CN100369925C - 透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品 - Google Patents

透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品 Download PDF

Info

Publication number
CN100369925C
CN100369925C CNB018124321A CN01812432A CN100369925C CN 100369925 C CN100369925 C CN 100369925C CN B018124321 A CNB018124321 A CN B018124321A CN 01812432 A CN01812432 A CN 01812432A CN 100369925 C CN100369925 C CN 100369925C
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligose
fraction
cell
sugar
hyaluronic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB018124321A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1440418A (zh
Inventor
浅利晃
栗原仁
柴田知己
宫崎由佳
山之口裕子
多和田明
政孝浩
松崎祐二
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seikagaku Corp
Original Assignee
Seikagaku Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Seikagaku Corp filed Critical Seikagaku Corp
Publication of CN1440418A publication Critical patent/CN1440418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100369925C publication Critical patent/CN100369925C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/033—Uronic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供具有选自4糖～60糖大小的透明质酸低聚糖；含有该透明质酸低聚糖、且具有特定理化性质的级分；和含有这些物质的药品。本发明的透明质酸低聚糖，作为细胞死亡抑制剂、细胞障碍抑制剂，及细胞、组织保护剂(例如器官保存剂、溃疡处置剂、肝脏障碍处置剂、IL-10产生促进剂，或IL-8产生抑制剂)的有效成分，发挥优良的药理效果，且具有很高的安全性，因而极其有用。

Description

透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品
技术领域
本发明涉及透明质酸低聚糖(以下称为“HA低聚糖”)及其新的级分。
而且本发明也涉及以这种HA低聚糖为有效成分的药品(特别是用于热冲击蛋白质表达增强剂、细胞死亡抑制剂、细胞障碍抑制剂，或细胞、组织保护剂(特别是器官保存剂、溃疡处置剂、及肝脏障碍处置剂、IL-10产生促进剂，或IL-8产生抑制剂)。
背景技术
透明质酸(以下称为“HA”)，其活性或功能随其分子大小发生变化是已知的。例如，分子量为120万的HA具有NF-κb的钝化作用、血管新生抑制作用等[High molecular weight hyaluronic acid inhibitsadvanced glycation endproduct-induced NF-kappaB  activation andcytokine expression.Neumann A，Schinzel R，Palm D，Riederer P，MunchG.FEBS Lett 1999 Jun 25；453(3)：283-7；Feinberg RN，Beebe DC.Hyaluronate in vasculogenesis.Science 220：1177-1179，1983.]，分子量为50万以下的HA据报道具有与此相反的活性[Noble PW，McKee CM，Cowman M，Shin HS.Hyaluronan fragments activate an NF-kappaB/I-kappaB alpha autoregulatory loop in murine macrophages.J Exp Med183：2373-2378，1996.；West DC，Shaw DM.Tumour hyaluronan inrelation to angiogenesis and metastasis.In：Laurent TC，ed.The chemistry，biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives.London：portland press，1998：227.]。
这些事实充分表示HA低聚糖可能具有多样的活性，或根据HA低聚糖的大小有可能发现其特殊的活性。从而，组合大小不同的HA低聚糖时，可能会发挥出相加或相乘的效果，与此相反，对于某一大小的HA低聚糖的活性，也要考虑其他大小的HA低聚糖产生拮抗剂的作用。
此时，首先在面向HA低聚糖的药品开发的活性研究阶段中，使用各种大小的HA低聚糖混合的级分时，不仅不能确定哪种大小的HA低聚糖为活性主体，而且也有某一大小的HA低聚糖的活性可能被不同大小的HA低聚糖抵消，有可能错过隐藏在HA低聚糖中的重要生理活性或功能。
另外，将某一大小的HA低聚糖作为药品使用时，有必要尽量排除影响该HA低聚糖发挥功能的其他大小的低聚糖，而且，作为药品需要实际上不含非必要物质的高纯度的级分。
如上所述，在新的药品研制与提供中，需要实质上由单一大小的HA低聚糖构成、且实质上不含其他大小的HA低聚糖或其他杂质的高纯度HA低聚糖级分。
另一方面，热冲击蛋白质(以下称为Hsp)也称为应力蛋白质，是一种防御因各种应力反应所产生的障碍的蛋白质，已知多种家庭。其中之一的Hsp70族热冲击蛋白质，可以抑制因热冲击、过氧化氢、重金属、氨基酸类似物、缺糖等环境应力产生的因子，或发热、炎症、缺血、病毒感染、代谢疾病、心肥大症、氧化应力、细胞组织障碍、癌基因或致癌物质等应力因子而产生的蛋白质的结构变化，和异常蛋白质的产生等，同时通过使蛋白质的功能再生等，可以防止细胞障碍或细胞死亡。
关于这些内容，在日本专利申请平9-227386号公报中，记载了将HA作为有效成分的应力蛋白质表达增强剂。在该公报中，记载了作为其活性成分优选2～20糖的HA(第3页)，暗示10糖以下的HA参与应力蛋白质表达的增强或诱导(第6页)。进而也记载了表示HA不饱和二糖增强应力蛋白质的表达，抑制细胞死亡的实验(实施例2)。
但是对于本发明涉及的各种低聚糖，没有具体的公开，而且对于下述在HA4糖中特异发现的极其显著的应力蛋白质表达增强，也没有任何公开或暗示。
而且，从前述应力蛋白质的功能，可以推测应力蛋白质参与细胞、组织的保护。
关于这些内容，在日本专利申请平11-246301号公报中，记载了含有HA和/或生理学上允许的盐的移植用的器官保存溶液。在该公报中，记载了HA的平均分子量优选10万以上，但是对于HA低聚糖及其发挥的优良效果并没有说明或暗示。
发明内容
本发明的目的在于提供具有4糖～60糖大小的HA低聚糖，特别是，实质上由单一大小的HA低聚糖构成、不含其他大小的HA低聚糖或其他杂质的级分。
本发明的另一个目的在于提供将这样的HA低聚糖作为有效成分的药品，特别是，提供效果更好的Hsp表达增强剂、细胞死亡抑制剂及细胞障碍抑制剂。进而，本发明的目的在于提供优良的细胞、组织保护剂，利用该物质的器官保存剂、溃疡处置剂、肝脏疾病处置剂、IL-10产生促进剂及IL-8产生抑制剂。
本发明者为了解决上述课题潜心研究的结果是，将选自4糖～60糖的HA低聚糖，及这些低聚糖的混合物，通过特殊方法进行分离分级，得到了实质上由目标大小的低聚糖构成、且不含其他大小的低聚糖与其他杂质的新的级分。
也就是说，本发明提供含有本发明的低聚糖，而且，特征是具有下述(1)～(6)中所示理化性质的级分(以下称为“本发明级分”)。
(1)将该级分，利用凝胶过滤色谱法，以下面(a)及(b)所述的检测方法进行分析，其结果，不论用哪一种方法都表现出实质上单一的峰，且该峰的面积如下面(a)及(b)所述。
(a)利用210nm吸收检测时，相对于级分中全部HA低聚糖的峰面积之和，前述实质上单一的峰的相对面积为85％以上。
(b)利用差示折射计检测时，相对于级分中全部HA低聚糖的峰面积之和，前述实质上单一的峰的相对面积为98％以上。
(2)将该级分，利用阴离子交换色谱法，以210nm吸收检测分析时，表现出实质上单一的峰，而且，相对于级分中全部HA低聚糖的峰面积之和，前述实质上单一的峰的相对面积为90％以上。
(3)将该级分进行荧光标记之后，通过电泳进行分析时，表现出单一的谱带，而且，没有检测出其他大小的HA低聚糖的谱带。
(4)将构成该级分的HA低聚糖的单一同位素分子量或平均分子量的理论值设定为1时，该级分的质谱分析的实测值为0.997～1.003(相对值)。
(5)构成该级分的HA低聚糖中的碳(C)、氢(H)及氮(N)的各自含量比的理论值(重量％)，与通过该级分的元素分析得到的各元素的实测值(重量％)之差，均在±1(重量％)范围内。
(6)实质上不含蛋白质、DNA及内毒素。
进而，本发明级分优选具有下面(7)所示的理化性质。
(7)该级分的1H-NMR及13C-NMR测定结果，与下面式(1)所示的HA低聚糖的结构不产生矛盾。
式(1)
Figure C0181243200081
(式中，n表示1～29的整数，M表示质子或一价阳离子，Ac表示乙酰基)
本发明级分中含有的HA低聚糖的大小优选选自4糖～20糖，更加优选选自4糖～16糖，进一步优选选自4糖～14糖，特别优选4糖。
另外，本发明者研究了本发明的低聚糖作为药品的可能性，其结果，发现规定大小的HA低聚糖具有极其显著的Hsp表达增强作用、细胞死亡抑制作用及细胞障碍抑制作用，利用这个发现提供了解决上述课题的Hsp表达增强剂、细胞死亡抑制剂及细胞障碍抑制剂。
而且本发明者发现本发明的低聚糖发挥优越的细胞、组织保护作用，从而提供了细胞、组织保护剂，进而提供利用该物质的器官保存剂、溃疡处置剂、肝障碍处置剂、IL-10产生促进剂及IL-8产生抑制剂。
也就是说，本发明提供将本发明的低聚糖作为有效成分的药品(医药组合物，以下称为“本发明药品”)。这种药品，优选为Hsp表达增强剂、细胞死亡抑制剂、细胞障碍抑制剂，或细胞、组织保护剂。
而且细胞、组织保护剂，优选作为器官保存剂、溃疡处置剂、肝障碍处置剂、IL-10产生促进剂、或IL-8产生抑制剂使用。
本发明药品及这些药剂，优选将选自4糖～20糖大小的HA低聚糖作为有效成分，更优选将选自4糖～16糖大小的HA低聚糖作为有效成分，进一步更加优选将选自4糖～14糖大小的HA低聚糖作为有效成分，特别优选HA4糖作为有效成分。
如上所述，以往存在关于HA低聚糖的生理活性、功能的报告。但是使用从分子大小、分子结构、纯度(其他分子大小的混入程度，蛋白质、DNA等其他成分的混入程度，内毒素含量)等多种角度保证的HA低聚糖的例子，至今还没有出现，也就是说，在以往的HA低聚糖的生理活性、功能的报告中，没有否定混入物的影响。对此在本发明中，得到了实质上不含蛋白质、DNA等其他成分的HA低聚糖，进而得到实质上不含其他分子大小的特定大小的HA低聚糖的级分，明确了这些物质的生理活性、功能。
下面，详细说明本发明。
<1>本发明的低聚糖
本发明的低聚糖，是具有选自4糖～60糖大小的HA低聚糖。
所谓“HA低聚糖”，是由与HA的构成二糖组成相同的组成构成的低聚糖。具体来说，是作为HA的构成单糖的葡糖醛酸(GlcA)与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)交替地以配糖键结合的低聚糖。
即，前述式(1)所示结构不仅表示非还原末端为葡糖醛酸的低聚糖，也包括非还原末端为N-乙酰基葡糖胺的HA低聚糖。
处在非还原末端上的糖，可以是饱和糖(单糖中的碳碳键不包括双键)，也可以是不饱和糖(单糖中的碳碳键包括双键)。在以下的说明中，GlcA表示饱和葡糖醛酸，ΔGlcA表示不饱和葡糖醛酸。
其中尤其优选处在非还原末端上的糖为饱和糖，具体来说，优选下面式(2)所示的HA低聚糖。
GlcA(-GlcNAc-GlcA)n-GlcNAc    (2)
(式中，GlcA表示葡糖醛酸残基，GlcNAc表示N-乙酰基葡糖胺残基，-表示配糖键，n表示1～29的整数)
在上式(2)中GlcA-GlcNAc的配糖键优选β1→3键，GlcNAc-GlcA的配糖键优选β1→4键。
其中，特别优选下式(1)所示的HA低聚糖。
式(1)
Figure C0181243200101
(式中，n表示1～29的整数，M表示质子或一价阳离子，Ac表示乙酰基)
如后述实施例所示，处在非还原末端上的糖为不饱和糖时，也表现出有意义的生理活性，这些也是本发明优选的实施方式。作为一具体例，可以例举下式所示的HA低聚糖。
Figure C0181243200102
(式中，Ac表示乙酰基)
在上式所示的非还原末端中含有不饱和糖的HA低聚糖相当于后述实施例中使用的ΔHA4。
而且，本发明的低聚糖可以是盐的形式，也可以是电离的状态。作为盐，有例如碱金属盐(钠盐、锂盐、钾盐等)、碱土金属盐、铵盐等无机碱的盐，或二乙醇胺盐、环己胺盐、氨基酸盐、半乳糖胺盐、葡糖胺盐等有机碱的盐。其中优选碱金属盐，特别优选钠盐。
本发明的低聚糖的来源没有特别的限定。例如，鸡冠、脐带、猪皮、牛皮、鱼类及其他动物的皮、大动脉等，或通过分解处理(例如酶分解、化学分解、加热处理、超声波处理等)从产生HA的微生物中分离.纯化的HA的步骤制备的物质。而且，也可以是通过合成(例如化学合成或酶合成)的步骤制备的物质。
作为酶分解法，可以例举将分解透明质酸酶(来自睾丸)、透明质酸酶(来自链霉菌)、透明质酸酶SD、软骨素酶ACI，软骨素酶ACIII，软骨素酶ABC，内葡萄糖苷酸酶(来自水蛭)等HA的酶作用于HA的方法(参考新生化学实验讲座“糖质II-蛋白多糖与粘多糖”244-288页，1991年发行，东京化学同人)。为了得到上式(1)所示的低聚糖，作为分解HA的酶，优选使用水解酶。
作为化学分解法，可以例举碱分解法或二甲亚砜法(DMSO法)。碱分解法，具体来说，例如通过在HA的溶液中加入1N氢氧化钠等碱，经数小时加温使其低分子化，之后加入盐酸等酸中和的方式进行。作为DMSO法，可以例举Nagasawa等的方法(Carbohyd.Res.，141，99-110页，1985)。而且，也可以通过盐酸或硫酸进行水解。
作为超声波处理法，可以例举在Biochem.，33，6503-6507页(1994)等中记载的方法。
作为合成制备方法，可以例举Glycoconjugate J，453-439页(1993)，国际公开WO93/20827等记载的方法。
这样制备的本发明的低聚糖，可以纯化到所需的纯度。例如下面说明，可以纯化到实质上由单一大小的本发明的低聚糖构成，且不含其他大小HA低聚糖及其他杂质的程度。
<2>本发明级分
本发明级分，为含有本发明的低聚糖的级分，是具有下述理化性质的物质。
通过前述<1>记载的方法可以得到本发明的低聚糖(含有本发明的低聚糖的级分。与“本发明级分”不同)，但是在得到的级分中混有多种大小的HA低聚糖。另一方面，本发明级分是实质上由单一大小的HA低聚糖构成，且不含其他大小HA低聚糖及其他杂质的级分。本发明级分可以通过以下方法制备。
将通过前述<1>记载的方法得到的级分(混有各种大小低聚糖的级分)，加载到强碱性阴离子交换剂的柱上。作为强碱性阴离子交换剂，可以例举含有三甲铵基、三甲基铵甲基、β-羟乙基二甲铵基、2-羟丙氨基、二乙基-(2-羟丙基)氨乙基、二甲基乙醇铵基等的阴离子交换剂，但是优选含有三甲基铵甲基的阴离子交换剂。
柱的大小可以根据施加量等适当设定，小规模制备时优选柱的直径为1～5cm，柱的长度为50～150cm。而且，优选组合使用2个以上的这种柱。
将混有多种大小HA低聚糖的级分加载到这样的柱上时，级分中含有的HA低聚糖与柱中的强碱性阴离子交换剂离子结合。
结合的HA低聚糖，根据盐的浓度梯度可以洗脱。用于洗脱的盐没有特别的限定，可以使用NaCl、KCl、LiCl等，优选使用NaCl。
另外盐的浓度梯度，优选盐浓度从0～0.1M左右上升至0.5M左右。而且优选盐的浓度梯度为直线，优选以0.1M/40～50小时的增大盐浓度，更加优选以0.1M/45～50小时的速度上升盐浓度。
另外流速优选80～100ml/小时，更加优选85～95ml/小时。
通过选择这样的色谱条件，在强碱性阴离子交换剂上离子结合的HA低聚糖，从大小小的开始依次洗脱。由此可以知道HA低聚糖与强碱性离子交换剂的结合力大致与HA低聚糖的大小成比例，其结果，因盐浓度梯度的负荷，从结合力弱的低聚糖(大小小的低聚糖)开始被依次洗脱。本发明级分，是通过利用这样的强碱性阴离子交换剂与HA低聚糖的结合、洗脱特性首次提供的。根据这个方法，利用高分离能，且通过1次柱操作，可以简单分离各种大小的HA低聚糖，可以有效制备实质上由单一大小的HA低聚糖构成，且不含其他大小的HA低聚糖或其他杂质的高纯度的HA低聚糖级分(本发明级分)。
本发明级分中含有的HA低聚糖，优选选自4糖～20糖大小，更加优选选自4糖～16糖大小，进一步优选选自4糖～14糖大小，特别优选4糖。
这样得到的本发明级分，可以再次附加在上述色谱步骤中。而且，也可以附加在浓缩、脱盐、及其他处理中。
本发明级分的保存、流通形态没有特殊的限定，可以是溶液状态、冻结状态、冻干状态中的任意一种。
而且，本发明级分中的HA低聚糖可以是盐的形态，也可以是电离状态。作为盐，有例如碱金属盐(钠盐、锂盐、钾盐等)、碱土金属盐、铵盐等无机碱的盐，或二乙醇胺盐、环己胺盐、氨基酸盐、半乳糖胺盐、葡糖胺盐等有机碱的盐。其中尤其优选碱金属盐，特别优选钠盐。本发明级分用于后述本发明药品时，这些盐中可以使用医学上允许使用的盐。此时也特别优选钠盐。
这样得到的本发明级分，其特征在于满足下面(1)～(6)所示的所有理化性质。另外，下面的理化性质所示的数值等，根据试验或实验条件、环境、使用设备、试验者的熟练度、及其他因素等可能会有一些变化。从而该数值，没有严格被限定于数据上，应该考虑到根据实验条件等测定结果可能存在差异(本领域技术人员常识范围中的数值差异；本领域技术人员可以认定为同一级分程度的数值差异)。
(1)利用凝胶过滤色谱法，以下面(a)及(b)所述检测方法进行分析，其结果，不论用哪一种方法都表现出实质上单一的峰，且该峰的面积如下面(a)及(b)所述，
(a)基于210nm的吸收检测时，相对于级分中全部HA低聚糖的峰面积之和，前述实质上单一的峰的相对面积为85％以上。这个相对面积，优选90％以上，更加优选95％以上。
(b)利用差示折射计(下面也略称为[RI])检测时，相对级分中全部HA低聚糖的峰面积之和，前述实质上单一的峰的相对面积为98％以上。
该理化性质，表示该级分由实质上单一大小的HA低聚糖分子构成。而且，表示实质上不含其他杂质。
另外，本发明中所谓“实质上单一”，并不是“完全单一”的含义，而是“本领域技术人员可以认定为单一”的含义。例如，一般，难以达到大小较大的低聚糖中完全不含其他大小的低聚糖，这可以说是本技术领域的常识。因此，在大小较大的低聚糖级分的色谱分析或质谱分析等中，除了大小较大的低聚糖产生的主峰之外，即使存在其他大小的低聚糖产生的小峰，在考虑低聚糖大小时，也认定是实质上单一的峰。从而，这样的情况下可以称为“实质上单一的峰”。
(2)将该级分，利用阴离子交换色谱法，以210nm吸收检测分析时，表示出实质上单一的峰，而且，相对级分中全部HA低聚糖的峰面积之和，前述实质上单一的峰的相对面积为90％以上。这个相对面积，优选在95％以上。
这个理化性质，表示这个级分由具有实质上单一电荷的HA低聚糖分子构成，即由均质的HA低聚糖构成。而且，表示实质上不含其他杂质。
另外，例如式(1)所示，在HA低聚糖分子中存在规则的羧基，这个基团在溶液中电离成-COO-离子。从而，可以说一定大小的HA低聚糖分子中含有的-COO-离子数是一定的。因此，构成级分的HA低聚糖的电荷实质上单一，也说明由实质上单一大小的HA低聚糖构成。
(3)将该级分进行荧光标记之后，通过电泳进行分析时，表示出单一的谱带，而且，没有检测出其他大小的HA低聚糖的谱带。
这个结果说明即使通过色谱法以外的方法(电泳法)进行分析，也可以明确这个级分由实质上单一大小的HA低聚糖分子构成，也支持色谱法分析的结果。而且，表示实质上不含其他杂质。
(4)将构成该级分的HA低聚糖的单一同位素分子量或平均分子量理论值设定为1时，该级分的质谱分析的实测值均为0.997～1.003(相对值)。这个相对值，优选0.998～1.002的范围，更加优选0.999～1.001的范围。
这个结果说明构成级分的HA低聚糖，其分子量(质量)也实质上单一，而且，暗示实质上不含其他杂质。
(5)构成该级分的HA低聚糖中的碳(C)、氢(H)及氮(N)的各自含量比的理论值(重量％)，与通过该级分的元素分析得到的各元素的实测值(重量％)之差，均在±1(重量％)范围内。
另外，HA低聚糖为钠盐时，更加优选对于钠(Na)同样为±1(重量％)。
这个结果说明构成级分的HA低聚糖，其元素组成也实质上单一，而且，实质上不含其他杂质。
(6)实质上不含蛋白质、DNA及内毒素。
本发明级分中蛋白质的含量，可以利用本领域技术人员公知常用的蛋白质测定法进行测定，但优选劳利(Lowry)法。通过这种方法没有检测出蛋白质时(在检测界限以下时)，判断实质上不含蛋白质。
本发明级分中的DNA含量，可以利用本领域技术人员公知常用的DNA测定法进行测定，但优选阈值(threshold)法。通过这种方法没有检测出DNA时(在检测界限以下时)，判断实质上不含DNA。
本发明级分中的内毒素含量，可以利用本领域技术人员公知常用的内毒素测定法进行测定，但优选使用鲎属变形细胞溶解产物成分的鲎试验法。通过这种方法没有检测出内毒素时(在检测界限以下时)，判断实质上不含内毒素。
本说明书中的所谓“实质上不含”，并不是杂质“一个分子也不存在”的含义，而是表示本领域技术人员可以认定不含杂质的程度(通过上述检测方法检测不出的程度)。即使将来分析技术进步而可以检测到分子单位，这个“实质上不含”，也应以本申请记载内容为基础解释。
进而，本发明级分的一个优选形式中，含有的实质上单一大小的HA低聚糖在非还原末端上具有饱和葡糖醛酸，此时本发明级分进一步具有下面(7)所述性质。
(7)该级分的1H-NMR及13C-NMR测定结果，与下面式(1)所示的HA低聚糖的结构不产生矛盾。
式(1)
Figure C0181243200171
(式中，n表示1～29的整数，M表示质子或一价阳离子，Ac表示乙酰基)
这个结果说明构成级分的HA低聚糖为上式所示HA低聚糖，其分子结构也实质上单一，而且，实质上不含其他杂质。
<3>本发明药品
本发明药品，为以本发明的低聚糖为有效成分的药品。
作为本发明药品的有效成分的本发明的低聚糖，或其优选的形态等，如同前述<1>所述。
其中，作为本发明的低聚糖，其大小优选选自4糖～20糖(HA4糖～HA20糖)，更加优选使用前式(2)中的n为选自1～9的整数的物质，特别优选使用前式(1)中的n为选自1～9的整数的物质。
更加优选，使用选自4糖～16糖大小的本发明的低聚糖(HA4糖～HA16糖)，更加优选使用前式(2)中的n为选自1～7的整数的物质，特别优选使用前式(1)中的n为选自1～7的整数的物质。
更加优选，使用选自4糖～14糖大小的本发明的低聚糖(HA4糖～HA14糖)，更加优选使用前式(2)中的n为选自1～6的整数的物质，特别优选前式(1)中的n为选自1～6的整数的物质。
其中作为本发明的低聚糖，优选使用4糖物质(HA4糖)，更加优选使用前式(2)中的n为1的物质，特别优选使用前式(1)中的n为1的物质。通过使用HA4糖，可以发挥各种优良的药理作用。
另外，前式(1)及(2)表示在非还原末端上含有葡糖醛酸的本发明的低聚糖，但根据本发明药品的具体用途，可以使用在非还原末端上含有不饱和葡糖醛酸的低聚糖，此时优选其大小也同上所述。
更加优选，作为本发明药品的有效成分使用本发明级分。以制剂使用的本发明级分及其优选的形态，如上述<2>记载。而且，本发明级分中含有的HA低聚糖的优选大小，也同上述。
通过使用本发明级分，可以提高本发明药品中的HA低聚糖所含比例，而且可以制备实质上不含作为药品禁止混入的物质的本发明药品。
本发明药品可以通过公知的方法进行制剂化。制剂化时，在对于本发明药品的有效成分HA低聚糖不会带来负面影响，而且在不影响本发明药品效果的范围内，可以使用通常药品中所使用的其他药品活性成分，或常用的稳定剂、乳化剂、渗压调节剂、pH调节剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、止痛剂、着色剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂等。
进而，本发明药品，优选含有本发明级分作为有效成分，但是将具有选自4糖～60糖大小的HA低聚糖作为有效成分，这样的HA低聚糖至少含有有效量也可行，在不影响本发明药品效果的范围内，即使含有其他分子大小的HA低聚糖，或超出低聚糖范围大小的HA，也不会受影响。
本发明药品，优选用作Hsp的表达增强用途、细胞死亡抑制用途、细胞障碍抑制用途，或细胞、组织保护用途的药品，根据这些用途可以制备以下制剂。
[1]Hsp表达增强剂
本说明书中所谓“表达增强”的术语，具有“表达量增加”及“活性增强”的双层含义。因此，本说明书中所谓“热冲击蛋白质表达增强剂”(Hsp表达增强剂)的术语，具有“增加热冲击蛋白质(Hsp)的表达量的制剂”及“增强Hsp活性的制剂”的双层含义。
(1)Hsp表达增强剂的给药方法、剂型等
本发明药品用作Hsp表达增强剂时，HA低聚糖中特别优选使用4糖物质。这样，可以发挥极其优良的Hsp表达增强作用。
Hsp表达增强剂的给药方法，只要在HA低聚糖发挥Hsp表达增强效果的范围内没有特别的限定，例如注射(静脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹腔内等)、经鼻、经口、经皮、吸入等。而且，根据这样的给药方法可以选择适当的剂型，例如可以采用注射剂(溶液、悬浊液、乳浊液、使用时溶解用的固形剂等)、片剂、胶囊剂、液剂、颗粒剂、散剂、脂化剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、糊剂、贴剂、凝胶剂、坐剂、外用散剂、喷剂、吸入散剂等。
Hsp表达增强剂中的HA低聚糖(特别是HA4糖)的含量没有特别的限定，但是例如将Hsp表达增强剂作为注射剂提供时，优选0.1～10％(w/v)。
例如Hsp表达增强剂作为注射剂提供时，其形态，可以是溶液、冻结物、或冻干物中任何一种。将其填充、密封在细颈瓶、小药水瓶、注射器等适当的容器内，以该形态流通或保存，可以作为注射剂进行给药。
如上所述，作为Hsp表达增强剂的有效成分，特别优选HA4糖，但是另外，含有其他分子大小的HA低聚糖也没有影响。而且从后面的实施例中可以看出，HA4糖具有特殊的极其显著的Hsp表达增强作用，所以仅仅增加在Hsp表达增强剂中的HA4糖含量，就可以得到很好的效果，而且可以减少维持与其他分子大小的HA低聚糖相同效果的给药量。从而，Hsp表达增强剂中的HA低聚糖特别优选实质上只由4糖构成，优选不添加HA4糖以外的HA低聚糖。
(2)Hsp表达增强剂的给药对象等
期待Hsp表达增强剂，对Hsp产生的防御作用所暗示的细胞障碍或细胞死亡等引起的疾病中的很多疾病会产生效果，例如心脏疾病(心肌梗塞等)、尿细管障碍、循环器官疾病、脑疾病(脑中风等)、神经疾病等血管狭窄或缺血导致的缺血性疾病，后天性免疫不全综合症、免疫抑制剂或抗癌剂的给药引起的胸腺细胞的障碍，末梢T细胞的减少、免疫不全症等免疫关联疾病、肝炎、溃疡性大肠炎等炎症、外伤、细菌感染症、病毒感染症、阿尔茨海默病、糖尿病、肥大症、川崎病、精神分裂症、发热、代谢疾病、癌等。
而且不仅是细胞障碍或细胞死亡引起的疾病，对于期待Hsp的细胞、组织保护作用的对象，也可以适用Hsp表达增强剂。对于这一点，在后面的“细胞、组织保护剂”中详细说明。
被给用Hsp表达增强剂的动物，优选脊椎动物，特别优选哺乳动物，特别优选人。可以将这些疾病的预防，进行的抑制(防止恶化)，症状的改善或治疗等为目的给用Hsp表达增强剂，但优选作为预防药物进行给药。
Hsp表达增强剂中HA低聚糖、特别是HA4糖的配合量、一次给药量、给药间隔等，增强剂的给药方法、给药形态、使用目的等，应该根据患者的具体症状、年龄、性别、体重等个别确定，没有特别的限定，但作为HA4糖的临床给药量，例示成人1人一次300～7500mg。而且Hsp表达增强的给药间隔，可以是一日一次，也可以一日分成2～3次。
Hsp表达增强剂，也可以用作与应力蛋白表达增强作用有关的实验用试验药品。
[2]细胞死亡抑制剂
细胞死亡抑制剂，是利用Hsp的表达增强作用的用途之一。即，HA低聚糖(特别是HA4糖)，不仅具有Hsp表达增强作用，实际上也发挥细胞死亡抑制作用，所以将其应用于细胞死亡抑制的目的。
可以适用该细胞死亡抑制剂的疾病，只要是通过Hsp的表达增强可以抑制细胞死亡疾病，则没有特别的限定，Hsp表达增强剂的说明优选已经例举的疾病。
被给用该细胞死亡抑制剂的动物、给药目的、HA低聚糖(特别是HA4糖)的配合量、给药量、给药间隔等，与Hsp表达增强剂相同。
[3]细胞障碍抑制剂
HA低聚糖(特别是HA4糖)不仅具有Hsp的表达增强作用，实际上也发挥细胞障碍抑制作用，所以将其应用于细胞障碍抑制的目的。
可以适用该细胞障碍抑制剂的疾病，只要是通过Hsp的表达增强可以抑制细胞障碍疾病，则没有特别的限定，Hsp表达增强剂的说明优选已经例举的疾病。
被给用该细胞障碍抑制剂的动物、给药目的、HA低聚糖(特别是HA4糖)的配合量、给药量、给药间隔等，与Hsp表达增强剂相同。
[4]细胞、组织保护剂
HA低聚糖(特别是HA4糖)不仅具有Hsp的表达增强作用，实际上也发挥细胞、组织保护作用，所以将其应用于细胞、组织保护的目的。
该细胞、组织保护剂，可以适用于期待Hsp的细胞、组织保护作用的对象。例如，可以用于需要细胞、组织保护的的疾病等，或取出生物体外的细胞、组织保护等。
作为需要细胞或组织保护的疾病，可以例举消化性溃疡(胃、十二指肠溃疡等)、胃炎、肝障碍(肝炎等)、溃疡性大肠炎、缺血性心疾病、心肌炎、脑中风、脑梗塞等。
该细胞、组织保护剂，具体来说，优选用作以下制剂。
(1)溃疡处置剂、肝障碍处置剂
前述细胞、组织保护剂，通过用作处置溃疡的制剂，可以作为溃疡处置剂，通过用作处置肝障碍的制剂，可以作为肝障碍处置剂。另外，本发明中所述“处置”的含义在于，以疾病的预防、维持(防止恶化)、减轻(症状的改善)及治疗为目的，对于患有该疾病的动物进行给药，“处置剂”为用于该处置的药剂。
(2)IL-10产生促进剂、IL-8产生抑制剂
前述细胞、组织保护剂，可以用于IL-10减少引起的疾病，或需要促进产生IL-10的疾病等。通过将细胞、组织保护剂用作促进产生IL-10的制剂，可以作为IL-10产生促进剂。
而且，该细胞、组织保护剂，可以用于IL-8增加引起的疾病，或需要抑制产生IL-8的疾病等。通过将细胞、组织保护剂用作抑制产生IL-8的制剂，可以作为IL-8产生抑制剂。
作为这种制剂的给药对象的动物，或给药目的等，与Hsp表达增强剂的说明相同。
(3)器官保存剂
前述细胞、组织保护剂，可以用于保护取出生物体外的细胞、组织的目的。通过将该细胞、组织保护剂用作保存取出生物体外的细胞或组织的制剂，可以作为例如器官保存剂。具体来说，通过用该器官保存剂灌流为移植而取出的器官(肝脏、肾脏、心脏、肺等)，或在该器官保存剂中保存、保持等，可以抑制该器官的细胞、组织伤害(浮肿、细胞死亡等)。
在细胞、组织保护剂中的HA低聚糖配合量、一次给药(使用)量、给药间隔等，根据给药(使用)方法、形态、目的等具体的状况可以个别确定。
例如将细胞、组织保护剂作为溃疡处置剂、肝障碍处置剂、IL-10产生促进剂、IL-8产生抑制剂等对人给药时，作为HA低聚糖(特别是HA4糖)的临床给药量，可以例举每一成人一次120～6000mg。
将该细胞、组织保护剂，作为保护取出生物体外的细胞、组织目的使用时，可以将其作为液剂、灌注用剂、使用时溶解用的固形剂等而制剂化。作为器官保存剂使用时，根据保存或保持的器官大小、保存时间、温度等具体状况，可以个别确定HA低聚糖(特别是HA4糖)的配合量。
该细胞、组织保护剂中HA低聚糖(特别是HA4糖)的浓度也没有特别的限定，但是作为例如注射剂(溶液)或保存器官的液剂提供时，优选1ng/ml～1mg/ml。
细胞、组织保护剂作为注射剂、或液剂提供时，其形态可以是溶液、冻结物、或冻干物中的任何一种。将其填充、密封在细颈瓶、小药水瓶、注射器等适当的容器内，以该形态流通或保存，可以作为注射剂进行给药。
进而，本发明不仅包括上述制剂，也包括在活体外或在活体内将HA低聚糖(特别是HA4低聚糖)作用于细胞或生物体组织等适用对象，在该适用对象中增强Hsp的表达，抑制细胞死亡，抑制细胞障碍，或保护细胞、组织(例如，保存器官，处置溃疡，处置肝障碍，促进IL-10产生，或抑制IL-8产生)的方法。
附图说明
图1为表示HA4在凝胶过滤色谱法中的洗脱曲线。上段的纵轴表示210nm吸收，下段的纵轴表示RI吸收。而且横轴始终表示洗脱时间。
图2为表示HA6在凝胶过滤色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图1相同。
图3为表示HA8在凝胶过滤色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图1相同。
图4为表示HA10在凝胶过滤色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图1相同。
图5为表示HA12在凝胶过滤色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图1相同。
图6为表示HA14在凝胶过滤色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图1相同。
图7为表示HA4在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴表示210nm吸收，横轴表示洗脱时间。
图8为表示HA6在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图9为表示HA8在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图10为表示HA10在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图11为表示HA12在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图12为表示HA14在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图13为表示HA48在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图14为表示HA50在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图15为表示HA52在阴离子交换色谱法中的洗脱曲线。纵轴及横轴的说明与图7相同。
图16为表示荧光标记低聚糖的电泳结果的图。
图17为表示HA4的质谱的图。
图18为表示HA6(上段)、HA8(中段)及HA10(下段)的质谱的图。
图19为表示HA6(上段)、HA8(中段)及HA10(下段)的反褶积结果的图。
图20为表示HA12(上段)、HA14(中段)及HA16(下段)的质谱的图。
图21为表示HA12(上段)、HA14(中段)及HA16(下段)的反褶积结果的图。
图22为表示HA48(上段)、HA50(中段)及HA52(下段)的质谱的图。
图23为表示HA43(上段)、HA50(中段)及HA52(下段)的反褶积结果的图。
图24为表示HA4的1H-NMR光谱的图。
图25为表示HA4的13C-NMR光谱的图。
图26为表示HA6的1H-NMR光谱的图。
图27为表示HA6的13C-NMR光谱的图。
图28为表示HA8的1H-NMR光谱的图。
图29为表示HA8的13C-NMR光谱的图。
图30为表示HA10的1H-NMR光谱的图。
图31为表示HA10的13C-NMR光谱的图。
图32为表示HA12的1H-NMR光谱的图。
图33为表示HA12的13C-NMR光谱的图。
图34为表示HA14的1H-NMR光谱的图。
图35为表示HA14的13C-NMR光谱的图。
图36为表示HA16的1H-NMR光谱的图。
图37为表示HA16的13C-NMR光谱的图。
图38为表示HA48的1H-NMR光谱的图。
图39为表示HA50的1H-NMR光谱的图。
图40为表示HA52的1H-NMR光谱的图。
图41为表示热冲击后HA4糖引起的HSFl活化的图。
图42为表示热冲击后HA4糖诱导的Hsp72的表达的图。
图43为表示各种HA低聚糖对由缺乏血清诱导的细胞死亡(编程性细胞死亡)的抑制程度的图。
图44为表示HA4糖对于器官浮肿的抑制效果的图。
图45为表示HA4糖对于细胞的染色质浓缩的抑制效果的图。
图46为表示由HA4糖获得的减少TUNEL染色细胞数的图。
图47为表示HA4糖对于细胞、组织障碍的抑制效果的图。
图48为表示HA4糖对于胃溃疡的抑制效果的图。
图49为表示HA4糖对肝障碍的抑制效果(GOT活性)的图。
图50为表示HA4糖对肝障碍的抑制效果(白血球数)的图。
图51为表示HA4糖促进IL-10产生的效果的图。
图52为表示HA4糖抑制IL-8产生的效果的图。
具体实施方式
下面，通过实施例更具体地说明本发明。
以下，将HA4糖级分略记为“HA4”，将HA6糖级分略记为“HA6”，将HA8糖级分略记为“HA8”。
[实施例1]
本发明的低聚糖及本发明级分的制备与理化性质
1.本发明的低聚糖及本发明级分的制备
以从鸡冠分离、纯化的HA的钠盐为原料，通过以下方法制备了本发明的低聚糖及本发明级分。另外，作为原料的HA的钠盐，通过使用醋酸纤维素膜的电泳(电泳缓冲液：吡啶-甲酸缓冲液，电流：15mA，电泳时间：30分钟)表现出单一的谱带，没有检测出HA以外的粘多糖(软骨素、硫酸-4-软骨素、硫酸-6-软骨素、硫酸软骨素E、硫酸软骨素D、肝素、硫酸类肝素、硫酸皮肤素)。
(制备例1)利用透明质酸酶的分解
将HA的钠盐25g溶解于含有0.15M NaCl的的0.1M磷酸缓冲液(pH5.3)1.IL中。在所得溶液中，添加来自牛睾丸的透明质酸酶(5.342单位/mg；生化学工业株式会社制造)200mg，在37℃下反应9小时。
反应之后，以10,000rpm离心分离30分钟后回收上清液。将回收的上清液，加载到具有作为阴离子交换基的三甲基铵甲基的强碱性阴离子交换剂的Dowex 1×2(100～200目)(Dow chemical制造)离子交换柱(φ1.5×123cm)上，通过NaCl的直线浓度梯度(0.01M～0.50M)洗脱。通过利用咔唑法(carbazole method)检测所得到级分中的糖醛酸，筛选了含有HA低聚糖的级分。将适当的级分汇集并进行浓缩，利用Sephadex G-10(Pharmacia制造；φ3×124)进行脱盐，之后实施冻干。
得到的级分的冻干重量，表示在以下的括号内。
HA4(330mg)、HA6(1210mg)、HA8(305mg)、HA10(1625mg)、HA12(685mg)、HA14(620mg)、HA16(430mg)、HA18(210mg)、HA20(202mg)、HA22(819mg)、HA24(197mg)、HA26(187mg)、HA28(159mg)、HA30(137mg)、HA32(122mg)、HA34(102mg)、HA36(91mg)、HA38(89mg)、HA40(65mg)、HA42(76mg)、HA44(61mg)、HA46(58mg)、HA48(46mg)、HA50(48mg)、HA52(21mg)。
(制备例2)利用软骨素酶ACI的分解
将HA的钠盐8g溶解于含有0.1％牛血清白蛋白的0.1M乙酸缓冲液(ph 6.0)500ml中。
在所得溶液中，添加软骨素酶AC I(生化学工业株式会社制造)32单位，在37℃下反应6小时。
反应之后，以10,000rpm离心分离30分钟后回收上清液。将回收的上清液，加载到Dowex 1×2(100～200目)(Dow chemical制造)离子交换柱(φ4.5×123cm)上，通过NaCl的直线浓度梯度(0.01M～0.50M)洗脱。通过利用咔唑法检测所得级分中的糖醛酸，筛选了含有HA低聚糖的级分。将适当的级分汇集后进行浓缩，利用Sephadex G-10(Pharmacia制造；φ3×124)进行脱盐，之后实施冻干。
所得级分的冻干重量，表示在以下的括号内。其中[Δ]表示非还原末端糖为不饱和糖。
ΔHA4(133mg)、ΔHA6(133mg)、ΔHA8(84mg)、ΔHA10(109mg)、ΔHA12(100mg)、ΔHA14(101mg)、ΔHA16(73mg)、ΔHA18(31mg)、ΔHA20(9mg)。
(制备例3)DMSO法
将HA的钠盐10g溶解于含有10％的0.1M HCl的二甲基亚砜(DMSO)3L中。在105℃下加热处理16小时。
处理之后，加载到Dowex 1×2(100～200目)(Dow chemical制造)离子交换柱(φ3.0×78cm)上进行了色谱分析。洗脱通过NaCl的直线浓度梯度(0.01M～0.50M)进行。通过利用咔唑法检测所得到级分中的糖醛酸，筛选了含有HA低聚糖的级分。将适当的级分汇集后进行浓缩，利用Sephadex G-10(Pharmacia制造；φ3×124)进行脱盐，之后实施冻干。
得到的级分的冻干重量，表示在以下的括号内。
HA2(50mg)、HA4(1100mg)、HA6(232mg)、HA8(1015mg)、HA10(1033mg)、HA12(459mg)。
将这样得到的各种大小的HA低聚糖，进行了以下各种分析。
2.本发明级分的理化性质
对于上述制备例1中得到的各HA低聚糖(钠盐)级分，检测了各种理化性质。
(1)凝胶过滤色谱法分析
使用的柱：TSKGe12500+3000+4000pwxl(TOSOH株式会社)
溶剂：0.05M NaCI
流速：0.6ml/分
检测波长：210nm、及差示折射计(RI)
试样加载量：作为HA低聚糖的量，为200μg/发射(Shot)
作为试样使用HA4(第1批)～HA14时的洗脱曲线，表示在图1～图6中。各图的上段表示在210nm检测的结果，下段表示以差示折射计检测的结果。
从这些图，可以看出任何级分都表示出实质上单一的峰。
而且，相对于级分中全部HA低聚糖的峰面积之和的主HA峰的相对面积，如表1所示，基于210nm吸收检测时均为85％以上，用差示折射计(RI)检测时均为98％以上。
表1
  试样   相对于全部峰的主峰的面积比(％)
  210nm   RI
  HA4(第1批)   89.037   99.854
  HA6   98.573   99.815
  HA8   96.617   98.929
  HA10   98.594   99.287
  HA12   100.000   100.000
  HA14   98.334   99.796
(2)离子交换色谱法分析
柱：YMC NH2柱(株式会社YMC)
溶剂：使用NaH2PO4的0M至0.8M的浓度梯度
流速：1ml/分
检测波长：210nm
试样加载量：作为HA低聚糖的量，为20μg/发射
作为试样使用HA4(第1批)～HA14及HA48～HA52时的洗脱曲线，表示在图7～图15中。从这些图，可以看出任何级分都表示出实质上单一的峰。而且，相对于级分中全部HA低聚糖的峰面积之和的主HA峰的相对面积，如表2所示均为90％以上。
表2
  试样   相对于全部峰的主峰的面积比(％)
  HA4(第1批)HA6HA8HA10HA12HA14HA48HA50HA52   98.500797.914098.120997.423694.542594.718194.474393.430594.2492
(3)荧光标记凝胶电泳分析
将HA4、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14及HA16各自进行如下处理。同时，对于HA低聚糖混合物级分(也含HA2糖；以下略记为“混合物”)也进行了同样的处理。
(3-1)荧光标记低聚糖的调制
将各个级分所含HA低聚糖，使用FACERN-linked OligosaccharideProfiling Kit(Glyko，Inc.，Novato，CA.U.S.A)实施了荧光标记。
将含有大约2nmol(对于混合物，以HA2糖单位大约2nmol)HA低聚糖量的级分，在0.5mL塑料管中利用离心式冻结真空干燥器(Speedvac，AS160，SAVANT INSTRUMENTS INC.NY.U.S.A)进行干燥。干燥后，在各管中各添加5μL的8-氨基萘-1，3，6-三磺酸二钠盐(ANTS)溶液(GLYKO，L2，Part#50058：reconstituted OLIGO LabelingDye)，搅拌后在室温放置15分钟。进而，各添加5μL的氰硼氢钠溶液(GLYKO，L1，Part#50056：Labeling Reducing Agent)，密封并在36℃下温育16小时。
温育之后，在离心式冻结真空干燥器上通过15分钟，进行部分干燥，之后加入20μL蒸馏水。
(3-2)荧光标记低聚糖的电泳
使用GLYKO O-linked Oligsaccharide Profiling Gel(GLYKO，Part#60200；交联度为36％的聚丙烯酰胺凝胶)进行了电泳。
将1包OLIGO Gel Running Buffer(GLYKO，Part#7000)用蒸馏水溶解使其达到1.5L，并在冰中冷却。
凝胶盒(GLYKO，GLYKO Gel Box，Part#40026)中循环冷却水，在其中加入已冷却的Running Buffer，并放上凝胶。凝胶盒也用冰进行冷却。
各取2μL含有荧光标记的HA低聚糖的各种级分溶液，与蒸馏水3μL和Loading Buffer(GLYKO，Part#50064)5μL混合。取2μL混合物溶液与Loading Buffer 2μL混合。将该各自的4μL加载到凝胶上。各级分的加载量是使每一泳道的HA低聚糖的加载量为80pmol。
用1000V的恒定电压电泳160分钟，通过紫外透照器(NLM-20E型，UVP，CA，U.S.A)照射365nm的光发出的荧光，利用快速成像照相机(MAMIYA，Professional SD，f＝127mm)及快速成像底片(PolaloidR Polapan T667，iso3000，Polapoid corp.MA.U.S.A.)进行记录。其结果表示在图16中。
图16中泳道与试样的关系如下。
泳道1：混合物，泳道2：HA4，泳道3：HA6，泳道4：HA8，泳道5：HA10，泳道6：HA12，泳道7：HA14，泳道8：HA16。
混合物表现出梯状谱带，但分级的各低聚糖级分，全都形成具有对应于其大小的泳动度的单一的谱带，而且，没有检测出其他大小HA低聚糖的谱带。
另外，大小越小，得到的泳动度越大。在各级分中低聚糖谱带的位置(泳动位置)，与混合物表示出的梯状谱带的各个大小的位置几乎一致，即使在多个大小的低聚糖的混合物中，各分子的泳动度也没有受到影响。
GLYKO O-linked Profiling Gel是交联度为36％的聚丙烯酰胺凝胶。8-氨基萘-1，3，6-三磺酸二钠盐(ANTS)是具有三价负电荷的荧光物质。
将不带电荷的2-氨基吖啶酮(AMAC)作为荧光物质时，该凝胶上的所有低聚糖都基本不动。从而可以看出，这个高交联度凝胶的电泳中仅HA低聚糖本身的负电荷不足，需要已结合的ANTS的电荷。而且，没有使用公知的与糖链骨架结构相互作用的硼酸，故暗示低聚糖的大小与聚丙烯酰胺的网目大小的相互作用影响泳动度。
使用Glyko公司的其他凝胶(交联度为20％或21％)，并用ANTS标记时，HA8糖以下不能分离，或HA4糖以下与泳动前线重叠而不能检测出。
(4)质谱分析
通过电喷雾离子化质谱分析法(electrospray ionization massspectrometry；ESIMS)进行质谱分析。
(4-1)方法
(4-1-1)分析试样
将HA4(第1批)、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14、HA16、HA48、HA50及HA52配成水溶液，使各自浓度依次达到2.6mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、6.5mg/ml、1.3mg/ml、1mg/ml、1mg/ml及1mg/ml。
另外，对于与HA低聚糖有关的分子量的理论值，以HA4糖～52糖具有下式(1)所示结构为基础求得。
式(1)
Figure C0181243200341
(式中，n表示1～29的整数，M表示质子或一价阳离子，Ac表示乙酰基)
(4-1-2)试药
在试验中使用的甲醇(和光纯药)及蒸馏水(和光纯药)是用于HPLC的，甲酸铵(和光纯药)使用了特级。
(4-1-3)仪器及器材
1)HPLC系统
Agilent 1100系列：二元泵、脱气装置、自动取样器(AgilentTechnologies)
2)质谱仪
三重四极型质谱仪：TSQ(ThermoQuest)
(4-1-4)ESIMS分析条件
向质谱仪导入试样是通过向连接在质谱仪上的HPLC系统中注入各试样溶液5μL或10μL进行的。HPLC及ESIMS的分析条件如下。
1)HPLC
移动相：10mM甲酸铵水溶液/甲醇＝80/20
流速：0.2ml/min
柱：无
注入量：10μL
2)ESIMS
探针：Off-axis
离子模式：阴离子模式
离子化法：ESI法(电喷雾离子化法)
ESI喷雾电压：4.5kV
热毛细管温度：350℃
辅助气体：35单位
保护气体(sheath gas)：50psi
扫描范围：m/z 10-2500或10-4000
扫描时间：1.5秒或3秒
(4-1-5)反褶积分析
从观测到的ESIMS光谱估算分子量的反褶积分析，通过分析软件Xcalibur Bioworks(ThermoQuest)进行。
(4-2)结果
HA4～HA16的阴离子ESIMS光谱测定结果总结在表3及表4中，HA4～HA16或HA48～HA52的光谱表示在图17～图23中。
表3
  试样   拟分子离子及其相关离子(m/z)   反褶积质量
  [M-H]<sup>-</sup>   [M-2H]<sup>2-</sup>   [M-3H]<sup>3-</sup>   [M-4H]<sup>4-</sup>   [M-5H]<sup>5-</sup>   [M+Na-2H]<sup>-</sup>   [M+Na-3H]<sup>2-</sup>   [M+2Na-4H]<sup>2-</sup>   [M+Na-4H]<sup>3-</sup>   [M+2Na-5H]<sup>3-</sup>   [M+3Na-6H]<sup>3-</sup>   [2M-H]<sup>-</sup>   [2M-3H]<sup>3-</sup>
  HA4(第1批)   774.9100   386.955   797.127   1551.615
HA6   1153.945   576.6100   383.81   1176.12   587.619   769.13   11551
HA8   1533.936   766.1100   510.33   777.09   1022.310   1534.5
HA10   1912.816   955.9100   636.915   967.04   1275.29   1913.7
HA12   2292.112   1145.5100   763.291   572.313   1156.316   1167.48   770.515   777.98   1527.911   2293.1
HA14   1335379   889.5100   666.612   1346.29   1357.54   897.114   1780.64   2671.9
HA16   1524.852   1016.1100   761.617   608.95   1535.74   1023.416   1030.69   1037.63   3051.2
上段：观测值
下段：峰的相对强度(％)
表4
试样   分子关联离子(m/z)   反褶积质量
  [M-5H]<sup>5-</sup>   [M-6H]<sup>6-</sup>   [M-7H]<sup>7-</sup>   [M-8H]<sup>8-</sup>   [M-9H]<sup>9-</sup>   [M-10H]<sup>10-</sup>   [M-11H]<sup>11-</sup>   [M-12H]<sup>12-</sup>   [M-13H]<sup>13-</sup>   [M-14H]<sup>14-</sup>   [M+Na-6H]<sup>5-</sup>   [M+2Na-7H]<sup>5-</sup>   [M+3Na-8H]<sup>5-</sup>
  HA48   1822.4100   1518.77   1301.96   1138.412   1011.716   910.537   827.977   758.659   700.222   650.08   1826.745   1831.725   1835.623   9117.2
  HA50   1898.2100   1581.47   1355.52   1186.57   1054.18   948.716   861.926   790.323   729.419   677.114   1903.043   1907.319   1911.812   9496.1
  HA52   1974.2100   1645.323   1409.57   1233.011   1096.423   986.727   89669   821.898   758.445   704.320   1979.350   1983.537   1987.439   9875.0
上段：观测值
下段：峰的相对强度(％)
在以上结果中，观测到了都被认为来自HA低聚糖的与各种分子有关的离子，这与HA4(第1批)相当于HA4糖，HA6相当于HA6糖，HA8相当于HA8糖，HA10相当于HA10糖，HA12相当于HA12糖，HA14相当于HA14糖，HA 16相当于HA16糖，HA48相当于HA48糖，HA50相当于HA50糖，及HA52相当于HA52糖的解释不矛盾。
根据以上结果，单一同位素分子量的理论值设定为1时，求得了主峰的实测值的相对值。其结果表示在表5A中。另外，对于HA4使用了有关[M-H]-的实测值与理论值。
表5A
  试样   实测值   理论值   相对值
  HA4(第1批)   774.9   775.2   0.9996
  HA6   1155.1   1155.3   0.9998
  HA8   1534.5   1534.5   1.0000
  HA10   1913.7   1913.6   1.0001
  HA12   2293.1   2292.7   1.0002
  HA14   2671.9   2671.8   1.0000
  HA16   3051.2   3050.9   1.0001
  HA48   9117.2   9116.7   1.0001
  HA50   9496.1   9495.8   1.0000
  HA52   9875.0   9874.9   1.0000
另外，将平均分子量的理论值设定为1时，求得了主峰的实测值的相对值。其结果表示在表5B中。另外，对于HA4使用了有关[M-H]-的实测值与理论值。
表5B
  试样   实测值   理论值   相对值
  HA4(第1批)   774.9   775.6   0.9991
  HA6   1155.1   1156.0   0.9992
  HA8   1534.5   1535.3   0.9995
  HA10   1913.7   1914.6   0.9995
  HA12   2293.1   2293.9   0.9997
  HA14   2671.9   2673.3   0.9995
  HA16   3051.2   3052.6   0.9995
  HA48   9117.2   9121.7   0.9995
  HA50   9496.1   9501.0   0.9995
  HA52   9875.0   9880.3   0.9995
这些结果说明，构成本发明级分的HA低聚糖的单一同位素分子量或平均分子量的理论值设定为1时，通过级分的质谱分析得到实测值均在0.999～1.001(相对值)的范围内。
(5)元素分析
将HA4(第1批)、HA6、HA8、HA10、HA12、HA14及HA16各自在80℃下减压干燥2小时，立即用元素分析器进行测定。其结果表示在表6中。
表6
  试样   元素   理论值(％)   实测值(％)   误差
  HA4(第1批)   CHNNa   40.985.163.415.60   40.635.203.345.48   0.35-0.040.070.12
  HA6   CHNNa   41.285.113.445.64   40.745.173.315.75   0.54-0.060.13-0.11
  HA8   CHNNa   41.445.093.455.67   41.415.223.365.41   0.03-0.130.090.26
  HA10   CHNNa   41.535.083.465.68   41.415.243.435.45   0.12-0.160.030.23
  HA12   CHNNa   41.595.073.465.69   40.965.333.235.41   0.63-0.260.230.28
  HA14   CHNNa   41.645.063.475.69   41.445.363.375.20   0.20-0.300.100.49
这个结果说明，构成本发明级分的HA低聚糖(钠盐)中的碳(C)、氢(H)、氮(N)及钠(Na)的各自含量比的理论值(重量％)，与该级分通过元素分析而得到的各元素的实测值(重量％)之差，都在±1(重量％)范围内。
(6)核磁共振光谱(NMR)
利用VARIAN UnityInova500型测定了HA低聚碳级分的1H-NMR及13C-NMR。测定溶剂使用了D2O。内标为t-BuOH(1H：1.23ppm，13C：32.461ppm)，测定温度设定为23℃，进行测定。各HA低聚糖级分的结果如下。另外，各自的光谱表示在图24～图40中。
(6-1)HA4(组1)的测定结果
500MHz1H-NMR  δ；
2.004(s，3H，NAc)，2.018，2.019(3H，NAc)，3.292-3.326(m，1H，H-2d)，3.354(dd，1H，J1，2＝7.9Hz，J2，3＝9.5Hz，H-2b)，4.027(dd，0.6H，J1，2＝3.5Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.453(d，J1，2＝7.9Hz，H-1d)，4.460(d，H-1bβ)，4.502(d，0.6H，H-1bα)，4.555(d，1H，J1，2＝8.4Hz，H-1c)，4.705(d，0.4H，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.144(d，0.6H，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图24中。
125MHz13C-NMRδ；
24.84，25.09，25.36(NHCOCH3)，55.81(C-2aα)，57.09(C-2c)，58.44(C-2aβ)，63.40，63.57(C-6a或C-6c)，
75.29，75.33(C-2bα或C-2bβ)，75.58(C-2d)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.44(C-1c)，
105.80，105.84，105.95(C-1bα或C-1bβ或C-1d)，
177.00，177.04，177.41，177.68，177.80，178.33(羰基)
作为分析基础的光谱表示在图25中。
这些结果，与前式(1)中n＝1表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-2)HA6的测定结果
500MHz 1H-NMR  δ；
2.002，2.010，2.017(9H，NAc)，3.291-3.368(m，3H，H-2b，H-2d和H-2f)，4.026(dd，0.6H，J1，2＝3.5Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，4.452，4.459(d×2，2.4H，J1，2＝7.8Hz，J1，2＝7.8Hz，H-1bβ，H-1d和H-1f)，4.500(d，0.6H，J1，2＝7.9Hz，H-1bα)，
4.544，4.550(d×2，2H，J1，2＝8.5Hz，J1，2＝8.5Hz，H-1c或H-1e)，4.702(d，J1，2＝8.3Hz，H-1aβ)，5.142(d，0.6H，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图26中。
125MHz13C-NMRδ；
24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.81(C-2aα)，57.09，57.16(C-2c或C-2e)，58.44(C-2aβ)，63.40，63.57(C-6a或C-6c或C-6e)，75.28，75.31，75.34，75.57(C-2bα或C-2bβ或C-2d或C-2f)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，103.40，103.45(C-1c或C-1e)，
105.80，105.85，105.94，106.02(C-1bα或C-1bβ或C-1d或C-1f)，176.97，177.40，177.68，177.80，178.27(羰基)
作为分析基础的光谱表示在图27中。
这些结果，与前式(1)中n＝2表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]2-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-3)HA8的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
2.002，2.003，2.008，2.016(12H，NAc)，3.290-3.368(m，4H，H-2b，H-2d，H-2f和H-2h)，
4.025(dd，0.6H，J1，2＝3.5Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，
4.450，4.458(d×2，3.4H，J1，2＝7.8Hz，J1，2＝7.8Hz，H-1bβ，H-1d，H-1f和H-1h)，
4.500(d，0.6H，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，
4.539，4.543，4.550(d×3，3H，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.5Hz，J1，2＝8.4Hz，H-1c或H-1e或H-1g)，4.702(d，0.4H，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.142(d，0.6H，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图28中。
125MHz13C-NMR δ；
24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，
57.10，57.16(C-2c，C-2e和C-2g)，58.44(C-2aβ)，
63.40，63.57(C-6a，C-6c和C-6e)，
75.28，75.34，75.57(C-2b，C-2d，C-2f和C-2h)，
93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，
103.39，103.45(C-1c，C-1e和C-1g)，
105.80，105.85，105.95，106.04(C-1b或C-1d或C-1f或C-1h)，176.93，177.40，177.68，177.80，178.27(羰基)
作为分析基础的光谱表示在图29中。
这些结果，与前式(1)中n＝3表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]3-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-4)HA10的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
2.001，2.007，2.016(15H，NAc)，4.025(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，
4.441-4.465(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h和H-1j)，4.499(d，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，
4.538，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.4Hz，H-1c，H-1e，H-1g和H-1i)，4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图30中。
125MHz13C-NMRδ；
24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，
57.10，57.16(C-2c，C-2e，C-2g和C-2i)，58.44(C-2aβ)，
63.37，63.57(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g和C-6i)，
75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h和C-2j)，
93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，
103.39，103.46(C-1c，C-1e，C-1g和C-1i)，
105.80，105.86，105.94，106.05(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h和C-1j)，176.94，176.99，177.41，177.68，177.81，178.30(羰基)
作为分析基础的光谱表示在图31中。
这些结果，与前式(1)中n＝4表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]4-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-5)HA12的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
2.002，2.006，2.016(18H，NAc)，4.025(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.7Hz，H-2aα)，
4.440-4.465(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h，H-1j和H-IL)，4.498(d，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，
4.538，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.4Hz，H-1c，H-1e，H-1g，H-1i和H-1k)，4.701(d，J1，2＝8.5Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图32中。
125MHz13C-NMRδ；
24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，
57.09，57.16(C-2c，C-2e，C-2g和C-2i)，58.44(C-2aβ)，
63.37(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g和C-6i)，
75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h和C-2j)，
93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，
103.40，103.45(C-1c，C-1e，C-1g和C-1i)，
105.80，105.86，106.05(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h和C-1j)，
176.95，177.40，177.80，178.31(羰基)
作为分析基础的光谱表示在图33中。
这些结果，与前式(1)中n＝5表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]5-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-6)HA14的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
2.001，2.006，2.016(21H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，
4.439-4.464(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h，H-1j，H-IL和H-1n)，4.498(d，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，
4.537，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.3Hz，H-1c，H-1e，H-1g，H-1i，H-1k和H-1m)，
4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图34中。
125MHz13C-NMRδ；
24.84，25.09，25.34(NHCOCH3)，55.81(C-2aα)，
57.09，57.15(C-2c，C-2e，C-2g和C-2i)，58.43(C-2aβ)，
63.36，63.57(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g和C-6i)，
75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h和C-2j)，
93.91(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，
103.40(C-1c，C-1e，C-1g和C-1i)，
105.80，105.85，105.94，106.07(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h和C-1j)，176.95，177.40，177.67，177.80，178.30(羰基)
作为分析基础的光谱表示在图35中。
这些结果，与前式(1)中n＝6表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]6-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-7)HA16的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
2.002，2.006，2.016(24H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，
4.434-4.464(m，H-1bβ，H-1d，H-1f，H-1h，H-1j，H-IL，H-1n和H-1p)，4.498(d，J1，2＝7.8Hz，H-1bα)，
4.537，4.549(d×2，J1，2＝8.4Hz，J1，2＝8.3Hz，H-1c，H-1e，H-1g，H-1i，H-1k，H-1m和H-1o)，
4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图36中。
125MHz13C-NMRδ；
24.84，25.09，25.35(NHCOCH3)，55.82(C-2aα)，
57.10，57.16(C-2c，C-2e，C-2g，C-2i，C-2k，C-2m和C-2o)，
58.44(C-2aβ)，
63.37，63.57(C-6a，C-6c，C-6e，C-6g，C-6i，C-6k，C-6m和C-6o)，
75.35，75.58(C-2b，C-2d，C-2f，C-2h，C-2j，C-2l，C-6n和C-6p)，93.92(C-1aα)，97.61(C-1aβ)，
103.40(C-1c，C-1e，C-1g，C-1i，C-1k，C-1m和C-1o)，
105.80，105.86，105.95，106.08(C-1b，C-1d，C-1f，C-1h，C-1j，C-IL，C-1n和C-1p)，
176.98，177.41，177.68，177.81，178.33(羰基)
作为分析基础的光谱表示在图37中。
这些结果，与前式(1)中n＝7表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]7-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-8)HA48的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
1.998，2.005，2.016(72H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，
4.395-4.470(m，GlcA-单元)，
4.498(d，J1，2＝8.0Hz，H-1bα)，
4.537，4.610(d×2，J1，2＝8.2Hz，J1，2＝7.8Hz，GlcNAc-单元)，
4.700(d，J1，2＝8.3Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，J1，2＝3.6Hz，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图38中。
这些结果，与前式(1)中n＝23表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]23-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-9)HA50的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
2.005，2.017(75H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，
4.390-4.470(m，GlcA-单元)，
4.498(d，J1，2＝7.9Hz，H-1bα)，
4.537，4.610(d×2，J1，2＝8.1Hz，J1，2＝8.1Hz，GlcNAc-单元)，
4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，J1.2＝3.6Hz，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图39中。
这些结果，与前式(1)中n＝24表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]24-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(6-10)HA52的测定结果
500MHz1H-NMRδ；
2.005，2.017(78H，NAc)，4.024(dd，0.6H，J1，2＝3.6Hz，J2，3＝10.6Hz，H-2aα)，
4.375-4.475(m，GlcA-单元)，
4.498(d，J1，2＝8.2Hz，H-1bα)，
4.536，4.610(d×2，J1，2＝8.1Hz，J1，2＝8.1Hz，GlcNAc-单元)，
4.701(d，J1，2＝8.4Hz，H-1aβ)，5.141(d，0.6H，J1，2＝3.4Hz，H-1aα)
作为分析基础的光谱表示在图40中。
这些结果，与前式(1)中n＝25表示的结构(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠-[(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-β-D-吡喃葡糖基-(1□4)-(β-D-吡喃葡糖基糖醛酸钠)]25-(1□3)-2-乙酰胺基-2-去氧-D-吡喃葡糖的结构)不矛盾。
(7)HA低聚糖以外的杂质
测定了各级分中以下杂质的含量。
(7-1)蛋白质
蛋白质的含量，以牛血清白蛋白为标准物质，利用BioRad ProteinAssay试剂盒(BioRad公司制造)进行测定。
(7-2)DNA
DNA，利用阈值法(DNA测定装置：Threshold(美国BioRad制造))进行测定。
(7-3)内毒素
内毒素，利用Toxycolor System(商品名；生化学工业株式会社制造)通过鲎试验法进行测定。
表7
  试样   蛋白质(％)   DNA   内毒素(pg/ml)
  HA4HA6HA8HA10HA12HA14   检测界限以下″″″″″   检测界限以下″″″″″   0.50.10.10.70.10.3
这个结果说明，本发明级分中的蛋白质及DNA的含量都在检测界限以下，而且内毒素的含量也为实质上没有影响的程度，可以得到任何一个都实质上不含内毒素的结论。
[实施例2]
<材料等>
(1)试验物质等
首先，说明本实施例中使用的试验物质。
试验物质(以下使用括号内的略号。而且在下式中，GlcA表示葡糖醛酸残基，GlcNAc表示N-乙酰基葡糖胺残基，Gal表示半乳糖残基，(6S)表示6-O-硫酸酯，-表示配糖键，Δ表示不饱和糖)
·HA饱和2糖(HA2)
GlcAβl-3GlcNAc
·HA不饱和2糖(ΔHA2)
ΔGlcAβ1-3GlcNAc
·HA饱和4糖(HA4)
GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc
·HA不饱和4糖(ΔHA4)
ΔGlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc
·HA饱和6糖(HA6)
GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc
·HA不饱和6糖(ΔHA6)
ΔGlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc
·HA饱和8糖(HA8)
GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc
·HA饱和10糖(HA10)
GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc
·HA饱和12糖(HA12)
GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAcβ1-4GlcAβ1-3GlcNAc
·HA饱和2～18糖的混合物(HA2-18)
·HA饱和8～14糖的混合物(HA8-14)
·HA(重均分子量84万；HA84)
·Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)(L4)
·Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)β1-3Gal(6S)β1-4GlcNAc(6S)(L4L4)
HA饱和低聚糖，使用了在前述制备例1中制备的HA低聚糖级分。
另外，HA不饱和低聚糖，是通过将利用软骨素AC-1裂解酶(软骨素酶AC I黄；生化学工业株式会社制造)处理HA而得的分解产物，通过与前述制备例1一样的方法分级而得到的(参考制备例2)。
L4及L4L4，通过国际公开WO96/16973所记载的方法调制。
将试验物质，以根据以下药效药理试验所定的浓度溶解于生理食盐水。溶解于生理食盐水之后的内毒素浓度，任何一个都在0.3EU/ml以下，而且铁含量任何一个都在20ppm以下。
(2)细胞、培养基
K562细胞(JCRB0019；人的白血病细胞)、PC-12细胞(JCRB0733)
K562细胞，利用含有10％牛胎儿血清(FBS)的RPMI1640培养基进行培养。
另外，PC-12细胞，利用含有10％马血清及5％新生牛犊血清(FCS)的DMEM培养基(含有D-葡萄糖(1,000mg/l)、L-谷氨酰胺(4mM)、丙酮酸钠(110mg/l)、碳酸氢钠(3.7g/l))575ml中，添加了10ml的20％葡萄糖水溶液的培养基进行培养。
<1>HSF1对磷酸化的作用
已知HSF1(热冲击因子1)蛋白质是Hsp70的转录因子(J.Biol.Chem.，271，3355-3358(1996))。而且HSF1蛋白质，通过被磷酸化而活化，该磷酸化基于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中的谱带位移(表观分子量大约从66kDa移至约81kDa)进行检测。利用该事实，将各种大小的低聚糖作用于施加应力的K562细胞，通过检测上述谱带的位移，确定了HSF1的磷酸化(活化)程度。
(1)实验1
将HA4、ΔHA4、HA6、HA8、HA2-18及HA8-14，各自添加在含有前述细胞的培养液中，使其浓度达到1、10或100ng/ml，之后通过立即移至42℃的环境中而施加热冲击，温育20分钟。温育之后，通过离心分离而回收细胞，进行SDS-PAGE(凝胶浓度为10％)。接着使用抗HSF1单克隆抗体(Stressgene公司制造)作为一次抗体，使用羊抗鼠单克隆抗体IgG(Jackson Lab公司制造)作为二次抗体进行免疫印迹法(Western Blotting)，检测出了从66kDa的谱带(没有磷酸化的HSF1)到81kDa的谱带(磷酸化的HSF1)的位移。
其结果，添加了HA4、ΔHA4、HA6及HA2-18的细胞中，根据HA低聚糖的添加量发现了向81kDa谱带的位移。在HA8-14中没有发现明显的变化。对于HA8反而发现了谱带位移的阻碍。
(2)实验2
为了确认实验1的再现性，使用HA4、ΔHA4、HA8及HA84，除了培养液的HA添加量只设定为100ng/ml，热冲击在43℃下进行之外，都与实验1一样，检测出了谱带位移。其结果表示在图41中。在图41中，从左数第一泳道为在37℃条件下(没有添加HA低聚糖)的细胞的提取物，第二泳道为在43条件下(没有添加HA低聚糖)的细胞的提取物，最右边泳道为作为标准将HSF1(来自细菌)以同样的方法检测的结果。
根据图41，在添加了HA4及ΔHA4的细胞中发现HSF 1的谱带位移，而且66及81kDa二者的HSF1本身的量也增加。另一方面，在HA8中发现了66kDa的HSF1的量增加，但是没有发现向81kDa的谱带位移。而且在HA84中没有发现变化。
(3)实验3(比较实验)
为了确定在实验2中观察到的作用对HA低聚糖的糖链骨架结构是否特异，进行了使用以下软骨素低聚糖的比较实验。软骨素(以下称为Ch)，只有HA的GlcNAc被半乳糖胺残基(GalNAc)置换这一点与HA不同，在为粘多糖及不含硫酸基的方面与HA相同。从而，可以说Ch是与HA结构极其类似的物质，对于它们的低聚糖也同样。
·Ch饱和4糖(Ch4)
GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAc
·Ch饱和6糖(Ch6)
GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAc
·Ch饱和8糖(Ch8)
GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-4GlcAB1-3GalNAc
这些Ch饱和低聚糖，根据Nagasawa等的方法(Carbohyd.Res.，141，99-110页，1985)，通过将利用含有HCl的二甲亚砜(DMSO)处理Ch而得到的分解产物，用阴离子交换色谱法根据大小进行分级而得到。
使用这些低聚糖，进行了与实验2相同的实验。其结果，添加任何一个Ch低聚糖的细胞中，都没有观察到HSF1的谱带位移或HSF1本身量的增加。
从这个实验可以看出，Ch低聚糖，没有HA低聚糖中发现的HSF1的活化或表达增强作用。这个结果说明，这样的作用是对HA低聚糖的糖链骨架结构特异性的。
这些实验说明，HA4糖及含有该物质的级分(HA2-18)，将HSF1极其显著地活化。
<2>对Hsp表达的作用
由于根据<1>确定了HA4糖与其他大小的HA相比可以将表达Hsp70必需的因子(HSF1)显著活化，所以为了确定被施加应力的K562细胞中的Hsp的表达，与使用其他大小的HA相比是否实际上由HA4糖的作用而显著增加，进行了如下实验。
将HA2、ΔHA4、HA6、HA84及L4L4，各自添加在含有前述细胞的培养液(37℃)中，使其浓度达到1、10或100ng/ml。之后通过立即移至43℃的环境下而施加热冲击，温育20分钟。之后使其培养液恢复到37℃又温育2小时，之后通过离心分离回收细胞，与上述<1>同样地进行SDS-PAGE。接着使用抗Hsp72单克隆抗体(Amersham公司制造)作为一次抗体，使用羊抗兔IgG单克隆抗体(Jackson Lab公司制造)作为二次抗体，进行免疫印迹法，检测出了Hsp72。Hsp72，为Hsp70家族成员之一，最具有代表性，发现其表达被应力所诱导及增强。
结果表示在图42中。在图42的a中最左边的泳道为没有施加热冲击(37℃)，而且没有添加试验物质，而同样检测Hsp72的结果，最右边的泳道为同样检测标准Hsp72(来自细菌的Hsp72；bHsp72)的结果。在图42中b为同样检测在没有施加热冲击的细胞中添加了ΔHA4时的Hsp72表达的结果。
从图42的a所示结果可以看出，施加热冲击(43℃)时(从左数第二泳道)，与37℃下没有添加试验物质时(最左边的泳道)相比，Hsp的表达被增强。而且，在各HA低聚糖存在下Hsp的表达进一步被增强，在ΔHA4的存在下Hsp的表达特别强有力地被增强(从左数第3～5泳道)。
如上所述，添加了ΔHA4的细胞(施加了热冲击的细胞)中发现了Hsp的强表达，但添加了其他大小HA的细胞中没有发现如添加ΔHA4那么强的Hsp72的表达增强。
而且在没有施加热冲击的细胞中，没有发现由ΔHA4增强Hsp72的表达。这个结果说明，HA4糖在没有应力的条件下对于Hsp的表达几乎没有影响，一旦施加应力，极速且显著增强Hsp的表达。
<3>细胞死亡的抑制作用
根据上述实验，确定了HA4糖增强应力下的细胞中Hsp表达的作用强于其他大小HA低聚糖，故为了确定HA低聚糖实际上能否更强有力地抑制受到应力作用的细胞的死亡，进行了如下实验。
PC-12细胞在不含血清的培养液中发生编程性细胞死亡是已知的。
因此将ΔHA2、HA4、ΔHA4、HA6、ΔHA6、HA8、HA10、HA12、HA84、L4、L4L4，各自添加在含有PC-12细胞(不含血清)的培养液中，使其浓度达到100ng/ml，24小时之后将细胞用台盼蓝(trypan blue)将细胞染色，算出了相对于总细胞数生存细胞(没有用台盼蓝染色的细胞)数的比例。
其结果表示在图43中。根据图43的结果可以判断，HA4糖，特别是HA4，与其他大小的HA低聚糖或其他种类低聚糖相比，显著抑制细胞死亡。
<4>细胞组织保护作用
1.器官保存方面的细胞、组织保护作用
(1)器官保存液的调制
将含有100ng/ml HA4糖的Euro-Collins液(Euro-Collins液；Am.J.Surg.，179，154-160页(2000))作为试验溶液(以下记为“HA4(+)”)。作为对照，使用Euro-Collins液(以下记为“HA4(-)”)。
(2)试验物质的给药等
将11周龄的SD雄性大鼠，分为“HA4(+)”使用组(n＝5)、“HA4(-)”使用组(n＝5)、及正常组(n＝5)。开腹取出器官(肝脏)之后，对于“HA4(+)”使用组及“HA4(-)”使用组，用大约40ml各溶液进行灌流，直至因出血使整个肝脏颜色变浅，之后在37℃下温育2小时。
(3)评价
温育之后，算出各组的器官湿重量/干重量比(组织伤害引起的浮肿程度的指标)，用光学显微镜观察(肉眼观察组织伤害程度)HE染色的组织切片，进行染色质浓缩图像分析及根据TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyltransferase(TdT)-mediated nick end labeling method)；J.Cell.Biol.，119，493-501页(1992))的分析(细胞死亡程度的评价)。
(3-1)器官的湿重量/干重量比的结果表示在图44中。在图44中的*表示因p＜0.05(威廉姆斯多范围检验(Williams multiple range test))而存在显著差异。
根据图44的结果，“HA4(+)”使用组，与“HA4(-)”使用组相比，显著降低了湿重量/干重量比。这个结果说明，HA4糖可以有效抑制由器官的保存引起的组织伤害而引起的浮肿。
(3-2)用光学显微镜观察进行了HE染色的组织切片，结果是，在“HA4(-)”使用组中观察到了浮肿、组织溶解(细胞质的消失)、核浓缩等。与此相反，在“HA4(+)”使用组中观察到了与正常组几乎相同的图像，没有观察到在“HA4(-)”使用组中观察到的显著的组织伤害。
(3-3)染色质浓缩的图像分析
作为评价细胞死亡程度的一种方法，使用进行了HE染色的组织切片，进行了细胞染色质浓缩的图像分析(Image-Pro PLUSTM Version3.0.1；Media Cybernetics制造)，比较了图像浓度。发生细胞死亡而染色质浓缩时，该部分被HE深染色。染色质浓缩的细胞越多，显微镜图像整体的浓度液越高，所以将其作为指标进行评价。
其结果表示在图45中。另外在图45中，*表示因p＜0.05(WilliamsMultiple range test)而存在显著差异。
(3-4)TUNEL法分析
作为评价细胞死亡程度的一种方法，进行了利用TUNEL法的DNA的片断化程度分析。细胞发生编程性细胞死亡时，DNA会片断化是已知的。TUNEL法为将DNA的末端染色的方法，DNA被片断化的细胞多时，TUNEL染色的程度会增高，所以可以作为细胞死亡(编程性细胞死亡)程度的指标。
将保存后的组织切片进行TUNEL染色，然后用光学显微镜肉眼观察，计数了每一平方厘米的TUNEL染色细胞数。同时，将各自组织切片的组织障碍程度，用“重度”、“中度”、“轻度”、“极轻度”4个阶段进行评价。而且这个评价，为了确保客观性而随机进行。前者的结果表示在图46中，后者的结果表示在图47中。而且在图46中的*表示因p＜0.05(Williams multiple range test)而存在显著差异。
从图46的结果中可以看出，相对于在“HA4(-)”使用组中观察到极多的TUNEL染色细胞，在“HA4(+)”使用组中TUNEL染色细胞极少，几乎是与正常组相同的程度。而且从图47可以看出，“HA4(-)”使用组中在80％的组织切片中观察到了“重度”、“中度”的组织障碍，但是在“HA4(+)”使用组中没有观察到“重度”的组织障碍，在20％的组织切片中最多观察到了“中度”的组织障碍。
以上结果说明，HA低聚糖(HA4糖)，在器官保存方面具有优良的细胞、组织保护效果。
2.在对溃疡的效果方面的细胞、组织保护作用
(1)给药用的试验溶液的调制
将试验物质溶解在羧甲基纤维素(CMC)中，作为给药用的试验溶液。根据后述的给药量，确定浓度，并使给药液量达到10ml/kg。
另外作为阳性对照溶液，使用将已有的胃炎、胃溃疡治疗剂(teprenone、geranylgeranylacetone；商品名Selbex，Eisai)溶解在CMC中的物质。确定浓度，使给药量达到1mg/kg(临床用量)，且给药液量达到10ml/kg。作为阴性对照溶液使用了0.5％CMC。
(2)试验物质的给药等
将5周龄的SD雄性大鼠，分为“阴性对照溶液”给药组(n＝8)、“HA44ml/kg”给药组(n＝8)、“HA420mg/kg”给药组(n＝8)、“HA4100mg/kg”给药组(n＝8)及[阳性对照溶液]给药组(n＝8)。
从第一次给药的前一天16:00开始使各组鼠绝食，第二天8:00将上述溶液经口给药之后用水浸进行限制。水浸限制一直持续到第二天的8:00(24小时)。在这期间，在16:00及24:00与第一次给药一样将各溶液进行给药。
之后解剖各鼠，取出胃。取出的胃注入10％缓冲甲醛溶液使其膨胀，将褶变平滑并固定。之后，水洗除去附着在胃壁上的血液。
(3)评价
利用图像分析装置(Image-pro PLUSTM Version 3.0.1；MediaCybernetics制造)测定了产生黑褐色变性的溃疡部的面积率(溃疡面积/腺胃面积)。其结果表示在图48中。在图48中*及**各自表示因p＜0.05及p＜0.01(Williams multiple range test)而存在显著差异。
从图48中可以看出，将HA4给药组与阴性对照溶液给药组相比，任何一个的溃疡部的面积率都明显下降。特别是HA420mg/kg给药组及HA4100mg/kg给药组，溃疡部面积率比阳性对照溶液组还低。
以上结果说明，HA低聚糖(HA4糖)，在对溃疡的效果方面，具有优良的细胞、组织保护效果。而且通过HA低聚糖的经口给药，可以得到上述优良的效果。进而，这个在实验中将HA低聚糖(HA4糖)预先给药之后用水浸进行限制，并且，水浸限制开始之后到产生溃疡需要一定时间，所以这个实验的结果说明HA低聚糖(HA4糖)具有预防效果。限制
3.在对肝障碍的效果方面的细胞、组织保护作用
实验1使用四氯化碳模型的实验
(1)给药用试验溶液的调制
将试验物质溶解在生理食盐水中，作为给药用试验溶液。根据后述的给药量，确定浓度，使给药液量达到5ml/kg。
而且作为阳性对照溶液，以给药量10mg/kg使用了FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸；Wakamoto制药)，FAD对于后述四氯化碳肝障碍模型的效果被报道(药物疗法，第9卷，特集号46-53页)。而且作为阴性对照溶液使用了生理食盐水。
(2)试验物质的给药等
将5周龄的SD雄性大鼠，分为“阴性对照溶液”给药组(n＝8)、“HA42ml/kg”给药组(n＝8)、“HA410mg/kg”给药组(n＝8)、“HA450mg/kg”给药组(n＝8)及“阳性对照溶液”给药组(n＝8)、“正常组”(n＝8)。
从第一次给药的前一天16:00开始使各组鼠断食，第二天8:00前经口给用四氯化碳(CCl4)100mg/kg。之后在8:00将上述各溶液腹腔内给药。之后仍然保持绝食状态，在16:00及24:00与第一次给药一样将各溶液进行给药。24:00给药之后进行喂食，第二天8:00解剖各鼠。
(3)评价
解剖之后，采集血液，测定了GOT活性及白血球数。GOT活性的测定使用临床化学自动分析装置(COBAS MIRA S；日本Roche)，白血球数的测定使用了自动血球测定装置(Sysmex(K)-2000；Sysmex公司制造)。
前者的结果表示在图49中，后者的结果表示在图50中。图49及图50中*表示因p＜0.05(Williams multiple range test)而存在显著差异。
根据图49可以看出，HA450mg/ml给药组与阴性对照溶液给药组相比，发现了显著的GOT活性下降。而且根据图50可以看出，任何一个HA4给药组，与阴性对照溶液给药组相比，发现了显著的末梢白血球数的减少，与FAD相比白血球数也有减少。这个结果说明，HA4糖在对肝障碍的效果方面具有细胞、组织保护效果。进而，这个实验中将四氯化碳预先给用之后，将HA低聚糖(HA4糖)给药，但是将四氯化碳给药之后到因四氯化碳而产生肝障碍需要一定时间，这个实验结果说明HA低聚糖(HA4糖)具有预防效果。
而且在本实验中，一并测定了末梢血中的IL-10及IL-8的浓度。
IL-10，据报道与应力蛋白质(细胞受到应力时被表达，具有保护细胞作用的蛋白质)的一种Hsp70相关(J.Immunol.，164(5)，2711-2717页(2000))，而且也有IL-10抑制因伴刀豆球蛋白A引起的肝炎的报道(Autoimmunity，31(2)，75-83页1999)。
另外，在镉或乙醇引起的肝障碍模型中，IL-8的表达量上升是已知的(Toxicology and Applied Pharmacology，163，231-9页(2000)，ActaGastro-Enterologica Belgica，57(3-4)，255-9页(1994))，而且也有通过诱导Hsp70的表达而抑制IL-8的表达的报道(Journal of Immunology，164，5416-23页(2000))。
末梢血中的IL-10，用IL-10Rat ELISA(ENDOGEN公司生产)进行测定。IL-8，用Panatest A Series Rat CINC-1(IL-8)(株式会社Panapharm Laboratories)进行测定。IL-10的测定结果表示在图51中，IL-8的测定结果表示在图52中。在图51及图52中的**表示因p＜0.01(Williams multiple range test)而存在显著差异。
从图51可以看出，血中的IL-10浓度随HA4的给药量增加，HA450mg/kg给药组与阴性对照溶液给药组相比，血中IL-10浓度显著提高。而且从图52可以看出，血中的IL-8浓度随HA4的给药量减少。
这个结果说明，HA低聚糖(HA4糖)，具有促进IL-10产生的效果及抑制IL-8产生的效果。因此HA低聚糖(HA4糖)通过促进IL-10产生或抑制IL-8产生，可以发挥前述细胞、组织保护效果。而且HA低聚糖(HA4糖)，对于因IL-10的减少或IL-8的增加引起的疾病，或需要促进IL-10产生或抑制IL-8产生的疾病等，可以作为处置剂利用。
实验2使用伴刀豆球蛋白A模型的实验
为了确定HA低聚糖(HA4糖)对除了四氯化碳模型以外的肝障碍模型是否有效，进行了使用伴刀豆球蛋白A模型的实验。
(1)给药用溶液的调制
给药用试验溶液的调制、浓度、给药量、及给药液量等，与实验1相同。
而且作为阳性对照溶液，使用了给药量5mg/kg的强力Neo-Minophangen C(Stronger Neo-Minophagen C；Minophagen制药)。这个量为该药剂的最高临床用量。而且作为阴性对照溶液使用了生理食盐水。
(2)试验物质的给药等
将8周龄的Balb/c小鼠，分为“阴性对照溶液”给药组(n＝12)、“HA42ml/kg”给药组(n＝12)、“HA410mg/kg”给药组(n＝12)、“HA450mg/kg”给药组(n＝12)及“阳性对照溶液”给药组(n＝12)、“正常组”(n＝8)。
将伴刀豆球蛋白A(ConA；Sigma公司)15mg/kg经尾部静脉给药。之后将上述各溶液经尾部静脉给药。之后饲养24小时。
(3)评价
从腹部主动脉采取血液，使用临床化学自动分析装置(COBASMIRA S；日本Roche)测定了GPT活性及GOT活性。另外取出肝脏，用肉眼观察了肝脏的状态。
其结果，GPT平均值在“阴性对照溶液”给药组中大约为5600(I.U./L)。与此相对，在“HA410mg/kg”给药组及“HA450mg/kg”给药组中各自大约为2200(I.U./L)及1200(I.U./L)，任何一个都比“阴性对照溶液”给药组显著偏低(p＜0.01；Dunnett的多重比较检测)。另外，“阳性对照溶液”给药组大约为4000(I.U./L)。
GOT的平均值在“阴性对照溶液”给药组中大约为6000(I.U./L)。与此相对，在“HA410mg/kg”给药组及“HA450mg/kg”给药组中各自大约为2000(I.U./L)及1000(I.U./L)，任何一个都比“阴性对照溶液”给药组显著偏低(p＜0.01；Dunnett的多重比较检测)。另外，“阳性对照溶液”给药组大约为4400(I.U./L)。
肝脏的肉眼观察结果是，“HA410mg/kg”给药组及“HA450mg/kg”给药组，与“阴性对照溶液”给药组及“阳性对照溶液”给药组相比，任何一组障碍程度都降低。
这些结果说明，HA低聚糖(HA4糖)对于伴刀豆球蛋白A引起的肝障碍也发挥效果，这暗示了HA低聚糖(HA4糖)对于各种肝障碍有效。进而这个实验与四氯化碳模型一样显示，HA低聚糖(HA4糖)也具有预防效果。
从HA低聚糖本身的高安全性以及上述实施例的结果，可以推断本发明的各种制剂的安全性。
工业实用性
本发明的低聚糖，作为本发明药品的有效成分是有用的。
本发明级分，为含有所需大小的HA低聚糖，实质上不含其他大小低聚糖及其他杂质的HA低聚糖级分，作为HA低聚糖的生理活性研究用试药、分析用标准、药品本身或其材料，是极其有用的。
以本发明的低聚糖为有效成分的药品，特别是Hsp表达增强剂，从前述实施例的结果中也可以看出，特定大小的HA低聚糖，发挥其他大小的HA低聚糖所没有的显著的效果。进而通过选择这个特定大小的HA低聚糖，可以在维持与其他大小HA低聚糖的效果的同时，可以减少给药量，在更加廉价且安全性高的制剂方面，是极其有用的。
进而，以本发明的低聚糖为有效成分的细胞死亡抑制剂、细胞障碍抑制剂、及细胞、组织保护剂(例如器官保存剂、溃疡处置剂、肝障碍处置剂、IL-10产生促进剂、或IL-8产生抑制剂)，也如前述实施例的结果所示，发挥优良的药理效果，且安全性高。

Claims (5)

1.一种级分，含有透明质酸四糖即包括4个糖残基的透明质酸低聚糖，其特征在于，具有下面(1)～(6)所述的理化性质，
(1)利用凝胶过滤色谱法，以下面(a)及(b)所述的检测方法分析该级分时，不论用哪一种方法都表现出实质上单一的峰，且该峰的面积如下面(a)及(b)所述，
(a)基于210nm的吸收进行检测时，相对于级分中全部透明质酸低聚糖的峰面积之和，透明质酸四糖的峰的相对面积为85％以上，
(b)利用差示折射计检测时，相对于级分中全部透明质酸低聚糖的峰面积之和，透明质酸四糖的峰的相对面积为98％以上，
(2)利用阴离子交换色谱法，基于210nm的吸收检测分析该级分时，表现出实质上单一的峰，而且，相对于级分中全部透明质酸低聚糖的峰面积之和，透明质酸四糖的峰的相对面积为90％以上，
(3)将该级分中的透明质酸四糖进行荧光标记之后，通过电泳进行分析时，表现出单一的谱带，而且，没有检测出其他大小的HA低聚糖的谱带，
(4)将构成该级分的透明质酸四糖的单一同位素分子量或平均分子量的理论值设定为1时，该级分的质谱分析的实测值以相对值计为0.997～1.003，
(5)构成该级分的透明质酸四糖中的由符号C表示的碳、由符号H表示的氢及由符号表示的氮的各自含量比的理论值，与通过该级分的元素分析得到的各元素的实测值之差，均在±1重量％范围内，和
(6)实质上不含蛋白质、DNA及内毒素。
2.根据权利要求1所述的级分，其特征在于，进一步具有如下面(7)所述的理化性质，
(7)该级分的1H-NMR及13C-NMR测定结果，与下面式(1)所示的透明质酸四糖的结构不矛盾，
式(1)
Figure C018124320003C1
式中，n表示1，M表示质子或一价阳离子，Ac表示乙酰基。
3.一种药品，含有权利要求1的透明质酸四糖的级分作为活性成分，其为选自热冲击蛋白质表达增强剂、细胞死亡抑制剂、细胞障碍抑制剂、及细胞和组织保护剂的药物。
4.根据权利要求3所述的药品，其特征在于，所述细胞、组织保护剂选自器官保存剂、溃疡处置剂、肝障碍处置剂、IL-10产生促进剂、及IL-8产生抑制剂。
5.根据权利要求3的药品，其为细胞和组织保护剂。
CNB018124321A 2000-07-07 2001-07-06 透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品 Expired - Fee Related CN100369925C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP206404/2000 2000-07-07
JP206404/00 2000-07-07
JP2000206404 2000-07-07
JP2000247840 2000-08-17
JP247840/00 2000-08-17
JP247840/2000 2000-08-17

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007103053104A Division CN101229186A (zh) 2000-07-07 2001-07-06 透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1440418A CN1440418A (zh) 2003-09-03
CN100369925C true CN100369925C (zh) 2008-02-20

Family

ID=26595584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018124321A Expired - Fee Related CN100369925C (zh) 2000-07-07 2001-07-06 透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品

Country Status (9)

Country Link
US (5) US7507723B2 (zh)
EP (1) EP1300412B1 (zh)
JP (1) JP4861596B2 (zh)
CN (1) CN100369925C (zh)
AT (1) ATE453655T1 (zh)
AU (3) AU2001269478B2 (zh)
CA (2) CA2414211C (zh)
DE (1) DE60140941D1 (zh)
WO (1) WO2002004471A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109517012A (zh) * 2018-11-13 2019-03-26 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7511026B2 (en) * 2003-03-25 2009-03-31 Seikagaku Corporation Therapeutic agent for nerve damage
JP4576583B2 (ja) * 2005-03-22 2010-11-10 キユーピー株式会社 ヒアルロン酸またはその塩、およびその製造方法、ならびにこれを含有する化粧料および食品組成物
JP2007153761A (ja) * 2005-12-01 2007-06-21 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk シナプス伝達促進剤及びシナプス保護剤
US20070099867A1 (en) * 2005-05-24 2007-05-03 Glycoscience Laboratories, Inc. Pharmaceutical agent containing hyaluronan as an active ingredient
JP2007084509A (ja) * 2005-09-26 2007-04-05 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 細胞賦活剤
CA2560844C (en) * 2005-09-26 2011-05-17 Glycoscience Laboratories, Inc. Pharmaceutical agent containing hyaluronan as an active ingredient
JP2009091248A (ja) * 2006-01-17 2009-04-30 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 外傷性神経障害および／または運動機能障害の治療薬
EP1992645A4 (en) * 2006-02-24 2011-03-09 Q P Corp NOVEL HYALURONIC ACID WITH LOW MOLECULAR WEIGHT AND / OR SALT THEREOF, AND COSMETIC PREPARATION, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND EACH FOOD COMPOSITION USING THE SAME
WO2008047779A1 (fr) * 2006-10-17 2008-04-24 Glycoscience Laboratories, Inc. Agent thérapeutique ou prophylactique pour la dermatite atopique
US8153614B2 (en) 2006-12-05 2012-04-10 Glycoscience Laboratories, Inc. Treatment of osteoarthritis
CA2702366C (en) * 2007-10-12 2016-06-07 London Health Sciences Centre Research Inc. Compositions affecting hyaluronic acid mediated activity
CN101326963B (zh) * 2008-03-03 2011-06-22 北京神州圣业科技有限公司 一种碱性阳离子饲料免疫增强剂溶液、生产方法及其用途
JPWO2009113512A1 (ja) * 2008-03-11 2011-07-21 キユーピー株式会社 Ｓｏｃｓ３発現促進剤、これを含有する医薬品および食品、ならびにｓｏｃｓ３の発現を促進する方法
TW201031749A (en) 2009-02-10 2010-09-01 Otsuka Chemical Co Ltd IgG-Fc fragment and method for manufacturing the same
JP5587637B2 (ja) * 2009-04-10 2014-09-10 生化学工業株式会社 マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤及びその用途
US20150018305A1 (en) * 2012-02-22 2015-01-15 Hyaluronan Research Institute, Inc. Sirtuin inducer, tissue repairing agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintenance agent, and tlr4 agonist, having hyaluronic acid fragment as active ingredient
EP2698636A1 (en) * 2012-08-13 2014-02-19 Fundació Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge Methods and reagents for prevention and/or treatment of transplant rejection
WO2015120223A1 (en) * 2014-02-06 2015-08-13 New York University Method for separating hyaluronan and quantifying its molecular mass distribution in biological samples
KR20180028787A (ko) * 2016-09-09 2018-03-19 삼성전자주식회사 디펙 검사 시스템과 방법, 및 그 검사 방법을 이용한 반도체 소자 제조방법
WO2018165656A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Short-acting heparin-based anticoagulant compounds and methods
JP7285048B2 (ja) * 2017-03-31 2023-06-01 ロート製薬株式会社 ヒアルロン酸オリゴ糖含有組成物の製造方法
US11993627B2 (en) 2017-07-03 2024-05-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Enzymatic synthesis of homogeneous chondroitin sulfate oligosaccharides
CN111601603A (zh) 2017-11-03 2020-08-28 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 具有抗炎活性的硫酸化寡糖
CN112437667B (zh) 2018-06-20 2024-05-28 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 细胞保护方法和组合物
CN109528753B (zh) * 2018-12-20 2021-01-22 四川大学华西医院 寡聚透明质酸或其盐在制备治疗心肌梗死的药物中的用途
CN113876623B (zh) * 2021-09-24 2024-06-14 华熙生物科技股份有限公司 一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途
CN115774066A (zh) * 2022-11-16 2023-03-10 南京乐韬生物科技有限公司 一种分析超低分子量透明质酸组分比例的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09227386A (ja) * 1996-02-16 1997-09-02 Seikagaku Kogyo Co Ltd ストレス蛋白質発現増強剤
JPH11246301A (ja) * 1998-02-27 1999-09-14 Denki Kagaku Kogyo Kk 臓器保存溶液
JPH11310588A (ja) * 1998-04-30 1999-11-09 Maruha Corp 新規な血小板粘着凝集抑制物質、その製造法およびその用途
JP2000103738A (ja) * 1998-09-28 2000-04-11 Maruha Corp 血管内皮細胞増殖促進剤

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4141973A (en) * 1975-10-17 1979-02-27 Biotrics, Inc. Ultrapure hyaluronic acid and the use thereof
JPH06107538A (ja) * 1992-03-31 1994-04-19 Shiseido Co Ltd 角膜移植用眼球保存液
US5902795A (en) * 1992-06-16 1999-05-11 Trustees Of Tufts College Oligosaccharides reactive with hyaluronan-binding protein and their methods of use
US5616568A (en) * 1993-11-30 1997-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Functionalized derivatives of hyaluronic acid
IT1287227B1 (it) * 1996-04-04 1998-08-04 Fidia Spa In Amministrazione S Acido ialuronico quale componente del liquido di conservazione della cornea
ATE302785T1 (de) * 1998-04-30 2005-09-15 Maruha Corp Verbindungen, deren struktur derivate von glukuronsäure und glukosamin enthält, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung
US7511026B2 (en) * 2003-03-25 2009-03-31 Seikagaku Corporation Therapeutic agent for nerve damage

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09227386A (ja) * 1996-02-16 1997-09-02 Seikagaku Kogyo Co Ltd ストレス蛋白質発現増強剤
JPH11246301A (ja) * 1998-02-27 1999-09-14 Denki Kagaku Kogyo Kk 臓器保存溶液
JPH11310588A (ja) * 1998-04-30 1999-11-09 Maruha Corp 新規な血小板粘着凝集抑制物質、その製造法およびその用途
JP2000103738A (ja) * 1998-09-28 2000-04-11 Maruha Corp 血管内皮細胞増殖促進剤

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109517012A (zh) * 2018-11-13 2019-03-26 华熙福瑞达生物医药有限公司 一种高纯度透明质酸寡糖的制备方法
CN109517012B (zh) * 2018-11-13 2020-05-22 华熙生物科技股份有限公司 一种透明质酸寡糖的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1300412A4 (en) 2004-08-18
CA2698561A1 (en) 2002-01-17
ATE453655T1 (de) 2010-01-15
AU2001269478B2 (en) 2006-09-21
CA2698561C (en) 2012-07-10
CA2414211C (en) 2011-08-02
EP1300412B1 (en) 2009-12-30
US20110224169A1 (en) 2011-09-15
US8314079B2 (en) 2012-11-20
AU2006252178B2 (en) 2010-05-27
DE60140941D1 (de) 2010-02-11
JPWO2002004471A1 (ja) 2004-01-15
WO2002004471A1 (fr) 2002-01-17
CA2414211A1 (en) 2003-01-06
US20070134646A1 (en) 2007-06-14
US7601488B2 (en) 2009-10-13
US7507723B2 (en) 2009-03-24
EP1300412A1 (en) 2003-04-09
US20090291914A1 (en) 2009-11-26
US20050090661A1 (en) 2005-04-28
JP4861596B2 (ja) 2012-01-25
US20080182983A1 (en) 2008-07-31
AU6947801A (en) 2002-01-21
CN1440418A (zh) 2003-09-03
AU2006252178A1 (en) 2007-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100369925C (zh) 透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品
Wieruszeski et al. Structure of the monosialyl oligosaccharides derived from salivary gland mucin glycoproteins of the Chinese swiftlet (genus Collocalia). Characterization of novel types of extended core structure, Gal beta (1—3)[GlcNAc beta (1—6)] GalNAc alpha (1—3) GalNAc (-ol), and of chain termination,[Gal alpha (1—4)] 0-1 [Gal beta (1—4)] 2GlcNAc beta (1—.).
Conrad Methylation of Carbohydrates with Methylsulfinyl Anion and Methyl Iodide in Dimethyl Sulfoxide: Methylation of Aerobacter aerogenes A3 (S1) Capsular Polysaccharide and 3-O-α-d-Glucopyranosyluronic acid-d-mannose
Ribeiro et al. A sulfated α-L-fucan from sea cucumber
Rao et al. Sialyl Lewis X mimics derived from a pharmacophore search are selectin inhibitors with anti-inflammatory activity.
Yu et al. Enzymatic preparation and structural determination of oligosaccharides derived from sea cucumber (Acaudina molpadioides) fucoidan
Dua et al. Characterization of the oligosaccharide alditols from ovarian cyst mucin glycoproteins of blood group A using high pressure liquid chromatography (HPLC) and high field 1H NMR spectroscopy.
Ghosh et al. Sulfated xylomannans from the red seaweed Sebdenia polydactyla: structural features, chemical modification and antiviral activity
ITMI962505A1 (it) Nuovi esteri butirrici ad attivita&#39; antiproliferativa e composizioni farmaceutiche che li contengono
Song et al. Structural characterization and anticoagulant activity of two polysaccharides from Patinopecten yessoensis viscera
Moreau et al. Application of high-resolution NMR spectroscopy to the elucidation of the structure of the specific capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 7F
Feng et al. Structural characterization and immunological activities of a novel water-soluble polysaccharide from the fruiting bodies of culinary-medicinal winter mushroom, Flammulina velutipes (Agaricomycetes)
EP2985298A1 (en) Low-molecular-weight glycosaminoglycan derivative containing terminal 2,5-anhydrated talose or derivative thereof
CN104725520A (zh) 一种分心木酸性多糖及其制备和应用
Du Penhoat et al. An NMR solution study of the mega-oligosaccharide, rhamnogalacturonan II
Šimek et al. How the molecular weight affects the in vivo fate of exogenous hyaluronan delivered intravenously: A stable-isotope labelling strategy
Defaye et al. The behavior of cellulose, amylose, and β-D-xylan towards anhydrous hydrogen fluoride
ITCO960031A1 (it) Fucani a basso peso molecolare aventi attivita&#39; anticoagulante antitrombinica e antitrombotica
Wu et al. A heteropolysaccharide from Rhodiola rosea L.: preparation, purification and anti-tumor activities in H22-bearing mice
Chiovitti et al. A nearly idealized 6′-O-methylated η-carrageenan from the Australian red alga Claviclonium ovatum (Acrotylaceae, Gigartinales)
CN101229186A (zh) 透明质酸低聚糖级分及含有该物质的药品
CN109400730A (zh) 一种枸杞多糖、其制备方法及用途
Danishefsky et al. Mucopolysaccharides in animal tumors
CN102603911B (zh) 河蚬糖胺聚糖及其制备方法和用途
Saliternik-Givant et al. Biochemical heterogeneity of the corneal glycosaminoglycans

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080220

Termination date: 20150706

EXPY Termination of patent right or utility model