CN109628347A - 一株发光杆菌fc615及其培养方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株发光杆菌FC615及其培养方法与应用。本发明中发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615，2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.16918。发光杆菌FC615菌株可以制备糖胺聚糖裂解酶，该酶对透明质酸的比活为15U/mg、对硫酸软骨素的比活为45U/mg；可应用于医药及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。

Description

一株发光杆菌FC615及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及一株发光杆菌FC615及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。

背景技术

糖胺聚糖(Proteoglycans，GAGs)又名粘多糖(Mucopolysacchride)、酸性粘多糖(Acid/Acidic Mucopoly saccharide)、硫酸粘多糖(Sulphuric Mucopolysaccharide)、硫酸酯多糖(Sulphate Polysaccharide)、结缔组织多糖(Connective TissuePolysaccharide)等，是广泛存在于动物细胞细胞表面和细胞基质中的线性直链多糖，由重复的二糖单位组成，主要包括硫酸软骨素/硫酸皮肤素(Chondroitin Sulfate/DermatanSulfate，CS/DS)，透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)，肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/HeparanSulfate，Hep/HS)，硫酸角质素(Keratan Sulfate，KS)。糖胺聚糖由于不同修饰酶的硫酸化和乙酰化作用，导致其结构复杂。其中硫酸软骨素(CS)是最常见的一种糖胺聚糖，是硫酸化线性多糖，由己糖醛酸(D-葡萄糖醛酸)与己糖胺(N-乙酰半乳糖胺)组成的二糖单位经β-1,4-糖苷键连接而成，其中D-葡萄糖醛酸常被C5-差向异构酶作用转变为L-艾杜糖醛酸糖胺聚糖，形成硫酸皮肤素(DS)。CS/DS与各种蛋白特异性相互作用，参与了细胞的增值和分化、细胞间的识别、细胞转移、组织形态发生、癌变等各种生理和病理过程，同时不同硫酸化位点的糖链在生命活动中行使不同功能，在医药及功能食品中也得到了广泛的应用。

由于分子量不均一，硫酸化模式差异以及糖醛酸的异构化使糖胺聚糖的结构高度复杂，不同来源和不同批次的同一种糖胺聚糖在活性上也存在着很大的差异；另一方面，由于糖胺聚糖的分子量过大不易吸收，生物利用度低。因此制备结构均一或相对均一的特定功能区寡糖，其分子量小利用率高，结构活性确定，有利于糖胺聚糖在食品和医药方面的利用。尽管近年来各种波谱技术，如高分辨率质谱和核磁共振技术等得到快速发展并被广泛应用于糖链分析领域，但是在分析复杂的糖胺聚糖多糖及高分子量寡糖时仍然面临着巨大的困难。目前，对复杂糖胺聚糖糖链的结构和功能分析主要是通过特异性降解酶和波谱技术相结合的方法，其中特异性降解酶发挥了至关重要的作用。同时在糖胺聚糖活性寡糖制备时，酶法明显优于化学方法，酶法特异高，反应条件温和，环境友好，适于对酸碱等化学条件敏感的硫酸化糖胺聚糖寡糖的制备。

糖胺聚糖降解酶在研究糖胺聚糖结构与功能以及活性寡糖制备方面十分重要，根据降解机制主要分为水解酶和裂解酶两大类。水解酶主要来自于高等动物，在动物体内一直未发现专一的硫酸软骨素/硫酸皮肤素降解酶家族，越来越多的研究显示哺乳动物体内硫酸软骨素/硫酸皮素的降解主要是由透明质酸酶家族的一些酶来完成的，最近透明质酸酶家族成员HYAL4被鉴定为一个硫酸软骨素水解酶。而裂解酶的主要来源是微生物，糖胺聚糖裂解酶主要分为以下几类：肝素酶，作用于肝素、硫酸乙酰肝素等相关结构糖胺聚糖；硫酸软骨素酶，主要作用于硫酸软骨素/硫酸皮肤素，包括有硫酸软骨素ABC酶、硫酸软骨素AC酶、硫酸软骨素B酶；透明质酸酶，主要降解透明质酸，其中大部分透明质酸酶可以同时降解非硫酸化及N-乙酰半乳糖胺4位(CS-A)或6(CS-C)位羟基硫酸化的低硫酸化度硫酸软骨素区段，但降解速度远低于降解透明质酸。

糖胺聚糖降解酶目前已经广泛应用于高活性药用及功能寡糖的酶法制备，同时在很多医疗食品领域的发展前景广阔。透明质酸酶可在整形手术中对透明质酸进行降解，促进药物的吸收和扩散，治疗糖尿病性硬肿症、硬皮病、瘢痕疙瘩等疾病。硫酸软骨素裂解酶ABC(CSase ABC)具有缓解退行性视网膜的功能，能够提高后肢运动能力，降低退变囊性纤维粘液，减轻腰椎间盘突出症的症状。此外，研究还发现使用CSase ABC处理软骨时，软骨细胞和表面的粘附能力将大大增强。肝素酶可抑制肿瘤细胞增殖，制备抗凝血药物低分子量肝素(Low molecular weight heparin，LWMH)和超低分子量肝素(Ultra low molecularweight heparin，ULMWH)，同时作为肝素拮抗药物在医药领域具有十分重要的意义。

综上所述，糖胺聚糖降解酶不仅是糖胺聚糖结构功能研究方面重要的工具，而且在糖胺聚糖活性寡糖制备和疾病治疗中有着重要的应用价值。但目前具有应用价值的高活力糖胺聚糖降解酶很少且大多来源于陆地，海洋来源的糖胺聚糖降解酶很少，因此在海洋来源中寻找新型糖胺聚糖降解菌并从其基因组中发现和鉴定新型的糖胺聚糖降解酶具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一株发光杆菌FC615及其培养方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一株发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615，2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.16918。

上述发光杆菌FC615，革兰染色阴性，细菌呈杆状，长1.2～3.5μm、宽0.5～1.3μm，无芽胞和荚膜，有鞭毛，运动非常活泼；悬滴观察，可见其呈穿梭运动。

上述发光杆菌FC615菌液的培养方法，步骤如下：

(1)取发光杆菌FC615接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为28～30℃，溶氧为25～30％的条件下，扩大培养2～5小时，制得发光杆菌FC615菌液。

根据本发明优选的，所述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨5～15g、酵母提取物3～8g、海水素30～35g，水1000mL，pH值为6.5～7.5。

上述发光杆菌FC615在制备糖胺聚糖裂解酶中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)取发光杆菌FC615菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧为25～30％的条件下，扩大培养2～5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01～0.02％，继续培养24～72小时，制得发光杆菌FC615发酵液；

(3)取步骤(3)制得的发光杆菌FC615发酵液，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度大于等于80％，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得糖胺聚糖裂解酶。

根据本发明优选的，步骤(1)和(2)所述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨5～15g、酵母提取物3～8g、海水素30～35g，水1000mL，pH值为6.5～7.5。

根据本发明优选的，步骤(3)所述固液分离采用离心的方式，条件为：12,000rpm离心15～30min。

有益效果

本发明首次分离得到的发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615菌株，可以制备糖胺聚糖裂解酶，该酶对透明质酸的比活为15U/mg、对硫酸软骨素的比活为45U/mg；可应用于医药及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1、发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615的电子显微镜照片；

图2、糖胺聚糖裂解酶LDRase的蛋白质三维结构模型；

图3、重组糖胺聚糖裂解酶LDRase表达情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中：泳道1、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道2、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道4、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道5、重组菌破壁后沉淀，上样量10μL。

图4、糖胺聚糖裂解酶LDRase降解硫酸软骨素A所得产物的HPLC分析图；

图中，CSA为硫酸软骨素A，1为CS二糖；

图5、糖胺聚糖裂解酶LDRase降解硫酸软骨素E所得产物的HPLC分析图；

图中，CSE为硫酸软骨素E，1为CS二糖；

图6、糖胺聚糖裂解酶LDRase降解透明质酸所得产物的HPLC分析图；

图中，HA为透明质酸，1为HA二糖。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

生物材料：

发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615菌株，2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.16918。

实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1、发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615的获得

取海泥浸出液，上清液l mL加入到9mL无菌水中，稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的浓度梯度，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于唯一碳源固体培养基上，于30℃恒温培养1天，菌落计数，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于相应的全营养琼脂平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，以备后用。

把培养出来的菌株，分别接种到唯一碳源液体培养基上，进行培养。200rpm、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，以及取培养上清进行咔唑反应检测碳源的消耗情况。依据上述两个指标选择产酶菌株。将在各唯一碳源液体培养基中均浑浊以及咔唑反应数值较小的菌株挑取到全营养培养基上培养，并保种记为FC615。

所述FC615经鉴定为发光杆菌(Photobacterium sp.)，该菌株革兰染色阴性，细菌呈杆状，长1.2～3.5μm、宽0.5～1.3μm，无芽胞和荚膜，有鞭毛，运动非常活泼；悬滴观察，可见其呈穿梭运动。发光杆菌FC615的电子显微镜照片如图1所示。

上述唯一碳源液体培养基每升组分如下：

海水素33g，(NH₄)₂SO₄ 2g，碳源(硫酸软骨素、透明质酸、肝素中的一种)，水1000mL，pH值为7.2。另添加琼脂20g即为唯一碳源固体培养基。

上述发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615，2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.16918。

实施例2、发光杆菌FC615菌液的培养

发光杆菌FC615菌液的培养方法，步骤如下：

(1)取发光杆菌FC615菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为200rpm的条件下，摇床培养10小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按7％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧(即溶解氧饱和度)为30％的条件下，扩大培养2小时，制得发光杆菌FC615菌液。

上述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、海水素33g、水1000mL，pH值为7.2。

实施例3、发光杆菌FC615在制备糖胺聚糖裂解酶中的应用

发光杆菌FC615在制备糖胺聚糖裂解酶中的应用，步骤如下：

(1)取发光杆菌FC615菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为300rpm的条件下，摇床培养16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按8％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧(即溶解氧饱和度)为25％的条件下，扩大培养5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01～0.02％，继续培养72小时，制得发光杆菌FC615发酵液；

(3)取步骤(3)制得的发光杆菌FC615发酵液，经12,000rpm离心20min，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度为80％，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得糖胺聚糖裂解酶。

上述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、海水素33g、水1000mL，pH值为7.2。

实施例4发光杆菌FC615基因组DNA的提取

将发光杆菌FC615接种至液体培养基(同实施例2)中，在30℃、200rpm的条件下，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8；取培养菌液40mL，在12,000rmp条件下离心25min，收集菌体沉淀，用20mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0)洗涤，在12,000rmp条件下离心25min，收集菌体沉淀；

上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0)12.0mL，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶各560μL，其终浓度约800μg/mL；冰浴1.0h后，37℃温浴2h，至溶液粘稠；加入10wt％SDS 0.82mL，100mg/mL的蛋白酶K溶液60μL，52℃水浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；10,000g、4℃条件下离心10min，转移上清，加入2.0mL的NaAc-HAc(pH 5.2，3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇，混匀；用1.0mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的EP离心管中，以70wt％的乙醇(贮于-20℃)，洗涤2次，微离心后弃上清；10,000g、4℃条件下离心3min，彻底弃掉上清；样品于无菌工作台中，酒精灯下风吹干燥；用无菌去离子水重悬溶解DNA样品，4℃过夜，得到大分子量基因组DNA。

实施例5、发光杆菌FC615基因组扫描及其序列分析

将实施例4制得的大分子量基因组DNA进行测序(美吉生物公司)。用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic LocalAlignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

NCBI分析结果显示发光杆菌FC615基因组上携带一个糖胺聚糖裂解酶基因ldrase，ldrase基因编码区长3045bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与Vibriosp.FC509的全基因组序列(NCBI注册号：AIL54323)中hclase基因的811个氨基酸有22％的同源性。

ldrase基因编码的糖胺聚糖裂解酶LDRase由1014个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白质的理论分子量约为112kD。用Simple Modular ArchitectureResearch Tool(SMART,http://smart.embl_heidelberg.de/)分析糖胺聚糖裂解酶LDRase的结构信息，结果显示N端无信号肽序列，第1-778位氨基酸序列属于糖胺聚糖裂解酶超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对糖胺聚糖裂解酶LDRase的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的LDRase蛋白质三维结构模型如图2所示。

实施例6、LDRsae基因在大肠杆菌中的重组表达

以实施例4制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物如下：

正向引物LDRase-F：GCATATGACTGCATGTTCTGGGGTCACTGTTACC；

反向引物LDRase-R：GAAGCTTTAGCACAGGCTGCAGAGTTAGCTCCTG；

正向引物下划线标注的是限制性内切酶Nco I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶HindⅢ位点。Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物用Nco I和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Novagen公司的pET-22b载体用Nco I和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。Nco I和HindⅢ均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。

将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切的pET-22b载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株后涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物LDRase-F和反向引物LDRase-R进行菌液PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去生工生物工程股份有限公司测序，结果表明，在pET-22b的Nco I和HindⅢ酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的ldrase基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET22b-LDRase。

将pET22b-LDRase转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组糖胺聚糖裂解酶LDRase诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组糖胺聚糖裂解酶LDRase的表达情况，结果如图3所示，重组糖胺聚糖裂解酶LDRase在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例7、LDRase降解糖胺聚糖产物的高效液相(HPLC)分析

将质量浓度为1％透明质酸或硫酸软骨素底物、LDRase酶液、150mM Tris-HCl缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，30℃条件下反应，酶解36h的产物进行HPLC分析。HPLC分析条件为：凝胶柱：superdex peptide 10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图4～6所示，从图4～6可以看出LDRase降解透明质酸和硫酸软骨素的终产物主要为不同聚合度的寡糖，可被用于糖胺聚糖寡糖的制备以及糖胺聚糖构效关系研究。

实施例8、糖胺聚糖裂解酶LDRase在药物中的应用

糖胺聚糖裂解酶LDRase可以用于增强药物的吸收或/和递送，包括但不限于经过皮肤途径辅助药物渗透。示例性的药物包括皮质类固醇如氢化可的松、泼尼松龙、倍氯米松丙酸酯、氟米松、去炎松、氯倍他索丙酸酯等；镇痛药和/或抗炎剂如对乙酰氨基酚、甲灭酸、氟芬那酸、双氯芬酸、双氯芬酸钠、阿氯芬酸、羟布宗、保泰松、布洛芬、氟比洛芬、水杨酸、薄荷醇、樟脑、萘普生等；抗高血压药如吲哚洛尔、茚诺洛尔、心痛定等；抗生素如青霉素、四环素、土霉素、新霉素、红霉素、氯霉素等；麻醉剂如利多卡因、苯佐卡因等以及其他药物。

通过敷布、纱布、或其它皮肤涂抹途径施用糖胺聚糖裂解酶。糖胺聚糖裂解酶溶液可以涂敷到合适的敷贴上(如5-6层纱布)。敷贴应覆盖受损区域，且敷贴本身用蜡纸或绷带固定。应用的制剂的量取决于损伤的面积，通常为5-100IU/cm²。敷贴应每天使用12-24小时，连续使用10-100天。

对于局部使用，溶液、悬浮液、凝胶剂、糊剂、软膏、乳膏或糖胺聚糖裂解酶的其他配方(有或没有另外的活性剂，都可以使用)。溶液等配方中包含制药和化妆品领域用于局部使用可接受的稀释剂、辅助剂和赋形剂的，这些其它配方主要包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其它有机酸盐，抗氧化剂如抗坏血酸，肽、蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、天然的或合成的油，氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸，单糖、二糖和其它碳水化合物如纤维素或其衍生物、葡萄糖、乳糖、甘露糖或糊精，螯合剂如EDTA，糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇，无机盐如氯化钠，和非离子表面活性剂如吐温、聚乙二醇。

其中，糖胺聚糖裂解酶溶液是糖胺聚糖裂解酶LDRase的冻干粉末悬浮或溶解在含有0.1％-10％蔗糖、1％-20％甘油的溶剂中，溶液的pH为6.5-8.5。

糖胺聚糖裂解酶组合物可以通过口服给药或肠胃外给药，并且糖胺聚糖裂解酶组合物可以与合适的递送载体结合后给药。

可通过活性化合物与固体赋形剂的组合获得用于口服使用的糖胺聚糖裂解酶药物制剂。上述的组合物加入合适的辅助剂混合使用。如果需要的话，合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白质，例如糖、纤维素、牛血清白蛋白等。

糖胺聚糖裂解酶酶与药物(如氢化可的松，抗生素，维生素)组合。以口服凝胶剂、膏剂、或悬浮液的形式通过静脉内、皮下或肌内注射给药；或以软膏剂、乳膏剂，面罩局部给药；以及用作化妆品辅助剂，用于增强皮肤的吸收。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一株发光杆菌FC615及其培养方法与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3045

<212> DNA

<213> 发光杆菌（Photobacterium sp.）

<400> 1

atgactgcat gttctggggt cactgttacc caaccgcttg agcaagtatc tccaccgccg 60

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gggtttggta tccaccgtta caacgacaac atggtgacca tgaaggcata caacagtaat 1920

gtctggtcgt cggaaatcta ttatcgcgac aaccgttatg gccgttacca gagtcatggc 1980

gcggtgcaag tcgtgccgtt cggcaagcag gcagatattg gctttagcca agagggctgg 2040

gactggaacc gcaacccggg gacgacaaca atccacttgc cgctggagca gcttgatagc 2100

ccgaactcgc acacactgat gttgcgaggt gatcagccat atagcggtgc ttcttcactc 2160

gacgggcaat ttggtatgtt cgcattcaag ttcaaagcgc cgtcgatgga taagtttgat 2220

agtagcttta ccgcgagaaa gtcgaccttt tctgcagccg acagggtggt gatgctagga 2280

accgatatca gcaactcgag tgcggataac gcgaccgaaa cgaccttatt ccagcacgga 2340

attaccccac aggccaacgc gattttgatt aatggcgagg cggttagcga gatgccttat 2400

caagcgcagc ttggccaagg tgattggttg atggacggtc acggcaatgg ctatttgatc 2460

accagtgatg tgacggtaga agttaggcgc cagcatcagc agtcggccaa tgataaaaac 2520

cgtcagccta ccgaagggaa cttcgcggtg gcttggataa accatggcaa tgctccgtcg 2580

ggtgcgggtt atgagtacct gttggtgctt gatgcgacag cggagaaaat gacgtcgctg 2640

gcaagtgctt atcaggccac cggtgagaag ccttacgagg tgctccgcga tgatcgcagt 2700

gtgcatgtgt tacgggataa gcaaacgggt gtgaccgcct atgctgcctt tgagggtgtt 2760

agcctagatg gtggcgtggt cacccaggtt gcgcagcctg ccatcgtcat gacccgagag 2820

ttggcgaacg gtcaattgca ggtatcgggg gtgacaccgg atctcaatat gactcgctat 2880

accgcagcca agccaaccag tatcagtgtc acactggcag ggcaatggca gccggttacg 2940

ccaaatgaca agatcacggt aagtgcgggc gcatcgtcga ccaccctgac gtttgagatt 3000

tactttggca tggtgcagga gctaactctg cagcctgtgc tataa 3045

<210> 2

<211> 1014

<212> PRT

<213> 发光杆菌（Photobacterium sp.）

<400> 2

Met Thr Ala Cys Ser Gly Val Thr Val Thr Gln Pro Leu Glu Gln Val

1 5 10 15

Ser Pro Pro Pro Val Met Gln Ser Gln Ile Leu Ala Met Thr Gly Glu

20 25 30

Thr Val Pro Asp Tyr Ala Glu Ala Gly Lys Gly Ser Val Leu Ser Leu

35 40 45

Ser Lys Ala Arg Tyr Val Leu Gly Glu Gln Ser Leu Gln Trp Asp Trp

50 55 60

Thr Ser Asn Ser Thr Val Ile Phe His Gln Pro Ile Gln Leu Val Thr

65 70 75 80

Asp Met Glu Gly Arg Arg Ala Trp Gly Arg Ala Ala Thr Gln Val Leu

85 90 95

Ser Phe Trp Ile Tyr Asn Glu Val Pro Val Asp Asp Tyr Met Val Val

100 105 110

Asp Leu Gly Arg Gly Leu Ser Gly Thr Ser Asn Ala Asp Ala Gly Phe

115 120 125

Lys Val Tyr Met Asn Phe Thr Gly Trp Arg Ala Ile Gly Val Ser Leu

130 135 140

Gln Asn Asp Ile Gln Gly Arg Glu Val Glu Gly Leu Gly Ile Thr Asp

145 150 155 160

Asn Ala Ala Gly Glu Gly Arg Gly Leu Asn Ser Met Pro Gly Gly Pro

165 170 175

Arg Ser Asp Met Asp Ser Ile Arg Phe Thr Ala Pro Ser Lys Ala Lys

180 185 190

Gln Gly Thr Phe Tyr Val Asp Arg Val Met Ile Ser Val Asp Asp Ala

195 200 205

Arg Tyr Gln Trp Ser Asp Asp Gln Val Thr Thr Arg Tyr Asp Ile Pro

210 215 220

Glu Ile Asp Phe Gly Leu Pro Ala Gln Leu Glu Ser Ala Gln Pro Glu

225 230 235 240

Glu Ile Ala Ala Ala Glu Ser Ile Arg Glu Ser Leu Val Asp Val Phe

245 250 255

Ile Asp Ala Lys Arg Leu Lys Gly Val Lys Ala Phe Asn Ser Leu Glu

260 265 270

Thr Val Arg Asp Gln Tyr Ala Ser Leu Arg Ile Arg Arg Asp Asp His

275 280 285

Gly Val Leu Ser Gly Arg His Ile Ile Thr Gly Lys Gln Lys Val Leu

290 295 300

Tyr Gln Pro Glu Phe Met Lys Glu Glu Asp Lys Ala Leu Phe Thr Asp

305 310 315 320

Tyr Val Thr Leu Ser Glu Tyr Ser Asn Ile Leu Phe Asn Ile Gly Arg

325 330 335

Phe Trp His Asn Thr Asp Asp Pro Ala Val Lys Gln Glu Leu Ala Asp

340 345 350

Met Tyr Val Leu Met Thr Glu His Ile Leu Asp Gln Gly Phe Val Asp

355 360 365

Gly Ser Ser Leu Val Thr Thr His His Trp Gly Tyr Ser Ser Arg Trp

370 375 380

Trp Tyr Ile Ser Ala Met Leu Met Ser Asp Val Leu Thr Glu Ala Glu

385 390 395 400

Leu Arg Gln Pro Ile Phe Asp Ala Leu Leu Trp Tyr Ser Arg Glu Phe

405 410 415

Lys Ala Asn Phe Asp Met Val Ala Gly Pro Glu Ser Ser Asp Leu Asp

420 425 430

Tyr Phe Asn Thr Leu Ser Arg Gln His Leu Ala Leu Leu Met Leu Glu

435 440 445

Pro Asp Gln Asp Arg Arg Ile Ala Leu Leu Lys Lys Phe Gly Asn Tyr

450 455 460

Ile Asn Ile Ala Leu Ser Gln Thr Pro Pro Gly Gly Tyr Asp Gly Leu

465 470 475 480

Arg Pro Asp Gly Thr Ala Trp Arg His Glu Gly Asn Tyr Pro Gly Tyr

485 490 495

Ser Phe Pro Ala Phe Asn Asn Ala Ala Gln Leu Val Tyr Met Leu Gln

500 505 510

Gly Thr Pro Phe Ser Val Ser Ser Glu Gly Arg Ala Ala Leu Lys Lys

515 520 525

Ala Met Leu Ser Ala Trp Ile Tyr Ser Asn Pro Glu Val Gly Leu Gly

530 535 540

Leu Ser Gly Arg His Pro Phe Asn Pro Pro Ala Val Arg His Leu Asp

545 550 555 560

Glu Ser Tyr Arg Trp Leu Ala Leu Thr Gly Asn Pro Glu Thr Gly Glu

565 570 575

Lys Val Asp Lys Ala Leu Ala Ala Ala Tyr Leu Gln Ile Thr Gly Lys

580 585 590

Thr Gln Ala Asp Ser Val Ala Leu Phe Gly Glu Thr Ile Thr Pro Ala

595 600 605

Ala Leu Pro Gln Gly Tyr Trp Ala Phe Asn Gly Gly Gly Phe Gly Ile

610 615 620

His Arg Tyr Asn Asp Asn Met Val Thr Met Lys Ala Tyr Asn Ser Asn

625 630 635 640

Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Tyr Arg Asp Asn Arg Tyr Gly Arg Tyr

645 650 655

Gln Ser His Gly Ala Val Gln Val Val Pro Phe Gly Lys Gln Ala Asp

660 665 670

Ile Gly Phe Ser Gln Glu Gly Trp Asp Trp Asn Arg Asn Pro Gly Thr

675 680 685

Thr Thr Ile His Leu Pro Leu Glu Gln Leu Asp Ser Pro Asn Ser His

690 695 700

Thr Leu Met Leu Arg Gly Asp Gln Pro Tyr Ser Gly Ala Ser Ser Leu

705 710 715 720

Asp Gly Gln Phe Gly Met Phe Ala Phe Lys Phe Lys Ala Pro Ser Met

725 730 735

Asp Lys Phe Asp Ser Ser Phe Thr Ala Arg Lys Ser Thr Phe Ser Ala

740 745 750

Ala Asp Arg Val Val Met Leu Gly Thr Asp Ile Ser Asn Ser Ser Ala

755 760 765

Asp Asn Ala Thr Glu Thr Thr Leu Phe Gln His Gly Ile Thr Pro Gln

770 775 780

Ala Asn Ala Ile Leu Ile Asn Gly Glu Ala Val Ser Glu Met Pro Tyr

785 790 795 800

Gln Ala Gln Leu Gly Gln Gly Asp Trp Leu Met Asp Gly His Gly Asn

805 810 815

Gly Tyr Leu Ile Thr Ser Asp Val Thr Val Glu Val Arg Arg Gln His

820 825 830

Gln Gln Ser Ala Asn Asp Lys Asn Arg Gln Pro Thr Glu Gly Asn Phe

835 840 845

Ala Val Ala Trp Ile Asn His Gly Asn Ala Pro Ser Gly Ala Gly Tyr

850 855 860

Glu Tyr Leu Leu Val Leu Asp Ala Thr Ala Glu Lys Met Thr Ser Leu

865 870 875 880

Ala Ser Ala Tyr Gln Ala Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Val Leu Arg

885 890 895

Asp Asp Arg Ser Val His Val Leu Arg Asp Lys Gln Thr Gly Val Thr

900 905 910

Ala Tyr Ala Ala Phe Glu Gly Val Ser Leu Asp Gly Gly Val Val Thr

915 920 925

Gln Val Ala Gln Pro Ala Ile Val Met Thr Arg Glu Leu Ala Asn Gly

930 935 940

Gln Leu Gln Val Ser Gly Val Thr Pro Asp Leu Asn Met Thr Arg Tyr

945 950 955 960

Thr Ala Ala Lys Pro Thr Ser Ile Ser Val Thr Leu Ala Gly Gln Trp

965 970 975

Gln Pro Val Thr Pro Asn Asp Lys Ile Thr Val Ser Ala Gly Ala Ser

980 985 990

Ser Thr Thr Leu Thr Phe Glu Ile Tyr Phe Gly Met Val Gln Glu Leu

995 1000 1005

Thr Leu Gln Pro Val Leu

1010

Claims (7)

1.一株发光杆菌(Photobacterium sp.)FC615，2018年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.16918。

2.权利要求1所述的发光杆菌FC615菌液的培养方法，其特征在于，步骤如下：

(1)取发光杆菌FC615接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为28～30℃，溶氧为25～30％的条件下，扩大培养2～5小时，制得发光杆菌FC615菌液。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨5～15g、酵母提取物3～8g、海水素30～35g，水1000mL，pH值为6.5～7.5。

4.权利要求1所述的发光杆菌FC615在制备糖胺聚糖裂解酶中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)取发光杆菌FC615菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧为25～30％的条件下，扩大培养2～5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01～0.02％，继续培养24～72小时，制得发光杆菌FC615发酵液；

(3)取步骤(3)制得的发光杆菌FC615发酵液，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度大于等于80％，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得糖胺聚糖裂解酶。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)和(2)所述液体培养基每升组分如下：

胰蛋白胨5～15g、酵母提取物3～8g、海水素30～35g，水1000mL，pH值为6.5～7.5。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述固液分离采用离心的方式，条件为：12,000rpm离心15～30min。