JPH0693836B2 - バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法 - Google Patents
バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法Info
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- JPH0693836B2 JPH0693836B2 JP63297807A JP29780788A JPH0693836B2 JP H0693836 B2 JPH0693836 B2 JP H0693836B2 JP 63297807 A JP63297807 A JP 63297807A JP 29780788 A JP29780788 A JP 29780788A JP H0693836 B2 JPH0693836 B2 JP H0693836B2
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、土壌から分離された新規微生物に関する。さ
らに詳細には、本発明は、ヘパリン及びヘパリチンを分
解する能力を有し、菌体外にヘパリナーゼを生産するバ
チルス属に属する新規微生物に関する。さらに、本発明
は、新規な菌体外ヘパリナーゼ及びその製法に関する。
らに詳細には、本発明は、ヘパリン及びヘパリチンを分
解する能力を有し、菌体外にヘパリナーゼを生産するバ
チルス属に属する新規微生物に関する。さらに、本発明
は、新規な菌体外ヘパリナーゼ及びその製法に関する。
ヘパリナーゼは、ヘパリン、つまり、主要繰返し単位と
して、−４）−２−デオキシ−２−スルファミノ−α−
グルコピラノース−６−スルフェート−（１−４）−α
−Ｌ−イドピアノシルウロン酸−２−硫酸−（１− を有する硫酸化ムコ多糖のある種のグリコシド結合を切
断する酵素である。該酵素活性による生産物はヘパリン
の鎖の短くなった断片である。
して、−４）−２−デオキシ−２−スルファミノ−α−
グルコピラノース−６−スルフェート−（１−４）−α
−Ｌ−イドピアノシルウロン酸−２−硫酸−（１− を有する硫酸化ムコ多糖のある種のグリコシド結合を切
断する酵素である。該酵素活性による生産物はヘパリン
の鎖の短くなった断片である。
ヘパリナーゼはヘパリチン（ヘパリンモノスルフェート
又はヘパリンスルフェートとして知られている）、つま
りヘパリンに似類の構造を有する硫酸化ムコ多糖を切断
し、ヘパリチンの鎖が短くなった断片を生成するもので
ある。
又はヘパリンスルフェートとして知られている）、つま
りヘパリンに似類の構造を有する硫酸化ムコ多糖を切断
し、ヘパリチンの鎖が短くなった断片を生成するもので
ある。
基質であるヘパリンは抗凝血剤として広く使用されてい
るので、ヘパリナーゼはヘパリンの構造研究、血液凝固
メカニズムの研究及び体組織と体液中のヘパリンの検出
のためのバイオアッセイと多様な用途がある。
るので、ヘパリナーゼはヘパリンの構造研究、血液凝固
メカニズムの研究及び体組織と体液中のヘパリンの検出
のためのバイオアッセイと多様な用途がある。
また、ヘパリナーゼは、抗トロンビン剤又は抗腫瘍剤と
して潜在的な治療上の価値がある低分子ヘパリン断片の
調製にも用いられる。
して潜在的な治療上の価値がある低分子ヘパリン断片の
調製にも用いられる。
ヘパリンを分解できる酵素は、フラボバクテリウム ヘ
パリナム，フラボバクテリウムsp., バクテロイデス
sp.,バクテロイデス ヘパリノリティカス，ペプトスト
レプトコッカス及びユーバクテリウムの培養物に見いだ
されている。これらのヘパリナーゼは、ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（第233巻 第853巻 1956年〕
（先例１〕，エクスペリエンティア〔第41巻 第1541頁
1985年〕（先例２），松本歯科大学報（日本）〔第８
巻第15頁 1982年〕（先例３），ジャーナル・オブ・ア
プライド・アンド・エンバイロメンタル マイクロバイ
オロジー〔第46巻 第1252頁（1983年）〕（先例４），
ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
〔第26巻 第1070頁（1988年）〕（先例５），ジャーナ
ル・オブ・ザ・サウス・アフリカン・ベテリナリー・ア
ソシエーション〔第53巻 第214頁（1982）〕（先例
６）に開示されている。
パリナム，フラボバクテリウムsp., バクテロイデス
sp.,バクテロイデス ヘパリノリティカス，ペプトスト
レプトコッカス及びユーバクテリウムの培養物に見いだ
されている。これらのヘパリナーゼは、ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（第233巻 第853巻 1956年〕
（先例１〕，エクスペリエンティア〔第41巻 第1541頁
1985年〕（先例２），松本歯科大学報（日本）〔第８
巻第15頁 1982年〕（先例３），ジャーナル・オブ・ア
プライド・アンド・エンバイロメンタル マイクロバイ
オロジー〔第46巻 第1252頁（1983年）〕（先例４），
ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー
〔第26巻 第1070頁（1988年）〕（先例５），ジャーナ
ル・オブ・ザ・サウス・アフリカン・ベテリナリー・ア
ソシエーション〔第53巻 第214頁（1982）〕（先例
６）に開示されている。
バチルス属の微生物によるヘパリナーゼの生産性は従来
検出されていない。
検出されていない。
これらの従来からの全てのヘパリナーゼは１以上の欠
点、たとえば、低熱安定性及び酵素の生産と回収のコス
ト高などその実際上の使用を制限する欠点があった。現
在、フラボバクテリウム ヘパリナム由来のヘパリナー
ゼだけが商業的に入手可能である。
点、たとえば、低熱安定性及び酵素の生産と回収のコス
ト高などその実際上の使用を制限する欠点があった。現
在、フラボバクテリウム ヘパリナム由来のヘパリナー
ゼだけが商業的に入手可能である。
フラボバクテリウム属又はバクテロイデス属の微生物に
より生産される従来からのヘパリナーゼは菌体に結合し
た酵素で醗酵培養液中へ放出されない。したがって、こ
れらの酵素の回収には菌体破壊が必要であり、該酵素の
精製にはかなりのコストがかかる。醗酵培養液中へ放出
される菌体外ヘパリナーゼは回収のための菌体破壊の必
要がなく低コストで酵素の回収・精製ができるので有用
である。
より生産される従来からのヘパリナーゼは菌体に結合し
た酵素で醗酵培養液中へ放出されない。したがって、こ
れらの酵素の回収には菌体破壊が必要であり、該酵素の
精製にはかなりのコストがかかる。醗酵培養液中へ放出
される菌体外ヘパリナーゼは回収のための菌体破壊の必
要がなく低コストで酵素の回収・精製ができるので有用
である。
菌体外にヘパリナーゼを創製することを目的とし、本発
明者らは菌体外に該ヘパリナーゼを生産する性質を有す
る微生物を自然界から純粋に分離することを試みた。そ
の結果、上記の好ましい性質を有するバチルス属に属す
る新規微生物を見出し、本発明を完成した。
明者らは菌体外に該ヘパリナーゼを生産する性質を有す
る微生物を自然界から純粋に分離することを試みた。そ
の結果、上記の好ましい性質を有するバチルス属に属す
る新規微生物を見出し、本発明を完成した。
本発明の目的は、ヘパリン及びヘパリチンを分解する能
力を有し、菌体外にヘパリナーゼを生産する新規微生物
を提供することにある。
力を有し、菌体外にヘパリナーゼを生産する新規微生物
を提供することにある。
本発明の他の目的は新規なヘパリナーゼ（以下、本酵素
と呼ぶ）を提供することにある。
と呼ぶ）を提供することにある。
本発明の別の目的は、本酵素の製造法を提供することに
ある。
ある。
つまり、ヘパリン及びヘパリチンを分解する能力を有
し、菌体外にヘパリナーゼを生産するバチルス属に属す
る新規微生物を提供すること及び活性至適温度45〜50℃
を有する新規ヘパリナーゼ並びに菌体外ヘパリナーゼを
産生するバチルス属に属する微生物を培養し、該ヘパリ
ナーゼを回収することを特徴とする上記新規ヘパリナー
ゼの新規な製法を提供することを意図するものである。
し、菌体外にヘパリナーゼを生産するバチルス属に属す
る新規微生物を提供すること及び活性至適温度45〜50℃
を有する新規ヘパリナーゼ並びに菌体外ヘパリナーゼを
産生するバチルス属に属する微生物を培養し、該ヘパリ
ナーゼを回収することを特徴とする上記新規ヘパリナー
ゼの新規な製法を提供することを意図するものである。
本発明により新規なヘパリナーゼを得ることができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
（１）微生物の入手 本発明者らは、土壌から、45℃で無機塩、微量のビタミ
ン及びヘパリンを主要栄養素とする液体培地中での成長
によるセレクションにより多数の微生物を分離した。培
養１週間後に微生物の成長の証拠を示す試料から、微生
物が生物学的に純粋な形で分離され、45℃で活性を有す
るヘパリナーゼの産生がテストされた。その結果、所望
のヘパリナーゼ活性を有し、その上このヘパリナーゼを
醗酵培養液中へ放出する１つの細菌の分離株が見出され
た。この新規ヘパリナーゼ生産菌株はBH100株と命名さ
れた。
ン及びヘパリンを主要栄養素とする液体培地中での成長
によるセレクションにより多数の微生物を分離した。培
養１週間後に微生物の成長の証拠を示す試料から、微生
物が生物学的に純粋な形で分離され、45℃で活性を有す
るヘパリナーゼの産生がテストされた。その結果、所望
のヘパリナーゼ活性を有し、その上このヘパリナーゼを
醗酵培養液中へ放出する１つの細菌の分離株が見出され
た。この新規ヘパリナーゼ生産菌株はBH100株と命名さ
れた。
BH100株の分類学上の特性は、バージーズ マニュアル
オブ システマチック バクテリオロジー第２巻に記
載された方法に従って調べられた。そして該株はグラム
陽性、胞子形成、桿状、通性嫌気性、運動性、カタラー
ゼ陽性で成育温度が20〜55℃であることが見つけられ、
そのことから該株はバチルス属に属する微生物であるこ
とは明らかとなった。バチルス属の公知種と比較して、
BH100株の分類学上の特性はいくつかの点でバチルス、
サーキュライスの特性と類似していると認められた。
オブ システマチック バクテリオロジー第２巻に記
載された方法に従って調べられた。そして該株はグラム
陽性、胞子形成、桿状、通性嫌気性、運動性、カタラー
ゼ陽性で成育温度が20〜55℃であることが見つけられ、
そのことから該株はバチルス属に属する微生物であるこ
とは明らかとなった。バチルス属の公知種と比較して、
BH100株の分類学上の特性はいくつかの点でバチルス、
サーキュライスの特性と類似していると認められた。
しかしながら、BH100株はバチルス サーキュランスと
は、2,3の重要な特性、もっとも顕著なのは、55℃での
成長する点、VP培地でのpHが6.0以上となる点、DNA中の
グアニン＋シトシン含量が55−58mol％である点、及び
ヘパリンとヘパリチンの分解能を有する点において相違
する。したがって、BH100株はバチルス属に属する既知
の微生物とは相違する新規微生物と判断された。
は、2,3の重要な特性、もっとも顕著なのは、55℃での
成長する点、VP培地でのpHが6.0以上となる点、DNA中の
グアニン＋シトシン含量が55−58mol％である点、及び
ヘパリンとヘパリチンの分解能を有する点において相違
する。したがって、BH100株はバチルス属に属する既知
の微生物とは相違する新規微生物と判断された。
本発明者らは、このバチルス属エスピー（Bacilluss
p.）のBH100株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託し、そして、このバチルス属エスピーに寄託番号FREM
P-10408（微工研菌寄第10408号）が与えられた。
p.）のBH100株を工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託し、そして、このバチルス属エスピーに寄託番号FREM
P-10408（微工研菌寄第10408号）が与えられた。
このBH100株の分類学的性質は次の通りである。
1.形態学的性質 グラム染色 陽 性 細胞サイズ 0.6-0.8μｍ×3-6μｍ 胞子形状 円筒形 胞子嚢の膨潤 陽 性 胞子配置 末 端 パラ胞子クリスタル 陰 性 運動性 陽 性 2.成長特性 好気的成長 陽 性 嫌気的成長 陽 性 成長温度 最高 55℃ 最低 20℃ 最適 45℃ リゾチーム（0.001％） 存在下での成長 陽 性 アジド（azide,0.02％） 存在下での成長 陰 性 NaCl存在下での成長 ２％ 陽 性 ５％ 陰 性 ７％ 陰 性 10％ 陰 性 pH6.8（栄養培地）での成長 陽 性 pH5.7（サブロー培地）での成長 陽 性 NaCl及びKClの要求性 陰 性 成長因子の要求性 な し 3.生化学的性質 カタラーゼ 陽 性 V-Pテスト 陰 性 （フォーゲス‐プロスカウェル試験） V-P培地でのpH 6.5-7.0 酸生成D-リポースから 陽 性 D-キシロースから 陽 性 L-ラムノースから 陽 性 D-ガラクトースから 陽 性 D-フルクトースから 陽 性 D-アラビノースから 陽 性 L-アラビノースから 陽 性 ラフィノースから 陽 性 D-マンノースから 陽 性 マルトースから 陽 性 シュークロースから 陽 性 ラクトースから 陽 性 D-グルコースから 陽 性 D-トレハロースから 陽 性 グリセロールから 陽 性 D-マンニトールから 陽 性 ソルビトールから 陰 性 m-エリトリトールから 陽 性 イノシトールから 陽 性 マドニトールから 陽 性 発酵炭水化物からのガス生成 陰 性 インドール生成 陰 性 ジヒドロキシアセトン生成 陰 性 結晶性デキストリン生成 陰 性 硝酸塩の還元 陰 性 クエン酸塩の資化性 陽 性 プロピオン酸塩の資化性 陰 性 チロシンの分解 陰 性 デンプンの加水分解 陰 性 カゼインの加水分解 陰 性 ヘパリンの分解 陽 性 ヘバリチンの分解 陽 性 コロンドロイチンＡの分解 陽 性 コロンドロイチンＢの分解 陽 性 コロンドロイチンＣの分解 陽 性 ヒアルロン酸の分解 陽 性 ポリガラクチュロン酸 陰 性 DNA中のグアニン＋シトシン含量 57モル％ BH100株の培養用培地としては、炭素源、窒素源及び無
機塩類を含有する通常の培地が用いられる。炭素源とし
ては、同化できるものいずれのものも用いることがで
き、たとえば、Ｄ−グルコース，マルトース,D−キシロ
ース，シュークロース，ヘパリン，クエン酸塩，コハク
酸塩，グルタミン酸塩，トリプトン又はペプトンが典型
例として例示できる。窒素源としては多種の通常の原料
が使用され、たとえば、イースト抽出物，ペプトン，肉
抽出物，コーンスティープリカー，アミノ酸溶液等、又
は、硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム等の無機窒素
源が容易に入手できるものとして例示できる。
機塩類を含有する通常の培地が用いられる。炭素源とし
ては、同化できるものいずれのものも用いることがで
き、たとえば、Ｄ−グルコース，マルトース,D−キシロ
ース，シュークロース，ヘパリン，クエン酸塩，コハク
酸塩，グルタミン酸塩，トリプトン又はペプトンが典型
例として例示できる。窒素源としては多種の通常の原料
が使用され、たとえば、イースト抽出物，ペプトン，肉
抽出物，コーンスティープリカー，アミノ酸溶液等、又
は、硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム等の無機窒素
源が容易に入手できるものとして例示できる。
さらに、上記の炭素及び窒素源に加えて、普通に使用さ
れる種々の塩類、たとえば、硫酸マグネシウム，塩化マ
グネシウム，リン酸カリウム，リン酸ナトリウム，塩化
カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。
ビタミンや他の成長因子は必須ではないがしかし、葉
酸，パントテン酸カルシウム，ビチオン，リボフラビ
ン，チアミン等を添加することも可能である。さらに、
望まれれば、アガー（寒天），ゼラチン，ゲルライト等
のゲル化剤を添加することも可能である。培地は、最終
的にpH5.5〜8.5、好適にはpH6.5〜8.0に、適当な酸又は
塩基の添加により調整される。
れる種々の塩類、たとえば、硫酸マグネシウム，塩化マ
グネシウム，リン酸カリウム，リン酸ナトリウム，塩化
カルシウム等の無機塩類を添加することも可能である。
ビタミンや他の成長因子は必須ではないがしかし、葉
酸，パントテン酸カルシウム，ビチオン，リボフラビ
ン，チアミン等を添加することも可能である。さらに、
望まれれば、アガー（寒天），ゼラチン，ゲルライト等
のゲル化剤を添加することも可能である。培地は、最終
的にpH5.5〜8.5、好適にはpH6.5〜8.0に、適当な酸又は
塩基の添加により調整される。
BH100株によるヘパリナーゼ合成は、培養培地中におけ
るヘパリンの存在により誘導される。ヘパリナーゼ生産
のために、１あたり0.05〜10g、好適には１あたり
1.0〜2.0gのヘパリンが培養培地に添加される。
るヘパリンの存在により誘導される。ヘパリナーゼ生産
のために、１あたり0.05〜10g、好適には１あたり
1.0〜2.0gのヘパリンが培養培地に添加される。
適当な培地の具体例として、１あたりにトリプトン10
g,イースト抽出物1g,K2HPO43.5g,MgCl2・6H2O2g,ヘパリ
ン1gを含有し、NaOHでpH8.0に調整された液体培地が例
示できる。
g,イースト抽出物1g,K2HPO43.5g,MgCl2・6H2O2g,ヘパリ
ン1gを含有し、NaOHでpH8.0に調整された液体培地が例
示できる。
BH100株は、好適には好気的条件下に30〜50℃で培養さ
れる。
れる。
（２）本酵素の取得法 本酵素を産生する株は、適当な培地、たとえば、上述の
１あたり0.05−10g、好適には１あたり1.0−2.0gの
インデューサーとしてヘパリンを含有する培地で培養さ
れ、12−72時間30〜50℃で好気的にインキュベートされ
た。
１あたり0.05−10g、好適には１あたり1.0−2.0gの
インデューサーとしてヘパリンを含有する培地で培養さ
れ、12−72時間30〜50℃で好気的にインキュベートされ
た。
本酵素の分離，精製は、たとえば以下のように行なわれ
る。ヘパリナーゼ活性の大部分を含有している培養液か
ら，菌体が遠心分離、マイクロフィルトレーション、又
は他の通常の方法により分離される。
る。ヘパリナーゼ活性の大部分を含有している培養液か
ら，菌体が遠心分離、マイクロフィルトレーション、又
は他の通常の方法により分離される。
この段階で、硫酸アンモニウム又はアセトンによる沈
殿、ポリエチレングリコールによる透析、又は限外濾過
などの従来方法により、粗ヘパリナーゼは濃縮される。
他の方法として、粗ヘパリナーゼ活性は、該濃縮工程な
しにさらに処理される。該ヘパリナーゼ活性物は、イオ
ン交換及びゲル濾過メディアのようなクロマトグラフィ
ーメディアにかけられ、及び／又はクロマトフォーカス
ィング、調製用等電点泳動法、電気泳動法のような、酸
素精製の分野の当業者に周知の種々の従来法により分画
され、それにより本酵素が得られる。
殿、ポリエチレングリコールによる透析、又は限外濾過
などの従来方法により、粗ヘパリナーゼは濃縮される。
他の方法として、粗ヘパリナーゼ活性は、該濃縮工程な
しにさらに処理される。該ヘパリナーゼ活性物は、イオ
ン交換及びゲル濾過メディアのようなクロマトグラフィ
ーメディアにかけられ、及び／又はクロマトフォーカス
ィング、調製用等電点泳動法、電気泳動法のような、酸
素精製の分野の当業者に周知の種々の従来法により分画
され、それにより本酵素が得られる。
本酵素の好適な取得方法は以下に例示される。バチルス
属sp.BH100株は、１あたり１〜2gの濃度でインデュー
サーとしてのヘパリンを含有する上述の適当な培地で培
養され、36〜40時間,40〜45℃で好気的にインキュベー
トされた。得られた培養物は培養物上清から菌体を除去
するために10℃ 8000×ｇで30分間遠心分離された。固
形硫酸アンモニウムが該培養液上清に飽和度70％まで加
えられ、粗ヘパリナーゼ含有沈澱を形成させるために、
溶液は５℃で３時間放置された。該沈澱は10℃ 8000×
ｇで30分間の遠心分離により回収され、pH7.8の10mMヘ
ペス（HEPES）バッファーに溶解された。粗ヘパリナー
ゼ溶液はpH7.8 10mMヘペス（HEPES）バッファーの100倍
量（２回交換）に対して５℃で24時間透析された。透析
物は10℃ 12000×ｇで30分間遠心分離され、沈澱した蛋
白質は捨てられた。粗ヘパリナーゼ溶液は、pH7.8 10mM
ヘペス（HEPES）バッファーで平衡化された。DEAE-TOYO
PEARLのカラムにかけられ、同じバッファーで溶出され
た。溶出物は一つの活性分画として回収され、この酵素
溶液は同じバッファーで平衡化されたセルロファイン−
サルフェートのカラムにかけられた。この酵素は、pH7.
8 10mMヘペス（HEPES）バッファー中０〜0.3M NaClの線
形濃度勾配で溶出された。約0.19M NaClで溶出された活
性分画が回収され、アミコンPM10膜を用いる限外濾過に
より濃縮された。このように処理された酵素溶液は、pH
7.4 50mMヘペス（HEPES）,100mM NaClのバッファーで平
衡化されたSHODEX WS-2003のカラムを用いるゲル濾過に
かけられた。このようにして得られた活性分画は合わせ
られ、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による検査により一つの蛋白質バン
ドであると示された精製ヘパリナーゼのみを含有してい
る。
属sp.BH100株は、１あたり１〜2gの濃度でインデュー
サーとしてのヘパリンを含有する上述の適当な培地で培
養され、36〜40時間,40〜45℃で好気的にインキュベー
トされた。得られた培養物は培養物上清から菌体を除去
するために10℃ 8000×ｇで30分間遠心分離された。固
形硫酸アンモニウムが該培養液上清に飽和度70％まで加
えられ、粗ヘパリナーゼ含有沈澱を形成させるために、
溶液は５℃で３時間放置された。該沈澱は10℃ 8000×
ｇで30分間の遠心分離により回収され、pH7.8の10mMヘ
ペス（HEPES）バッファーに溶解された。粗ヘパリナー
ゼ溶液はpH7.8 10mMヘペス（HEPES）バッファーの100倍
量（２回交換）に対して５℃で24時間透析された。透析
物は10℃ 12000×ｇで30分間遠心分離され、沈澱した蛋
白質は捨てられた。粗ヘパリナーゼ溶液は、pH7.8 10mM
ヘペス（HEPES）バッファーで平衡化された。DEAE-TOYO
PEARLのカラムにかけられ、同じバッファーで溶出され
た。溶出物は一つの活性分画として回収され、この酵素
溶液は同じバッファーで平衡化されたセルロファイン−
サルフェートのカラムにかけられた。この酵素は、pH7.
8 10mMヘペス（HEPES）バッファー中０〜0.3M NaClの線
形濃度勾配で溶出された。約0.19M NaClで溶出された活
性分画が回収され、アミコンPM10膜を用いる限外濾過に
より濃縮された。このように処理された酵素溶液は、pH
7.4 50mMヘペス（HEPES）,100mM NaClのバッファーで平
衡化されたSHODEX WS-2003のカラムを用いるゲル濾過に
かけられた。このようにして得られた活性分画は合わせ
られ、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法による検査により一つの蛋白質バン
ドであると示された精製ヘパリナーゼのみを含有してい
る。
（３）本酵素の特性 本方法により製造された本酵素の酵素学上の特性は以下
のとおりである。
のとおりである。
（ａ）作用 ヘパリン及びヘパリチンのエリミネーティブな切断を触
媒し、それぞれ、ヘパリンとヘパリチンの鎖の短かくな
った断片を生成する。これらは、232nmに紫外線吸収を
示す。
媒し、それぞれ、ヘパリンとヘパリチンの鎖の短かくな
った断片を生成する。これらは、232nmに紫外線吸収を
示す。
（ｂ）基質特異性 ヘパリンとヘパリチンを切断するが、コンドコイキンA,
コンドロイチンB,コンドロイチンC,ヒアルロン酸，デキ
ストラン硫酸及びポリガラクチュロン酸は切断しない。
コンドロイチンB,コンドロイチンC,ヒアルロン酸，デキ
ストラン硫酸及びポリガラクチュロン酸は切断しない。
（ｃ）最適pH及び安定なpH範囲 活性に最適なpHは、第１図に示されるように、7.2−7.8
である。30℃における24時間活性保持の条件下では、pH
7.0−8.0の範囲で安定である。
である。30℃における24時間活性保持の条件下では、pH
7.0−8.0の範囲で安定である。
（ｄ）耐熱性（熱安定性） pH7.4で5.0nMCaCl2の存在下で、45℃30分間加熱後100％
の酵素活性が残存し、45℃３時間の加熱後10％の活性が
残存した。
の酵素活性が残存し、45℃３時間の加熱後10％の活性が
残存した。
カルシウムイオンが安定性のためには必要である。
（ｅ）最適温度範囲 5.0nMCaCl2存在下で活性に最適な温度は、用いたアッセ
イ時間の長さに依存し、45℃（30分間アッセイ，（第２
図参照）又は50℃（10分間アッセイ）である。
イ時間の長さに依存し、45℃（30分間アッセイ，（第２
図参照）又は50℃（10分間アッセイ）である。
（ｆ）無機イオンの影響 2.5mMのCa2+，Mg2+又はBa2+の塩化物存在下で酵素活性
は50％増加する。最適濃度である5mMCa2+の存在下で、
活性は100％増加する。0.5mMのCo2+，Zn2+，Cu2+，Ni2+
及びPb2+の塩化物の存在下で活性はそれぞれ38％,66％,
90％,80％及び100％低下する。2.5mMのFe2+，Mn2+及びL
i2+の塩化物は、該活性に影響しない。NaClは30mM,100m
M,200mM,300mMの濃度でそれぞれ10％,44％,88％及び100
％活性を阻害する。
は50％増加する。最適濃度である5mMCa2+の存在下で、
活性は100％増加する。0.5mMのCo2+，Zn2+，Cu2+，Ni2+
及びPb2+の塩化物の存在下で活性はそれぞれ38％,66％,
90％,80％及び100％低下する。2.5mMのFe2+，Mn2+及びL
i2+の塩化物は、該活性に影響しない。NaClは30mM,100m
M,200mM,300mMの濃度でそれぞれ10％,44％,88％及び100
％活性を阻害する。
（ｇ）分子量 本酵素の分子量は、SDS（ドジシル硫酸ナトリウム）ポ
リアクリルアミド電気泳動で４〜20％の線形勾配ゲルを
用いて分子量標準蛋白質を参照した見積りによると1200
00である。
リアクリルアミド電気泳動で４〜20％の線形勾配ゲルを
用いて分子量標準蛋白質を参照した見積りによると1200
00である。
本酵素の理化学的性質を従来公知のヘパリナーゼのそれ
と比較すると第１表の通りである。
と比較すると第１表の通りである。
本酵素の活性の測定及び指示方法は以下のとおりであ
る。
る。
トルイデン・ブルー・メタクロマジー・アッセイ 本酵素液（適宜希釈）20μl,50mMヘペス（HEPES）バッ
ファー,pH7.4 80μl,及びヘパリン（ナトリウム塩）をm
lあたり100μｇ（含む溶液）20μl,を含有する反応溶液
が蒸発を防ぐため密封され、45℃で30分間保持された。
そして0.025mg/mlトリイデン ブルー溶液20μｌが添加
され、620nmにおける該溶液の吸光度が測定された。反
応混合物中の残存ヘパリン総量は、既知のヘパリン濃度
の一連の標準（試料）溶液を参照し、その吸光度から算
出された。酵素活性１単位は、45℃で時間あたり1.0mg
のヘパリンを分解するのに必要な量とされた。
ファー,pH7.4 80μl,及びヘパリン（ナトリウム塩）をm
lあたり100μｇ（含む溶液）20μl,を含有する反応溶液
が蒸発を防ぐため密封され、45℃で30分間保持された。
そして0.025mg/mlトリイデン ブルー溶液20μｌが添加
され、620nmにおける該溶液の吸光度が測定された。反
応混合物中の残存ヘパリン総量は、既知のヘパリン濃度
の一連の標準（試料）溶液を参照し、その吸光度から算
出された。酵素活性１単位は、45℃で時間あたり1.0mg
のヘパリンを分解するのに必要な量とされた。
紫外吸光アッセイ 本酵素（適宜希釈）20μl,及びpH7.4 50mMヘペス（HEPE
S）バッファーで10mg/mlヘパリンを含有するバッファー
50μｌを含有する反応混合物が45℃で30分間保持され
た。その後、pH2.0の20mM KCl-HClを2.0ml添加すること
で反応が停止され、該溶液の232nmにおける吸光度が測
定された。酵素活性の１国際単位（I.U）は、分解物の
分子吸光度係数が5100cm-1M-1であるのに基づき、45℃
で１分間あたり二重結合を１マイクロモル生成するのに
必要な酵素量とされた。
S）バッファーで10mg/mlヘパリンを含有するバッファー
50μｌを含有する反応混合物が45℃で30分間保持され
た。その後、pH2.0の20mM KCl-HClを2.0ml添加すること
で反応が停止され、該溶液の232nmにおける吸光度が測
定された。酵素活性の１国際単位（I.U）は、分解物の
分子吸光度係数が5100cm-1M-1であるのに基づき、45℃
で１分間あたり二重結合を１マイクロモル生成するのに
必要な酵素量とされた。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。但し、こ
の実施例は本発明の単なる例であって、本発明がこれに
より制限されるものでない。
の実施例は本発明の単なる例であって、本発明がこれに
より制限されるものでない。
実施例１ 新規に見出された菌株、バチルス属sp.BH100（FERM P-1
0408）は土壌から次の方法で分離された。
0408）は土壌から次の方法で分離された。
約0.1gの土壌試料が1.5mlの培地〔１あたり〕ヘパリ
ン2.0g,K2HPO40.35g,NH4Cl0.27g,MgCl2・6H2O0.2g,リジ
ン0.001g,ヒスチジン0.001g,メチオニン0.001g,クエン
酸第一鉄0.0025g,微量元素溶液0.1ml〔１あたりにZnS
O40.12g,MnSO40.5g,H3BO30.13g,CuSO40.004g,Na2MoO40.
006g,及びCoCl2・6H2O0.012gを含有〕，及びビタミン溶
液0.1ml（１あたり、葉酸及びビチオン各10mg,リボフ
ラビン25mg,チアミン25g,ニコチン酸25mg,パントテン酸
カルシウム25mg,パラアミン安息香酸25mg及びピロドキ
シン塩酸塩を含有〕に添加された。該培養液は、滅菌さ
れた24穴のマイクロタイタートレーに蒸発を最小限にお
さえるためにプラスチックラップを密封されたものに、
45℃で振とうすることなく保持された。一週間の培養
後、微生物の成長の証拠を示したこれら試料から，（ｌ
あたり）2.0gヘパリン,0.1gK2HPO4,1.0gMgCl2・6H2O，
及び8.0gゲルライトを含有する固体培地にpH8.0,45℃で
繰返し継代することにより該微生物学、生物学的に純粋
な形で分離された。
ン2.0g,K2HPO40.35g,NH4Cl0.27g,MgCl2・6H2O0.2g,リジ
ン0.001g,ヒスチジン0.001g,メチオニン0.001g,クエン
酸第一鉄0.0025g,微量元素溶液0.1ml〔１あたりにZnS
O40.12g,MnSO40.5g,H3BO30.13g,CuSO40.004g,Na2MoO40.
006g,及びCoCl2・6H2O0.012gを含有〕，及びビタミン溶
液0.1ml（１あたり、葉酸及びビチオン各10mg,リボフ
ラビン25mg,チアミン25g,ニコチン酸25mg,パントテン酸
カルシウム25mg,パラアミン安息香酸25mg及びピロドキ
シン塩酸塩を含有〕に添加された。該培養液は、滅菌さ
れた24穴のマイクロタイタートレーに蒸発を最小限にお
さえるためにプラスチックラップを密封されたものに、
45℃で振とうすることなく保持された。一週間の培養
後、微生物の成長の証拠を示したこれら試料から，（ｌ
あたり）2.0gヘパリン,0.1gK2HPO4,1.0gMgCl2・6H2O，
及び8.0gゲルライトを含有する固体培地にpH8.0,45℃で
繰返し継代することにより該微生物学、生物学的に純粋
な形で分離された。
実施例２ 実施例１に示されるようにして得られた生物学的に純粋
な分離株は、（１あたり）14gトリプトン,1.0g酵母抽
出物,3.5gK2HPO4,2gMgCl2，及び1.0gヘパリンを含有
し、NaOHでpH8.0に調節された液体培地20mlで該菌株を
培養することにより、ヘパリナーゼ活性の生産性がテス
トされた。該培養物は45℃で65rpmで回転振とうしイン
キューベートされた。72時間の培養後、菌体は20分間80
00×ｇの遠心分離により回収され、上清はトルイデン
ブルー メタクロマジー アッセイにより残存ヘパリン
が測定された。バチルスspBH100株（FERM P−10408）を
含有する培養物では該培養物上清に残存するヘパリン量
はmlあたりゼロmgと定量された。ヘパリナーゼ活性は45
℃でトルイデン ブルー メタクロマジー アッセイに
より定量され、該培養物上清はmlあたり0.074単位ヘパ
リナーゼを含有すると認められた。
な分離株は、（１あたり）14gトリプトン,1.0g酵母抽
出物,3.5gK2HPO4,2gMgCl2，及び1.0gヘパリンを含有
し、NaOHでpH8.0に調節された液体培地20mlで該菌株を
培養することにより、ヘパリナーゼ活性の生産性がテス
トされた。該培養物は45℃で65rpmで回転振とうしイン
キューベートされた。72時間の培養後、菌体は20分間80
00×ｇの遠心分離により回収され、上清はトルイデン
ブルー メタクロマジー アッセイにより残存ヘパリン
が測定された。バチルスspBH100株（FERM P−10408）を
含有する培養物では該培養物上清に残存するヘパリン量
はmlあたりゼロmgと定量された。ヘパリナーゼ活性は45
℃でトルイデン ブルー メタクロマジー アッセイに
より定量され、該培養物上清はmlあたり0.074単位ヘパ
リナーゼを含有すると認められた。
実施例３ バチルス属sp.BH100株は、１あたりに、ペルス（HEPE
S）緩衝液7.0g,イースト抽出物2.0g,K2HPO40.5g,MgCl
21.0g,ヘパリン1.0g及び以下に示される炭素源10gを含
有し、NaOHでpH8.0に調整された液体培地20ml中で培養
された。該培養物は、64rpmで回転振とうさせつつ45℃
でインキュベートされた。培養40時間,64時間及び72時
間後に各培養物から1.0mlの試料が取り出され、菌体は
遠心分離により集められ、培養物上清は、実施例２に示
されたようなトルイデン ブルー メタクロマジー ア
ッセイによりヘパリナーゼ活性がステト（定量）され
た。結果を第２表に示す。
S）緩衝液7.0g,イースト抽出物2.0g,K2HPO40.5g,MgCl
21.0g,ヘパリン1.0g及び以下に示される炭素源10gを含
有し、NaOHでpH8.0に調整された液体培地20ml中で培養
された。該培養物は、64rpmで回転振とうさせつつ45℃
でインキュベートされた。培養40時間,64時間及び72時
間後に各培養物から1.0mlの試料が取り出され、菌体は
遠心分離により集められ、培養物上清は、実施例２に示
されたようなトルイデン ブルー メタクロマジー ア
ッセイによりヘパリナーゼ活性がステト（定量）され
た。結果を第２表に示す。
実施例４ バチルス属sp.BH100株（FERM P−10408）によりヘパリ
ナーゼ合成の誘導は以下のようにして調べられた。BH10
0株は、（１あたり）10g トリプトン,1.0g酵母抽出
物,3,5gK2HPO4,2.0gMgCl2・6H2O及びそれぞれ１あた
り1gのコンドロイチンA,コンドロイチンB,コンドロイチ
ンC,ヒアルロン酸，ポリガラクチュロン酸，硫酸デキス
トラン，グルコサミン又はグルクロン酸，又は下に示さ
れる濃度のヘパリンを含有する液体培地20mlに培養され
た。培養物は、65rpmの回転振とうしつつ45℃でインキ
ュベートされた。培養36時間後、菌体は遠心分離により
除去され、培養物上清が以下のように更に処理された。
固定硫酸アンモニウムが70％飽和度まで添加され、該溶
液は沈澱生成のために５℃で３時間保持された。該沈澱
は10℃で30分間8000×ｇの遠心分離により回収され、pH
7.4の20mMヘペス（HEPES）バッファー2.0mlに溶解され
た。この溶液は、pH7.4 20mMヘペス（HEPES）バッファ
ー4lに対して４℃で16時間透析され、そして紫外線吸収
アッセイ法を用いて45℃でヘパリナーゼ活性が定量され
た。結果は第３表に要約されている。
ナーゼ合成の誘導は以下のようにして調べられた。BH10
0株は、（１あたり）10g トリプトン,1.0g酵母抽出
物,3,5gK2HPO4,2.0gMgCl2・6H2O及びそれぞれ１あた
り1gのコンドロイチンA,コンドロイチンB,コンドロイチ
ンC,ヒアルロン酸，ポリガラクチュロン酸，硫酸デキス
トラン，グルコサミン又はグルクロン酸，又は下に示さ
れる濃度のヘパリンを含有する液体培地20mlに培養され
た。培養物は、65rpmの回転振とうしつつ45℃でインキ
ュベートされた。培養36時間後、菌体は遠心分離により
除去され、培養物上清が以下のように更に処理された。
固定硫酸アンモニウムが70％飽和度まで添加され、該溶
液は沈澱生成のために５℃で３時間保持された。該沈澱
は10℃で30分間8000×ｇの遠心分離により回収され、pH
7.4の20mMヘペス（HEPES）バッファー2.0mlに溶解され
た。この溶液は、pH7.4 20mMヘペス（HEPES）バッファ
ー4lに対して４℃で16時間透析され、そして紫外線吸収
アッセイ法を用いて45℃でヘパリナーゼ活性が定量され
た。結果は第３表に要約されている。
上記データに示されるようにバチルス属sp.BH100株によ
るヘパリナーゼ合成は、培地中のヘパリンの存在により
誘導される。該酵素の生産はコンドロイチンA,B,又はC,
ヒアルロン酸，ポリガラクチュロン酸，硫酸デキストラ
ン，グルコサミン，又はグルクロン酸の存在によっては
誘導されない。
るヘパリナーゼ合成は、培地中のヘパリンの存在により
誘導される。該酵素の生産はコンドロイチンA,B,又はC,
ヒアルロン酸，ポリガラクチュロン酸，硫酸デキストラ
ン，グルコサミン，又はグルクロン酸の存在によっては
誘導されない。
実施例５ ヘパリナーゼの精製法は以下に示される。
バチルス属sp.BH100株（FERM P−10408）は、（ｌあた
り）10gトリプトン,1.0g酵母抽出物,3.5gK2HPO4,2.0gMg
Cl2・6H2O及び2.0gヘパリンを含有し、NaOHでpH7.4に調
節された液体培地6l中に５％接種物から培養され、40℃
36時間、好気的にインキュベートされた。得られた培養
物は培養物上清から菌体を除去するために10℃で30分間
8000×ｇで遠心分離された。全ヘパリナーゼ活性の14％
と見積もられた活性は菌体に結合したもので捨てられ
た。固体硫酸アンモニウム（2652g）が70％飽和度に達
するように、該培養物上清に添加され、該溶液は、粗ヘ
パリナーゼを含有する沈澱を形成するように、５℃で３
時間放置された。該沈澱は10℃で8000×g30分間の遠心
分離により回収され、pH7.8 10mMヘペス（HEPES）バッ
ファー50mlに溶解された。該粗ヘパリナーゼ溶液はpH7.
8 10mMヘペス（HEPES）バッファー10l（5lを２回交換）
に対して５℃で24時間透析された。透析物は10℃で1200
0×g30分間遠心分離され、沈澱蛋白質は捨てられた。そ
の後の精製は室温、つまりおよそ22℃で行なわれた。ヘ
パリナーゼ活性は各工程で紫外線吸収アッセイを用いて
モニターされた。粗ヘパリナーゼ溶液はpH7.8 10mMヘペ
ス（HEPES）バッファーで平衡化されたDEAE-TOYPEARLの
カラムにかけられ、同じバッファーで溶出された。溶出
物は一つの活性分画として回収され、この酵素溶液は同
じバイファーで平衡化されたCELLVOFINE-SULFATEのカラ
ムにかけられた。該酵素はpH7.8 10mMヘペス（HEPES）
バッファー中０−0.3M NaClの線形濃度勾配により溶出
された。約0.19M NaClで溶出した活性分画は回収され、
アミコン（Amicon）PM10膜を用いる限外濾過により濃縮
された。このように処理された酵素溶液は、pH7.4 50mM
ヘペス（HEPES）バッファーで100mMNaClを含有するバッ
ファーで平衡化されたSHODEXWS-2003のカラムを用いて
ゲル濾過された。このようにして得られた活性分画は合
わせられ、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリ
ルアミド電気泳動法により調べられたところ一つの蛋白
質バンドとして示された精製ヘパリナーゼのみを含有す
るものと認められた。精製の結果は以下に要約されてい
た。
り）10gトリプトン,1.0g酵母抽出物,3.5gK2HPO4,2.0gMg
Cl2・6H2O及び2.0gヘパリンを含有し、NaOHでpH7.4に調
節された液体培地6l中に５％接種物から培養され、40℃
36時間、好気的にインキュベートされた。得られた培養
物は培養物上清から菌体を除去するために10℃で30分間
8000×ｇで遠心分離された。全ヘパリナーゼ活性の14％
と見積もられた活性は菌体に結合したもので捨てられ
た。固体硫酸アンモニウム（2652g）が70％飽和度に達
するように、該培養物上清に添加され、該溶液は、粗ヘ
パリナーゼを含有する沈澱を形成するように、５℃で３
時間放置された。該沈澱は10℃で8000×g30分間の遠心
分離により回収され、pH7.8 10mMヘペス（HEPES）バッ
ファー50mlに溶解された。該粗ヘパリナーゼ溶液はpH7.
8 10mMヘペス（HEPES）バッファー10l（5lを２回交換）
に対して５℃で24時間透析された。透析物は10℃で1200
0×g30分間遠心分離され、沈澱蛋白質は捨てられた。そ
の後の精製は室温、つまりおよそ22℃で行なわれた。ヘ
パリナーゼ活性は各工程で紫外線吸収アッセイを用いて
モニターされた。粗ヘパリナーゼ溶液はpH7.8 10mMヘペ
ス（HEPES）バッファーで平衡化されたDEAE-TOYPEARLの
カラムにかけられ、同じバッファーで溶出された。溶出
物は一つの活性分画として回収され、この酵素溶液は同
じバイファーで平衡化されたCELLVOFINE-SULFATEのカラ
ムにかけられた。該酵素はpH7.8 10mMヘペス（HEPES）
バッファー中０−0.3M NaClの線形濃度勾配により溶出
された。約0.19M NaClで溶出した活性分画は回収され、
アミコン（Amicon）PM10膜を用いる限外濾過により濃縮
された。このように処理された酵素溶液は、pH7.4 50mM
ヘペス（HEPES）バッファーで100mMNaClを含有するバッ
ファーで平衡化されたSHODEXWS-2003のカラムを用いて
ゲル濾過された。このようにして得られた活性分画は合
わせられ、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリ
ルアミド電気泳動法により調べられたところ一つの蛋白
質バンドとして示された精製ヘパリナーゼのみを含有す
るものと認められた。精製の結果は以下に要約されてい
た。
第１図は本酵素活性に対するpHの影響を示す図であり、
第２図は本酵素活性に対する温度の影響を示す図であ
る。
第２図は本酵素活性に対する温度の影響を示す図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (3)
- 【請求項１】次の理化学的性質を有するヘパリナーゼ （１）基質特異性 ：ヘパリン及びヘパリチンを切断す るが、コンドコイキンA,コンドロ イチンB,コンドロイチンC,ヒア ルロン酸，デキストラン硫酸及びポ リガラクチュロン酸は切断しない （２）最適pH範囲 :pH7.2〜7.8 （３）安定なpH範囲:pH7.0〜8.0 （４）最適温度範囲:45〜50℃ （５）活性化 ：Ca2+
- 【請求項２】バチルス属に属する請求項１記載のヘパリ
ナーゼ生産菌を培地に培養し、菌体外に該ヘパリナーゼ
を蓄積せしめ、次いで該ヘパリナーゼを培養液から回収
することを特徴とする前記ヘパリナーゼの製造法。 - 【請求項３】ヘパリン及びヘパリチンを分解する能力を
有し、ヘパリナーゼを菌体外に生産するバチルス属sp.B
H100（FERM P−10408）。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63297807A JPH0693836B2 (ja) | 1988-11-25 | 1988-11-25 | バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法 |
| EP89810894A EP0370958B1 (en) | 1988-11-25 | 1989-11-22 | Heparinase-producing microorganism belonging to the genus Bacillus, new heparinase and process for producing same |
| DE198989810894T DE370958T1 (de) | 1988-11-25 | 1989-11-22 | Heparinase produzierender mikroorganismus des stammes bacillus, neue heparinase und verfahren zu ihrer herstellung. |
| US07/440,061 US5145778A (en) | 1988-11-25 | 1989-11-22 | Heparinase produced by microorganism belonging to the genus bacillus |
| AT89810894T ATE108826T1 (de) | 1988-11-25 | 1989-11-22 | Heparinase produzierender mikroorganismus des stammes bacillus, neue heparinase und verfahren zu ihrer herstellung. |
| DE68916915T DE68916915T2 (de) | 1988-11-25 | 1989-11-22 | Heparinase produzierender Mikroorganismus des Stammes Bacillus, neue Heparinase und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
| US07/799,597 US5362645A (en) | 1988-11-25 | 1991-11-27 | Heparinase-producing microorganism belonging to the genus bacillus |
| US08/285,383 US5455162A (en) | 1988-11-25 | 1994-08-03 | Process for producing heparinase with a bacilius strain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63297807A JPH0693836B2 (ja) | 1988-11-25 | 1988-11-25 | バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02142470A JPH02142470A (ja) | 1990-05-31 |
| JPH0693836B2 true JPH0693836B2 (ja) | 1994-11-24 |
Family
ID=17851424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63297807A Expired - Lifetime JPH0693836B2 (ja) | 1988-11-25 | 1988-11-25 | バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5145778A (ja) |
| EP (1) | EP0370958B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0693836B2 (ja) |
| AT (1) | ATE108826T1 (ja) |
| DE (2) | DE370958T1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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