CN102888390B

CN102888390B - 肝素酶ⅲ的固定化方法

Info

Publication number: CN102888390B
Application number: CN201210423099.7A
Authority: CN
Inventors: 马小来; 白佳珂; 史绍鹏; 李锂
Original assignee: SHENZHEN HEPALINK PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2032-10-30
Also published as: CN102888390A

Abstract

本发明涉及一种肝素酶Ⅲ的固定化方法，尤其涉及一种以壳聚糖微球为固定化材料，对肝素酶Ⅲ进行固定化的方法。肝素酶Ⅲ固定化以后具有可回收、可重复利用、酶与底物和产物易分离等优越性。

Description

肝素酶Ⅲ的固定化方法

技术领域

本发明涉及一种肝素酶Ⅲ的固定化方法，尤其涉及一种以壳聚糖为固定化材料对肝素酶Ⅲ进行固定化的方法，实现肝素酶Ⅲ的固定化和可重复利用性。

背景技术

肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后又发现在一些微生物和动物组织中也有肝素酶存在。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶Ⅰ（EC编号4.2.2.7）、肝素酶Ⅱ（无EC编号）、肝素酶Ⅲ（EC编号4.2.2.8）。肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别是分子量大约43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9.0左右，应用和研究非常广泛。

肝素酶Ⅲ是一种主要以硫酸乙酰肝素为催化降解底物的酶，只对肝素链上极少的特定位点具有催化裂解作用。肝素酶Ⅲ对制备硫酸乙酰寡糖、研究肝素和硫酸乙酰肝素的结构有重要的作用。然而游离的肝素酶Ⅲ在发生反应时需要将其加入底物中，反应以后酶溶液、底物和产物混合在一起不容易分离，导致酶无法重复使用，利用效率低下，这为应用带来很多不便，需要寻找一种能提高肝素酶Ⅲ利用效率的方法。

与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，具有分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控等一系列优点，因此，对肝素酶Ⅲ的固定化是一种提高使用效果的理想选择。但目前对肝素酶Ⅲ进行固定化的研究未见报道。

经过长期研究，本发明的发明人发现了一种高效并且低成本的肝素酶Ⅲ的固定化方法。籍此，本发明给出了一种以壳聚糖微球为材料对肝素酶Ⅲ固定化的方法，成功实现了肝素酶Ⅲ与底物和产物的分离，使酶的应用潜力更大。

发明内容

本发明提供了一种用壳聚糖微球固定肝素酶Ⅲ的方法，包括下述步骤：

（1）肝素酶Ⅲ溶液的制备：选择Tris-HCl缓冲液（pH7.0，其中含CaCl₂）作为肝素酶Ⅲ的溶剂，将肝素酶Ⅲ溶解在该缓冲液中，制得肝素酶Ⅲ溶液；

（2）肝素酶Ⅲ与壳聚糖微球的交联：将壳聚糖微球用Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）充分溶胀，再取步骤（1）获得的肝素酶Ⅲ溶液，将其加入该壳聚糖微球中，进行交联；

（3）用乙酸-乙酸钠和Tris-HCl两种缓冲液分别洗涤上述交联后的壳聚糖微球至洗脱液无酶活性；

（4）利用还原剂对步骤（3）中获得的固定了肝素酶Ⅲ的壳聚糖微球进行处理，随后，如果需要，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶Ⅲ。

在上述实施方案中，优选步骤（1）中用于溶解肝素酶Ⅲ的溶剂Tris-HCl的浓度为10-50mM，其中含CaCl₂浓度为10-100mM，最优选50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）；

在上述实施方案中，优选步骤（1）中肝素酶Ⅲ在溶液中的浓度为0.1-100IU/ml，更优选为1-10 IU/ml，最优选为2-5 IU/ml。

在上述实施方案中，步骤（2）中所述壳聚糖微球可以通过现有技术中已知的制备方法进行制备，例如，可以采用反相悬浮法进行制备，其中使用的交联剂可以由本领域技术人员适当选择，例如应用最为广泛的交联剂为戊二醛。所述溶胀时间可以根据溶胀程度由本领域技术人员进行控制，例如，溶胀20分钟。

在上述实施方案中，优选步骤（2）中使用的壳聚糖微球与肝素酶Ⅲ溶液的体积比为1/10-10/1，更优选1/5-5/1，最优选1/2-2/1。

在上述实施方案中，优选在步骤（2）中，交联温度为4-10℃，交联时间为8-24h，更优选的交联温度为8-10℃，交联时间为12-20h。

在上述实施方案中，优选步骤（3）中使用的缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 6.0-8.0），更优选为50-150mM乙酸-乙酸钠（pH 6.5-8.0，其中含50-200mM NaCl）缓冲液，最优选为100mM乙酸-乙酸钠（pH 7.5，其中含100mM NaCl）缓冲液。

在上述实施方案中，优选步骤（3）中使用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液，更优选为50mM Tris-HCl（pH 6.5-8.0，其中含10-100mM CaCl₂和50-200mM NaCl）缓冲液，最优选为50mM Tris-HCl（pH 7.5，其中含50mM CaCl₂和100mM NaCl）缓冲液。

在上述实施方案中，在步骤（4）的还原剂处理步骤中，是对壳聚糖上的氨基与戊二醛上的醛基共价交联后产生的不稳定C=N双键进行还原，该还原步骤中可以使用任何已知的可以用于还原该双键的还原剂，比如硼氢化物、氢化铝锂、雷尼镍等，优选硼氢化物，比如碱金属硼氢化物，例如硼氢化钠、硼氢化钾等。

在上述实施方案中，优选步骤（4）中使用的NaBH₄浓度为1-10mg/ml，反应0.5-10h；最优选择浓度为1-5mg/ml的NaBH₄，反应1-3h。

在上述实施方案中，优选步骤（4）中使用Tris-HCl缓冲液冲洗除去剩余的还原剂，更优选该缓冲液为50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）。

在上述实施方案中，在进行步骤（4）之后，为了能够对该方法进行评价，获得固定化酶活与上样的游离酶活相比能够得出整个固定化过程的效率，以及对固定化酶进行定量，可以在进行还原剂处理步骤之后，测固定化酶活。

在上述实施方案中，在获得固定化的肝素酶Ⅲ之后，保存条件为：保存在Tris-HCl缓冲体系中，pH 6.5-8.0，添加金属盐CaCl₂和NaCl，保存温度为0-25℃，最优条件为保存在50mM Tris-HCl（pH 7.5，其中含10mM CaCl₂），温度为4-10℃环境中。

在使用时，该固定在载体上的酶可以和底物直接反应，反应完后经分离，固定在载体上的酶可以再次使用。固定化肝素酶可以应用于血液中肝素的清除，用于低分子肝素的生产制备，用于肝素和低分子肝素样品的部分或完全降解。

在上述实施方案中，优选步骤（2）中的反相悬浮法为：

取市售壳聚糖粉末溶于乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将分散剂加入油相中，然后将酸性壳聚糖溶胶加入油相中，乳化之后，加入戊二醛进行交联，交联完毕后加入等体积的NaOH和无水乙醇的混合液，搅拌后静置，弃去油层和水层，并用超纯水反复洗涤，即得壳聚糖微球。

在上述实施方案中，用于溶解壳聚糖的溶剂为2%的乙酸溶液，壳聚糖的质量分数为2%。优选分散剂为Span 80，优选油相为液体石蜡，优选转速为500-800rpm；优选的交联剂为25%的戊二醛，优选的交联时间为1-2h，优选的2.5M NaOH与无水乙醇的体积比为1/1。

在上述实施方案中，优选使用的固定化肝素酶Ⅲ测定方法为DMB法[Richard, W. et al. , (1986), Biochimica et Biophysica Acta， 883, 173-177]和232nm法[Bernstein, H. , (1987), Appl. Biochem. Biotech. 16, 129-143]。

在最优选的实施方案中，本发明的肝素酶Ⅲ的固定化方法包括下述步骤：

（1a）、壳聚糖微球的制备：

取壳聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将Span 80加入液体石蜡中，高速搅拌混合，将酸性壳聚糖溶胶逐滴加入液体石蜡中，乳化1h后，加入戊二醛作为交联剂，交联温度为40℃，交联完毕后加入2.5M NaOH和无水乙醇（体积比1/1）的混合液，搅拌后静置，弃去油层和水层，并用超纯水反复洗涤，即得壳聚糖微球；

（1）配制缓冲液50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂），将其作为肝素酶Ⅲ的溶剂，制得肝素酶Ⅲ溶液，调整浓度至酶活力2-5IU/ml；

（2）取步骤（1）获得的肝素酶Ⅲ溶液，将其加入用50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）充分溶胀过的步骤（1a）获得的壳聚糖微球中，壳聚糖与肝素酶的体积比为1/2-2/1，4-10℃交联12-20h；

（3）配制100mM乙酸-乙酸钠（pH 7.5，其中含100mM NaCl）和50mM Tris-HCl（pH 7.5，其中含50mM CaCl₂和100mM NaCl）缓冲液，先后对交联后的壳聚糖微球进行洗涤，缓冲液100mM乙酸-乙酸钠（pH 7.5，其中含100mM NaCl）洗脱体积为壳聚糖微球体积的两倍，然后用缓冲液50mM Tris-HCl（pH 7.5，其中含50mM CaCl₂和100mM NaCl）洗涤，收集洗脱液测酶活，直至洗脱液中无游离酶；

（4）在固定化酶中加入还原剂，反应后除去残余还原剂：在固定了肝素酶Ⅲ的壳聚糖微球中加入NaBH₄1-5mg/ml，反应1-3h进行还原，反应完毕后，以50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）为缓冲液，对壳聚糖微球进行洗涤，所用缓冲液体积是壳聚糖微球体积的3-5倍。

本发明的有益效果：

通过以上所述的发明内容，本发明实现了肝素酶Ⅲ的固定化和可重复利用。该方法可对肝素酶Ⅲ达到显著的固定化效果，每毫升的壳聚糖微球可以固定化3.11 IU的肝素酶Ⅲ，交联效率可达到80.3%，在特定的保存条件中可以使固定化的肝素酶Ⅲ在保存1周后仍保持93.5%的活性。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例：

所用肝素酶为从肝素黄杆菌发酵培养后的菌体中分离纯化得到的，酶制备过程见发明专利申请号200910039360.1 “一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ的制备方法”中的实施例。

a、取1g市售的纯度为99%的壳聚糖粉末溶于50ml 2%的乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将0.6g 市售化学纯的Span 80（国药集团化学试剂有限公司，化学纯）加入100ml液体石蜡中，以800rpm的转速搅拌混合，将酸性壳聚糖溶胶逐滴加入液体石蜡中，乳化1h后，加入5ml质量分数为25%的戊二醛作为交联剂，交联温度为40℃，1h后加入100ml的等体积的2.5M NaOH和无水乙醇的混合液，搅拌后10min后静置，弃去油层和水层，用超纯水冲洗5次，弃去水层即得壳聚糖微球。

b、选择50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）缓冲液作为肝素酶Ⅲ的溶剂，制得用DMB法测得酶活为31.20 U/ml，用232nm法测定酶活为3.88 IU/ml的肝素酶Ⅲ溶液，取1ml该肝素酶液加入装有1ml壳聚糖微球的小柱中，摇匀，10℃冷库中交联15h，弃去交联后的上清液。

c、用2ml的100mM乙酸-乙酸钠（pH 7.5，其中含100mM NaCl）缓冲液洗涤上述交联肝素酶后的壳聚糖微球，再用约10ml的50mM Tris-HCl（pH 7.5，其中含50mM CaCl₂和100mM NaCl）缓冲液洗涤上述交联后的壳聚糖微球，至洗脱液检测无酶活为止。

d、在上述固定了肝素酶Ⅲ的壳聚糖微球中加入1ml的1mg/ml的硼氢化物阴离子的碱金属盐NaBH₄，反应1h，用10ml的50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）缓冲液洗涤，以除去残余的NaBH₄，得到固定化酶1ml。用DMB法测得固定化酶活性为23.19 U/ml，换算为肝素酶国际酶活单位（即232nm法测定的酶活值）为3.11 IU/ml。肝素酶Ⅲ的固定化效率为 80.3%，每1ml壳聚糖微球可固定3.11 IU/ml的肝素酶Ⅲ。

e、将上述固定化酶置于2ml的50mM Tris-HCl（pH 7.5，其中含50mM CaCl₂和100mM NaCl），温度为4-10℃的环境中保存。在保存1周后固定化酶的活力经测定为保存前的93.5%。

在实施例中，测定酶活力的具体方法如下：

1) 232nm法测酶活：在5ml石英比色皿中加入在30℃预热过的2.5ml肝素浓度为1mg/ml的50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）缓冲液，移取20μl酶液，摇匀后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性（IU/ml），该方法测得的酶活为肝素酶的国际酶活单位。

2) DMB法测酶活：取固定化酶加入一定浓度的硫酸乙酰肝素底物，45℃水浴中反应5min，取样，测定剩余硫酸乙酰肝素的浓度，测定方法为：将未知浓度的硫酸乙酰肝素底物用50mM Tris-HCl（pH 7.0，其中含10mM CaCl₂）缓冲液稀释一定倍数，在5ml玻璃比色皿中加入2.5ml的DMB溶液，再加入25μl稀释后的硫酸乙酰肝素溶液，摇匀后测定525nm处的吸光值，根据DMB法测定肝素浓度的标准曲线求得酶解后剩余的硫酸乙酰肝素浓度，以每小时降解1mg硫酸乙酰肝素所需的酶量为一个酶活单位，由此计算固定化酶的单位活性（U/ml）。

232nm法是测定肝素酶Ⅲ活性的最通用方法，可用于游离肝素酶Ⅲ活性的测定，但用于固定化酶活性测定时微球带来很大干扰而难以使用；DMB法可用于游离肝素酶Ⅲ和固定化肝素酶Ⅲ活性的测定。本发明中通过对相同浓度的游离肝素酶的DMB法和232nm法分别测定，得到两种测定方法的换算关系，DMB法测得的酶活数值是232nm法测定数值的7.45倍，以此对固定化的肝素酶酶活进行国际单位活性换算。

Claims

1.一种肝素酶III的固定化方法，包括下述步骤：

（1）肝素酶III溶液的制备：选择Tris-HCl缓冲液作为肝素酶III的溶剂，缓冲液的pH为7.0，含CaCl₂，将肝素酶III溶解在该缓冲液中，制得酶溶液；

（2）肝素酶III与壳聚糖微球的交联：将壳聚糖微球用Tris-HCl缓冲液充分溶胀，缓冲液的pH为7.0，含10mM CaCl₂，再取步骤（1）获得的肝素酶III溶液，将其加入该壳聚糖微球中，进行交联；

（3）用乙酸-乙酸钠和Tris-HCl两种缓冲液分别洗涤上述交联后的壳聚糖微球，至洗脱液无酶活性，其中乙酸-乙酸钠pH 6.5-8.0，含NaCl，Tris-HCl pH 6.5-8.0，含CaCl₂和NaCl；

（4）利用还原剂处理步骤（3）中获得的固定了肝素酶III的壳聚糖微球，随后，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶III；

其中上述步骤(2)中壳聚糖微球的制备方法如下: 取市售壳聚糖粉末溶于乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将分散剂加入油相中，然后将酸性壳聚糖溶胶加入油相中，乳化之后，加入戊二醛进行交联，交联完毕后加入等体积的NaOH和无水乙醇的混合液，搅拌后静置，弃去油层和水层，并用超纯水反复洗涤，即得壳聚糖微球。

2.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（1）中用于溶解肝素酶III的溶剂Tris-HCl的浓度为10-100mM， CaCl₂浓度为5-20mM。

3.根据权利要求2的固定化方法，其特征在于，步骤（1）中使用的Tris-HCl溶剂为50mM Tris-HCl，pH 7.0，含10mM CaCl₂。

4.根据权利要求1～3任一项的固定化方法，其特征在于，步骤（2）中使用的壳聚糖微球与肝素酶III溶液的体积比为1/10-10/1。

5.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（3）中使用的乙酸-乙酸钠缓冲液为50-150mM乙酸-乙酸钠缓冲液，pH 6.5-8.0，含50-200mM NaCl。

6.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（3）中使用的Tris-HCl缓冲液为50mM Tris-HCl缓冲液，pH 6.5-8.0，含10-100mM CaCl₂，50-200mM NaCl。

7.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，步骤（4）中使用的还原剂为碱金属硼氢化物。

8.根据权利要求1的固定化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1a）、壳聚糖微球的制备：

取壳聚糖粉末溶于2%的乙酸中，制得酸性壳聚糖溶胶，将Span 80加入液体石蜡中，高速搅拌混合，将酸性壳聚糖溶胶逐滴加入液体石蜡中，乳化1h后，加入戊二醛作为交联剂，交联温度为40℃，交联完毕后加入2.5M NaOH和无水乙醇的混合液，NaOH和无水乙醇的体积比为1/1，搅拌后静置，弃去油层和水层，并用超纯水反复洗涤，即得壳聚糖微球；

（1）配制缓冲液50mM Tris-HCl， pH 7.0，含10mM CaCl₂，将其作为肝素酶III的溶剂，制得肝素酶III溶液，调整浓度至酶活力1-3IU/ml；

（2）取步骤（1）获得的肝素酶III溶液，将其加入用50mM Tris-HCl充分溶胀过的步骤（1a）获得的壳聚糖微球中，Tris-HCl pH 7.0，含10mM CaCl₂，壳聚糖与肝素酶的体积比为1/2-2/1，4-10℃交联12-20h；

（3）配制100mM乙酸-乙酸钠和50mM Tris-HCl缓冲液，先后对交联后的壳聚糖微球进行洗涤，缓冲液100mM乙酸-乙酸钠洗脱体积为壳聚糖微球体积的两倍，然后用缓冲液50mM Tris-HCl洗涤，收集洗脱液测酶活，直至洗脱液中无游离酶，其中乙酸-乙酸钠pH 7.5，含100mM NaCl，Tris-HCl pH 7.5，含50mM CaCl₂，100mM NaCl；

（4）在固定了肝素酶III的壳聚糖微球中加入NaBH₄1-5mg/ml，反应1-3h，反应完毕后，以50mM Tris-HCl为缓冲液，pH 7.0，含10mM CaCl₂，对壳聚糖微球进行洗涤，所用缓冲液体积是壳聚糖微球体积的3-5倍，除去残余的还原剂，由此得到固定在壳聚糖微球上的肝素酶III。