CN112126606B

CN112126606B - 一株发光杆菌qa16及其培养方法与应用

Info

Publication number: CN112126606B
Application number: CN202011114028.XA
Authority: CN
Inventors: 李福川; 张庆冬; 路丹荣; 魏琳
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-10-18
Filing date: 2020-10-18
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2040-10-18
Also published as: CN112126606A

Abstract

本发明涉及一株发光杆菌QA16及其培养方法与应用。本发明中发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。发光杆菌QA16菌株可以制备硫酸软骨素裂解酶，该酶可降解硫酸软骨素及硫酸皮肤素，是一类硫酸软骨素ABC酶；可应用于硫酸软骨素的结构研究，也可应用于医药及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。

Description

一株发光杆菌QA16及其培养方法与应用

技术领域

本发明涉及一株发光杆菌QA16及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。

背景技术

硫酸软骨素(CS)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺组成的二糖单位通过β-1,4糖苷键重复链接而成的酸性直链阴离子多糖，是一类重要的糖胺聚糖，也是糖胺聚糖中结构较为复杂的典型代表。CS糖链中一般包含50-70个二糖单位，分子量在5000-50000Da之间。CS常广泛存在于动物细胞表面及细胞外基质中。大量研究表明，CS具有多种生物学功能，可参与机体一系列的生理和病理过程。CS合成过程中，在各种糖基修饰酶(硫酸基转移酶和C5差向异构酶)的作用下，不同羟基可被不同程度的硫酸化，并且部分D-葡萄糖醛酸被异构化为其差向异构体L-艾杜糖醛酸，从而转变为硫酸皮肤素(DS)区，在自然界中，CS和DS糖链常交替存在，形成高度复杂的CS/DS杂和结构。CS/DS糖链多从动物结缔组织中提取获得，大量存在于动物的软骨、皮肤、韧带和角膜等组织中。CS/DS通过与多种蛋白的相互作用来发挥生物学功能，如趋化因子、细胞因子、生长因子、酶、粘附因子以及细胞外基质组成成分等。且由于CS/DS糖链结构高度复杂，这种结构特点赋予了其功能的多样性，CS/DS作为一种重要的糖类药物及膳食营养物质，在防治骨关节炎、神经保护、心血管疾病等方面有重要应用。

硫酸软骨素钠和硫酸软骨素钙分别是国内外使用的第一代和第二代硫酸软骨素产品，但是这两代产品均面临着分子量大，难以透过细胞膜，生物利用度低，在抑制肿瘤发生、治疗脊柱损伤和轴突再生等方面很多功效难以得到有效的发挥等问题。第三代硫酸软骨素产品是低分子量的CS，低分子量的CS具有易吸收、溶解性好、粘度低以及能够高效的聚集在靶部分等优点，对关节炎、伤口愈合、冠心病等具有更好的治疗效果。研究发现不同分子量的CS药理活性也存在很大的区别，目前，制备低分子量CS主要采用的是酶解法，通过硫酸软骨素降解酶对CS/DS进行不完全降解获得的不同聚合度的寡糖，酶解法工艺简单、反应条件温和、容易控制，且不会对糖链中的硫酸基团造成破坏，在CS活性寡糖生产中至关重要。

细菌来源的CS/DS降解酶在研究CS/DS结构与功能以及活性寡糖制备方面十分重要，根据降解特性主要分为裂解酶及硫酸酯酶。其中广为应用的CS/DS裂解酶又分为：硫酸软骨素酶ABC、硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B、硫酸软骨素酶C四类。CS/DS裂解酶特异性降解CS/DS，产物为不饱和寡糖，低分子量CS/DS寡糖粘度低、溶解性好以及生物利用度高，具有更显著的生物活性。此外不同结构的寡糖生物活性具有显著的差异，目前寡糖鉴定技术主要采用波谱分析，如质谱法和核磁共振技术等，但是所需样品量大、设备昂贵以及解析过程复杂，增加了寡糖结构的鉴定难度。利用具有特殊活性的CS/DS裂解酶结合高效液相色谱分析技术所建立的酶法测序方法在pmol级别即可完成对寡糖结构的鉴定，并且分析过程十分简便，在寡糖结构与功能关系的研究中具有广泛的应用前景。CS/DS裂解酶因具有多种药用价值已成为一种新型的药用酶，在治疗椎间盘突出、囊性纤维病变引起的器官功能受阻、脊髓损伤部位的轴突再生以及视网膜出血等具有重要的作用。

综上所述，CS/DS降解酶不仅是CS/DS结构功能研究方面重要的工具，而且在CS/DS活性寡糖制备和疾病治疗中有着重要的应用价值。但目前具有应用价值的高活力CS/DS降解酶很少且大多来源于陆地，海洋来源的CS/DS降解酶更少，因此在海洋来源中寻找新型CS/DS降解菌具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一株发光杆菌QA16及其培养方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一株发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

上述发光杆菌QA16，革兰染色呈阴性，细菌呈杆状，长1.2～3.5μm、宽0.5～1.2μm，无芽胞和荚膜，有鞭毛，运动非常活泼；悬滴观察，可见其呈穿梭运动。

上述发光杆菌QA16菌液的培养方法，步骤如下：

(1)取发光杆菌QA16接种至液体培养基中，于温度为28～30℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为28～30℃，溶氧为25～30％的条件下，扩大培养2～5小时，制得发光杆菌QA16菌液。

根据本发明优选的，所述液体培养基每升组分如下：

K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 30g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄ 0.001g，NH₄Cl1g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，水1000mL，pH值为7.0。

上述发光杆菌QA16在制备硫酸软骨素裂解酶中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)取发光杆菌QA16菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按5～10％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧为25～30％的条件下，扩大培养2～5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01～0.02％，继续培养24～72小时，制得发光杆菌QA16发酵液；

(3)取步骤(3)制得的发光杆菌QA16发酵液，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度大于等于80％，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得硫酸软骨素裂解酶。

根据本发明优选的，步骤(1)和(2)所述液体培养基每升组分如下：

根据本发明优选的，步骤(3)所述固液分离采用离心的方式，条件为：12,000rpm离心15～30min。

一种硫酸软骨素裂解酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述硫酸软骨素裂解酶分离自发光杆菌QA16。

上述硫酸软骨素裂解酶的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述编码基因来源于发光杆菌QA16。

上述硫酸软骨素裂解酶在制备硫酸软骨素寡糖和/或硫酸皮肤素寡糖中的应用。

上述硫酸软骨素裂解酶在研究CS/DS结构与功能中的应用。

有益效果：

本发明首次分离得到的发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16菌株，可以制备硫酸软骨素裂解酶PCDase，该酶可降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素，降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素的终产物主要为不饱和四糖，是一类硫酸软骨素酶ABC；可应用于硫酸软骨素和硫酸皮肤素寡糖的制备、硫酸软骨素和硫酸皮肤素构效关系研究以及医药及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16的电子显微镜照片；

图2为硫酸软骨素裂解酶PCDase的蛋白质三维结构模型；

图3为重组硫酸软骨素裂解酶PCDase表达情况的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

其中：泳道1、蛋白质分子量标准，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD；泳道2、对照菌株破壁前菌体，上样量10μL，泳道3、重组菌破壁前菌体，上样量10μL，泳道4、重组菌破壁后上清，上样量10μL，泳道5、重组菌破壁后沉淀，上样量10μL；

图4为硫酸软骨素裂解酶PCDase降解硫酸软骨素A所得产物的HPLC分析图；

图中，1为CS四糖；

图5为硫酸软骨素裂解酶PCDase降解硫酸皮肤素所得产物的HPLC分析图；

图中，1为DS四糖。

具体实施方式

以下实施例的阐述，是为了全面公开本发明如何实施的一些常用技术，而不是为了限制本发明的应用范围。发明人已经尽最大努力确保实施例中各参数的准确性(例如量，温度，等等)，但是一些实验误差和偏差也应该予以考虑。除非另有说明，本发明中分子量是指重均分子量，温度是摄氏度。

生物材料：

发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16菌株，2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

实施例中涉及的药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1、发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16的获得

取海泥浸出液，上清液l mL加入到9mL无菌水中，稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的浓度梯度，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于唯一碳源固体培养基上，于30℃恒温培养1天，菌落计数，然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落，重复划线接种于相应的全营养琼脂平板上，直至纯化得到单菌落，然后转接于相应的琼脂斜面上，以备后用。

把培养出来的菌株，分别接种到唯一碳源液体培养基上，进行培养。200rpm、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，以及取培养上清进行咔唑反应检测碳源的消耗情况。依据上述两个指标选择产酶菌株。将在各唯一碳源液体培养基中均浑浊以及咔唑反应数值较小的菌株挑取到全营养培养基上培养，并保种记为QA16。

所述QA16经鉴定为发光杆菌(Photobacterium sp.)，该菌株革兰染色阴性，细菌呈杆状，长1.2～3.5μm、宽0.5～1.2μm，无芽胞和荚膜，有鞭毛，运动非常活泼；悬滴观察，可见其呈穿梭运动。发光杆菌QA16的显微镜照片如图1所示。

上述唯一碳源液体培养基每升组分如下：

K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 30g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄ 0.001g，NH₄Cl1g，硫酸软骨素A，水1000mL，pH值为7.0。另添加琼脂15g即为唯一碳源固体培养基。

上述发光杆菌(Photobacterium sp.)QA16，2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.20556。

实施例2、发光杆菌QA16菌液的培养

发光杆菌QA16菌液的培养方法，步骤如下：

(1)取发光杆菌QA16菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为200rpm的条件下，摇床培养10小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按7％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧(即溶解氧饱和度)为30％的条件下，扩大培养2小时，制得发光杆菌QA16菌液。

上述液体培养基每升组分如下：

实施例3、发光杆菌QA16在制备硫酸软骨素裂解酶中的应用

发光杆菌QA16在制备硫酸软骨素裂解酶中的应用，步骤如下：

(1)取发光杆菌QA16菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为300rpm的条件下，摇床培养16小时，制得种子液；

(2)取步骤(1)制得的种子液，按8％的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧(即溶解氧饱和度)为25％的条件下，扩大培养5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01～0.02％，继续培养72小时，制得发光杆菌QA16发酵液；

(3)取步骤(3)制得的发光杆菌QA16发酵液，经12,000rpm离心20min，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度为80％，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得硫酸软骨素裂解酶。

上述液体培养基每升组分如下：

实施例4发光杆菌QA16基因组DNA的提取

将发光杆菌QA16接种至液体培养基(同实施例2)中，在30℃、200rpm的条件下，振荡培养至OD₆₀₀＝0.8；取培养菌液40mL，在12,000rmp条件下离心25min，收集菌体沉淀，用20mL的溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0)洗涤，在12,000rmp条件下离心25min，收集菌体沉淀；

上述菌体沉淀中，每管加入溶菌酶缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0)12.0mL，得到约14.0mL的菌液，分别加入浓度为20mg/mL的溶菌酶各560μL，其终浓度约800μg/mL；冰浴1.0h后，37℃温浴2h，至溶液粘稠；加入10wt％SDS 0.82mL，100mg/mL的蛋白酶K溶液60μL，52℃水浴1.0h；加入Tris-平衡过的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)15mL，轻轻颠倒混匀，至充分乳化；10,000g、4℃条件下离心10min，转移上清，加入2.0mL的NaAc-HAc(pH 5.2，3.0M)缓冲液，以及17.0mL的无水乙醇，混匀；用1.0mL的枪头挑出丝状DNA，转移至1.5mL的EP离心管中，以70wt％的乙醇(贮于-20℃)，洗涤2次，微离心后弃上清；10,000g、4℃条件下离心3min，彻底弃掉上清；样品于无菌工作台中，酒精灯下风吹干燥；用无菌去离子水重悬溶解DNA样品，4℃过夜，得到大分子量基因组DNA。

实施例5、发光杆菌QA16基因组扫描及其序列分析

将实施例4制得的大分子量基因组DNA进行测序(北京源宜公司)。用NCBI(National Center for Biotechnology Information,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的软件对测序结果进行分析。所用到的NCBI分析软件是Open Reading Frame Finder(ORF Finder,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和Basic LocalAlignment Search Tool(BLAST,http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

NCBI分析结果显示发光杆菌QA16基因组上携带一个硫酸软骨素裂解酶基因pcdase，pcdase基因编码区长3174bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。与ProteusVulgaris的全基因组序列中chondroitinase ABC-I(NCBI序列号：P59807.2)有45.83％的同源性。

pcdase基因编码的硫酸软骨素裂解酶PCDase由1057个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白质的理论分子量约为116kD。用Simple Modular ArchitectureResearch Tool(SMART,http://smart.embl_heidelberg.de/)分析硫酸软骨素裂解酶PCDase的结构信息，结果显示N端无信号肽序列，第248-922位氨基酸序列属于硫酸软骨素裂解酶超家族。用SWISS-MODEL同源建模服务器(http://swissmodel.expasy.org)对硫酸软骨素裂解酶PCDase的蛋白质三维结构进行同源建模，最终得到的PCDase蛋白质三维结构模型如图2所示。

实施例6、PCDase基因在大肠杆菌中的重组表达

以实施例4制得的大分子量基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物如下：

正向引物PCDase-F：GCATATGGCCGGATTAGAGGCACAAATCCTCAGTTTCG；

反向引物PCDase-R：GCTCGAGTTTTGCGCGGACGCCTGGTTTCAACCGCG；

正向引物下划线标注的是限制性内切酶Nde I位点，反向引物下划线标注的是限制性内切酶Xho I位点。Primerstar HS DNA聚合酶购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，68℃1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

将PCR产物用Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切的PCR产物。将购于美国Novagen公司的pET-30a载体用Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收酶切载体大片段。Nde I和Xho I均购于宝生物公司，酶与底物反应的体系、温度和时间均按照公司提供的产品说明操作。

将经过双酶切的PCR产物与同样经过双酶切的pET-30a载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株后涂布于含有50μg/mL卡纳抗生素的Luria-Bertani培养基固体平板上，37℃培养14h，挑取单克隆；将单克隆接入含有50μg/mL卡纳抗生素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；将质粒用正向引物PCDase-F和反向引物PCDase-R进行菌液PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去生工生物工程股份有限公司测序，结果表明，在pET-30a的Nde I和Xho I酶切位点之间插入SEQ ID NO.1所示的pcdase基因，且插入方向正确，所以进一步证明构建的重组质粒正确，将该重组质粒命名为pET30a-PCDase。

将pET30a-PCDase转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)(购自美国Novagen公司)，然后按照该公司提供的操作步骤进行重组硫酸软骨素裂解酶PCDase诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测重组硫酸软骨素裂解酶PCDase的表达情况，结果如图3所示，重组硫酸软骨素裂解酶PCDase在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。

实施例7、PCDase降解硫酸软骨素产物的高效液相(HPLC)分析

将质量浓度为1％硫酸软骨素A底物或硫酸皮肤素、PCDase酶液、150mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液以及水按2：1：3：4(体积比)的比例混合后，在pH8.0，30℃条件下反应，酶解24h的产物进行HPLC分析。HPLC分析条件为：凝胶柱：superdex peptide10/300GL(GE)；流动相：0.2M碳酸氢铵；流速：0.4mL/min；检测条件：UV232nm。

结果如图4～5所示，从图4～5可以看出PCDase降解硫酸软骨素A和硫酸皮肤素的终产物主要为不饱和四糖，可被用于硫酸软骨素和硫酸皮肤素寡糖的制备以及硫酸软骨素和硫酸皮肤素构效关系的研究。

实施例8、硫酸软骨素裂解酶PCDase在药物中的应用

硫酸软骨素裂解酶PCDase可以用于增强药物的吸收或/和递送，包括但不限于经过皮肤途径辅助药物渗透。示例性的药物包括皮质类固醇如氢化可的松、泼尼松龙、倍氯米松丙酸酯、氟米松、去炎松、氯倍他索丙酸酯等；镇痛药和/或抗炎剂如对乙酰氨基酚、甲灭酸、氟芬那酸、双氯芬酸、双氯芬酸钠、阿氯芬酸、羟布宗、保泰松、布洛芬、氟比洛芬、水杨酸、薄荷醇、樟脑、萘普生等；抗高血压药如吲哚洛尔、茚诺洛尔、心痛定等；抗生素如青霉素、四环素、土霉素、新霉素、红霉素、氯霉素等；麻醉剂如利多卡因、苯佐卡因等以及其他药物。

通过敷布、纱布、或其它皮肤涂抹途径施用硫酸软骨素裂解酶。硫酸软骨素裂解酶溶液可以涂敷到合适的敷贴上(如5-6层纱布)。敷贴应覆盖受损区域，且敷贴本身用蜡纸或绷带固定。应用的制剂的量取决于损伤的面积，通常为5-100IU/cm²。敷贴应每天使用12-24小时，连续使用10-100天。

对于局部使用，溶液、悬浮液、凝胶剂、糊剂、软膏、乳膏或硫酸软骨素裂解酶的其他配方(有或没有另外的活性剂，都可以使用)。溶液等配方中包含制药和化妆品领域用于局部使用可接受的稀释剂、辅助剂和赋形剂的，这些其它配方主要包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其它有机酸盐，抗氧化剂如抗坏血酸，肽、蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白，亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、天然的或合成的油，氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸，单糖、二糖和其它碳水化合物如纤维素或其衍生物、葡萄糖、乳糖、甘露糖或糊精，螯合剂如EDTA，糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇，无机盐如氯化钠，和非离子表面活性剂如吐温、聚乙二醇。

其中，硫酸软骨素裂解酶溶液是硫酸软骨素裂解酶PCDase的冻干粉末悬浮或溶解在含有0.1％-10％蔗糖、1％-20％甘油的溶剂中，溶液的pH为6.5-8.5。

硫酸软骨素裂解酶组合物可以通过口服给药或肠胃外给药，并且硫酸软骨素裂解酶组合物可以与合适的递送载体结合后给药。

可通过活性化合物与固体赋形剂的组合获得用于口服使用的硫酸软骨素裂解酶药物制剂。上述的组合物加入合适的辅助剂混合使用。如果需要的话，合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白质，例如糖、纤维素、牛血清白蛋白等。

硫酸软骨素裂解酶与药物(如氢化可的松，抗生素，维生素)组合。以口服凝胶剂、膏剂、或悬浮液的形式通过静脉内、皮下或肌内注射给药；或以软膏剂、乳膏剂，面罩局部给药；以及用作化妆品辅助剂，用于增强皮肤的吸收。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一株发光杆菌QA16及其培养方法与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3174

<212> DNA

<213> 发光杆菌（Photobacterium sp.）

<400> 1

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gataaccgct atggccgcta tcagagccat ggcagcgtcc atgttatccc ttacggcgat 1920

ccgaccatgt tgggttaccg gcaagagggc tgggactgga acagaaaccc gggaaccacc 1980

acaattcacc tcgaccttga ccagttggaa agcccgaaga catccacgct gatggtccgc 2040

tccgatgaag ggatcagtgg tgcaacgtcg ctgaacaacc agtacagtct attcaccttc 2100

aaacaccggg ctcctcagaa tctcagccaa tttgaaccga cctttgtcgc ggaaaaatat 2160

gtactggccg caggaaataa actactgctg accgggaagg ggatcagcaa tcacgatggt 2220

gcccaccgga ccgaaaccac cttgttccaa ctggctatcg gcagcaatcc gaccgggatc 2280

tgggttaacg gcgttcagca caaagaagcc gacttctcgg ccaccctcag ctctggagac 2340

tggctgatcg atgacaatgg tgtcggctac tacctgcttg atgccgaatc ggtccaggta 2400

cgccgaggtc agcaacagtc gcgccacaat aaaactaaag cggccactac cggtgagttt 2460

tcatcggcct ggattgatca tggtgttgcg ccagacaacg ccagctaccg ctatgtgatg 2520

gtgatgcaaa cgaccccgac tgacatggcc gcctttgccc gtcaaatgaa aaacacaccg 2580

ttcctgacgg tcccggaaag caagtcgaac ggggttgtgc tggccgacag cagcaatcac 2640

ctctacggct atagcgccct ggctgctgtt gagtttactc agggaccggt gaagtcggtc 2700

agccgaaccg ctcagatctt agcgcagcaa aacgccaata cgctgtcgtt gagtgtggcg 2760

tcgcctgagc tcaaccttca acccgatgac caaccgaccc cacccgtcgc gattgacgtg 2820

gaactgctgg gagaatggga tctcacggaa gccgcctatt cacaccggga tggcaatacc 2880

tgggtgaccg taaacagtca gtttggtcag gcggttcaat tgacgctcat ccagaatggc 2940

ggcaacctcc ccgacgccgg tggtgatggc agacacagca gcggcgggaa caacaacaat 3000

accgacaata gcggtactga cggcaatacc agtcaggaga gcgataattc cggcagcggc 3060

gcagccgtcg atcgggcgga cacgggcgga agcagcgggg gctcgaccag tctgtcgatt 3120

ctggttgttc tgatggcctt gtcgcggttg aaaccaggcg tccgcgcaaa ataa 3174

<210> 2

<211> 1057

<212> PRT

<213> 发光杆菌（Photobacterium sp.）

<400> 2

Met Thr Gln Ser Met Leu Gln Gly Ile Ala Ala Gly Leu Val Ser Leu

1 5 10 15

Ala Val Ser Gly Tyr Ala Gln Ala Ala Gly Leu Glu Ala Gln Ile Leu

20 25 30

Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Pro Asp Trp Ile Thr Ala Ser Asn Ser

35 40 45

Gln Leu Thr Ser Gln Arg Ala Ile His Gly Thr Gln Ser Leu Leu Trp

50 55 60

Gln Trp Gln Asn Asn Gln Thr Leu Thr Ile Asn His Thr Phe Glu Arg

65 70 75 80

Leu Thr Asp Thr Gln Ala Ser Ala Ala Leu Gly Arg Ser Ala Thr Gln

85 90 95

Val Leu Ser Phe Trp Leu Tyr Asn Pro Val Ala Met Gln Asp Ser Leu

100 105 110

Thr Val Ala Leu Ser Asp Gln Gly Glu Asn Glu Val Thr Thr Phe Pro

115 120 125

Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly Trp Arg Ala Ile Gly Ile Ser Leu Asn

130 135 140

Leu Asp Tyr Pro Ser Thr His Gln Phe Asp Arg Ile Arg Phe Thr Ala

145 150 155 160

Pro Ala Gly Ser Thr Ser Ala Gly Gln Leu Tyr Leu Asp Arg Val Met

165 170 175

Val Ser Val Asp Asp Ser Arg Tyr Gln Trp Ser Asp Asp Gln Ile Thr

180 185 190

Thr Arg Phe Thr Val Pro Glu Ile Asp Phe Gly Leu Pro Ser Ile Leu

195 200 205

Pro Glu Pro Thr Gln Thr Glu Leu Asp Asp Ala Lys Ala Val Arg Lys

210 215 220

Thr Leu Ile Thr Glu Phe Gly Gly Asn Pro Gly Ser Leu Ser Ser Leu

225 230 235 240

Glu Asp Arg Phe Arg Ala Phe Ala Ile His Lys Asp Asn Gln Gly Val

245 250 255

Ile Thr Gly Arg His Ile Leu Thr Asp Lys Gln Gln Val Ile Tyr Gln

260 265 270

Pro Arg His Leu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Gly Phe Asp Asn Tyr Val

275 280 285

Leu Leu Gly Asp Ala Asp Ser Gln Gly Asn Lys Leu Ser Gly Tyr Ala

290 295 300

Lys Leu Met Leu Asp Leu Gly Met Ala Tyr His Asp Pro Ala Phe Ser

305 310 315 320

Gly Asp Gln Ser Arg Leu Ala Glu Met Tyr Arg Leu Leu Thr Glu His

325 330 335

Leu Leu Asp Gln Gly Phe Ala Asp Gly Ser Ser Leu Val Thr Ser His

340 345 350

His Trp Gly Tyr Ser Gly Arg Trp Trp Tyr Ile Ser Ala Leu Met Met

355 360 365

Ala Glu Glu Leu Ala Ala Glu Gln Leu Leu Asp Pro Thr Tyr Gln Ala

370 375 380

Leu Leu Trp Phe Ser Arg Glu Phe Lys Asp Ser Phe Asp Met Ala Leu

385 390 395 400

Asn Pro Ala Ser Ser Asn Leu Asp Tyr Phe Asn Thr Leu Ser Arg Gln

405 410 415

His Leu Ala Leu Ile Leu Leu Asn Pro Asp Asp Arg Glu Arg Ile Ala

420 425 430

Leu Leu His Arg Phe Arg His Phe Phe Ser Gly Ala Leu Ser Gln Thr

435 440 445

Pro Pro Gly Thr Gln Asp Gly Phe Arg Pro Asp Gly Thr Ala Trp Arg

450 455 460

His Gln Gly His Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe Pro Ala Phe Glu Asn Ala

465 470 475 480

Ala His Val Ala Tyr Met Leu Lys Gly Thr Arg Tyr Ala Leu Gly Asp

485 490 495

Glu Ala Leu Asn Ser Leu Lys Ser Ala Met Phe Ala Gly Trp Arg Tyr

500 505 510

Ser Asn Pro Tyr Val Pro Leu Gly Leu Ser Gly Arg His Pro Phe Thr

515 520 525

Asp Leu Ser Val Gln Arg Tyr Ser Asn Gly Leu Lys Trp Leu Ala Gln

530 535 540

Ser Tyr Thr Gln Val Asp Glu Glu Leu Ala Ala Val Tyr Leu Gln Val

545 550 555 560

Ser Gln Thr Asn Ala Gln Gln Ser Thr Ala Leu Phe Gly Lys Gln Ile

565 570 575

Ser Pro Ala Val Leu Pro Glu Gly Ser Trp Ser Phe Asn Gly Gly Ala

580 585 590

Phe Ala Ile His Arg Ser Gly Asp Arg Met Ala Ile Met Lys Gly Tyr

595 600 605

Asn Gln Asp Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Arg Tyr

610 615 620

Gly Arg Tyr Gln Ser His Gly Ser Val His Val Ile Pro Tyr Gly Asp

625 630 635 640

Pro Thr Met Leu Gly Tyr Arg Gln Glu Gly Trp Asp Trp Asn Arg Asn

645 650 655

Pro Gly Thr Thr Thr Ile His Leu Asp Leu Asp Gln Leu Glu Ser Pro

660 665 670

Lys Thr Ser Thr Leu Met Val Arg Ser Asp Glu Gly Ile Ser Gly Ala

675 680 685

Thr Ser Leu Asn Asn Gln Tyr Ser Leu Phe Thr Phe Lys His Arg Ala

690 695 700

Pro Gln Asn Leu Ser Gln Phe Glu Pro Thr Phe Val Ala Glu Lys Tyr

705 710 715 720

Val Leu Ala Ala Gly Asn Lys Leu Leu Leu Thr Gly Lys Gly Ile Ser

725 730 735

Asn His Asp Gly Ala His Arg Thr Glu Thr Thr Leu Phe Gln Leu Ala

740 745 750

Ile Gly Ser Asn Pro Thr Gly Ile Trp Val Asn Gly Val Gln His Lys

755 760 765

Glu Ala Asp Phe Ser Ala Thr Leu Ser Ser Gly Asp Trp Leu Ile Asp

770 775 780

Asp Asn Gly Val Gly Tyr Tyr Leu Leu Asp Ala Glu Ser Val Gln Val

785 790 795 800

Arg Arg Gly Gln Gln Gln Ser Arg His Asn Lys Thr Lys Ala Ala Thr

805 810 815

Thr Gly Glu Phe Ser Ser Ala Trp Ile Asp His Gly Val Ala Pro Asp

820 825 830

Asn Ala Ser Tyr Arg Tyr Val Met Val Met Gln Thr Thr Pro Thr Asp

835 840 845

Met Ala Ala Phe Ala Arg Gln Met Lys Asn Thr Pro Phe Leu Thr Val

850 855 860

Pro Glu Ser Lys Ser Asn Gly Val Val Leu Ala Asp Ser Ser Asn His

865 870 875 880

Leu Tyr Gly Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Val Glu Phe Thr Gln Gly Pro

885 890 895

Val Lys Ser Val Ser Arg Thr Ala Gln Ile Leu Ala Gln Gln Asn Ala

900 905 910

Asn Thr Leu Ser Leu Ser Val Ala Ser Pro Glu Leu Asn Leu Gln Pro

915 920 925

Asp Asp Gln Pro Thr Pro Pro Val Ala Ile Asp Val Glu Leu Leu Gly

930 935 940

Glu Trp Asp Leu Thr Glu Ala Ala Tyr Ser His Arg Asp Gly Asn Thr

945 950 955 960

Trp Val Thr Val Asn Ser Gln Phe Gly Gln Ala Val Gln Leu Thr Leu

965 970 975

Ile Gln Asn Gly Gly Asn Leu Pro Asp Ala Gly Gly Asp Gly Arg His

980 985 990

Ser Ser Gly Gly Asn Asn Asn Asn Thr Asp Asn Ser Gly Thr Asp Gly

995 1000 1005

Asn Thr Ser Gln Glu Ser Asp Asn Ser Gly Ser Gly Ala Ala Val

1010 1015 1020

Asp Arg Ala Asp Thr Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Ser Leu

1025 1030 1035

Ser Ile Leu Val Val Leu Met Ala Leu Ser Arg Leu Lys Pro Gly

1040 1045 1050

Val Arg Ala Lys

1055

Claims

1.一株发光杆菌（Photobacteriumsp.）QA16，2020年8月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO. 20556。

2.权利要求1所述的发光杆菌QA16菌液的培养方法，其特征在于，步骤如下：

（1）取发光杆菌QA16接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为150～300 rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

（2）取步骤（1）制得的种子液，按5～10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为28～30℃，溶氧为25～30%的条件下，扩大培养2～5小时，制得发光杆菌QA16菌液。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述液体培养基每升组分如下：

K₂HPO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 30g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，FeSO₄ 0.001g，NH₄Cl 1g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，水1000mL，pH值为7.0。

4.权利要求1所述的发光杆菌QA16在制备硫酸软骨素裂解酶中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）取发光杆菌QA16菌株接种至液体培养基中，在温度为28～30℃、转数为150～300rpm的条件下，摇床培养8～16小时，制得种子液；

（2）取步骤（1）制得的种子液，按5～10%的体积百分比接种于液体培养基中，在温度为25～30℃，溶氧为25～30%的条件下，扩大培养2～5小时，加入硫酸软骨素，使硫酸软骨素的质量浓度为0.01～0.02%，继续培养24～72小时，制得发光杆菌QA16发酵液；

（3）取步骤（2 ）制得的发光杆菌QA16发酵液，经固液分离，取液体，加入硫酸铵，使硫酸铵质量浓度大于等于80%，收集沉淀，沉淀用PBS缓冲液进行透析去除硫酸铵，制得硫酸软骨素裂解酶。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）和（2）所述液体培养基每升组分如下：

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述固液分离采用离心的方式，条件为：12,000 rpm离心15~30min。

8.一种硫酸软骨素裂解酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述硫酸软骨素裂解酶分离自权利要求1所述的发光杆菌QA16。

9.权利要求8所述的硫酸软骨素裂解酶的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述编码基因来源于权利要求1所述的发光杆菌QA16。

10.权利要求8所述的硫酸软骨素裂解酶在制备硫酸软骨素寡糖和/或硫酸皮肤素寡糖中的应用。

11.权利要求8所述的硫酸软骨素裂解酶在研究硫酸软骨素/硫酸皮肤素结构与功能中的应用。