JPH0257180A - グリコサミノグリカン分解酵素の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、グリコサミノグリカンを分解するリアーゼ、
グリクロニグーゼ、スルファターゼ等を精製する方法に
関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）リアー
ゼとは、例えば微生物が産生ずるコンドロイチン硫酸リ
アーゼ、デルマタン硫酸リアーゼ、ヘパラン硫酸リアー
ゼなど硫酸化グリコサミノグリカンナンのへキソサミニ
ド結合に作用してグリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧ
と略する）を分解する酵素を指す。

グリクロニダーゼとは、上記リアーゼがＧＡＧに作用し
て生成した切断部位の非還元末端不飽和糖鎖のウロン酸
を切りはなす酵素を指す。

スルファターゼとは、上記リアーゼ及びグリクロニダー
ゼが作用して生成した分解物の硫酸基を切りはなす酵素
を指す。

また、不溶性硫酸化多糖類とは、セルロース、デキスト
ラン、キシラン、マンナン、アミロース、キチンなど高
分子多糖類の水性溶媒に不溶な糖類、あるいは水可溶性
多糖類を架橋して不溶化した糖類に対し、その糖鎖の水
酸基に硫酸基を導入したものを指す。

従来、グリコサミノグリカン分解酵素産生菌を培養した
微生物の菌体内あるいは培地には、はとんどの場合に多
糖類のＧＡＧ分解酵素、たとえばリアーゼ、グリクロニ
ダーゼ、スルファターゼなどが産生されている。これら
の酵素を用いて糖鎖構造を分析をする際、酵素の精製が
不十分であると、その分析結果の判定に重大な誤りを生
ずる場合がある。このため、各々の酵素は互いに混入が
ないように夫々精製しておく必要がある。しかし一方、
夫々の酵素は糖鎖の分析過程においていずれも重要な役
割を果たす有用な酵素であるため、いかにこれらの酵素
を夫々高純度に効率よく回収できるかが従来からの課題
となっている。

今までに精製法が検討されてきている微生物由来のＧＡ
Ｇ分解酵素のリアーゼ類は、はとんどハイドロキシアパ
タイトカラムによりその比活性を著しく上昇させること
ができた。

しかし、リアーゼ類とスルファターゼ又はグリクロニダ
ーゼとの分離は多くの場合不十分であり、イオン交換ク
ロマトグラフ法やゲル枦適法などの工程を加える必要が
あった。しかし、これらの方法を重ねても分離の不十分
な酵素類、例えばフラボバクテリウム・ヘバリナム由来
のヘバリナーゼとスルファターゼ、あるいはへパリチナ
ーゼとグリクロニダーゼなどがあり、これらの課題を解
決するため、ヘパリンあるいはデルマタン硫酸を固定化
したクロマトグラフ法などが報告されている（にａｒｂ
ｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　７０２９５．１
９７９．同誌８８２９１．１９８１１゜ この方法はＧＡＧとＧＡＧ分解酵素の親和性を利用して
いる点で他のクロマトグラフ法より分離能は改良されて
いるが、酵素相互の分離はまだ完全ではなく、またＧＡ
Ｇ分解酵素によるリガンドの減少やカラム再生操作の煩
雑さなどにも問題があった。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、これらの問題点を解決するため、微生物
由来のＧＡＧ分解酵素の各種担体に対する親和性を広く
検討した結果、これらの酵素類は、多糖類の糖鎖の水酸
基に硫酸基を導入した担体に対し、ＧＡＧ類似体として
の親和性が認められること、また各酵素の親和性に差が
あるため塩濃度を種々変えることにより酵素類を極めて
効率良く分画できることを見出し、本発明を完成するに
至った。

即ち、本発明は、グリコサミノグリカン分解酵素を不溶
性硫酸化多糖類担体に吸着・脱離させることを特徴とす
るグリコサミノグリカン分解酵素の精製法である。

本発明に用いる不溶性硫酸化多糖類担体としては、市販
されている硫酸化セルロファイン（生化学工業製）、セ
ファデックス（ファルマシア社製）やセファロース（フ
ァルマシア社製）などの市販多糖類クロマト基剤を硫酸
化したもの、あるいは可溶性多糖類をエピクロルヒドリ
ン等を用いて架橋して水不溶性とした後硫酸化を行なっ
たものなど、いずれを用いることもでき、その多糖類の
種類、不溶化法、又は硫酸化の方法によって、何ら制限
を受けるものではない。

硫酸化の方法としては、従来知られている方法、たとえ
ば多糖類をピリジン、クロロホルム、ジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中に懸濁し、クロ
ロスルホン酸、無水硫酸等の硫酸化剤及びその有機塩基
との複合体等の量や、反応温度、反応時間を選ぶことに
より、種々の硫酸化度の異なる硫酸化多糖類を得ること
ができる。

これら不溶性硫酸化多糖類担体を用いて酵素を精製する
方法としては、従来のイオン交換クロマトグラフ法に用
いられている一般的手法、バッジ法、カラムクロマトグ
ラフ法などが適用でき、これら担体に吸着・脱離させる
ことにより行なう。使用する緩衝液としては、酢酸緩衝
液、燐酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液など通常ｐＨ５，０
〜９．５の範囲で操作できる緩衝液が用いられるが、そ
の種類を選択することにより酵素の分離パターンを種々
変化させることも可能である。

（実施例） 以下に不溶性硫酸化多糖類の製造例及びこれを担体とし
て用いたグリコサミノグリカン分解酵素の精製法の実施
例を示す。

製造例 セファデックスＧ−５０（ファルマシア製）５ｇをホル
ムアミド１００−に懸濁し、この液に予め冷却したクロ
ロスルホン酸２．５−を含むホルムアミド溶液１００−
を添加した。この混液を撹拌しつつ３０℃に５時間保持
した後、約２００−の氷水を添加し、２Ｍ炭酸ナトリウ
ム溶液を滴下してｐＨを７．０とした。この液をグラス
フイルターを用いて濾過し、よく冷水で洗浄して硫酸化
セファデックスを得た。一部をエタノールで脱水後、乾
燥し、得られた乾燥物中に含まれる硫酸基の含有量は０
．８％であった。

以下の実施例における酵素活性測定法は次の通りである
。

ａ）ヘパリナーゼ活性測定法：ブタ腸粘膜ヘパリン溶液
（１０ｍｇ／＋ｉ）　２５１、酵素液２５７Ｊ及び２ｍ
Ｍ酢酸カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７，
０）５０パを混ぜ、３７℃で１０分間反応させる。反応
終了時、０．０６Ｎ塩酸５００μを加え、２３２ｎｍの
吸収増大を測定する。活性力価は１分間に１μモルの不
飽和ウロン酸を形成させる酵素量を１単位とする。

ｂ）ヘパリチナーゼ（ヘパラン硫酸リアーゼ）活性測定
法二基質としてヘパラン硫酸を用い、その他はヘパリナ
ーゼ測定法に同じ。

ｃ）２−スルファターゼ活性測定法：ΔＤｉ−ｄｉＳｏ
（生化学工業製）２．８ｍｇを１−のイミグゾール緩衝
液（ｐＨ６，５）に溶解し基質とする。この液１０パに
対し酵素液２０μを加え、３７℃で１５分間反応後、１
００℃で１分加熱して反応を停止する。この液２０μを
高速液体クロマトグラフィーに負荷し、分解で生じるΔ
Ｄｉ−６Ｓ量を２３２ｎｍ吸収で測定する。

活性力価は１分間に１μモルのΔＤｉ−６５の生成量を
１単位とする。

ｄ）グリクロニダーゼ活性測定法：△Ｄｉ−６３（生化
学工業製）（２ｍｇ／ｄ）　１０μ、０．２Ｍトリス塩
酸緩衝液ｐＨ７，５を１０ｄ及び酵素１０ｐＩ！を加え
、３７℃で１５分間反応させ、次いで１００℃で１分加
熱して反応を停止する。

この液２０−を高速液体クロマトグラフィーに負荷し、
２３２ｎｍの吸収の低下量から活性を算出する。酵素力
価は１分当り１μモル相当の不飽和糖の分解量を１単位
とする。

ｅ）コンドロイチナーゼＡＢＣ及びコンドロー４−スル
ファクーゼの測定法：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　（：ｈｅｍ
。

２４３１５２３　（１９６８）記載の方法に準じて行う
。

実施例１ ヘパリンを誘導剤として培養したフラボバクテリウム・
ヘパリナム菌体から得られた粗酵素抽出液の凍結乾燥粉
末を原料とした。この粉末５ｇを５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６，８）に溶解し、同緩衝液で平衡化したハイド
ロキシアパタイトカラム６Ｘ２０ｃｍに負荷した。カラ
ムを２βの同緩衝液で洗浄後、同緩衝液及びその０．５
Ｍ食塩液各３１２ずつの溶液による直線的濃度勾配法で
溶出を行い、ヘパリンを基質として活性を測定した。

ヘパリナーゼの活性画分（溶出食塩濃度綿０．１２Ｍ〜
０．２Ｍ）を集め、限外濾過膜を用い脱塩濃縮し、続い
て５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄した
後１００−とじた。この液に同緩衝液で平衡化した硫酸
化セファデックスＧ−５０の２０ｇ（湿重量）を加え、
５℃で１時間ゆっくり撹拌した後、２×ｌＯＣｍのカラ
ムに移し同溶媒で洗浄、２−スフイターゼを通過させ、
次いで０．２Ｍ食塩液で洗浄後、０．５Ｍ食塩液でヘパ
リナーゼを溶出した。得られた活性画分を表に示す。

分画前　　　　　９５　　　１４８単位　　３．８単位
未吸着画分　　　７３　　　　０　　　　３．２０．２
Ｍ食塩　　　　　？、５　　　　　（ｌ　　　　　Ｏ溶
出画分 ０°５Ｍ食塩　　　　　３．２　　　１１６　　　　０
溶出画分 実施例２ 実施例１において、ハイドロキシアパタイトカラムから
の溶出画分をヘパラン硫酸基質で追跡し、ヘパリチナー
ゼ画分（食塩濃度的０．２５〜０．３２Ｍ）を集め、限
外濾過膜を用いて濃縮脱塩及び５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，２）で洗浄した。この液を同緩衝液で平衡
化した硫酸化セルロファイン力ラム（２，２Ｘ３０ｃｍ
）に通した後、同緩衝液で洗浄、次いで０．４Ｍ食塩を
含む同緩衝液を終濃度とする直線的濃度勾配法で溶出を
行った。

このヘパリチナーゼ画分のカラム負荷前の試料にはグリ
クロニダーゼが混入していたため、ΔＤｉ−６３を基質
としてその活性を追跡した。

クロマトグラフィーの溶出パターンを図１に示す。

このクロマトグラフィーによりヘパリチナーゼ及びグリ
クロニダーゼの比活性はクロマトグラフィー前に較べ夫
々６倍及び１８倍上昇した。

実施例３ コンドロイチン硫酸を誘導剤としてプロテウス・ブルガ
リスの培養を行い、その菌体内からプロクミン処理、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィーを行った
後、５０ｍＭ１−リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対し
透析し、部分精製したコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液４
０−を得た。この液を硫酸化セルロファイン力ラム（２
，２Ｘ２２ｃｍ）に負荷し、洗浄後、同緩衝液中で食塩
濃度を０から０．４Ｍまで上昇させてコンドロー４−ス
ルファターゼを除去し、コンドロイチナーゼＡＢＣの比
活性を約１２倍上昇させた。クロマトグラフィーの溶出
パターンを図２に示す。

コンドロイチナーゼＡＢＣの活性収量及び比活性を下表
に示す。

前　　　　６７００単位　　　４２２　　　　　１５．
’Ｊ後　　　　５９８０単位　　　３０．６　　　１９
５（発明の効果） 本発明の精製法によれば、多種類の有用な酵素を夫々効
率的に分画精製できる。更に、従来のグリコサミノグリ
カン固定化担体を用いてＧＡＧそのものを固定化したリ
ガンドは酵素分解を受けやすいのに対し、本発明の不溶
性硫酸化多糖類担体は安定であり、カラムは塩で洗うだ
けで容易に再生可能であり、且つ担体は非常に廉価であ
るため多量に使用することができるという利点がある。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例２のクロマトグラフィーの溶出パターン
を示し、図２は、実施例３のクロマトグラフィーの溶出
パターンを示す。 ｆｌＪルα、ｌ　　　＜Ｍノ ＣＵ先α〕〔Ｍ〕 二 ０毛１ｄＯ 〜 ０８でσＯ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. グリコサミノグリカン分解酵素を不溶性硫酸化多糖類担
   体に吸着・脱離させることを特徴とするグリコサミノグ
   リカン分解酵素の精製法。