CN106906161A

CN106906161A - 一种微杆菌、该菌表达的广谱糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106906161A
Application number: CN201710163891.6A
Authority: CN
Inventors: 李博; 刘会会; 蔡晓娟; 颜颢; 张传伟; 韩文君; 王申
Original assignee: Jinan Tangtai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jinan Tangtai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2017-06-30
Anticipated expiration: 2037-03-14
Also published as: CN106906161B

Abstract

本发明涉及一种微杆菌、表达的广谱糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。一株微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株，2016年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13421，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明首次由微杆菌属细菌(Microbacterium)WS15的基因组中获得糖胺聚糖裂解酶TT16，该酶既能降解未经硫酸化修饰的透明质酸，也能降解不同硫酸化修饰的硫酸软骨素A(CS‑A)、硫酸软骨素C(CS‑C)和硫酸软骨素E(CS‑E)，是一个广谱糖胺聚糖裂解酶。

Description

一种微杆菌、该菌表达的广谱糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种微杆菌、该菌表达的广谱糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用，属于生物技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAGs)，又称为氨基多糖、酸性粘多糖等，是重复的二糖结构单元聚合而成的直链多糖^[1]。它们广泛存在于动物结缔组织中，在体内大多与核心蛋白通过共价键结合成蛋白聚糖而存在。

GAGs根据其单糖组成、糖苷键连接形式以及硫酸化的程度和位置的不同，可分为透明质酸(hyaluronic acid,HA)、肝素(heparin,HP)、硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate,DS)及硫酸角质素(kermatan sulfate,KS)等类别^[2]。HA结构相对简单，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通过β-1,3-糖苷键组成的二糖单位经β-1,4-糖苷键连接而成^[3]；HP是由D-葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸与N-乙酰氨葡糖胺组成的二糖经过α-l,4-糖苷键连接而成的线性多糖，HS是由D-葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸与N-乙酰氨葡糖胺组成的二糖经过β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖^[4]；CS是由D-葡萄糖酸酸/艾杜糖醛酸(GIcA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)通过β-1,3-糖苷键连接的重复二糖单元形成的线性多糖^[5]，由于硫酸化位点的不同，CS被分为多种不同类型^[6]，其中硫酸软骨素A(CS-A)、硫酸软骨素C(CS-C)和硫酸软骨素E(CS-E)分别在GalNAc的C-4位、C-6位以及C-4和C-6位羟基上发生硫酸化，硫酸软骨素D(CS-D)则在CS-E的基础上，在GIcA的C-2位进行了硫酸化修饰；硫酸软骨素B(CS-B)，一般称为硫酸皮肤素，是D-葡萄糖酸酸在C5-差向异构酶的作用下转变为L-艾杜糖酸酸，从而形成了DS；KS则是由中性的D-半乳糖和N-乙酰葡糖胺组成的二糖重复构成。

糖胺聚糖结构的多样化使它们在细胞黏附、保护、识别、抗凝血、神经细胞发育等多方面发挥着重要而独特的生物学功能。大量研究表明，GAGs糖链的长度、单糖残基和硫酸根基团的排列形式决定了糖链与各类蛋白因子结合的能力，进而影响其所在蛋白聚糖的生物学活性。通常，GAGs分子量大，难以穿透生物细胞膜而发挥其活性；低分子量的GAGs具有黏度小、溶解性好、易吸收等特点，相对于高分子量的GAGs，活性更高。因此，如何制备低分子量的GAGs从而提高其生物利用率，具有重要科学意义与应用价值，成为当前的研究热点之一^[7]。目前，制备低分子量GAGs的方法主要有化学降解、物理降解、氧化降解和生物降解等方法。其中，生物降解主要是酶法降解，其特点是专一、高效且安全，具有广阔的应用前景。

糖胺聚糖降解酶是指能够以GAGs为底物并将其裂解为寡糖及不饱和二糖的一类酶，主要包括微生物来源的裂解酶系和动物来源的水解酶系。根据底物特异性不同，可分为透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)、硫酸软骨素酶(chondroitin sulfate lyase,CSase)、肝素酶(Heparinase)等^[8,9]。其中，HAase主要作用于HA，降解产物是不饱和寡糖，还可在一定程度上催化作用于CS，但降解速度远低于降解HA^[10]。CSase根据其作用底物的差异主要分为CSase ABC、CSase AC、CSase B、CSase C等类型，主要底物是CS，同时表现一定的透明质酸降解活性，但CSase B是高度专一性硫酸皮肤素降解酶，对硫酸软骨素和透明质酸均无降解活性。Heparinases主要包括Heparinase I、II、Ⅲ，Heparinase I主要降解HP，Heparinase III主要降解HS，Heparinase II既降解HP也降解HS^[11]。目前，HAase被广泛应用于临床，例如，整形、外科手术、眼科、内科、肿瘤治疗、皮肤科及妇科等。经美国FDA认证的用途有3种^[8]：(1)用于眼科手术中提高麻醉效果，透明质酸酶在加快麻醉速度的同时也降低了麻醉持续的时间；(2)皮下灌注液的添加剂，皮下输液主要用于缓解老年病人出现的脱水症状；(3)透明质酸酶用于泌尿道造影时促进造影剂的再吸收，尤其是婴儿或儿童静脉注射达不到效果时。硫酸软骨素酶在基础研究、临床、低分子量CS制备等多种领域具有重要用途。例如，通过CSase降解蛋白聚糖的硫酸软骨素侧链，比较降解前后功能活性的变化，可用来研究CS在蛋白聚糖中发挥的作用^[12]；向髓损伤部位注入CSase，通过特异地降解CS糖胺聚糖使轴突再生，治疗脊髓损伤，进而恢复部分功能^[13]；另外，低分子量CS由于更容易穿过细胞膜而被机体吸收，对治疗风湿性关节炎、阿尔兹海默病IW^[14]、动脉粥样硬化及伤口愈合等有更好的疗效。因此，CSase可用于降解CS生产低分子量CS药物。

综上所述，糖胺聚糖降解酶不仅可以用于制备低分子量活性GAGs，还可作为研究糖胺聚糖结构功能的工具酶使用，更重要的是，可以在疾病治疗中发挥独特的作用。但目前具有应用价值的高活力糖胺聚糖降解酶较少，因此发掘新型糖胺聚糖降解菌中分离和鉴定新型高效的糖胺聚糖降解酶具有重要意义。到目前为止，已从黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)^[15]、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)^[16]、拟杆菌属(Bacteroides sp.)^[17]、链霉菌属(Streptomyces sp.)^[18]、弧菌属(Vibrio sp.)^[19]等多种微生物中分离获得了糖胺聚糖裂解酶，但是，未见来源于微杆菌属(Microbacterium sp.)的糖胺聚糖裂解酶。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种微杆菌、表达的广谱糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株，2016年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13421，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株，革兰氏染色阳性，在固体培养基上经普通光学显微镜观察为黄色不透明菌落，有光泽(图1A)。在幼龄培养物中细胞呈细长、不规则的杆菌，单个或成对，有的排列成直角到V字形；老龄培养物杆状缩短，可出现球状，但无明显的杆-球周期(图1B)。

用于菌体形态观察的培养基为TSB固体培养基，组分如下：胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂20g/L，pH7.2。

上述微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株的培养方法，步骤如下：

(1)取微杆菌WS15菌株接种至液体培养基中，在温度为25～30℃、转数为150～220转/分钟的条件下，摇床培养1～3天，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按1～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃、转数为150～220转/分钟的条件下，扩大培养1～3天，制得微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌液；

根据本发明优选的，所述液体培养基，每升组分如下：

碳源1～10g、胰蛋白胨5～15g、酵母提取物3～8g、NaCl 20～40g、KH₂PO₄ 2～5g、K₂HPO₄5～10g、(NH4)₂SO₄ 1～5g、MgSO₄·7H₂O 1～5mg、FeSO_··7H₂O 2～4mg，水定容至1升，pH值为6.5～7.5；

所述碳源选自硫酸软骨素、透明质酸中的一种。

根据本发明优选的，所述的液体培养基，每升组分如下：

胰蛋白胨10～20g、植物蛋白胨1～10g、氯化钠3～8g、磷酸二氢钾2～3g、葡萄糖2～3g，水定容至1升，pH 6.5～7.5。

本发明的菌株，经测定，其16S rRNA的基因序列长度为1447bp，如SEQ ID NO.1所示。通过使用美国生物工程信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)BLASTN程序比对，本发明的菌株的16S rRNA的基因序列与NCBI注册的微杆菌标准菌株(Microbacterium)16S rRNA的基因序列具有较高的同源性。本发明筛选到的菌株与标准菌株Microbacterium esteraromaticum ATCC 8091，Microbacteriumarabinogalactanolyticum ATCC 51926亲缘关系最近，相似度分别为99.8％、99.3％。

本发明中，16S rRNA基因系统发育树构建方法：应用MEGA6.0软件包中的ClustalW对测得的16S rRNA基因序列以及基因库中的相似序列，一起进行多序列比对，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验，获得统计树(图2)。结果表明，WS15菌株与微杆菌属的模式菌株聚类，且位于该分支内部。因此，将WS15菌株鉴定至微杆菌属。

上述16S rRNA基因测序的基本方法是：用细菌基因组提取试剂盒(天根)制备菌株的基因组DNA，以菌株的基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证后，连接到pEASY-Blunt Simple CloningVector，转化E.coli DH5α感受态细胞。经氨苄抗性筛选，获得阳性克隆。16S rRNA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将所得序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的标准菌株的16S rRNA基因序列进行比对。

按照上述流程，本发明分离到一株微杆菌，编号为WS15，命名为Microbacteriumsp.WS15，于2016年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13421。

一种来源于上述微杆菌WS15菌株的广谱糖胺聚糖裂解酶TT16，氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

上述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16既能降解未经硫酸化修饰的透明质酸，也能降解不同硫酸化修饰的硫酸软骨素A(CS-A)、硫酸软骨素C(CS-C)和硫酸软骨素E(CS-E)。在降解透明质酸时，随着酶解反应时间的增加，产物只有不饱和透明质酸二糖，说明TT16属于外切型糖胺聚糖裂解酶。该酶降解透明质酸后终产物为不饱和的透明质酸二糖；降解CS-A后终产物为单硫酸化的硫酸软骨素二糖(A-unit)和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为20:1；降解CS-C后终产物为单硫酸化的硫酸软骨素二糖(C-unit)和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为21:1；降解CS-E后终产物为双硫酸化的硫酸软骨素二糖(E-unit)、单硫酸化的硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为1:26:1.5。

上述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的编码基因，全长共2412bp，所编码蛋白质含有804个氨基酸，分子量约为85.9kD。

一种重组表达载体，在表达载体中插入了上述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的编码基因。

一种重组菌，在宿主细胞中转入了上述重组表达载体。

上述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的编码基因、重组表达载体、重组菌在制备广谱糖胺聚糖裂解酶TT16中的应用。

上述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的在降解透明质酸、硫酸软骨素和制备不饱和寡糖中的应用。

有益效果

1、本发明首次由微杆菌属细菌(Microbacterium)WS15的基因组中获得糖胺聚糖裂解酶TT16，该酶既能降解未经硫酸化修饰的透明质酸，也能降解不同硫酸化修饰的硫酸软骨素A(CS-A)、硫酸软骨素C(CS-C)和硫酸软骨素E(CS-E)，是一个广谱糖胺聚糖裂解酶。TT16在降解透明质酸时，随着酶解反应时间的增加，产物只有不饱和透明质酸二糖，是一种外切型糖胺聚糖裂解酶。该酶彻底降解透明质酸后的产物是不饱和的透明质酸二糖；降解CS-A后终产物为单硫酸化的硫酸软骨素二糖(A-unit)和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为20:1；降解CS-C后终产物为单硫酸化的硫酸软骨素二糖(C-unit)和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为21:1；降解CS-E后终产物为双硫酸化的硫酸软骨素二糖(E-unit)、单硫酸化的硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为1:26:1.5。整体上，该酶可以用于彻底降解透明质酸和硫酸软骨素，以及高效制备透明质酸二糖和不同硫酸化修饰的硫酸软骨素二糖。

2、本发明所述的糖胺聚糖裂解酶以透明质酸或硫酸软骨素为底物时，在50℃、pH7.0条件下具有最高酶活力。TT16对透明质酸的比活为16,200U/mg、对硫酸软骨素A的比活为18,400U/mg、对硫酸软骨素C的比活为15,100U/mg、对硫酸软骨素E的比活为15,700U/mg，该酶具有广泛的底物特异性，应用前景广阔。

附图说明

图1、微杆菌WS15菌株的基本形态学特征；

其中，A、WS15菌株在TSB培养基上的菌落形态；

B、WS15菌株的光学显微镜照片，左图为培养24h后的菌体形态，右图为培养48h后的菌体形态；

图2、微杆菌WS15菌株基于16S rRNA基因序列绘制的进化树；

图3、重组糖胺聚糖裂解酶rTT16功能模块构成的BLASTp分析结果；

图4、重组糖胺聚糖裂解酶rTT16表达及纯化情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)；

其中：M、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道1、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道2、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道4、经镍柱纯化的rTT16，上样量10μL；

图5、温度对重组糖胺聚糖裂解酶rTT16活性的影响曲线；

图6、pH值对重组糖胺聚糖裂解酶rTT16活性的影响曲线；

图7、温度对重组糖胺聚糖裂解酶rTT16稳定性的影响曲线；

图8、pH值对重组糖胺聚糖裂解酶rTT16稳定性的影响曲线；

图9、金属离子及化学试剂对重组糖胺聚糖裂解酶rTT16活性的影响柱状图；

图10、重组糖胺聚糖裂解酶rTT16降解透明质酸和硫酸软骨素所得产物的高效液相(HPLC)分析图；

其中：1、双硫酸化的不饱和CS二糖；2、单硫酸化的不饱和CS二糖；3、不饱和的CS二糖或HA二糖；

图11、重组糖胺聚糖裂解酶rTT16降解透明质酸过程中寡糖产物的HPLC分析图；

图12、用重组糖胺聚糖裂解酶rTT16彻底降解透明质酸和硫酸软骨素后所制备的不饱和寡糖终产物的HPLC分析图；

图13、用重组糖胺聚糖裂解酶rTT16彻底降解透明质酸和硫酸软骨素所制备不饱和寡糖片段的MS分析图；

其中：A、重组酶rTT16彻底降解HA制备的不饱和HA二糖；B、重组酶rTT16彻底降解CS-A制备的不饱和CS二糖；C、重组酶rTT16彻底降解CS-C制备的不饱和CS二糖；D、重组酶rTT16彻底降解CS-E制备的不饱和CS二糖；

图14、用重组糖胺聚糖裂解酶rTT16彻底降解透明质酸所制备不饱和寡糖片段UDP2的¹H-NMR图；

图15、用重组糖胺聚糖裂解酶rTT16彻底降解透明质酸所制备不饱和寡糖片段UDP2的¹³C-NMR图；

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中个参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

实施例1、微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株的获得

称取10g海泥样品(海泥样品于2015年5月份，从青岛市栈桥边采集)，加入10mL无菌水，得浸出液，分别取上清液1mL加入到9mL无菌水中，分别稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等5个浓度，分别涂布于唯一碳源分离培养基上，于28℃恒温培养72h，菌落计数，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线于TSB固体平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，以备后用。

把培养出来的菌株，分别接种到唯一碳源液体培养基中，200rpm，28℃培养72h，观察菌液浑浊情况，同时取培养上清进行咔唑反应检测碳源的消耗情况。依据上述两个指标选择产酶菌株。将在各唯一碳源培养基中均浑浊以及咔唑反应数值较小的菌株挑取到TSB固体平板上，并保种记为WS15。

所述的WS15菌株，革兰氏染色阳性，在固体培养基上为黄色不透明菌落，有光泽(图1A)。在幼龄培养物中细胞呈细长、不规则的杆菌，单个或成对，有的排列成直角到V字形；老培养物杆状缩短，可出现球状，但无明显的杆-球周期(图1B)。

所述的TSB培养基成分为：胰蛋白胨17g/L，植物蛋白胨3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH7.2。

TSB固体培养基中为在TSB培养基的基础上加入2wt％的琼脂。

上述唯一碳源培养基成分为：碳源5g/L、NaCl 30g/L、KH₂PO₄ 3g/L、K₂HPO₄ 7g/L、(NH4)₂SO₄ 2g/L、MgSO₄·7H₂O 5mg/L、FeSO₄·7H₂O 2mg/L，pH值为7.2。

所述碳源选自硫酸软骨素、透明质酸中的一种。

实施例2、微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株的培养方法，步骤如下：

(1)取微杆菌WS15菌株接种至液体培养基中，在温度为28℃、转数为200转/分钟的条件下，摇床培养1天，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按1％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为28℃、转数为200转/分钟的条件下，扩大培养1天，制得微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌液；

所述液体培养基，每升组分如下：

硫酸软骨素5g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 30g、KH₂PO₄ 3g、K₂HPO₄ 7g、(NH4)₂SO₄ 2g、MgSO₄·7H₂O 5mg、FeSO₄·7H₂O 2mg，水定容至1升，pH值为7.2；

所述的液体培养基也可采用TSB培养基，其组成为：胰蛋白胨17g/L、植物蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L，水配制，pH 7.2。

实施例3、微杆菌(Microbacterium sp.)WS15基因组DNA的提取

按照实施例2所述的培养方法，培养WS15菌株至600nm吸光值(OD₆₀₀)为1.2；取培养菌液20mL，在12,000×g(g，地球引力常数)条件下离心20min，收集菌体沉淀；用20mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0)悬浮菌体，在12,000×g条件下离心20min，收集菌体沉淀；

向上述菌体沉淀中，加入溶菌酶缓冲液12.0mL，得到14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶各560μL，其终浓度为800μg/mL；置于冰水浴中1.0h，然后转移至37℃水浴中，温浴2h，至反应体系粘稠；加入浓度为100mg/mL的十六烷基磺酸钠溶液0.82mL、100mg/mL的蛋白酶K溶液60μL，在52℃温浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；在10,000×g、4℃条件下离心10min，收集上清，并加入2.0mL的NaAc-HAc(pH5.2，3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇(贮于-20℃)，充分混匀；用枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的离心管中，以70％乙醇，洗涤2次，微离心后弃掉上清；在10,000×g、4℃条件下离心2min，彻底弃掉上清；将DNA沉淀于无菌工作台中风吹干燥，然后用无菌去离子水在4℃过夜溶解DNA样品，制得基因组DNA。

实施例4、微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株基于16S rRNA基因的分子鉴定

以实施例3制备的WS15基因组DNA为模板，使用细菌16S rRNA基因的通用引物进行扩增，用胶回收试剂盒(天根)纯化PCR扩增产物，电泳验证后，连接到pEASY-Blunt SimpleCloning Vector，转化到E.coli DH5α。经氨苄抗性筛选，获得阳性克隆。16S rRNA基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，将序列与美国国家生物信息中心(NCBI)收录的标准菌株的16S rRNA基因序列进行比对，应用MEGA6.0构建系统发育树。

上述用于菌株16S rRNA基因扩增的通用引物为：

正向引物为27f：5’-AGAGTTTGATCCTG GCT CAG-3’；

反向引物为1492r：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

上述用于菌株16S rRNA基因扩增的反应体系如下，总体积30μL：

所用基因扩增试剂购自大连宝生物技术有限公司。

上述用于菌株16S rRNA基因扩增的程序为：

94℃预变性5min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸90S，共35个循环；72℃延伸15min；降温至4℃并保温15min。

上述基于16S rRNA基因系统发育树构建方法：

应用MEGA6.0软件包中的Clustal W对测得的16S rRNA基因序列以及基因库中的相似序列，一起进行多序列比对，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验，获得统计树。

本发明筛选到的WS15菌株与标准菌株Microbacterium esteraromaticum ATCC8091，Microbacterium arabinogalactanolyticum ATCC 51926亲缘关系最近，16S rRNA基因之间的相似度分别为99.8％、99.3％。且基于16S rRNA基因构建所得的统计树(图2)表明，WS15菌株与微杆菌属的模式菌株聚类，位于该分支内部。因此，WS15菌株被鉴定至微杆菌属。

实施例5、微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株基因组的扫描及其序列分析

将实施例3制得的基因组DNA，采用焦磷酸测序技术进行基因组的扫描测序，由上海美吉生物公司完成。用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的在线软件对DNA测序结果进行分析。所用到的NCBI网站的分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic Local Alignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

用上述生物学软件分析的结果显示，微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株基因组DNA上携带一个疑似糖胺聚糖裂解酶的编码基因tt16，基因tt16的编码区长2412bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。基因tt16所编码的糖胺聚糖裂解酶TT16共含有804个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

用BLASTp软件在线分析，结果显示，NCBI数据库中已鉴定的蛋白，与糖胺聚糖裂解酶TT16的氨基酸序列相似性最大的是Chondroitin Ac Lyase(Arthrobacter Aurescens)，相似性为44％。如图3所示，BLASTp分析还推测蛋白质TT16内部含有在糖胺聚糖裂解酶超级家族中保守的假定催化结构域，同时含有多糖裂解酶8家族(PL8)的保守结构域。用生物学软件BioEdit 7.0.5.3进行分析，显示蛋白质TT16的理论分子量约为85.9kDa。用信号肽在线预测软件SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析，该蛋白质的N-端1-33位氨基酸为分泌型信号肽。

实施例6、基因tt16在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中的重组表达

以实施例3制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物序列如下：

正向引物TT16F：5’-g CATATGTCGCTGCAGCCGCTGAGC-3’(Nde I)；

反向引物TT16R：5’-g CTCGAGGCGGTGCAGCGAGAACTCCAG-3’(Xho I)；

正向引物TT16F中下划线标注的是限制性内切酶Nde I位点，反向引物TT16R下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymer购自中国大连宝生物公司，所用PCR反应试剂按照该公司提供的产品说明进行操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性40s，65℃退火40s，72℃延伸150s，35个循环；72℃延伸10min；4℃稳定10min。

将PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将购于美国Invitrogen公司的产品pET-30a(+)质粒DNA，用Nde I和XhoI双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。限制性内切酶Nde I和Xho I均购于中国大连宝生物公司，酶切所用到的酶与底物反应的体系、温度和时间，均按照该公司提供的产品说明操作。

将经过Nde I和Xho I双酶切的PCR产物，与同样经过双酶切的pET-30a(+)质粒载体，在DNA连接酶的催化下进行接；连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养16h后，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL卡那霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用扩增引物进行PCR验证，结果得到大小为2.3kb的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒进行测序，结果表明，在pET-30a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的基因tt16(去除信号肽)，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pE30a-TT16。

将重组质粒pE30a-TT16转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤，使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的诱导表达。在8,000×g、4℃条件下离心15min，收集菌体，并用缓冲液A重悬菌体，冰水浴环境中超声破碎。在15,000×g、4℃条件下进一步离心30min，收集水溶性组分，并用Ni-琼脂糖凝胶对重组糖胺聚糖裂解酶rTT16进行纯化。用含有咪唑浓度为10、50、100、250、500mM的缓冲液A进行梯度洗脱，纯化条件按照凝胶的产品手册操作。用聚丙烯酰胺凝变性胶电泳检测重组褐藻胶裂解酶rTT16的纯化情况。结果如图4所示：经IPTG诱导表达后的BL21(DE3)菌体中，重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的产量不低于100mg/L菌体培养物；纯化后的重组糖胺聚糖裂解酶rTT16在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合；将纯化后的重组糖胺聚糖裂解酶rTT16样品装入最小分子截留量为10kD的透析袋，在4℃环境中对缓冲液A进行透析。所述缓冲液A的成分是50mM Tris、150mM NaCl，pH 7.9，制得重组糖胺聚糖裂解酶rTT16酶液。

实施例7、重组酶rTT16最适温度的测定

用去离子水配制质量体积浓度为0.1～1.2％的透明质酸和硫酸软骨素，加热溶解后，置于0℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴环境中降温1h。向每900μL底物溶液中添加实施例6制得的重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的稀释液100μL，重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的稀释液浓度为10μg/mL，混匀后继续反应，隔时取样。每个温度条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。

用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成还原糖的浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值，进行偏差分析。最大吸收值对应的反应温度为重组酶的最适温度，相对酶活(RA)定义为：各吸收值与最大吸收值的百分比。结果如图5所示：在分别以透明质酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C和硫酸软骨素E测定酶活时，重组糖胺聚糖裂解酶rTT16在50℃反应时达到最大活力，这表明重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的最适反应温度是50℃。重组糖胺聚糖裂解酶rTT16在0℃和70℃展示了60％以上的相对酶活，这表明重组糖胺聚糖裂解酶rTT16具有适冷的酶学性质以及一定的耐热性。

实施例8、重组酶rTT16最适pH的测定

分别用浓度为50mM的NaAc-HAC缓冲液、50mM的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液、50mM的Tris-HCl缓冲液，分别与透明质酸配制质量体积浓度(g/mL)为0.1～1.2％的透过明质酸底物，所对应的pH值分别为5、6，6、7、8，8、9、10三个区段，各pH值均在最适温度下调定。将底物溶解后，置于最适温度中孵育1h，然后向每900μL底物中添加实施例6制得的重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的稀释液100μL，混匀后开始反应，隔时取样。每个pH条件下3个平行样品，以沸水浴灭活的重组酶制剂为对照组。用DNS-还原糖法测定各反应体系中新生成的还原糖浓度(OD₅₄₀)，并计算平均值和偏差。

相对酶(RA)活定义为：各组平均吸收值与最大吸收值的百分比。最大吸收值对应的pH为重组酶的最适pH。结果如图6所示：重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的最适反应pH为7.0。

实施例9、重组酶rTT16的温度稳定性分析

将实施例6制得的重组糖胺聚糖裂解酶rTT16酶液在不同温度(0～70℃)下热处理2h后，分别与用蒸馏水配置的质量体积浓度(g/mL)为0.1～1.2％的透明质酸，按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过热处理的酶液酶活定义为100％相对活力。结果如图7所示：重组糖胺聚糖裂解酶rTT16在低于40℃的温度下预处理2h后，仍然具有>90％的残余活性，表明该酶具有一定的热稳定性。

实施例10、重组酶rTT16的pH稳定性分析

将实施例6制得的重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的酶液，在最适温度(50℃)、不同的pH(pH5～10)环境中分别预孵育2h后，与质量体积浓度(g/mL)为0.1～1.2％的透明质酸底物溶液按1：9(体积比)的比例混合，然后在最适温度下测定残余酶活，以不经过预处理的酶液酶活定义为100％相对活力。结果如图8所示，在pH5～10的范围内预处理2h，rTT16酶活保持70％以上。这表明重组糖胺聚糖裂解酶rTT16对pH值的耐受范围较广。

实施例11、金属离子对重组酶rTT16活性的影响

将用去离子水配置的质量浓度为0.1～1.2％透明质酸底物、实施例6制得的重组糖胺聚糖裂解酶rTT16酶液、以及水按5：1：4(体积比)的比例混合后，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的离子终浓度为1mM或10mM，然后在50℃反应4h，按前述的DNS-还原糖法测酶的活力。对照组为不加任何金属离子时rTT16的活性(设定为100％)。结果如图9所示，在1mM或10mM浓度下：(1)Na⁺、K⁺、Li⁺、Ag⁺等四种一价金属试剂在1mM时，对rTT16的活性具有微弱的抑制作用，Ag⁺在10mM时具有显著抑制作用；(2)Fe²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、等二价金属例子对酶活具有促进作用,而其余二价、三价金属离子对酶活具有抑制作用；(3)β-巯基乙醇、EDTA及DTT在10mM时对rTT16的活性有明显促进活性，可分别使酶活提高至139.8％、115.5％及132.9％。

实施例12、重组糖胺聚糖裂解酶rTT16的酶活测定

将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素底物、rTT16酶液、150mM Tris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应1-10min，用紫外法测酶活力^[20]，同时用购于上海生工生物工程有限公司的蛋白质定量试剂盒测定rTT16酶液的蛋白含量，结果表明重组rTT16对HA的比活为16,200U/mg，对CS-A的比活为18,400U/mg，对CS-C的比活为15,100U/mg，对CS-A的比活为15,700U/mg。

实施例13、重组酶rTT16降解糖胺聚糖所得产物的高效液相(HPLC)分析

用去离子水配制质量体积浓度(g/mL)为0.1～1.2％的透明质酸和硫酸软骨素底物，加热溶解后，置于50℃水浴环境中降温1h。向每100μL底物中添加实施例6制得的重组酶rTT16的稀释液10～100μL，不足200μL体积时，用无菌去离子水补足；混匀后继续反应，隔时取样。将反应产物在沸水浴中加热10min，转入冰水浴中5min。在12,000×g、4℃条件下离心15min，收集上清。

用浓度为0.20mol/L的NH₄HCO₃溶液，平衡Superdex Peptide 10/300GL(GE公司)分子凝胶色谱柱，流速0.40mL/min，至少2柱床。将上述不同酶解时间的样品，以自动进样器加载100μg/样品，其它条件不变，232nm检测。用HPLC操作软件，分析各寡糖组分的积分面积，计算相对摩尔浓度。

结果如图10和图11所示，从图10可以看出，重组糖胺聚糖裂解酶rTT16既能降解未经硫酸化修饰的透明质酸，也能降解不同硫酸化修饰的硫酸软骨素A(CSA)、硫酸软骨素C(CSC)和硫酸软骨素E(CSE)，这初步表明重组酶rTT16是糖胺聚糖裂解酶。该酶彻底降解透明质酸后的产物是不饱和的透明质酸二糖；降解CSA后终产物为单硫酸化的硫酸软骨素二糖(A-unit)和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为20:1；降解CSC后终产物为单硫酸化的硫酸软骨素二糖(C-unit)和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为21:1；降解CSE后终产物为双硫酸化的硫酸软骨素二糖(E-unit)、单硫酸化的硫酸软骨素二糖和硫酸软骨素二糖(O-unit)，摩尔比为1:26:1.5。

从图11可以看出，随着酶解反应时间的增加，具有232nm特征吸收的寡糖产物的含量逐渐增加，且产物只有一种，即出峰时间为41.85'的寡糖产物。该结果表明重组酶rTT16属于外切型糖胺聚糖裂解酶。

实施例14、重组酶rTT16彻底降解透明质酸和硫酸软骨素的寡糖主产物的分子量鉴定

按照实施例13所述，将共200mg透明质酸或硫酸软骨素用重组酶rTT16彻底酶解，样品分批上样、过Superdex Peptide 10/300GL分子凝胶色谱柱(GE公司)，并按照出峰时间收集寡糖样品。将多次收集到的寡糖样品集中后，反复冷冻干燥以脱盐。用无菌去离子水溶解所得寡糖样品，进行一级质谱(MS)分析，确定各寡糖的相对分子量。

如图12所示，用重组酶rTT16彻底降解透明质酸或硫酸软骨素后所制备的不饱和寡糖片段进行HPLC分析，结果显示产物在232nm具有特征吸收，纯度均大于95％，符合进一步实验要求。

在阴离子模式下进行的一级质谱分析的结果表明，用重组酶rTT16彻底降解透明质酸所得寡糖产物的分子量是379，说明是不饱和透明质酸二糖(图13A)；用重组酶rTT16彻底降解CS-A所得寡糖主产物的分子量是459，说明是来自于CS-A多糖的不饱和4位硫酸化的硫酸软骨素二糖(图13B)；用重组酶rTT16彻底降解CS-C所得寡糖主产物的分子量是459，说明是来自于CS-C多糖的不饱和6位硫酸化的硫酸软骨素二糖(图13C)；用重组酶rTT16彻底降解CS-E所得寡糖产物的分子量是539，说明是来自于CS-E多糖的不饱和4、6位硫酸化的硫酸软骨素二糖(图13D)

实施例15、重组酶rTT16彻底降解透明质酸所得寡糖主产物的核磁鉴定

将实施例14制备的透明质酸二糖，用重水(D₂O)反复冷冻干燥，以完成氢-氘置换，并进行¹H-NMR和¹³C-NMR测试，比对参考文献，最终确定该寡糖的化学结构及特征。

通过¹H-NMR数据分析透明质酸二糖的结构特征^[21]：如图14所示，5.68ppm处的特征性化学位移值表明，重组酶rTT16降解透明质酸后的二糖产物为不饱和二糖UDP2；由4.98～5.02ppm处的化学位移值表明，不饱和二糖存在α和β两种构象，而且两处峰的面积积分之比为100:104，表明这两种不饱和二糖的摩尔比约为1:1。

通过¹³C-NMR数据分析透明质酸二糖的结构特征^[22]：如图15所示，¹³C-NMR给出了各个碳原子的信号，174.2ppm处为D-葡萄糖醛酸上-COO^-的^-特征性化学位移值，174.5ppm处为N-乙酰氨基葡萄糖上-CONH的特征性化学位移值，结合一级质谱给出透明质酸二糖的分子量为379，进一步证明重组酶rTT16降解透明质酸产生的二糖结构为Δ^4,5HexUAα1-3GlcNAc。

参考文献：

[1]DeAngelis P L,Liu J,Linhardt R J.Chemoenzymatic synthesis ofglycosaminoglycans:re-creating,re-modeling and re-designing nature's longestor most complex carbohydrate chains[J].Glycobiology,2013,23(7):764-777.

[2]Ida M,Shuo T,Hirano K,et al.Identification and functions ofchondroitin sulfate in the milieu of neural stem cells[J].Journal ofBiological Chemistry,2006,281(9):5982-5991.

[3]Gallagher J T,Walker A.Molecular distinctions between heparansulphate and heparin.Analysis of sulphation patterns indicates that heparansulphate and heparin are separate families of N-sulphated polysaccharides[J].Biochemical Journal,1985,230(3):665-674.

[4]Olson S K,Bishop J R,Yates J R,et al.Identification of novelchondroitin proteoglycans in Caenorhabditis elegans:embryonic cell divisiondepends on CPG-1and CPG-2[J].The Journal of cell biology,2006,173(6):985-994.

[5]Kitagawa H.Using sugar remodeling to study chondroitin sulfatefunction[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin,2014,37(11):1705-1712.

[6]Sugahara K,Mikami T,Uyama T,et al.Recent advances in thestructural biology of chondroitin sulfate and dermatan sulfate[J].Currentopinion in structural biology,2003,13(5):612-620.

[7]严子琴,黄海婵,王畅,等.低分子肝素制备的研究进展[J].中国生化药物杂志,2012,33(6):913-916.

[8]苏康,吉爱国.透明质酸酶的研究进展[J].生物技术通报,2014,3:15-21.

[9]Hynes W L,Walton S L.Hyaluronidases of Gram-positive bacteria[J].FEMS microbiology letters,2000,183(2):201-207.

[10]Yamada S.Role of Hyaluronidases in the Catabolism of ChondroitinSulfate[M]//Biochemical Roles of Eukaryotic Cell SurfaceMacromolecules.Springer International Publishing,2015:185-197.

[11]Ernst S,Venkataraman G,Winkler S,et al.Expression in Escherichiacoli,purification and characterization of heparinase I from Flavobacteriumheparinum[J].Biochemical Journal,1996,315(2):589-597.

[12]Zeng Y,Ebong E E,Fu B M,et al.The structural stability of theendothelial glycocalyx after enzymatic removal of glycosaminoglycans[J].PLoSOne,2012,7(8):e43168.

[13]Mountney A,Zahner M R,Sturgill E R,et al.Sialidase,chondroitinaseABC,and combination therapy after spinal cord contusion injury[J].Journal ofneurotrauma,2013,30(3):181-190.

[14]Zhang Q,Li J,Liu C,et al.Protective effects of low molecularweight chondroitin sulfate on amyloid beta(Aβ)-induced damage in vitro and invivo[J].Neuroscience,2015,305:169-182.

[15]Sasisekharan R,Bulmer M,Moremen K W,et al.Cloning and expressionof heparinase I gene from Flavobacterium heparinum[J].Proceedings of theNational Academy of Sciences,1993,90(8):3660-3664.

[16]Guo X,Shi Y,Sheng J,et al.A novel hyaluronidase produced byBacillus sp.A50[J].PloS one,2014,9(4):e94156.

[17]Shim K W,Kim D H.Cloning and expression of chondroitinase AC fromBacteroides stercoris HJ-15[J].Protein expression and purification,2008,58(2):222-228.

[18]Elmabrouk Z H,Vincent F,Zhang M,et al.Crystal structures of afamily 8 polysaccharide lyase reveal open and highly occluded substrate‐binding cleft conformations[J].Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,2011,79(3):965-974.

[19]Han W,Wang W,Zhao M,et al.A novel eliminase from a marinebacterium that degrades hyaluronan and chondroitin sulfate[J].Journal ofBiological Chemistry,2014,289(40):27886-27898.

[20]Yamagata T,Saito H,Habuchi O,et al.Purification and properties ofbacterial chondroitinases and chondrosulfatases[J].Journal of BiologicalChemistry,1968,243(7):1523-1535.

[21]Homer,K.A.,Grootveld,M.C.,Hawkes,J.,Naughton,D.P.and Beighton,D.(1994).Degradation of hyaluronate by Streptococcus intermedius strain UNS35.J Med Microbiol 41(6):414-22.

[22]John E.Scott,Frank Heatley(1999).Hyaluronan forms specific stabletertiary structures in aqueous solution:A¹³C NMR study.Proc.Natl.Acad.Sci.96:4850-4855.

SEQUENCE LISTING

<110> 济南唐泰生物科技有限公司

<120> 一种微杆菌、表达的广谱糖胺聚糖裂解酶及其编码基因与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1447

<212> DNA

<213> Microbacterium sp.

<400> 1

gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagccc agcttgctgg 60

gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgagcaacc tgcccctgac tctgggataa 120

gcgctggaaa cggcgtctaa tactggatat gtcccgtcac cgcatggtgt gcgggtggaa 180

agatttttcg gttggggatg ggctcgcggc ctatcagctt gttggtgagg taatggctca 240

ccaaggcgtc gacgggtagc cggcctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat 360

gcagcaacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttt agcagggaag 420

aagcgagagt gacggtacct gcagaaaaag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480

taatacgtag ggtgcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtc 540

tgtcgcgtct gctgtgaaat cccgaggctc aacctcgggc ttgcagtggg tacgggcaga 600

ctagagtgcg gtaggggaga ttggaattcc tggtgtagcg gtggaatgcg cagatatcag 660

gaggaacacc gatggcgaag gcagatctct gggccgtaac tgacgctgag gagcgaaagg 720

gtggggagca aacaggctta gataccctgg tagtccaccc cgtaaacgtt gggaactagt 780

tgtggggtcc tttccacgga ttccgtgacg cagctaacgc attaagttcc ccgcctgggg 840

agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggcggagc 900

atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata cacgagaacg 960

ggccagaaat ggtcaactct ttggacactc gtgaacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcgtt ctatgttgcc 1080

agcacgtaat ggtgggaact catgggatac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga 1140

tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtct tgggcttcac gcatgctaca atggccggta 1200

caatgggctg cgataccgta aggtggagcg aatcccaaaa agccggtccc agttcggatt 1260

gaggtctgca actcgacctc atgaagtcgg agtcgctagt aatcgcagat cagcaacgct 1320

gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc aagtcatgaa agtcggtaac 1380

acctgaagcc ggtggcctaa ccccttgtgg gagggagctg tcgaaggtgg gatcggtaat 1440

taggact 1447

<210> 2

<211> 2415

<212> DNA

<213> Microbacterium sp.

<400> 2

atgttcaccc cctctcgccg caatgtcctg caactgggcg gcttcgcgct ggcctcagct 60

ctgctgatgg acgccggccg tccgctgacg gcatcggcgt cgctgcagcc gctgagcgtc 120

ggcgttcccg agatcgaggc gctgcgcacc cgctgggtcg agacgctgac cggccgcggc 180

atcatcagcg gctctcccgc gaccttcgcc gcggcgatcg cccgacagga tcggggcacc 240

gacgctctgc tcgcgaagat cagcccgacc gccacccgct acttctcgga tcaggactgg 300

tcgatcggcg ccaccgagat cgcgaagtcc aacgccatgc gcatgaacta ctcgggcatc 360

cagagtctcg ccgtctcgtg gtcgacccct ggctcgaagc acgagggatc ggccgtcgtg 420

ctcgacgccg cgctgcgcgg gctggctcac atgcacgagc gggtctacaa cccgaacacg 480

cagtggtggg gcaactggtg gtcgtggaac atcggtgccg cccagcccct ggcgaacacg 540

atggcgctgc tgcacgacga gctcgaccag accgagatcg acgcgtactg cgcatccatc 600

gaccacttca tccccggtcg agacccgcgc atgcagctgc atccgaccgg accgcgggag 660

tccgacggcg cgaaccgcgt cgacatctgc caggcgatca tcgtgcgggc gatcgcacac 720

cccgatcccg acctgctgcg cgccgcggtg accgcgctga gcgacacctg gcagtacatc 780

accgagggca acgggttctt ccgcgacggc tcgttcgtgc agcactccac gatcggctac 840

accggcacct acggactcgt gctgctgggc gggctggcga agctcttcgc cctactcgcc 900

ggcaccgcgt tcgacgtcac cgaccccagc cggtccaacg tcagcggatt cgtggagagc 960

tcgttcgcgc cgctgatgtt ccgcggccag atgatggacg ccgtgcgcgg gcgagcggtc 1020

gcccggtatg ccgagcgcag catcagcaac ggaaacgacc tcatcgagca cacgctgcgc 1080

ctcgcccagt ccgccgacgc tgcgacggct gcacgctggc gggggctctg ccggcagtgg 1140

atcgagagca actccgcggc gaacatcacc acgaccacga gcatcgtgcg cctgtcgctg 1200

gtcaccgagc tgctgaactc ggacgcggtg gccgtcgcgg acccgaccgg cccccggctg 1260

ttcccggcga tggaccggct cgtgcaccgt gccgccgacg gctcgtgggc cctcgccgtc 1320

gcgatgtgct cgaaccggat cgcgtggcac gagggcaccg aagccgagaa cttcgagggc 1380

gtgaagacca gtcagggaat gacctatctg tacctgcgcg gcgatgagga tcacttcgac 1440

gacgagttct ggtcgacctc cgacctcgcg tcccctccgg gcaccacggt cgacctcacc 1500

ccgctgccac gcaacccgga gggcgagtgg ggcgagcgca cacccgccaa cgagtggacc 1560

ggcggtgtca ccctcgaaga caccgcgctc gctgccatgc acctggtcgc tccgggaggg 1620

acgggtctgg tcgcgcgcaa ggtgtggttc acgcttccgg atgcctatgt cgcgctgggc 1680

tcggacatct ccaccgcgag cgacggcgag gtgcgcacga cgatcgagca tcgcaacctg 1740

ggcacctcgg cgcgccgact ggtcgtcgac ggcgctgccg tgaccacgcc gcagaccgtg 1800

tccggggcac ggtgggcgca tctggagggc gtcggcggct acgtgcttct cgacggtccg 1860

gtcgatctcc tcgccggggt cgacgagcgc gagggcacct ggcgccgcaa cagcaccaac 1920

gccgcggccg gcaccgaggt gctgcgccgc cggtggtacg gcaccctgag cctgtcgcac 1980

ggcgtgggag ggcaggcacg cggcggatac gcctacgccg tgcatccggg tgccgatgcc 2040

gagacgactg cagcagccgc ccgctccggt cgcttccgcg tgctgcgcaa cgacgaggtg 2100

gcacaggcga tccagcattc cggccacgtg accgccgccg cgttctggaa ggcgggcgca 2160

gtcggcgctc tcaccgccga ccgtgccgcc tgcgtgatcg cccgcatcac gcccggcatg 2220

gtgcggatgt cggtgagcga cccgacgcac agcgccacga cactggtgat cgatgtcgcc 2280

cagaccgcgg tcacccgggt gaagggagcc gacgccgccc gcgtcgcact cgcccgccgc 2340

ggcgagggca tccggctcac catcgacacc gccgggacgg cgggaacgac gctggagttc 2400

tcgctgcacc gctga 2415

<210> 3

<211> 804

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

<400> 3

Met Phe Thr Pro Ser Arg Arg Asn Val Leu Gln Leu Gly Gly Phe Ala

1 5 10 15

Leu Ala Ser Ala Leu Leu Met Asp Ala Gly Arg Pro Leu Thr Ala Ser

20 25 30

Ala Ser Leu Gln Pro Leu Ser Val Gly Val Pro Glu Ile Glu Ala Leu

35 40 45

Arg Thr Arg Trp Val Glu Thr Leu Thr Gly Arg Gly Ile Ile Ser Gly

50 55 60

Ser Pro Ala Thr Phe Ala Ala Ala Ile Ala Arg Gln Asp Arg Gly Thr

65 70 75 80

Asp Ala Leu Leu Ala Lys Ile Ser Pro Thr Ala Thr Arg Tyr Phe Ser

85 90 95

Asp Gln Asp Trp Ser Ile Gly Ala Thr Glu Ile Ala Lys Ser Asn Ala

100 105 110

Met Arg Met Asn Tyr Ser Gly Ile Gln Ser Leu Ala Val Ser Trp Ser

115 120 125

Thr Pro Gly Ser Lys His Glu Gly Ser Ala Val Val Leu Asp Ala Ala

130 135 140

Leu Arg Gly Leu Ala His Met His Glu Arg Val Tyr Asn Pro Asn Thr

145 150 155 160

Gln Trp Trp Gly Asn Trp Trp Ser Trp Asn Ile Gly Ala Ala Gln Pro

165 170 175

Leu Ala Asn Thr Met Ala Leu Leu His Asp Glu Leu Asp Gln Thr Glu

180 185 190

Ile Asp Ala Tyr Cys Ala Ser Ile Asp His Phe Ile Pro Gly Arg Asp

195 200 205

Pro Arg Met Gln Leu His Pro Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Gly Ala

210 215 220

Asn Arg Val Asp Ile Cys Gln Ala Ile Ile Val Arg Ala Ile Ala His

225 230 235 240

Pro Asp Pro Asp Leu Leu Arg Ala Ala Val Thr Ala Leu Ser Asp Thr

245 250 255

Trp Gln Tyr Ile Thr Glu Gly Asn Gly Phe Phe Arg Asp Gly Ser Phe

260 265 270

Val Gln His Ser Thr Ile Gly Tyr Thr Gly Thr Tyr Gly Leu Val Leu

275 280 285

Leu Gly Gly Leu Ala Lys Leu Phe Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ala Phe

290 295 300

Asp Val Thr Asp Pro Ser Arg Ser Asn Val Ser Gly Phe Val Glu Ser

305 310 315 320

Ser Phe Ala Pro Leu Met Phe Arg Gly Gln Met Met Asp Ala Val Arg

325 330 335

Gly Arg Ala Val Ala Arg Tyr Ala Glu Arg Ser Ile Ser Asn Gly Asn

340 345 350

Asp Leu Ile Glu His Thr Leu Arg Leu Ala Gln Ser Ala Asp Ala Ala

355 360 365

Thr Ala Ala Arg Trp Arg Gly Leu Cys Arg Gln Trp Ile Glu Ser Asn

370 375 380

Ser Ala Ala Asn Ile Thr Thr Thr Thr Ser Ile Val Arg Leu Ser Leu

385 390 395 400

Val Thr Glu Leu Leu Asn Ser Asp Ala Val Ala Val Ala Asp Pro Thr

405 410 415

Gly Pro Arg Leu Phe Pro Ala Met Asp Arg Leu Val His Arg Ala Ala

420 425 430

Asp Gly Ser Trp Ala Leu Ala Val Ala Met Cys Ser Asn Arg Ile Ala

435 440 445

Trp His Glu Gly Thr Glu Ala Glu Asn Phe Glu Gly Val Lys Thr Ser

450 455 460

Gln Gly Met Thr Tyr Leu Tyr Leu Arg Gly Asp Glu Asp His Phe Asp

465 470 475 480

Asp Glu Phe Trp Ser Thr Ser Asp Leu Ala Ser Pro Pro Gly Thr Thr

485 490 495

Val Asp Leu Thr Pro Leu Pro Arg Asn Pro Glu Gly Glu Trp Gly Glu

500 505 510

Arg Thr Pro Ala Asn Glu Trp Thr Gly Gly Val Thr Leu Glu Asp Thr

515 520 525

Ala Leu Ala Ala Met His Leu Val Ala Pro Gly Gly Thr Gly Leu Val

530 535 540

Ala Arg Lys Val Trp Phe Thr Leu Pro Asp Ala Tyr Val Ala Leu Gly

545 550 555 560

Ser Asp Ile Ser Thr Ala Ser Asp Gly Glu Val Arg Thr Thr Ile Glu

565 570 575

His Arg Asn Leu Gly Thr Ser Ala Arg Arg Leu Val Val Asp Gly Ala

580 585 590

Ala Val Thr Thr Pro Gln Thr Val Ser Gly Ala Arg Trp Ala His Leu

595 600 605

Glu Gly Val Gly Gly Tyr Val Leu Leu Asp Gly Pro Val Asp Leu Leu

610 615 620

Ala Gly Val Asp Glu Arg Glu Gly Thr Trp Arg Arg Asn Ser Thr Asn

625 630 635 640

Ala Ala Ala Gly Thr Glu Val Leu Arg Arg Arg Trp Tyr Gly Thr Leu

645 650 655

Ser Leu Ser His Gly Val Gly Gly Gln Ala Arg Gly Gly Tyr Ala Tyr

660 665 670

Ala Val His Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Thr Ala Ala Ala Ala Arg

675 680 685

Ser Gly Arg Phe Arg Val Leu Arg Asn Asp Glu Val Ala Gln Ala Ile

690 695 700

Gln His Ser Gly His Val Thr Ala Ala Ala Phe Trp Lys Ala Gly Ala

705 710 715 720

Val Gly Ala Leu Thr Ala Asp Arg Ala Ala Cys Val Ile Ala Arg Ile

725 730 735

Thr Pro Gly Met Val Arg Met Ser Val Ser Asp Pro Thr His Ser Ala

740 745 750

Thr Thr Leu Val Ile Asp Val Ala Gln Thr Ala Val Thr Arg Val Lys

755 760 765

Gly Ala Asp Ala Ala Arg Val Ala Leu Ala Arg Arg Gly Glu Gly Ile

770 775 780

Arg Leu Thr Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Thr Leu Glu Phe

785 790 795 800

Ser Leu His Arg

Claims

1.一株微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株，2016年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13421，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.如权利要求1所述的微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株的培养方法，其特征在于，步骤如下：

(2)取步骤(1)制得的种子液，按1～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃、转数为150～220转/分钟的条件下，扩大培养1～3天，制得微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌液。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基，每升组分如下：

碳源1～10g、胰蛋白胨5～15g、酵母提取物3～8g、NaCl 20～40g、KH₂PO₄ 2～5g、K₂HPO₄5～10g、(NH4)₂SO₄ 1～5g、MgSO₄·7H₂O 1～5mg、FeSO₄·7H₂O 2～4mg，水定容至1升，pH值为6.5～7.5；

所述碳源选自硫酸软骨素、透明质酸中的一种。

4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的液体培养基，每升组分如下：

5.一种来源于权利要求1所述微杆菌(Microbacterium sp.)WS15菌株的广谱糖胺聚糖裂解酶TT16，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.权利要求5所述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一种重组表达载体，在表达载体中插入了权利要求6所述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的编码基因。

8.一种重组菌，在宿主细胞中转入了权利要求7所述的重组表达载体。

9.权利要求6所述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的编码基因、权利要求7所述重组表达载体、权利要求8所述重组菌在制备广谱糖胺聚糖裂解酶TT16中的应用。

10.权利要求5所述广谱糖胺聚糖裂解酶TT16的在降解透明质酸、硫酸软骨素和制备不饱和寡糖中的应用。