CN102603911B - 河蚬糖胺聚糖及其制备方法和用途 - Google Patents
河蚬糖胺聚糖及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种河蚬糖胺聚糖的制备方法，包括下列步骤：(1)河蚬预处理；(2)河蚬脱脂；(3)超声波处理；(4)木瓜蛋白酶酶解；(5)TCA沉淀；(6)溶解；(7)离心取上清后，氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀多糖；(8)盐溶去除CPC；(9)乙醇沉淀，干燥；(10)经截留分子量7000Da的透析袋透析后冷冻干燥，得冻干后的河蚬糖胺聚糖粗品。上述河蚬糖胺聚糖粗品经DEAE-Cellulose阴离子交换柱层析，能近一步纯化河蚬糖胺聚糖粗品，从而得河蚬糖胺聚糖的精糖。本发明方法制备而得的河蚬糖胺聚糖能用于抑制胃癌细胞或卵巢癌细胞的生长活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种来源于河蚬的糖胺聚糖及其超声辅助制备方法和用途；属于生物技术天然活性物质提取领域。
背景技术
糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，曾称为黏多糖，为杂多糖的一种，由重复的二糖单位构成的长链多糖，其二糖单位之一是氨基己糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖)，故称糖胺聚糖；另一个是糖醛酸。通常分为4类：(1)透明质酸(HA)、(2)硫酸角质素、(3)硫酸软骨素(CS)和硫酸皮肤素(DS)、(4)肝素(Hep)和硫酸乙酰肝素(HS)。糖胺聚糖是细胞间质的重要组成部分，细胞间质绝大部分都是糖胺聚糖。因此，在自然界中有广泛的分布，在动物界、植物界以及细菌界均有相关报道。
高血压、高血脂、糖尿病、冠心病、恶性肿瘤等所谓现代“文明病”的发病率居高不下，时刻威胁着地球上每一个人的身心健康。研究表明糖胺聚糖具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫等多种活性并且对以上“文明病”有一定的治疗效果，在治疗以上现代病尤其是在抑制恶性肿瘤细胞生长的治疗中效果极其显著。如海参糖胺聚糖可以使肿瘤内毛细血管量减少，出血坏死区变小，癌周淋巴细胞反应明显，癌细胞浸润减轻或无，电镜观察可发现瘤细胞内细胞器减少，线粒体肿胀，粗面内质网扩张和脱颗粒，以及多聚核糖体解聚等，因此，近年来在临床病理及药学领域备受关注。
糖胺聚糖分布广泛，对不同种类的无脊椎动物的综合研究发现，不同的物种同样存在着硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素类似物。之前的研究也表明不同的软体动物都存在着肝素。如Mercenaria mercenaria存在着一类肝素类似物。Anomalocardiabrasiliana，Ti ela mactroides，Tapes phylippinarum中分离到具有抗凝血活性的肝素类似物。此外，从其它的软体动物门中也分离到了DS，CS以及硫酸角质素。
然而，商业上的硫酸软骨素、硫酸角质素及肝素主要是以脊椎动物为原料的。然而近年来发现，以脊椎动物为原料存在着各种各样的问题，如存在病原体污染(疯牛病)及一些地区的宗教限制(猪硫酸角质素)。再者，非动物来源的糖胺聚糖如化学合成、酶解合成及重组体合成不能作为药物被运用。种种原因需要我们去找到新的糖胺聚糖来源。
河蚬是一种淡水贝类，外壳或呈黄绿色、棕黄色，或呈黑褐色。河蚬营养丰富，内脏可同食，故人体很容易吸收河蚬所含有的钙、铁、碘等元素，是高蛋白质低脂肪的食物。据有关专家测定，每100克蚬肉含蛋白质15克，脂肪仅3克，还含有多种维生素、碳水化合物和钙、磷、铁、硒等人体所需的营养物质。有较高的药用价值和食用功效。《本草纲目》称“蚬肉能下湿气，利小便”。现代有关资料也记载河蚬有清热解毒、明目利尿、利湿等功效。适量食用蚬肉可以治疗疔疮肿毒、湿热黄疸、小便不利等症，还能促进产妇乳汁分泌。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种河蚬糖胺聚糖及其制备方法和用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种河蚬糖胺聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)、河蚬预处理：
将新鲜的河蚬冷冻干燥后粉碎，得河蚬粉末；
2)、河蚬脱脂：
将河蚬粉末于2～6℃的丙酮中浸泡20～28h，室温抽滤至干燥，得脱脂后河蚬粉末；
3)、超声波处理：
向脱脂后河蚬粉末中加入醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)，于190～475W的超声功率下超声10～30min，得超声处理液；所述河蚬粉末与醋酸-醋酸钠缓冲液的料液比为：1g/25～35ml；
4)、木瓜蛋白酶酶解：
向超声处理液中加入乙二胺四乙酸(EDTA)和L-半胱氨酸，从而使乙二胺四乙酸(EDTA)和L-半胱氨酸的终浓度均分别为4.8～5.2mM；混匀后升温至55～65℃，再加入木瓜蛋白酶保温水解30～110min(较佳为70～110min)，木瓜蛋白酶是河蚬粉末质量的1.4～1.6％；最后再加入用以沉淀蛋白的三氯乙酸(TCA)至终浓度50g/L；于3～5℃静置20～40min；
5)、沉淀：
将步骤4)所得的酶解液离心，收集上清，向上清中加2.8～3.2体积倍的质量浓度为5％的乙酸钾乙醇溶液，于3～5℃静置10～14小时；
6)、溶解：
将步骤5)所得的溶液离心，所得的沉淀先用无水乙醇洗涤，烘干至恒重后，得干燥后沉淀；在干燥后沉淀中加入摩尔浓度为0.2M的NaCl溶液，所述干燥后沉淀与NaCl溶液的料液比为1g/30～50ml；再次离心，收集上清；
7)、CPC沉淀：
向步骤6)所得的上清中加入质量浓度为5％的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，离心收集沉淀；所述氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液与上述步骤6)中的干燥后沉淀的料液比为1g/0.4～0.6ml；
8)、盐溶：
步骤7)所得的沉淀用2.5M的NaCl溶液溶解，所述NaCl溶液与上述步骤6)中的干燥后沉淀的料液比为1g/8～12ml；
9)、醇沉：
向步骤8)所得的溶液中加入4.5～5.5体积倍的无水乙醇，直至沉淀出现后离心，收集沉淀；
10)、透析：
将步骤9)所得的沉淀加水溶解后，经截留分子量7000Da的透析袋透析后冷冻干燥，得冻干后的河蚬糖胺聚糖粗品。
作为本发明的河蚬糖胺聚糖的制备方法的改进：将冻干后的河蚬糖胺聚糖粗品依次进行以下步骤：
①、DEAE-cellulose DE-52离子交换柱层析：
DEAE-cellulose DE-52层析柱(15cm×5cm)用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)以10ml/min流速平衡体系90min后(柱体积约500ml)，将冻干后的糖胺聚糖粗品5g用8～12ml上述醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)溶解后加入层析柱中，再次用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)平衡体系90min后，用洗液进行均匀洗脱；
洗液为：以NaCl和醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)配制而得；所述NaCl在洗脱液中的线性梯度浓度为0M-1.5M；
②、检测洗脱后所收集的液体中有糖醛酸特有吸收峰(硫酸-咔唑法)和硫酸化糖胺聚糖(二甲基亚甲基蓝法，DMB)特有吸收峰的样品，3体积倍醇沉，沉淀收集透析后，冷冻干燥，得河蚬糖胺聚糖的精糖。
作为本发明的河蚬糖胺聚糖的制备方法的进一步改进：将河蚬糖胺聚糖的精糖进行Sephacryl-300HR柱层析：
将1g河蚬糖胺聚糖的精糖溶于1～2ml，0.2M NaCl溶液后，加入Sephacryl-300HR层析柱中，以醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)为洗液，0.2ml/min流速，收集洗脱液；用硫酸-苯酚法检测收集的洗脱液中糖的特征吸收峰，收集各洗脱峰；得河蚬糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2。注：洗脱液用自动部分收集器收集，一般每管4ml。
本发明还同时公开了利用上述制备方法所得的河蚬糖胺聚糖的用途：用于抑制胃癌细胞或卵巢癌细胞的生长活性。
作为本发明的河蚬糖胺聚糖的用途的改进：胃癌细胞为SGC7901，卵巢癌细胞为A2780或SKOV3。
本发明解决的一个技术问题弥补了现有存在技术中提取率较低，提取时间过长的不足，提出一种新的可作为抑制癌细胞生长的糖胺聚糖，它来源于河蚬，药效好，无毒害及其它不良副作用。
本发明解决的一个技术问题弥补了现有存在技术的不足，提供了一种超声波辅助制备河蚬糖胺聚糖的新方法，以便有效快速地提取河蚬糖胺聚糖，并提高其纯度，平衡河蚬糖胺聚糖得率、制备时间和纯度之间的关系。
本发明提供了一种新的来源于河蚬的糖胺聚糖，并建立了一种有效的制备河蚬糖胺聚糖的方法，在对河蚬组织进行酶解作用之前，结合超声波提取技术，即首先采用超声波处理河蚬组织，再用木瓜蛋白酶酶解，这样大大缩短了酶解时间，增强了酶解的效率。同时为了提高河蚬糖胺聚糖的纯度，本发明综合运用了三氯乙酸去除蛋白质、氯化十六烷基吡啶(CPC)沉淀法和乙醇沉淀法。本发明能够平衡河蚬糖胺聚糖制备效率和纯度的关系，大大缩短了提取时间，提高了纯度。
在本发明中，原料能通过市购的方式获得，新鲜的河蚬冷冻干燥后的蚬干可购自湖州凡人食品公司；木瓜蛋白酶可购自杭州昊天生物公司产品；氯化十六烷基吡啶(CPC)、氯化钠、EDTA、L-半胱氨酸、醋酸钠、无水乙醇、丙酮、三氯乙酸、硫酸、咔唑、二甲基亚甲基蓝可购自国药集团化学试剂有限公司；透析袋7000Da(杭州越欣)；DEAE-Cellulose-DE52(上海索莱宝生物科技有限公司)
本发明所涉及的仪器中Scientz-IID型超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；TSK-GEL G3000SWXL(北京绿百草科技发展有限公司)；恒温水浴锅(国华电器有限公司)；冷冻干燥机(thermo SuperModulyo)；pH剂(TP-311，北京时代新维测控设备股份有限公司)；离心机(Hitachi CP100WX)。
本发明所得的河蚬糖胺聚糖黏性较强，粗糖呈棕黄色，精糖呈现亮白色，如图1所示。最终所得的河蚬糖胺聚糖CFGS-2的分子量在12000Da，单糖组成分析表明该糖胺聚糖含葡萄糖醛酸、葡萄糖等。其纯度检测图如图3所示，其单糖组成分析图如图4所示。其对胃癌细胞(SGC7901)的IC50为0.028mg/ml、卵巢癌细胞(A2780)的IC50为0.364mg/ml、卵巢癌细胞(SKOV3)的IC50为0.157mg/ml。
特别要指出的是，本发明所得的河蚬糖胺聚糖对胃癌细胞(SGC7901)、卵巢癌细胞(A2780/A2780)也具有很好的抑制效果；因此，河蚬糖胺聚糖的发现将对胃癌及卵巢癌细胞抑制药物的开发打开一扇新的大门。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是过Cellulose DE-52柱(A前，B后)河蚬糖胺聚糖(即，A为河蚬糖胺聚糖粗品，B为河蚬糖胺聚糖的精糖)。
图2是河蚬精糖(河蚬糖胺聚糖的精糖)经Sephacryl-300HR柱层析(硫酸-苯酚法检测)。
图3是河蚬糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2的纯度检测(TSK Gel G3000SWxL)；
图4是河蚬糖胺聚糖CFGS-2单糖组成分析：
PMP柱前衍生高效液相色谱法检测河蚬糖胺聚糖CFGS-2的单糖组成，以乳糖为内标；A：不同单糖标准品的PMP衍生；1甘露糖，2氨基葡萄糖，3鼠李糖，4葡萄糖醛酸，5半乳糖醛酸，6乳糖，7氨基半乳糖，8葡萄糖，9半乳糖，10木糖，11阿拉伯糖，12岩藻糖。B：河蚬糖胺聚糖CFGS-2的单糖分析其中还有(2氨基葡萄糖，6乳糖，7氨基半乳糖，8葡萄糖，9半乳糖，12岩藻糖)；各单糖组成的摩尔质量比为：氨基葡萄糖∶乳糖∶氨基半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖∶岩藻糖＝2∶17∶2∶17∶5∶5。
具体实施方式
下面结合具体的实施案例对本发明进一步详细说明
实施例1、一种河蚬糖胺聚糖的制备方法，依次进行以下步骤：
1)、原料预处理：
将新鲜河蚬经-80℃冷冻过夜(12小时)后置于冷冻干燥机-50℃干燥24h，再经粉碎机粉碎后过筛(40目)，得河蚬粉末；
2)、脱脂：
称取1g的河蚬粉末于4℃丙酮中浸泡24h，室温抽滤至干燥(恒重)；得脱脂后河蚬粉末；
3)、超声处理：
向步骤2)所得的脱脂后河蚬粉末中加入醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)30ml(即，物料比W∶V＝1∶30)超声时间30min，功率190W。
4)、酶解：
向步骤3)所得的超声处理液中加入EDTA(乙二胺四乙酸)和L-半胱氨酸，从而使EDTA和L-半胱氨酸的终浓度均分别为5mM；混匀后升温至60℃，再加入15mg木瓜蛋白酶于振荡水浴锅(200rpm)保温水解110min；最后再加入TCA(从而使TCA的终浓度为50g/L)用以沉淀蛋白，于4℃静置30min。
5)、沉淀：
将步骤4)所得的酶解液离心(8000rpm，20min)去除沉淀后收集上清，向上清中加3倍体积的质量浓度为5％的乙酸钾乙醇溶液，4℃过夜静置(即静置12小时)。
6)、溶解：
将步骤5)所得的溶液离心(8000rpm，30min)收集沉淀。用无水乙醇洗涤并于50℃烘箱中烘干(至恒重)沉淀后，得干燥后沉淀。
向干燥后沉淀中加入浓度为0.2M的NaCl溶液(干燥后沉淀与该NaCl溶液的质量/体积＝1g∶40ml)。再次离心(8000rpm，30min)弃去沉淀中不溶解的物质；同时收集上清。
7)、CPC沉淀：
向步骤6)收集的上清中加入质量浓度为5％的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，会出现沉淀，离心(8000rpm，30min)，收集沉淀。
氯化十六烷基吡啶溶液与上述步骤6)中的干燥后沉淀的料液比为1g/0.5ml。
8)、盐溶：
将步骤7)所得的沉淀用2.5M的NaCl溶液溶解，NaCl溶液与上述步骤6)中的干燥后沉淀的料液比为1g/10ml；
9)、醇沉：
向步骤8)所得的溶液中加入5倍体积的无水乙醇，沉淀出现后，离心(10000rpm，30min)，收集沉淀。
10)、透析：
步骤9)所得的沉淀加水溶解(水的用量只需能溶解该沉淀即可，约1ml)后，经透析袋(截留分子量7000Da，扁宽10mm)透析后，得透析溶液。
透析溶液经-80℃冷冻过夜后置于冷冻干燥机于-50℃干燥24h，得冻干后的河蚬糖胺聚糖粗品240mg。
注：提取率以此处的粗糖(河蚬糖胺聚糖粗品)与河蚬干粉(即，步骤2)的河蚬粉末)计算。
改变实施例1的步骤3)中的超声功率(P)、超声时间(UT)、步骤4)中的水解时间(ET)，从而得到不同的案例。具体如表1所示，每个案例所对应的收率也同表1所示。
表1、不同超声频率、时间、不同水解时间对糖胺聚糖得率的影响
注：P：功率，UT(min)：超声时间，ET(min)：酶解时间，V(％)：提取率。
实施例2、制备河蚬糖胺聚糖的精糖：
1)、DEAE-cellulose DE-52离子交换柱层析：
DEAE-cellulose DE-52层析柱(15cm×5cm)用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)以10ml/min流速平衡体系90min后(柱体积约500ml)，将冻干后的糖胺聚糖粗品(上述实施例1所得)5g用10ml醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)溶解后加入上述层析柱中，再次用醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)平衡体系90min(以10ml/min流速)后，用洗液进行均匀洗脱。
洗液是NaCl和醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)配制而得的溶液；NaCl在洗液中的浓度为0M-1.5M的线性梯度(可依靠梯度混合仪自动生成)，洗液的总用量为1000ml。洗液的流速为1ml/min，于分布收集器中每10min收集一管；即，每管10ml，共收集100管。
2)、检测不同收集管的洗脱液中是否有糖醛酸特有吸收峰(硫酸-咔唑法)和硫酸化糖胺聚糖(二甲基亚甲基蓝法，DMB)，具体如下：
a)硫酸-咔唑法：
从收集管中(10ml洗脱液)取0.5ml洗脱液，在冰浴中预冷后逐滴加入0.0125mol/L四硼酸钠硫酸溶液2.5ml。振摇混合，在沸水浴中煮沸5min。以冰浴冷却至室温，加入质量浓度0.125％咔唑无水乙醇溶液0.1ml。摇匀后，在沸水浴中煮沸10min。冷却摇匀后观察颜色变化，如有颜色变化(呈紫红色)，则该收集管中的其余洗脱液需要收集。可在530nm处测定吸收度。
b)、二甲基亚甲基蓝法：
用移液枪从a)步骤收集的洗脱液中(还剩9.5ml洗脱液)取100μl洗脱液加入到比色皿中，沿着比色皿壁加入2.5mL显色剂(称取16mg二甲基亚甲基蓝，3.04g甘氨酸和2.37gNaCl溶于900mL去离子水中，利用浓HCl调整pH至3.00，去离子水定容至1L)，放置4～6min后观察颜色变化。如有颜色变化(呈蓝色)，则收集该收集管中的剩余洗脱液。可在测量520nm处吸光度。
同时满足上述有糖醛酸特有吸收峰和硫酸化糖胺聚糖特有吸收峰的洗脱液进行收集(第15管～第45管的洗脱液同时符合上述2种条件)。将满足上述要求的洗脱液汇总后用3体积倍的乙醇沉淀，沉淀收集透析(截留分子量7000Da，扁宽10mm)后冷冻干燥(-50℃干燥24h)，得河蚬糖胺聚糖的精糖CFGS。
实施例3、Sephacryl-300HR柱层析
将实施例2所得的河蚬糖胺聚糖的精糖CFGS(简称河蚬精糖)1g溶于1ml，0.2M NaCl溶液后，加入Sephacryl-300HR层析柱中，以醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1M，pH6.0)为洗液，以0.2ml/min流速进行洗脱，收集洗脱液(每管4ml)，检测收集的洗脱液中糖的特征吸收峰(硫酸-苯酚法)。硫酸苯酚法：取收集的洗脱液0.5ml于玻璃试管中，加入0.5ml，0.6M苯酚溶液后再加入2.5ml浓硫酸(分析纯，95.5％)，室温放置20分钟以后于490nm测光密度。以水按同样显色操作为空白，横坐标为收集的试管数，纵坐标为光密度值，收集各洗脱峰如图2。所得的河蚬糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2经氨基酸测定仪、PMP柱前衍生高效液相色谱法进行检测，各项性能理化指标如表2和图2～图4所示。
表2、河蚬糖胺聚糖精糖CFGS-2的氨基酸组成
河蚬糖胺聚糖精糖CFGS-2中氨基酸的含量(104.60mg/g)
实验1、将本发明实施例2所得的河蚬糖胺聚糖的精糖CFGS和实施例3所得的河蚬糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2按照四氮唑蓝还原法(MTT法)法进行抗肿瘤细胞活性的测定；所得结果如表3所示。
表3、抗肿瘤细胞活性的对比
FLB：海参糖胺聚糖，TAXOL：泰素(紫杉醇)，SGC7901：胃癌细胞，A2780\SKOV3：卵巢癌细胞。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.河蚬糖胺聚糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、河蚬预处理：
将新鲜的河蚬冷冻干燥后粉碎，得河蚬粉末；
2)、河蚬脱脂：
将河蚬粉末于2～6℃的丙酮中浸泡20～28h，室温抽滤至干燥，得脱脂后河蚬粉末；
3)、超声波处理：
向脱脂后河蚬粉末中加入0.1M、pH6.0的醋酸－醋酸钠缓冲液，于190～475W的超声功率下超声10～30min，得超声处理液；所述河蚬粉末与醋酸－醋酸钠缓冲液的料液比为：1g/25～35ml；
4)、木瓜蛋白酶酶解：
向超声处理液中加入乙二胺四乙酸和L-半胱氨酸，从而使乙二胺四乙酸和L-半胱氨酸的终浓度均分别为4.8～5.2mM；混匀后升温至55～65℃，再加入木瓜蛋白酶保温水解30～110min，所述木瓜蛋白酶是河蚬粉末质量的1.4～1.6％；最后再加入用以沉淀蛋白的三氯乙酸至终浓度50g/L；于3～5℃静置20～40min；
5)、沉淀：
将步骤4)所得的酶解液离心，收集上清，向上清中加2.8～3.2体积倍的质量浓度为5％的乙酸钾乙醇溶液，于3～5℃静置10～14小时；
6)、溶解：
将步骤5)所得的溶液离心，所得的沉淀先用无水乙醇洗涤，烘干至恒重后，得干燥后沉淀；在干燥后沉淀中加入摩尔浓度为0.2M的NaCl溶液，所述干燥后沉淀与NaCl溶液的料液比为1g/30～50ml；再次离心，收集上清；
7)、CPC沉淀：
向步骤6)所得的上清中加入质量浓度为5％的氯化十六烷基吡啶溶液，离心收集沉淀；所述氯化十六烷基吡啶溶液与上述步骤6)中的干燥后沉淀的料液比为1g/0.4～0.6ml；
8)、盐溶：
步骤7)所得的沉淀用2.5M的NaCl溶液溶解，所述NaCl溶液与上述步骤6)中的干燥后沉淀的料液比为1g/8～12ml；
9)、醇沉：
向步骤8)所得的溶液中加入4.5～5.5体积倍的无水乙醇，直至沉淀出现后离心，收集沉淀；
10)、透析：
将步骤9)所得的沉淀加水溶解后，经截留分子量7000Da的透析袋透析后冷冻干燥，得冻干后的河蚬糖胺聚糖粗品。
2.根据权利要求1所述的河蚬糖胺聚糖的制备方法，其特征是：将冻干后的河蚬糖胺聚糖粗品依次进行以下步骤：
①、DEAE-cellulose DE-52离子交换柱层析：
15cm×5cm的DEAE-cellulose DE-52层析柱用0.1M、pH6.0的醋酸－醋酸钠缓冲液以10ml/min流速平衡体系后，将冻干后的糖胺聚糖粗品5g用8～12ml上述0.1M、pH6.0的醋酸－醋酸钠缓冲液溶解后加入层析柱中，再次用0.1M、pH6.0的醋酸－醋酸钠缓冲液平衡体系90min后，用洗液进行均匀洗脱；
所述洗液为：以NaCl和0.1M、pH6.0的醋酸－醋酸钠缓冲液配制而得；所述NaCl在洗脱液中的线性梯度浓度为0M-1.5M；
②、检测洗脱后所收集的液体中有糖醛酸特有吸收峰和硫酸化糖胺聚糖特有吸收峰的样品，3体积倍醇沉，沉淀收集透析后，冷冻干燥，得河蚬糖胺聚糖的精糖。
3.根据权利要求2所述的河蚬糖胺聚糖的制备方法，其特征是：将河蚬糖胺聚糖的精糖进行Sephacryl-300HR柱层析：
将1g河蚬糖胺聚糖的精糖溶于1～2ml,0.2M NaCl溶液后，加入Sephacryl-300HR层析柱中，以0.1M、pH6.0的醋酸－醋酸钠缓冲液为洗液，0.2ml/min流速，收集洗脱液；用硫酸-苯酚法检测收集的洗脱液中糖的特征吸收峰，收集各洗脱峰；得河蚬糖胺聚糖的精糖成分CFGS-2。
4.利用如权利要求2或3所述的制备方法所得的河蚬糖胺聚糖在制备抑制胃癌细胞或卵巢癌细胞生长活性的药物上的应用；所述胃癌细胞为SGC7901，所述卵巢癌细胞为A2780或SKOV3。
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