WO2002004471A1

WO2002004471A1 - Fractions oligosaccharidiques d'acide hyaluronique et medicament les contenant

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Publication number: WO2002004471A1
Application number: PCT/JP2001/005918
Authority: WO
Inventors: Akira Asari; Hitoshi Kurihara; Tomomi Ito; Yuka Miyazaki; Hiroko Yamanokuchi; Akira Tawada; Takahiro Masa; Yuji Matsuzaki
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2001-07-06
Publication date: 2002-01-17
Also published as: AU2006252178A1; US20050090661A1; DE60140941D1; CA2414211A1; US7507723B2; CN1440418A; CA2414211C; AU6947801A; JP4861596B2; EP1300412A1; US20110224169A1; US20090291914A1; US20080182983A1; US8314079B2; ATE453655T1; AU2006252178B2; AU2001269478B2; CA2698561A1; CN100369925C; CA2698561C

Description

ヒアルロン酸オリゴ糖画分およびそれを含む医薬技術分野本発明は、ヒアルロン酸オリゴ糖（以下、「HAオリゴ糖」ともいう）およびその新規な画分に関する。

また本発明は、この HAオリゴ糖を有効成分とする医薬（特に、熱ショック蛋白質発現増強剤、細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、又は細胞 ·組織保護剤（特に、臓器保存剤、潰瘍処置剤、及び肝障害処置剤、 I L - 1 0産生促進剤、又は I L 一 8産生抑制剤の用途に用いられるもの）に関する。背景技術ヒアルロン酸（以下、「HA」ともいう）は、その分子サイズに依存して活性や機能が変化することが知られている。例えば、分子量 1 2 0万の HAには NF- κ Bの不活' 14化作用、血管新生抑制作用等が認められるが [High molecular weight hyaluronic acid inhibits advanced glycation endproduct - induced NF - kappaB activation and cytokine expression. Neumann A, Schinzel R, Palm D, Riederer P， Munch G. FEBS Lett 1999 Jun 25 ;453 (3) : 283-7； Feinberg RN， Beebe DC. Hyaluronate in vasculogenesis. Science 220 : 1177 - 1179, 1983. ]、分子量 5 0 万以下の H Aは、それらとは逆の活性があることが報告されている [Noble PW， McKee CM, し0龍317 M, Shin HS. Hyaluronan fragments activate an NF- kappaB/I-kappaB alpha autoregulatory loop in murine macrophages. J Exp Med 183 : 2373 - 2378， 1996. ； West DC, Shaw DM. Tumour hyaluronan in relation to angiogenesis and metastasis. In : Laurent TC, ed. The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives. London: Port land Press, 1998 :227. ]。

このことは、 HAオリゴ糖についても多彩な活性が見出される可能性や、 HA オリゴ糖のサイズに依存して特異的な活性が見出される可能性を十分に示唆するものといえる。したがって、サイズが異なる H Aオリゴ糖を組み合わせた場合、相加的 ·相乗的効果を発揮する場合もありうるし、逆に、あるサイズの HAオリゴ糖の活性に対して、別のサイズの HAオリゴ糖がアンタゴニストとして作用することも考えられる。

そうすると、まず HAオリゴ糖の医薬開発に向けた活性探索の段階において種々のサイズの HAオリゴ糖が混在している画分を用いていたのでは、どのサイズの HAオリゴ糖が活性本体なのか見出せないばかりカあるサイズの HAオリゴ糖の活性が別のサイズの H Aオリゴ糖によって打ち消されてしまう可能性もあり、 HAオリゴ糖に秘められた重要な生理活性や機能を見逃してしまう可能性がめる。

また、ある特定のサイズの HAオリゴ糖を医薬として用いる場合にも、その H Aオリゴ糖が発揮する機能を妨げるような他のサイズのォリゴ糖を可及的に排除することが必要であり、また、医薬として望ましくない物質を実質的に含有しない、純度が高い画分が求められる。

以上の通り、新規な医薬の創製や提供にあたり、実質的に単一のサイズの H A オリゴ糖からなり、他のサイズの HAオリゴ糖やその他の不純物を実質的に含有しない高純度の H Aオリゴ糖画分が求められていた。

一方、熱ショック蛋白質 (以下、 H s pともいう）はストレス蛋白質とも呼ばれ、種々のストレス反応によって生じる障害を防御する蛋白質であり、種々のフアミリーが知られている。その中の 1つである H s p 7 0フアミリーの熱ショック蛋白質は、熱ショック、過酸化水素、重金属、アミノ酸アナログ、グルコース飢餓などの環境ストレスを生じさせる因子や、発熱、炎症、虚血、ウィルス感染、代謝疾患、心肥大症、酸化的ストレス、細胞組織障害、癌遺伝子や発癌物質などのストレス因子によって生じる蛋白質の構造変化、異常蛋白質の産生などを抑制したり、蛋白質の機能を再生するなどの働きによって、細胞障害や細胞死を防止すると考えられている。

これに関連して、特開平 9一 2 2 7 3 8 6号公報には、 HAを有効成分とするストレス蛋白質発現増強剤が開示されている。同公報には、その活性成分として 2〜2 0糖程度の H Aが好ましい旨（第 3頁）、 1 0糖以下の HAがストレス蛋白質の発現の増強あるいは誘導に関与していることが示唆される旨 (第 6頁)が記載されている。さらに HA不飽和二糖が、ストレス蛋白質の発現を増強し、細胞死を抑制することを示す実験も記載されている（実施例 2 )。

し力し、本発明のような各種オリゴ糖についての具体的な開示はなく、また後述する HA 4糖に特異的に見られる極めて顕著なストレス蛋白質発現増強についても何等開示あるいは示唆されていない。

また、前記のストレス蛋白質の機能からすると、ストレス蛋白質は細胞 ·組織の保護にも関与していると考えられる。

これに関連しては、特開平 1 1一 2 4 6 3 0 1号公報には、 H A及び/又はその生理学的に許容される塩を含有してなる移植向けの臓器保存溶液が記載されている。同公報には、 HAの平均分子量は 1 0万以上であることが好ましい旨記載されているが、 HAオリゴ糖、およびこれが発揮する優れた効果については記載もないし示唆もない。発明の開示

本発明は、 4糖〜 6 0糖程度のサイズを有する HAオリゴ糖、特に、実質的に単一のサイズの H Aオリゴ糖からなり、他のサイズの H Aオリゴ糖やその他の不純物を実質的に含有しない画分を提供することを目的とする。

また本発明は、このような HAオリゴ糖を有効成分とする有用な医薬、特に、より効果が高い H s p発現増強剤、細胞死抑制剤及び細胞障害抑制剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、優れた細胞 ·組織保護剤を提供し、これを利用した臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝疾患処置剤、 I L - 1 0産生促進剤および I L一 8産生抑制剤を提供することを目的とする。本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 4糖〜 60糖から選択される H Aオリゴ糖、及びこれらオリゴ糖の混合物を特定の方法で分離分画することにより、実質的に目的サイズのオリゴ糖のみからなり、他のサイズのオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しない新規な画分を取得するに至った。すなわち本発明は、 4糠〜 60糖から選択されるサイズを有する HAオリゴ糖 (以下、'「本発明オリゴ糖」ともいう）を提供する。

また本発明は、本発明オリゴ糖を含有し、かつ、下記 (1) 〜（6) に示す理化学的性質を有することを特徴とする画分（以下、「本発明画分」ともいう）を提供する。

(1) 当該画分を、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて以下の（a)および (b)に記載した検出方法により分析すると、レ、ずれの方法によっても実質的に単一なピークを示し、かつ当該ピークの面積が以下の（a)および（b)に示す通りとなる。

(a) 210 nmの吸収で検出した場合、画分中の全 H Aオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 85 %以上である。

(b)示差屈折計で検出した場合、画分中の全 HAオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 98 %以上である。

(2) 当該画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて 21 Onmの吸収で検出して分析すると、実質的に単一なピークを示し、かつ、画分中の全ヒアル口ン酸オリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 90%以上である。

(3) 当該画分を蛍光標識した後、これを電気泳動によって分析すると、単一なバンドを示し、かつ、他のサイズの HAオリゴ糖のバンドが検出されない。

(4) 当該画分を構成する H Aオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は平均分子量の理論値を 1とした場合、当該画分の質量分析による実測値が 0. 997〜 1. 003 (相対値）である。

(5) 当該画分を構成する HAオリゴ糖における炭素（C)、水素（H) および窒素（N) のそれぞれの含量比の理論値（重量％) と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量⁰ /。）との差が、いずれも土 1 (重量％) である。

( 6 ) タンパク質、 D NAおよびエンドトキシンを実質的に含有しない。

本発明画分はさらに、下記（7 ) に示す理化学的性質を有することが好ましい

( 7 ) 当該画分の¹ H— NMRおよび^{1 3} C— NMR測定の結果が、下記式（1 ) で示される HAオリゴ糖の構造と矛盾しない。

式（1 )

(式中、 nは 1〜2 9の整数であり、 Mはプロトン又は 1価のカチオンを示し、 A cはァセチル基を示す。）

本発明画分に含まれる H Aオリゴ糖のサイズは 4糖〜 2 0糖から選択されることが好ましく、 4糖〜 1 6糖から選択されることがより好ましく、 4糖〜 1 4糖から選択されることがさらに好ましく、 4糖であることが特に好ましい。

また本発明者らは、本発明オリゴ糖の医薬としての可能性を探索した結果、所定サイズの H Aオリゴ糖が、極めて顕著な H s pの発現増強作用、細胞死抑制作用及び細胞障害抑制作用を有することを見出し、これにより上記課題を角军決しうる H s p発現増強剤、細胞死抑制剤及び細胞障害抑制剤を提供するに至った。さらに本発明者らは、本発明オリゴ糖が優れた細胞 ·組織保護作用を発揮することを見出して細胞 ·組織保護剤を提供するに至り、さらにこれを用いた臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、 I L一 1 0産生促進剤および I L一 8産生抑制剤を提供するに至った。

すなわち本発明は、本発明オリゴ糠を有効成分とする医薬（医薬組成物、以下、「本発明医薬」ともいう）を提供する。この医薬は、 H s p発現増強剤、細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、又は細胞 ·組織保護剤であることが好ましい。また細胞 ·組織保護剤は、臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、 I L— 1 0産生促進剤、又は I L一 8産生抑制剤としての用途に使用されることが好ましい。

本発明医薬及びこれらの剤は、 4糖〜 2 0糖のサイズから選択される H Aオリゴ糖を有効成分とすることが好ましく、 4糖〜 1 6糖のサイズから選択される H Aオリゴ糖を有効成分とすることがより好ましく、 4糖〜 1 4糖のサイズから選択されることがさらに好ましく、 HA 4糖を有効成分とすることが特に好ましい。上記の通り、 HAオリゴ糖の生理活性'機能についての報告はこれまでにも存在した。しかし、分子サイズ ·分子構造 ·純度（他の分子サイズの混入度合い、蛋白質、 D N Aなど他の成分の混入度合い、エンドトキシン含有量）等、多角的に保証された HAオリゴ糖を使用している例は、これまでに認められておらず、すなわち、これまでの HAオリゴ糖の生理活性 '機能の報告においては、混入物の影響が否定されていなかったものである。これに対し、本発明においては、蛋白質、 DNAなど他の成分が実質的に含まれていない HAオリゴ糖、さらにはそのような HAオリゴ糖であってかつ実質的に他の分子サイズを含まない特定のサィズの H Aオリゴ糖の画分を取得し、それらの生理活性 ·機能を明らかにしたものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

く 1〉本発明オリゴ糖

本発明オリゴ糖は、 4糖〜 6 0糖から選択されるサイズを有する H Aオリゴ糖である。

ここで「HAオリゴ糖」とは、 HAの構成二糖組成と同様の組成からなるオリゴ糖である。具体的には H Aの構成単糖であるダルク口ン酸 (GlcA)と N—ァセチルダルコサミン (GlcNAc)とが交互にグリコシド結合しているオリゴ糖を意味する。すなわち、前記の式 '（1 ) で示される構造で代表される非還元末端がダルク口ン酸であるオリゴ糖の他、非還元末端が N—ァセチルダルコサミンであるオリゴ糖も H Aオリゴ糖に包含される。

非還元末端に位置する糖は、飽和糖 (単糖中の炭素 ·炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖 (単糖中の炭素 ·炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよレ、。なお、以下の説明において、 GlcA は飽和グルクロン酸を、 A GlcA は不飽和ダルク口ン酸を示すものとする。

なかでも非還元末端に位置する糖が飽和糖であるものが好ましく、具体的には下記式 (2)で示される H Aオリゴ糖が好ましい。

GlcA (-GlcNAc-GlcA) n-GlcNAc (2)

(式中、 GlcAはダルク口ン酸残基を、 GlcNAcは N-ァセチルグルコサミン残基を、 -はグリコシド結合を、 nは 1〜 2 9の整数を示す。 )

上記式 (2)の GlcA- GlcNAcにおけるグリコシド結合は β 1→3結合であることが好ましく、 GlcNAc- GlcAにおけるグリコシド結合は β 1→4結合であることが好ましい。

そのなかでも、下記式（1 ) で示される ΗΑオリゴ糖が特に好ましい。

式 ( 1 )

(式中、 ηは 1〜2 9の整数であり、 Μはプロトン又は 1価のカチオンを示し、 A cはァセチル基を示す。）

ただし、後述の実施例に示すように非還元末端に位置する糖が不飽和糖であるものも有意な生理活性を示すものであり、それらも本発明の好ましレ、態様である。具体的な一例としては下記式で示される HAオリゴ糖が挙げられる。

(式中、 A cはァセチル基を示す。）

上記式で示される非還元末端に不飽和糠を有する H Aオリゴ糖は後記実施例で使用した Δ ΗΑ 4に相当する。

また、本発明オリゴ糖は塩の形態であってもよく、電離した状態であってもよい。塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、力リウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモ-ゥム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロ八キシルァミン塩、アミノ酸塩、ガラクトサミン塩、ダルコサミン塩等の有機塩基との塩が例示される。なかでもアルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。

本発明オリゴ糖の由来は特に限定されない。例えば、鶏冠、臍帯、豚皮、牛皮、魚類その他の動物の皮、大動脈等や、 H Aを産生する微生物等から分離、精製された HAを分解処理（例えば酵素分解、化学分解、加熱処理、超音波処理等）する工程を経て製造されるものであってもよい。また、合成（例えばィヒ学合成ゃ酵素合成）の工程を経て製造されるものであってもよい。

酵素分解法としては、ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ (Streptomyces 由来）、ヒアルロニダーゼ S D、コンドロイチナ一ゼ A C I、コンドロイチナーゼ A C III、コンドロイチナーゼ A B C、エンドグルクロニダ一ゼ（ヒル由来）などの HAを分解する酵素を HAに作用させる方法が挙げられる (新生化学実験講座「糖質 IIープ口テオダリカンとグリコサミノグリカン一」 P244-248, 1991 年発行、東京化学同人参照）。上記式（1 ) の HAオリゴ糖を得るためには、 H Aを分解する酵素として加水分解酵素を用いることが好ましレ、。化学分解法としては、アル力リ分解法やジメチルスルホキシド法（DM S O、法）等が挙げられる。アルカリ分解法は、具体的には、例えば HAの溶液に 1 N程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和することにより行うことができる。 D M S O法としては Nagasawa らの方法（Carbohyd. Res. , 141, p99- 110， 1985) が挙げられる。また、塩酸や硫酸等の酸によって加水分解することもできる。超音波処理法としては Biochem.， 33, p6503-6507 (1994)等に記載された方法が挙げられる。

合成による製造方法としては Glycoconjugate J. , p453~439 (1993)、国際公開 W093/20827等に記載された方法が挙げられる。

このようにして製造された本発明オリゴ糖は、所望の純度に精製することができる。例えば以下に説明するように、実質的に単一のサイズの本発明オリゴ糠からなり、他のサイズの HAオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しない程度にまで精製することもできる。

< 2 >本発明画分

本発明画分は、本発明オリゴ糖を含有する画分であって、後述する特定の理ィ匕学的性質を有するものである。

前記く 1〉に記載の方法によって本発明オリゴ糖 (本発明オリゴ糖を含む画分。「本発明画分」とは異なる。）が得られるが、得られた画分には複数のサイズの HAオリゴ糖が混在している。一方本発明画分は、実質的に単一のサイズの HA オリゴ糖からなり、他のサイズの H Aオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しない画分である。本発明画分は以下の方法によって製造することができる。

前記く 1〉に記載の方法によって得られる画分（種々のサイズのオリゴ糖が混在する画分）を、強塩基性陰イオン交換体のカラムにアプライする。強塩基性陰イオン交換体としては、トリメチルアンモニゥム基、トリメチルアンモ-オメチル基、 —ヒドロキシェチルジメチルアンモニゥム基、 2—ヒドロキシプロピノレアミノ基、ジェチルー ( 2—ヒドロキシプロピル) アミノエチル基、ジメチルェタノールァンモニゥム基等を有する陰ィオン交換体が例示されるが、トリメチルアンモ-オメチノレ基を有する陰イオン交換体が好ましい。

カラムのサイズはアプライする量等に応じて適宜設定できる、小スケールの調製の際にはカラム直径 1〜5 cm、カラム長 5 0〜 1 5 0 cm程度が好ましい。また、このようなカラムを 2本以上組み合わせることが好ましい。

複数のサイズの H Aオリゴ糖が混在する画分をこのようなカラムにアプライすると、画分中に含まれる HAオリゴ糖がカラム中の強塩基性陰イオン交換体にィオン結合する。

結合した HAオリゴ糖は、塩の濃度勾配によって溶出することができる。溶出に用いる塩は特に限定されず、 NaC l、 KC 1、 L i C 1等を用いることができるが、 Na C 1を用いることが好ましい。

また塩の濃度勾配は、塩濃度 0〜0. 1M程度から開始し、 0. 5 M程度まで上昇させることが好ましい。また塩濃度勾配は直線であることが好ましく、好ましくは 0. 1MZ40〜50時間、より好ましくは 0. 1Μ/45〜50時間程度で塩濃度を上昇させる。 '

また流速は好ましくは 80〜 100ml Z時間、より好ましくは 85〜 95m 1/時間程度とする。

このようなクロマトグラフィ一条件を選択することにより、強塩基性陰ィオン交換体にイオン結合した H Aオリゴ糖が、そのサイズの小さいものから順番に溶出する。このことから、 H Aオリゴ糖の強塩基性陰イオン交換体への結合力は H Aオリゴ糖のサイズにほぼ比例していると考えられ、その結果、塩の濃度勾配を負荷することによって結合力が弱いオリゴ糖（サイズの小さいオリゴ糖）から順番に溶出されるものと考えられる。本発明画分は、このような強塩基性陰イオン交換体と HAオリゴ糖との結合 ·溶出特性を利用することによって初めて提供されたものである。この方法によれば、高い分離能で、かつ 1回のカラム操作により各種サイズの H Aオリゴ糖を簡便に分離することができ、実質的に単一のサイズの H Aオリゴ糖からなり、他のサイズの H Aオリゴ糖やその他の不純物を実質的に含有しない高純度の HAオリゴ糖画分（本発明画分）を効率よく製造することができる。

本発明画分に含まれる H Aオリゴ糖は、 4糖〜 20糖のサイズから選択されることが好ましく、 4糖〜 16糖のサイズから選択されることがより好ましく、 4 糖〜 14糖のサイズから選択されることがさらに好ましく、 4糖であることが特に好ましい。

このようにして得られた本発明画分は、再度上記のクロマトグラフィーのステップに付してもよレ、。また、濃縮、脱塩、その他の処理に付してもよい。本発明画分の保存 ·流通形態等は特に限定されず、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態のレ、ずれの状態であってもよい。

また、本発明画分中の HAオリゴ糖は塩の形態であってもよく、電離した状態であってもよい。塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニゥム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロへキシルァミン塩、アミノ酸塩、ガラクトサミン塩、ダルコサミン塩等の有機塩基との塩が例示される。なかでもアル力リ金属塩が好ましく、特にナトリゥム塩が好ましい。本発明画分を後述の本発明医薬に用いる場合には、これらの塩のうち薬学的に許容される塩を用いることができる。この場合もナトリゥム塩であることが特に好ましい。

このようにして得られる本発明画分は、下記（1 ) 〜（6 ) に示す理化学的性質を全て満たしていることを特徴とする。なお、以下の理化学的性質に示された数値等は、試験や実験の条件、環境、使用機器、試験者の熟練度、その他の要因等によって多少変化しうるものである。従って当該数値は、その数値に厳密に限定されるものではなく、実験条件等による多少の測定結果の違い（当業者に常識的な範囲での数値の相違；当業者が同一の画分であると認識可能な程度の数値の相違）が存することを考慮して解釈すべきものである。

( 1 ) ゲル濾過ク口マトグラフィーを用いて以下の（a)および (b)に記載した検出方法により分析すると、レ、ずれの方法によっても実質的に単一なピークを示し、かつ当該ピークの面積が以下の（ a )および（ b )に示す通りとなる。

( a ) 2 1 0 n mの吸収で検出した場合、画分中の全 H Aオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 8 5 %以上である。この相対面積は、 9 0 %以上であるものが好ましく、 9 5 %以上であるものがより好ましレ、。

( b )示差屈折計（以下、「R I」と略すこともある。）で検出した場合、画分中の全 H Aオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 9 8 %以上である。

この理化学的性質は、この画分が実質的に単一のサイズの H Aォリゴ糖分子から構成されていることを示すものである。また、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものである。

なお、本明細書において「実質的に単一」とは、 '「完全に単一」の意ではなく、「当業者において単一であると認識される」ことを意味するものである。例えば、一般に、大きいサイズのオリゴ糖においては他のサイズのオリゴ糖を全く含まない画分とすることは困難であり、このことは当技術分野の常識であるといえる。よって、サイズの大きいオリゴ糖画分のクロマトグラフィ一分析や質量分析等において、当該オリゴ糖に由来する主要なピークの他に、他のサイズのオリゴ糖に由来する小さなピークが存在したとしても、オリゴ糖のサイズを勘案すると、実質的に単一のピークであると認識されるのが通常である。従って、このような場合には「実質的に単一なピーク」ということができる。

( 2 ) 当該画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて 2 1 O n mの吸収で検出して分析すると、実質的に単一なピークを示し、力つ、画分中の全ヒアル口ン酸オリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 9 0 %以上である。この相対面積は、 9 5 %以上であるものが好ましい。

この理ィ匕学的性質は、この画分が実質的に単一の電荷を有する H Aオリゴ糖分子から構成されていること、すなわち均質な HAオリゴ糖から構成されていることを示すものである。また、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものである。

なお、例えば式（1 ) に示す通り、 H Aオリゴ糖分子中には規則的にカルボキシル基が存在しており、この基は溶液中で電離して- C00—イオンとなる。従って、一定サイズの HAオリゴ糖分子中に含まれている- C00—イオンの数は一定であるといえる。従って、画分を構成する H Aオリゴ糖の電荷が実質的に単一であるということは、実質的に単一のサイズの HAオリゴ糖から構成されていることをも示している。

( 3 ) 当該画分を蛍光標識した後、これを電気泳動によって分析すると、単一なノンドを示し、かつ、他のサイズの HAオリゴ糖のバンドが検出されない。

このことは、クロマトグラフィ一以外の手法（電気泳動法）による分析によつても、この画分が実質的に単一のサイズの HAオリゴ糖分子から構成されていることが明らかにされることを示すものであ、クロマトグラフィーによる分析の結果を支持するものである。また、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものでもある。

( 4 ) 当該画分を構成する H Aオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は β分子量の理論値を 1とした場合、当該画分の質量分析による実測値がいずれも 0 . 9 9 7〜； I . 0 0 3 (相対値）である。なお、この相対値は、 0 . 9 9 8〜 1 . 0 0 2の範囲にあることが好ましく、 0. 9 9 9〜ュ. 0 0 1の範囲にあることがより好ましい。

このことは、画分を構成する Η Αオリゴ糖が、分子量（質量）的にも実質的に単一であり、かつ、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものでもある。

( 5 ) 当該画分を構成する HAオリゴ糖における炭素（C )、水素（H) および窒素（N) のそれぞれの含量比の理論値（重量％) と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量⁰ /₀) との差が、いずれも士 1 (重量％) である。

また、 H Aオリゴ糖がナトリゥム塩である場合には、さらにナトリウム（N a ) についても同様に ± 1 (重量⁰ /₀) であることが好ましい。

このことは、画分を構成する H Aオリゴ糖が、元素組成的にも実質的に単一であり、かつ、他の不純物を実質的に含有しないことを示唆するものでもある。

本発明画分中のタンパク質の含有量は、当業者に周知慣用のタンパク質の測定法を用いて測定することができるが、ローリー法が好ましい。この方法によってタンパク質が検出できない場合（検出限界以下の場合）には、タンパク質を実質的に含有しないと判断される。

本発明画分中の D N Aの含有量は、当業者に周知' I貧用の D NAの測定法を用いて測定することができるが、スレッシュホールド法が好ましい。この方法によつて D NAが検出できない場合（検出限界以下の場合）には、 D NAを実質的に含有しないと判断される。

本発明画分中のェンドトキシンの含有量は、当業者に周知慣用のェンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カプトガニ ·ァメボサイト ·ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。この方法によってエンドトキシンが検出できない場合（検出限界以下の場合）には、エンドトキシンを実質的に含有しないと判断される。

なお、本明細書において「実質的に含有しない」とは、不純物等が「1分子たりとも含まれていない」という意味ではなく、不純物が含まれていないと当業者に認識される程度（上記検出方法によっても検出できない程度）を意味するものである。仮に将来分析技術が進歩して分子単位での検出が可能となったとしても、この「実質的に含有しない」は、本願の記載内容等に基づいて解釈すべきものである。

さらに本発明画分の好ましい態様の一つにおいては、含まれる実質的に単一のサイズの HAオリゴ糖が、非還元末端に飽和ダルクロン酸を有するものであり、その場合本発明画分はさらに下記（7 ) の性質を有する。

( 7 ) 当該画分の¹ H— NMRおよび^{1 3} C— NMR測定の結果が、下記式（1 ) で示される HAオリゴ糖の構造と矛盾しない。式（

このことは、画分を構成する H Aオリゴ糖が、上記式で示される HAオリゴ糖であって、分子構造的にも実質的に単一であり、かつ、他の不純物を実質的に含有しないことをも示唆するものである。

く 3〉本発明医薬

本発明医薬は、本発明オリゴ糖を有効成分とする医薬である。

本発明医薬の有効成分として用いる本発明オリゴ糖や、その好ましい態様等は、前記く 1 >に記載した通りである。

なかでも、本発明オリゴ糖として 4糖〜 2 0糖から選択されるサイズのもの（H A 4糖〜 HA 2 0糖）を用いることが好ましく、前記式（2 ) における nが 1〜 9の整数から選択されるものを用いることがより好ましく、前記式（1 ) における nが 1〜 9の整数から選択されるものを用いることが特に好ましい

より好ましくは、 4糖〜 1 6糖から選択されるサイズの本発明オリゴ糖（HA 4糖〜 HA 1 6糖）を用いることが好ましく、前記式（2 ) における nが 1〜7 の整数から選択されるものを用いることがより好ましく、前記式（1 ) における n力 S 1〜 7の整数から選択されるものを用いることが特に好ましい。

さらに好ましくは、 4糖〜 1 4糖から選択されるサイズの本発明オリゴ糖 (H A 4糖〜 HA 1 4糖）を用いることが好ましく、前記式 ( 2 ) における nが 1〜 6の整数から選択されるものを用いることがより好ましく、前記式（1 ) における nが 1〜 6の整数から選択されるものを用いることが特に好ましい。

なかでも本発明オリゴ糖として 4糖のもの（HA 4糖）を用いることが好ましく、前記式（2 )における nが 1のものを用いることがより好ましく、前記式（ 1 ) における nが 1のものを用いることが特に好ましい。 HA 4糠を用いることにより、種々の優れた薬理作用を発揮させることができる。

なお、前記式（1 ) および（2 ) は、非還元末端に飽和グルクロン酸を有する本発明オリゴ糖を示すが、本発明医薬の具体的用途によっては、非還元末端に不飽和グルクロン酸を有する本発明オリゴ糖であってもよく、その場合の好ましいサイズも上記と同様である。

さらに好ましくは、本発明医薬の有効成分として本発明画分を用いる。製剤化に用いる本発明画分おょぴその好ましい態様は、前記く 2〉に記載した通りである。また、本発明画分に含有される HAオリゴ糖の好ましいサイズについても、前記と同様である。

本発明画分を用いることにより、本発明医薬中の HAオリゴ糖の含有率を高めることができ、また医薬として混入が許されない物質を実質的に含有しない本発明医薬を製造することができる。

本発明医薬は公知の方法により製剤化することができる。製剤化にあたり、本発明医薬の有効成分である HAオリゴ糖に悪影響を与えず、かつ本発明医薬の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、 pH調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。なお、本発明医薬は、有効成分として本発明画分を含むことが好ましいが、 4 糖〜 6 0糖から選択されるサイズを有する HAオリゴ糖を有効成分とすることから、少なくともこのような HAオリゴ糖が有効量含有されていればよく、本発明医薬の効果に影響を与えない限りにおいては、他の分子サイズの H Aオリゴ糖や、オリゴ糖の域を超えるサイズの HAを含んでいても差し支えない。

本発明医薬は、 H s pの発現増強用途、細胞死抑制用途、細胞障害抑制用途、又は細胞 ·組織保護用途の医薬であることが好ましく、これらの用途に応じて以下のような剤とすることができる。

[1] H s p発現増強剤

本明細書における「発現増強」という用語は、「発現量の増加」及び「活性の増強」の双方の意味を包含する。したがって、本明細書における「熱ショック蛋白質発現増強剤」（H s p発現増強剤）という用語は、「熱ショック蛋白質（H s p ) の発現量を増加させる剤」及び「H s pの活性を増強させる剤」の双方の意味を包含する。

(D H s 発現増強剤の投与方法 ·剤形等

本発明医薬を H s p発現増強剤とする場合、 HAオリゴ糖のうち 4糖のものを用いることが極めて好ましい。これによつて、極めて優れた H s p発現増強作用が発揮される。 H s p発現増強剤の投与方法は、 HAオリゴ糖による H s p発現増強効果が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射（静脈內、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等が挙げられる。また、このような投与方法に応じて適宜剤形を選択することができ、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等)、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等を採用することができる。

H s p発現増強剤中の HAオリゴ糖（特に HA 4糖）の含量も特に限定されないが、例えば、 H s p発現増強剤を注射剤として提供する場合には、 0 . ；！〜 1 0 % (w/v)程度とするのが好ましい。

例えば、 H s p発現増強剤を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれであってもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填 ·密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。

前記の通り、 H s p発現増強剤の有効成分としては特に H A 4糖が好ましいが、さらに他の分子サイズの H Aオリゴ糖を含んでいても差し支えない。しかし後述の実施例からも明らかな通り、 H A 4糖が特異的に極めて顕著な H s p発現増強作用を示すことから、 H s p発現増強剤中の HA 4糖の含有率を上げればそれだけ高い効果を得ることができ、また他の分子サイズの H Aオリゴ糖と同一の効果を維持しつつ投与量を減少させることができる。従って、 H s p発現増強剤中の HAオリゴ糖は実質的に 4糖のみからなるものが特に好ましく、 H A 4糖以外の HAオリゴ糖は添加しないことが望ましい。

(2) H s 発現増強剤の投与対象等

H s p発現増強剤は、細胞の障害又は細胞死などに起因する疾患において、 H s pによる防御作用が示唆される多くの疾患、例えば心臓疾患（心筋梗塞など）、尿細管障害、循環器疾患、脳疾患 (脳卒中など)、神経疾患などの血管狭窄ゃ虚血による虚血性疾患、後天性免疫不全症候群、免疫抑制剤ゃ抗瘙剤の投与による胸腺細胞の障害、末梢 T細胞の減少、免疫不全症等の免疫関連疾患、肝炎、潰瘍性大腸炎などの炎症、外傷、細菌感染症、ウィルス感染症、アルツハイマー病、糖尿病、肥大症、川崎病、精神分裂病、発熱、代謝疾患、癌などへの効果が期待される。

また細胞の障害又は細胞死などに起因する疾患のみならず、 H s pによる細胞 ·組織保護作用が期待される対象に対しても H s p発現増強剤を適用することができる。この点については、後述する「細胞 ·組織保護剤」において詳述する。

H s p発現増強剤が投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。 H s p発現増強剤はこれら疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、症状の改善または治療等を目的として投与することができるが、予防薬として投与されることが好ましい。

H s p発現増強剤における HAオリゴ糖、特に HA 4糖の配合量、 1回あたりの投与量、投与間隔等は、増強剤の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、 HA 4糖の臨床投与量として成人 1人 1回当り 3 0 0〜 7 5 0 O mg が例示される。また H s p発現増強剤の投与間隔は、 1日 1回程度でもよく、 1日 2〜3回に分けてもよい。

H s p発現増強剤は、ストレス蛋白発現増強作用に関する実験用の試験試薬としても使用することができる。

[2]細胞死抑制剤

細胞死抑制剤は、 H s pの発現増強作用を利用した用途の 1つである。すなわち、 HAオリゴ糖（特に HA 4糖）は、 H s pの発現増強作用に止まらず、実際に細胞死抑制作用をも発揮することから、これを細胞死抑制の目的に応用したものである。

この細胞死抑制剤を適用することができる疾患は、 H s pの努現増強によって細胞死が抑制できる疾患である限りにおいて特に限定されないが、 H s p発現増強剤の説明において例示した疾患が好ましい。

この細胞死抑制剤が投与される動物、投与の目的、 HAオリゴ糖（特に HA 4 糖）の配合量、投与量、投与間隔等については、 H s p発現増強剤と同様である。 [3]細胞障害抑制剤

細胞障害抑制剤は、 HAオリゴ糖（特に HA 4糖）が H s pの発現増強作用に止まらず、実際に細胞障害抑制作用をも発揮することから、これを細胞障害抑制の目的に応用したものである。

この細胞障害抑制剤を適用することができる疾患は、 H s の発現増強によつて細胞障害が抑制できる疾患である限りにおいて特に限定されないが、 H s p発現増強剤の説明において例示した疾患が好ましい。

この細胞障害抑制剤が投与される動物、投与の目的、 HAオリゴ糖（特に HA 4糖）の配合量、投与量、投与間隔等については、 H s p発現増強剤と同様である。

[4]細胞.組織保護剤

細胞 '組織保護剤は、 HAオリゴ糖（特に HA 4糖）が H s pの発現増強作用に止まらず、実際に細胞，組織保護作用をも発揮することから、これを細胞 '組織保護の目的に応用したものである。

この細胞 ·組織保護剤は、 H s pによる細胞 ·組織保護作用が期待される対象に適用することができる。例えば、細胞 ·組織の保護が求められる疾患等、あるいは生体外に摘出された細胞 ·組織の保護等に用いることができる。

細胞あるいは組織の保護が求められる疾患としては、消化性潰瘍（胃 ·十二指腸潰瘍等)、胃炎、肝障害（肝炎等)、潰瘍性大腸炎、虚血性心疾患、心筋症、脳卒中、脳梗塞等が挙げられる。

この細胞 ·組織保護剤は、具体的には以下の剤として使用されることが好ましい。

(1)潰瘍処置剤 .肝障害処置剤

前記の細胞 ·組織保護剤を、潰瘍処置のための剤とすることで潰瘍処置剤とすることができ、肝障害処置のための剤とすることで肝障害処置剤とすることができる。なお、本発明にいう「処置」とは該当する疾患の予防、維持 (悪化防止)、軽減 (症状の改善)及ぴ治療を目的として該疾患を有する動物に投与することをいい、「処置剤」とはそのような処置に用いられる薬剤をいう。 (2) I L— 1 0産生促進剤 · I L一 8産生抑制剤

前記の細胞 ·組織保護剤は、 I L一 1 0の減少に起因する疾患や、 I L一 1 0 の産生促進が求められる疾患等の処置にも用いることができる。この細胞 ·組織保護剤を I L一 1 0の産生促進のための剤とすることにより、 I L一 1 0産生促進剤とすることができる。

また、この細胞 ·組織保護剤は、 I L一 8の増加に起因する疾患や、 I L _ 8 の産生抑制が求められる疾患等の処置にも用いることができる。この細胞 ·組織保護剤を I L一 8の産生抑制のための剤とすることにより、 I L一 8産生抑制剤とすることができる。

このような剤の投与対象となる動物や、投与の目的等については、 H s p発現増強剤における説明と同様である。

(3)臓器保存剤

前記の細胞 ·組織保護剤は、生体外に摘出された細胞 ·組織の保護の目的等に用いることもできる。この細胞 ·組織保護剤を、生体外に摘出された細胞や組織の保存のための剤とすることによって、例えば臓器保存剤とすることができる。具体的には、移植用に摘出した臓器（肝臓、腎臓、心臓、肺等）をこの臓器保存剤で灌流したり、この臓器保存剤中で保存、保持等することにより、かかる臓器の細胞袓織傷害（浮腫、細胞死等）を抑制することができる。

細胞 ·組,織保護剤における HAオリゴ糖の配合量、 1回あたりの投与 (使用）の量、間隔等は、投与 (使用）の方法、形態、目的等、具体的な状況に応じて個別に決定することができる。

例えば細胞 ·組織保護剤.を潰瘍処置剤、肝障害処置剤、 I L一 1 0産生促進剤、 I L一 8産生抑制剤等としてヒトに投与する場合、 HAオリゴ糖（特に H A 4糖）の臨床投与量として成人 1人 1回当り 1 2 0〜 6 0 0 O m gが例示される。

この細胞 ·組織保護剤を、生体外に摘出された細胞 ·組織の保護を目的として使用する場合には、液剤、灌注用剤、用時溶解用固形剤等として製剤化することができる。臓器保存剤として用いる場合は、保存ないし保持をする臓器の大きさ、保存時間、温度等、具体的な状況に応じて、 HAオリゴ糖（特に HA 4糖）の配合量等を個別に決定することができる。

この細胞 ·組織保護剤中の H Aオリゴ糖（特に HA 4糖）の濃度も特に限定されないが、例えば、注射剤（溶液）あるいは臓器保存のための液剤として提供する場合には、 lng/ml〜lmg/ml程度とするのが好ましい。

細胞 '組織保護剤を注射剤、あるいは液剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれであっても良い。これをアンプル、バィアル、注射用シリンジ、ボトル等の適当な容器に充填'密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤あるいは液剤として使用できる。

本発明はさらに、以上のような剤だけではなく、 in vitro または in vivo において細胞または生体組織等の適用対象に HAオリゴ糖（特に HA 4糖）を作用させ、該適用対象において H s pの発現を増強し、細胞死を抑制し、細胞障害を抑制し、又は細胞 ·組織を保護（例えば、臓器を保存し、潰瘍を処置し、肝障害を処置し、 I L一 1 0の産生を促進し、又は I L一 8の産生を抑制）する方法も包含する。図面の簡単な説明

図 1は、 HA 4をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。上段の縦軸は 2 1 0 n mの吸収を、下段の縦軸は R Iの吸収を示す。また横軸はレ、ずれも溶出時間を示す。

図 2は、 H A 6をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 1と同様である。

図 3は、 HA 8をゲル濾過クロマトグラフィ一に付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 1と同様である。

図 4は、 HA 1 0をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 1と同様である。

図 5は、 HA 1 2をゲル濾過ク口マトグラフィ一に付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 1と同様である。

図 6は、 HA 1 4をゲル濾過クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 1と同様である。

図 7は、 HA 4を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸は 2 1 0 n mの吸収を、横軸は溶出時間を示す。

図 8は、 HA 6を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 7と同様である。

図 9は、 H A 8を陰ィオン交換ク口マトグラフィ一に付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 7と同様である。

図 1 0は、 HA 1 0を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 7と同様である。

図 1 1は、 HA 1 2を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 7と同様である。

図 1 2は、 HA 1 4を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 7と同様である。

図 1 3は、 HA 4 8を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及ぴ横軸の説明は、図 7と同様である。

図 1 4は、 HA 5 0を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 7と同様である。

図 1 5は、 HA 5 2を陰イオン交換クロマトグラフィーに付した場合の溶出曲線を示す図である。縦軸及び横軸の説明は、図 7と同様である。

図 1 6は、蛍光標識オリゴ糖の電気泳動の結果を示す図である。

図 1 7は、 HA 4 (ロット 1 ) のマススペクトルを示す図である。

図 1 8は、 HA 6 (上段）、 HA 8 (中段）及び HA 1 0 (下段）のマススぺクトルを示す図である。

図 1 9は、 HA 6 (上段）、 HA 8 (中段）及ぴ HA 1 0 (下段）についての Deconvolutionの結果を示す図である。

図 2 0は、 HA 1 2 (上段）、 HA 1 4 (中段）及び HA 1 6 (下段）のマススぺクトルを示す図である。

図 2 1は、 HA 1 2 (上段）、 HA 1 4 (中段）及び HA 1 6 (下段）についての Deconvolutionの結果を示す図である。

図 2 2は、 HA 4 8 (上段）、 HA 5 0 (中段）及ぴ HA 5 2 (下段）のマススぺクトルを示す図である。

図 2 3は、 HA 4 8 (上段）、 HA 5 0 (中段）及ぴ HA 5 2 (下段）についての Deconvolutionの結果を示す図である。

図 2 4は、 HA 4についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 2 5は、 HA 4についての¹³ C— NMRスぺクトルを示す図である。

図 2 6は、 HA 6についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 2 7は、 HA 6についての¹³ C— NMRスぺクトルを示す図である。

図 2 8は、 HA 8についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 2 9は、 HA 8についての¹³ C— NMRスぺクトルを示す図である。

図 3 0は、 HA 1 0についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 3 1は、 HA 1 0についての ¹³C— NMRスぺクトルを示す図である。図 3 2は、 HA 1 2についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 3 3は、 HA 1 2についての ¹³C— NMRスぺクトルを示す図である。図 3 4は、 HA 1 4についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 3 5は、 HA 1 4についての ¹³C— NMRスぺクトルを示す図である。図 3 6は、 HA 1 6についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 3 7は、 HA 1 6についての ¹³C— NMRスぺクトルを示す図である。図 3 8は、 HA 4 8についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 3 9は、 HA 5 0についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 4 0は、 HA 5 2についての¹ H— NMRスぺクトルを示す図である。

図 4 1は、 HA 4糖による熱ショック後の H S F 1の活性ィ匕を示す図である。図 4 2は、 HA 4糖による熱ショック後の H s p 7 2の発現を示す図である。図 4 3は、各種 H Aオリゴ糖による血清飢餓により誘導されるの細胞死（アポトーシス）の抑制の程度を示す図である。

図 4 4は、 H A 4糖による臓器の浮腫の抑制効果を示す図である。

図 4 5は、 HA 4糖による細胞のクロマチン濃縮の抑制効果を示す図である。図 4 6は、 HA 4糖による T U N E L染色細胞数の減少を示す図である。

図 4 7は、 H A 4糖による細胞 ·組織障害の抑制効果を示す図である。

図 4 8は、 HA 4糖による胃潰瘍抑制効果を示す図である。

図 4 9は、 HA 4糖による肝障害抑制効果（G O T活性）を示す図である。図 5 0は、 H A 4糖による肝障害抑制効果（白血球数）を示す図である。

図 5 1は、 HA 4糖による I L一 1 0産生促進効果を示す図である。

図 5 2は、 HA 4糖による I L _ 8産生抑制効果を示す図である。発明を実施するための最良の形態以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

以下、 H A 4糖画分を「HA 4」、 HA 6糖画分を「HA 6」、 HA 8糖画分を「HA 8」、という要領で略記する。

(実施例 1 ) 本発明オリゴ糖及び本発明画分の製造と理化学的性質

1 . 本発明オリゴ糖及び本発明画分の製造

鶏冠から分離 ·精製された HAのナトリゥム塩を原料として、以下の方法によつて本発明オリゴ糖及び本発明画分を製造した。なお、原料とした HAのナトリゥム塩は、セルロースアセテート膜を用いた電気泳動（泳動緩種 ί液：ピリジン一ギ酸緩衝液、電流： 1 5 mA、泳動時間： 3 0分間）によって単一のバンドを示し、 HA以外のグリコサミノダリカン (コンドロイチン、コンドロイチン一4 _ 硫酸、コンドロイチン _ 6 _硫酸、コンドロイチン硫酸 E、コンドロイチン硫酸 D、へパリン、へパラン硫酸、デルマタン硫酸）は検出されなかった。

(製造例 1 ) ヒアルロニダーゼによる分解

HAのナトリウム塩 2 5 gを、 0. 15M NaCl を含有する 0. 1M リン酸緩衝液 (pH 5. 3) 1. 1 L に溶角军した。これに、ゥシ睾丸由来のヒアルロニダーゼ（5. 342 ュニット /mg；生化学工業株式会社製） 200mgを添カ卩して、 37 ° で 9時間反応させた。反応後、 10, OOOrpmで 30分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を、陰イオン交換基としてトリメチルアンモニオメチル基を有する強塩基性陰イオン交換体である Dowex 1x2 (100- 200mesh) (ダウケミカノレ社製）イオン交換カラム (Φ1.5 X 123cra)にアプライし、 NaCl の直線濃度勾配（0.01M〜0.50M)によって溶出した。得られた画分中のゥロン酸をカルパゾール法（carbazole method)で検出することにより、 HAオリゴ糖を含む画分をスクリーニングした。適当な画分をプールして濃縮し、 Sephadex G- 10 (フアルマシア社製； ψ 3 x 124)で脱塩した後、凍結乾燥した。

得られた画分の凍結乾燥重量を以下の力ッコ内に示す。

HA4 (330mg)、 HA 6 (1210mg)、 HA8 (305mg)ヽ HA 1 0 (1625mg)、 HA 1 2 (685mg)、 HA 14 (620mg)、 HA 1 6 (430mg)、 HA 18 (210mg)、 HA 20 (202mg)ゝ HA22

(819mg)、 HA 24 (197mg), HA26 (187mg)、 HA28 (1 59mg)、 HA 30 (137mg)、 HA 32 (122mg)、 HA34 (10 2mg)、 HA 36 (91mg)、 HA38 (89mg)ヽ HA40 (65mg)ヽ HA42 (76mg)、 HA44 (61mg)ヽ HA46 (58mg)ゝ HA48

(46mg)、 HA 50 (48mg)、 HA 52 (2 lmg)

(製造例 2) コンドロイチナーゼ AC Iによる分解

HAのナトリゥム塩 8 gを、 0.1%ゥシ血清アルブミン (BSA)を含有する 0.1M酢酸緩衝液 (pH 6.0) 500mlに溶解した。

これに、コンドロイチナーゼ AC I (生化学工業株式会社製） 32 ュ-ットを添加して、 37 '°Cで 6時間反応させた。

反応後、 10， OOOrpraで 30分間遠心分離して上清を回収した。回収した上清を、 Dowe 1x2 (100-200mesh) (ダウケミカル社製）イオン交換カラム（ φ 4.5 x 123cm) にアプライし、 NaCl の直線濃度勾配 (0.01M〜0.50M)によって溶出した。得られた画分中のゥ口ン酸を力ルバゾール法（carbazole method)で検出することにより、 HAオリゴ糖を含む画分をスクリーニングした。適当な画分をプールして濃縮し、 Sephadex G- 10 (フアルマシア社製； φ3 x 124)で脱塩した後、凍結乾燥した。得られた画分の凍結乾燥重量を以下のカツコ内に示す。なお「Δ」は非還元末端糖が不飽和糖であることを示す。

ΔΗΑ4 (133mg) ΔΗΑ6 (133mg)、 ΔΗΑ8 (84mg)、 ΔΗ A 10 (109mg)、 ΔΗΑ 12 (100mg)、 ΔΗΑ14 (101mg)、 ΔΗΑ16 (73mg)、 ΔΗΑ 18 (31mg)、 ΔΗΑ20 (9mg)

(製造例 3) DM SO法

HAのナトリゥム塩 10 gを、 0.1M HC1 を 10%含有するジメチルスルホキシド (DMSO) 3Lに溶解した。 105°Cで 16時間加処理した。

処理後、 Dowex 1x2 (100- 200mesh) (ダウケミカル社製）イオン交換カラム（Φ 3.0x78cm)にアプライしてクロマトグラフィーを行った。溶出は NaClの直線濃度勾配（0.01M〜0.50M)により行った。得られた画分中のゥロン酸を力ルバゾール法 (carbazole method)で検出することにより、 HAオリゴ糖を含む画分をスクリ一ニングした。適当な画分をプールして濃縮し、 SephadexG- 10(フアルマシア社製； 3 X 124)で脱塩した後、凍結乾燥した。

得られた画分の凍結乾燥重量を以下のカツコ内に示す。

HA2 (50mg)、 HA4 (1100mg)、 HA 6 (232mg)、 HA 8 (1 015mg)、 HA 10 (1033mg)、 HA 12 (459mg)

このようにして得られた各種サイズの HAオリゴ糖を、以下の種々の分析に付した。

2. 本発明画分の理化学的性質

前記製造例 1で得られた各 H Aオリゴ糖（ナトリウム塩）画分について、種々の理化学的性質を調べた。

( 1 ) ゲル濾過ク口マトグラフィ一による分析

使用カラム： TSKGel2500 + 3000+4000pwxl (東ソ一株式会社）

溶媒： 0. 05M Na C 1

流速： 0. 6mlノ分

検出波長： 210 _nm、及び示差屈折計 (R I ) 試料のアプライ量： HAオリゴ糖として 200 g/ショット

試料として HA 4 (ロット 1) 〜HA14を用いた場合の溶出曲線を、図 1〜図 6に示す。各図の上段は 21 Onmで検出した結果を、下段は示差屈折計で検出した結果を示す。

これらの図から、いずれの画分も実質的に単一なピークを示すことがわかる。また、画分中の全 HAオリゴ糖のピーク面積の和に対するメインの HAピークの相対面積は、表 1に示す通り、 210n mの吸収で検出した場合にはいずれも 85%以上であり、示差屈折計 (R I) で検出した場合にはいずれも 98%以上であった。

Ρ¾料全ピークに対するメインピ -クの面積比（％)

21 0 n m R I

ΗΑ4 (ロット 1) 89. 037 99. 854

ΗΑ6 98. 573 99. 815

ΗΑ8 96. 617 98. 929

HA 10 98. 594 99. 287

HA 12 100 . 000 100. 000

HA 14 98. 334 99. 796

(2) イオン交换クロマトグラフィ一による分析

カラム： YMC NH2カラム（株式会社ヮイエムシィ)

溶媒： Na H₂P0₄を用いた 0Mから 0. 8Mまでの濃度勾配

■ '(M ： 1 m 1 Z分

検出波長： 210 nm

試料のアプライ量： HAオリゴ糖として 20 μ g/ショット

試料として HA 4 (ロット 1) 〜HA 14及び HA48〜HA 52を用いた場合の溶出曲線を、図 7〜図 15に示す。これらの図から、いずれの画分も実質的に単一なピークを示すことがわかる。また、画分中の全 HAオリゴ糖のピーク面積の和に対するメインの H Aピークの相対面積は、表 2に示す通りいずれも 90 %以上であった。表 2

料全ピークに対するメノ rンピクの面積比（％)

HA4 (ロット 1) 9 8. 5 0 0 7

HA 6 9 7. 9 1 4 0

HA8 9 8. 1 2 0 9

HA10 9 7. 4 2 3 6

HA 12 9 4. 5 4 2 5

HA 14 9 4. 7 1 8 1

HA48 9 4. 4 7 4 3

HA 50 9 3. 4 3 0 5

HA52 9 4. 2 4 9 2

(3) 蛍光標識ゲル電気泳動による分析

HA4、 HA6、 HA8、 HA10、 HA12、 HA 14および HA 16のそれぞれを以下の通り処理した。併せて、 HAオリゴ糖の混合物画分（HA2糖も含まれる；以下、「混合物」と略記する）についても同様に処理した。

(3-1)蛍光標識オリゴ糖の調製

それぞれの画分に含まれる HAオリゴ糖を、 FACE^RN- linked Oligosaccharide Profiling Kit (Glyko, Inc. , Novato, CA. U.S.A.) を用いて蛍光標識した。

HAオリゴ糖として約 2nmol (混合物については H A 2糖単位として約 20nmol) を含有する量の画分を、 0.5mL プラスチックチューブ中で遠心式凍結真空乾燥機（SpeedVac, AS 160, SAVANT INSTRUMENTS INC. NY. U.S. A)によって乾燥した。乾燥後、それぞれのチューブに 8 -ァミノナフタレン- 1, 3, 6-トリスルホン酸ニナトリゥム塩（ANTS)溶液（GLYK0， L2, Part # 50058： reconstituted 0LIG0 Labeling Dye)を 5 μ Lずつ加え、攪拌後室温で 15分放置した。さらに、シァノ水素化ホウ素ナトリゥム溶液（GLYKO, LI, Part # 50056: Labeling Reducing Agent) を 5μ Lずつ加え、密封して 36。Cで 16時間ィンキュベートした。

インキュベート後、遠心式凍結真空乾燥機に約 15分間かけ、部分乾燥させた後、蒸留水を加えて 20 Lに合わせた。 (3 - 2)蛍光標識オリゴ糖の電気泳動

電気泳動は GLYK0 0- linked Oligosaccharide Profi ling Gel (GLYKO, Part # 60200；架橋度 36%のポリアクリルァミドゲル）を用いて行つた。

0LIG0 Gel Running Buffer (GLYKO, Part # 7000) 1包を蒸留水に溶かして 1. 5L とし、氷中で冷却しておいた。

ゲルボックス（GLYKO, GLYKO Gel Box, Part # 40026)に冷却水を循環させ、冷却しておいた Running Buffer を入れ、ゲルをセットした。ゲルボックスごと氷につけ、冷やした。

蛍光標識した H Aオリゴ糖を含むそれぞれの画分溶液から 2 L をとり、蒸留水と Loading Buffer (GLYKO, Part # 50064) 5 Lを混合した。混合物溶液は、その 2 しを Loading Buffer 2 L と混合した。これをそれぞれ 4 μ ΐずつゲルにアプライした。それぞれの画分は、 1レーンあたり Η Αオリゴ糖として 80praolのアプライ量とした。

1000V の定電圧で 160 分間電気泳動し、 UV トランスイルミネーター（model NLM-20E, UVP, CA, U. S. A. )で 365nmの光を照射することにより発せられる蛍光を、インスタントカメラ（MAMIYA , Professional SD， f=127ram)およびインスタントフィルム（Polaloid^R Polapan T667， iso3000, Polapoid corp. MA. U. S. A) を用いて記録した。結果を図 1 6に示す。

図 1 6中のレーンと試料の関係は以下の通りである。

レーン 1 ：混合物、レーン 2 ： HA 4、レーン 3 ： HA 6、レーン 4 ： HA 8、レーン 5 ： HA 1 0、レーン 6 ： HA 1 2、レーン 7 ： H A 1 4、レーン 8 ： H A 1 6

混合物は梯子状のバンドを示したが、分画された各オリゴ糖画分は、すべてそれぞれのサイズに応じた泳動度で単一のバンドを形成し、かつ、他のサイズの H Aオリゴ糖のパンドは検出されなかった。

また、サイズの小さいものほど大きな泳動度が得られた。それぞれ画分におけるオリゴ糖のパンドの位置（泳動位置）は、混合物が示した梯子状バンドのそれぞれサイズの位置とよく一致し、複数のサイズのォリゴ糖の混合物でも、それぞれの分子の泳動度に影響がないことが示された。 '

GLYKO 0-linked Profiling Gel は架橋度 36%のポリアクリルアミドゲルである。 8 -ァミノナフタレン- 1,3,6-トリスルホン酸ニナトリウム塩（ANTS)は 3価の負電荷を持つ蛍光物質である。

電荷を持たない 2-Aminoacridon (AMAC)を蛍光物質とした場合、このゲルではどのオリゴ糖もほとんど泳動しなかった。このことから、この高架橋度ゲルでの電気泳動には H Aオリゴ糖自身の負電荷だけでは不足で、結合している ANTS の電荷が必要であることが示唆された。また、糖鎖骨格と相互作用することが知られているホウ酸は使用していないので、オリゴ糖のサイズとポリアクリルアミドの網目との直接の相互作用が泳動度を左右していることが示唆された。

Glyko社の他のゲル (架橋度 20% または 21%)では、 ANTS ラベルした場合、 H A 8糖以下では分離できないか、または H A 4糖以下が泳動前線と重なってしまい、検出できなかった。

(4) 質量分析

質量分析は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ electrospray ionization mass spectrometry； E^IMS) により行った。

(4 - 1)方法

(4-ト 1)分析試料

HA4 (ロット 1)、 HA6、 HA8、 HA10、 HA1 2、 HA14、 HA 1 6、 HA48、 HA 50および HA 52を、それぞれ 2.6mg/ml、 1.2mg/ml、 1.4mg/ral、 3.0mg/ml、 2.0mg/ml、 6.5mg/ml、 1.3mg/ml、 lmg/ml、 lmg/mlおよび lmg/ml の濃度となるように水溶液を調製して分析した。

なお、 HAオリゴ糖に関する分子量の理論値については、 HA4糖〜52糖が下記式（1).で表される構造を有していることに基づいて求めた。式（1 )

(式中、 nは 1〜2 9の整数であり、 Mはプロトン又は 1価のカチオンを示し、 A cはァセチノレ基を示す。）

(4-1- 2)試薬

試験に用いたメタノール（和光純薬）および蒸留水（和光純薬）は HPLC用を、ぎ酸アンモニゥム（和光純薬）は特級をそれぞれ使用した。

(4-ト 3)機器及び機材

D HPLCシステム

Agilent 1100シリーズ：バイナリポンプ、デガッサ、ォー (Agilent l echnologi es)

2)質量分析計

三連四重極型質量分析計： TSQ (サーモクエスト）

(4-1- 4) ESIMS分析条件

質量分析計への試料の導入は、質量分析計に繋いだ HPLC システムに各試料溶液を 5 1又は 10 1注入することにより行った。 HPLCおよび ESIMSの分析条件を以下に示す。

D HPLC

移動相 lOmMぎ酸アンモニゥム水溶液/メタノール =80/20

流: ¾ 0. 2ml/ min

カラムなし注入量： ΙΟ ,α Ι

2) ESIMS

プローブ： Off- axis

ィオンモード：陰ィオンモード

ィォン化法： ESI法（エレクトロスプレーィォン化法）

ESIスプレー電圧： 4. 5 kV

ヒーティドキヤビラリ一温度： 350 °C

Auxiliaryガス： 35 units

Sheathガス： 50 psi

スキャン範囲： m/z 10- 2500又は 10-4000

スキャン Bき間： 1. 5 sec又は 3 sec.

(4 - 1 -りノ Deconvolution角军析

観測された ESIMSスぺクトルから分子量を推定するための Deconvolution解析は、解析ソフト Xcalibur Bioworks (サーモクエスト株式会社）を用いて行った。

(4 - 2)結果

H A 4〜H A 1.6の陰ィオン ESIMSスぺクトル測定の結果をまとめて表 3及ぴ表 4に、 HA 4〜HA 1 6および HA 4 8〜HA 5 2のスぺクトルを図 1 7〜図 2 3に示す。

表 3

CO CO

上段：測値

下段：ピ-クの相対強度 (¾)

表 4

以上の結果においては、いずれも HAオリゴ糖由来と考えられる各種分子関連イオンが観測されており、 HA4 (ロット 1) が HA4糖、 6が11八6糖、 HA8が HA8糖、 HAI Oが HAI O糖、 HA12が HA1 2糖、 HA14が HA14糖、 ^[ 16が《[ 1 6糖、 HA48がHA48糖、 HA5 C^ HA5 0糖、および HA52が HA52糖に相当するものと解して矛盾がないものである。

以上の結果に基づき、モノアイソトピック分子量の理論値を 1とした場合における、メインピークの実測値の相対値を求めた。結果を表 5 Aに示す。なお、 H A 4については [M-H]—についての実測値と理論値を用レヽた。表 5 A

また、平均分子量の理論値を 1とした場合における、メインピークの実測値の相対値を求めた。結果を表 5 Bに示す。なお、 HA4については [M- ΗΓについての実測値と理論値を用いた。表 5 B

これらの結果から、本発明画分を構成する H Aオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は平均分子量の理論値を 1とした場合、当該画分の質量分析による実測値がいずれも 0. 999〜1. 001 (相対値）の範囲内であることが示された。

(5) 元素分析

HA4 (ロット 1)、 HA6、 HA8、 HA10、 HA12、 HA14および H A 16をそれぞれ 80 °Cで 2時間減圧乾燥し、直ちに元素分析器で測定した。結果を表 6に示す。

試料 Ll 理論値 (％) 卖沏 1値（o/o)

HA 4 (ロッ卜 1 ) c 40.63 0.35

H . u 5.20 -0.04

N 3 41 3.34 0.07

Na d 5 fiO 5 AS 0.12

HA 6 c < 0 40.74 0.54

JL o,丄丄

NT U. ϋ

q

I , U. i 1

A R 寸 A

il Jr O π π

xn o. uO Cy r -0.13

IN O. Ό ί o, ^ 0.26

Π. r\ A 1 Q 0.12

"Γ 3.46 0.03

5.68 5 5 0.23

HA 12 c 41.59 40.96 0.63

H 5.07 5.33 - 0· 26

N 3.46 3.23 0.23

Na 5.69 5.41 0, 28

HA14 C 41.64 41.44 ρ 0.20

ο

H 5.06 5.36 -0.30

N 3.47 3.37 0.10

Na 5.69 5.20 0.49 この結果、本発明画分を構成する HAオリゴ糖（ナトリウム塩）における炭素 (C)、水素（H)、窒素（N) およびナトリウム（Na) のそれぞれの含量比の理論値（重量％) と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量⁰ /₀) との差は、いずれも ±1 (重量％) であることが示された。

(6) 核磁気共鳴スぺクトル（NMR)

HAオリゴ糖画分の¹ H— NMRおよび¹³ C— NMRを、 VARIAN Unitylnova 500型を用いて測定した。測定溶媒は D₂0 を使用した。内部標準を t-Bu0H (^XH 1.23 ppm, ¹³C 32.461 ppm)とし、測定温度を 2 3°Cとして測定を行つた。各 HAオリゴ糖画分についての結果を以下に示す。また、それぞれのスぺクトルを図 2 4〜図 4 0に示す。

(6-1) HA 4 (ロット 1 ) の測定結果

500 MHz 'H-NMR δ；

2.004 (s， 3H, NAc), 2.018, 2.019 (3H, NAc), 3.292-3.326 (m, 1H, H— 2d)，

3.354 (dd, 1H, J_li2=7.9Hz, J_2i3=9.5Hz, H - 2b)，

4.027 (dd, 0.6H, J_li2=3.5Hz, J_{2 3}=10.6Hz, H-2a a ) , 4.453 (d, J_1>2=7.9Hz, H— Id), 4. 60 (d, H-lbi3), 4.502 (d， 0.6H, H-lba), 4.555 (d, 1H， J_li2=8. Hz, H-lc), 4.705 (d, 0.4H, J_li2=8.4Hz, H - lai3)， 5. 144 (d， 0.6H, H-laa) 解析の基礎としたスぺクトルを図 2 4に示す。

125 MHz ¹³C-腿 δ ；

24.84, 25.09, 25.36 (NHC0CH₃), 55.81 (C-2a a ) , 57.09 (C一 2c)， 58.44 (C-2a β ) , 63.40, 63.57 (C - 6a or C- 6c)，

75.29, 75.33 (C-2b a or C-2b β ) , 75.58 (C一 2d), 93.92 (C-laa),

97.61 (C-lajS ), 103.44 (C— lc),

105.80， 105.84， 105.95 (C~lb a or C - lbjS or C— Id),

177.00, 177.04, 177.41, 177.68, 177.80, 178.33 (carbonyl)

解析の基礎としたスぺクトルを図 2 5に示す。

これらの結果は、前記式（1 ) において n = 1で示される構造（Sodium j3- D- glucopyranosyluronate- (1→ 3) -2- acetamido - 2— deoxy - j3 - D_glucopyranosyl - →4) - (Sodium β - D - glucopyranosyluronate) - (1→3) -2 - acetamido- 2_deoxy - D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6- 2) HA 6の測定結果

500 MHz NMR δ ；

2.002, 2.010, 2.017 (9H， NAc), 3.291—3.368 (m, 3H, H— 2b， H— 2d and H - 2f)，

4.026 (dd, 0.6H, J_{1 2}=3.5Hz, J, ₃=10.6Hz, H-2aa), 4.452, 4.459 (dX2, 2.4H, J_{1 2}=7.8Hz, J₁₂=7.8Hz, H- lbj3, H- Id and H - lf)， 4.500 (d, 0.6H, J_{1 2}=7.9Hz, H-lba),

4.544, 4.550 (dX 2, 2H, J_li2=8.5Hz, J₁₂=8.5Hz, H- lc or H-le),

4.702 (d, J_1>2=8.3Hz, H— laj3), 5.142 (d, 0.6H, H-la a )

解析の基礎としたスぺクトルを図 2 6に示す。

125 MHz ¹³C-NMR δ ；

24.84, 25.09, 25.35 (NHC0CH₃), 55.81 (C一 2aひ），

57.09， 57.16 (C- 2c or C-2e) , 58.44 (C - 2a β ) ,

63.40, 63.57 (C - 6a or C - 6c or C - 6e) ,

75.28, 75.31, 75.34, 75.57 (C-2b a or C-2b β or C - 2d or C-2f)，

93.92 (C-laa), 97.61 (C-la 3),

103.40, 103.45 (C-lc or C- le),

105.80, 105.85, 105.94, 106.02 (C-lba or C - lbj3 or C- Id or C - If), 176.97, 177.40, 177.68, 177.80, 178.27 (carbonyl)

解析の基礎としたスぺクトルを図 2 7に示す。

これらの結果は、前記式（1) において n = 2で示される構造（Sodium 3 - D- glucopyranosyluronate- [ (1→3)— 2— acetamido— 2— deoxy— β—D— glucopyranosyl— (1 ^→4)- (Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ] ₂ - (1→ 3) - 2- acetamido - 2 - deoxy- D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6 - 3) HA 8の測定結果

500 MHz ^XH-NMR δ ；

2.002， 2.003, 2.008, 2.016 (12H, NAc), 3.290-3.368 (m, 4H, H- 2b, H - 2d， H— 2f and H-2h) ,

4.025 (dd, 0.6H, J_li2=3.5Hz, J₂,₃=10.6Hz, H-2aa),

4.450, 4.458 (dX2, 3.4H, J_{1 2}=7.8Hz, J_li2=7.8Hz, H-lb β , H- ld， H - If and H - lh)， 4.500 (d, 0.6H, J_li2=7.8Hz, H~lb a ) ,

4.539, 4.543, 4.550 (dX 3, 3H， J_li2=8.4Hz, J_{1 2}=8.5Hz, J₁₂=8.4Hz, H- lc or H - le or H-lg), 4.702 (d, 0.4H, J_li2=8.4Hz, U-la^ ), 5. 142 (d， 0.6H， H-la a ) 解析の基礎としたスぺクトルを図 2 8に示す。

125 MHz ^{1 3}C-NMR δ ；

24.84, 25.09, 25.35 (NHC0CH₃), 55.82 (C_2a a )，

57.10, 57. 16 (C-2c, C- 2e and C- 2g)， 58.44 (C-2a j3 )，

63.40, 63.57 (C-6a, C- 6c and C- 6e)，

75.28, 75.34, 75.57 (C— 2b, C_2d， C_2f and C-2h)，

93.92 (C-laa), 97.61 (C-la β ) ,

103.39， 103.45 (C- lc， C_le and C- lg)，

105.80, 105.85， 105.95, 106.04 (C— lb or C— Id or C— If or C— lh) ,

176.93, 177.40, 177.68, 177.80， 178.27 (carbonyl)

解析の基礎としたスぺクトルを図 2 9に示す。

これらの結果は、前記式（1 ) において n = 3で示される構造（Sodium j3- D - glucopyranosyluronate-[(l→3)-2-acetamido-2-deoxy- j3 _D— g丄 ucopyranosy丄ー (1 → 4) -(Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ] ₃ - (1→3) - 2- acetaraido - 2 - deoxy- D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6-4) HA 1 0の測定結果

500 MHz ^XH-NMR δ ；

2.001, 2.007， 2.016 (15H， NAc)， 4.025 (dd, 0.6H, J_li2=3.6Hz, J_2i3=10.6Hz, H-2a a ) ,

4.441-4.465 (m, H-lb j3 , H - ld， H - If, H- lh and H-1 j) , 4.499 (d, J_{1 2}=7.8Hz, H-lb a),

4.538, 4.549 (dX2, J_li2=8.4Hz, J_{1 2}=8.4Hz, H - lc， H— le， H—lg and H - li)， 4.701 (d， J_{1 2}=8.4Hz, H-la 3), 5. 141 (d， 0.6H, H-la a)

解析の基礎としたスぺクトルを図 3 0に示す。

125 MHz ¹³C-NMR δ ；

24.84, 25.09, 25.35 (NHC0CH₃), 55.82 (C-2a ) , 57.10, 57. 16 (C - 2c， C-2e， C - 2g and C- 2i)， 58.44 (C - 2aj3)，

63.37, 63.57 (C— 6a, C - 6c， C一 6e， C_6g and C— 6i),

75.35, 75, 58 (C一 2b, C— 2d， C - 2f， C - 2h and C— 2 j)，

93.92 (C-laa), 97.61 (C - la 3),

103.39， 103.46 (C一 lc， C— le, C一 lg and C- li),

105.80, 105.86， 105.94， 106.05 (C - lb， C-ld, C— If, C-lh and C-lj),

176.94, 176.99, 177.41, 177.68, 177.81, 178.30(carbonyl)

解析の基礎としたスぺクトルを図 3 1に示す。

これらの結果は、前記式（1 ) において n = 4で示される構造（Sodium β D- glucopyranosyluronate- [ (l→3) -2-acetami do-2-deoxy- j3 _D- glucopyranosy丄- (1 →4)- (Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ] ₄ _ (1^→ 3) _2 - acetamido- 2- deoxy - D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6-5) H A 1 2の測定結果

500 MHz - NMR δ ；

2.002, 2.006， 2.016 (18H, NAc), 4.025 (dd， 0.6H, J_{1 2}=3.6Hz， J₂,₃=10.7Hz， H-2a a )，

4.440-4.465 (ra, H-lb β , H - Id, H-lf, H- lh, H - 1 j and H— 11) , 4.498 (d, J_{1 2}=7.8Hz， H-lb a ) ,

4.538， 4.549 (dX2, J_li2=8.4Hz, J_li2=8.4Hz, H - lc, H— le， H - lg, H - li and H-lk) , 4.701 (d, J_{1 2}=8.5Hz， H-la β ) , 5.141 (d， 0.6H, H-la a )

解析の基礎としたスぺクトルを図 3 2に示す。

125 MHz ^{1 3}C-腿 δ ；

24.84, 25.09, 25.35 (NHC0CH₃), 55.82 (C-2a a ) ,

57.09, 57. 16 (C— 2c, C_2e， C一 2g and C— 2i)， 58.44 (C~2a β ) ,

63.37 (C-6a, C— 6c， C— 6e， C一 6g and C_6i) ,

75.35, 75.58 (C一 2b， C-2d， C_2f, C一 2h and C一 2 j)，

93.92 (C-laa), 97.61 (C-la β ) , 103.40, 103.45 (C- lc， C-le, C-lg and C~li),

105.80， 105.86, 106.05 (C—lb, C - ld， C-lf, C-lh and C-lj),

176.95, 177.40, 177.80, 178.31 (carbonyl)

解析の基礎としたスぺクトルを図 3 3に示す。

これらの結果は、前記式（1) において n = 5で示される構造（Sodium j3 - D- glucopyranosyluronate- [ (1→3) - 2-acetamido - 2 - deoxy - β - D- glucopyranosyl- (1 →4)- (Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ] ₅-(1→3)- 2 - acetamido_2 - deoxy - D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6-6) H A 1 4の測定結果

500 MHz ^-NMR δ ；

2.001， 2.006， 2.016 (21H, NAc), 4.024 (dd, 0.6H， J_{1 2}=3.6Hz, J₂,₃=10.6Hz， H-2a a ) ,

4.439-4.464 (m, H_lbj3， H_ld, H- lf， H - lh， H- lj, H- 11 and H-ln) , 4.498 (d， J_li2=7.8Hz, H-lb a ) ,

4.537, 4.549 (dX2, J_li2=8.4Hz, J_li2=8.3Hz, H- lc, H— le， H - lg， H - li， H - lk and H-lm),

4.701 (d， J_li2=8.4Hz, H— la/3), 5.141 (d， 0.6H, H-la a )

解析の基礎としたスぺクトルを図 34に示す。

125 MHz ¹³C -羅 δ ；

24.84, 25.09, 25.34 (NHC0CH₃), 55.81 (C-2a ) ,

57.09, 57.15 (C— 2c， C- 2e, C- 2g and C- 2i)， 58.43 (C- 2a β ) ,

63.36, 63.57 (C一 6a, C— 6c， C一 6e， C— 6g and C-6i),

75.35, 75.58 (C- 2b， C- 2d, C - 2f, C-2h and C- 2 j)，

93.91 (C-la a ) , 97.61 (C-la β ) ,

103.40(C-lc, C-le, C-lg and C-li),

105.80， 105,85, 105.94， 106.07 (C - lb， Old, C-lf, C-lh and C-lj), 176.95, 177.40, 177.67, 177.80, 178.30 (carbonyl) 解析の基礎としたスぺクトルを図 35に示す。

これらの結果は、前記式（1) において n = 6で示される構造（Sodium j3 - D - glucopyranosyluronate- [ (1→3) -2 - acetamido- 2- deoxy - j3 - D- g丄 ucopyranosyl- (1 →4)- (Sodium β -D-glucopyranosyluronate)] ₆-(l→3)-2-acetaraido-2-deoxy - D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6-7) H A 1 6の測定結果

500 MHz ^XH-NMR δ ；

2.002, 2.006， 2.016 (24Η, NAc), 4.024 (dd, 0.6H， J₁₂=3.6Hz, J₂,₃=10.6Hz， H-2aa),

4.434-4.464 (m， H-lb β , H- ld， H- If, H- lh, H-lj, H- 11， H-ln and H-lp), 4.498 (d， J_li2=7.8Hz, H-lb a),

4.537, 4.549 (dX2, J₁₂=8.4Hz， J₁₂=8.3Hz, H-lc, H— le, H - lg， H— li， H_lk, H- lm and H- lo)，

4.701 (d， J_li2=8. Hz, H-laj3), 5.141 (d， 0.6H， H-laa)

解析の基礎としたスぺクトルを図 3 6に示す。

125 MHz ¹³C-NMR δ ；

24.84, 25.09, 25.35 (NHC0CH₃), 55.82 (C-2a a ) ,

57.10， 57.16 (C - 2c， C一 2e， C— 2g, C - 2i, C— 2k, C_2m and C- 2o),

58.44 (C-2a/3),

63.37, 63.57 (C— 6a， C_6c， C— 6e， C— 6g, C_6i， C一 6k， C一 6m and C— 6o)， 75.35, 75.58 (C一 2b, C— 2d， C_2f， C一 2h, C— 2j, C— 21， C-6n and C-6p), 93.92 (C-laa), 97.61 (C-la β ) ,

103.40(C-lc, C-le, C- lg, C- li, C_lk， C-lm and C-lo),

105.80， 105.86, 105.95， 106.08 (C— lb, C— Id, C— If, C— lh， C-lj, C一 11， C—ln and C-lp),

176.98， 177.41, 177.68, 177.81, 178.33 (carbonyl)

解析の基礎としたスぺクトルを図 3 7に示す。これらの結果は、前記式（1) において n= 7で示される構造（Sodium β-Ό~ glucopyranosyluronate- [ (l→3)-2-acetaraiao-2-deoxy- β -D-glucopyranosyl- (1 → 4) - (Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ] ₇ - (1^→3) - 2 - acetamido - 2- deoxy - D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6-8) HA 48の測定結果

500 MHz -匪 R δ；

1.998, 2.005， 2.016 (72Η, NAc), 4.024 (dd, 0.6H, J_li2=3.6Hz, J。，=10.6Hz， H-2a a ) ,

4.395-4.470 (m, GlcA- unit)，

4.498 (d, J₁₂=8.0Hz, H-lba),

4.537， 4.610(dX2, J₁₂=8.2Hz， J₁₂=7.8Hz, GlcNAc- unit) ,

4.700 (d, J_1>2=8.3Hz, H-laj3), 5.141 (d, 0.6H, J_1>2=3.6Hz, H-laa)

解析の基礎としたスぺクトルを図 38に示す。

この結果は、前記式（1) において n= 2 3で示される構造（Sodium j3 - D- glucopyranosyluronate- [ (l→3) - 2 acetamido— 2 - deoxy— β _D_glucopyranosyl - (丄 ^→ 4)- (Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ]₂₃-(l→ 3) -2-acetarai do-2-deoxy- D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6-9) HA 50の測定結果

500 MHz ^-NMR δ；

2.005， 2.017 (75Η, NAc), 4.024 (dd, 0.6H, J₁₂=3.6Hz， J₂,₃=10.6Hz， H-2a a ) , 4.390-4.470 (m, GlcA— unit) ,

4.498 (d, J₁₂=7.9Hz, H-lba),

4.537, 4.610 (dX2, J_li2=8.1Hz, J_1>2=8.1Hz, GlcNAc-unit) ,

4.701 (d, J₁₂=8.4Hz, H— la/3), 5.141 (d, 0.6H, J₁₂=3.6Hz, H—laa)

解析の基礎としたスぺクトルを図 3 9に示す。

この結果は、前記式（1) において n= 24で示される構造（Sodium β-Ό- glucopyranosyluronate- [ (1→3) - 2 - acetamido - 2 deoxy - β -D-glucopyranosyl- (1 → 4) -(Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ]₂₄- (1→ 3) - 2- acetamido - 2 - deoxy- D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(6-10) HA 52の測定結果

500 MHz 'H-NMR δ；

2.005, 2.017 (78Η, NAc), 4.024 (dd, 0.6H, J_li2=3.6Hz, J₂₃=10.6Hz, H-2a a ) , 4.375-4.475 (m, GlcA— unit)，

4.498 (d， J_h2=8.2Hz, H-lba),

4.536, 4.610(dX2, J_li2=8.1Hz, J₁₂=8. IHz, GlcNAc - unit)，

4.701 (d, J_li2=8.4Hz, H— la/3)， 5.141 (d， 0.6H, J_li2=3.4Hz, H—laa)

解析の基礎としたスぺクトルを図 40に示す。

この結果は、前記式（1 ) において n = 2 5で示される構造（Sodium β -D- glucopyranosyluronate- [ (1→3) -2-acetamido-2-deoxy- β -D-glucopyranosyl- (1 → 4)- (Sodium β -D-glucopyranosyluronate) ]₂₅-(l→ 3) - 2 - acetamido- 2- deoxy - D-glucopyranoseの構造）と矛盾しないものである。

(7) HAオリゴ糖以外の不純物

それぞれの画分について、以下の不純物の含量を測定した。

(7 - 1)タンパク質

タンパク質含量は、ゥシ血清アルブミンを標準物質として、 BioRad Protein Assay kit (BioRad社製）で測定した。

(7-2) DN A

DNAは、スレッシュホールド法（DNA測定装置：スレッシュホールド（米国モレキュラーデバイス社製)）で測定した。

(7-3)エンドトキシンエンドトキシンは、トキシカラーシステム（商品名；生化学工業株式会社製）を用いたリムルス試験法により測定した。 .

それぞれの画分中のタンパク質、 D NA及ぴェンドトキシンの含量の測定結果を表 7に示す。表 7

この結果から、本発明画分中のタンパク質および D N Aの含量はいずれも検出限界以下であり、またェンドトキシンの含量も実質的に影響がない程度であり、レ、ずれも実質的に含有しないと結論された。

(実施例 2 ) H s p発現の増強作用

ぐ材料等〉

(1)被験物質等

まず、本実施例において用いた被験物質等を説明する。

被験物質（カツコ内は以下で用いる略号を示す。また下記式中、 GlcAはダルクロン酸残基を、 GlcNAc は N-ァセチルダルコサミン残基を、 Gal はガラクトース残基を、（6S)は 6-0-硫酸エステルを、 -はグリコシド結合を、 Δは不飽和糖であることを表す。）

• H A飽和 2糖（HA 2 )

GlcA β 1 - 3GlcNAc

• HA不飽和 2糖（Δ ΗΑ 2 )

厶 GlcA j3 1 - 3GlcNAc • HA飽和 4糖（HA 4)

GlcA β l-3GlcNAc jS 1- 4GlcA β 1- 3GlcNAc

• HA不飽和 4糖（ΔΗΑ4)

AGlcA β l-3GlcNAc β l~4GlcA β l-3GlcNAc

• HA飽和 6糖（HA 6)

GlcA β 1- 3GlcNAc j31- 4GlcA β 1- 3GlcNAc j3 l_4GlcA j3 l-3GlcNAc

• HA不飽和 6糖 (ΔΗΑ6)

厶 GlcA j3 l-3GlcNAc j3 l-4GlcA β 1— 3GlcNAc j3 l-4GlcA β 1一 3GlcNAc

• HA飽和 8糖（HA 8)

GlcA j3 l-3GlcNAc j31- 4GlcA β l-3GlcNAc j3 l-4GlcA j31- 3GlcNAc β l-4GlcA β l-3GlcNAc

• HA飽和 10糖（HA10)

GlcA j31- 3GlcNAc j3 l-4GlcA β 1- 3GlcNAc j3 l-4GlcA β l-3GlcNAc β l-4GlcA j31- 3GlcNAc j3 l-4GlcA β 1 - 3GlcNAc

• HA飽和 12糖（HA12)

GlcA β 1- 3GlcNAc j31— 4GlcA β 1— 3GlcNAc β 1- 4GlcA β 1— 3GlcNAc j31- 4GlcA β 1 - 3GlcNAc j3 l-4GlcA β 1- 3GlcNAc β l-4GlcA β l-3GlcNAc

• HA飽和 2〜18糖の混合物（HA2- 18)

• HA飽和 8〜： L 4糖の混合物（HA8- 14)

• HA (重量平均分子量 84万； HA84)

• Gal (6S) j3 l-4GlcNAc (6S) (L 4)

• Gal (6S) l-4GlcNAc (6S) β 1- 3Gal (6S) β HGlcNAc (6S) (L 4 L4)

HA飽和オリゴ糖は、前記の製造例 1で製造された H Aオリゴ糖画分を使用した。

また HA不飽和オリゴ糖は、 HAをコンドロイチン AC- 1 リアーゼ（コンド口イチナーゼ AC Iフラボ；生化学工業株式会社製）で処理して得られた分解産物を、前記製造例 1と同様の方法で分画することにより得た（製造例 2参照)。

L 4及び L 4 L 4は、国際公開 W096/16973に記載の方法で調製した。被験物質は、以下の薬効薬理試験に応じて所定の濃度となるように生理食塩水に溶解して用いた。生理食塩水に溶解した後のェンドトキシン濃度はいずれも 0. 3 EUZmL以下であり、また鉄含量はいずれも 2◦ p pm以下であった。

(2)細胞、培地

K562細胞（JCRB0019；ヒト白血病細胞）、 PC- 12細胞（JCRB0733)

K 562細胞は、 10 %ゥシ胎仔血清 (FBS)を含有する RPMI 1640培地で培養した。

また P C _ 12細胞は、 10 %ゥマ血清および 5 %ゥシ新生仔血清 (FCS)を含有する DM EM培地（D -グルコース（1, 000 mg/l)、 L -グルタミン（4 mM)、ピルビン酸ナトリウム（110 rag/1)、炭酸水素ナトリウム（3.7 g/1)を含有する） 57

5 mlに、 20%グルコース水溶液を 10 ml添加した培地で培養した。く 1>HSF 1のリン酸化に対する作用

HSF1 (heat shock factor 1) 蛋白質は、 Hs p 70の転写因子であることが知られている（J. Biol. Chem. , 271, 3355 - 3358 (19%))。また HSF 1蛋白質は、リン酸ィ匕されることによって活性ィ匕し、このリン酸ィ匕は SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE)上でのパンドのシフト（見かけ分子量が約

66 kDaから約 81 kDaにシフトする）によって検出することができる。このことを利用して、各種サイズの H Aオリゴ糖をストレスを与えた K 562細胞に作用させて、上記バンドのシフトを検出することにより HS F 1のリン酸化 (活性化）の程度を調べた。

(1)実験 1

ΗΑ4、 ΔΗΑ4、 HA6、 HA8、 HA2-18および ΗΑ8- 14のそれぞれについて、前記細胞を含む培養液中に 1、 10または 100ng/ml となるように添加し、その後直ちに 42 °Cの環境下に移すことによって熱ショックを与え、 20分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を遠心分離によって回収し、 SDS- PAGE (ゲル濃度 10 %)を行った。次いで一次抗体として抗 H S F 1モノクローナル抗体 (Stressgene社製）を、二次抗体としてャギ抗マウス I g Gモノクローナル抗体 (Jackson Lab社製）を用いたウェスタンプロッティングを行い、 66 kDaのパンド（リン酸化されていない HSF 1)から 81 kD aのバンド（リン酸化された HSF 1)へのシフトを検出した。

その結果、 ΗΑ4、 ΔΗΑ4、 ΗΑ6および ΗΑ2- 18を添加した細胞において、 ΗΑオリゴ糖の添加量に依存して 81 kD aパンドへのシフトが見られた。 H A8 - 14でははっきりした変化は見られなかった。 HA8では逆にバンドシフトの阻害が見られた。

(2)実験 2

実験 1の再現性を確認するため、 ΗΑ4、 ΔΗΑ4、 ΗΑ8 および ΗΑ84を用いて、培養液への Η Αの添加量を 100n_g/mlのみとし、熱ショックを 43°Cとした以外は実験 1と同様にして、バンドシフトを検出した。結果を図 41に示す。図 41中、左から 1番目のレーンは 37。C条件下（HAオリゴ糖無添加）の細胞の抽出物、同 2番目のレーンは 43°C条件下（HAオリゴ糖無添加）の細胞の抽出物、最も右のレーンは標準としての HSF1 (バクテリア由来）を同様に検出したものである。

図 41より、 HA4および ΔΗΑ4 を添加した細胞において H S F 1のバンドのシフトが見られ、かつ 66及ぴ 81 kD aの両方の HS F 1自体の量も増加していた。一方 HA8では 66 kDaの HSF 1の量の増加は見られたが、 81 k Daへのバンドのシフトは見られなかった。また HA84では変化は見られなかつた。

(3)実験 3 (比較実験）

実験 2で観察された作用が、 HAオリゴ糖の糖鎖骨格構造に特異的なものであるか否かを調べるために、以下のコンドロイチンオリゴ糖を用いた比較実験を行つた。コンドロイチン（以下、 Chという）は、 HAにおける GlcNAc がガラクトサミン残基（GalNAc) に置換されている点のみが HAと異なっており、グリコサミノダリカンである点及び硫酸基を有していない点などは H Aと共通している。従って、 Chは HAと構造的に極めて類似した物質であるといえ、そのオリゴ糖についても同様である。

- Ch飽和 4糖 (Ch 4)

GlcA β 1 - 3GalNAc jS 1 - 4GlcA β l-3GalNAc

- Ch飽禾ロ 6糖 (Ch 6)

GlcA β 1 - 3GalNAc β 1- 4GlcA β 1 - 3GalNAc β 1- 4GlcA j31 - 3GalNAc

- Ch飽和 8糖 (Ch 8)

GlcA β 1一 3GalNAc β 1- 4GlcA j31- 3GalNAc β 1- 4GlcA β l_3GalNAc β 1— 4GlcA j3 l-3GalNAc

これらの C h飽和オリゴ糖は、 Nagasawa らの方法（Carbohyd. Res.， 141, P99-110, 1985)に準じて、 HCl を含有するジメチルスルホキシド (DMS0)で C hを処理して得られた分解産物を、陰イオン交換クロマトグラフィーでサイズごとに分画することによって得た。

これらのオリゴ糖を用いて、実験 2と同様の実験を行った。その結果、いずれの Chオリゴ糖を添加した細胞においても、 HSF 1のバンドのシフトあるいは HS F 1自体の量の増加は観察されなかった。

この実験から、 Chオリゴ糖には、 HAオリゴ糖において見られるような HS F 1の活' I"生ィ匕や発現増強作用がないことが示された。このことは、かかる作用が HAオリゴ糖の糖鎖骨格構造に特異的なものであることを示すものである。

これらの実験から、 H A 4糖及びこれを含む画分（HA2- 18)は、特に顕著に H S F 1を活十生ィ匕することが明らかとなつた。

<2>Hs の発現に対する作用

く 1〉より、 HA4糖がHs p 70の発現に必要な因子（HSF 1 )を他のサイズの H Aと比較してより顕著に活性ィ匕することが明らかになつたので、ストレスを与えた K 562細胞中の Hs pの発現が実際に HA 4糖の作用によって他のサィズの H Aを使用した場合よりもより顕著に増加している力否かを調べるため、以下の実験を行った。

ΗΑ2、 Δ ΗΑ4、 HA6、 HA 8 4及び L 4 L 4のそれぞれについて、前記細胞を含む培養液（3 7 °C) 中に 1、 10または 100ng/ml となるように添カ卩した。その後直ちに 4 3 °Cの環境下に移すことによって熱ショックを与え、 2 0分間ィンキュペートした。その後培養液を 3 7 °Cに戻してさらに 2時間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって回収し、上記く 1〉と同様に SDS- PAGE を行つた。次いで一次抗体として抗 H s p 7 2モノクローナル抗体 (Amershara社製）を、二次抗体としてャギ抗ゥサギ I g Gモノクローナル抗体（Jackson Lab社製）を用いたウェスタンブロッテイングを行い、 H s p 7 2を検出した。 H s p 7 2は、 H s p 7 0フアミリーのメンバーの 1つで、最も代表的なものであり、ストレスにより発現が誘導及び増強されることが知られている。

結果を図 4 2に示す。図 4 2の aにおける最も左のレーンは熱ショックを与えず (37°C)、かつ被験物質を加えずに同様に H s p 7 2を検出したものであり、最も右のレーンはスタンダードの H s p 72 (バクテリア由来 H s p 7 2 ； b H s p 7 2 )を同様に検出したものである。図 4 2中の bは、熱ショックを与えない細胞に Δ ΗΑ4を添加した際の H s p 7 2の発現を同様に検出したものである。図 4 2の aに示した結果から明らかな通り、熱ショック（43°C)を与えた場合 (左から 2番目のレーン）、 37°Cで被験物質無添加とした場合（最も左のレーン）と比較して H s pの発現が増強された。また、各 HAオリゴ糖の存在下では H s pの発現がさらに増強され、 Δ ΗΑ4 の存在下では H s ρの発現が特に強力に増強された（左から 3〜 5番目のレーン）。

このように、 Δ ΗΑ4 を添加した細胞（熱ショックを与えたもの）においては H s p 7 2の強い発現が見られたが、他のサイズの HAを添加した細胞では Δ Η A4を添力！]した場合のような強い H s p 7 2の発現増強は見られなかった。

また熱ショックを与えない細胞においては、 Δ ΗΑ4 による H s 7 2の発現の増強は見られなかった。このことから HA 4糖は、ストレスがない条件下では H s pの発現にほとんど影響を与えないにもかかわらず、一旦ストレスが負荷されると、極めて急速かつ顕著に H s Pの発現を増強することが明らかになった。

< 3 >細胞死の抑制作用

上記実験により、 HA4糖がストレス下で細胞中の Hs pの発現を他のサイズの HAオリゴ糖よりも強く増強することが明らかになったことから、 HAオリゴ糖が実際にストレスに曝された細胞の死をより強く抑制するか否かを調べるため、以下の実験を行った。 '

PC— 12細胞は、血清を含まない培養液中ではアポトーシスに陥ることが知られている。

そこで ΔΗΑ2、 ΗΑ4、 ΔΗΑ4、 ΗΑ6、 ΔΗΑ6、 ΗΑ8、 ΗΑ10、 ΗΑ12、 ΗΑ84、 L4、 L4L4のそれぞれを、 PC— 12細胞を含む（血清含まない）培養液中に 10 Ong/ml の濃度となるように添カ卩し、 24時間後に細胞をトリパンブルーで染色し、全細胞数に対する生存細胞（トリパンプル一で染色されなかつた細胞）数の割合を算出した。

結果を図 43に示す。図 43の結果から判る通り、 HA4糖、特に HA4は、他のサイズの H Aオリゴ糖ゃ他の種類のオリゴ糖に比して、顕著に細胞死を抑制した。

< 4〉細胞組織保護作用

1. 臓器保存の面から見た細胞 '組織保護作用

(1)臓器保存液の調製

100ng/mlの HA 4糖を含むユーロコリンズ液（Euro- Collins液； Am. J. Surg. , 179， pi 54- 160 (2000))を被験溶液（以下、「HA4( + )J とも表記する）とした。対照として、ユーロコリンズ液（以下、「HA4(—）」とも表記する）を用いた。

(2)被験物質の投与等

11週齢の SD系雄ラットを、「HA4(+)」使用群 (n=5)、「HA4(— )」使用群 (n=5)、および正常群 (n= 5)に分けた。開腹して臓器（肝臓）を摘出後、「HA4(+)」使用群および「HA4 (—）」使用群に、それぞれの溶液約 4 Oral を、脱血して肝全体の色が薄くなるまで灌流した後、 37°Cで 2時間インキュべ一トした。

(3)評価

インキュベート後、各群の臓器の湿重量/乾重量比（組織傷害による浮腫の程度の指標）の算出、 HE染色した組織切片の光学顕微鏡観察（肉眼による組織傷害程度の観察）、クロマチン濃縮の画像解析おょぴ TUNE L法（Terminal deoxynucleot i dy 1 transferase (TdT) -mediated nick end labeling method; J. Cell. Biol., 119, p493-501 (1992))による解析 (細胞死の程度の評価) を行つた。

(3 - 1)臓器の湿重量 Z乾重量比の結果を図 44に示す。なお図 44中の *は、 pく 0.05 (Williams multiple range test)で有意差があることを示す。

図 44の結果から、「HA4(+)」使用群は、「HA4(—）」使用群に比して有意に湿重量/乾重量比が低下していた。このことから、 HA 4糖は臓器の保存により引き起こされる組織傷害による浮腫を有意に抑制することが示された。

(3-2) HE染色した組織切片の光学顕微鏡観察の結果、「HA4(_)」使用群では浮腫、組織融解（細胞質の消失)、核濃縮等が観察された。これに対し、「HA4 (+)」使用群は正常群とほぼ同様の像が観察され、「HA4 (—）」に見られるような顕著な組織傷害は観察されなかった。

(3-3)クロマチン濃縮の画像解析

細胞死の程度を評価する 1方法として、 HE染色した #且織切片を用いて、細胞のクロマチン濃縮の画像解析（Image-Pro PLUSTM Version 3.0.1 ； Media Cybernetics製）を行い、画像濃度を比較した。細胞死が起きてクロマチンが濃縮すると、その部分は HEによって濃く染色される。クロマチンが濃縮している細胞が多いほど顕微鏡画像全体の濃度が高まるため、これを指標に評価した。結果を図 45に示す。なお図 45中の *は、 pく 0.05 (Williams multiple range test)で有意差があることを示す。

図 45の結果から、「HA4(—）」使用群では正常群に比して有意に画像濃度が高まったが、「HA4(+)」使用群は正常群に比して有意な画像濃度の上昇は見られなかった。

(3-4) T U N E L法による解析

細胞死の程度を評価する 1方法として、 TUNE L法を用いた DN Aの断片化の程度を角军析した。細胞がアポトーシスを起こすと D N Aが断片化することが知られている。 TUNE L法は DNAの末端を染色する方法であり、 DNAが断片化されている細胞が多いと TUNE L染色の程度が高まることから、細胞死（ァポトーシス）の程度の指標とすることができる。

保存後の組織切片を TUNE L染色して光学顕微鏡で肉眼観察し、 1mm² あたりの TUNE L染色細胞数をカウントした。併せて、それぞれの組織切片ごとの組織障害の程度を、「重度」、「中度」、「軽度」、「極めて軽度」の 4段階で評価した。なおこの評価は、客観性を確保するためにブラインドで行った。前者の結果を図 46に、後者の結果を図 47に示す。なお図 46中の *は、 pく 0.05 (Williams multiple range test)で有意差があることを示す。

図 46の結果から、「HA4(—）」使用群では TUNE L染色された細胞が極めて多く観察されたのに対し、「HA4( + )J 使用群では TUNE L染色された細胞は極めて少なく、ほぼ正常群と同程度であった。また図 47の結果から、「H A4 (-)j 使用群では「重度」「中度」の組織障害が 8割の組織切片で観察されたが、「HA4 ( + )」使用群では「重度」の組織障害は観察されず、 2割の組織切片で「中度」の組織障害が観察されるに止まった。

以上の結果から、 HAオリゴ糖（HA4糖）は、臓器保存の面において優れた細胞 ·組織保護効果を有することが明らかになった。

2. 潰瘍に対する効果の面から見た細胞 ·組織保護作用 (1)投与用被験溶液の調製

被験物質をカルボキシメチルセルロース（CMC) に溶解し、投与用の被験溶液とした。濃度は、後述の投与量に応じ、かつ投与液量が 10ml/k_gとなるように決定した。

また陽性対照溶液として、既存の胃炎 · 胃潰瘍治療剤（tepr_enone、 geranylgeranylacetone；商品名セノレベックス；エーザィ) を CMCに溶角军したものを用いた。濃度は、投与量 lmg/kg (臨床用量)、かつ投与液量が lOml/kg となるように決定した。陰性対照溶液としては 0.5% CMCを用いた。

(2)被験物質の投与等

5週齢の S D系雄ラットを、「陰性対照溶液」投与群（n== 8)、「HA4 4mg/kgJ 投与群 (n=8)、「HA4 20mg/kg」投与群 (n=8)、「HA4 lOOmg/kgj 投与群 (n=8)および「陽性対照溶液」投与群 (n=8)に分けた。

第 1回目の投与の前日の 16:00から各群のラットを絶食させ、その翌日の 8:00 に上記各溶液を経口投与した後に水浸拘束した。水浸拘束は翌日の 8:00まで（24 時間)行った。途中、 16:00および 24:00 に第 1回目投与と同様に各溶液を投与した。

その後各ラットを解剖し、胃を摘出した。摘出した胃は 10%緩衝ホルマリンを注入して膨張させて襞を伸ばして固定した。その後、胃壁に付着している血液を水洗した除去した。

(3)評価

黒褐色に変性している潰瘍部の面積率（潰瘍面積 Z腺胃の面積）を画像解析装置（Image - Pro PLUSTM Version 3.0.1； Media Cybernetics製）で測定した。結果を図 48に示す。なお図 48中の *および **は、それぞれ pく 0.05 および pく 0.01 (Williams multiple range test)で有意差があることを示す。

図 48の結果から、 HA 4を投与した群はいずれも陰性対照溶液投与群に比して有意に潰瘍部の面積率が低下していた。特に HA4 20mg/kg投与群および同 06

lOOmg/kg投与群は、陽性対照溶液群よりも潰瘍部面積率が低かった。

以上の結果から、 HAオリゴ糖（HA4糖）は、潰瘍に対する効果の面においても、優れた細胞 ·組織保護効果を有することが明らかになつた。また HAォリゴ糖の経口投与によっても、上記のような優れた効果が得られることが明らかとなった。さらに、この実験では HAオリゴ糖（HA4糖）を予め投与した後に水浸拘束しており、かつ、潰瘍が発生するまでには水浸拘束開始後しばらく時間を要することから、この実験の結果は H Aオリゴ糖（HA4糖）が予防効果を有することを示しているともいえる。

3. 肝障害に対する効果の面から見た細胞 ·組織保護作用

実験 1 四塩ィ匕炭素モデルを用いた実験

(1)投与用被験溶液の調製

被験物質を生理食塩液に溶解し、投与用の被験溶液とした。濃度は、後述の投与量に応じ、力つ投与液量が 5 ml/kgとなるように決定した。

また陽性対照溶液として、後述の四塩化炭素肝障害モデルに対する効果が報告されている（薬物療法、第 9卷、特集号 p46- 53) FAD (フラビンアデ-ンジヌクレオチド；わかもと製薬）を、投与量 10mg/k_gで用いた。また陰性対照溶液としては生理食塩液を用いた。

(2)被験物質の投与等

5週齢の S D系雄ラットを、「陰性対照溶液」投与群（n= 8)、「HA4 2rag/kgj 投与群 (_η=8)、 ΓΗΑ4 lOrag/kgJ 投与群 (n=8)、「HA4 50mg/kgj 投与群 (n= 8)および「陽性対照溶液」投与群 (n=8)、「正常群」（n=8)に分けた。

第 1回目の投与の前日の 16:00から各群のラットを絶食させ、その翌日の 8:00 前に四塩化炭素（CC1₄)を 100mg/kg経口投与した。その後 8:00 に上記各溶液を腹腔内投与した。その後絶食状態のまま飼育し、 16:00および²⁴: 00に第 1回目投与と同様に各溶液を投与した。 24:00 の投与後に給餌し、翌日 8:00 に各ラットを角军剖した。 (3)評価

解剖後、血液を採取して、 GOT活性及び白血球数の測定を行った。 GOT活性の測定は臨床化学自動分析装置 (COBAS MIRA S；日本ロシュ）を用い、白血球数の測定は自動血球測定装置（Sysmex K- 2000； Sysmex社製）を用いて行った。

前者の結果を図 4 9、後者の結果を図 5 0に示す。なお図 4 9および図 5 0中の *は、 pく 0. 05 (Williams multiple range test)で有意差があることを示す。図 4 9より、 HA 4 50rag/ml 投与群において、陰性対照溶液投与群に比して有意な GOT活性の低下が見られた。また図 5 0より、いずれの H A 4投与群においても、陰性対照溶液投与群に比して有意な末梢白血球数の減少が見られ、 F A Dに比しても白血球数が減少していた。このことから、 HA 4糖は肝障害に対する効果の面からも細胞 ·組織保護効果を有することが明らかになった。さらに、この実験では四塩化炭素を予め投与した後に H Aオリゴ糖（HA 4糖）を投与しているが、四塩化炭素によって肝障害が発生するまでには四塩化炭素投与後しばらく時間を要することから、この実験の結果は H Aオリゴ糖（HA 4糖）が予防効果を有することを示しているともいえる。

また本実験においては、末梢血中の I L一 1 0および I L— 8の濃度も併せて測定した。

I L一 1 0は、ストレス蛋白質（細胞がストレスを受けると発現し、細胞を保護する作用を有する蛋白質）の一種である Hsp70と関連していることが報告されており（J. Immunol. , 164 (5) , ρ2711-2717 (2000) )、またコンカナパリン Αによって惹起された肝炎を I L— 1 0が抑制したとの報告もある（Autoimmunity, 31 (2) , p75-83 1999)。

また I L—8は、力ドミゥムゃアルコールによる肝障害モデルにおいて、発現量が上昇していることが明らかとなっており（Toxicology and Applied Pharmacology, 163, p231-9 (2000) , Acta Gastro-Enterologica Belgica, 57 (3 - 4)， P255-9 (1994) )、さらに Hsp70の発現誘導により I L一 8の発現が抑制されたとの報告もある（Journal of Immunology, 164, p5416-23 (2000) )。

末梢血中の I L _ 1 0は、 IL - 10 Rat ELISA(END0GEN社製）で測定した。 I L —8は、パナテスト Aシリーズラット CINC- 1 (IL-8) (株式会社パナファームラボラトリーズ）で測定した。 I L— 1 0の測定結果を図 5 1に、 I L一 8の測定結果を図 5 2に示す。なお図 5 1および図 5 2中の * *は、 pく 0. 01 (Williams multiple range test)で有意差力 Sめることを示す。

図 5 1より、 H A 4の投与量依存的に血中 I L一 1 0濃度が増加しており、 H A 4 50mg/kg投与群においては陰性対照溶液投与群に比して血中 I L一 1 0濃度が有意に高いことがわかる。また図 5 2より、 HA 4の投与量依存的に血中 I L _ 8濃度が減少していることがわかる。

この結果から HAオリゴ糖（HA 4糖）は、 I L— 1 0の産生促進効果おょぴ I L— 8の産生抑制効果をも有していることが明らかとなった。このことから、 HAオリゴ糖（HA 4糖）は I L— 1 0の産生促進や I L一 8の産生抑制を介して前記細胞 '組織保護効果を発揮する可能性も考えられる。また HAオリゴ糖 (H A 4糖）は、 I L一 1 0の減少や I L— 8の増加に起因する疾患や、 I L一 1 0 の産生促進や I L一 8の産生抑制が求められる疾患等の処置剤としても利用しうることが示された。実験 2 コンカナパリン Aモデルを用いた実験

HAオリゴ糖（HA 4糖）力 \ 四塩化炭素モデル以外の肝障害モデルにも有効か否か確認するために、コンカナバリン Aモデ ·/レを用いた実験を行った。

(1)投与用被験溶液の調製

投与用の被験溶液の調製、濃度、投与量、および投与液量等については、実験 1と同様である。

また陽性対照溶液として、強力ネオミノファーゲン C (Stronger Neo - Minophagen C；ミノファーゲン製薬）を、投与量 5 mg/kg で用いた。この量は当該薬剤の最高の臨床用量である。また陰性対照溶液としては生理食塩液を用いた。 (2)被験物質の投与等

8週齢の Balbんマウスを、「陰性対照溶液」投与群 (n= 12)、「HA 4 2rag/kgJ 投与群（n = 12)、「HA 4 10mg/kg」投与群 (n= 12)、「HA 4 50mg/kg」投与群 (n = 12)および「陽性対照溶液」投与群 (_n= 12)、「正常群」（n=8)に分けた。

コンカナパリン A (ConA;シグマ社）を 15mg/kg尾静脈投与した。その後上記各溶液を尾静脈投与した。その後 24時間飼育した。

(3)評価

腹部大静脈より全血液を採取し、臨床化学自動分析装置 (COBAS MIRA S；日本ロシュ）を用いて GPT活性及び GOT活性を測定した。また肝臓を摘出して、肝臓の状態を肉眼で評価した。

その結果、 GPT の平均値は「陰性対照溶液」投与群で約 5 6 0 0 (I. U. /L)であつた。これに対し「HA 4 10mg/kgJ 投与群及び「HA 4 50mg/kgj 投与群ではそれぞれ約 2 2 0 0 (I. U. /L)及び約 1 2 0 0 (I. U. /L)であり、いずれも「陰性対照溶液」投与群に対して有意に低かった（p〈0. 01； Dunnett の多重比較検定)。なお、「陽' I"生対照溶液」投与群は約 4 0 0 0 (I. U. /L)であった。

また、 GOTの平均値は「陰性対照溶液」投与群で約 6 0 0 0 (I. U. /L)であった。これに対し「HA 4 10mg/kgJ 投与群及ぴ「HA 4 50mg/kgJ 投与群ではそれぞれ約 2 0 0 0 (I. U. /L)及ぴ約 1 0 0 0 (I. U. /L)であり、いずれも「陰性対照溶液」投与群に対して有意に低かった（pく 0. 01； Dunnett の多重比較検定)。なお、「陽性対照溶液 J 投与群は約 4 4 0 0 (I. U. /L)であった。

また肝臓の肉眼所見の結果、「HA 4 10mg/kg」投与群及び「HA 4 50mg/kgJ は、いずれも「陰性対照溶液」投与群および「陽性対照溶液」投与群に対して障害の程度が低かった。

このことから、 HAオリゴ糖（HA 4糖）はコンカナパリン Aによって惹起される肝障害に対しても効果を発揮することが示され、 HAオリゴ糖（HA 4糖）が種々の肝障害に対して有効であることが示唆された。さらにこの実験も四塩ィ匕炭素モデルと同様に、 HAオリゴ糖（HA 4糖）が予防効果を有することを示しているともいえる。

なお本発明の各剤は、そもそも HAオリゴ糖自体の安全性が高いことに加え、上記実施例の結果からも、その安全性が推定される。産業上の利用可能性

本発明オリゴ糖は、本発明医薬の有効成分等として有用である。

本発明画分は、所望のサイズの H Aオリゴ糖を含有し、他のサイズのオリゴ糖その他の不純物を実質的に含有しない HAオリゴ糖画分であり、 HAオリゴ糖の生理活性探索用の試薬、分析用のスタンダード、医薬品自体ないしその素材として極めて有用である。

本発明オリゴ糖を有効成分とする医薬、特に H s p発現増強剤は、前記実施例の結果からも明らかな通り、特定サイズの H Aオリゴ糖が、他のサイズの HAォリゴ糖には見られない顕著な効果を発揮することから極めて有用である。さらに、この特定サイズの H Aオリゴ糖を選択することにより、他のサイズの H Aオリゴ糖と同一の効果を維持しつつ投与量を減少させることもできることから、より安価かつ安全性の高い剤としうる点においても、極めて有利である。

さらに、本発明オリゴ糖を有効成分とする細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、及び細胞 ·組織保護剤（例えば、臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、 I L一 1 0産生促進剤、または I L一 8産生抑制剤）は、前記実施例の結果からも明らかな通り、優れた薬理効果を発揮し、かつその安全性も高いことから極めて有用である。

Claims

請求の範囲

1. 4糖〜 60糖から選択されるサイズを有するヒアルロン酸オリゴ糖。

2. 請求項 1に記載のヒアルロン酸オリゴ糖を含有し、かつ、下記（1)〜（6) に示す理化学的性質を有することを特徴とする画分。

(a) 210 nmの吸収で検出した場合、画分中の全 H Aオリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 85%以上である。

(2) 当該画分を、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて 210 nmの吸収で検出して分析すると、実質的に単一なピークを示し、かつ、画分中の全ヒアル口ン酸ォリゴ糖のピーク面積の和に対する前記実質的に単一なピークの相対面積が 90%以上である。

(4) 当該画分を構成する H Aオリゴ糖のモノアイソトピック分子量又は平均分子量の理論値を 1とした場合、当該画分の質量分析による実測値が 0 · 997〜 1. 003 (相対値）である。

(5) 当該画分を構成する HAオリゴ糖における炭素（C)、水素（H) および窒素（N) のそれぞれの含量比の理論値（重量％) と、当該画分を元素分析することによって得られるそれぞれの元素の実測値（重量⁰ /₀) との差が、いずれも土 1 (重量％) である。

(6) タンパク質、 DNAおよびエンドトキシンを実質的に含有しない。

3. さらに下記 (7) の理ィヒ学的性質を有することを特徴とする請求項 2に記載の画分。

(7) 当該画分の¹ H— NMRおよび¹³ C— NMR測定の結果が、下記式（1) で示される HAオリゴ糖の構造と矛盾しない。 · 式（1)

(式中、 nは 1〜29の整数であり、 Mはプロトン又は 1価のカチオンを示し、 Acはァセチル基を示す。）

4. ヒアルロン酸オリゴ糖が、 4糖〜 20糖のサイズから選択されることを特徴とする、請求項 2または 3に記載の画分。

5. ヒアルロン酸オリゴ糖が、 4糖〜 16糖のサイズから選択されることを特徴とする、請求項 2または 3に記載の画分。

6. ヒアルロン酸オリゴ糖が 4糖である、請求項 2または 3に記載の画分。 7. 請求項 1に記載のヒアル口ン酸ォリゴ糖を有効成分とする医薬。

8. 請求項 1に記載のヒアルロン酸オリゴ糖として請求項 2または 3に記載の画分を使用する請求項 7に記載の医薬。

9 . 医薬が、熱ショック蛋白質発現増強剤、細胞死抑制剤、細胞障害抑制剤、及び細胞 ·組織保護剤から選ばれるものである、請求項 7または 8に記載の医薬。

1 0 . 細胞 ·組織保護剤が、臓器保存剤、潰瘍処置剤、肝障害処置剤、 I L一 1 0産生促進剤、及び I L一 8産生抑制剤から選ばれるレ、ずれかの剤であることを特徴とする、請求項 9に記載の医薬。

1 1 . ヒアルロン酸オリゴ糖が、 4糖〜 2 0糖のサイズから選択されることを特徴とする、請求項 7〜1 0のいずれか 1項に記載の医薬。

1 2 . ヒアルロン酸オリゴ糖が、 4糖〜 1 6糖のサイズから選択されることを特徴とする、請求項 7〜1 0のいずれか 1項に記載の医薬。

1 3 . ヒアルロン酸オリゴ糖が 4糖である、請求項？〜 1 0のいずれか 1項に記載の医薬。