JPH05507297A - ヘパリンの酵素による中和 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヘパリンの存在により生じる正常な血液機能に対する干渉を除去する ために、市販の生細菌のヘバリナーゼ調製物を用いて哺乳類の血液および血漿を 処理する方法に関する。

ヘパリンは、交互に結合されているヘキスロン酸、すなわち交互に１．４結合で 結合されている、Ｌ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸のいずれかと、Ｄ−グ リコシアミンの残基よりなる骨格を有する硫酸化グリコサミノグリカンであるａ 　Ｌｉｎｄｚｂｌら、’ｏｓ　ｎｔ　ｅｓ’ｓ　ｏｆ　ｈｅ　ａｒ’ｎ　ＴｌＢ ５１１（５）：２Ｏ−２２５（１９８６）に報告されているように、ヘパリンの 異種構造特性は、これらの残基における硫酸置換基の程度および位置が変化する ことによるもので、ポリマー中に少なくとも１０個の異なる単糖類の構造ブロッ クを有している。この異質性のためおよび三糖類ユニットあたり硫酸残基が２． ６を越える程に硫酸置換が高程度であるため、ヘパリンは高いタンパク質結合能 を有し、この結果、いくつかの酵素系を阻害または活性化する（　Ｓａｋａｍｏ ｔｏおよびＳａｋａｍｏｔｏ、”Ｈｅｐａｒｉｎ　ａｎｄ　ｂｏｎｅ　ｍｅｔａ ｂｏｔｉｓｉ：　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆｈｅｐａｒｉｎ　ｏｎ　ｂｏｎｅ　ｃｏ ｌｌａｇｅｎａｓｅ　ｒａｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ａｃｔｆｖｉｔｙ　ａｎｄａｎ 　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｒｉｎ−ｓａｐｈａｒｏｓｅ　ａｆ ｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｆｏｒ　ｆｎ　ｖｉｔｒｏ　５ ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｂｏｎｅ　ｒｅｓｏｒｐｔｆｏｎ−５Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　ａｎ ｄ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　Ｆｌｅ　ａｒｉｎ　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　 Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｒｅｓｓ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　１９８１＞）。タンパク 質−ヘパリン会合は、多くは静電気による相互作用に起因するものであるが、特 異的オリゴ糖配列領域に対応した三次および二次構造の相互作用に起因する会合 もまた観察されている。ｔ？ｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＤａｍｕｓ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２４８：６４９０−６５０５（１９７３）に論じ られているように、最も完全に研究されている配列特異的相互作用は、抗トロン ビン３　（ＡＴ　Ｉ目）−トロンビン複合体の安定化であり、その結果、凝血が 抑制される。

ヘパリンは、外科手術および透析治療に関連して、広く抗凝血剤として用いられ ており、静脈ラインおよび血栓溶解異常の治療中の凝血を防ぐ。すべての入院患 者の５−１０％が血液中にヘパリンを有している。最近では、低分子量のヘパリ ン、天然ヘパリンの化学誘導体が潜在的な抗凝血剤として研究されている。これ らにおける反応の主要なメカニズムは、Ｃｈｏａｙら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　 Ｒｅｓ、　１に２４０（１９８０）に報告されているように、Ｘａ因子の阻害で ある ヘパリン治療を受けている患者または静脈を通してヘパリンに曝されている患者 は、血液学的な状態を評価するため、またはヘパリン治療自体を観察するため種 々の方法で頻繁に検査される。例えば、活性化クロブト形成時間（ａｃｔｉｖａ ｔｅｄｃｌｏｔｔｉｎｇ　ｔｉｍｅ）アッセイは体外での処置の間２０分間隔で 行われ、十分なヘパリン化が行われているか、および接触活性化クロ・ノド形成 が抑制されているかが確認される。ヘパリンはいくつかの通常の血液学的分析を 妨害する。血流中にヘパリンが存在すると、最終ポイントとしてのクロット形成 に依存する標準的な凝血アッセイによる凝血異常の同定が妨害される。これらは 、活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、因子補体（ｆａｃ ｔｏｒ　ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）アッセイ１および活性化クロ７ト形成時間を含 む。ヘパリンと、フィブリン溶解アッセイにおけるポリリジン基質のような、他 の検査の主要成分との静電的相互作用により同様な干渉の問題が生じる。

ヘパリンの干渉の問題を回避する試みがいくつかなされている。ＣｕＩＩＩＩｉ ｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、　４１：４３−５６（１９８６）に記 載のように、検査前に試料からヘパリンを吸着するためにイオン交換樹脂が用い られている。この方法は非特異的であり、ヘパリンの他に凝血因子および他の血 液タンパク質をも除去するため検査結果に影響を及ぼす。この技術はまた時間を 要するため、結果を早急に必要とする手術中の５ＴＡＴ検査としてはすぐには使 用され得ない。

ＣＣｕｍｍ１ｎら（１９１１８）にも報告されているように、ヘパリンを静電気 による相互作用および沈澱により中和するために硫酸プロタミンが使用されてい る。プロタミン−ヘパリンの反応は化学量論的であり、正確に滴定して、不完全 な中和または硫酸プロタミン自体の抗凝血特性の結果生じる悪影響を防ぐ必要が ある。この方法は煩雑で、間違えやすく、また正確な滴定測定を行うためには多 量の試料が必要である。硫酸プロタミンは低分子量のヘパリンの抗凝血効能を中 和することはできない。

別の方法としては、Ｆｕｎｋら、Ｂ　ｉｔ、　Ｊ、　ｔｌａｅｍａｔｏｌ、　２ １：４３−５２　（ｔ９７１）に記載されているように、阻害されたトロンビン を、さらにトロンビンを追加することにより、または同様の反応を触媒し得るレ ブチラーゼ（ｒｅｐｔｉｌａｓｅ）のような代替酵素により補うことである。こ の方法は、フィブリン形成後の成行きを観察するためのアッセイの場合は成功し 得るが、トロンビン媒介の反応の前の凝血経路における凝血異常を検出するため には不適切である。さらに、血小板などの他の成分に及ぼすヘパリンの影響はこ れらの代替酵素によっては回避され得ない。

ヘパリンの干渉の問題に対するもっとも望ましい解決方法は、試験の開始直前に 血液試料からヘパリンを迅速且つ特異的に除去し得る方法である。これを行うた めに使用される添加物は広範囲な条件にわたって機能する必要がある。ヘパリン をほぼ即座に中和し、一方この試薬自体は長い露出期間にわたって血液成分にい かなる影響も及ぼしてはならない。これらの特性を示す試薬は、試料調達の直後 に行われるＡＣＴアッセイに関連して、また処理前に１時間はどは準備して待つ ことが多い血液学実験室で試験される試料に対して使用され得るものである。試 薬は、以下のものを含む試料に対処するために２から３７℃の広い温度領域にわ たって機能しなければならない。すなわち、血液学実験室にて氷上保存されたも の、血液１度が３０″Ｃに維持された心臓血管の手術を行う患者から採集された 試料、および正常な体温３７°Ｃで実行される透析などの治療を受ける患者から の試料を含む。ヘパリン中和試薬はまた、試薬を一滴加えるだけで、臨床におい て使用される量を越えるヘパリンの広範囲の濃度（血栓溶解治療に対しては０． ３　Ｉｌｌ／ｍｌまで、透析治療に対しては１．５１ＬＩ／ｍｌまで、および心 臓血管手術に対しては６１Ｕ／ｍｌまで）を効果的に中和するように、濃度に非 依存的であるべきである。さらに、ヘパリンを含有する試料を処理した後は、ヘ パリンに曝されていない未処理の試料と同じ結果が示されねばならない。このよ うな試薬の候補としては、ヘパリンに対して特異的であり、意図する試験により 測定される試料に対して他の影響は及ぼさない分解酵素グルカナーゼであり得る 。

Ｈｕｔ　ｔおよびＫｉｎｇｄｏｎ、　Ｊ、ａｂ、　Ｃ’ｎ、　Ｍｅｄ、　７９： １０２７　（１９７２）はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ 由来のヘパリナーゼを使用して・ＰＴＴ分析を行う前に血漿試料を処理すること を試みた。この論文の著者は、細ｍ源からの干渉の影響を減らすために、Ｆ、　 ｈｅｐａｒｉｎｕｍの粗抽出物からヘバリナーゼを精製するための必要条件につ いて述べている。しかし、彼らのデータによれば干渉部分を完全に除去し得ない ことが示された。０．００８１０のヘパリナーゼを含有するタンパク質調製物で は０．１１Ｕ／＊Ｉのヘパリンを中和するには不十分であり、一方、Ｇ、０４１ Ｕのヘバリナーゼを含有する調製物ではＰＴＴ時間が延長された。この調製物が 成功するかどうかは、酵素の正確な滴定に依存し、また中和され得るヘパリンの 量において制限される。

Ｆｏｌｋｍａｎらの米国特許第４．７９５．７０３号は、Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎ ｕｍ由来のヘバリナーゼを使用して、活性化クロット形成時間アッセイを使用し てヒト全血試料におけるヘパリンの定量測定を行う方法について述べている。こ の場合も同様に、彼らの酵素調製物から干渉部分を完全に除去することは不可能 であった。

もともとヘパリンを含有するヘパリナーゼにより処理された試料は、ヘパリンに 曝されていない未処理の試料より１６％長いＡＣＴ時間を示した。ヘパリンの定 量測定は、試験結果を酵素調製物が試験結果に及ぼす影響を考慮に入れたと思わ れる標準曲線と比較することによるものであるため、この影響は彼らの方法にと っては有害なものではなかった。

どちらのグループも、試験結果に影響を及ぼす原因であるＦ、　ｈｅｐａｒｉｎ ｕｍ部分を同定してはおらず、またこれをヘパリン中和の原因であるＦ、　ｈｅ ｐａｒｉｎｕｍ活性成分からその解明も行っていない。これら論文の著者はいず れも、自分たちの調製物が抗凝血剤として作用するＦ、　ｌｅｐａｒｆｎｕｍか らの別の分子を含有するのか、もしくは過剰にまたはヘパリンと結合して使用さ れるとヘバリナーゼ自体が抗凝血特性を宵するのかどうかを識別し得なかったｏ Ａｋｏｕｍら、ｏｍｂｏｓ’ｓ　ｅｓ、　６０：９−４８　（１９９Ｇ）に報告 されているように、グラム陰性細菌源からの糖タンパク質であるミキサリン（ｍ ｙｘａｌ　ｉｎ）の最近の特性付けにより、この物質がその炭水化物部分と関連 する抗凝血特性を有することが示された。ヘバリナーゼもまた塘タンパク質であ リ、従って同様の特性を有する可能性が強（示唆される。

Ｂｏｈｍｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、６０：３３Ｌ−３３５＜１９ ９（１）は、未測定で人手不能な細菌源由来のヘバリナーゼＩＩ＋を使用してａ ＰＴＴおよびＰＴアッセイ前にヘパリンを中和して、トロンビン介在のフィブリ ノーゲンの分解に対するヘノくリンの阻害を中和するこの試薬の潜在能を検査し た。この酵素をクエン酸塩添加血漿と共に３７℃で５分間、および全血と共に３ ７°Ｃで１５分間インキコベートしたものを使用して所望のヘノでリン中和を行 った。

ヘパリナーゼＩＩ＋の最適活性のための条件、ｐＨ７，６、［ＮａＣ１］コ０． ０３、および温度４５℃（１６）を得るには、報告された方法ζこインキコベー ション期間を加える必要があったと考えられる。

以上３グループのいずれも、臨床用生成物の必須成分である各々のヘパリナーゼ 処方剤の安定性に対する証拠を提出しなかった。

ヘパリンの主要な治療用途の１つは、心臓血管手術中に患者の血液を体外循環路 を通して循環させるときに凝血を防ぐことである。この適用においては正常な血 栓溶解投与量の約１０倍のヘパリンが使用されるため、プロタミンを投与するこ とによる術後の中和が２要となる。プロタミン逆転はＩ４１りつかの合併症を引 き起こし、また滴定が必要であるため、ヘノくリン／プロタミンによる止血制御 に代わる別の方法力く望ましい。１つの方法としては、プロタミン逆転の代わり （こヘノ＜ＩＪナーゼを用いてバイパス後、患者に直接注入することである。

Ｋｌｅｉｎら、）　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　１０２：８２８−８３７ 　（１９８２）およびＬａｎｇｅｒら、Ｔｒａｎｓ、Ａｍ、Ｓｏｃ、Ａｒｔｔｆ ｉｃ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｏｒ　ａｎｓ　２８：３８７−３９０　（１９＆２）に報 告されているように、Ｌａｎｇｅｒおよび共同研究者は動物モデルでヘパリナー ゼのインビボにおける効果について調べた。０．５８１０／ｍｇの比活性を有す るヘパリナーゼを、ヘパリンを投与したウサギに注入して、凝血を経時的に測定 するためにａＰＴＴアブセイを使用した。ヘパリナーゼを投与しなかったウサギ に比べてヘパリンのクリアランスが促進された。しかし、凝血時間はヘバリナー ゼ注入後ＩＳ分では依然として基準値の３倍で、１時間後に基準値に戻った。こ れはヘパリナーゼを注入しなかったコントロールの動物と同じ時間であった。Ｌ ａｎｇｅｒはまた固定化ヘパリナーゼリアクターを通して血液を吸入することに より逆転をよりよく行うことができた。この結果の後、Ｌａｎｇｅｒのグループ はヘパリナーゼを直接注入することは諦めて、プロタミンに代えてヘパリナーゼ を体外にて使用する方法を開発することに集中した。

従って、本発明の目的は、幅広い濃度領域で、インビトロおよびインビボの両方 でヘパリンを迅速および完全に中和するために使用し得るヘパリナーゼ調製物を 提供することである。

本発明の別の目的は、凝血時間を変える夾雑物を含まないヘパリナーゼ調製物を 提供することである。

本発明のさらに別の目的は、室温で長時間安定であるヘパリナーゼ調製物を提供 することである。

発明の要旨 正常な血液機能に対するヘパリンの干渉を除去し得る臨床試薬としてのすべての 要求を満たす、Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍに由来するヘバリナーゼ処方剤が開発 された。Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘバリナーゼは凝血を抑制する成分を 含んでいない。これは、通常の製造、運搬、および臨床用保管の条件下において 少くとも１年間は安定である。ヘバリナーゼには、ｐｌ！＝６．５から７゜０、 ［ＮａＣ１］・０．１、および１度３７°Ｃという生理的条件に近い最適活性の ための条件がある。この調製物は、臨床において想定され得る全ての条件を包含 する幅広い範囲の条件にわたって意図する中和を行う。

ヘパ’Ｊ　ナーゼは、ヘパリンの存在による血液学的アッセイにおける干渉を除 去するためにインビトロにおいて有用である。ヘパリナーゼはまた外科手術の間 にヘパリンをインビボにおいて中和するためにも有用である。この調製物の利点 は、従来の入手可能な組成物よりも中和が速くより完全になされ、また長期にわ たって安定であることである。

図面の簡単な説明 図１は、２５０１［Ｊ／ｋｇのヘパリンは投与されているがヘパリナーゼは投与 されていないコントロールのウサギ（白丸）、および２５０１Ｕ／ｋｇのヘパリ ン投与の５分後に２．５１０／ｋｇのヘバリナーゼを投与されたウサギ（黒丸） に対する、活性化クロット形成時間（秒）対ヘバリナーゼ注入後の経過時間（分 ）のグラフである。ベースラインＡＣＴは（、、、、）として示す。これら処置 を行ったウサギのＡＣＴをｇｏ分間にわたって観察した。

発明の詳細な説明 正常な血液機能に対するヘパリンの干渉を除去し得る臨床試薬としてのすべての 条件を満たすＦ、　ｈｅｐａｒｉｎｕ＋ｏに由来するヘバリナーゼ処方剤が開発 された。ヘバリナーゼ自体は抗凝血剤ではないということが確認されている。こ の目的を追求するために、Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼを凝血 を抑制する成分から完全に分離した。ヘパリナーゼを通常の製造、運搬、および 臨床用保管の条件下において少な（とも１年間は安定であるように処方する方法 もまた開発された。Ｆ、　ｈａｐａｒｆｎｕｍ由来のヘバリナーゼは生理的条件 に近い最適な活性特性を有するため、この酵素は意図される適用条件、ｐｆｌ＝ ６．５から７−０．　［ＮａＣ目＝０．１、および温度３７℃に対して適切であ る。本明細書にて述べる調製物は、臨床において想定され得る全ての条件を包含 する幅広い範囲の条件にわたって意図する中和を行う。本明細書にて示す結果を 、発表されているデータと比較することにより、′この精製された安定したヘバ リナーゼが、ヘパリンの干渉の問題を解決し得る最初の商業化された酵素に基づ く生成物を提供することが示される。

工程は次の３つの部分に分かれる。（１）抗凝血剤を含まないヘパリナーゼの調 製、（２）抗凝血剤を含まないヘパリナーゼの安定化および処方、および（３） 抗凝血剤を含まないヘバリナーゼを使用して、ヘパリンの存在による血液学的ア ッセイにおける干渉を除去することである。ヘパリナーゼはまた外科手術の間に ヘパリンをインビボにおいて中和するためにも有泪である。

抗凝血剤を含まないヘパリナーゼの調製ヘパリン干渉はグラム陰性細１！ＩＦｌ ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｉ　ｈｅｐａｒｉｎｕｍの培養物から単離される。Ｆ、 　ｈｅｐａｒｉｎｕｍは、Ｇａ１ｌｆｈｅｒら、鑓、ｎｖｔ　ｏｎ、　Ｍ’ｃｒ ｏｂｔｏｔ、　４１（２）：３８０−３６５　（１９８１）の方法まには同様の 方法により、ヘパリンを含有する適切な栄養培地にて培養し、ヘパリン干渉の合 成を誘引する。　Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍ細胞を濃縮してヘパリン干渉を音波 破砕、ホモジナイゼーション、または浸透圧ショック法により溶液中に放出する 。次に、硫酸プロタミン沈澱、硫酸アンモニウム沈澱、ヒドロキシルアパタイト クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、またはカチオン交換ク ロマトグラフィーを含む標準的な精製法を１つ以上使用し、ヘパリナーゼをこの 溶液から精製し、タンパク質Ｂ当りヘパリナーゼ１０から３５！ｕの比活性を有 する調製物を生成する。この物質は、標準的なａＰＴＴおよびＡＣＴアッセイに よる測定によれば、凝血を抑制する部分を含有する。

この物質はさらに、セルファインスルフェート（ＡｍｉｃｏｎＴ″）または同等 のポリ硫酸化樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィ一工程により精製 される。この物質は、抗凝血性部分が例えばｐＨ７，０，伝導率３から１２ｍｍ ｈｏｓの溶液に残存する一方でヘパリン干渉は吸着されるという条件の下で樹脂 に曝される。樹脂を洗浄して抗凝血性部分の形跡を完全に除去した後、ヘパリン 干渉を伝導率がさらに大きい、例えばｐＨ７，０゜１６ｍｍｈｏを越える伝導率 の緩衝液にて洗浄することにより回収する。機能的に同等の溶液であれば、上述 のｐＨ７，０，３から１２および１６ｍｍｈａｓを越える溶液の代わりに使用し 得る。回収されたヘパリナーゼ画分は抗凝血性部分を含まない。

ヘパリン干渉の臨床用処方 ヘパリナーゼは、ヘパリナーゼの反応を行うために通常使用される緩衝塩溶液に 保存すると、半減期は３７℃で１時間、“２３℃で３０時間、４℃で１２５時間 であると、Ｌａｎｇｅｒら、鋭お瓜岨２１７：２６１−２６３　（１９８２）に 報告されている。以下に述べるように、数種の化合物を、可溶性ヘパリナーゼ調 製物を安定化する能力について試験した。これらの中で、硫酸アンモニウムが最 も優れ、ヘパリナーゼの酵素半減期を６０倍延長させた。高濃度の酢酸ナトリウ ムおよび硫酸ナトリウムもまたヘパリナーゼ活性を安定化したが、硫酸アンモニ ウムはどに大規模ではなかった。安定化剤、好ましくは硫酸アンモニウムまたは 他の同様の塩を、抗凝血剤を含まないヘパリナーゼＩＵ単位あたり０．５−１． ０ｍｇ硫酸アンモニウムの割合でヘパリナーゼに添加する。はとんどの臨床試料 は抗凝血剤を含まないヘパリナーゼを０．０５から３．０ＩＵの範囲で含有する 。

ヘパリン干渉の除去 採集されたばかりの全血または゛血液から回収された血漿の一部分を凍結乾燥さ せたヘパリナーゼ調製物を含有するチューブに移す。この酵素を試料に溶解させ て４−３７℃で６０分以内の間インキユベートする。一般には、ヘパリナーゼ中 和は酵素が溶解するのに要する時間、１５秒を越えない時間内に完了する。例え ば、０．０５１Ｕのヘパリン干渉は、　４．８　Ｉｌｌのへ、ｆリンを含有する ０、４ｍ１Ｏ全血試料中のヘパリンを１５秒で中和する。

インキュベーション後、試料は意図する血液学的アッセイによる処理に供される 。アッセイは標準的な方法を使用して行われ得る。得られる結果は、ヘパリンま たはへ／ｆリナーゼのいずれにも曝されていない同じ患者から採集された試料に 対して得られる結果と等しい。

もしくは、ヘパリナーゼをＧ、０１１Ｕヘパリナーゼ／ＩＵへ／４リンの割合の 投与量で哺乳類の体内に静脈注射し得る。ヘノ櫂すナーゼ注入後１５分以内で止 血に対するへ／ｆシリン影響が中和される。

本発明がさらに理解されるよう以下に実施例を示すが、これらは限定的なもので はない。

実施例１：ヘパリナーゼの調製 １００　Ｌ、のＦ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍをＧａ１ｌｉｈｅｒら、　、ｎｖ’　 ｏｎ、Ｍ’ｃ（社）性態−４１（２）：３６０−３６５　（１９８１）に記載の 最少培地の変形物を用いてケマップ（Ｃｈｅｍａｐ）ファーメンタ−中で培養し た。この技術は本明細書に援用している。温度は２３℃に維持し、そして適度に 水酸化アンモニウムを添加してｐＨを７．０に調節した。

２４時間のインキュベーション後、容積あたりの＾／４リナーゼ活性は２．５１ Ｕ／ｍｌに達した。細胞を遠心分離により集めて、本明細書に援用されているＺ Ｉｍ＋＊ａｒ＋ｗａｎｎらの米国特許出願系０７／２０３．２３５号に記載され ている浸透圧シヨツク法の変法により周辺腔からヘパリナーゼを放出させた。浸 透圧シコ・ツク生成物をＺｉｍｍｅｒｍａｎｎらに記載のようにカチオン交換ク ロマトグライーで処理した。得られたヘパリン干渉画分をセルファインスルフェ ート（ｃｅｌｌｕＨｎｅ　５ｕｌｆａｔｅ）カラム（５，０ｃｏ＋内径Ｘ３０　 ａｍ＞に直接かけ！、１０１１Ｍ　リン酸ナトリウム、ｐＨ７，０：　１０ｍＭ リン酸ナトリウム、２００　ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，０；　１０　ｍＭ　リン 酸ナトリウム、４００　ｉＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，０；および１０　ｍＭ　リン 酸ナトＩＪウム、１０００ｍＭ　Ｎａｃｌ、ｐＨ７，０のＩＬの洗浄液で連続し て溶出した。

アフィニティークロマトグラフィ一工程で得られたものを表１に示す。ヘパリン 干渉活性は０．４　Ｍ　ＮａＣ１で溶出した画分に回収されるが、抗凝血性部分 は結合されない画分中に存在する。この工程で回収されたヘノクリナーゼは、血 液に対するヘパリンの影響を除く巨的の使用に適している。

本抗凝血活性は、既知量の物質を正常ヒト血漿と温度４℃において１５分間イン キュベーションを行った後、ａＰＴＴ試験を行って測定をする。この活性は、物 質とイン亭ユベートした血漿のａＰＴＴの、その試料の正常ａＰＴＴ値に対する 比率として表すく典型的には２４−２８秒）ヘパリナーゼをヒドロキシルアパタ イトカラムクロマトグラフィーでさらに精製した。セルファインスルフェートク ロマトグラフィ一工程で回収したヘパリナーゼ画分を、１０倍容量の１０　ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐｇ　７．０に対して２回透析を行い、そしてＢｉｏｇｅｌ 　ＨＴＰ”　（ＢｉｏＲａｄ）カラム（１，６ａｍ内径ｘ１０ｅ謹）にかけた。

このタンパク質を、２０倍カラム容量にわたる量の１０から２５０　ｍＭのリン 酸ナトリウムおよび０から０．５Ｍの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配で溶出し た。ヘパリナーゼを、１６■Ｍリン酸ナトリウムおよび０．１９Ｍ塩化ナトリウ ムで溶出されるタンパク質の単一ピークとして回収した。この物質の５Ｏ３−Ｐ ＡＧＥ分析は、均質に近いたことを示している（９８％を越える）。精製データ および抗凝血性部分の除去を示すヘパリー！−−セの回収工程の概要を表２に示 す。上記のヒドロキシルアバタイト工程で回収された均質なヘパリナーゼは同様 に、ヒト血液および血漿中のヘパリンを中和し得゛た。これはヘパリナーゼ以外 のセルファインスルフェート調製物中のタンパク質はこの使用には必要ではない ことを示す。

本抗凝血活性は、既知量の物質を正常ヒト血漿と温度４℃において１５分間イン キニベーシテンを行った後、ａＰＴＴ試験を行って測定をする。この活性は、物 質とインキユベートした血漿のａＰＴＴの、その試料の正常ａＰＴＴ値に対する 比率として表す（典型的には２４−２８秒）実施例２：ヘバリナーゼ調製物の安 定化ヘパリナーゼ調製物は通常の製造、運搬および臨床用保管条件下で少なくと も１年間にわたって安定である。安定性は、ある程度は添加物、最も好ましくは 硫酸アンモニウムの作用による。数種の化合物に対して、可溶性ヘパリナーゼ調 製物を安定にする能力について試験した。その結果を表３に示す。

引き続いて、種々の量の凍結乾燥硫酸アンモニウムの凝血に対する影響を試験し た。２．５Ｂ／ｍｌ血液までの量の硫酸アンモニウムは凝血に対して測定し得る ほどの影響を示さなかった。１．５１０ヘパリナーゼあたり０．２ｍｇという少 量の硫酸アも２００日に延ばせ得る。この実施態様においては、０，５から２゜ ０１０のヘパリナーゼを１．０ｍｇ硫酸アンモニウムの存在下に凍結乾燥して、 液が０．２から５．０＋１１人るチューブζこ入れる。これらには、マイクロタ イターウェルから５．０ｍｌのポリブロブレンテストチ二−ブまで種々のチュー ブが含まれる。他の実施態様においては、ヘノくリナーゼー硫酸アンモニウムｉ ！、直接凍結乾燥して、市販されている種々の血液学的アブセイキットに含まれ ている容器、試験される試料を収集するために用いられるシリンジ、移送用ピペ ット、あるいは調製物を注射治療薬として使用の前に再溶解され得るような隔膜 壁を備えた滅菌バイアルに入れられ得る。

実施例３　：　ＡＣＴアッセイのための試料中のへ／ｆリンの中和ＡＣＴアッセ イ−活性化クロット形成時間（ＡＣＴ）アツセイは、心臓血管手術においてヘパ リンの抗凝血効果をモニターするため日常的に用いられている。内在性のクロッ ト形成経路の機能測定であるため、ＡＣＴ測定値はへ、ｆリン以外の因子に影響 される。心臓血管手術および体外循環は、手術中にクロット形成時間のベースラ インを変える血小板機能不全、血液希釈、播種住血管内凝固、あるいは凝血亢進 を引き起こし得る。従って、手術前の値と等しいＡＣＴの一定ベースラインを仮 定することは、ヘパリンあるいはプロタミンの投与に関する誤った結果を導き得 る。例えば、血液希釈はＡＣＴを引き延ばし、中和に必要とされるプロタミン量 の過大評価を導き得る。これとは逆に、接触活性化によって引き起こされる凝血 亢進は、ＡＣＴを短縮し、中和に必要とされるプロタミン量の過小評価を導き得 る。

たとえヘパリンを得た患者からの試料であったとしても、ＡＣＴ測定の前に迅速 に試料を前処理することによってクロット形成情報のベースラインが獲得できる 。１５１Ｕのへ、４リナーゼを上記のように凍結乾燥してＨｅｍｏＴｅｃ、Ｉｎ ｃ、（Ｄｅｎｖｅｒ、　Ｃｏ）製のデュアルテスト広範囲ＡＣＴカートリッジの １チャネルに入れた。得られたカートリッジから２つの結果を得る：処理されて いない試料の活性化クロブト形成時間およびヘノくリナーゼで処理された試料の 活性化クロット形成時間である。あらたに採血した血液を直接このカートリ・２ ジにより分析する力）、あるいはテストの前に、６１Ｕヘパリン／ｍｌとインキ ニベーシ重ンを行って分析した。表４に示されている結果は、ヘノ（リナーゼが 、血液試料６１Ｕ／ｍｌ中に含有されているへｔ４リンを完全に中和したことを 示している。ヘノくリンおよびヘノくリナーゼ両方で処理した試料は、そのいず れの試薬にも曝されていない試料と同じ結果を示した。同様の結果が０〜１２　 ［Ｕヘノくリン／ｍｌの範囲で得られた。心臓血管の外科手術にお０て得られた ヘパリン投与量の上限は６１Ｕ／ｍｌであった。

（以下余白） 奴４：　ヒ１−／Ｅ卸−ヤ偽へｊ＼・リゾの守秤このアッセイは以下の答えを含 む、心臓血管の外科手術中の有益な情報を臨床医に提供する。

（１）外科手術前にヘパリンが存在したかどうか。

（２）クロット形成時間のベースラインが処置中に変化したかどうか。

（３）ヘパリンのプロタミン逆転が達せられたかどうか。

（４）手術後にヘパリンが再生されたかどうか。

臨床研究からの結果および予測され得るテスト結果の解釈を表５に示す。

表５：　心臓血管外科手術中でのヘパリナーゼ活性化りロフト形成時間テストの 使用 テスト　八ＣＴ　ヘパリナーゼ　状態　推薦される　研究結果の時間　結果　＾ ＣＴ結果　（１９例）　処置バイパス前 正常　正常　正常　なし　１６／Ｈ 凝血 正常以上　正常　ヘパリン存在なし　Ｏ／９正常以上　正常　凝血異常　さらに 評価　３７１９４５０以下　正常　不十分な　ヘパリンの添加　Ｏ／１９抗凝血 性 ブクタミン投与後 正常　正常　逆転を満たすなし　４７１ｇ正常以上　正常以上　血液希釈　さら に評価　０／１９あるいは　凝血因子の添加 凝血！富 正常以上　正常　ヘパリン存在プロタミン　０／１９の添加 正常以下　正常以下　凝血亢進　抗凝血治療　１５／１９正常以下　正常　凝血 亢進　なし　０／１９及び 正常以上　正常以上　凝血異常　さらに評価　測定値なし正常　ｗＭ１０５−１ ３０秒 実施例５：ＰＴおよびａＰＴＴアッセイのための臨床試料中のヘパリンの中和 ＰＴ／　ａＰＴＴ−−プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイおよび活性化部分ト ロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイは、止血機能のアセスメントに日常 的に用いられている。ＰＴは、患者のクエン酸塩添加血液に、リン脂質、組織因 子およびカルシウムの調製物を添加し、クロットを形成すための必要な時間を測 定することのより行われる。このテストでは、第■因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子お よびヒブリノーゲンの凝集活性を測定する。ＦＴは、次の経口的抗凝血剤治療に しばしば利用される：すなわち、クマリンおよび抗ビタミンに薬剤。ａＰＴＴテ ストは、患者のクエン酸塩添加血漿に、セライト、リン脂質およびカルシウムの 調製物を添加して、そしてクロット形成に必要とされる時間を測定することによ り行った。このテストは、因子Ｘ［［、、ＸＩ、ＩＸ、　Ｖ［ＩＩ、Ｘ、　ｌｌ ５Ｖ、およびフィブリノーゲンの凝集活性を測定する。ａＰＴＴは、入院患者の 機能不全因子に対する凝血スクリーニングテストとして用いられている。

ａＰＴＴおよびＦＴ測測定れぞれに対するヘパワンを測定する方法は、これらの 結果の評価に役立つ。ヘパリナーゼＡＣＴテストの開発と同様の様式で、ａＰＴ Ｔ／ＰＴ情報のベースラインを提供するためのヘバリナーゼの使用が究明されて きた。上記のように、ｔ、ＺＵのヘパリナーゼを凍結乾燥して１．５■ｌポリプ ロ　゛ビレンチコーブに入れた。表６に示されているように、この量のヘパリナ ーゼは、クエン酸塩添加ヒト血漿中の１．０１０／ｌＬまでのヘパリンの影響を 完全に逆転し得る。典型的な治療用ヘパリン投与量は０．３１Ｕ／ｍＬである。

凝血データのベースラインが所望の場合には、標準の凝血分析の前に、０．５か ら１．０ｍＬの血漿をバイアルに加えて、逆転させておだやかに混合する。

実施例７：ヘパリンのインビボにおける中和Ｋｌｅｉｎら（１９１１２）および Ｌａｎｇｅｒら（１９８２）により報告されている、これまでに不成功に終わっ ているインビボにおけるヘパリンの中和の試みは、Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍの 抗凝血性部分による上記の同じ現象を反映しているようである。本明細書に記載 の方法により精製されたヘバリナーゼを用いて、インビボにおける調査を繰り返 し、１５分以内にヘパリンの完全な逆転が達成された。この結果を表１に示す。

４　ｋｇのウサギに２５０　Ｉｌｌ／ｋｇヘパリンを投与して、活性化クロット 形成時間（ＡＣＴ）を１８０秒から９９９秒に引き延ばした。ヘパリン投与後５ 分以内に、２．５１Ｕ／ｋｇヘバリナーゼを注入し、そしてＡＣＴの経時変化を 定期的にモニターした。ヘノくリナーゼの注入後１５分にベースラインに戻った ＡＣＴは、ヘパリンの抗凝血活性が完全に逆転したことを示している。同じ量の ヘノ（リンは投与されたがベハリナーゼは投与されていないコントロールのウサ ギでは、　ＡＣＴベースラインは１．５時間後に戻った。

このデータは、心臓血管の外科手術におけるへ、ｆリンを逆転させるための方法 として、ヘパリナーゼの直接注入を用い得る可能性を示している。

へ１＼°り丁−り゛辻ト、味ら巳：キ゛１１１（／ゴ）ＦＩＧＵＲＥ　７ 要約書 正常血液機能に対するヘパリンの干渉を除去し得る臨床薬剤としての全要求を満 たす、Ｆ、　ｈｅｐａｒｉｎｕｍに由来するヘパリナーゼ処方剤が開発された。

Ｆ、ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来のヘパリナーゼは、凝血を抑制する成分を含んでい ない。これは、通常の製造、運搬、および臨床用保管条件下において少なくとも １年間は安定である。このヘバリナーゼは、ヘパリンの存在が原因である血液学 的アッセイにおける干渉を、インビトロにおいて除去するために有用である。さ らに、ヘパリナーゼは、外科手術中のインビボにおけるヘパリンの中和に有用で ある。この調製物の利点は、従来の入手可能な組成物よりも中和が速くより完全 になされ、そして長期間に渡って安定であることである。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血液成分に対するヘパリンの生理学的影響を除去する方法であって、抗凝血 成分を含まない、ｐＨ＝６．５から７．０、［ＮａＣｌ］＝０．１、および３７ ℃において最適活性を有する安定へパリナーゼ調製物により、ヘパリンを含有す る血液を処理する工程を包含する、方法。 ２．前記ヘパリナーゼが、ポリ硫酸化樹脂を用いたアフィニティークロマトグラ フィーにより、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍの培養物から精製される、請求項１に記 載の方法。 ３．部分的に精製されたへパリナーゼを、ヘパリナーゼは樹脂に保持され、かつ 凝血を抑制するＦ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ成分は樹脂に保持されない条件下のアフ ィニティー樹脂にかける、請求項２に記載の方法。 ４．溶出剤の伝導率を増加させることによりアフィニティー樹脂からへパリナー ゼを溶出し、該溶出ヘパリナーゼ画分には凝血を抑制するＦ．ｈｅｐａｒｉｎｕ ｍ成分が含まれていない、請求項２に記載の方法。 ５．前記血液が、低分子量へパリンを含有する、請求項１に記載の方法。 ６．ヘパリナーゼ処方剤が、０．５〜１．０ｍｇ硫酸アンモニウム／ＩＵヘパリ ナーゼの存在下に、抗凝血剤を含まない０．０５から３．０ＩＵのへパリナーゼ を凍結乾燥することにより調製され、血液あるいは血漿試料の採集あるいはイン キュベーションに適した容器に入れられる、請求項１に記載の方法。 ７．前記容器が、採血チューブ、ピペットチップ、流体移送装置、およびシリヒ ジからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。 ８．前記血液あるいは血漿試料が、血液学的試験の開始前に、前記凍結乾燥され たへパリナーゼ処方剤とともに、２と４１℃との間の温度で１と３６００秒との 間の時間インキュベーションされる、請求項１に記載の方法。 ９．前記試験が終結ポイントとしてクロットの形成に依存する、請求項８に記載 の方法。 １０．前記試験が血液成分の作用に依存し、該作用が、該試験結果を変えるよう な様式でへパリンの存在下において影響される、請求項８に記載の方法。 １１．前記試験が血液成分の作用に依存し、該作用が、該試験結果を変えるよう な様式で低分子量ヘパリンの存在下において影響される、請求項８に記載の方法 。 １２．前記ヘパリナーゼ処方剤が、０．５〜１．０ｍｇ硫酸アンモニウム／ＩＵ へパリナーゼの存在下に、抗凝血剤を含まない０．０５から３００ＩＵのヘパリ ナーゼを凍結乾燥することにより調製され、容器に入れられ、該ヘパリナーゼが 生理学的に適した溶液に再溶解されることをさらに包含する、請求項１に記載の 方法。 １３．前記溶解されたへパリナーゼ処方剤が、血流中のヘパリンの抗凝血特性を 中和することを目的とするへパリン治療を受ける患者に静脈注射されることをさ らに包含する、請求項１に記載の方法。 １４．前記溶解されたヘパリナーゼ処方剤が、血流中の低分子量ヘパリンの抗凝 血特性を中和することを目的とする低分子量へパリン治療を受ける患者に静脈注 射される、請求項１３に記載の方法。 １５．抗凝血成分を含まない、ｐＨ＝６．５から７．０、［ＮａＣｌ］＝０．１ 、および３７℃において最適活性を有する、安定ヘパリナーゼ調製物。 １６．Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ由来である、請求項１５に記載のヘパリナーゼ調 製物。 １７．前記へパリナーゼが、ポリ硫酸化樹脂を用いたアフィニティークロマトグ ラフィーによって、Ｆ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍの培養物から精製される、請求項１ ５に記載のヘパリナーゼ調製物。 １８．部分的に精製されたへパリナーゼを、ヘパリナーゼは樹脂に保持され、か つ凝血を抑制するＰ．ｈｅｐａｒｉｎｕｍ成分は樹脂に保持されない条件下のア フィニティー樹脂にかける、請求項１５に記載のへパリナーゼ調製物。 １９．溶出剤の伝導率を増加させることによりアフィニティー樹脂からへパリナ ーゼを溶出し、該溶出へパリナーゼ画分には凝血を抑制するＦ．ｈｅｐａｒｉｎ ｕｍ成分が含まれていない、請求項１８に記載のヘパリナーゼ調製物。 ２０．０．５〜１．０ｍｇ硫酸アンモニウム／ＩＵへパリナーゼを凍結乾燥する ことにより調製される、請求項１５に記載のヘパリナーゼ調製物。 ２１．抗凝血剤を含まない０．０５から３．０ＩＵのヘパリナーゼを、０．５〜 １．０ｍｇ硫酸アンモニウム／ＩＵへパリナーゼの存在下に凍結乾燥し、血液あ るいは血漿試料の採集あるいはインキュベーションに適した容器に入る、請求項 ２０に記載のヘパリナーゼ調製物。