CN110982862A - 一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法,该方法采用两步酶解和两步纯化,先利用透明质酸酶酶解高分子透明质酸或其盐,所得产物用低有机溶剂倍数进行纯化,得到纯度较高的低分子量透明质酸或其盐,进而对低分子量透明质酸或其盐进行彻底酶解,所得产物用高有机溶剂倍数进行纯化,得到高纯度不饱和透明质酸二糖。该方法工艺流程操作简单,条件温和,生产效率高,能耗相对较低,适合大规模工业化生产。所得产品纯度高、细胞毒性低、具有促进人脐静脉内皮细胞及人角膜上皮细胞增殖的特点,可以作为标准品用作透明质酸及其相关产品的含量及纯度检测,在医药领域也具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种不饱和透明质酸二糖的制备方法,特别涉及一种纯度高、产量大、适合大规模生产的不饱和透明质酸二糖的制备方法,属于寡聚透明质酸制备技术领域。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种广泛存在于人及哺乳动物体内的酸性黏多糖,是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成、无分支的单链高分子糖胺聚糖。由于透明质酸独特的物理学特性、高保湿性、粘弹性、润滑性,广泛用于医药、化妆品、食品等领域,分子量一般为105~107Da(道尔顿)。
寡聚透明质酸是指分子量小于10 kDa的透明质酸。有研究认为,不同的分子量的透明质酸有着不同的甚至完全相反的生物活性,高分子量透明质酸由于其保湿性、粘弹性及润滑性常被应用在滴眼液、美容填充及骨科填充等领域,但当透明质酸的分子量降低至寡糖的水平时(10 kDa以下),透明质酸寡糖表现出与高分子量透明质酸完全不同的性能,具有抗氧化性、透皮吸收、创伤修复的活性。不饱和透明质酸二糖分子量为383Da,是透明质酸经过细菌产透明质酸酶酶解制备的透明质酸二糖,与透明质酸二糖结构相区别的是,不饱和透明质酸二糖在葡萄糖醛酸的4,5糖苷键处形成不饱和键。经前期研究发现,不饱和透明质酸二糖(ΔDiHA)具有较强的抗氧化性,并能够明显促进人脐静脉内皮细胞及人角膜上皮细胞增殖,在医药领域具有广阔的应用前景。另外,高纯度不饱和透明质酸二糖(ΔDiHA)也可以作为标准品,用作透明质酸及其相关产品的含量及纯度检测。
李强在其毕业论文中公开了一种不饱和透明质酸二糖的制备方法(李强. 不饱和透明质酸二糖的制备和活性研究[D]. 山东大学, 2013),该方法以高分子透明质酸为原料,通过一次酶解、酶灭活、冷冻干燥的步骤制备不饱和透明质酸二糖。该工艺采用冻干工艺得到不饱和透明质酸二糖,批次产量过低,高耗能,效率低下,无法应用于透明质酸不饱和二糖的大规模制备。有机溶剂沉淀提取产物的方式是工业上常用的透明质酸提取方式,但由于不饱和透明质酸二糖自身的吸水性高,分子量低(383 Da),且采用高分子透明质酸为原料,溶液中底物浓度低,因此很难通过有机溶剂沉淀的方式得到不饱和透明质酸二糖。
CN107460184A 公开了一种链霉菌属来源的透明质酸裂解酶HyaL16-3及其编码基因与应用,其将透明质酸裂解酶HyaL16-3的编码基因插入到表达载体中,使其在宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中表达,所得透明质酸裂解酶用于降解透明质酸,从而制备不饱和透明质酸二糖。该专利所得的透明质酸裂解酶酶活很低,其对透明质酸的比活仅为10306 U/mg,容易引入更多杂质,降解后需要经过分子凝胶色谱柱分离纯化,并需经过反复冷冻干燥脱盐才能得到纯度较高的不饱和透明质酸二糖。该方法工艺复杂、产品纯化难度大、能耗高、成本高,无法实现大规模生产,且重组菌株的安全性也有待考量。
CN201210499375.8公开了一种低分子透明质酸盐的酶解制备方法,采用0.1%~2%的透明质酸盐溶液进行酶解,然后加入无机盐以便增强溶液的离子强度进而进行有机溶剂沉淀获得低分子透明质酸及其盐,随着低分子透明质酸及其盐分子量的降低,需要不断的提高有机溶剂的添加浓度以使透明质酸沉淀析出,但无机盐在高浓度的有机溶剂中也会沉淀析出,因此在沉淀的过程中势必会造成无机盐残留。
CN201611127881.9公开了一种超低分子透明质酸的制备方法,采用不断添加的方式使得透明质酸及其盐的最终浓度达到5%~25%,此专利没有特意关注产品中无机盐残留问题,后期又采用喷雾干燥的工艺制备,除活性炭吸附一些较大分子量杂质外,需要后期超滤浓缩,同时去除一些无机盐及小分子,以便获得目标分子量段的透明质酸及其盐,后处理繁琐,成本高。
发明内容
针对现有技术中制备不饱和透明质酸二糖存在的纯化方法不利于工业化生产,所得产品纯度低等不足,本发明提供了一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法,该方法以高分子透明质酸或其盐为原料,先通过第一次酶解,降低透明质酸或其盐的分子量,酶解后通过有机溶剂沉淀的方式进行初步纯化,得到纯度较高的低分子量透明质酸或其盐,然后再将低分子量透明质酸或其盐在较高浓度下进行第二次酶解,酶解后采用高倍数有机溶剂沉淀的方式进行纯化,最终得到高纯度不饱和透明质酸二糖。该方法通过两步酶解和两步纯化提高了最终不饱和透明质酸二糖产品的纯度,并且第二步酶解采用粘度较低的低分子透明质酸或其盐为底物,可以提高底物浓度,使最终酶解液中产物浓度提高,无须加入无机盐仅通过有机溶剂沉淀即可使不饱和透明质酸二糖充分析出,纯化方法简便、易操作、能耗低,所得产品纯度高,便于工业化大规模生产。
目前市售的无论是高分子还是低分子的透明质酸或其盐中,都存在一定的无机盐杂质,如果通过一步酶解制备不饱和透明质酸二糖,无机盐一直存在在酶解液中,势必会在后期纯化的过程中进入产物中,降低产物浓度。本发明先进行一次酶解和纯化,降低透明质酸或其盐的分子量,使其在第二次酶解中浓度提高,再者通过第一次纯化可以去除原料引入的杂质,使第二步酶解所用原料纯度高、杂质少,进一步降低了最终产物中杂质的含量。
本发明通过两次酶解和两次纯化解决了高分子透明质酸或其盐一次酶解无法获得高浓度不饱和透明质酸二糖溶液、产物提取不适合工业化生产的难题,实现了不饱和透明质酸二糖的高效大规模制备。本发明具体技术方案如下:
一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法,该方法包括以下步骤:
(1)将透明质酸酶加入pH4~9的水中,配成酶解缓冲液;
(2)在搅拌下向酶解缓冲液中加入高分子透明质酸或其盐,高分子透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为1~2 g:10 ml,酶解至透明质酸或其盐的分子量为50 kDa~100kDa时升温进行灭活;
(3)向步骤(2)灭活后的反应液中加入有机溶剂进行沉淀,过滤,所得沉淀洗涤、干燥,得低分子量透明质酸或其盐;
(4)按照步骤(1)的方法配制酶解缓冲液,在搅拌下向该酶解缓冲液中加入步骤(3)的低分子量透明质酸或其盐,低分子量透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为3~9 g:10 ml,酶解直至终点;
(5)将酶解液用活性炭进行吸附,吸附后过滤,所得滤液用有机溶剂沉淀,所得沉淀干燥,得不饱和透明质酸二糖。
本发明要制备高纯度的不饱和透明质酸二糖,因此在整个制备过程中,都要避免杂质的引入。例如,加入的各种试剂都采用高纯度的试剂,例如采用纯度高的高分子透明质酸或其盐,优选纯度≥99%。采用比活高、纯度高的透明质酸酶,以避免杂质的引入。本发明所指的高纯度指的是纯度在90%以上,更优选在95%以上,更更优选在99%以上。
进一步的,本发明所用透明质酸酶为细菌产透明质酸酶,优选的为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744 发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶,该酶酶活高,经过纯化其纯度在95%以上,其比活大于1.4×107 IU/mg,可以采用工业化生产的方法获得。
进一步的,所述高分子透明质酸或其盐的分子量大于等于1000 kDa,优选为1000kDa~2000 kDa。所述高分子透明质酸盐为高分子透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐,常用的为钠盐。
进一步的,步骤(2)中,在搅拌下加入高分子透明质酸或其盐并进行酶解,搅拌速度为10~50 rpm。为了降低高分子透明质酸或其盐的溶解难度,提高其在酶解缓冲液中的分散均匀度,高分子透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入,以保证酶解体系的粘度不要太大。可以根据高分子透明质酸或其盐的分子量和加入的总量调整每次加入的量、加入的次数、加入的时间、每次间隔的时间、连续加入的速度等,优选的,加入方式保证高分子透明质酸或其盐较容易溶解且分散均匀。采用这样的加入方式,可以使酶解缓冲液中透明质酸的浓度尽可能的高,加入的高分子透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比可以达到1~2 g: 10 ml,在此用量关系下,既可以保证透明质酸的分散均匀,又可以保证透明质酸浓度较高,在后续提取过程中可以不加无机盐直接进行有机溶剂沉淀。
进一步的,步骤(2)中,酶解温度和酶解pH使用透明质酸酶的最佳适宜温度和pH,当所用透明质酸酶优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744 发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶时,酶解温度为20~48℃,优选为30~40℃,酶解pH为4~9,优选为5.5~7.5。
进一步的,步骤(2)中,酶解缓冲液中透明质酸酶与加入的高分子透明质酸或其盐总质量的关系为:每1 kg高分子透明质酸或其盐需要1×105~1×106 IU的透明质酸酶。
进一步的,步骤(2)中,所得低分子量透明质酸或其盐的分子量为50 kDa ~100kDa,优选为50 kDa ~80 kDa。所得低分子量透明质酸或其盐的分子量越小,越容易溶解,越容易在第二次酶解时形成高浓度的底物溶液。但是分子量过小又会造成有机试剂沉淀时有机试剂加入倍数过高,使杂质也析出,因此此步骤产物分子量优选范围为50 kDa ~80 kDa。酶解完成后进行酶灭活。酶灭活采用现有技术中常用的方法,例如在50~70℃下处理1~60min。
进一步的,步骤(3)中,用有机溶剂进行沉淀,所述有机溶剂为乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、乙二醇等,优选为乙醇。有机溶剂可以以纯有机溶剂的形式加入,也可以以其高浓度的水溶液的形式加入。优选的,加入有机溶剂至酶解液中有机溶剂的体积浓度为70%~85%。步骤(3)中,将酶解得到的低分子量透明质酸或其盐进行纯化提取,所得低分子量透明质酸或其盐固体再进行酶解和纯化,两步分次纯化可以更好的除去透明质酸中的微量杂质,使最终产物的浓度更高。
进一步的,步骤(4)中,所用酶解缓冲液与步骤(1)相同。将低分子量透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入,与传统的酶解方式先配制底物溶液再加入透明质酸酶进行酶解相比,此种酶解方式更容易获得高浓度的不饱和透明质酸二糖溶液。每次加入的量、加入的次数、每次间隔的时间、连续加入的加入速度等可以根据酶解液的黏度进行调整。酶解缓冲液中透明质酸酶的用量与加入的低分子量透明质酸或其盐总质量的关系为:每1 kg低分子量透明质酸或其盐需要1×107~1×109 IU的透明质酸酶。
进一步的,步骤(4)中,在搅拌下加入低分子量透明质酸或其盐并进行酶解,搅拌速度为10~50 rpm。酶解温度和酶解pH使用透明质酸酶的最佳适宜温度和pH,当所用透明质酸酶优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744 发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶时,酶解温度为20~48℃,优选为30~40℃,酶解pH为4~9,优选为5.5~7.5。
进一步的,步骤(4)中,第二次酶解以低分子量透明质酸或其盐为底物,溶解快速,更加容易制备成高浓度的底物溶液,加入的低分子量透明质酸或其盐总量与酶解缓冲液的质量体积比为3~9 g:10 ml,优选为4.5~7.5 g:10 ml。酶解后所得的酶解液中产物浓度高,避免了无机盐的使用。
进一步的,步骤(4)中,酶解过程中,酶解液吸收值维持不变时即达到酶解终点。
进一步的,步骤(5)中,酶解后的酶解液无须灭活直接加入活性炭进行吸附,处理1~60 min。活性炭用量为酶解液质量的1~5%。因为所用透明质酸酶比活高,用量少,通过有机溶剂沉淀即可实现透明质酸酶与产品的分离,因此考虑到不饱和透明质酸二糖在高温下稳定性差,无须灭活直接进行活性炭吸附。
进一步的,步骤(5)中,所述有机溶剂为乙醇、丙醇、异丙醇或乙二醇,优选为乙醇。有机溶剂可以以纯有机溶剂的形式加入,也可以以其高浓度的水溶液的形式加入。优选的,加入有机溶剂至酶解液中有机溶剂的体积浓度为88~99 %,更优选为90~92 %。高的有机溶剂浓度可以进一步去除产物中的微量油溶性杂质,提高了产物纯度。
进一步的,步骤(5)中,干燥方式为真空干燥,成本低,便于工业化生产。真空干燥的温度为20~40℃,优选为25~35℃。
本发明经过第一次酶解和第一次纯化后,不加入无机盐就可以直接进行有机溶剂沉淀,沉淀效果好,产物纯度高,最终所得不饱和透明质酸二糖为白色粉末,纯度可达99.5%以上。该不饱和透明质酸二糖纯度高、杂质少,具有较强的抗炎、促创伤修复的活性,可以作为透明质酸检测标准品,也可以应用于医药、化妆品等领域。
本发明采用两步酶解和两步纯化,先利用透明质酸酶酶解高分子透明质酸或其盐,制备纯度较高的低分子量透明质酸或其盐,再对低分子量透明质酸或其盐进行彻底酶解,制得高浓度不饱和透明质酸二糖溶液,最终通过活性炭除杂、过滤、有机溶剂沉淀、真空干燥得到高纯度不饱和透明质酸二糖。与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1、本发明操作简单,条件温和,通过两步酶解制备了高浓度不饱和透明质酸二糖溶液,在不添加无机盐的状态下进行有机溶剂沉淀、干燥,从而解决了无法采用有机溶剂沉淀法获得高纯度不饱和透明质酸二糖的难题。
2、本发明采用了两步酶解和两步纯化,第一步酶解降低了透明质酸分子量,提高了透明质酸纯度,并进行分子量的合理控制,从而可以使第二步酶解提高底物浓度。
3、本发明纯化时无须加入无机盐即可直接进行有机溶剂沉淀,避免了无机盐对产物纯度的干扰,因此可以使用高浓度的有机溶剂进行沉淀,使最终得到的不饱和透明质酸二糖纯度更高,可达99.5%以上。
4、本发明摈弃了采用低浓度酶解产物溶液冻干制备不饱和透明质酸二糖的方式,高浓度沉淀、真空干燥的工艺大幅度降低了产品能耗,提高了批次产量,适用于工业化大规模生产。
附图说明
图1为实施例1的不饱和透明质酸二糖(ΔDiHA)样品的HPLC色谱图。
图2为比较例1的不饱和透明质酸二糖(ΔDiHA)样品的HPLC色谱图。
图3为比较例2产品的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例中,不饱和透明质酸二糖的分子量测定采用Laurent法,含量测定采用文献“李强. 不饱和透明质酸二糖的制备和活性研究[D]. 山东大学, 2013”中记载的HPLC(外标法)。
下述实施例中,氯离子含量采用硝酸银滴定法进行测定(欧洲药典检测法)。
下述实施例中,所用的芽孢杆菌透明质酸酶来自华熙生物科技股份有限公司,该透明质酸酶为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744发酵生产得到的透明质酸酶,其比活大于1.4×107 IU/mg,纯度大于95%。
实施例1
1、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至30℃,用盐酸调节pH为5.0。
2、设置搅拌速度20 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入1.8×108 IU的芽孢杆菌透明质酸酶, 搅拌1 min 后,缓慢加入分子量为2000 kDa的透明质酸钠100 kg,加入时间为1h,加入后酶解1 h,然后继续缓慢加入分子量为2000 kDa的透明质酸钠50 kg,加入时间为1h,加入后继续酶解 1 h,然后再继续缓慢加入分子量为2000 kDa的透明质酸钠30 kg,加入时间为1 h,继续酶解,酶解至分子量小于50 kDa时,将温度升高至50℃,维持60 min。
3、将灭酶后的酶解液用0.45 µm的混合纤维素滤膜过滤,然后用3 m3的乙醇沉淀,得到透明质酸钠沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子量透明质酸钠。可以按照上述方法制备多批次低分子量透明质酸钠,备用。
4、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至48℃,用盐酸调节pH为5.0。设置搅拌速度20 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入6.0×1010 IU的芽孢杆菌透明质酸酶,搅拌1 min 后,边搅拌边间歇地向酶解缓冲液加入上述低分子量透明质酸钠600 kg,保持每隔15 min投料50 kg~60 kg的速度,3~4 h内完全投入。每次加入的量、加入的次数以及每次间隔的时间可以根据酶解液的黏度进行调整,酶解过程中,每隔0.5 h将酶解液取样,采用水稀释5000~20000倍,测定232 nm处的紫外吸收值,待吸收值维持1 h不再继续增长时,达到酶解终点。
5、达到酶解终点后,向酶解液中加入25 kg的活性炭,维持40 min,通过钛棒过滤器和0.2 μm滤芯,过滤得到滤液。用15 m3的乙醇沉淀,静置,待上清变清后,吸出上清。将沉淀转入真空干燥机干燥,真空干燥机设置温度范围为25℃。得到不饱和透明质酸二糖513.6kg,其HPLC色谱图如图1所示,纯度为99.9%,没有检测到氯离子残留。
实施例2
1、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至35℃,用盐酸调节pH为6.0。
2、设置搅拌速度30 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入2.4×107 IU的芽孢杆菌透明质酸酶,搅拌1 min 后,缓慢加入分子量为1300 kDa的透明质酸钾80 kg,加入时间为1 h,加入后酶解1 h,然后继续缓慢加入分子量为1300 kDa的透明质酸钾40 kg,加入时间为1h,加入后继续酶解 1 h,然后再继续缓慢加入分子量为1300 kDa的透明质酸钾20 kg,加入时间为1 h,继续酶解,酶解至分子量小于80 kDa时,将温度升高至55℃,维持40 min。
3、将灭酶后的酶解液用0.45 µm的混合纤维素滤膜过滤,然后用5 m3的乙醇沉淀,得到透明质酸钾沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子量透明质酸钾。按照上述方法制备多批次,备用。
4、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至38℃,用盐酸调节pH为6.0。设置搅拌速度20 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入4.5×109 IU的芽孢杆菌透明质酸酶, 搅拌1 min 后,缓慢边搅拌边间歇地向酶解缓冲液加入450 kg的低分子量透明质酸钾,保持每隔15 min投料40~50 kg的速度,2~4 h内完全投入。每次加入的量、加入的次数以及每次间隔的时间可以根据酶解液的黏度进行调整,酶解直至终点。
5、达到酶解终点后,向酶解液中加入30 kg的活性炭,维持60 min,通过钛棒过滤器和0.2 μm滤芯,过滤得到滤液。用12 m3的乙醇沉淀,静置,待上清变清后,吸出上清。将沉淀转入真空干燥机干燥,真空干燥机设置温度范围为28℃。得到不饱和透明质酸二糖352.4kg,纯度为99.7%,没有检测到氯离子残留。
实施例3
1、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至40℃,用盐酸调节pH为6.5。
2、设置搅拌速度50 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入1.0×107 IU的芽孢杆菌透明质酸酶, 搅拌1 min 后,缓慢加入分子量为1800 kDa的透明质酸钙40 kg,加入时间为1 h,加入后酶解1 h,然后继续缓慢加入分子量为1800 kDa的透明质酸钙35 kg,加入时间为1h,加入后继续酶解 1 h,然后继续缓慢加入分子量为1800 kDa的透明质酸钙25 kg,加入时间为1 h,继续酶解,酶解至分子量小于55 kDa时,将温度升高至60℃,维持20 min。
3、将灭酶后的酶解液用0.45 µm的混合纤维素滤膜过滤,然后用4 m3的乙醇沉淀,得到透明质酸钙沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子量透明质酸钙。制备多批次,备用。
4、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至44℃,调节pH为7.0。设置搅拌速度40 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入1.5×1010 IU的芽孢杆菌透明质酸酶, 搅拌1 min后,缓慢边搅拌边间歇地向酶解缓冲液加入750 kg低分子量透明质酸钙,保持每隔15 min投料70~80 kg的速度,2~4 h内完全投入。每次加入的量、加入的次数以及每次间隔的时间可以根据酶解液的黏度进行调整,酶解直至终点。
5、达到酶解终点后,向酶解液中加入50 kg的活性炭,维持50 min,通过钛棒过滤器和0.2 μm滤芯,过滤得到滤液。用10 m3的乙醇沉淀,静置,待上清变清后,吸出上清。将沉淀转入真空干燥机干燥,真空干燥机设置温度范围为28℃。得到不饱和透明质酸二糖655.5kg,纯度为99.8%,没有检测到氯离子残留。
实施例4
1、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至25℃,用氢氧化钠溶液调节pH为7.5。
2、设置搅拌速度25 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入3.2×107 IU的芽孢杆菌透明质酸酶, 搅拌1 min 后,缓慢加入分子量为1500 kDa的透明质酸镁80kg,加入时间为1 h,加入后酶解1 h,然后继续缓慢加入分子量为1500 kDa的透明质酸镁60 kg,加入时间为1h,加入后继续酶解 1 h,然后再继续缓慢加入分子量为1500 kDa的透明质酸镁40 kg,加入时间1 h,继续酶解,酶解至分子量小于60 kDa时,将温度升高至70℃,维持10 min。
3、将灭酶后的酶解液用0.45 µm的混合纤维素滤膜过滤,然后用3 m3的乙醇沉淀,得到透明质酸镁沉淀,该沉淀用乙醇脱水,然后真空干燥即得低分子量透明质酸镁。制备多批次,备用。
4、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至33℃,用盐酸调节pH为5.0。设置搅拌速度50 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入1.0×1011 IU的芽孢杆菌透明质酸酶, 搅拌1 min 后,缓慢边搅拌边间歇地向酶解缓冲液加入300 kg低分子量透明质酸镁,保持每隔15 min投料20~30 kg的速度,2~3 h内完全投入。每次加入的量、加入的次数以及每次间隔的时间可以根据酶解液的黏度进行调整。酶解直至终点。
5、达到酶解终点后,向酶解液中加入30 kg的活性炭,维持50 min,通过钛棒过滤器和0.2 μm滤芯,过滤得到滤液。用20 m3的乙醇沉淀,静置,待上清变清后,吸出上清。将沉淀转入真空干燥机干燥,真空干燥机设置温度范围为28℃。得到不饱和透明质酸二糖216.2kg,纯度为99.6%,没有检测到氯离子残留。
比较例1
将5 g 分子量2000 kDa的透明质酸钠溶解在1 L纯化水中,配成0.5wt% 的反应底物溶液,待透明质酸钠完全溶解后,将溶液置于30℃水浴中,然后向该底物溶液中加入1.0×106 IU的芽孢杆菌透明质酸酶,降解直至酶解液的稀释液232nm的吸收值不再升高,降解结束。将酶解液温度升至50℃,维持40 min,将最终酶解液过0.2 μm滤膜,过滤所得溶液在-40℃下预冻24 h,-20℃下冷冻干燥48 h,即得不饱和透明质酸二糖3.8 g,其HPLC色谱图如图2所示,纯度为96.3%,氯离子含量>1000 ppm。该方法酶解液后处理能耗高、耗时长,批量过低,得到的产品纯度较低,无法规模化生产。
比较例2
将5 g 分子量2000 kDa的透明质酸钠溶解在1 L纯化水中,配成0.5 wt% 的反应底物溶液,待透明质酸钠完全溶解后,将溶液置于37℃水浴中,然后向该底物溶液中加入1.0×106 IU的牛睾丸透明质酸酶,降解直至降解结束。将酶解液温度升至50℃,维持40 min,将最终降解液过0.2 μm滤膜,过滤所得溶液在-40℃下预冻24 h,-20℃下冷冻干燥48 h,得3.9g产物。所得产物HPLC色谱图如图3所示,为透明质酸寡糖四糖到二十糖的混合物。
比较例3
将5 g 分子量2000 kDa的透明质酸钠溶解在1 L纯化水中,配成0.5wt% 的反应底物溶液,待透明质酸钠完全溶解后,将溶液置于30℃水浴中,然后向该底物溶液中加入1.0×106 IU的芽孢杆菌透明质酸酶,降解直至酶解液的稀释液232 nm的吸收值不再升高,降解结束。将最终酶解液过0.2 μm滤膜,过滤所得溶液加入20倍乙醇进行搅拌沉淀,无明显沉降物出现,产物浓度太低,无法采用高浓度有机试剂沉淀的方式得到不饱和透明质酸二糖。
比较例4
1、向1.5 m3不锈钢溶解罐中加入1 m3纯化水,升温至30℃,用盐酸调节pH为5.0。
2、设置搅拌速度20 rpm,边搅拌边向该溶解罐中加入1.8×108 IU的芽孢杆菌透明质酸酶, 搅拌1 min 后,缓慢加入分子量为2000 kDa的透明质酸钠100 kg,加入时间为1h,加入后酶解1 h,然后继续缓慢加入分子量为2000 kDa的透明质酸钠50 kg,加入时间为1h,加入后继续酶解 1 h,然后再继续缓慢加入分子量为2000 kDa的透明质酸钠30 kg,加入时间为1 h,继续酶解,酶解至分子量小于50 kDa时,将温度升高至50℃,维持60 min。
3、边搅拌边向该溶解罐中补加1.8×1010 IU的芽孢杆菌透明质酸酶,酶解直至终点。
4、向酶解液中加入25 kg的活性炭,维持40 min,通过钛棒过滤器和0.2 μm滤芯,过滤得到滤液。用15 m3的乙醇沉淀,静置,待上清变清后,吸出上清。将沉淀转入真空干燥机干燥,真空干燥机设置温度范围为25℃。得到不饱和透明质酸二糖36.8 kg,纯度为93.4%,氯离子含量>2500 ppm,产品纯度明显低于实施例1产品的纯度。
比较例5
按照实施例1的方法制备不饱和透明质酸二糖,不同的是:步骤3中,向酶解液中先加入15 kg NaCl,然后用3 m3的乙醇沉淀。获得的不饱和透明质酸二糖纯度为98.5%,氯离子含量>5000 ppm,产品纯度明显低于实施例1产品的纯度。
Claims (10)
1.一种大规模制备高纯度不饱和透明质酸二糖的方法,其特征是包括以下步骤:
(1)将透明质酸酶加入pH4~9的水中,配成酶解缓冲液;
(2)在搅拌下向酶解缓冲液中加入高分子透明质酸或其盐,高分子透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为1~2 g:10 ml,酶解至透明质酸或其盐的分子量为50 kDa~100kDa时升温进行灭活;
(3)向步骤(2)灭活后的反应液中加入有机溶剂进行沉淀,过滤,所得沉淀洗涤、干燥,得低分子量透明质酸或其盐;
(4)按照步骤(1)的方法配制酶解缓冲液,在搅拌下向该酶解缓冲液中加入步骤(3)的低分子量透明质酸或其盐,低分子量透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为3~9 g:10 ml,酶解直至终点;
(5)将酶解液用活性炭进行吸附,吸附后过滤,所得滤液用有机溶剂沉淀,所得沉淀干燥,得不饱和透明质酸二糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(2)中,酶解缓冲液中透明质酸酶的用量与加入的高分子透明质酸或其盐总质量的比值为:1×105~1×106 IU:1 kg;步骤(4)中,酶解缓冲液中透明质酸酶的用量与加入的低分子量透明质酸或其盐总质量的比值为:1×107~1×109 IU:1 kg。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(4)中,低分子量透明质酸或其盐与酶解缓冲液的质量体积比为4.5~7.5 g:10 ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征是:步骤(3)和(5)中,所述有机溶剂均为乙醇、丙醇、异丙醇或乙二醇,优选为乙醇;优选的,步骤(3)中,加入有机溶剂至酶解液中有机溶剂的体积浓度为70%~85%;优选的,步骤(5)中,加入有机溶剂至酶解液中有机溶剂的体积浓度为88~99%,更优选为90~92%。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征是:步骤(2)中,所述高分子透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入;步骤(4)中,所述低分子量透明质酸或其盐以连续的方式加入或以间歇的方式加入。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征是:步骤(1)中,所述透明质酸酶为细菌产透明质酸酶,优选的为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶,其比活大于1.4×107 IU/mg;步骤(2)中,所述高分子透明质酸或其盐的分子量大于等于1000 kDa,优选为1000 kDa~2000 kDa;优选的,所述高分子透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征是:步骤(2)中,搅拌速度为10~50 rpm;步骤(4)中,搅拌速度为10~50 rpm。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征是:步骤(2)和(4)中,酶解温度均为20~48℃,均优选为30~ 40℃;步骤(2)和(4)中,酶解pH均优选为5.5~7.5。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征是:步骤(4)中,酶解液吸收值维持不变时即达到酶解终点。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法,其特征是:步骤(2)中,在50~70℃下处理1~60 min进行灭活;优选的,步骤(5)中,在酶解液中加入活性炭处理1~60 min;优选的,步骤(5)中,活性炭用量为酶解液质量的1~5%。
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