CN109517012A

CN109517012A - 一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法

Info

Publication number: CN109517012A
Application number: CN201811346941.5A
Authority: CN
Inventors: 陈玉娟; 陈雯雯; 杜国辉; 刘建建; 李德杰; 穆淑娥; 郭学平; 栾贻宏
Original assignee: BLOOMAGE FREDA BIOPHARM Co Ltd; Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Current assignee: Huaxi Biotechnology Tianjin Co ltd; Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2018-11-13
Publication date: 2019-03-26
Anticipated expiration: 2038-11-13
Also published as: CN109517012B

Abstract

本发明提供一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离、脱盐，本发明采用的填料粒径小、流速高、柱长短，可明显缩短分离时间，使分离效率大大提高，可实现克级寡糖的生产，易于向更大生产规模转化。

Description

一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法

技术领域

本发明涉及透明质酸寡糖的制备领域，具体涉及一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖。1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得。

分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>1×10⁶)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×10⁵-10⁶)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

透明质酸经过酶解得到的产物一般为多种透明质酸寡糖(oligosaccharides ofhyaluronan，简称o-HA)的混合物，如果要制备不同糖残基数的o-HA，必须经过分离。o-HA是相对分子量小于10000、单糖残基数量为2～40(一般为4～16)的HA分子片段。o-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。

目前透明质酸寡糖主要通过柱色谱法进行分离纯化。由于透明质酸本身结构特点，分离方法主要有凝胶色谱法和离子交换色谱法。凝胶色谱法主要根据各寡糖分子量的不同进行分离。凝胶色谱所用填料都有一定排阻极限，而高分子量寡糖之间相对分子量差异较小，使其较难分离；另外对于相对低分子量的寡糖分离则仍需要较长色谱柱尺寸，较低的流速，显然不利于大规模制备。离子交换色谱法主要根据寡糖所带羧基电荷的不同进行分离，分子量越高，所带羧基电荷越多，与填料结合能力越强，越难洗脱。

在专利文献1中公开了一种利用离子交换柱实现单一分子量透明质酸寡糖的制备方法，其中使用强阴离子交换柱HiPrep Q FF 16/10对透明质酸酶水解透明质酸得到的透明质酸寡糖混合物进行分离纯化。得到的寡糖HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的产物纯度分别为75％、64.5％、55％、43.5％、43％、40.5％，HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14的产物得率分别为94％、91％、88％、87.5％、85％、82％、80.5％。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:CN106399428A

发明内容

然而，上述专利文献1中以2mL/min的流速进行洗脱，分离时间仍旧较长，并不适于向更大生产规模的转化，另外，仍旧有透明质酸寡糖的纯度提高以及种类扩大的余地。

为了解决上述技术问题，本发明专利采用的技术方案是：

1.一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，其特征在于，包括：

透明质酸酶解步骤，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；

透明质酸寡糖的分离步骤，使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分；和

透明质酸寡糖的脱盐步骤，将分离后的各组分通过旋蒸浓缩，然后用尺寸排阻色谱进行脱盐，

其中，在所述透明质酸寡糖的分离的步骤中，所述离子交换色谱柱为强阴离子交换色谱柱。

2.根据项1所述的制备方法，其还包括在所述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，针对脱盐后的各组分依次进行旋蒸浓缩，以及放入冻干机冻干的冻干步骤。

3.根据项2所述的制备方法，其还包括在所述冻干步骤之后，将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱法进行分析，用面积归一化法测定各组分的纯度的检测步骤。

4.根据项1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱在0～5000psi的压力下使用，且其固定相为键合季铵强阴离子交换基团的硅胶固定相。

5.根据项1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱为Sepax HP-SAX。

6.根据项1～5中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的脱盐中使用的是尺寸排阻色谱是HW-40F或Sephadex G10。

7.根据项3～6中任一项所述的制备方法，其中，所述检测步骤中使用的色谱柱为LUNA NH2柱。

8.根据项1～7中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱使用的流动相为0～0.5mol/L NaCl或Na₂SO₄溶液的线性梯度洗脱。

9.根据项1～8中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的离子交换色谱柱中流动相的流速为5～100ml/min，优选为20～80ml/min，进一步优选为30～60ml/min。

10.根据项1～9中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的离子交换色谱柱中流动相的运行时间为30min以上，优选为30～600min，更优选为40～150min，进一步优选为50～100min。

11.根据项3～10中任一项所述的制备方法，其中，利用高效液相色谱法分析得到的HA4～HA20的纯度在80％以上，总收率在50％以上。

发明的效果

本发明的方法可提供的o-HA的种类更为丰富。可生产HA4～HA20的透明质酸寡糖。且与现有技术相比，生产的o-HA纯度较高，HA4,HA6,HA8，HA10纯度>95.0％，HA12,HA14,HA16，HA18，HA20纯度>85.0％，总收率能达到60％以上。

本发明的方法与现有技术相比，采用更小粒径的填料、更高的流速、更短的柱长，可明显缩短分离时间，使分离效率大大提高。并且本发明的方法可实现克级寡糖的生产，易于向更大生产规模转化。

附图说明

图1为实施例1中的o-HA制备的色谱图。

发明的具体实施方式

以下将对本发明做以详细说明。

根据本发明的一个方面，提供一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，其特征在于，包括：透明质酸酶解步骤，以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物；透明质酸寡糖的分离步骤，使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分；和透明质酸寡糖的脱盐步骤，将分离后的各组分，通过旋蒸浓缩，依次用尺寸排阻色谱进行脱盐，其中，在上述透明质酸寡糖的分离的步骤中，上述离子交换色谱柱为0～5000psi的压力下使用的强阴离子交换色谱柱。

在本发明的一个实施方式中，本发明的制备方法还包括在上述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，将脱盐后的各组分，依次进行浓缩，放入冻干机冻干的冻干步骤。

在本发明的一个实施方式中，本发明的制备方法还包括在上述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱法进行分析，面积归一化法测定各组分的纯度的检测步骤。

下面具体说明本发明的高纯度透明质酸寡糖的制备方法中的各个步骤。

1.透明质酸酶解步骤

本发明的透明质酸酶解步骤是以透明质酸酶水解透明质酸得到透明质酸寡糖混合物的步骤。

本文中的术语“酶解”，是利用活性酶来水解特定的某种物质，这种方法可用于一般的生物实验中，酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶是一类极为重要的生物催化剂(biocatalyst)。由于酶的作用，生物体内的化学反应在极为温和的条件下也能高效和特异地进行。

透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)是能使透明质酸产生低分子化作用酶的总称，本发明使用透明质酸酶也称为玻璃酸酶，其降解透明质酸时，只有酶切位点的糖苷键断裂，其双糖结构单元没有变化。由HA酶解制备o-HA一般使用从睾丸提取的透明质酸酶，其为内切糖苷酶，可以打断分子链内的β-1,4糖苷键。另外，硫酸软骨素ABC酶、硫酸软骨素AC酶以及微生物提取的HAase也可以降解HA。其中硫酸软骨素ABC酶是将HA降解为双糖，由链球菌提取的HAase将HA降解为4糖或6糖。另外报道有由微生物提取的HAase将HA降解成非还原性末端不饱和的寡糖(Δ4,5-糖醛酸)，而动物来源的HAase将HA降解为饱和的寡糖，硫酸软骨素酶降解HA的产物为不饱和寡糖。

在透明质酸酶解步骤中，可以将透明质酸钠溶于例如醋酸盐缓冲液中(pH＝5.0～7.0)，35℃～50℃水浴充分酶解。酶解后，将酶解液煮沸，用例如0.1～0.45um滤膜过滤，将酶解液备用。

通过在上述条件下进行酶解，能够将透明质酸更彻底地水解成各种分子量的透明质酸寡糖。

2.透明质酸寡糖的分离步骤

本发明的透明质酸寡糖的分离步骤是使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分的步骤。

色谱法(chromatography)又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

离子交换柱是指用来进行离子交换反应的柱状压力容器，离子交换反应是指离子交换剂功能基中的阳离子或阴离子与溶液中同性离子进行可逆交换的过程。离子交换剂分为有机和无机的离子交换剂。无机离子交换剂分为天然和例如合成沸石等人造的材料。有机离子交换剂中有离子交换树脂，离子交换树脂按照物理结构分类可以分为孔径为5nm的凝胶型和孔径为20-100nm的大孔型，按照合成的树脂所用原料单体分类可以分为苯乙烯系、酚醛系、丙烯酸系、环氧系、乙烯吡啶系等。离子交换树脂最常用的分类是依据树脂离子交换功能团分类，分为包括强酸性阳离子型离子交换树脂、弱酸性阳离子型离子交换树脂、强碱性阴离子型离子交换树脂和弱碱性的阴离子型离子交换树脂以及其他类型。

本发明中离子交换色谱柱使用的是0～5000psi的压力下使用的强阴离子交换色谱柱。由此，能够以更高的流速、更短的柱长，可明显缩短分离时间，使分离效率大大提高。

在本发明的一个实施方式中，上述透明质酸寡糖的分离步骤中的上述离子交换色谱柱的固定相为键合季铵强阴离子交换基团的硅胶固定相。例如，上述离子交换色谱柱为Sepax HP-SAX。Sepax HP-SAX(塞分HP-SAX)键合固定相是以高纯度具有良好机械稳定性的硅胶为基质，通过使用高纯度键合试剂在硅胶上键合季铵强阴离子交换基团，具有季铵和苯基官能团的混合官能结构。该填料为均一的球形颗粒，孔径为比表面积为300m²/g。通过使用特定的离子交换色谱柱，能够更有效地分离不同分子量的透明质酸寡糖。

在本发明的一个实施方式中，上述透明质酸寡糖的分离步骤中的上述离子交换色谱柱使用的流动相可以为0-0.5mol/L NaCl或Na₂SO₄溶液的线性梯度洗脱。流动相的流速为5～100ml/min，优选为20～80ml/min，进一步优选为30～60ml/min。流动相的运行时间为30min以上，优选为30～600min，更优选为40～150min，进一步优选为50～100min。检测波长为200nm～220nm，优选为210nm。上样量为0.5～5g。通过选择特定的色谱条件，能够以更高的纯度、更高的收率得到不同分子量的透明质酸寡糖。

3.透明质酸寡糖的脱盐步骤

本发明的透明质酸寡糖的脱盐步骤是将分离后的各组分，通过旋蒸浓缩，依次用尺寸排阻色谱进行脱盐的步骤。

旋蒸可以在50℃～70℃温度下进行，优选在65℃进行，由此，能够更好地将透明质酸寡糖进行提取和浓缩。另外，通过选择旋蒸(旋转蒸发)，由于旋转蒸发在旋转过程中，使溶剂均匀地涂覆在蒸馏烧瓶表面，蒸发速度更快，受热也更均匀，不需要加入沸石。因此，可以使透明质酸寡糖的纯度更高。

尺寸排阻色谱(Size exclusion chromatography SEC)，也被称为凝胶过滤.是根据物质尺寸大小的不同来进行分离.一般情况下，体积排阻层析可以用于纯化的步骤，按分子量大小将产品粗分；也可以用作纯化的中间步骤来改换缓冲液或脱盐，还可以用于纯化的最后一步来去除杂质，精制产品。

在使用尺寸排阻色谱时，流动相可以采用水，流速为1～5ml/min，检测波长为200nm～220nm，优选为210nm。通过在上述范围的条件下进行脱盐，能够更好地对透明质酸寡糖进行脱盐和纯化。

在本发明的一个实施方式中，上述透明质酸寡糖的脱盐中使用的是尺寸排阻色谱填料是HW-40F或Sephadex G10。HW-尺寸排阻树脂是一种大孔树脂，具有乙烯醇和甲基丙烯酸酯共聚而成的半坚硬的球状体，表面有大量羟基和醚键，因此具有亲水性，并形成许多官能团的吸附点。通过使用该类型的色谱柱，能够更有效地对各个分子量的透明质酸寡糖进行脱盐和纯化。SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分布范围。Sephadex G10分离范围<700，适用于寡糖、肽等与其它小分子的分离，例如寡糖脱盐。

在使用尺寸排阻树脂时，流动相可以采用水，流速为1～5ml/min，优选为4ml/min，检测波长为200nm～220nm，优选为210nm。在该条件下脱盐，能够进行得更加有效。

4.冻干步骤

本发明的冻干步骤是将脱盐后的各组分，依次进行旋蒸浓缩，放入冻干机冻干的步骤。

冻干又称冷冻干燥或升华干燥，是将被干燥液体物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用冰的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种方法。

通过将脱盐后的各组分进行冻干，能够更好地使各透明质酸寡糖不变质、易长期储存、定量准确、脱水彻底、易复水再生、易进行无菌操作。

5.检测步骤

本发明的检测步骤是将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱法(HPLC)进行分析，面积归一化法测定各组分的纯度的步骤。

本发明的检测方法并不限于HPLC法，也可以使用其他各种可用于检测透明质酸的方法，例如比色法、CTAB比浊法和咔唑显色法等

在本发明的一个实施方式中，上述检测步骤中使用的色谱柱为氨基键和柱，例如LUNA NH2柱。在这种情况下，流动相可以使用0～0.8mol/L NaH₂PO₄溶液线性梯度洗脱，运行时间采用20min以上，例如为30min，流速：0.5～1.5ml/min，例如为1ml/min，进样体积：5～50μL，例如为20μL，检测波长：200nm～220nm，例如为210nm。在上述色谱条件下，能够更准确地检测各种分子量的透明质酸寡糖。

利用本发明的方法，可提供的o-HA的种类更为丰富的透明质酸寡糖产物。例如，可以生产包括HA4～HA20的透明质酸寡糖的产物。且与现有技术相比，生产的o-HA纯度较高，HA4～HA20的纯度均可以高达80.0％以上，总收率能达到50％以上，在有的具体的实施例中HA4～HA20中的某些寡糖的纯度可以高达85.0％以上，以及90.0％以上，以及95.0％以上，在有的具体的实施例中总收率能达到60％以上。

此外，本发明的方法，与利用现有技术的方法相比，由于采用具有更小粒径的填料来分离，可以利用更高流速、更短的柱长，可大大缩短整个过程的分离时间，使分离效率大大提高。并且利用本发明的方法能够生产克级的寡糖，易于向更大生产规模转化。

实施例

以下利用实施例对本发明做以详细说明。然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。在本发明中列举的数值范围均包括该数值范围的两个端点的数据，也包括该数值范围中具体的每一个数值，并且该数值可以与端点任意组合组成新的小范围。

实施例1

1.HA酶解

称取透明质酸钠约20g，溶于500ml醋酸盐缓冲液中(PH＝5.0)，50℃水浴酶解20h。将酶解液煮沸5min，0.1μm滤膜过滤，备用。

2.o-HA分离

将酶解液用强阴离子交换色谱柱按照以下色谱条件进行分离，根据出峰时间依次收集各组分。强阴离子交换色谱的色谱图，如图1所示。

色谱柱：Sepax HP-SAX(50*250mm，10μm，赛分科技)

流动相：0-0.5mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱运行时间：60min

流速：50ml/min 检测波长：210nm

上样量：2g

3.o-HA脱盐

将强阴离子色谱柱分离后的各组分，65℃旋蒸浓缩。依次用HW-40F填料按照以下色谱条件进行脱盐。

色谱柱：HW-40F(36*460mm，TOSOH公司)

流动相：水

流速：4ml/min

检测波长：210nm

4.冻干

将脱盐后的各组分，依次进行浓缩。放入冻干机(德国christ alpha 1-4plus)冻干。

5.检测

将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱(HPLC)按照以下条件进行分析，面积归一化法测定各组分的纯度。进一步，本发明中的总收率是通过制备得到的所有寡糖质量之和/透明质酸钠投料量计算获得的。

色谱柱：LUNA NH₂柱(4.6*250mm，5μm)(菲罗门)

流动相：0-0.8mol/L NaH₂PO₄溶液线性梯度洗脱

运行时间：30min

流速：1ml/min 进样体积：20μl

检测波长：210nm

各组分HPLC检测结果见表1。

表1：o-HA纯度

由表1可知，本发明的方法可提供的o-HA的种类更为丰富。可生产HA4～HA20的透明质酸寡糖。且与现有技术相比，生产的o-HA纯度较高，HA4,HA6,HA8，HA10纯度>95.0％，HA12,HA14,HA16，HA18，HA20纯度>85.0％，总收率能达到60％以上。

实施例2

将实施例1中的o-HA分离步骤中的色谱的流动相更换为0-0.5mol/L硫酸钠，其他条件与实施例1相同，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表2。

表2：o-HA纯度

将流动相更换为0-0.5mol/L硫酸钠后，可生产o-HA4～o-HA16，纯度均能达到85％以上，总收率高于50％。

实施例3

将实施例1中的o-HA分离步骤中的色谱的流速改变为60mL/min，其他条件与实施例1相同，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表3。

表3：o-HA纯度

将o-HA分离步骤中的色谱的流速改变为60mL/min，可生产HA4～HA20，纯度均能达到80％以上，总收率高于60％。

实施例4

将实施例1中的o-HA分离步骤中的色谱的检测波长改变为215nm，其他条件与实施例1相同，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表4。

表4：o-HA纯度

将分离步骤中的色谱的检测波长改变为215nm，可生产HA4～HA20，纯度均能达到85％以上，总收率高于60％。

实施例5

将实施例1中的o-HA脱盐步骤中的色谱柱填料改变为Sephadex G10，其他条件与实施例1相同，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表5。

表5：o-HA纯度

将脱盐步骤中的色谱柱填料改变为Sephadex G10，可生产HA4～HA20，纯度均能达到80％以上，总收率高于50％。

实施例6

将实施例1中的o-HA分离步骤中的流速改变为30ml/min，运行时间延长至2h，检测波长改为200nm，其他条件与实施例1相同，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表6。

表6：o-HA纯度

将分离步骤中的流速改变为30ml/min，可生产HA4～HA18，纯度均能达到80％以上，总收率高于50％。

实施例7

将实施例1中的o-HA分离步骤中的流速改变为20ml/min，运行时间延长至3h，检测波长改为220nm，其他条件与实施例1相同，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表7。

表7：o-HA纯度

将分离步骤中的流速改变为20ml/min，可生产HA4～HA16，纯度均能达到80％以上，总收率高于50％。

比较例1

将实施例1中的o-HA分离步骤中的色谱柱更换为Dowex 1×2(100-200目)，其他条件按照日本生化学株式会社在《透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品》专利(申请号CN01812432.1)，制备各个分子量的o-HA。

以下的表8为本发明的实施例1与比较例1的对比：

表8

从表6中可以看出，Dowex 1×2虽然也是强阴离子交换色谱法，但是本

发明的制备方法与比较例1的工艺相比，采用更小粒径的填料、更高的流速、更短的柱长，可明显缩短分离时间，使分离效率大大提高。并且本生产工艺可实现克级寡糖的生产，易于向更大生产规模转化。

比较例2

将实施例1中的o-HA分离步骤中的色谱柱更换为Amino-NH2色谱柱，色谱条件及其他步骤同实施例1，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表9。

表9：o-HA纯度

将分离步骤中的色谱柱更换为Amino-NH2色谱柱，可生产HA4～HA12，纯度均能达到80％以上，总收率约为40％。

比较例3

将实施例1中的o-HA分离步骤中的流动相更换为0-0.5mol/l NaNO₃，色谱条件及其他步骤同实施例1，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表10。

表10：o-HA纯度

将分离步骤中的流动相更换为0-0.5mol/l NaNO₃，可生产HA4～HA12，纯度均能达到80％以上，总收率约为30％。

比较例4

将实施例1中的o-HA分离步骤中的流速改变为120ml/min，色谱条件及其他步骤同实施例1，制备各个分子量的o-HA。

各组分HPLC检测结果见表11。

表11：o-HA纯度

分离步骤中的流速变为120ml/min，分离效果变差，仅可得到纯度较高的HA4～HA10，纯度能达到80％以上，总收率约为10％。

比较例5

将实施例1中的o-HA分离步骤中的运行时间改变为25min，色谱条件及其他步骤同实施例1，制备各个分子量的o-HA。

在流速不变化的情况下缩短运行时间，寡糖未能得到有效收集(即基于色谱图的结果，所有寡糖都是在25min之后出峰)，总回收率约为0％。

尽管对本发明的实施方案和具体实施例进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims

1.一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法，包括：

透明质酸寡糖的分离步骤，使用离子交换色谱柱对透明质酸寡糖混合物进行分离，根据出峰时间依次收集各组分；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其还包括：

在所述透明质酸寡糖的脱盐步骤之后，针对脱盐后的各组分依次进行旋蒸浓缩、以及放入冻干机冻干的步骤。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其还包括：

在所述冻干步骤之后，将冻干后的各组分，依次用高效液相色谱法进行分析，用面积归一化法测定各组分的纯度的检测步骤。

4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱在0～5000psi的压力下使用，且其固定相为键合季铵强阴离子交换基团的硅胶固定相，优选所述离子交换色谱柱为Sepax HP-SAX。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的脱盐中使用的是尺寸排阻色谱填料是HW-40F或Sephadex G10。

6.根据权利要求3～5中任一项所述的制备方法，其中，所述检测步骤中使用的色谱柱为LUNA NH2柱。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的所述离子交换色谱柱使用的流动相为0～0.5mol/L NaCl或Na₂SO₄溶液的线性梯度洗脱。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的离子交换色谱柱中流动相的流速为5～100ml/min，优选为20～80ml/min，进一步优选为30～60ml/min。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，所述透明质酸寡糖的分离步骤中的离子交换色谱柱中流动相的运行时间为30min以上，优选为30～600min，更优选为40～150min，进一步优选为50～100min。

10.根据权利要求3～9中任一项所述的制备方法，其中，利用高效液相色谱法分析得到的HA4～HA20的纯度在80％以上，总收率在50％以上。