CN117247930A - 利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法 - Google Patents
利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117247930A CN117247930A CN202311087013.2A CN202311087013A CN117247930A CN 117247930 A CN117247930 A CN 117247930A CN 202311087013 A CN202311087013 A CN 202311087013A CN 117247930 A CN117247930 A CN 117247930A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- heparanase
- solution
- heparinase
- chitosan
- sodium alginate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102100024025 Heparanase Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108010037536 heparanase Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 title claims abstract description 27
- 239000000696 magnetic material Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 53
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 53
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 108010006406 heparinase II Proteins 0.000 claims description 28
- UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4-dimethylphenyl)propan-1-one Chemical compound CCC(=O)C1=CC=C(C)C=C1C UWFRVQVNYNPBEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 9
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 6
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 3
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 abstract description 22
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 abstract description 21
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 19
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 abstract description 8
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 abstract description 6
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 7
- PGWTYMLATMNCCZ-UHFFFAOYSA-M azure A Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGWTYMLATMNCCZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000605114 Pedobacter heparinus Species 0.000 description 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- -1 heparin polysaccharide Chemical class 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N L-idopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000010953 base metal Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010083213 heparitinsulfate lyase Proteins 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 1
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 108091022901 polysaccharide lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000020244 polysaccharide lyase Human genes 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01019—Heparinase (3.2.1.19)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶II的固定化方法，尤其涉及以壳聚糖和海藻酸钠为固定化原料，制备出力学性质优良且耐高温的壳聚糖－海藻酸钠复合水凝胶，对具备耐高温特性的肝素酶II进行固定化的方法。肝素酶II固定化后具备热稳定性、可回收、可重复多次利用、产物分离与回收效率高等优势，极大提升了系列肝素酶在超低分子量肝素制备领域的产业化应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶II的固定化方法。
背景技术
肝素酶是多糖裂解酶（EC 4.2.2）中的一员，目前大多数研究集中在微生物来源的肝素酶上，最初肝素酶是从肝素黄杆菌（Flavobacteriumheparinum）中分离出来，在其他微生物来源中也有发现，如：拟杆菌（Bacteroidesthetaiotaomicron）、粪便拟杆菌（Bacteroidesstercoris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）以及棒杆菌（Corynebacterium sp.）等，但至今肝素黄杆菌仍然是商品肝素酶的唯一来源。
肝素的酶解可由三类具有不同特异性的酶催化，即肝素酶I、II 和III。三种肝素酶均是通过β-消除机制作用于GlcN和 HexA之间 的1→4糖苷键内聚解聚肝素，从而在非还原性末端形成含有C=C不饱和键的不饱和糖醛酸（ΔUA）。肝素酶II属于PL21家族（EC4.2.2-）, 和肝素酶Ｉ一样是 一类内切型HP/HS裂解酶。肝素酶II催化连接到IdoA/GlcA和IdoA2S/GlcA2S的a-1，4糖苷键的断裂，因此肝素酶II对HP和HS没有选择性。现阶段使用最广，已投入商品化使用的肝素酶II来自于肝素黄杆菌。其是一种可以以肝素和硫酸乙酰肝素为底物的酶，具有清除血液中残存肝素、防止凝血的功能；同时对低分子量肝素的制备、肝素降解产物的结构研究等领域具备十分重要的作用。然而肝素黄杆菌发酵所得的游离酶在上述实际应用中存在不足，如游离酶与底物和产物的分离纯化难度高，热稳定性低、酶易失活、无法重复利用和成本高等，为产业化开发应用带来严重阻碍，因此，亟需开发一种可提高肝素酶热稳定性、易回收和高效催化的方法。
酶的固定化是指利用物理吸附或化学结合法将游离酶固定在载体上或束缚在一定的空间内，通过连续使用或反复使用来提高酶的利用率的一种技术。常用的固定化方法有包埋法、吸附法、共价结合法和交联法。固定化酶和游离酶相比，具有热稳定性高、成本低、易控制、对变性剂耐受性强等优点，可重复或连续使用，且易于与产品分离，是生物医药领域尤其在肝素多糖领域研究较少，公布的专利CN102888391 A开展了壳聚糖固定化肝素酶II的研究成果，但在产业化应用中发现该固定化酶的耐高温存在不足。
壳聚糖链上存在较活泼的一级胺基和羟基，能和多种基团反应制备得到各样衍生物，大大提高了它的使用范围和应用价值，是一种资源量丰富、性质独特、多功能的天然高分子生物材料。本发明人一方面通过冻融的方法得到壳聚糖水凝胶，改变了以往通过酸溶而导致机械强度低、不耐高温等缺点。另一方面利用壳聚糖对重金属离子具有良好的吸附性能，利用壳聚糖基质中存在的氨基，这些氨基通过离子交换和络合反应与溶液中的金属离子相互作用，进一步提高壳聚糖水凝胶的机械强度和热稳定性，进而将其应用到肝素酶II的耐高温酶产业化应用中，实现提升生产效率和节约生产成本的绿色生物制造领域。
发明内容
针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供开发出一种高效、耐温性、低成本和可多次重复使用的磁性复合材料微球固定化肝素酶II的方法，成功实现肝素酶II热稳定性显著提升，为其产业化应用提供有力的技术保障。
为实现上述目的，本发明提供一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶II的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:将磁性壳聚糖-海藻酸钠微球加入0.8%的乙二醇二缩水甘油醚溶液，放入摇床在条件25℃ 、250rpm中 1小时后取出，得到处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球；
S2：将制备好的肝素酶II溶液利用注射器匀速加入处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球中进行交联固定，然后置于25℃ 250rpm的摇床中继续摇晃10小时以上，然后用PBS缓冲液洗涤3次至无肝素酶蛋白被洗出，得到微球制品，在4℃保存备用；
S3: 用乙酸-乙酸钠和PBS两种缓冲液分别洗涤所得的微球制品，直至洗脱液中无法检测到肝素酶II，然后利用清除溶剂进行再次清洗，即得到固定在磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球材料的肝素酶II。
作为优选，在步骤S1前，还包括肝素酶II溶液的制备，具体步骤为：选择PBS缓冲液作为肝素酶II溶剂，将肝素酶II冷冻浓缩后溶解到PBS缓冲液中，搅拌均匀后得到一定浓度的酶溶液；其中PBS缓冲液含有ZnCl2或CaCl2，pH值为6.5，PBS的浓度为20-80mM，ZnCl2/CaCl2浓度为5-40mM。
作为优选，在步骤S2中，磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球与肝素酶II溶液的摩尔比为1：（10-40）。
作为优选，在步骤S1中，乙二醇二缩水甘油醚溶液浓度为0.5-2.0%；且从摇床中取出后采用去离子水进行清洗，除去残留的乙二醇二缩水甘油醚溶液。
作为优选，在步骤S3中，乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为20-200mM乙酸-乙酸钠缓冲液，其中pH为6.0-8.0，含有20-100mM ZnCl2 或20-200mM CaCl2。
作为优选，在步骤S3中，清除溶剂为碱金属硼氢化物、戊二醛、蹂酸和亚硫酸钠中的一种。
本发明的有益效果是：本发明实现了肝素酶II的磁性化固定，提高了酶的热稳定性、可重复利用和易分离纯化。该方法可显著提高肝素酶的热稳定性和固定化催化活力，每毫升的壳聚糖-海藻酸钠磁性微球可固定化2-5IU的肝素酶II，热稳定性相对游离酶提高100-350%，固定化的肝素酶II重复使用3次后仍保留58.6%的活性。
附图说明
图1为本申请的肝素酶II的热稳定性示意图；
图2位本申请的肝素酶II的重复利用的酶活力示意图。
具体实施方式
为了更清楚地表述本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步地描述，当然本发明的保护范围不仅于此，在不付出创造性劳动的前提下本领域技术人员所作出的简单置换都属于本发明的保护范围。
在这里申请人需要说明的是，本申请所采用的肝素酶II为从肝素黄杆菌发酵培养后的上清液中分离纯化所得，酶制备与纯化过程可以通过现有技术或者申请号200910039360.1，名称为“一种肝素黄杆菌肝素酶II的制备方法”中的实施例中得到，在这里不作任何的重复赘述。
请参阅图1 和图2；本发明公开了一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶II的固定化方法，，包括以下步骤：S1:将磁性壳聚糖-海藻酸钠微球加入0.8%的乙二醇二缩水甘油醚溶液，放入摇床在条件25℃ 、250rpm中 1小时后取出，得到处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球；S2：将制备好的肝素酶II溶液利用注射器匀速加入处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球中进行交联固定，然后置于25℃ 250rpm的摇床中继续摇晃10小时以上，然后用PBS缓冲液洗涤3次至无肝素酶蛋白被洗出，得到微球制品，在4℃保存备用；S3: 用乙酸-乙酸钠和PBS两种缓冲液分别洗涤所得的微球制品，直至洗脱液中无法检测到肝素酶II，然后利用清除溶剂进行再次清洗，即得到固定在磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球材料的肝素酶II。在具体实施过程中，本申请一方面通过冻融的方法得到壳聚糖水凝胶，改变了以往通过酸溶而导致机械强度低、不耐高温等缺点；另一方面利用壳聚糖对重金属离子具有良好的吸附性能，利用壳聚糖基质中存在的氨基，这些氨基通过离子交换和络合反应与溶液中的金属离子相互作用，进一步提高壳聚糖水凝胶的机械强度和热稳定性，进而将其应用到肝素酶II的耐高温酶产业化应用中，实现提升生产效率和节约生产成本的绿色生物制造领域。
在步骤S1前，还包括肝素酶II溶液的制备，具体步骤为：选择PBS缓冲液作为肝素酶II溶剂，将肝素酶II冷冻浓缩后溶解到PBS缓冲液中，搅拌均匀后得到一定浓度的酶溶液；其中PBS缓冲液含有ZnCl2或CaCl2，pH值为6.5，PBS的浓度为20-80mM，ZnCl2/CaCl2浓度为5-40mM。在本实施里中，最优选PBS的浓度为30mM，pH为6.5，在PBS中同时含有浓度为20mM的CaCl2和30mM的ZnCl2；肝素酶II在溶液中的浓度为0.5-500IU/mL。
在步骤S2中，磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球与肝素酶II溶液的摩尔比为1：（10-40），交联温度为0-20℃。在本实施例中，对壳聚糖中多种基团发生交联反应，与传统交联剂的基团（如醛基）相比，环氧基团的反应活性低，反应条件相对温和，并易使壳聚糖的链式结构变成网状结构；壳聚糖-海藻酸钠磁性微球可以制备所得，详细的步骤为：
（1）磁性纳米粒子的制备：采用共沉淀法制备Fe3O4磁性纳米粒子。暨将无水FeCl3和FeSO4•7H2O溶解在去离子水中（摩尔比2∶1）。向混合物中加入适量氨水溶液，使反应液体系pH约为9，将得到的黑色沉淀液在70℃下加热搅拌30min。反应完成后，用去离子水洗涤三次，并将反应溶剂置换成乙醇，滴加适量TEOS继续在70℃下反应2h。结束后通过外加磁场收集Fe3O4/SiO2磁性纳米颗粒，并用去离子水和乙醇各洗涤3次。最后将得到的磁性纳米颗粒在烘箱中干燥24h，得到固体粉末。取1g上述固体粉末加入80mL50％的乙醇溶液中，滴加4mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）在40℃、250r/min的摇床中反应24h。结束后用去离子水和乙醇各洗涤3次，最后将得到的磁性纳米颗粒在烘箱中干燥24h，得到磁性纳米颗粒Fe3O4/SiO2/NH2。
（2）磁性壳聚糖复合（微球）珠的制备：取50mL的离心管，向其中加入2g海藻酸钠粉末和17g去离子水，溶胀1h后，加热搅拌至澄清透明，得到海藻酸钠溶液。向上述海藻酸钠溶液中加入2gKOH、1.2g脲和壳聚糖粉末1g，搅拌均匀，放入-20℃冰箱中冷冻24h。取出后放入室温让其缓慢解冻，解冻期间不停搅拌，直至形成淡黄色透明凝胶。向凝胶中加入0.6g磁性纳米粒子，搅拌至均匀后，用5mL注射器吸取上述混合液，以15cm左右的高度逐滴滴入20g/LZnCl2溶液，同时滴加几滴浓硫酸至溶液变澄清，持续固化2h。结束后，通过外加磁场回收磁性壳聚糖复合凝胶珠，去离子水洗涤3次，并将其保存在水中。
在步骤S1中，乙二醇二缩水甘油醚溶液浓度为0.5-2.0%；且从摇床中取出后采用去离子水进行清洗，除去残留的乙二醇二缩水甘油醚溶液。在本实施例中，使用的较为新颖的环氧型交联剂乙二醇二缩水甘油醚（EGDE），其环氧基团可以和胺基、巯基、羟基等多种基团反应，对比传统的戊二醛其具备高操作稳定性，在保留水凝胶材料的优异性能的同时，该交联剂还对酶的毒性小，且交联效果高于戊二醛，可以进一步提高酶活；使用的EGDE的体积分数比为0.2-5%。
在步骤S3中，乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为20-200mM乙酸-乙酸钠缓冲液，其中pH为6.0-8.0，含有20-100mM ZnCl2 或20-200mM CaCl2。
在步骤S3中，清除溶剂为碱金属硼氢化物、戊二醛、蹂酸和亚硫酸钠中的一种，在本实施里中，利用清除溶剂作为还原剂进行处理，例如采用硼氢化钠，浓度为0.5-8mg/mL，反应时间1-10h；当加入清洁溶剂后，还需要利用PBS缓冲溶液洗去残留的清除溶剂，此时PBS缓冲溶液的浓度为100Mm, pH为7.0-7.5，其中含有100mMCaCl2和50mMZnCl2。
为能够评价该固定化方法的效能，获得磁性微球固定化肝素酶II与上样的游离肝素酶II计算出肝素酶的固定化效率，以及对固定化化肝素酶进行定量，可在进行还原剂清洗处理完毕步骤后，直接测定磁性微球固定化肝素酶的酶活力，经过测定后发现固定化肝素酶II酶解肝素寡糖收率高于游离酶，其产物有较多的二/四/六/八/十糖片段，相对于游离酶其降解产物相对较为集中。
检测方法如下：
在上述固定化了肝素酶II的微球制品中加入3ml的1mg/ml的硼氢化物阴离子贱金属盐NaBH4，反应2h，再用20ml50mMPBS（pH7.0，其中含100mMCaCl2和200mMNaCl）洗涤3次，去除残留的NaBH4，即可得到0.5ml的固定化酶。用天青A法测得酶活力为100U/mL,换算成肝素酶国际酶活单位（用232nm法测定酶活力）为4IU/mL。肝素酶II的固定化效率为76.4%，每ml壳聚糖-海藻酸钠磁性微球可固定4IU/mL的肝素酶II。
将上述磁性微球固定化酶置于1mL的30mMPBS（pH 6.5，其中含20mMCaCl2和30mMZnCl2），4℃低温保存。一周后固定化酶的酶活力经测定为保存前的84.6%。
将上述磁性微球固定化酶置于1mL的30mMPBS（pH 6.5，其中含20mMCaCl2和30mMZnCl2），分别在40℃、50℃、60℃、70℃保温60min，测定固定化酶的残留酶活力。
在实施例中，磁性微球固定化肝素酶II的热稳定性测定，具体如下：分别取20mg固定化酶，溶于1mL，60mM PBS（pH 6.5，其中含20mMCaCl2和30mMZnCl2）无菌离心管中，同时取等量的游离酶并溶于上述PBS缓冲液的无菌理性管中；分别在40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中保温60min，测定残留酶的相对酶活力，对比同批处理的游离酶其残留酶活力分别提升140%、210%、260%、340%。
在实施例中，将固定化的肝素酶II在降解肝素粗品反应完成后，立即离心回收磁性微球，再继续上述反应并测定酶活力，连续反应3次后，固定化酶的肝素酶活力仍保留最初的酶活力的58.6%。
在实施例中，肝素酶II的酶活力测定具体方法为：
① 232nm法酶活力测定：在5ml石英比色皿中加入经30℃预热的2.5mL一定规格的粗品肝素，浓度为1mg/mL,60mM PBS（pH 6.5，其中含20mMCaCl2和30mMZnCl2）缓冲液，用移液枪吸取0.02mL的酶液；摇匀后在232nm测定其吸光值，读取并记录每分钟吸光值读数。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶的单位活性（IU/mL）,此法测定的肝素酶活力为肝素酶的国际标准酶活力单位。
在实施例中，肝素酶II的酶活力测定具体方法为：
②天青A法肝素酶活力测定：取固定化酶加入一定浓度和规格的粗品肝素底物，45℃水浴中反应5min，加入反应终止试剂后，取样，测定反应剩余肝素的浓度，具体操作方法为：将已知浓度的肝素粗品底物（20mg/mL）溶于30mM PBS（pH 6.5，其中含20mMCaCl2和30mMZnCl2）稀释不同的倍数，在5ml石英比色皿中加入2mL浓度为25mg/mL的天青A溶液，在加入一定量的肝素粗品溶液，摇匀后并加入三氯乙酸终止反应后在620nm处测定吸光值，根据天青A法测定肝素浓度的标准曲线求得酶解剩余肝素的浓度，以每小时降解1mg肝素粗品所需的酶量为1U，据此间接计算出固定化酶的单位酶活力（U/mL）。
232nm方法测定肝素酶II活力是国际最通用的方法，可用于游离酶测定肝素酶II的酶活力，但在固定化酶的酶活力测定时磁性微球带来很大的干扰而导致其测定难以进行，天青A法可用于游离和固定化肝素酶的酶活力测定。本发明在我司前述专利的基础上进一步改进，通过添加反应终止剂使肝素酶失活，确保酶活力测定的数据更加精确；另外，通过天青A法和232nm法的对比测定，获得两种方法的换算系数，即天青A法所测酶活力是232nm法测定酶活力的23.3倍，以此确定对固定化的肝素酶II酶活力进行国际单位酶活力的换算。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种利用壳聚糖磁性材料对肝素酶II的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1:将磁性壳聚糖-海藻酸钠微球加入0.8%的乙二醇二缩水甘油醚溶液，放入摇床在条件25℃ 、250rpm中 1小时后取出，得到处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球；
S2：将制备好的肝素酶II溶液利用注射器匀速加入处理后的磁性壳聚糖-海藻酸钠微球中进行交联固定，然后置于25℃ 250rpm的摇床中继续摇晃10小时以上，然后用PBS缓冲液洗涤3次至无肝素酶蛋白被洗出，得到微球制品，在4℃保存备用；
S3: 用乙酸-乙酸钠和PBS两种缓冲液分别洗涤所得的微球制品，直至洗脱液中无法检测到肝素酶II，然后利用清除溶剂进行再次清洗，即得到固定在磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球材料的肝素酶II。
2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤S1前，还包括肝素酶II溶液的制备，具体步骤为：选择PBS缓冲液作为肝素酶II溶剂，将肝素酶II冷冻浓缩后溶解到PBS缓冲液中，搅拌均匀后得到一定浓度的酶溶液；其中PBS缓冲液含有ZnCl2或CaCl2，pH值为6.5，PBS的浓度为20-80mM，ZnCl2/CaCl2浓度为5-40mM。
3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤S1中，磁性壳聚糖-海藻酸钠复合微球与肝素酶II溶液的摩尔比为1：（10-40）。
4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤S1中，乙二醇二缩水甘油醚溶液浓度为0.5-2.0%；且从摇床中取出后采用去离子水进行清洗，除去残留的乙二醇二缩水甘油醚溶液。
5.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤S3中，乙酸-乙酸钠缓冲液的浓度为20-200mM乙酸-乙酸钠缓冲液，其中pH为6.0-8.0，含有20-100mM ZnCl2 或20-200mMCaCl2。
6.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，在步骤S3中，清除溶剂为碱金属硼氢化物、戊二醛、蹂酸和亚硫酸钠中的一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311087013.2A CN117247930A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311087013.2A CN117247930A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117247930A true CN117247930A (zh) | 2023-12-19 |
Family
ID=89128511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311087013.2A Pending CN117247930A (zh) | 2023-08-28 | 2023-08-28 | 利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117247930A (zh) |
-
2023
- 2023-08-28 CN CN202311087013.2A patent/CN117247930A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Talekar et al. | Carrier free co-immobilization of alpha amylase, glucoamylase and pullulanase as combined cross-linked enzyme aggregates (combi-CLEAs): a tri-enzyme biocatalyst with one pot starch hydrolytic activity | |
| JP2884188B2 (ja) | 固定化酵素によるヘミセルロースの加水分解の方法および固定化ヘミセルロース分解酵素からなる製品 | |
| CN1165624C (zh) | 用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法 | |
| CN103343117B (zh) | 一种固定化头孢菌素c酰化酶的制备方法 | |
| CN102943069A (zh) | 共固定化葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶微球及其在生产葡萄糖酸或其盐中的应用 | |
| JPH0257180A (ja) | グリコサミノグリカン分解酵素の精製法 | |
| Bhushan et al. | Heparin depolymerization by immobilized heparinase: A review | |
| CN101397580A (zh) | 在稳恒磁场条件下制备低聚壳聚糖的方法 | |
| EP0271289A2 (en) | Method for immobilization of enzyme and immobilized enzymes | |
| CN107354143A (zh) | 一种固定化β‑葡萄糖苷酶及其制备方法和应用 | |
| CN111718972A (zh) | 一种特定聚合度的壳寡糖的制备方法 | |
| CN100584955C (zh) | 壳寡糖/壳低聚体的专一性酶法生产工艺 | |
| CN112553187A (zh) | 一种聚合物固定化木聚糖酶及其制备方法和应用 | |
| Aslan et al. | Covalent immobilization of Aspergillus niger amyloglucosidase (ANAG) with ethylenediamine-functionalized and glutaraldehyde-activated active carbon (EFGAAC) obtained from sesame seed shell | |
| CN117247930A (zh) | 利用壳聚糖磁性材料对肝素酶ii的固定化方法 | |
| CN1746193A (zh) | 一种低分子量壳聚糖或壳寡糖的制备方法 | |
| CN102796723A (zh) | 肝素酶i的固定化方法 | |
| RU2295538C2 (ru) | Способ получения гепаринов с низкой молекулярной массой | |
| CN101845470A (zh) | 一种用固定化酶生产果寡糖和高果糖浆的方法 | |
| CN109321559B (zh) | 一种以磁性Fe3O4-多糖微球为载体固定化果糖基转移酶的方法 | |
| CN102888390B (zh) | 肝素酶ⅲ的固定化方法 | |
| EP3514231A1 (en) | Method for producing immobilized allulose epimerase | |
| WO2022206189A1 (zh) | 一种固定化多酶体系生产塔格糖的方法 | |
| KR101644939B1 (ko) | 효소의 고정화 방법 및 이에 의한 고정화 효소 | |
| CN114426958A (zh) | 糖基转移酶-双金属有机框架复合催化材料及其制备方法和在二糖和多糖合成中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |