CN107354143A - 一种固定化β‑葡萄糖苷酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种固定化β‑葡萄糖苷酶及其制备方法和应用，步骤为（1）大孔树脂预处理；（2）大孔吸附树脂NKA‑9聚醚酰亚胺表面改性；（3）大孔树脂吸附β‑葡萄糖苷酶；（4）戊二醛交联反应修饰。本发明首次利用金属离子Zn2+作为利用大孔吸附树脂固定化β‑葡萄糖苷酶的激活剂、热稳定剂。Zn2+的参与使β‑葡萄糖苷酶的催化效率提高了20%以上；使固定化酶NKA‑9II的催化效率提高了92%以上。相对于起始酶活，Zn2+的参与，在85℃条件下，温育7 h，固定化酶NKA‑9II的酶活还保持在80%以上；90℃条件下温育7 h，固定化酶NKA‑9II的酶活还保持在54%以上。

Description

一种固定化β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于酶工程和生物工程应用领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法和应用，尤其涉及β‐葡萄糖苷酶的固定化方法及利用Zn2+提高其固定化酶催化能力及酶学特性的方法应用。
背景技术
β‐葡萄糖苷酶(β‐glucosidase，EC 3.2.1.21)属于外切水解酶类，又称β‐D‐葡萄糖苷水解酶，可以在短链的纤维寡糖或纤维二糖内部打断β‐1，4‐糖苷键，也可以在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断β‐1，4‐糖苷键，因而被广泛应用纤维素水解、黄酮类化合物和皂苷类等天然活性物质的生物催化和转化等领域。但制约着β‐葡萄糖苷酶规模化应用的主要障碍是酶的使用成本高。一是游离酶只能使用一次，而且在实际使用环境下，酶的温度和pH等酶学性质不稳定，酶易失活。解决这一问题的有效途径之一是将酶固定化。酶的固定化不仅能显著提高酶的使用次数，而且固定化酶的酶学特性会有不同程度的改善。
酶的固定技术包括物理吸收法，包埋法和共价结合法等。其中载体和蛋白质之间通过简单吸附作用固定酶蛋白，优势在于不会破坏酶蛋白的空间构象以及活性位点，但缺点在于载体和酶之间的结合非常弱，酶易泄漏丢失。解决这一难题可以从以下几个方面来实现：(1)不同的吸附材料具有不同的吸附能力，不同的酶也具有不同的被吸附的特性。要针对特定的酶，选择吸附能力强的固定化材料。研究表明，在许多固定化酶载体中，大孔吸附树脂具有相对较大的比表面积和孔径，具有很好的热稳定性。(2)对大孔树脂进行修饰、改造，集成包埋法等酶固定化方法，提高载体和酶之间的结合力。(3)通过筛选，引入固定化酶的激活剂、稳定剂等。
目前，随着研究的深入和应用领域的拓宽，GH3家族的β‐葡萄糖苷酶(如来源于Thermotoga petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶Tpebgl3)、GH1家族的β‐葡萄糖苷酶(如来源于Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH1家族的β‐葡萄糖苷酶)相继被开发利用，它们具有优良的催化特性，其基因重组菌也实现了较高水平的表达，在植物纤维原料糖化、天然活性物质生物催化与转化等领域中具有很大的应用潜力。但这些酶还不能满足工业化应用的需求，主要表现在pH稳定性，糖的耐受性、温度稳定性等方面性质还需改善，而且酶的使用成本偏高。
本发明在通过大量筛选，获得优良的固定β‐葡萄糖苷酶的大孔树脂NKA‐9的基础上，通过利用化学试剂聚醚酰亚胺(PEI)对大孔树脂NKA‐9进行修饰和改造，利用戊二醛作为交联剂，制备固定化酶，并通过大量筛选，引入金属离子Zn2+作为固定化酶的激活剂。发明的β‐葡萄糖苷酶固定化技术显著提高了来源于Thermotoga petrophila DSM 13995等微生物的GH3、GH1家族的β‐葡萄糖苷酶的酶催化活力和重复利用次数，显著改善了固定化酶的热稳定性和在溶液中的pH稳定性，有效提高了固定化酶的耐糖能力。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一种固定化β‐葡萄糖苷酶及其制备方法和应用，具体为利用大孔吸附树脂NKA‐9固定GH3、GH1β‐葡萄糖苷酶和利用金属离子Zn2+提高固定化酶催化能力及改善固定化酶酶学特性的方法。
技术方案：一种固定化β‐葡萄糖苷酶的制备方法，步骤为：(1)大孔树脂预处理：通过加入乙醇，盐酸和氢氧化钠对大孔树脂进行预处理，除去杂质和污染物；(2)大孔吸附树脂NKA‐9聚醚酰亚胺表面改性：将质量浓度不超过12％的聚醚酰亚胺加入大孔树脂中反应，反应后利用去离子水洗涤；按比例，在100mL pH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺质量浓度为8％，树脂量为50g，此时，β‐葡萄糖苷酶蛋白吸附量最高；(3)大孔树脂吸附β‐葡萄糖苷酶：将β‐葡萄糖苷酶与聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂混合，进行吸附作用；按比例，在100mLpH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂质量为10g，β‐葡萄糖苷酶蛋白浓度为0.5mg/mL；(4)戊二醛交联反应修饰：将质量浓度不超过2.0％的戊二醛加入到利用聚醚酰亚胺改性后并吸附了β‐葡萄糖苷酶的大孔树脂混合，反应后利用去离子水涤，按比例，在100mL的反应体系中，戊二醛质量浓度为0.25％，吸附β‐葡萄糖苷酶的聚醚酰亚胺修饰的树脂质量为10g。
优选的，上述步骤(1)具体处理方法为：按比例，首先将20g大孔树脂加入到含有100mL的无水乙醇中浸泡24小时，然后用去离子水反复洗涤至无乙醇气味残留；然后将处理过的大孔树脂浸泡在含5wt.％盐酸的100mL溶液中4h，接着利用去离子水将树脂洗涤至中性pH；接着将洗涤干净的树脂浸入含100mL 1M氢氧化钠溶液中浸泡4小时，继续用去离子水将树脂洗涤至中性pH。
优选的，上述大孔树脂为NKA‐9。
优选的，上述聚醚酰亚胺的质量浓度为8％。
优选的，上述戊二醛的质量浓度为0.25％。
优选的，上述β‐葡萄糖苷酶为Thermotoga petrophila DSM 13995等来源的GH3家族、GH1家族等家族的β‐葡萄糖苷酶。
优选的，上述制备方法制备得到的固定化β‐葡萄糖苷酶。
优选的，上述固定化β‐葡萄糖苷酶的应用，反应体系中含有Mn2+或Zn2+。
优选的，反应体系为200μL，含10μL 100mM纤维二糖，190μL 100mM的pH5.0柠檬酸Na2HPO4缓冲液，10mg的固定化酶，Mn2+或Zn2+的浓度为1～3mM。
优选的，上述Zn2+的浓度为2mM。
有益效果：1、本发明利用特定浓度的聚醚酰亚胺(PEI)处理的大孔树脂NKA‐9固定β‐葡萄糖苷酶。然后利用特定浓度的戊二醛作为固定化的交联剂制备固定化酶。固定来源于Thermotoga petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶时，该固定化酶NKA‐9II的最适反应温度为85‐90℃，最适pH为5.0。该固定化酶的热稳定性、pH稳定性和葡萄糖耐受性相比游离酶有着显著提高。在Zn2+参与的条件下，固定化酶在重复利用10次，其固定化酶的剩余酶活力保持在78％以上。2、本发明首次利用金属离子Zn2+作为利用大孔吸附树脂固定化β‐葡萄糖苷酶的激活剂、热稳定剂。相比未加Zn2+制备的固定化酶，Zn2+的参与使固定Thermotoga petrophila DSM 13995GH1家族的β‐葡萄糖苷酶的的催化效率提高了20％以上；使固定化酶NKA‐9II的催化效率提高了92％以上。相对于起始酶活，Zn2+的参与，在85℃条件下，温育7h，固定化酶NKA‐9II的酶活还保持在80％以上；90℃条件下温育7h，固定化酶NKA‐9II的酶活还保持在54％以上。3、本发明首次在固定化酶NKA‐9II中加入金属离子Zn2+，能有效提高固定化酶的葡萄糖耐受性，在Zn2+加入的条件下，在葡萄糖浓度为400mM时，固定酶NKA‐9II的相对酶活力保持在63％以上。
附图说明
图1：聚醚酰亚胺(PEI)的浓度对大孔树脂固定T.DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶效果的影响。
图2：戊二醛浓度对大孔树脂固定T.DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶效果的影响。
图3：固定化酶NKA‐9II的最适反应温度。
图4：固定化酶NKA‐9II的最适反应pH。
图5：固定化酶NKA‐9II在不同温度条件下的热稳定性。
图6：固定化酶NKA‐9II在不同pH条件下的稳定性。
图7：Zn2+对固定化酶NKA‐9II的重复利用次数的影响。
图8：Zn2+对固定化酶NKA‐9II热稳定性的影响。
图9：Zn2+对固定化酶NKA‐9II的葡萄糖耐受性的影响。
图10：Zn2+对固定化酶催化效率的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种利用大孔吸附树脂NKA‐9固定GH3、GH1β‐葡萄糖苷酶和利用金属离子Zn2+提高固定化酶催化能力及改善固定化酶酶学特性的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
实施例1.T.petrophila DSM 13995来源的GH3家族的β‐葡萄糖苷酶克隆及重组酶制备
1.1 T.petrophila DSM 13995的培养
Thermotoga petrophila DSM 13995购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为13995。其培养基配方为：10g/L starch，5g/L tryptone，3g/L yeast extract，5g/Lmeat extract,10g/L2‐morpholinoethanesulfonic,10mg/L FeSO4×7H2O，1mg/Lresazurin,调整pH为7.2。用注射器按照0.5％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。
1.2基因组DNA的提取
(1)静置培养Thermotoga petrophila DSM 13995约24小时，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。
(2)用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。
(3)加入1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。
(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。
(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。
(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。
(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。
(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。
(9)室温下风干，加500μL TE缓冲液溶解。
(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。
1.3重组质粒pET20b‐TPEBGL3的构建
按照已知的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高糖β‐葡萄糖苷酶基因设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。P1：CGCCATATGATGGGAAAGATCGATGAAA，下划线表示Nde I位点。P2：CCGCTCGAGTGGTTTGAATCTCTTCTCT，下划线表示Xho I位点，并去除终止密码子。以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Thermotoga petrophila DSM 13995耐高温β‐葡萄糖苷酶基因。
将得到的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高温β‐葡萄糖苷酶基因和pET‐20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高糖β‐葡萄糖苷酶基因的重组质粒pET20b‐TPEBGL3。
1.4重组酶的制备
将重组质粒pET20b‐TPEBGL3转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。去上清，加入无菌水，超声波破碎细胞，离心取上清。由于重组质粒pET20b‐TPEBGL3中含有His‐tag标签，通过His·Bind Purification Kit(Novagen)进行纯化，得到纯化的Thermotoga petrophila DSM 13995来源的GH3家族的β‐葡萄糖苷酶。
实施例2.利用大孔吸附树脂固定来源于T.petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶制备固定化酶(NKA‐9II)
2.1大孔树脂预处理
为了除去大孔树脂中的杂质和污染物，更有效地使大孔吸附树脂载体吸附的酶蛋白量达到最大化，实验通过分别加入乙醇、盐酸和氢氧化钠预处理大孔树脂。首先将大孔树脂(20g)加入到含有100mL的无水乙醇中浸泡24小时，然后用去离子水反复洗涤3次，直至无乙醇气味残留。然后将处理过的大孔树脂浸泡在含5％盐酸的100mL溶液中4h，接着利用去离子水将树脂洗涤至中性pH。接着将洗涤干净的树脂浸入含1M氢氧化钠(100mL)溶液中浸泡4小时，继续用去离子水将树脂洗涤至中性pH，然后将处理完的树脂储存在4℃冰箱中待用。
2.2固定化酶载体的筛选
为了提高大孔吸附树脂对来源于T.petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶固定化效率，试验通过筛选不同类型的大孔吸附树脂H103、NKA‐9、AB‐8、D101、CAD40、CD180吸附来源于GH3家族的β‐葡萄糖苷酶的蛋白，结果见表1，且在10mL反应体系中，包括终浓度为6mg/mL酶蛋白和1g树脂，pH为4.5，其中吸附温度为28℃，摇床转速为150r/min。发现大孔吸附树脂NKA‐9对GH3家族的β‐葡萄糖苷酶的蛋白的吸附率最大，为57％(12h)，酶活为0.55U/g。
2.3大孔吸附树脂NKA‐9聚醚酰亚胺表面改性
试验以浓度为0、2％、4％、6％、8％、10％、12％的聚醚酰亚胺改性大孔树脂NKA‐9(1g)反应时间为4h，其中吸附温度为28℃，摇床转速为150r/min。然后利用去离子水反复洗涤3‐4次，抽滤吸干，检测其被树脂NKA‐9吸附的蛋白量和固定化酶酶活，结果见图1：8％的聚醚酰亚胺处理的树脂对固定化酶具有最大的吸附量和蛋白酶活，单位质量酶活达到1.31U/g，蛋白吸附量达到84.7％。
2.4聚醚酰亚胺表面改性后的大孔吸附树脂NKA‐9的戊二醛交联反应修饰
试验以6％的聚醚酰亚胺改性大孔树脂NKA‐9(1g)反应时间为4h后，直接以浓度为0、0.25％、0.50％、0.75％、1.0％、1.25％、1.5％和2.0％的戊二醛交联用聚醚酰亚胺改性的大孔树脂NKA‐9(1g)，反应时间为2h，其中吸附温度为28℃，摇床转速为150r/min。然后利用去离子水反复洗涤3‐4次，抽滤吸干，制备成利用大孔吸附树脂固定来源于Thermotogapetrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶制备固定化酶。然后检测不同浓度戊二醛处理的固定化酶的酶活，结果见图2：利用浓度为0.25％的戊二醛交联吸附来源于Thermotoga petrophila DSM13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶的8％的聚醚酰亚胺处理的树脂NKA‐9，单位质量酶活最高，为1.7U/g，该处理方式所得的固定化酶被命名为NKA‐9II。
2.5固定化酶NKA‐9II的最适温度、pH、热稳定性和pH稳定性
利用8％的聚醚酰亚胺(PEI)处理的大孔树脂NKA‐9固定来源于Thermotogapetrophila DSM13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶。然后利用0.25％的戊二醛作为固定化的交联剂制备固定化酶。试验通过改变反应温度条件，即在60、65、70、75、80、85、90和95℃条件下确定最适反应温度；在pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和8.0确定最适pH；将制备的固定化酶温育在不同的温度条件(20、30、40、50、60、70、80和90℃)检测固定酶相对于游离酶的热稳定性；最后，常温条件下，改变反应体系中pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和8.0)，温育3h，确定固定化酶相对于游离酶的pH稳定性。确定该固定化酶NKA‐9II的最适反应温度为85‐90℃(图3)，最适pH为5.0(图4)。该固定化酶的热稳定性(图5)、pH稳定性(图6)相比游离酶有着显著提高。
2.6来源于Thermotoga petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶的酶活力测定
2.6.1固定化酶酶活性测定
试验测定来源于Thermotoga petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶和利用树脂制备的固定化酶(NKA‐9II)的活性。一种方法以纤维二糖为底物，在200μL反应体系中，加入10μL 100mM纤维二糖，190μL 100mM的pH5.0柠檬酸Na2HPO4缓冲液，10mg的固定化酶。在90℃的水浴锅中振荡反应20min，然后用冰浴冷却结束反应。然后，通过葡萄糖测定试剂盒通过酶标仪(SpectraMax190)在505nm吸光度检测检测反应样品中葡萄糖的浓度。另一种方法是以对硝基苯酚‐β‐葡萄糖苷(pNP‐G)为底物，200μL反应体系包括190μL 100mM最适pH 5.0缓冲液，10μL 20mM底物，混匀预热后加入10mg的固定化酶反应，5min，然后加入0.6mL 1M NaCO3终止反应，混匀后在405nm条件下酶标仪测定。同时做有有固定化酶无底物的对照和有底物无固定化酶的对照。
酶活的定义：终浓度为5mM纤维二糖或1mM对硝基苯基‐β‐D‐吡喃葡萄糖苷(pNPG)每分钟水解以释放1μmol葡萄糖或pNP，定义为1个酶活单位[U]。
其中，蛋白浓度检测方法则是利用Bradford蛋白测定试剂盒(Sangon Biotech，Shanghai，China)检查蛋白质浓度。
其中对照酶降解纤维二糖的标准曲线，计算固定化酶酶活：
酶活(U/g)＝c×V 1/(t×m)×N
c：由葡萄糖试剂盒提供的测定方法计算出的酶反应后的葡萄糖的生成量(μmol/mL)；
V1：反应体系总体积(mL)；
t：酶与底物反应时间(min)；
m：酶反应时固定化酶质量(g)；
N：酶液稀释倍数。
对照以对硝基苯酚‐β‐葡萄糖苷(pNP‐G)为底物的标准曲线，计算酶活：
酶活(U/g)＝c×V 1/(t×m)×N
c：由对硝基苯酚标准方程计算出的酶反应后的对硝基苯酚含量(μmol/mL)；
V1：反应体系总体积(mL)；
t：酶与底物反应时间(min)；
m：酶反应时固定化酶质量(g)；
N：酶液稀释倍数。
2.6.2游离酶酶活性测定
试验测定来源于Thermotoga petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶的活性。一种方法以纤维二糖为底物，在200μL反应体系中，加入10μL 100mM纤维二糖，185μL100mM的pH5.0柠檬酸Na2HPO4缓冲液，5μL适当稀释的游离酶。在90℃的水浴锅中振荡反应20min，然后用冰浴冷却结束反应。然后，通过葡萄糖测定试剂盒通过酶标仪(SpectraMax190)在505nm吸光度检测检测反应样品中葡萄糖的浓度。另一种方法是以对硝基苯酚‐β‐葡萄糖苷(pNP‐G)为底物，200μL反应体系包括185μL 100mM最适pH 5.0缓冲液，10μL 20mM底物，混匀预热后加入5μL适当稀释倍数的游离酶，反应10min，然后加入0.6mL1M NaCO3终止反应，混匀后在405nm条件下酶标仪测定。同时做有酶液无底物的对照和有底物无酶液的对照。
酶活的定义：终浓度为5mM纤维二糖或1mM对硝基苯基‐β‐D‐吡喃葡萄糖苷(pNPG)每分钟水解以释放1μmol葡萄糖或pNP，定义为1个酶活单位[U]。
其中对照酶降解纤维二糖的标准曲线，计算游离酶酶活：
酶活(U/mL)＝c×V1/(t×V2)×N
c：由葡萄糖试剂盒提供的测定方法计算出的酶反应后的葡萄糖的生成量(μmol/mL)；
V1：反应体系总体积(mL)；
t：酶与底物反应时间(min)；
V2：酶反应时游离酶体积(mL)；
N：酶液稀释倍数。
对照以对硝基苯酚‐β‐葡萄糖苷(pNP‐G)为底物的标准曲线，计算酶活：
酶活(U/mL)＝c×V1/(t×V2)×N
c：由对硝基苯酚标准方程计算出的酶反应后的对硝基苯酚含量(μmol/mL)；
V1：反应体系总体积(mL)；
t：酶与底物反应时间(min)；
m：酶反应时游离酶体积(g)；
N：酶液稀释倍数。
实施例3.Zn2+对固定的酶NKA‐9II酶学特性的影响
3.1.金属阳离子Zn2+对制备的固定的酶NKA‐9II的催化活性的影响
试验通过比较不同的金属阳离子Fe2+，Li2+，Al3+，K+，Ni2+，Mn2+，Ca2+，Zn2+和Mg2+对固定化酶NKA‐9II的催化活性的影响，结果见表2，金属离子Mn2+和Zn2+能够显著提高固定化酶的催化效率。Mn2+能够使固定化酶的酶活力提高45％；Zn2+能够使固定化酶酶活力提高92％，结果表明Zn2+的作用效果更加明显。
3.2.Zn2+对制备的固定化酶NKA‐9II的可重复性的影响
在有无2mM Zn 2+参与的情况下，进行了10次重复反应，结果见图7，观察到有Zn2+参与的条件下，固定化酶的重复使用率最高，在78％以上。相比没有金属离子参与条件有显著的提高。
3.3.Zn2+对固定化酶NKA‐9II热稳定的影响
Zn2+对固定化酶NKA‐9II的热稳定性影响见图8，在85℃条件下，温育7h，相对于起始酶活，其固定化酶的酶活还保持在80％以上；90℃条件下温育7h，相对最初起始酶活率为54％以上。相比无金属离子存在的条件，有了显著的提高。
3.4.Zn2+对固定化酶NKA‐9II的葡萄糖耐受性的影响
试验在固定化酶NKA‐9II中加入金属离子Zn2+，提高固定化酶的葡萄糖耐受性，结果见图9，在Zn2+加入的条件下，在葡萄糖浓度为400mM时，固定化酶NKA‐9II的相对酶活力保持在63％以上，而无金属离子参与条件下相对酶活只有43％。同时，这也是至今报道的关于β‐葡萄糖苷酶耐葡萄糖量最高的报道。
实施例4.Zn2+对利用修饰改性后大孔树脂NKA‐9固定来源于Thermotogapetrophila DSM13995GH1家族的β‐葡萄糖苷酶的固定化酶酶学特性的影响
利用上述建立的固定来源于T.petrophila DSM 13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶的技术与方法，固定同样来源的GH1家族的β‐葡萄糖苷酶(固定化材料同样为修饰改性后的大孔树脂NKA‐9)，研究Zn2+对固定GH1家族的β‐葡萄糖苷酶催化活性的影响，结果见图10。结果表明，尽管不是同一家族的β‐葡萄糖苷酶，相比未添加金属离子，Zn2+同样能够有效提高被固定的GH1家族的β‐葡萄糖苷酶的催化效率。Zn2+能够使固定化酶酶活力提高20％。进一步表明Zn2+可作为大孔吸附树脂NKA‐9固定生物酶的一种很好的激活剂，从而有效提高固定化酶的催化效率。
表1:不同载体对固定β‐葡萄糖苷酶效果的比较
表2:不同金属离子对固定化酶NKA‐9II的催化活性的影响
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
江苏康缘药业股份有限公司
<120> 一种固定化β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgccatatga tgggaaagat cgatgaaa 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgctcgagt ggtttgaatc tcttctct 28

Claims (10)

1.一种固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于步骤为：
（1）大孔树脂预处理：通过加入乙醇，盐酸和氢氧化钠对大孔树脂进行预处理，除去杂质和污染物；
（2）大孔吸附树脂NKA-9聚醚酰亚胺表面改性：将质量浓度不超过12%的聚醚酰亚胺加入大孔树脂中反应，反应后利用去离子水洗涤；按比例，在100mL pH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺质量浓度为8%，树脂量为50g；
（3）大孔树脂吸附β-葡萄糖苷酶：将β-葡萄糖苷酶与聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂混合，进行吸附作用；按比例，在100mL pH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂质量为10g，β-葡萄糖苷酶蛋白浓度为0.5mg/mL；
（4）戊二醛交联反应修饰：将质量浓度不超过2.0%的戊二醛加入到利用聚醚酰亚胺改性后并吸附了β-葡萄糖苷酶的大孔树脂混合，反应后利用去离子水涤，按比例，在100mL的反应体系中，戊二醛质量浓度为0.25%，吸附β-葡萄糖苷酶的聚醚酰亚胺修饰的树脂质量为10g。
2.根据权利要求1所述固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于所述步骤（1）具体处理方法为：按比例，首先将20g大孔树脂加入到含有100mL的无水乙醇中浸泡24小时，然后用去离子水反复洗涤至无乙醇气味残留；然后将处理过的大孔树脂浸泡在含5wt.％盐酸的100mL溶液中4 h，接着利用去离子水将树脂洗涤至中性pH；接着将洗涤干净的树脂浸入含100mL 1M氢氧化钠溶液中浸泡4小时，继续用去离子水将树脂洗涤至中性pH。
3.根据权利要求1所述固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为NKA-9。
4.根据权利要求1所述固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于所述聚醚酰亚胺的质量浓度为8%。
5.根据权利要求1所述固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于所述戊二醛的质量浓度为0.25%。
6.根据权利要求1所述固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶为Thermotoga petrophila DSM 13995 等来源的GH3家族、GH1家族等家族的β-葡萄糖苷酶。
7.权利要求1~6任一所述制备方法制备得到的固定化β-葡萄糖苷酶。
8.权利要求7所述固定化β-葡萄糖苷酶的应用，其特征在于反应体系中含有Mn2+或Zn2+。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于反应体系为200μL，含10 μL 100mM纤维二糖，190 μL 100mM的pH5.0柠檬酸Na2HPO4缓冲液，10 mg的固定化酶，Mn2+或Zn2+的浓度为1~3mM。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于Zn2+的浓度为2mM。
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