶0.5份。制备方法与实施例1相同。
实施例3
按重量份比计，原料配方如下：纤维素酶8份、木聚糖酶5份、β-甘露聚糖酶4份、糖化酶6份、蛋白酶3份、植酸酶1份和右旋糖酐酶1份。制备方法与实施例1相同。
实施例4
复合酶强化酵母发酵生产乙醇的方法
(1)原糖蜜预处理：
用60℃温水将浓度为88°Bx的甘蔗糖蜜进行稀释至58°Bx，同时添加浓硫酸调整酸度pH3.6，加热100℃后，添加4ppm的聚丙烯酰胺，搅拌均匀，絮凝澄清，静止1小时，取上清液备用。
(2)酵母的培养液制备：
取经过上述步骤(1)预处理的糖蜜，加水稀释到浓度为13°Bx，将酿酒酵母As2.1190(GIM2.43又名古巴Ⅱ)加入到该稀释后的糖蜜中；28℃下培养15h，利用平板计数法测得此时菌液中单一菌落数为l.8×109cfu/ml，得到接种菌液，将其中取出20％作为酒母种，其余送入发酵罐中。
(3)稀糖蜜的发酵：取经过上述步骤(1)预处理的糖蜜加水稀释至浓度30°Bx，加入营养盐，投加量分别为：硫酸铵0.06％(对糖蜜量)，磷酸钙0.12％(对糖蜜量)以及硫酸镁0.05％(对糖蜜量)，然后，与上述(2)制备的酵母接种菌液一同流入主发酵罐内，酵母接种菌液的接种量为25％，用10％的硫酸调整pH4.5，最后，将实施例3制得的复合酶直接投加在发酵罐内，投加量为8mg/kg糖蜜，混匀。发酵温度控制在30±2℃，酶解发酵18小时后，得到成熟醪。取样检测分析其指标为：残糖0.5％；酒精含量13.2％；酸度5.2°；浓度9°Bx；镜检杂菌不明显，酵母形态正常。
实施例5
(1)原糖蜜预处理：
用60℃温水将浓度为88°Bx的甘蔗糖蜜进行稀释至58°Bx，同时添加浓硫酸调整酸度pH3.8，加热100℃后，添加4ppm的聚丙烯酰胺，搅拌均匀，絮凝澄清，静止1小时，取上清液备用。
(2)酵母的培养液制备：
取经过上述步骤(1)预处理的糖蜜，加水稀释到浓度为13°Bx，将酿酒酵母As2.1190(GIM2.43又名古巴Ⅱ)加入到该稀释后的糖蜜中；28℃下培养15h，利用平板计数法测得此时菌液中单一菌落数为1.8×109cfu/ml，得到接种菌液，将其中取出20％作为酒母种，其余送入发酵罐中。
(3)糖蜜的发酵：
将甘蔗原糖蜜加水稀释至浓度35°Bx，然后与上述(2)制备的酵母接种菌液一同流入主发酵罐内，酵母接种菌液的接种量为30％，用10％的硫酸调整pH 4.5，将实施例3制得的复合酶直接投加在发酵罐内，投加量为8mg/kg糖蜜，混匀。发酵温度控制在30±2℃，酶解发酵18小时后，得到成熟醪。取样检测分析其指标为：残糖0.7％；酒精含量11.5％；酸度5.5°；浓度9.5°Bx；镜检杂菌不明显，酵母形态正常。
实施例6
在糖蜜储藏时投加复合酶强化糖蜜发酵燃料乙醇的方法
将实施例3制得的复合酶直接投加在糖蜜储存罐内放置24小时以上，投加量为5mg/kg糖蜜，通过搅拌均匀混合。该糖蜜以传统双浓度糖蜜乙醇连续发酵的工艺中使用，发酵成熟醪液的酒度可由10％提高到13.2％，发酵效率由原来的90％提高到93％，产量由50吨提高到66吨，每吨酒精消耗标准糖蜜由4.3减少到4.1，燃煤消耗由0.6吨减少到0.4吨，每吨酒精排放废液由11.6吨减少到7.5吨。
实施例7
本实施与实施例4的不同之处在于：复合酶投加量为5mg/kg糖蜜
采用实施例1制得的复合酶进行发酵。
发酵产品检测分析其指标为：残糖0.6％；酒精含量12.5％；酸度5.3°；浓度9.5°Bx；镜检杂菌不明显，酵母形态正常。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本方面进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者进行替换，而不脱离本发明的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之内。

Claims (9)

1.一种用于甘蔗糖蜜发酵的复合酶，其特征在于，按重量份比计，该复合酶由纤维素酶4～10份、木聚糖酶3～8份、β-甘露聚糖酶2～8份、糖化酶3～10份、酸性蛋白酶1～5份、植酸酶1～3份和右旋糖酐酶0.5～1份组成；所述纤维素酶活力不低于50000U/g，木聚糖酶活力不低于10000U/g，β-甘露聚糖酶活力不低于10000U/g，糖化酶活力不低于3000U/g，酸性蛋白酶活力不低于50000U/g，植酸酶活力不低于5000U/g，右旋糖酐酶活力不低于30000U/g。
2.根据权利要求1所述的复合酶，其特征在于，所述的纤维素酶是由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶，纤维二糖酶组成的复合体。
3.根据权利要求1或2所述的复合酶，其特征在于，该复合酶由纤维素酶8份、木聚糖酶5份、β-甘露聚糖酶4份、糖化酶6份、酸性蛋白酶3份、植酸酶1份和右旋糖酐酶1份组成。
4.权利要求1或2或3所述复合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将原料酶分别进行灭菌处理，再按配比混合，
(2)然后通过均匀混料、真空包装即可。
5.权利要求1或2或3所述的复合酶在甘蔗糖蜜生产燃料乙醇的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述复合酶在糖蜜发酵醪中进行发酵，发酵条件为温度28～32℃，时间18～22小时，然后物料进入成熟醪的蒸馏与精馏工序，最后得到酒精或燃料乙醇产品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
(1)酵母培养液的制备：将供酵母培养用的甘蔗糖蜜进行连续稀释，先用60℃温水将糖蜜稀释至55～58°Bx，同时添加浓硫酸调整酸度pH 3.0～3.8，进行酸化，加热100℃后添加4～8ppm的聚丙烯酰胺，搅拌均匀，絮凝澄清，静止1小时，取上清液，再稀释到干固物含量为12％～14％的浓度，用于酵母培养液；
(2)稀糖液的发酵：供发酵醪用的糖蜜经连续稀释器一次加水稀释至干固物含量30％～35％的浓度，然后与上述(1)制备的酵母培养液一同流入主发酵罐内，调整pH 4.0～4.5；所述复合酶加入储藏时的供发酵醪用的糖蜜中或加入发酵罐中，经发酵，最后得到乙醇产品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述流入发酵罐的酵母培养液占发酵醪总容量的15～40％；所述发酵罐内还加入营养盐，营养盐的配方为：硫酸铵，用量为糖蜜重量的0.06％～0.12％；磷酸钙，用量为糖蜜重量的0.10～0.25；以及硫酸镁，用量为糖蜜重量的0.04～0.05％。
9.根据权利要求6或7或8所述的应用，其特征在于，所述复合酶的添加量为5～15ppm。
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