CN104593347B - 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用 - Google Patents

来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104593347B
CN104593347B CN201410839278.8A CN201410839278A CN104593347B CN 104593347 B CN104593347 B CN 104593347B CN 201410839278 A CN201410839278 A CN 201410839278A CN 104593347 B CN104593347 B CN 104593347B
Authority
CN
China
Prior art keywords
heparinase
sdhep
columns
tris
buffer solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410839278.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104593347A (zh
Inventor
白佳珂
张紫恒
曲海薇
马小来
李锂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd filed Critical Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority to CN201410839278.8A priority Critical patent/CN104593347B/zh
Publication of CN104593347A publication Critical patent/CN104593347A/zh
Priority to PCT/CN2015/079704 priority patent/WO2016138700A1/zh
Priority to EP15883757.5A priority patent/EP3266868B1/en
Priority to PL15883757T priority patent/PL3266868T3/pl
Priority to US15/555,040 priority patent/US10214735B2/en
Priority to JP2017563374A priority patent/JP6561143B2/ja
Priority to DK15883757.5T priority patent/DK3266868T3/da
Priority to ES15883757T priority patent/ES2820048T3/es
Application granted granted Critical
Publication of CN104593347B publication Critical patent/CN104593347B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02007—Heparin lyase (4.2.2.7), i.e. heparinase I
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了从Sphingobacterium daejeonense细菌中得到的新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ，为未经过报道的新型肝素酶。酶的获得是通过将筛选得到的细菌发酵培养、粗酶提取、多步柱层析等步骤最终得到。性质研究表明这两种酶在酶解肝素方面具有特异性，有望用于低分子肝素制备或肝素类质量检测方面。

Description

来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和 应用
技术领域
本发明涉及前未报道过的新型肝素酶，具体而言是涉及来源于Sphingobacterium daejeonense细菌，经过细菌发酵、细胞破碎、多步柱层析分离技术制备出来的两种新型肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ），以及这两种酶的制备方法及其在肝素和低分子肝素质量检测方面的应用。
背景技术
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，其应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、制备低分子肝素、用于肝素结构的研究和质量检测等。肝素酶最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后又陆续在一些微生物和动物组织中也发现了肝素酶的存在。目前有学术论文报道的肝素酶有10多种，例如Yang V.C.从肝素黄杆菌中发现肝素酶I、II、III，Robert W. Bellamy等人从杆菌属BH100(FERM BP-2613)细菌中发现的产生于胞外的肝素酶，Wan-Seok Kim等人从粪便拟杆菌HJ-15中发现一种肝素裂解酶[Carbohydrate Research,2012,359:37-43]。
目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，他们分别是分子量大约为43、78、66kDa的单体蛋白质，等电点均在9.0左右。肝素酶的发现为肝素结构研究和质量检测起了重要的推动作用，其中产自肝素黄杆菌的酶I、II、III已经用于肝素类质量检测和低分子肝素生产。
本发明所阐述的肝素酶为未经报道过的新型肝素酶，其理化性质不同于目前已知肝素酶，且酶解肝素时酶切位点选择性强，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明给出了从细菌Sphingobacterium daejeonense中纯化出的两种新型胞内肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ。其中，SDhepⅠ的分子量为74692 Da，以HS为底物时的米氏常数为0.0418，等电点为5.64，SDhepⅡ的分子量为94716Da，以HEP为底物时的米氏常数为0.0052，等电点为5.76，这两种肝素酶为目前未经报道的新型肝素酶。
本发明还包括以下内容：
1. 菌种来源：从中国湖北省云梦县城关镇城西的农田土样中分离得到一株菌种（编号Z4-2），使用含肝素的培养基培养时能产生肝素酶。将该菌种培养在斜面培养基上，-70℃保藏。经广东省微生物分析检测中心鉴定，该菌种为一种鞘氨醇杆菌Sphingobacterium daejeonense。这种细菌曾于2006年被报道[Int J Syst EvolMicrobiol. ,2006, 56(Pt 9):2031-6.]，目前没有产肝素酶的相关报道。
2. 肝素酶的制备：（1） Sphingobacterium daejeonense菌株的发酵及粗酶液制备：
将菌体从平板或斜面上刮取两环接种到种子培养基中，培养1-2天后，按5-20%接种量接入二级液体种子培养基中，培养1-2天，再按5-20%接种量接入2L发酵培养基中，培养1-5天。收集菌液10000rpm，4℃离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机4℃，800bar，破碎1-5个循环，离心30min，收取上清，冰浴条件下做硫酸铵沉淀，收取硫酸铵饱和度35%-85%的沉淀。将沉淀溶解于100ml的Tris-HCl缓冲液中，于相同的缓冲液中透析过夜。
（2）Q柱粗酶的粗分离：将步骤（1）中的酶液上样于一根Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，用试管收集上样流出液和平衡液，检测各管肝素酶活性，收集合并有活性的部分，为不与Q柱结合的肝素酶。同样收集洗脱液中有肝素酶活性的各管，合并透析，为与Q柱结合的肝素酶。
（3）SDhepⅠ酶的纯化：将步骤（2）中得到的不与Q柱结合的肝素酶上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后再以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，收集各具有肝素酶活性的组分，透析。透析后酶液上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡，然后以Tris-HCl缓冲液中氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，收集各活性组分,以截留分子量30kD的超滤离心管浓缩至0.2ml。浓缩的酶液上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的Sephadex G-100柱，以同样缓冲液洗脱，收集各组分，合并，浓缩。
（4）SDhepⅡ酶的纯化：将步骤（2）中得到的与Q柱结合的肝素酶上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中氯化钠0.1-0.6M线性梯度洗脱，检测洗脱液中具有肝素酶活性的组分，收集合并，透析。酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，以含0.08M氯化钠的同样缓冲液洗脱，检测并收集有活性组分。上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中0-1M氯化钠线性梯度洗脱，收集活性组分，合并，浓缩。
步骤(1)、(2)、(3)、(4)中所述的Tris-HCl缓冲液为含CaCl2的Tris-HCl, pH6.5-8.0，Tris-HCl优选的浓度为10-50mM，最优选的浓度为25mM；CaCl2的含量优选1-50mM，最优选10 mM；优选的pH范围为7.0-7.5，更优选7.0。
步骤(2)、(3)、(4)中所述的Q柱为Q-Sepharose Fast Flow，也可为Q-SepharoseBig Beads、Q-Sepharose XL、Q-Sepharose High Performance等强阴离子交换柱。
步骤(3)、(4)中所述的CS柱为Cellufine Sulfate，也可为结合了肝素的CNBr-activated Sepharose CL-4B等可与肝素酶结合的亲和柱。
步骤(3)中所述的SP柱为SP-Sepharose Fast Flow，也可为其它强阳离子交换柱。
步骤(3)中所述的Sephadex G-100柱，也可以是适合于蛋白质10-100KDa分离纯化的其它规格的凝胶柱。
过程中肝素酶、硫酸乙酰肝素酶活性测定参考专利“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的制备方法”（专利申请号201110241260.4）。蛋白质含量测定及酶纯度测定方法参考文献[Carbohydrate Research,2012,359:37-43]。
步骤（1）所述的种子培养基组成参考专利“一种肝素黄杆菌肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的制备方法”（专利申请号201110241260.4）。
步骤（1）中所述的发酵培养基组成（g/L）为：胰蛋白胨 2， 肝素 8， NaCl 5，(NH4)2SO4 1，KH2PO4 2.5，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.0。
3. 肝素酶的性质：（1）本发明所涉及的肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ分别用SDS-PAGE测定分子量约为74700Da和94700Da。用MALDI-TOF-MS质谱法测定其确切分子量，SDhepⅠ为74692Da，SDhepⅡ为94716Da。
（2）本发明所涉及的肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ分别用等电点聚焦电泳测定其等电点5.64和5.76。
（3）本发明所涉及的肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ，以HEP和HS为底物，最佳反应pH均为8.0。
（4）本发明所涉及的肝素酶SDhepⅠ以HEP和HS为底物的最佳反应温度分别为47和45℃；SDhepⅡ以HEP和HS为底物的最佳反应温度均为43℃。
（5）对本发明所涉及的肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ，K+、Mg2+、Na+、Mn2+和Ca2+均显示促进酶活的作用，其中Ca2+的作用最强，而Cu2+、Fe2+和Fe3+具有抑制酶活的作用。
本发明提供了两种来源于Sphingobacterium daejeonense的肝素酶，通过细菌发酵、细胞破碎、硫酸铵沉淀和多步柱层析分离纯化而来。所述两种肝素酶SDhepⅠ和SDhepⅡ的理化性质，包括分子量、等电点均不同于目前已知的其它肝素酶，这两种肝素酶对HEP和HS酶解，得到的双糖组成具有特异性，该酶可以用来对肝素及其类似物的结构进行分析，可以用于肝素质量的检测，以及制备低分子肝素。
附图说明
图1. SDhepⅠ和SDhepⅡ酶的SDS-PAGE图。
图2. SDhepⅠ酶解HEP产物组分SAX-HPLC液相分析图。
图3. SDhepⅡ酶解HEP产物组分SAX-HPLC液相分析图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：SDhepⅠ的制备
a) Sphingobacterium daejeonense菌株的发酵及粗酶液制备：将菌种从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，30℃，150rpm，培养12小时，然后按10%接种量接入200ml的二级液体种子培养基中，30℃，150rpm，培养24小时，然后按10%接种量接入2L发酵培养基中，30℃，150rpm，培养24小时。取1L菌液10000rpm，4℃离心30min，收集沉淀，悬浮在100ml的25mM Tris-HCl(含10mM CaCl2, pH7.0)的缓冲液中，用高压均质机4℃，800bar，破碎三个循环，然后4℃，10000rpm,离心30min，上清即为粗酶液。做硫酸铵沉淀，收集硫酸铵饱和度为35%-85%的沉淀，将沉淀溶解于100ml的Tris-HCl缓冲液中，于相同的缓冲液中透析过夜。
b）Q柱分离：将步骤a）中的酶液上样于一根用25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2,pH7.0）缓冲液平衡过的规格为2.5×30cm的Q柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积。检测上样流出液和平衡流出液中的肝素酶活性，收集有活性的组分，合并。
c）CS柱纯化：将步骤b）收集的上样流出液和平衡液，上样于用25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的规格为2.5×30cm的CS柱，再以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后在缓冲液加入氯化钠0-1M线性梯度洗脱，收集各活性组分，用2L体积的25mMTris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液过夜透析。
d) SP柱纯化：将步骤c)中透析过的酶液上样于用25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2,pH7.0）缓冲液平衡过的规格为2.5×30cm的SP柱，再以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后在缓冲液加入氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，收集各活性组分，用30KD的超滤离心管超滤浓缩至200µL。
e) Sephadex G100柱纯化：将步骤d）中浓缩后的样品上样至用25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的规格为1.0×100cm的Sephadex G-100柱，再以相同缓冲液洗脱，以蠕动泵控制流速约2ml/h，收集各组分，每管体积1ml，测定各组分活性，将有酶活组分收集，用30KD的超滤离心管超滤浓缩至200µL，置于1.5ml的EP管中，加300µl的25mMTris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）的缓冲液，再加入500µl甘油，定容至1ml。纯化流程各步骤所得酶活和蛋白含量如下表所示:
表1. SDhepⅠ纯化各步骤酶活和蛋白含量
实施例2：SDhepⅠ的性质研究
经SDS-PAGE测定，结果如图1所示，SDhepⅠ分子量大约是74700Da，经MALDI-TOF-MS质谱测定分析其确切分子量为74692Da。
经等电点聚焦电泳测定，SDhepⅠ的等电点是5.64。
以不同的底物浓度测定各条件下酶反应的初速度，以求得米氏常数，经测定，以HEP和HS为底物时SDhepⅠ的米氏常数分别为0.5738和0.0418。
肝素酶SDhepⅠ分别以HEP和HS为底物，将底物pH分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0九个梯度，测定上述底物中酶的活性，结果显示，在以HEP为底物时具有活性的pH范围是6.5-9.5，最优的pH为8.0，以HS为底物时，具有活性的pH范围是5.5-9.0，最优的pH为8.0。
肝素酶SDhepⅠ分别以HEP和HS为底物，将底物温度分别设置为25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49℃几个梯度，测定上述底物中酶的活性，结果显示，在以HEP为底物时最优的温度条件是47℃，以HS为底物时最优的温度为45℃。
金属离子种类对SDhepⅠ的影响：分别以25mM Tris-HCl（pH7.0）为缓冲液，考察了在底物HEP和HS中分别添加10mM的Mg2+、Mn2+和Ca2+、Na+、 K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+等金属离子对肝素酶SDhepⅠ的影响，以不添加任何金属离子为空白对照组，所得结果显示，在添加金属离子的情况下，K+、Mg2+、Na+、Mn2+和Ca2+均显示了促进酶活的作用，其中Ca2+的促进作用最强，酶活大幅度提高，其次Mg2+和Na+也具有明显的促进作用，而Cu2+、Fe2+和Fe3+具有抑制酶活的作用，使酶失活。
金属离子浓度对SDhepⅠ的影响：考察了分别以HEP和HS为底物时，具有促进作用的Mg2+、Na+和Ca2+在0、1、10、50、100、500和1000mM的浓度下对酶活性的影响，结果显示在以HEP和HS为底物时，Mg2+对SDhepⅠ的活性促进作用最强的均为100mM。在以HEP为底物时，Na+对SDhepⅠ的活性促进作用最强的是500mM。以HS为底物时，Na+对SDhepⅠ的活性促进作用最强的则是50mM。以HEP和HS为底物时，Ca2+对SDhepⅠ促进作用最强的均为100mM。
变性剂对SDhepⅠ的影响：分别考察了H2O2、乙腈、SDS、盐酸胍和尿素作为变性剂，并将各自的浓度分别设置为1mM和10mM的H2O2、1%和10%的乙腈、1%的SDS、1M的盐酸胍以及1M的尿素，并设置不添加任何变性剂的空白对照组，以此考察变性剂对肝素酶活性的影响。在上述变性剂存在的条件下，1%和10%的乙腈、1M尿素对SDhepⅠ酶的影响较小，而1mM 和10 mM的H2O2、1%SDS、1M盐酸胍对SDhepⅠ的影响较大，有显著的抑制作用。
实施例3：SDhepⅠ酶解HEP的产物特异性研究
a) SDhepⅠ底物特异性研究：分别以肝素（HEP）、硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸软骨素（CS）、硫酸皮肤素（DS）为底物，测定SDhepⅠ的活性，发现SDhepⅠ酶在以CS和DS为底物时没有酶活，在以HEP和HS为底物时有酶活，且活性比约为HEP：HS=1:1.3。
b) SDhepⅠ酶解HEP双糖组成：在50mg的肝素中加入3IU（以肝素为底物的酶活）的SDhepⅠ，用缓冲液25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）定容至500µL，37℃条件下酶解24h，然后置于100℃水浴中，灭活5min，样品进行二糖组分液相分析，结果如图2所示，SDhepⅠ酶解HEP后，产物主要组分为IVA、IVS、IIA、IIS和IS，其中以IIA和IIS为主，分别占15.35%和12.2%，IS的峰面积只占5.29%，除了上述几种二糖外，还有较多种类的四糖组分。
实施例4：SDhepⅡ的制备
a) 菌株的发酵及粗酶液制备同于实施例1。
b) Q柱粗酶分离步骤同于实施例1，在缓冲液平衡3个柱体积后，在该缓冲液中加入氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，收集洗脱液活性组分，过夜透析。
c) CS柱纯化：将步骤b）中透析过的酶液，上样于用25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2,pH7.0）缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后在缓冲液加入氯化钠0-1M线性梯度洗脱，收集各活性组分，用2L体积的25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液过夜透析。
d) Q柱再纯化：将步骤c)中透析过的酶液上样于用25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2,pH7.0）缓冲液平衡过的Q柱，然后在同样缓冲液中加入0.080M氯化钠，洗脱800ml，收集有活性组分。
e) CS柱再纯化：将步骤d)中收集到的有酶活的组分中加入等体积的缓冲液，上样于用25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后在缓冲液加入氯化钠0-1M线性梯度洗脱，收集各活性组分，将有活性组分做SDS-PAGE，将电泳单条带的有酶活组分收集，用用30KD的超滤离心管超滤浓缩至200µL，取出置于1.5ml的EP管中，加300µl的25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）的缓冲液，再加入500µl甘油，定容至1ml。纯化流程各步骤所得酶活和蛋白含量如下表所示:
表2. SDhepⅡ纯化各步骤酶活和蛋白含量
实施例5：SDhepⅡ的性质研究
经SDS-PAGE测定，结果如图1所示，SDhepⅡ分子量大约是94700Da，经MALDI-TOF-MS质谱测定分析其确切分子量为94716Da。
经等电点聚焦电泳测定，SDhepⅡ的等电点是5.76。
以不同的底物浓度测定各条件下酶反应的初速度，以求得米氏常数，经测定，以HEP和HS为底物时SDhepⅡ的米氏常数分别为0.0052和1.6618。
肝素酶SDhepⅡ分别以HEP和HS为底物，将底物pH分别设置为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0九个梯度，测定上述底物中酶的活性，结果显示，在以HEP为底物时具有活性的pH范围是6.5-9.0，最优的pH为8.0，以HS为底物时，具有活性的pH范围是6.5-9.0，最优的pH为8.0。
肝素酶SDhepⅡ分别以HEP和HS为底物，将底物温度分别设置为25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49℃几个梯度，测定上述底物中酶的活性，结果显示，在以HEP为底物时最优的温度条件是47℃，以HS为底物时，最优的温度为43℃。
金属离子种类对SDhepⅡ的影响：分别以25mM Tris-HCl（pH7.0）为缓冲液，考察了在底物HEP和HS中分别添加10mM的Mg2+、Mn2+和Ca2+、Na+、 K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+等金属离子对酶的影响，以不添加任何金属离子为空白对照组，所得结果显示，在添加金属离子的情况下，K+、Mg2+、Na+、Mn2+和Ca2+均显示了促进酶活的作用，其中Ca2+的促进作用最强，酶活大幅度提高，其次Mg2+和Na+也具有明显的促进作用，而Cu2+、Fe2+和Fe3+具有抑制酶活的作用，使酶失活。
金属离子浓度对SDhepⅡ的影响：考察了对酶具有促进作用的Mg2+、Na+和Ca2+在0、1、10、50、100、500和1000mM的浓度下肝素酶活性的影响，结果显示在以HEP和HS为底物时，Mg2+对SDhepⅡ的活性促进作用最强的是均为100mM。在以HEP和HS为底物时，Na+对SDhepⅡ的活性促进作用最强的分别是100mM和50mM。Ca2+对SDhepⅡ的活性促进作用最强的分别是100mM和50mM。
变性剂对SDhepⅡ的影响：分别考察了H2O2、乙腈、SDS、盐酸胍和尿素作为变性剂，并将各自的浓度分别设置为1mM和10mM的H2O2、1%和10%的乙腈、1%的SDS、1M的盐酸胍以及1M的尿素，并设置不添加任何变性剂的空白对照组，以此考察变性剂对肝素酶SDhepⅡ活性的影响。在上述变性剂存在的条件下，1%和10%的乙腈、1M尿素对SDhepⅡ酶的影响较小，而1mM和10 mM 的H2O2、1%SDS、1M盐酸胍对SDhepⅡ有显著的抑制作用。
实施例6：SDhepⅡ酶解HEP的产物特异性研究
a) SDhepⅡ底物特异性研究：分别以肝素（HEP）、硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸软骨素（CS）、硫酸皮肤素（DS）为底物，测定SDhepⅠ的活性，发现SDhepⅠ酶在以CS和DS为底物时没有酶活，在以HEP和HS为底物时有酶活，且活性比约为HEP：HS=1:3.5。
b) SDhepⅡ酶解HEP双糖分析：在50mg的肝素中加入3IU（以肝素为底物的酶活）的SDhepⅡ，用缓冲液25mM Tris-HCl（含10mMCaCl2, pH7.0）定容至500µL，37℃条件下酶解24h，然后置于100℃水浴中，灭活5min，样品进行二糖组分液相分析，结果如图3所示，SDhepⅡ酶解HEP后，产物主要组分为IIS和IS，其中IS的峰面积占56.39%，酶解产物种类较少，酶解较彻底，与SDhepⅠ酶解HEP的产物完全不同。因此SDhepⅠ和SDhepⅡ是两种酶解特性完全不同的肝素酶，在肝素质量检测及低分子肝素的制备等方面具有潜在的应用价值。

Claims (9)

1.一种肝素酶，其特征在于，所述肝素酶从Sphingobacterium daejeonense细菌中获得，所述肝素酶为SDhepⅠ或SDhepⅡ，所述肝素酶SDhepⅠ的等电点为5.64，以HS为底物时的米氏常数为0.0418；所述肝素酶为SDhepⅡ的等电点为5.76，以HEP为底物时的米氏常数为0.0052。
2.根据权利要求1所述的肝素酶，其特征在于，所述肝素酶SDhepⅠ的分子量为74692Da，所述SDhepⅡ的分子量为94716Da。
3.一种如权利要求1所述肝素酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将菌种Sphingobacterium daejeonense接种于斜面培养基；
(2)将步骤(1)所述的菌种接种到种子培养基中，培养1-2天后，接入二级液体种子培养基中，培养1-2天，再接入2L发酵培养基中，培养1-5天，收集细胞；
(3)将步骤(2)所述的细胞悬浮在Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机破碎细胞，离心取上清，冰浴条件下做硫酸铵沉淀，收集饱和度35％-85％的沉淀组分，将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液中，透析；
(4)将步骤(3)中的酶液上样于一根Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，再以同样缓冲液平衡，以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，收集上样流出液和平衡液中有酶活组分，为不与Q柱结合的肝素酶SDhepⅠ，同样收集洗脱液中有肝素酶活性的组分，合并透析，为与Q柱结合的肝素酶SDhepⅡ；
当所述肝素酶为SDhepⅠ时，进入步骤(5)；当所述肝素酶为SDhepⅡ时，进入步骤(6)；
(5)将步骤(4)中的SDhepⅠ上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后再以同样缓冲液中氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，收集各具有肝素酶活性的组分，透析后上样于Tris-HCl缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡，然后以Tris-HCl缓冲液中氯化钠0-0.5M线性梯度洗脱，收集各活性组分,以截留分子量30kD的超滤离心管浓缩至0.2mL，浓缩的酶液上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的Sephadex G-100柱，以同样缓冲液洗脱，收集各组分，合并，浓缩，即得到纯化后的SDhepⅠ；
(6)将步骤(4)中的SDhepⅡ上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中氯化钠0.1-0.6M线性梯度洗脱，检测洗脱液中具有肝素酶活性的组分，收集合并，透析，酶液上一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的Q柱，以同样缓冲液含0.08M氯化钠等度洗脱，检测并收集有活性组分，上样于一根用Tris-HCl缓冲液平衡过的CS柱，再以同样缓冲液平衡，然后以同样缓冲液中0-1M氯化钠线性梯度洗脱，收集活性组分，合并，浓缩，即得到纯化后的SDhepⅡ；
所述Q柱为强阴离子交换柱；
所述SP柱为强阳离子交换柱；
所述CS柱为Cellufine Sulfate亲和柱或结合了肝素且能与肝素酶结合的CNBR-activated Sephareose CL-4B亲和柱。
4.根据权利要求3所述的肝素酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)、(4)、(5)和(6)中所述的Tris-HCl缓冲液为含CaCl2的Tris-HCl，pH6.5-8.0，Tris-HCl的浓度为10-50mM，所述CaCl2的含量为1-50mM。
5.根据权利要求3所述的肝素酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)和(6)中所述的Q柱为Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换柱。
6.根据权利要求3所述的肝素酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)、(6)中所述的CS柱为Cellufine Sulfate亲和柱。
7.根据权利要求3所述的肝素酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的SP柱为SP-Sepharose Fast Flow强阳离子交换柱。
8.如权利要求1所述肝素酶在肝素、低分子肝素或超低分子肝素的质量检测中的应用。
9.如权利要求1所述肝素酶在低分子肝素或超低分子肝素的生产制备中的应用。
CN201410839278.8A 2015-03-05 2015-03-05 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用 Active CN104593347B (zh)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410839278.8A CN104593347B (zh) 2015-03-05 2015-03-05 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用
US15/555,040 US10214735B2 (en) 2015-03-05 2015-05-25 Heparinases obtained from Sphingobacterium daejeonense, preparation therefor and application thereof
EP15883757.5A EP3266868B1 (en) 2015-03-05 2015-05-25 Heparinases obtained from sphingobacterium daejeonense, preparation therefor and application thereof
PL15883757T PL3266868T3 (pl) 2015-03-05 2015-05-25 Heparynazy otrzymane ze Sphingobacterium daejeonense, ich wytwarzanie i ich zastosowanie
PCT/CN2015/079704 WO2016138700A1 (zh) 2015-03-05 2015-05-25 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用
JP2017563374A JP6561143B2 (ja) 2015-03-05 2015-05-25 Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ由来のヘパリナーゼ及びその調製と応用
DK15883757.5T DK3266868T3 (da) 2015-03-05 2015-05-25 Heparinaser opnået fra sphingobacterium daejeonense, fremstilling deraf og anvendelse deraf
ES15883757T ES2820048T3 (es) 2015-03-05 2015-05-25 Heparinasas obtenidas de Sphingobacterium daejeonense, su preparación y su aplicación

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410839278.8A CN104593347B (zh) 2015-03-05 2015-03-05 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104593347A CN104593347A (zh) 2015-05-06
CN104593347B true CN104593347B (zh) 2018-08-28

Family

ID=53119403

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410839278.8A Active CN104593347B (zh) 2015-03-05 2015-03-05 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用

Country Status (8)

Country Link
US (1) US10214735B2 (zh)
EP (1) EP3266868B1 (zh)
JP (1) JP6561143B2 (zh)
CN (1) CN104593347B (zh)
DK (1) DK3266868T3 (zh)
ES (1) ES2820048T3 (zh)
PL (1) PL3266868T3 (zh)
WO (1) WO2016138700A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104593347B (zh) * 2015-03-05 2018-08-28 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用
CN106754462B (zh) * 2016-11-10 2020-03-17 广州清源生物科技有限公司 一株脱硫鞘氨醇杆菌及其应用
EP3561048A4 (en) * 2016-12-22 2020-08-12 Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Co., Ltd. PSEUDOMONAS STUTZERI-PRODUCING STRAIN OF HEPARINASE AND Heparinase derived from it
CN114787195B (zh) * 2019-12-27 2024-01-12 深圳市天道医药有限公司 一种肝素酶iii的制备方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5169772A (en) * 1988-06-06 1992-12-08 Massachusetts Institute Of Technology Large scale method for purification of high purity heparinase from flavobacterium heparinum
JPH0693836B2 (ja) * 1988-11-25 1994-11-24 新技術事業団 バチルス属に属するヘパリナーゼ生産微生物、新規ヘパリナーゼ及びその製法
JPH02261390A (ja) * 1989-03-31 1990-10-24 Toshiba Corp セルロースの分解法
US5389539A (en) * 1992-11-30 1995-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Purification of heparinase I, II, and III from Flavobacterium heparinum
TW565614B (en) 1996-07-18 2003-12-11 Univ Australian Detection of mammalian heparanase activity and purification of mammalian heparanase
CN1244702C (zh) * 2001-12-30 2006-03-08 中国科学院微生物研究所 一种鞘氨醇杆菌及用其生产的肝素酶生产肝素寡糖的方法
WO2009059283A1 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Non-anticoagulant polysaccharide compositions
CN101886067B (zh) 2009-05-11 2012-03-07 深圳市海普瑞药业股份有限公司 一种肝素黄杆菌肝素酶ⅰ的制备方法
CN102286448B (zh) 2011-08-22 2013-02-27 深圳市海普瑞药业股份有限公司 一种肝素黄杆菌肝素酶i、iii的制备方法
CN102864191A (zh) * 2011-12-16 2013-01-09 深圳市海普瑞药业股份有限公司 肝素双糖混合物及其制备方法和应用
CN102965362B (zh) * 2012-11-28 2014-09-03 深圳市海普瑞药业股份有限公司 一种肝素黄杆菌肝素酶ⅱ的制备方法
CN104593347B (zh) 2015-03-05 2018-08-28 深圳市海普瑞药业集团股份有限公司 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018506311A (ja) 2018-03-08
ES2820048T3 (es) 2021-04-19
EP3266868A4 (en) 2018-08-08
EP3266868B1 (en) 2020-07-22
JP6561143B2 (ja) 2019-08-14
EP3266868A1 (en) 2018-01-10
CN104593347A (zh) 2015-05-06
DK3266868T3 (da) 2020-08-24
PL3266868T3 (pl) 2020-12-28
US20180051270A1 (en) 2018-02-22
US10214735B2 (en) 2019-02-26
WO2016138700A1 (zh) 2016-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104593347B (zh) 来自Sphingobacterium daejeonense的肝素酶及其制备和应用
Labavitch et al. Structure of plant cell walls. Purification and characterization of a beta-1, 4-galactanase which degrades a structural component of the primary cell walls of dicots.
DE69333834T2 (de) Reinigung, zusammensetzung und spezifität von heparinase i, ii und iii aus flavobacterium heparinum
Sancovich et al. Porphyrin biosynthesis: VI. Separation and purification of porphobilinogen deaminase and uroporphyrinogen isomerase from cow liver. Porphobilinogenase an allosteric enzyme
CN106906161A (zh) 一种微杆菌、该菌表达的广谱糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用
CN106995811A (zh) 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用
Ma et al. Purification and characterization of κ‐carrageenase from marine bacterium mutant strain pseudoalteromonas sp. AJ5‐13 and its degraded products
CN100392078C (zh) 一种酸性海藻糖酶及其制备方法
CN101886067B (zh) 一种肝素黄杆菌肝素酶ⅰ的制备方法
CN105238772A (zh) 一种尿激酶分离纯化方法
CN103789300B (zh) 一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组dna的提取方法
CN105274075A (zh) 一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用
CN103224920A (zh) 一种枯草芽孢杆菌耐高温β-淀粉酶分离纯化的方法
CN104630197A (zh) 一种来自脑膜脓毒性金黄杆菌的肝素酶及其制备和应用
CN103667201B (zh) 海洋微生物菌株ys0810产的碱性过氧化氢酶及其分离纯化方法
CN105950589B (zh) 一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法
CN109182321A (zh) 肝素黄杆菌肝素酶ⅰ的高效制备方法
CN108239629A (zh) 来自食神鞘氨醇杆菌的肝素酶及其制备和应用
CN103149198A (zh) 一种酶法快速定量检测heparosan的方法
Geng et al. Enzymatic characterization and validation of gene expression of phosphoglucomutase from Cordyceps militaris
CN100383239C (zh) 从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方法
CN103088004A (zh) 一种重组耐热的β-1,4内切纤维素酶的纯化方法
Xia et al. Purification and characterization of extracellular chitinase from a novel strain Aspergillus fumigatus CS-01
CN102051365B (zh) 一种β-脱卤酶的基因及制备3-羟基丙酸的方法
Matsuda et al. Molecular transformation of tumor adenylosuccinate synthetase and characteristics of its converting factor

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 518057 Guangdong city of Shenzhen province Nanshan District Song Ping Lang Road No. 21

Applicant after: Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Group Limited by Share Ltd

Address before: 518057 Guangdong city of Shenzhen province Nanshan District Song Ping Lang Road No. 21

Applicant before: Shenzhen Hepalink Pharmaceutical Co., Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant