KR20100138440A

KR20100138440A - 푸코이단 분해 효소 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20100138440A
Application number: KR1020090056982A
Authority: KR
Inventors: 정미경; 박주웅; 서현효; 박용일; 김우중; 이성환
Original assignee: 주식회사 한립생명공학
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2010-12-31

Abstract

본 발명은 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드, 이를 이용한 푸코이단 분해 효소의 정제방법, 상기 방법에 의해 정제한 푸코이단 분해 효소 및 상기 푸코이단 분해 효소를 이용하여 푸코 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 푸코이단 분해 효소의 정제로 인해 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 수율을 높일 수 있으며, 이러한 푸코 올리고당은 푸코이단보다 항혈액 응고작용, 항스트레스, 콜레스테롤 저하 작용, 항종양 작용 등이 우수하고, 저분자이므로 다양한 약제, 식품 및 기능성 화장품 등의 활성성분으로 이용할 수 있다.

스핑고모나스, 푸코이단, 푸코 올리고당, 푸코이단 분해효소

Description

푸코이단 분해 효소 및 이의 제조방법 {Fucoidanase and Method of Preparing the Same}

본 발명은 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드, 이를 이용한 푸코이단 분해 효소의 정제 방법, 및 상기 방법에 의해 정제한 푸코이단 분해 효소에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 푸코이단 분해 효소를 이용하여 푸코 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

다시마, 미역, 톳 같은 갈조류에는 중성 다당인 라미나란 (laminaran)과 황산기를 함유한 산성 다당이 다량 함유되어 있는데 대표적인 함황 산성 다당이 푸코이단이다. 푸코이단은 L-푸코오스에 에스테르화 황산을 주성분으로 하며 소량의 D-자일로오스, D-갈락토오스 및 우론산 등을 함유한 함황 헤테로 (hetero)형 산성 다당으로, 일반적으로 분자량이 20만 달톤이 넘는 거대분자로서, 푸코이단의 생리활성을 나타내는 주요성분은 주로 황산기인 것으로 알려져 있다.

푸코이단은 기타 식이 섬유 다당인 알긴산, 카라기난 (carrageenan), 라미나란 등과는 구조 및 생리적 작용이 다르고, 오히려 동물의 혈액응고 저해능이 있는 산성 다당인 헤파린과 구조 및 작용이 매우 유사하고 헤파린과 비교시 약 40% 정도 의 항혈액응고 및 혈액정화 활성을 나타낸다 (Chizhov 등, Chordajlum Carbohydrates Res, 1999, vol.319, pp.108-119). 또한, 항염증(antiinflammatory), 항암(antitumor), 항바이러스(antiviral) 및 면역억제 (immunosuppressive) 등의 탁월한 생리활성능이 밝혀지고 있다 (McClure 등, AIDA Res. Hum. Retroviruses, 1992, vol.8, pp.19-26; Nagumo와 Nishino, In Polysaccharides in Medicinal Applications, 1997, pp.545-574; Patankar 등, J. Biol. Chemi. 1993, vol.268, pp.21770-21776).

푸코이단의 항암활성 기작은 종양세포의 표면전하에 작용하여 음전하를 띄게 하여 전이를 억제하거나 숙주의 면역 방어 기능을 활성화시킴으로써 항암활성을 나타낸다 (Yamamoto 등, JPN. J. Exp. Med., 1981, vol.51, pp.187-189). 또한, 황산기를 갖는 푸코이단은 항 HIV 작용도 가지고 있다 (Schaeffer 와 Krylov, Ecotoxicolgy Environmental Safety, 2000, vol.45, pp.208-227). 이러한 생리적 기능성 이외에도 푸코이단은 점성이 낮고 우수한 용해성으로 수용성 식이섬유 소재로서 응용 가능성이 매우 높다.

한편 푸코 올리고당은 푸코이단을 효소분해하여 생성된 것으로서 일반적으로 2 내지 30개의 단당으로 이루어진 황산기를 가진 수용성 올리고당을 의미하는 것으로, 항혈액응고, 항암활성, 항바이러스 작용 등은 대개 거대 분자량의 푸코이단보다 작은 분자량의 푸코 올리고당 상태에서 활성이 증가한다고 보고되었다 (Schaeffer와 Krylov, Ecotoxicolgy Environmental Safety, 2000, vol.45, pp.208-227; Koyanagi 등, Biochemicl Pharmacology, 2003, vol.65, pp.173-179; Nishino 등, Phytochemistry, 1991, vol.30, pp.535-539).

푸코이단은 일반적으로 20만 달톤이 넘는 거대 분자로서 이를 분해하여 작은 분자량으로 만드는 방법으로는 화학적 분해와 효소를 이용하여 분해하는 방법이 있다. 화학적 분해 방법은 분해 정도가 매번 다르며 푸코 올리고당의 활성이 달라지기 때문에 효소적 분해를 많이 사용한다.

푸코이단을 분해하는 미생물에 대한 연구는 세계 여러 곳에서 진행 중에 있으며 푸코이단 분해능을 가진 몇몇 미생물들이 알려져 있으나, 푸코이단을 분해하는 효소의 명확한 분해 기작 및 완전 정제에 관하여는 알려진 것이 거의 없어, 현재 상업적으로 시판되는 푸코이단 분해 효소는 없다.

본 발명은 높은 수율로 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해할 수 있는 푸코이단 분해 효소를 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 푸코이단 분해 효소의 정제를 위한 친화성 비드 및 이를 이용한 정제방법을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 푸코이단 분해 효소를 이용하여 푸코이단을 분해하여 푸코 올리고당을 제조함을 목적으로 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드, 상기 친화성 비드를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 푸코이단 분해 효소의 정제 방법 및 그 방법에 의해 정제된 푸코이단 분해 효소를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 푸코이단 분해 효소를 이용하여 푸코 올리고당을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) PF-1 미생물로부터 얻어지고 최적 온도가 30℃, 최적 pH가 5.0인 푸코이단 분해 효소를 제공한다. 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) PF-1은 대한민국특허 제10-0887682호에 따른 균주로서, 기탁번호가 KCTC 11130BP 이다.

본 발명에 따른 푸코이단 분해 효소는 27℃ 내지 40℃ 에서 높은 효소 활성을 보이며, 바람직하게는 28℃ 내지 35℃, 최적 온도는 30℃ 인 것을 특징으로 한다. 또한 pH 조건의 경우, pH 4 내지 pH 7에서 높은 효소 활성을 보이며, 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 6.0, 최적 pH 5.0 인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에 따른 푸코이단 분해 효소는 SDS-PAGE 측정 분자량이 약 34, 80, 및 100 kDa 이며, Native PAGE 측정 분자량은 약 30 및 60 kDa 인 것을 특징으로 한다. Somogyi-Nelson 방법으로 측정한 효소의 특이 활성은 0.588 mU/mg 이다.

본 발명은 또한 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) PF-1 미생물로부터 얻은 푸코이단 분해 효소에 의해 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 푸코 올리고당의 제조방법을 제공한다. 상기 푸코이단 분해 효소와 푸코이단을 접하게 하여 푸코이단을 분해하도록 함으로써 저분자 푸코 올리고당을 제조할 수 있다. 바람직하게 상기 푸코 올리고당은 분자량이 1000 내지 10000 Da 의 저분자 푸코 올리고당일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1000 내지 4000 Da 일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서 푸코 올리고당의 제조는 27℃ 내지 40℃ 에서 수행하며, 바람직하게는 28℃ 내지 35℃ 에서 수행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 구체예에서 푸코 올리고당의 제조는 pH 4 내지 pH 7에서 수행하며, 바람직하게는 pH 4.5 내지 pH 6에서 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 푸코이단 10 중량부에 대해 알긴산 5 내지 40 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 "친화성 비드"란 친화성 크로마토그래피에서 친화성 리간드로서 사용되는 물질을 의미한다. 바람직하게는, 상기 푸코이단-알긴산 비드는 푸코이단 10 중량부에 대해 알긴산 15 내지 40 중량부를 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 푸코이단 10 중량부에 대해 알긴산 25 내지 35 중량부를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 친화성 비드에 푸코이단 10 중량부에 대해 폴리비닐알콜 40 내지 60 중량부를 추가로 포함하는 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드를 제공한다. 바람직하게는, 푸코이단 10 중량부에 대해 폴리비닐알콜은 40 내지 60 중량부, 그리고 알긴산은 5 내지 10 중량부일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 친화성 비드를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 푸코이단 분해 효소의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 친화성 크로마토그래피는 친화성 비드를 컬럼에 충진하는 단계; 및 푸코이단 분해 효소를 포함하는 생물로부터 얻은 샘플을 컬럼에 가하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 친화성 크로마토그래피는, 지지체 겔을 포함하는 컬럼에 친화성 비드를 충진하여 친화성 컬럼을 제조하여 버퍼로 세척한 뒤, 여기에 푸코이단 분해 효소를 포함하는 생물로부터 얻은 샘플을 가하여 흡착시킨 다음, 버퍼로 푸코이단 분해 효소를 함유하는 분획물을 용출시킴으로써 수행할 수 있다.

지지체 겔을 포함하는 컬럼에 친화성 비드를 충진하여 친화성 컬럼을 제조함에 있어서, 지지체 겔은 일종의 친수성 고분자로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 지지체 겔을 사용할 수 있으며, 구체적인 예로서 세파로스 겔(sepharose-2B), 블루-세파로스 6(blue-sepharose 6), Affi-Gel Blue 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 친화성 크로마토그래피를 수행함에 있어서 버퍼는 당업계에 공지되어 일반적으로 사용되는 것일 수 있다. 다만 버퍼가 효소 활성에 영향을 미칠 수 있으므로 약산성의 버퍼를 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 트리스(Tris) 버퍼, 아세트산나트륨과 염화칼슘을 혼합한 버퍼 등을 사용할 수 있고, 특히 최종적으로 푸코이단 분해 효소를 함유하는 분획물을 용출시키기 위한 버퍼로는 염화나트륨을 첨가한 버퍼를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 푸코이단 분해 효소를 포함하는 생물은 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물, 비브리오(Vibrio) 속 미생물, 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 속 미생물, 플라보박 테리아세애(Flavobacteriaceae) 과 미생물, 할리오티스(Haliotis) 속 생물, 및 파티노펙텐(Patinopecten) 속 생물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 구체적으로는 슈도모나스 아틀란티카(Pseudomonas atlantica), 슈도모나스 가라기노바(Pseudomonas carrageenova), 슈도알테로모나스 시트레아(Pseudoalteromonas citrea), 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas Paucimobilis), 할리오티스 루페센스 (Haliotis rufescens), 할리오티스 코루가타 (Haliotis corrugata), 할리오티스 지잔테아 (Haliotis gigantea), 파티노펙텐 예소엔시스 (Patinopecten yessoensis), 및 파티노펙텐 막시무스 (Patinopecten maximus)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 대한민국특허 제10-0887682호에 따른 스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) PF-1(기탁번호 KCTC 11130BP)일 수 있다.

스핑고모나스 속 미생물로부터 샘플을 얻는 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어, 푸코이단 분해 효소를 포함하는 생물의 세포를 파쇄하여 조효소액을 추출하고 이를 침전시켜 샘플을 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 "조효소액"이란 세포를 파쇄해서 얻은 세포 내 전체 단백질 효소를 총칭한다. 세포의 파쇄는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 화학적 방법을 모두 포함하는 것으로서 초음파 분해, 프렌치 프레스(French press), SDS 처리 등을 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 한 구체예에서 상기 조효소액은 스핑고모나스 파우시모빌리스 PF-1을 원심분리하여 얻은 균체를 아세트산나트륨 버퍼로 세척하고 초음파 분해한 후 다시 원심분리하여 수득한 상등액일 수 있다. 조효소액을 침전시켜 샘플을 얻는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한없이 이용할 수 있으며, 예를 들어, 황산암모늄, 황산스트렙토마이신 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기한 푸코이단 분해 효소의 정제방법에 의해 정제된 푸코이단 분해 효소를 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 푸코이단 분해 효소의 정제방법에 의해 정제된 푸코이단 분해 효소에 의해 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 것을 특징으로 하는 푸코 올리고당의 제조방법을 제공한다. 상기 푸코이단 분해 효소와 푸코이단을 접하게 하여 푸코이단을 분해하도록 함으로써 푸코 올리고당을 제조할 수 있다. 바람직하게 상기 푸코 올리고당은 분자량이 1000 내지 10000 Da 의 저분자 푸코 올리고당일 수 있으며, 보다 바람직하게는 1000 내지 4000 Da 일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한 다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> S. paucimobilis PF -1 균주로부터 샘플 추출

< 실시예 1-1> S. paucimobilis PF -1 균주의 배양

0.2% 푸코이단과 2% 펩톤이 들어있는 배지 100 ml에 0.1N NaOH를 이용하여 pH 5.6으로 맞춘 후 PF-1 균주를 접종하여 3일간 진탕 배양기에서 배양(30℃, 120rpm) 후 같은 조건의 배지 4L에 계대배양 하여 4일간 진탕 배양기에서 배양하였다. 4L에서 배양 후 배지를 원심분리(6,000rpm, 4℃, 30min)하여 침전물(균체)과 상등액을 따로 분리하였다.

< 실시예 1-2> 초음파분해에 의한 조효소액의 준비

침전물(균체)은 50 mM 아세트산나트륨(sodium acetate) 버퍼 pH 5.6로 세척한 후 원심분리(12,000rpm, 4℃, 30min)하여 침전물(균체)을 모으는 것을 두 번 반복하였다. 두 번 세척 후 침전물(균체)을 40 mL의 50 mM 아세트산나트륨 버퍼 pH 5.6에 녹여 2시간 동안 초음파분해(Duty cycle : 60%, output control : 4)하였다. 초음파분해 후 원심분리(12,000 rpm, 4℃, 30 min)하여 상등액을 따로 모아 조효소액으로 사용하였다.

< 실시예 1-3> 황산암모늄 ( ammonium sulfate ) 침전

40 ml의 조효소액(전체 단백질: 14.676 mg/ml)는 20 ~ 80%의 황산암모늄을 조금씩 첨가하여 1시간 염석(salting out)하였고, 원심분리 (12,000rpm, 30분, 4℃)하여 침전물을 따로 모았다. 침전물은 50 mM 아세트산나트륨 버퍼 pH 5.6 로 투석(MWCO 3,500)하여, 한외여과막(ultrafiltration membrane, MWCO 10,000) 으로 농축하였다.

< 실시예 1-4> 황산스트렙토마이신( Streptomycin sulfate ) 침전

황산암모늄 침전에서 얻어진 샘플은 10%의 황산스트렙토마이신(160ul/ml 단백질)을 처리하여 1시간동안 교반하였고, 원심분리 (12,000rpm, 30분, 4℃)하여 상등액을 따로 모아 핵산 등을 제거하였다. 얻어진 상등액은 50 mM 아세트산나트륨 버퍼 pH 5.6 로 투석(MWCO 3,000) 하여, 한외여과막(MWCO 10,000)으로 농축하였다.

< 실시예 2> 친화성 비드의 제조

< 실시예 2-1> 푸코이단 -알긴산 비드의 제조

3차 증류수 50ml에 3g의 알긴산나트륨을 중탕으로 녹여 교반한 용액과 증류수 50ml에 1g의 푸코이단을 녹인 용액을 혼합하여 총 100ml의 혼합용액을 제조하였다. 2M CaCl₂ 용액을 얼음 위에 두고 교반기를 천천히 돌리면서, 주사기에 앞서 제조한 혼합용액을 넣고 주사바늘을 통해 천천히 CaCl₂ 용액에 떨어뜨렸다. 생성된 비 드를 증류수로 3번 세척한 후 Whatman paper #1을 사용하여 걸러낸 다음 비이커에 넣고 완충액(10mM Tris, pH 7.0)에 담가서 냉장고에 보관하였다.

< 실시예 2-2> 푸코이단 - 폴리비닐알콜 -알긴산 비드의 제조

증류수 50ml에 폴리비닐알콜 5g과 알긴산나트륨 0.8g을 녹여 60℃로 가열하여 만든 용액과 증류수 50ml에 1g의 푸코이단을 녹여 만든 용액을 혼합한 혼합용액을 제조하였다. 상기 혼합용액을 1L의 2% (W/V) CaCl₂?2H₂O 용액에 떨어뜨렸다. 생성된 비드를 24시간 동안 2% (W/V) CaCl₂?2H₂O 용액에 담가둔 뒤 200ml의 증류수로 3번 세척하였다. Whatman paper #1을 사용하여 비드를 걸러낸 다음 완충액(10mM Tris, pH 7.0)에 담가서 4℃로 보관하였다.

< 실시예 3> 친화성 컬럼 크로마토그래피( Affinity column chromatography )

푸코이단-알긴산 비드를 3 × 30 cm의 컬럼에 충진한 후 50 mM 아세트산나트륨 pH 5.6 과 300mM CaCl₂ 가 들어있는 버퍼로 세척하였다. 세척 후 샘플(6.97 mg/ml)을 10ml 로딩한 후 24시간 동안 상온에서 효소 반응을 시켰다. 24시간 후 50 mM 아세트산나트륨 pH 5.6과 300mM CaCl₂, 1.5M NaCl 이 첨가된 버퍼로 선형 그레디언트(linear gradient)로 1ml 씩 분획물을 얻었다.

도 1은 친화성 컬럼 크로마토그래피 결과를 보여준다. 여기서 얻은 피크 I 을 따로 모아 투석 후 농축하여 SDS-PAGE, Native PAGE를 실시하였다.

< 실시예 4> SDS - PAGE

친화성 컬럼 크로마토그래피에서 얻어진 피크 I 을 10% 아크릴아미드 겔을 이용하여 SDS-PAGE를 실행하였다. 초음파 분해 후 원심분리 하여 모은 단백질을 전체 단백질로 정하였고, 친화성 컬럼 크로마토그래피에서 나온 피크 1을Affinity라 명하였다. 각 샘플을 로딩한 후 120V의 전류를 흘려주어 분석하였다.

도 2는 SDS-PAGE 결과를 보여준다. M은 마커, 1은 전체 단백질, 2는 Affinity 밴드를 나타낸다. 친화성 컬럼 크로마토그래피에서 얻은 Affinity 에서 약 34, 80 및 100 kDa 의 3개의 주요 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> Native PAGE

SDS-PAGE 와 마찬가지의 조건에서 겔에 SDS가 첨가되지 않고, 샘플을 변성(denature)시키지 않은 조건에서 Native PAGE를 실행하였다.

도 3은 Native PAGE 결과를 보여준다. M1은 45kDa 마커, M2는 66 및 132 kDa 마커, 1은 전체 단백질, 2는 Affinity 밴드를 나타낸다. Native PAGE 결과 약 60 및 30 kDa 의 2개의 주요 단백질 밴드를 얻을 수 있었다.

< 실험예 1> S. paucimobilis PF -1 균주로부터 분리한 푸코이단 분해 효소의 효소 활성 측정

효소 정제의 각 단계별 샘플을 이용하여 Somogyi-Nelson 방법으로 환원당을 정량함으로써 효소활성을 측정하여 효소의 특이 활성(specific activity)을 측정하였다.

표 1은 효소 정제 단계별 활성을 나타낸 표이다. 효소 정제의 정제 단계를 거침에 따라, 전체 단백질은 점점 줄어들지만 효소의 활성을 나타내는 특이 활성은 조추출액보다 친화성 컬럼 크로마토그래피 후에 약 12.4% 활성이 증가하였다. 이 결과는 정제 단계가 진행 될수록 푸코이단을 분해하는 효소가 정제되고 있음을 보여준다.

정제 단계	전체 단백질(mg)	전체 활성(mU)	특이 활성(mU/mg)	회수(%)
배양배지	273.8	28	0.073	100
(NH₄)₂SO₄ 침전물	70.89	17.1	0.098	61.1
친화성 크로마토그래피	6.56	0.8	0.588	2.9

< 실험예 2> 푸코이단 분해 조효소액의 푸코이단 분해 최적 조건 측정

푸코이단을 분해하는 PF-1 균주의 효소 활성을 측정하기 위하여 80g의 PF-1을 80 ml의 50 mM 아세트산나트륨 pH 5.6 버퍼와 혼합하여 2시간 동안 초음파 분해(Duty cycle: 40%, Out put control : 4)하여 원심분리(12,000rpm, 4℃, 30min) 하였다. 침전물과 상등액을 따로 취하여 상등액을 조효소액으로 사용하였다.

< 실험예 2-1> 푸코이단 분해 최적 온도 측정

1% 푸코이단을 50mM 아세트산나트륨 pH 5.6 버퍼 (최종 0.5%) 5 ml에 녹여 조효소액 5 ml과 0.01% 아지드화나트륨을 넣어 온도별로 각각 25℃, 30℃, 37℃, 및 42℃로 진탕 항온 수조에서 효소 반응(120rpm, 72시간)을 시켰다. 반응 후 100℃에서 10분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 후 원심분리(12,000rpm, 4℃, 10min)하여 상등액을 취하여 Somogyi-Nelson method를 이용하여 환원당 값을 정하였다.

도 4는 푸코이단 분해 조효소액의 온도에 따른 효소 활성을 나타낸다. 온도 조건을 제외하고는 동일한 조건을 사용하여 푸코이단 분해 조효소액의 효소 활성을 측정한 결과 25℃, 37℃, 또는 42℃ 보다 30℃에서의 효소활성이 높게 측정되었다.

< 실험예 2-2> 푸코이단 분해 최적 반응 시간 측정

1% 푸코이단을 50mM 아세트산나트륨 pH 5.6 버퍼 (최종 0.5%) 5 ml에 녹여 조효소액 5 ml과 0.01% 아지드화나트륨을 넣어 시간별로 각각 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 및 72시간 동안 진탕 항온 수조에서 효소 반응(120rpm, 30℃)을 시켰다. 반응 후 100℃에서 10분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 후 원심분리(12,000rpm, 4℃, 10min)하여 상등액을 취하여 Somogyi-Nelson method를 이용하여 환원당 값을 정하였다.

도 5는 푸코이단 분해 조효소액의 시간에 따른 효소 활성을 나타낸다. 반응 시간을 제외하고는 동일한 조건을 사용하여 푸코이단 분해 조효소액의 효소 활성을 측정한 결과 시간이 지남에 따라 효소활성이 증가되었고 48시간에서 효소 활성이 감소하기 시작하였다.

< 실험예 2-3> 푸코이단 분해 최적 pH 측정

1% 푸코이단 (최종 0.5%) 5 ml과 조효소액 5 ml, 0.01% 아지드화나트륨을 넣어 pH 별로 각각 pH 3, 5, 7, 및 8로 진탕 항온 수조에서 효소 반응(120rpm, 30℃, 3일)을 시켰다. 반응 후 100℃에서 10분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 후 원심분리(12,000rpm, 4℃, 10min)하여 상등액을 취하여 Somogyi-Nelson method를 이용하여 환원당 값을 정하였다.

도 6은 푸코이단 분해 조효소액의 pH 에 따른 효소 활성을 나타낸다. pH를 제외하고는 동일한 조건을 사용하여 푸코이단 분해 조효소액의 효소 활성을 측정한 결과 pH 5 에서 가장 활성이 높은 것으로 나타났다.

< 실험예 3> 푸코이단 분해 효소의 설파타제 활성 측정

1mM 파라-니트로페닐 설페이트를 50mM 아세트산나트륨 pH 5.6 버퍼에 녹인 후 200 ul(1.5mg)과 500 ul(3.75ug)의 조효소액을 넣어 30℃ 항온 수조에서 시간별로 효소 활성을 측정하였다. 대조군은 0.005 U의 Aerobacter aerogenes 유래의 설파타제(Sigma, USA)를 사용하였다. 효소 활성 후 1ml 100mM 트리클로로아세트산으로 반응을 정시시켰으며, 스핀 다운으로 침전물을 제거한 후 상등액을 따로 취하여 같은 양의 0.7N NaOH를 첨가하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 7은 설파타제(A)와 푸코이단 분해 조효소액(B)의 활성 측정 결과를 나타낸다. 대조군인 설파타제는 기질로 사용한 파라-니트로페닐 설페이트를 분해하지만, PF-1에서 추출한 조효소액은 파라-니트로페닐 설페이트를 분해하지 못했다. 즉, PF-1에서 추출한 조효소액은 황산기 결합을 끊는 설파타제 활성은 없는 것으로 나타났다.

< 실시예 2> 푸코 올리고당의 제조

HPLC(Dionex)를 이용한 푸코 올리고당 측정은 Shodex OHpak SB-805HQ(MW: ~4×106, 8.0×300mm, Showa, Japan)과 ELSD(Evaporative light scattering detector, Alltech)를 사용하여 확인하였다. 조효소액과 0.5% 푸코이단을 효소반응 시킨 후 원심분리(12000rpm, 4℃, 30분)하여, 상등액을 취하였다. 상등액에 75% 에탄올 처리하여 원심분리한 후 상등액을 농축하여 푸코 올리고당을 얻었다. 생성된 푸코 올리고당을 증류수에 1% 되게 녹여 분석하였다. 용출용매는 증류수이고 유속은 0.8ml/min으로 하여 분석하였다.

도 8은 푸코 올리고당을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다. A는 0.5%의 푸코이단을 HPLC로 분석한 것이고(RT : 8.2), B 는 효소 반응 후 75% 에탄올을 처리하여 얻어진 푸코 올리고당을 분석한 것이다(RT : 1 ; 7.44, 2 ; 8.12, 3 ; 14.09, 4 ; 15.73, 5 ; 16.31, 6 ; 17.83, 7 ; 19.06, 8 ; 19.32). 푸코이단 분해 조효소액에 의해 푸코이단이 분해되어 사이즈가 다른 저분자의 푸코 올리고당이 생성되었다.

1. 도 1은 친화성 컬럼 크로마토그래피 결과를 보여준다.

2. 도 2는 SDS-PAGE 결과를 보여준다(M: 마커, 1: 전체 단백질, 2: Affinity 밴드).

3. 도 3은 Native PAGE 결과를 보여준다(M1: 45 kDa 마커, M2: 66 및 132 kDa 마커, 1: 전체 단백질, 2: Affinity 밴드).

4. 도 4는 온도에 따른 푸코이단 분해 조효소액의 효소 활성을 나타낸다.

5. 도 5 는 시간에 따른 푸코이단 분해 조효소액의 효소 활성을 나타낸다.

6. 도 6은 pH에 따른 푸코이단 분해 조효소액의 효소 활성을 나타낸다.

7. 도 7은 설파타제(A)와 푸코이단 분해 조효소액(B)의 효소 활성을 나타낸다.

8. 도 8은 푸코이단 분해 조효소액의 처리에 의해 생성된 푸코 올리고당을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다. (A : 푸코이단, B : 푸코이단 분해 조효소액 처리로 생성된 푸코 올리고당)

Claims

스핑고모나스 파우시모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) PF-1으로부터 얻어지고, 하기의 특징을 가지는 푸코이단 분해 효소.

(a) 최적 온도 30℃;

(b) 최적 pH 5.0.
제1항에 따른 푸코이단 분해 효소에 의해 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 푸코 올리고당의 제조방법.
푸코이단 10 중량부에 대해 알긴산 5 내지 40 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드.
제3항에 있어서,

푸코이단 10 중량부에 대해 폴리비닐알콜 40 내지 60 중량부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드.
제4항에 있어서,

푸코이단 10 중량부에 대해 알긴산은 5 내지 10 중량부인 것을 특징으로 하는 푸코이단 분해 효소 정제용 친화성 비드.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 친화성 비드를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 푸코이단 분해 효소의 정제방법.
제6항에 있어서,

상기 친화성 크로마토그래피는

(a) 친화성 비드를 컬럼에 충진하는 단계: 및

(b) 푸코이단 분해 효소를 포함하는 생물로부터 얻은 샘플을 컬럼에 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 푸코이단 분해 효소의 정제방법.
제7항에 있어서,

상기 푸코이단 분해 효소를 포함하는 생물체는 스핑고모나스(Sphingomonas) 속 미생물, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 미생물, 비브리오(Vibrio) 속 미생물, 슈 도알테로모나스(Pseudoalteromonas) 속 미생물, 플라보박테리아세애(Flavobacteriaceae) 과 미생물, 할리오티스(Haliotis) 속 생물, 및 파티노펙텐(Patinopecten) 속 생물로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 푸코이단 분해 효소의 정제방법.
제6항에 따른 푸코이단 분해 효소의 정제방법에 의해 정제된 푸코이단 분해 효소.
제9항에 따른 푸코이단 분해 효소에 의해 푸코이단을 푸코 올리고당으로 분해하는 푸코 올리고당의 제조방법.