CN115161361A - 酶分子机器技术制备无支链的直链半乳聚糖的方法及应用 - Google Patents

酶分子机器技术制备无支链的直链半乳聚糖的方法及应用 Download PDF

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Abstract

发明公开了一种酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链半乳聚糖的方法及应用，它是运用现代声化技术辅助酶解、α‑普鲁蓝酶，β‑半乳聚糖酶，α‑阿拉伯糖苷酶和β‑木糖苷酶，多酶联用构成制备无支链的支链甘露聚糖的酶分子机器技术体系，脱除阿拉伯糖半乳聚糖中的阿拉伯糖+半乳糖支链，然后经离心分离，絮凝澄清，离子交换技术脱盐祛杂，再用膜分离技术进行分子量聚合度的筛分，最后经浓缩、干燥，制备出不同分子量的直链半乳聚糖。无支链的不同分子量直链半乳聚糖，既具有显著增强免疫力，显著调理胃肠道健康功能食品特性，还可作为辅助抗AD病特医食品的先导物主要成份，更能作为抗AD病创新药先导物前体物质的主要成分。

Description

酶分子机器技术制备无支链的直链半乳聚糖的方法及应用
技术领域
本发明涉及化工技术和酶分子机器技术，更确切说是应用超声波空化传质辅助，多酶联用水解脱除落叶松木粉中阿拉伯糖半乳聚糖中的阿拉伯糖+半乳糖支链，再集成膜技术，制备生成纯度≥95.0％，无半乳糖支链的不同分子量(段)直链半乳聚糖，脱支产生另具生物学意义的阿拉伯糖+半乳糖复合物,形成一类新化合物集群及应用。
背景技术
阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan，AG)在针叶树的木质部中大量存在，特别在落叶松中可达25％。AG的主链由1→3连接的β-D-吡喃型半乳糖基构成，每个主链半乳糖基C-6上有两个或一个l→6连接的β-D-吡喃型半乳糖基和3(2)–O-L-呋喃型阿拉伯糖基-L- 呋喃型阿拉伯糖，所以说，AG也称为高度支链的中性多糖.其主链半乳糖:链半乳糖:侧链阿的比值为6:9:2(蒋杏芬等，1996.1，<兴安落叶松阿拉伯糖基半乳聚糖化学结构的研究>)。
AG作为一种半纤维素，主要应用于食品工业，如作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、增容剂、上光剂、粘结剂，也用于面条、面包和香肠等加工食品中，代替阿拉伯树胶。同时， AG也是一种良好的膳食纤维，可在人体和动物肠道内通过微生物菌群的发酵，提高短链脂肪酸的产量，进而调节肠道菌群，维持体液和电解质的平衡，给肠道上皮细胞提供营养支持等(黄桂东等，2006.7,<阿拉伯半乳聚糖的研究进展>)。
目前，关于AG的研究还局限于如何从落叶松木粉中高效提取方面(张海芸等，2018.4， <超声波法辅助定向降解阿拉伯半乳聚糖的研究>；杨磊等，2015.7，张宏壮等，2021.3，<落叶松阿拉伯半乳聚糖的提取及纯化方法研究进展>)，及AG生理功能的应用研究方面(郑双阳等， 2019.7，<中国专利：一种落叶松阿拉伯半乳聚糖组合物的制备方法及其临床应用>)，AG的高度支链是双刃剑，既产生了某些生理功能，又限制了其生理功能的扩展。
本发明借鉴了半乳甘露聚糖改性和阿拉伯糖半乳聚糖研究方面的一些思路(王玲玲等， 2009.3；雷鹏等2018.7，中国专利：CN108835611A，裴建军等，2003.4，<阿拉伯糖苷酶的研究进展>,高冬梅等，2015.9,超声波在有机合成中的应用综述)。独辟蹊径，研究出用酶分子机器技术制备无支链不同分子量(段)直链半乳聚糖的方法，以图填补该领域的空白。
前面说到的声化作用，主要是指超声波作用于化学反应，特别是有机合成与分解。超声波的声化作用主要是利用超声的空化现象，空化泡崩溃产生局部的高温、高压和强烈的冲击波及射流，为一般条件下难以实现或不可能实现的化学反应提供了一种新的非常特殊的物理化学环境，它是门新兴的声学与化学边缘交叉学科，在有机精细合成和分解反应中大有可为。
发明内容
自然界中的阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，AG)分子量为30～120kDa(Mn)，可分为I 型和II型，且主要是II型，II型AG的取代度高，主链上半乳糖基通过1，3-糖苷键连接，对支链的详细结构尚不清楚，多数研究者认为，半乳聚糖主链上每个半乳糖基的C-6 位都有支链，其中，约一半的支链是β-1，6连接的半乳二聚糖，约四分之一的支链是单个半乳糖，Ara连接在Galp支链上，研究证明没有任何Ara直接与主链——半乳聚糖连接。但也有研究者认为，在半乳聚糖主链的非还原性末端可能存在1，3连接的阿拉伯糖基。AG 的分枝度很高，主链：支链半+支链阿之复合物的比值约为6：9。结构见下：
Figure RE-GDA0003826424720000021
注：半乳糖(Galactan，Gal)＝β-D-Gal；阿拉伯糖(Arabinose，Ara)
R＝β-D-Galp-(1-or α-L-Araf)-(1-or β-L-Arap-(1-3)-L-Aarf-(1-…。
我们应用声化技术辅助普鲁蓝酶和半乳糖苷酶脱除半乳二聚体作为脱支链的首要任务，接着用声化技术辅助阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶把支链半乳糖中混杂的阿拉伯糖也分离出来。
本发明的目的是提出了一种酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链半乳聚糖的方法及应用，它是应用普鲁蓝酶，β-半乳糖苷酶，阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶，及β-半乳聚糖酶共同构成制备直链半乳聚糖的酶分子机器技术体系，脱除落叶松木粉中阿拉伯糖半乳聚糖中的半乳糖+阿拉伯糖支链，经离心分离，硅滤澄清，离子交换脱盐，再用膜技术进行不同分子量聚合度的筛分，浓缩、干燥后制备出不同分子段的直链半乳聚糖。
本发明对已基本脱支的不同分子段直链半乳聚糖混合糖液再应用用膜技术进行分子段筛分，阿拉伯糖半乳聚糖原料转化为不同分子段直链半乳聚糖的得率为25.0％，伴生出的阿拉伯糖+半乳糖得率为55.0％，换算成脱支率为92.0％。
本发明的核心产物既具有增强免疫力，调理胃肠道健康功能食品特性，还可作为辅助抗阿尔茨海默(AD)病的特医食品的先导物主要成份，有望改善患者服药治疗的预后，更具有抗AD病创新药先导物的前体物质的耀眼前景，而脱支产生的阿拉伯糖+半乳糖复合物，具有特殊的生物学功能，可另作他用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种酶分子机器技术制备无支链不同分子段半乳甘露聚糖的方法，包括：
1、第1次酶法水解
用超声波声化技术辅助酶解技术——采用α-D-普鲁蓝酶和β-D半乳糖苷酶协同作用，以降解脱除阿拉伯糖半乳聚糖(AG)上的阿拉伯糖+半乳糖之复合物支链。
(1)为提高酶解效率，参照现有技术，采用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
(2)将含半乳甘露聚糖的瓜尔豆胶原料按底物浓度6～8％调浆混匀，用氨水调节pH至 8.0～8.5，用超声波装置于25MHz、强度30％的超声波处理30min；
(3)将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.0～7.5，干燥后置室温放置2h；
(4)将α-D-普鲁蓝酶和β-D半乳糖苷酶按2：1的比例配成<复合酶A>，在协同作用下酶解阿拉伯糖半乳聚糖(AG)以初步脱除其支链：
(5)在500L酶解罐中，加水350L，底物浓度6～8％，添加<复合酶A>2～5.0％；
(6)酶解罐温度保持在50～55℃，搅拌40～60r/min，pH 6.5～7.5，酶解时间：2～3小时，在酶解过程中采用分光光度法快速测定酶解液中还原糖含量(以推知脱支程度)，当还原糖含量达到20.0％时(本发明的该工序指标是≥20％)，即可停止酶解脱支；
(7)将上述酶解液离心去渣后用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶，絮凝去蛋白，硅滤机过滤去杂与澄清；
(8)离子交换装置脱盐，为下工序纳滤的污染防治创造条件；
(9)澄清酶解液再经1kDa超滤或600Da纳滤分离出阿拉伯糖+半乳糖之复合物，阿拉伯糖+半乳糖之复合物得率为20％， 而已初步脱支的直链半乳聚糖称为“1#产物”；
2、第2次酶法水解——用超声波声化技术辅助酶解技术——用α-L-阿拉伯糖苷酶、β-D-木糖苷酶和β-D半乳糖苷酶按1：0.5：0.5的比例配成<复合酶B>，作用于前述“1#产物”，进行第2次脱除AG剩余的支链；
(1)为提高酶解效率，参照现有技术，采用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
(2)将“1#产物”按底物浓度6～8％调浆混匀，用氨水调节pH至8.0～8.5，用超声波装置于25MHz、强度30％的超声波处理30min；
(3)将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.0～7.5，干燥后置室温放置2h；
(4)在500L酶解罐中，按有效容量70％计，加入上述超声处理过的产物350kg，50～55℃，搅拌40～60r/min，pH在7.0～7.5之间，按0.5～0.8％添加<复合酶B>酶法水解，继续脱除前述“1#产物”中剩余的阿拉伯糖+半乳糖的支链；
(5)酶解1.5小时后，用分光光度法快速测定酶解液中还原糖含量，当还原糖含量达到 18.0％(本发明的该工序指标是≥18.0％)时，即可停止酶解脱支；
(6)对上述酶解液进行灭酶与过滤澄清，再经1kDa超滤或600Da纳滤分离出半乳糖+ 阿拉伯糖之复合物，该复合物得率为18％，经第2次脱支后，其产物为基本无支链的直链半乳聚糖，称为“2#产物”，以上2次酶法水解共获得阿拉伯糖+半乳糖为38％，脱支率为89％；直链半乳聚糖的得率为25.0％。
3、脱支链检测与计算
(1)参照张志华等，<分光光度法测定木糖醇中的还原糖含量，2004,3期中国食品添加剂>)，测定半乳聚糖酶解脱支溶液中还原糖(半乳糖)的含量为38.0％，还原糖(阿拉伯糖+ 半乳糖)的生成率可以方便地换算成阿拉伯糖+半乳糖的脱支率。
(2)通过公式计算阿拉伯糖+半乳糖的脱支率：
Figure RE-GDA0003826424720000041
式中：Dr％为半乳糖+阿拉伯糖的脱枝率；M1为脱支酶解溶液中还原糖的含量，单位为克；M2为阿拉伯糖半乳聚糖中阿拉伯糖+半乳糖的理论质量＝43，单位为克。
(3)上述3次酶解脱支后的还原糖含量为38.0％，换算成总脱支率(Dr)为：
Figure RE-GDA0003826424720000042
4、第3次酶法水解——用β-半乳聚糖酶对上述“2#产物”——已基本脱支链的直链半乳聚糖进行适度并可控的酶法水解：
(1)在500L酶解罐中，按有效容量70％计，加入已脱除阿拉伯糖+半乳糖支链的直链半乳聚糖350kg，调整pH在6.5～7.5之间，加热至45～50℃，并保温；
(2)按β-半乳聚糖酶酶与直链半乳聚糖即“2#产物”之比为1:10～15加酶，并搅拌均匀，酶解1.0～1.5小时，在酶解过程中用NDJ-型旋转粘度计，以12rpm的转速检测50℃时酶解液的粘度，当酶解液粘度为250～300mPa·s时，停止降解；
(3)离心分离与去杂，用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶灭酶、过滤澄清；
(4)再次离子交换脱盐，可称为“3#产物”——即“已基本脱除半阿拉伯糖+半乳糖支链的不同分子段直链半乳聚糖的混合糖液”，占阿拉伯糖半乳聚糖原料的得率为25％，伴生的阿拉伯糖+半乳糖之复合物为38.0％，换算成脱支率为89.0％。
进一步的技术方案，所述的酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链半乳聚糖的方法制备出的产品，所述含阿拉伯半乳聚糖的半纤维素原料包括但不限于：落叶松木粉，韭葱根、胡萝卜、马铃薯等食物，具有免疫提高性的中草药，如仙人掌、徐长卿、野靛草等，抗酸分枝杆菌等微生物；应用酶分子机器技术体系进行酶解及后续的配套操作以制备不同分子段直链半乳聚糖的方法与上述方法相同。
进一步的技术方案，所述的声化技术辅助酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链半乳聚糖的方法，还包括应用中空纤维超滤膜装置，设60kDa，30kDa，20kDa，10kDa，6kDa， 2kDa，共6组截留不同分子量的超滤膜组件，在超滤压力为0.25～0.30MPa，待超滤液pH 为7.5～8.0，温度为25～28℃的条件下，对“3#产物”进行连续超滤分级：
进一步的技术方案，所述的酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链半乳聚糖的方法制备出的产品，可以筛分出不同分子段的产品，A类产品为直链半乳亚聚糖，分子量＞ 60kDa，约占“3#产物”的5.0％，B类产品为直链半乳次亚聚糖(40～60kDa以上)，约占“3#产物”的10.0％，C类产品为直链半乳次聚糖(20～40kDa)，约占“3#产物”的30％， D类产品为直链中分子半乳聚糖(10～20kDa)，约占“3#产物”的25％，E类产品为直链小分子甘露聚糖(甘露大糖，6～10kDa)，约占“3#产物”的15％，F类产品为直链大分子半乳寡糖(2～6kDa)，约占“3#产物”的10％，G类产品为直链小分子甘露寡糖(＜2kDa)约占“3#产物”的5.0％；将2～40kDa不同分子段聚合度直链半乳聚糖液分别经真空浓缩、喷雾干燥产出糖粉成品，这些产品统称为“4#产物”；＞60kDa的直链半乳聚糖和＜2kDa的直链半乳寡糖将另作他用。
上述“5#产物”中，B\C\D\E为本发明的核心产物，统称为5#产物，四者之和占超滤前“4#产物”的80.0％，占阿拉伯半乳聚糖原料的20.0％，纯度≥95％。
进一步的技术方案，还可以在小分子半乳寡糖基础上，参照刘坐镇等于1999.11月报道的《D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂在柠檬酸精制中的应用》中的技术方法使用 D315大孔树脂作为分离介质经玻璃层析柱(φ25mm×800mm)从半乳寡糖中分离出半乳六糖和半乳五糖二个糖分子单体。
进一步的技术方案，所述的酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链半乳聚糖的方法制备出的产品，直链半乳聚糖的经检测：总糖：≥99.5％，以100克阿拉伯糖半乳聚糖原料为例：酶解生成4#产物25克，伴生阿拉伯糖+半乳糖38克，超滤筛分出核心产物B\C\D\E共20克。
进一步的技术方案，所述的无支链不同分子量(段)直链半乳聚糖中：直链半乳大糖(6～ 10kDa)具有显著增强免疫力，显著调理胃肠道健康功能食品特性；直链中分子半乳聚糖 (10～20kDa)可作为辅助抗AD病的特医食品的先导物主要成份，有望改善阿尔茨海默(AD) 病患者服药治疗的预后；直链半乳次聚糖(20～40kDa)更具有抗AD病创新药先导物的前体物质的耀眼前景；而脱支产生的阿拉伯糖+半乳糖，其特殊的生物学功能，可另作他用。
本发明还提供采用上述方法制备得到的直链半乳露次亚聚糖(40～60kDa)；
本发明还提供采用上述方法制备得到的直链半乳露次聚糖(20～40kDa)；
本发明还提供采用上述方法制备得到的直链中分子半乳聚糖(10～20kDa)；
本发明还提供采用上述方法制备得到的直链小分子半乳聚糖(半乳大糖)(6～10kDa)；
本发明还提供采用上述方法制备得到的直链大分子半乳寡糖(2～6kDa)；
上述技术方案中，所述％为质量百分含量。
名词解释(以下指来源于落叶松木粉酶解后的不同分子段直链半乳聚糖)
1、直链半乳聚糖，其数均分子量范围是：＞100kDa。
2、直链半乳亚聚糖，其数均分子量范围是：60～100kDa。
3、直链半乳次亚聚糖，其数均分子量范围是：40～60kDa。
4、直链半乳次聚糖，其数均分子量范围是：20～40kDa。
5、直链中分子半乳聚糖，其数均分子量范围是：10～20kDa。
6、直链小分子半乳聚糖(半乳大糖)，其数均分子量范围是：6～10kD。
7、直链大分子半乳寡糖，其数均分子量范围是：2～6kD)。
8、直链小分子半乳寡糖，其数均分子量范围是：＜2kDa。
本发明的创新点(有益效果)
——本发明应用声化技术辅助酶分子机器技术生成不同分子段直链半乳聚糖，再集成膜技术，筛分出分子量由2kDa到60kDa，分布较宽，是一类新化合物集群，为全球首创。
——本发明制备的不同分子段直链半乳聚糖极大地拓展了应用领域，6～10kDa直链半乳大糖是优良的健康食品的终端产品；10～20kDa中分子直链半乳聚糖是辅助抗AD病特医食品的前体物质；而20～40kDa直链半乳次聚糖更展现出抗AD病创新药先导物的耀眼前景。
——本发明娴熟地应用酶技术结合膜技术及膜污染防治方法，经济而高效的工艺技术把太阳能光合作用产出的一种植物多糖制备成不同分子段直链半乳聚糖、脱支产生技术经济价值较高的阿拉伯糖+半乳糖等四种产品，诠释了创新技术赋能经济价值的深刻内涵。
具体实施方式
下面以实施例对本发明进一步说明。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许发明人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本发明的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，实施案例仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限制本发明的范围，从而应当理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，由其获得的其他改进方式和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例1
1、第1次酶解
用超声波声化技术辅助酶解技术——采用市售食品级α-D-普鲁蓝酶和β-D半乳糖苷酶协同作用，以降解脱除阿拉伯糖半乳聚糖(AG)上的阿拉伯糖+半乳糖之复合物支链：
(1)为提高酶解效率，参照现有技术，采用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
(2)将含半乳聚糖主链的阿拉伯糖半乳聚糖原料按底物浓度6～8％调浆混匀，用氨水调节pH至8.0～8.5，用超声波装置于25MHz、强度30％的超声波处理30min；
(3)将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.0～7.5，干燥后置室温放置2h；
(4)将α-D-普鲁蓝酶和β-D半乳糖苷酶按2：1的比例配成<复合酶A>，在协同作用下酶解阿拉伯糖半乳聚糖(AG)以初步脱除其支链：
(5)在500L酶解罐中，加水350L，底物浓度6～8％，添加<复合酶A>2～5.0％；
(6)酶解罐温度保持在50～55℃，搅拌40～60r/min，pH 6.5～7.5，酶解时间：2～3小时，在酶解过程中采用分光光度法快速测定酶解液中还原糖含量(以推知脱支程度)，当还原糖含量达到20.0％时(本发明的该工序指标是≥20％)，即可停止酶解脱支；
(7)将上述酶解液离心去渣后用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶，絮凝去蛋白，硅滤机过滤去杂与澄清；
(8)离子交换装置脱盐，为下工序纳滤的污染防治创造条件；
(9)澄清酶解液再经1kDa超滤或600Da纳滤分离出阿拉伯糖+半乳糖之复合物，阿拉伯糖+半乳糖之复合物得率为30％，而已初步脱支的直链半乳聚糖称为“1#产物”；
2、第2次酶法水解——用超声波声化技术辅助酶解技术——用α-L-阿拉伯糖苷酶、β-D- 木糖苷酶和β-D半乳糖苷酶按1：0.5：0.5的比例配成<复合酶B>，作用于前述“1#产物”，进行第2次脱除AG剩余的支链：
(1)为提高酶解效率，参照现有技术，采用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
(2)将含半乳甘露聚糖的瓜尔豆胶原料按底物浓度6～8％调浆混匀，用氨水调节pH至 8.0～8.5，用超声波装置于25MHz、强度30％的超声波处理30min；
(3)将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.0～7.5，干燥后置室温放置2h；
(4)在500L酶解罐中，按有效容量70％计，加入上述超声处理过的产物350kg，50～55℃，搅拌40～60r/min，pH在7.0～7.5之间，按0.5～0.8％添加<复合酶B>酶法水解，继续脱除前述“1#产物”中剩余的阿拉伯糖+半乳糖的支链；
(5)酶解1.5小时后，用分光光度法快速测定酶解液中还原糖含量，当还原糖含量达到18.0％(本发明的该工序指标是≥18.0％)时，即可停止酶解脱支；
(6)对上述酶解液进行灭酶与过滤澄清，再经1kDa超滤或600Da纳滤分离出半乳糖+ 阿拉伯糖之复合物，该复合物得率为18％，经第2次脱支后，其产物为基本无支链的直链半乳聚糖，称为“2#产物”，以上2次酶法水解共获得阿拉伯糖+半乳糖为38％，脱支率为89％；直链半乳聚糖的得率为25.0％。
3、脱支链检测与计算
(1)参照张志华等，<分光光度法测定木糖醇中的还原糖含量，2004,3期中国食品添加剂>)，测定半乳半乳聚糖酶解脱支溶液中还原糖(半乳糖)的含量为38.0％，还原糖(阿拉伯糖+半乳糖)的生成率可以方便地换算成阿拉伯糖+半乳糖的脱支率；
(2)通过公式计算阿拉伯糖+半乳糖的脱支率：
Figure RE-GDA0003826424720000081
式中：Dr％为阿拉伯糖+半乳糖的脱枝率；M1为脱支酶解溶液中还原糖的含量，单位为克；M2为阿拉伯糖半乳聚糖中阿拉伯糖+半乳糖的理论质量＝43，单位为克；
(3)上述3次酶解脱支后的还原糖含量为38.0％，换算成总脱支率(Dr)为：
Figure RE-GDA0003826424720000082
4、第3次酶解——用β-半乳聚糖酶对上述“3#产物”——已基本脱支链的直链半乳聚糖进行适度并可控的酶法水解：
(1)在500L酶解罐中，按有效容量70％计，加入已脱除阿拉伯糖+半乳糖支链的直链半乳聚糖350kg，调整pH在6.5～7.5之间，加热至45～50℃，并保温；
(2)按β-半乳聚糖酶酶与直链半乳聚糖即“2#产物”之比为1:10～15加酶，并搅拌均匀，酶解1.0～1.5小时，在酶解过程中用NDJ-型旋转粘度计，以12rpm的转速检测50℃时酶解液的粘度，当酶解液粘度为250～300mPa·s时，停止降解；
(3)离心分离与去杂，用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶灭酶、过滤澄清；
(4)再次离子交换脱盐，可称为“3#产物”——即“已基本脱除半乳糖+阿拉伯糖支链的不同分子段直链半乳聚糖的混合糖液”，占阿拉伯糖半乳聚糖原料的得率为25％，伴生的阿拉伯糖+半乳糖之复合物为38.0％，换算成脱支率为89.0％。
实施例2
本发明所用的含阿拉伯糖半乳聚糖的原料包括但不限于：落叶松木粉，韭葱根、胡萝卜、马铃薯等食物，具有免疫提高性能的仙人掌、徐长卿、野靛草等中草药，抗酸分枝杆菌等微生物。应用酶分子机器技术体系中的阿拉伯糖苷酶，普鲁蓝酶，木糖苷酶和β-半乳聚糖酶协同制备不同分子段无支链之直链半乳聚糖的方法与上实施例1相同。
实施例3
运用中空纤维超滤膜装置，设60kDa，40kDa，20kDa，10kDa，6kDa，2kDa，共6 套截留不同分子量的超滤膜组件，以截留不同半乳聚糖分子量(Mn，下同，)及不同聚合度 (DP)，在pH呈碱性(碱性条件下，使膜表面带正电荷，有助于提高透过速率)，多肽混合液浓度10.0％，及其它工艺条件下，对实施例1～2所得产物进行连续超滤，及单体分离：
1、连续超滤分级
(1)超滤压力为0.25～0.30MPa，调整待超滤液pH为8.0～8.5，温度为26～28℃。
(2)待超滤液先进入60kDa超滤膜组件进行第1级超滤，得到截留液A和透过液A’；
(3)透过液A’加压进入截留分子量为40kDa的超滤膜组件进行第2级超滤，得到截留液B 和透过液B’，截留液B是直链半乳次亚聚糖，分子量40～60kDa，占“3#产物”的10.0％；
(4)透过液B’加压进入截留分子量为20kDa的超滤膜组件进行第3级超滤，得到截留液 C和透过液C’，截留液C是直链半乳次聚糖，分子量20～40kDa。占“3#产物”的30％；
(5)透过液C’加压进入截留分子量为10kDa的超滤膜组件进行第4级超滤，得到截留液 D和透过液D’，截留液D是直链中分子半乳聚糖，分子量10～20kDa，占“3#产物”的25％；
(6)透过液D’加压进入截留分子量为6kDa的超滤膜组件进行第5级超滤，得到截留液 E和透过液E’，截留液E是直链小分子半乳聚糖，分子量6～10kDa，占“3#产物”的15％；
(7)透过液E’加压进入截留分子量为2kDa的超滤膜组件进行第6级超滤，得到截留液 F和透过液G，截留液F称为直链大分子半乳寡糖,分子量2～6kDa，占“3#产物”的10％；
(8)透过液G称为直链小分子半乳寡糖,分子量＜2kDa，占“3#产物”的5.0％。
2、除了上述超滤筛分以外，还可以在小分子半乳寡糖基础上，参照刘坐镇等于1999.11 月报道的《D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂在柠檬酸精制中的应用》中的技术方法使用D315大孔树脂作为分离介质经玻璃层析柱(φ25mm×800mm)从半乳寡糖中分离出半乳六糖和半乳五糖二个糖分子单体。
3、前述产品经浓缩、干燥得到不同分子量直链半乳聚糖粉，统称为“4#产物”，而＜60kDa的直链半乳聚糖，以及＜2kDa的直链半乳寡糖将另作他用。
4、经超滤筛分的“5#产物”中，B\C\D\E为本发明的核心产物，统称为5#产物，四者之和占超滤前“3#产物”的80.0％。以100克阿拉伯糖半乳聚糖原料为例：酶解生成“3 #产物”25克，超滤筛分出核心产物——B\C\D\E 20克，伴生阿拉伯糖+半乳糖38克。
实施例4
1、发明人所在公司的化验室对上述实施例1～2的有关指标进行了检测，结果如下：
Figure RE-GDA0003826424720000101
注：上表是以阿拉伯糖半乳聚糖为原料酶法制备直链甘露聚糖的相关数据。阿拉伯糖半乳聚糖原料中含半乳聚糖为80％，酶解转化率为90％，也就是80％×90％＝72％(直链半乳聚糖)。按阿拉伯糖+半乳糖：半乳露糖＝9：6的比值，阿拉伯糖+半乳糖的理论质量为43.0％，半乳聚糖的理论质量为28.0％，上表说明,还原糖(阿拉伯糖+半乳糖)总得率为38.0％,总脱支率为89.0％；脱支中有漏损；表中的直链即直链半乳聚糖,得率为25.0％；核心成份得率即2～40kDa占直链半乳聚糖的比率。
2、还原糖的快速检测采用分光光度法——参照张志华等(分光光度法测定木糖醇中的还原糖含量，2004，3期<中国食品添加剂>)。
3、本发明酶解制备无支链之直链半乳聚糖的技术原理见附图1
槐豆胶及其它含半乳甘露聚糖的原料的技术原理与之相同。
4、工艺流程图见附图2(1)～(4)：
(1)超声波声化技术辅助普鲁蓝酶和半乳糖苷酶脱除阿拉伯糖/半乳糖支链
(2)超声波声化技术辅助阿拉伯糖苷酶+木糖苷酶+半乳糖苷酶脱除剩余的阿拉伯糖/半乳糖支链
(3)应用β-半乳聚糖酶适度酶解无支链的直链半乳聚糖为不同聚合度直链半乳聚糖
(4)应用超滤装置对不同分子段直链半乳聚糖的混合糖液，即“3#产物”进行超滤筛分出3～30kDa不同分子量聚合度直链半乳聚糖的核心产物，统称为“3#产物”。
5、HPLC测定相对分子质量：
采用Waters TM650E高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和M32工作站)。
色谱柱：TSKgel 2000SWXL(300mm×7.8mm)；流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝45：55：0.1(体积比)；检测波长：UV 220nm；流速：0.5mL·min-1；柱温：30℃。
取不同分子段直链半乳聚糖的样品配成一定浓度的溶液，离心(4000r/min，15min)，除去沉淀后，通过HPLC分别测定其分子量分布，进样量：10μL。
不同分子段直链半乳聚糖分子量色谱图见说明书附图3。
实施例5
药学功能实验——直链半乳次聚糖(20～40kDa)<体外细胞抗肿瘤活性实验>
直链半乳次聚糖(20～40kDa)抗肿瘤活性的实验，分别取处于对数期生长的Hela和 HL-60、SPCA-1和BGC-832细胞株采用MTT(四氮唑盐)比色法进行试验，通过埋板、加药培养，MTT法检测等一系列试验步骤。在490nm处用酶联免疫检测仪测定各孔OD 值，计算抑制率。我们选择了临床上应用比较成熟且抗肿瘤效果较好的CDDP(顺铂)注射液作为阳性对照，采用抑制率(IR,％)方法评价。
初筛抑制率(IR％)如下表：
在100ug/ml浓度下样品对肿瘤细胞抑制率
Figure RE-GDA0003826424720000111
结论：直链半乳次聚糖(20～40kDa)在体外对肿瘤细胞的增殖有一定的抑制作用，虽然其抑制率低于阳性对照组和甘露聚糖肽药物，但其大于50％的抑制率也初步展显出药学效能，若进一步优化直链半乳次聚糖(20～40kDa)的结构后必定会有更显著的抗病变效果。
实施例6
生理功能试验——直链中分子半乳聚糖(10～20kDa)调节人体免疫功能的对比试验
1、直链中分子半乳聚糖(10～20kDa)对单核—巨噬细胞功能的影响
项目 中剂量对照组 本发明中剂量组
吞噬率％ 43.0±3.0 48.5±2.4
吞噬指数 0.4±0.01 0.48±0.02
吞噬指数a 5.97±0.52 6.55±0.43
注：①中剂量对照组是已授权专利CN 102373256 B中的相关内容：
②中剂量组日服直链中分子半乳聚糖：1.5g；
③与对照组比较，表明本发明中剂量组能显著提高吞噬率\吞噬指数和碳廓清指数。
2、直链中分子半乳聚糖(10～20kDa)对NK细胞活性的影响
项目 已授权专利中剂量对照组 中剂量组
NK细胞活性％ 27.98±6.68 33.84±6.74*
注：①中剂量对照组是已授权专利CN 102373256 B中的相关内容：
②中剂量组日服直链中分子半乳聚糖：1.5g；
③与对照组比较，表明本发明中剂量组能显著增强NK细胞活性；
结论：直链中分子半乳聚糖(10～20kDa)有显著的免疫调节功能。
实施例7
生理功能试验——<调节人体肠道菌群的功能对比试验>
1、食用直链小分子半乳聚糖(6～10kDa)后抑制人体肠道有害菌的对比试验结果
Figure RE-GDA0003826424720000121
注：①对照组是抄录已授权专利CN 102373256 B中的相关内容：
②食用量为1.5g/日直链小分子半乳聚糖；
③与对照组比较，本发明中的直链小分子半乳聚糖(半乳大糖，6～10kDa)能极显著抑制人体肠道有害菌。
2、食用直链大分子半乳寡糖(2～6kDa)后增殖人体肠道有益菌的对比试验结果
Figure RE-GDA0003826424720000131
注：①对照组是抄录已授权专利CN 102373256 B中的相关内容：
②食用量为1.5g/日直链小分子半乳聚糖(半乳大糖，6～10kDa)；
③与对照组比较，本发明中的直链大分子半乳寡(2～6kDa)能显著增殖肠道有益菌。
结论：直链大分子半乳寡糖(2～6kDa)能显著增殖肠道有益菌，而直链小分子半乳聚糖(6～10kDa)则能明显减少肠杆菌和产气荚膜梭菌等有害菌的数量，效果极显著，推测其原因是其分子量大于对照组“甘露低聚糖”的结果。
附图说明
1、说明书附图1是本发明酶解阿拉伯糖半乳聚糖中的阿拉伯糖+半乳糖支链制备无支链之直链半乳聚糖的技术原理图，包括：
上左：是阿拉伯半乳聚糖主链与支链的分子结构图；
上右：是酶法脱除阿拉伯半乳聚糖的支链；
下中：是直链半乳聚糖分子结构图。
2、说明书附图2是阿拉伯糖半乳聚糖脱支链工艺流程图，包括：
(1)示例：超声波声化技术辅助普鲁蓝酶和半乳糖苷酶脱除阿拉伯糖/半乳糖支链；
(2)示例：超声波声化技术辅助阿拉伯糖苷酶+木糖苷酶+半乳糖苷酶脱除剩余的阿拉伯糖/半乳糖支链；
(3)示例：半乳聚糖酶可控酶解生成不同分子量直链半乳聚糖混合液；
(4)示例：超滤技术筛分不同分子量(段)直链半乳聚糖。
3、说明书附图3是直链半乳聚糖分子量检测图，包括：
a示例：直链半乳聚糖(20～40kDa)色谱图，由左至右，第1个峰是40kDa，依次是30kDa 和20kDa；
b示例：直链半乳聚糖分子量(10～20kDa)色谱图，由左至右，第1个峰是20kDa，第2个峰是10kDa；
c示例：色谱图直链半乳聚糖分子量(6～10kDa)色谱图，由左至右，第1个峰是10kDa，依次是8kDa和6kDa。

Claims (7)

1.酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链半乳聚糖的方法，其特征在于：
⑴第1次酶解
用超声波声化技术辅助酶解技术——采用市售食品级α-D-普鲁蓝酶和β-D半乳糖苷酶协同作用，以降解脱除阿拉伯糖半乳聚糖(AG)上的半乳糖+阿拉伯糖之复合物支链：
①为提高酶解效率，参照现有技术，采用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
②将含半乳聚糖主链的阿拉伯糖半乳聚糖原料按底物浓度 6～8%调浆混匀，用氨水调节pH至8.0～8.5，用超声波装置于25 MHz、强度30%的超声波处理30min；
③将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.0～7.5，干燥后置室温放置2 h；
④将α-D-普鲁蓝酶和β-D半乳糖苷酶按2：1的比例配成<复合酶A>，在协同作用下初步酶解脱除阿拉伯糖+半乳聚糖支链：
⑤在500L酶解罐中，加水350L，底物浓度 6～8%，添加<复合酶A> 2～5.0%；
⑥酶解罐温度保持在 50～55℃，搅拌40～60r/min，pH 6.5～7.5，酶解时间：2～3小时，在酶解过程中采用分光光度法快速测定酶解液中还原糖含量(以推知脱支程度)，当还原糖含量达到20.0 %时(本发明的该工序指标是≥20 %)，即可停止酶解脱支；
⑦将上述酶解液离心去渣后用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶，絮凝去蛋白，硅藻土过滤机过滤去杂与澄清；
⑧离子交换装置脱盐，为下工序纳滤的污染防治创造条件；
⑨澄清酶解液再经1kDa超滤或600Da纳滤分离出半乳糖+阿拉伯糖之复合物，半乳糖+阿拉伯糖之复合物得率为20%，而已初步脱支的直链半乳聚糖称为“1＃产物”；
⑵第2次酶法水解——用超声波声化技术辅助酶解技术——用α-L-阿拉伯糖苷酶、β-D-木糖苷酶和β-D半乳糖苷酶按1：0.5：0.5的比例配成<复合酶B>，作用于前述“1＃产物”，继续脱除AG支链；
①为提高酶解效率，参照现有技术，采用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
②将“1＃产物”按底物浓度 6～8%调浆混匀，用氨水调节pH至8.0～8.5，用超声波装置于25 MHz、强度30%的超声波处理30min；
③将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.0～7.5，干燥后置室温放置2 h；
④在500L酶解罐中，按有效容量70%计，加入上述超声处理过的产物350kg， 50～55℃，搅拌40～60 r/min，pH 在 7.0～7.5之间，按0.5～0.8%添加 <复合酶B>酶法水解，继续脱除前述“1＃产物”中剩余的的阿拉伯糖+半乳糖支链；
⑤酶解1.5小时后，用分光光度法快速测定酶解液中还原糖含量，当还原糖含量达到18.0 %(本发明的该工序指标是≥18.0%)时，即可停止酶解脱支；
⑥对上述酶解液进行灭酶与过滤澄清，再经1kDa超滤或600Da纳滤分离出阿拉伯糖+半乳糖之复合物，该复合物得率为18%，经第2次脱支后，其产物为基本无支链的直链半乳聚糖，称为“2＃产物”，以上2次酶法水解共获得阿拉伯糖+半乳糖支链为38%，脱支率为89%；直链半乳聚糖的得率为25.0%；
⑶第3次酶法水解——用β-半乳聚糖酶对上述“2＃产物”——已基本脱支链的直链半乳聚糖进行适度并可控的酶法水解：
①在500L酶解罐中，按有效容量70%计，加入已脱除阿拉伯糖+半乳糖支链的直链半乳聚糖350kg，调整pH 在 6.5～7.5之间，加热至 2＃产物”之比为 1: 10～15加酶，并搅拌均匀，酶解1.5～2小时，在酶解过程中用NDJ-型旋转粘度计，以 12rpm 的转速检测 50℃ 时酶解液的粘度，当酶解液粘度为250～300 mPa•s时，停止降解；
③离心分离与去杂，用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶、过滤澄清；
④再次离子交换脱盐，可称为“3＃产物”——即“已基本脱除阿拉伯糖+半乳糖支链的不同分子段直链半乳聚糖的混合糖液”，占阿拉伯糖半乳聚糖原料的得率为25%，伴生的阿拉伯糖+半乳糖之复合物为38.0%，换算成脱支率为89.0%。
2.根据权利要求1所述的酶分子机器技术制备无支链不同分子量(段)直链半乳聚糖的方法，其特征还在于：所述含阿拉伯糖半乳聚糖的半纤维素原料包括但不限于：落叶松木粉，韭葱根、胡萝卜、马铃薯等食物，具有免疫提高性的中草药，如仙人掌、徐长卿、野靛草等，以及抗酸分枝杆菌等微生物。
3.根据权利要求1所述的酶分子机器技术制备无支链不同分子量(段)直链半乳聚糖的方法，其特征还在于：应用中空纤维超滤膜装置，设60kDa，30kDa，20kDa，10 kDa，6kDa，2kDa，共6组截留不同分子量的超滤膜组件，在超滤压力为0 .25～0 .30 MPa，待超滤液 pH为 7.5～8.0，温度为 25～28℃的条件下，对“3＃产物”进行连续超滤分级。
4.根据权利要求2所述的酶分子机器技术制备无支链不同分子量(段)直链半乳聚糖的方法制备出的产品，其特征在于，所述“3＃产物”可以筛分出不同分子段的产品，A类产品为直链半乳亚聚糖，分子量＞60kDa，约占“3＃产物”的5.0%，B类产品为直链半乳次亚聚糖(40～60kDa以上)，约占“3＃产物”的10.0%，C类产品为直链半乳次聚糖(20～40kDa)，约占“3＃产物”的30%，D类产品为直链中分子半乳聚糖(10～20kDa)，约占“3＃产物”的25%，E类产品为直链小分子半乳聚糖(半乳大糖，6～10kDa)，约占“3＃产物”的15%，F类产品为直链大分子半乳寡糖(2～6kDa)，约占“3＃产物”的10%，G类产品为直链小分子半乳寡糖(＜2kDa)约占“3＃产物”的5.0%；将2～40kDa不同分子段聚合度直链半乳聚糖液分别经真空浓缩、喷雾干燥产出糖粉成品，这些产品统称为“4＃产物”；＞60kDa的直链半乳聚糖和＜2kDa的直链小分子半乳寡糖另作他用。
5.根据权利要求4所述的超滤筛分出的直链小分子半乳寡糖产品，其特征还在于，参照刘坐镇等于1999.11月报道的《D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂在柠檬酸精制中的应用》中的技术方法用D315大孔树脂经玻璃层析柱从半乳寡糖中分离出半乳六糖和半乳五糖二个糖分子单体。
6.根据权利要求4所述的经超滤筛分的“4＃产物”中，B\C\D\E为本发明的核心产物，统称为5＃产物，四者之和占超滤前“3＃产物”的80.0%，占阿拉伯半乳聚糖原料的20.0%，纯度≥95%。
7.无支链不同分子段直链半乳聚糖，其特征还在于，采用权利要求1～5任意一项方法制备得到，检测其总糖：≥99.5%；以100克阿拉伯糖半乳聚糖原料为例：酶解生成3＃产物25克，超滤筛分出核心产物——B\C\D\E 20克，伴生阿拉伯糖+半乳糖38克。
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