WO2013125634A1 - ヒアルロン酸フラグメントを有効成分とするサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、及びｔｌｒ４作用剤 - Google Patents

ヒアルロン酸フラグメントを有効成分とするサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、及びｔｌｒ４作用剤 Download PDF

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浅利　晃
ジェルーン コデエ
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Definitions

  • the present invention relates to a sirtuin inducer, a tissue repair agent, a hepatocyte growth factor inducer, a tissue homeostasis maintenance agent, and a TLR4 agonist that contain a hyaluronic acid fragment as an active ingredient.
  • Hyaluronic acid is known as a natural polymer that constitutes the extracellular matrix of joints, skin, brain and the like, and has been conventionally used as a moisturizing ingredient in pharmaceuticals and cosmetics.
  • Hyaluronic acid is a polysaccharide in which disaccharide units of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine are linked, and is classified into high molecular weight hyaluronic acid, low molecular weight hyaluronic acid, or hyaluronic acid fragment depending on its molecular weight. .
  • the molecular weight of high molecular weight hyaluronic acid is generally about 100,000 to 1,000,000.
  • the molecular weight of the low molecular weight hyaluronic acid is about 10,000 to 100,000.
  • the molecular weight of the hyaluronic acid fragment is about 400 to 10,000 (Non-Patent Document 1).
  • hyaluronic acid has various physiological activities in vivo, and the physiological activity varies greatly depending on the molecular weight (Non-patent Document 2).
  • hyaluronic acid fragments are considered to be very different from high molecular weight hyaluronic acid and low molecular weight hyaluronic acid.
  • its function and utility have not been clarified yet.
  • An object of the present invention is to provide a sirtuin inducer, tissue repair agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintenance agent, or TLR4 agonist using a hyaluronic acid fragment.
  • a sirtuin comprising, as an active ingredient, a hyaluronic acid fragment selected from sizes of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof Inducer.
  • the sirtuin inducer according to any one of the above [1] to [3], which is used in the form of a pharmaceutical, a functional food, or a cosmetic.
  • a tissue comprising, as an active ingredient, a hyaluronic acid fragment selected from sizes of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof Repair agent.
  • tissue repair agent according to [6] above wherein the hyaluronic acid fragment is a trisaccharide or tetrasaccharide hyaluronic acid fragment.
  • the tissue repair agent according to any one of [6] to [8] which is used for repairing a cornea, skin, epithelial tissue, nerve tissue, or myocardial tissue.
  • a liver comprising as an active ingredient a hyaluronic acid fragment selected from a size of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof Cell growth factor inducer.
  • a hyaluronic acid fragment selected from a size of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof Cell growth factor inducer.
  • the hepatocyte growth factor inducer according to any one of [11] to [13], which is used for treatment and / or prevention of liver damage or organ preservation.
  • a tissue comprising, as an active ingredient, a hyaluronic acid fragment selected from sizes of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof Homeostasis maintenance agent.
  • tissue homeostasis maintaining agent according to the above [16], wherein the hyaluronic acid fragment is a hyaluronic acid fragment selected from a size of 3 to 10 sugars.
  • tissue homeostasis maintenance agent according to [16] above, wherein the hyaluronic acid fragment is a trisaccharide or tetrasaccharide hyaluronic acid fragment.
  • tissue homeostasis maintenance agent according to any one of the above [16] to [18], which is used for maintaining stem cell nature of cells in a tissue and inducing differentiation.
  • tissue homeostasis maintenance agent according to any one of the above [16] to [18], which is used in the form of a pharmaceutical, a functional food, or a cosmetic.
  • a TLR4 comprising, as an active ingredient, a hyaluronic acid fragment selected from sizes of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof Agent.
  • the hyaluronic acid fragment is a trisaccharide or tetrasaccharide hyaluronic acid fragment.
  • a hyaluronic acid fragment selected from sizes of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a pharmaceutically acceptable solvate thereof as an active ingredient
  • the expression of the sirtuin protein can be promoted.
  • heart disease, arteriosclerosis, osteoporosis, inflammatory bowel disease, dementia, stroke, metabolic syndrome, cancer, lung disease, kidney disease, diabetes, osteoarthritis, rheumatism, progeria, radiation disorder, muscle disease, brain It is effectively used for the treatment and / or prevention of developmental disorders, neurological diseases, hypertension, or obesity, or aging control.
  • tissue repair agent of the present invention a hyaluronic acid fragment selected from a size of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof as an active ingredient
  • the tissue can be repaired. Therefore, for example, it is effectively used for the repair of cornea, skin, epithelial tissue, nerve tissue, or myocardial tissue.
  • hepatocyte growth factor inducer of the present invention a hyaluronic acid fragment selected from a size of 2 sugars to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable solvate thereof is effective. Since it is contained as a component, it is possible to promote the expression of hepatocyte growth factor. Therefore, for example, it is effectively used for treatment and / or prevention of liver damage or organ preservation.
  • tissue homeostasis maintenance agent of the present invention a hyaluronic acid fragment selected from a size of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a pharmaceutically acceptable solvate thereof as an active ingredient
  • the tissue homeostasis can be maintained.
  • it is effectively used to maintain stem cell nature of cells in tissue and induce differentiation.
  • a hyaluronic acid fragment selected from a size of 2 to 20 sugars, a pharmaceutically acceptable salt thereof or a pharmaceutically acceptable solvate thereof as an active ingredient Therefore, the action via TLR4 can be exhibited.
  • it is effectively used for the treatment and / or prevention of diseases in the cornea, skin, liver, nerve tissue, kidney, lung, heart, skeletal muscle, pancreas, or blood vessels.
  • FIG. 2 is a photograph showing a stained image obtained by staining human epidermal keratinocytes with an anti-human SIRT1 antibody in Test Example 1.
  • FIG. 6 is a chart showing the results of sirtuin protein expression levels in Test Example 1. 6 is a chart showing the results of sirtuin enzyme activity (sirt1 enzyme activity) in a cell lysate in Test Example 2. 4 is a photograph showing a stained image obtained by staining human epidermal keratinocytes with anti-human SIRT1 antibody in Test Example 3.
  • FIG. 10 is a chart showing the results of changes in the size of human epidermal keratinocytes in Test Example 3.
  • FIG. 10 is a photograph showing a stained image obtained by staining human epidermal keratinocytes with anti-human SIRT1 antibody in Test Example 4.
  • FIG. It is a graph which shows the result of the cell number per unit visual field area of the cell which is dividing in Test Example 4, the form is smaller than other cells, and the sirtuin protein is highly expressed.
  • 10 is a chart showing the results of the number of cells per unit visual field of cells that are dividing in Test Example 5 and whose morphology is smaller than other cells and in which the sirtuin protein is highly expressed.
  • 10 is a chart showing the results of the number of cells per unit visual field of cells that are dividing in Test Example 6 and whose morphology is smaller than other cells and in which the sirtuin protein is highly expressed.
  • human neural stem cells (Gibco human neural stem cells (H9-Derived)) are double-stained with an anti-human Nestin antibody and an anti-human tubulin antibody.
  • 10 is a chart showing the results of expression levels of sirtuin proteins in Test Example 8.
  • 10 is a photograph showing a stained image of human colon epithelial cells (HT29 cells) stained with anti-NF-kappaB antibody in Test Example 9.
  • 12 is a chart showing the results of the expression level of NF-kappaB in Test Example 9.
  • 10 is a chart showing the results of the expression level of NF-kappaB in Test Example 10. It is a photograph of the appearance of the cornea of a rabbit eye when 24 hours have elapsed since the cornea was damaged in Test Example 11.
  • part at the time of 24 hours passing after damaging a cornea in the test example 11 is shown with the graph.
  • the state of the cornea of the rabbit eye when 48 hours have elapsed since the cornea was damaged in Test Example 11 was photographed.
  • part at the time of 48-hour progress after damaging a cornea in the test example 11 is shown with the graph.
  • the cornea tissue of a rabbit eye was stained with hematoxylin and eosin when 33 hours had passed since the cornea was damaged. It is a microscope picture of the woven section of the liver after preserve
  • FIG. 16 is a chart showing the results of blood GOT values in Test Example 15. It is a graph which shows the result of the antiaging effect of the hyaluronic acid fragment with respect to the human large intestine epithelial cell (HT29 cell) which induced aging in Test Example 16. It is a graph which shows the result of the antiaging effect of the hyaluronic acid fragment with respect to the human large intestine epithelial cell (HT29 cell) which induced aging in Test Example 17.
  • FIG. 16 is a chart showing the results of the aging inhibitory effect of hyaluronic acid fragments on human colon epithelial cells (HT29 cells) induced in aging in Test Example 18.
  • FIG. 19 is a chart showing the results of the antiaging effect of hyaluronic acid fragments on human oral cavity-derived epithelial cells (Ca9-22 cells) in which aging was induced in Test Example 19.
  • FIG. 19 is a chart showing the results of aging inhibitory effects of hyaluronic acid fragments on human neural stem cells (Gibco human neural stem cells (H9-Derived)) induced in Test Example 20.
  • Example 22 is a chart showing the results of the antiaging effect of hyaluronic acid fragments on rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells induced in aging in Test Example 21. It is a graph which shows the result of having detected the keratinocyte marker Keratin K14 in human epidermal keratinocytes in Test Example 22. It is a graph which shows the result of having detected the keratinocyte marker Filagrin in the human epidermal keratinocytes in Test Example 23.
  • the hyaluronic acid fragment used in the present invention contains at least a disaccharide unit formed by glycosidic bonding of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, which is a structural unit of hyaluronic acid. Means the size of Specifically, it is a hyaluronic acid fragment having a structure represented by the following formula (1), formula (2), formula (3) or formula (4).
  • GlcA (-GlcNAc-GlcA) n -GlcNAc (1)
  • GlcA represents a glucuronic acid residue
  • GlcNAc represents an N-acetylglucosamine residue
  • ⁇ represents a glycosidic bond
  • n represents an integer of 0 to 9.
  • GlcA represents a glucuronic acid residue
  • GlcNAc represents an N-acetylglucosamine residue
  • ⁇ represents a glycosidic bond
  • n represents an integer of 0 to 9.
  • GlcNAc (-GlcA-GlcNAc) n -GlcA (3)
  • GlcA represents a glucuronic acid residue
  • GlcNAc represents an N-acetylglucosamine residue
  • ⁇ represents a glycosidic bond
  • n represents an integer of 0 to 9.
  • the hyaluronic acid fragment used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above-mentioned basic structure, and its sugar moiety is modified.
  • some or all of the sugar hydroxyl groups may have undergone esterification, etherification or the like.
  • Some or all of the carboxyl groups of glucuronic acid may be subjected to esterification, amidation, and the like.
  • the sugar located at the non-reducing end can be a saturated sugar (one that does not contain a double bond in the carbon-carbon bond in a monosaccharide) or an unsaturated sugar (a double bond in the carbon-carbon bond in a monosaccharide). May be included).
  • the hyaluronic acid fragment has a size of 2 to 20 sugars, it easily penetrates into tissues and cells. In addition, it is suitable for efficient application due to its low viscosity. More preferably, the size is from 3 sugars to 10 sugars. According to this, it is easier to penetrate into tissues and cells. Moreover, it is even more suitable for efficient application due to its low viscosity. Most preferably, the size is trisaccharide or tetrasaccharide. According to this, in addition to the above effects, the effects on tissues and cells are remarkably superior to those of other sizes.
  • a pharmaceutically acceptable salt of a hyaluronic acid fragment can also be used.
  • the salts include sodium salts and potassium salts which are alkali metal salts.
  • anhydrous salts not only anhydrous salts but also hydrated salts may be included.
  • the salt may be derived from the raw material or may be brought in during the preparation of the hyaluronic acid fragment. These salts function in the same manner as hyaluronic acid fragments, for example, by ionization in solution or in vivo.
  • a pharmaceutically acceptable solvate of a hyaluronic acid fragment can also be used.
  • solvates include hydrates.
  • it may be brought in at the time of preparation of a hyaluronic acid fragment.
  • These solvates function in the same manner as hyaluronic acid fragments, for example, by ionization in solution or in vivo.
  • the hyaluronic acid fragment, pharmaceutically acceptable salt thereof, or pharmaceutically acceptable solvate thereof may be used alone or in combination of two or more. That is, the size and molecular structure of the hyaluronic acid fragment may be single, a combination of these different hyaluronic acid fragments, or a composite containing a plurality of these different hyaluronic acid fragments may be used. Further, the salt or solvate may be a single species, a combination of different types thereof, or a composite containing those different types.
  • the hyaluronic acid fragment used in the present invention may be one extracted from natural products such as animals, one obtained by culturing microorganisms, or one synthesized chemically or enzymatically. May be.
  • hyaluronic acid that can be obtained from a living tissue such as a chicken crown, umbilical body, skin, and joint fluid by a known extraction method is subjected to a decomposition treatment such as enzymatic decomposition, acid decomposition, base decomposition, heat treatment, and ultrasonic treatment. Thereafter, it can be produced by purifying the hyaluronic acid fragment by a known purification method.
  • hyaluronic acid produced by a fermentation method using lactic acid bacteria, bacteria belonging to the genus Streptococcus, or the like can be similarly produced using a starting material.
  • commercially available high molecular weight hyaluronic acid may be used as a starting material.
  • the hyaluronic acid fragment is produced according to the method disclosed in International Publication No. 2002/4471, Glycobiology, 2002, Vol. 12, No. 7, pages 421-426. can do.
  • High molecular weight hyaluronate is dissolved in a buffer solution (for example, 0.1 M phosphate buffer solution) so that the pH of the solution is around 5, and then hydrolyzed by adding hyaluronidase.
  • the temperature for the hydrolysis is preferably around 37 ° C., and the reaction is carried out for about 1 to 24 hours.
  • the supernatant is collected by centrifugation at about 10,000 rpm, and the supernatant is fractionated by an ion exchange column or the like, whereby a hyaluronic acid fragment of a specific size can be obtained.
  • a high molecular weight hyaluronate is reacted in a 50% aqueous solution of concentrated hydrochloric acid at 40 ° C. to reflux temperature for about 1 to 5 hours.
  • a hyaluronic acid fragment of a specific size can be obtained by fractionation with an ion exchange column or the like.
  • the hydrolysis can be performed under milder conditions by heating with about 0.05 to 1M hydrochloric acid in a DMSO solvent.
  • P3776-3779 discloses a method for efficiently producing the following hyaluronic acid fragments for each sugar size by a solid phase synthesis method, and can also be produced by such a method. .
  • the hyaluronic acid fragment having the basic sugar structure of (a), (b), (c), (d) and (f) is obtained by decomposing it using hyaluronic acid as a starting material. Is a hyaluronic acid fragment that is hardly obtained or has a very poor yield.
  • the sirtuin inducer, tissue repair agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintenance agent, or TLR4 agonist according to the present invention is the hyaluronic acid fragment, pharmaceutically acceptable salt thereof or pharmacology thereof described above.
  • Solvates hereinafter simply referred to as “hyaluronic acid fragments” as an active ingredient.
  • the content of the hyaluronic acid fragment is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exerted, but a sirtuin inducer, tissue repair agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintainer, or TLR4 agonist Is preferably 0.0001 mass% or more and 100 mass% or less, more preferably 0.01 mass% or more and 20 mass% or less, and 0.5 mass% or more and 5 mass% or less. Most preferably.
  • the sirtuin inducer, tissue repair agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintainer, or TLR4 agonist according to the present invention can be used, for example, in the form of pharmaceuticals, functional foods, or cosmetics.
  • Examples of pharmaceutical forms include tablets, liquids, dry powders, injections, drops, external preparations, patches, liquids for vaporization administration, and insertion agents. In this case, it may be prepared in combination with one or more pharmaceutically acceptable ingredients or carriers.
  • pharmaceutically acceptable ingredients or carriers for example, additives, excipients, disintegrants, binders, lubricants, surfactants, alcohol, water, water-soluble polymers, sweeteners, corrigents, acidulants, and the like can be added.
  • a lubricant such as calcium stearate or an emulsifier
  • purified water for supplying moisture to the stratum corneum such as ion-exchanged water
  • moisturizing the stratum corneum such as glycerin and PEG.
  • Emollients oil components that prevent moisture from evaporating
  • moisturizers such as moisturizers, ester oils and vegetable oils to improve moisturizing properties and usability
  • solubilizers for solubilizing raw material components
  • pH adjustments Buffering agents, antiseptics to control microorganisms and prevent decay, coloring agents to color, UV absorbers to prevent fading and discoloration, astringents, bactericides, activators, flame retardants Agents can be added.
  • the functional food examples include liquid food, tablet food, powdered food, and granular food. In this case, it may be prepared in combination with one or more components or carriers that are edible.
  • vitamins B 1 , Vitamin B 2 , Vitamin B 6 , Vitamin B 12 , vitamins such as folic acid, niacin, vitamin E, fats and oils, thickeners, preservatives, colorants, antioxidants, seasonings, acidity A sweetener, a sweetener, etc. can be added.
  • cosmetic forms include eye drops, gels, creams, spray solutions, spray solutions, foamed aerosol formulations, gel and sheet face masks, and the like.
  • it may be prepared in combination with one or more cosmetically acceptable ingredients or carriers.
  • lubricants such as calcium stearate and emulsifiers, purified water for supplying moisture to the stratum corneum such as ion exchange water, moisturizers for moisturizing the stratum corneum such as glycerin and PEG, moisturizing properties such as ester oil and vegetable oil Emollient for improving the feeling of use (oil component that prevents water from evaporating), solubilizer for solubilizing raw material components, buffer for adjusting pH, suppressing microorganisms and preventing spoilage
  • Anti-fading agents for preventing discoloration and discoloration such as preservatives for coloring, coloring agents for coloring, ultraviolet absorbers, astringents, bactericides, activators, anti-inflammatory agents, and the like.
  • the sirtuin inducer, tissue repair agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintenance agent, or TLR4 agonist is used in the form of a pharmaceutical, functional food, or cosmetic
  • the hyaluronic acid fragment The content is preferably 0.0001% by mass or more and 100% by mass or less, and 0.01% by mass or more and 20% by mass or less with respect to the total mass of the pharmaceutical, functional food, or cosmetic. Is more preferable, and most preferably 0.5% by mass or more and 5% by mass or less.
  • the administration form of the sirtuin inducer, tissue repair agent, hepatocyte growth factor inducer, tissue homeostasis maintenance agent, or TLR4 agonist according to the present invention can be taken orally or in the form of an injection or infusion. And can be administered by intravenous injection or perfusion. Alternatively, it may be applied to the skin or absorbed through suction from the respiratory system, or applied locally. It may be ophthalmic administration. In any case, the dosage form is not particularly limited. It can also be applied to animals as well as humans.
  • the dose per administration of hyaluronic acid fragment, administration interval, etc. are matters to be determined individually according to the administration form, purpose of use, specific symptoms of patient, age, sex, body weight, etc., and are not particularly limited However, when taken orally, 1 mg to 7500 mg per adult is exemplified. When applied to the skin, an amount of about 0.01 ⁇ g to 1000 ⁇ g / cm 2 per unit area is exemplified. In addition, in the case of ophthalmic administration, an application amount of 0.01 ⁇ g to 1000 ⁇ g per time is exemplified.
  • hyaluronic acid fragments Since hyaluronic acid fragments have almost no toxicity or antigenicity, they are extremely effective as sirtuin inducers, tissue repair agents, hepatocyte growth factor inducers, tissue homeostasis maintainers, or TLR4 agonists with very little risk of side effects. Act on.
  • sirtuin inducer The sirtuin protein is a translation product of the SIRT1 gene and an enzyme that deacetylates histones. In cells where the sirtuin protein is expressed, the acetyl group is removed from the histone, and the force of winding the DNA around the histone is increased. As a result of the strong winding of DNA around histones, the expression of genes in that region decreases, thereby regulating the expression of specific genes and transcription factors. DNA damage is also reduced. Sirtuin proteins are also involved in the determination of the lifespan of cells, tissues, or individual organisms by being responsible for regulating various cell functions such as stress resistance, fat / glucose metabolism, and neuronal differentiation.
  • the sirtuin inducer according to the present invention can suppress the aging of cells, tissues, living organisms, etc. by promoting the expression of the sirtuin protein. And it is possible to keep a living individual healthy and extend its life. In addition, at the cell and biological tissue level, the aging can be suppressed, and for example, the activity can be maintained and the survival period can be extended.
  • sirtuin expression is increased by genetic manipulation, cancer formation is suppressed, and conversely, knockdown of a sirtuin gene (SIRT1 gene) promotes cancer formation (Kabra N, Li Z).
  • SIRT1 gene sirtuin gene promotes cancer formation
  • sirtuin induction suppresses vascular endothelial cell aging and prevents arteriosclerosis (Ota H, Eto M, Ogawa S, Iijima K, Akishita M, Ouchi Y “SIRT1 / eNOS axis as a potential target against vascular senescence, dysfunction and atherosclerosis. "Journal of Atherosclerosis and Thrombosis Vol. 17 (2010) No. 5 p431-435.).
  • Sirtuin protein has also been reported to suppress amyloid ⁇ production, which causes dementia (Alzheimer's disease) (Donmez G, Wang D, Cohen DE, Guarente L "SIRT1 suppresses beta-amyloid production by activating the alpha-secretase gene ADAM10. ”Cell 2010 Jul 23; 142 (2): 320-32.).
  • sirtuin protein is an inhibitor of the action of lung inflammation and thrombosis caused by atmospheric particulates (Wu Z, Liu MC, Liang M, Fu J “Sirt1 protects against thrombomodulin down-regulation and lung coagulation after particulate matter exposure. "Blood. 2012 Mar 8; 119 (10): 2422-9.).
  • sirtuin induction reduced renal tubule toxicity and NF-kappaB activation induced by cisplatin Jung YJ, Lee JE, Lee AS, Kang KP, Lee S, Park SK, Lee SY, Han MK, Kim DH, Kim W ⁇ SIRT1 overexpression decreases cisplatin-induced acetylation of NF- ⁇ B p65 subunit and cytotoxicity in renal proximal tubule cells. '' Biochem Biophys Res Commun. 2012 Mar 9; 419 Ten.).
  • sirtuin proteins are involved in the mechanism of insulin resistance (Chen YR, Lai YL, Lin SD, Li XT, Fu YC, Xu WC “SIRT1 interacts with metabolic transcriptional factors in the pancreas of insulin-resistant-and calorie-restricted rats. ”MolsBiol Rep. 2013 Jan 6.).
  • sirtuin proteins regulate TNF ⁇ -induced inflammation in human chondrocytes (Moon MH, Jeong JK, Lee YJ, Seol JW, Jackson CJ, Park SY "SIRT1, a class III histone deacetylase, regulates TNF- ⁇ -induced inflammation in human chondrocytes. "Osteoarthritis Cartilage. 2013 Mar; 21 (3): 470-80.).
  • sirtuin protein when sirtuin protein is highly expressed, formation of dendrites in hippocampal neurons is promoted. Conversely, when a sirtuin inhibitor is acted on, dendrites atrophy, and when sirtuin protein is highly expressed, amyloid ⁇ There are also reports that this also means that sirtuin proteins are responsible for the development and maintenance of cranial nerve tissues such as the hippocampus because they also suppress dendritic atrophy due to treatment. (Codocedo JF, Allard C, Godoy JA, Varela-Nallar L, Inestrosa NC "SIRT1 regulates dendritic development in hippocampal neurons.” PLoS One. 2012; 7 (10): e47073.).
  • sirtuin proteins suppress angiotensin II, a factor inducing hypertension (Li L, Gao P, Zhang H, Chen H, Zheng W, Lv X, Xu T, Wei Y, Liu D, Liang C “SIRT1 inhibits angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy.” Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2011 Feb; 43 (2): 103-9.).
  • the sirtuin inducer according to the present invention includes, in particular, heart disease, arteriosclerosis, osteoporosis, inflammatory bowel disease, dementia, stroke, metabolic syndrome, cancer, lung disease, kidney disease, diabetes, osteoarthritis, rheumatism, It is preferably used for the treatment and / or prevention of progeria, radiation disorder, muscle disease, brain development disorder, neurological disease, hypertension, or obesity, or suppression of aging.
  • tissue repair agent The tissue repair agent according to the present invention promotes repair of a wound site in a living tissue or a tissue at a defect site. More specifically, it is possible to promote the repair of the wound site of the living tissue or the tissue of the defective site by promoting cell proliferation of the wound site or the defective site of the living tissue or inducing cell differentiation. .
  • Various including, for example, pressure ulcers (bed sores), nutritional ulcers, burns, painless ulcers, post-traumatic ulcers, ulcers due to venous and post-phlebitic venous hematomas, skin lesions, skin grafts and skin lesions derived from herpes simplex Useful for the treatment of wounds.
  • pressure ulcers bed sores
  • nutritional ulcers burns
  • painless ulcers post-traumatic ulcers
  • skin lesions skin grafts and skin lesions derived from herpes simplex
  • skin lesions skin grafts and skin lesions derived from herpes simplex
  • it is preferably used for repairing the cornea, skin, epithelial tissue, nerve tissue, or myocardial tissue.
  • Hepatocyte growth factor inducer Hepatocyte growth factor (HGF) is a protein having a heterodimeric structure in which a heavy chain having a molecular weight of approximately 60,000 and a light chain having a molecular weight of approximately 35,000 are disulfide bonded.
  • a hepatocyte growth factor is synthesized in vivo, and after removal of the N-terminal signal peptide and secretion to the outside of the cell, it is cleaved into a double chain by an HGF activator or urokinase (u-PA) to become an active form .
  • HGF activator or urokinase urokinase
  • Hepatocyte growth factor not only promotes the proliferation of hepatocytes, but also acts on vascular endothelial cells, hematopoietic cells and nervous system cells, mainly epithelial cells derived from main organs, and activates and proliferates various cells. Prompt. It is also involved in the activation of skin and the like.
  • hepatocyte growth factor acts on epithelial cells such as keratinocytes, hair matrix, hair follicle cells, and vascular endothelial cells directly below, and activates the cells.
  • hepatocyte growth factor also has a cell motility enhancing action, a morphogenesis inducing action such as tube formation, an anti-apoptotic action, an angiogenesis action, and an immune response regulating action.
  • hepatocyte growth factor plays an important role in vivo.
  • the hepatocyte growth factor inducer activates cells of various organs and tissues including the liver, heart, gastrointestinal tract, blood vessels, and skin by promoting the expression of hepatocyte growth factor, or its
  • the activity can be maintained and they can be protected from disease factors such as inflammation, bacteria, viruses and the like, and over time or external damage.
  • it is preferably used for treatment and / or prevention of liver damage or organ preservation.
  • HGF morphogenesis inducing action is HGF morphogenesis inducing action and angiogenesis action.
  • wound healing such as blood vessels, skin and gastrointestinal tract can be expected.
  • it can be expected to have a significant preventive effect on various inflammations such as hepatic disorders such as hepatitis, renal disorders such as nephritis, and lung disorders such as pneumonia.
  • Still another aspect of the hepatocyte growth factor inducer according to the present invention relates to use in the form of a cosmetic.
  • the cosmetic according to the present invention has the effect of promoting the expression of hepatocyte growth factor by having a hyaluronic acid fragment. For this reason, for example, inflammation of the skin can be suppressed.
  • by activating cells on the surface of the living body cell proliferation on the surface of the living body can be promoted and an anti-aging effect can be exerted.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-213733 discloses a skin cosmetic with excellent skin beautifying effect that improves skin roughness caused by sunburn and improves wrinkles on the skin, which contains hepatocyte growth factor (HGF) as an active ingredient.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • the cosmetic according to the present invention also functions as a skin cosmetic excellent in the skin-beautifying effect that improves rough skin caused by sunburn and improves fine wrinkles of the skin, similar to the cosmetic disclosed in this publication.
  • tissue homeostasis maintenance agent tissue homeostasis maintenance agent It has been reported that tissue aging is due to tissue stem cell depletion (Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE “Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche.” Science. 2005 Feb 4; 307 (5710) : 720-4). That is, tissue aging occurs when cells do not newly proliferate in the tissue and constituent cells become dysfunctional. Therefore, to prevent tissue aging, ⁇ 1> maintenance and proliferation of tissue stem cells, ⁇ 2> induction of mature and differentiated cells that are functional cells, and ⁇ 3> maintenance of mature and differentiated cells as much as possible It is necessary.
  • the tissue homeostasis maintenance agent in particular, by maintaining the stem cell nature of the cells in the tissue and inducing differentiation, the aging is suppressed at the biological tissue level.
  • the activity can be maintained and the survival period can be extended.
  • TLR4 agonist TLR4 agonist
  • hyaluronic acid fragments have the effect of reducing tissue damage after being stored in a tissue preservation solution, and the reduction is also brought about by the action via TLR4. Furthermore, it has been found that hyaluronic acid fragments induce cell differentiation, and that induction is also brought about by an action via TLR4.
  • TLR4 (toll-like receptor 4) is found as a receptor that recognizes gram-negative lipopolysaccharide (LPS), and is known to be a receptor that activates, for example, NF-kappaB, which causes inflammation .
  • LPS gram-negative lipopolysaccharide
  • TLR4 is also present in various organs and cells such as cornea, skin, liver, nerve tissue, kidney, lung, heart, skeletal muscle, pancreas, and blood vessels as shown in the following documents. It is known to be expressed and involved in various physiological functions. Therefore, the TLR4 can be used to treat and prevent various diseases described below.
  • Cornea Corneal epithelium, keratosite
  • Corneal disease dry eye, corneal epithelial disorder, corneal epithelial detachment, corneal tissue destruction due to inflammation, etc.
  • Johnson AC Heinzel FP, Diaconu E, Sun Y, Hise AG, Golenbock D, Lass JH, Pearlman E ⁇ Activation of toll-like receptor (TLR) 2, TLR4, and TLR9 in the mammalian corneainduces MyD88-dependent corneal inflammation.
  • TLR toll-like receptor
  • Liver liver parenchymal cells, Kupffer cells
  • Nerve tissue nerve cells, microglia cells
  • Neuropathy Dementia, neurodevelopmental disorder, neurodegeneration, inhibition of neuronal differentiation, etc. 1.
  • various diseases can be treated and / or prevented by the action via TLR4.
  • corneal diseases such as dry eye, corneal epithelial disorder, corneal epithelial detachment, corneal tissue destruction due to inflammation; skin diseases such as pressure ulcer, skin ulcer, skin tissue destruction due to infection / inflammation; acute hepatitis, chronic hepatitis, liver transplantation disorder, etc.
  • Liver diseases such as: dementia, neurodevelopmental disorder, neural tissue degeneration, nerve differentiation inhibition, etc .; kidney diseases such as nephritis, nephropathy; lung diseases such as pneumonia, COPD, ischemia reperfusion disorder; myocardial infarction,
  • HYA-OLIGO10EF-1 (trade name, manufactured by Hyalose) This is an octasaccharide-sized hyaluronic acid fragment having a structure of GlcA (-GlcNAc-GlcA) 4 -GlcNAc and obtained by enzymatic degradation of hyaluronic acid.
  • ⁇ Test Example 1> (Sirtuin induction in human epidermal keratinocytes, part 1) Human epidermal keratinocytes (normal human keratinocytes (derived from Asian female (27 years old))) were cultured and prepared. Human epidermal keratinocytes were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 using a growth medium for long-term culture (EpiLife-KG2), and then cells were collected by trypsin treatment. Thereafter, the cells were seeded at 100 ⁇ L per well in a 96-well plate and cultured overnight.
  • Human epidermal keratinocytes normal human keratinocytes (derived from Asian female (27 years old)
  • Human epidermal keratinocytes were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 using a growth medium for long-term culture (EpiLife-KG2), and then cells were collected by trypsin treatment. Thereafter, the cells were seeded at 100 ⁇ L per well
  • the culture solution of each well was added to a medium not added with a hyaluronic acid fragment (“Keratinocyte SFM” manufactured by Gibco), or a hyaluronic acid fragment (4mer) added thereto at a final concentration of 0.01 ng / ml, 0.
  • the medium was changed to the same medium added at 1 ng / ml, 1.0 ng / ml, and 10 ng / ml, and cultured for 24 hours.
  • the anti-human SIRT1 antibody is an antibody that recognizes and stains a human sirtuin protein.
  • the stained cells were observed using a Nikon microscope, and the shape of the cells and the stained images of the cells were photographed.
  • FIG. 1 shows a photograph of the stained image.
  • FIG. 1 (a) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution to which no hyaluronic acid fragment is added.
  • FIG. 1 (b) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution containing 0.01 ng / ml hyaluronic acid fragment (4mer).
  • FIG. 1 (c) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution containing 0.1 ng / ml hyaluronic acid fragment (4mer).
  • FIG. 1 (a) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution to which no hyaluronic acid fragment is added.
  • FIG. 1 (b) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution containing 0.01 ng / ml hyaluronic acid fragment (4mer).
  • FIG. 1 (d) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution containing 1.0 ng / ml hyaluronic acid fragment (4mer).
  • FIG. 1 (e) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution containing 10 ng / ml hyaluronic acid fragment (4mer).
  • Table 1 shows the results of analyzing the stained image using image analysis software (free software “ImageIJ”).
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Table 1.
  • the staining intensity of this result indicates the degree of staining with the anti-human SIRT1 antibody, and the higher the value, the greater the expression level of the sirtuin protein.
  • ⁇ Test Example 2> (Sirtuin induction in human epidermal keratinocytes, part 2) Human epidermis angle in the same manner as in Test Example 1 except that the final concentration of the hyaluronic acid fragment was 10 ng / ml and the size was changed to tetrasaccharide (4mer), hexasaccharide (6mer), and 10 sugar (10mer). The treated cells were treated, and the sirtuin enzyme activity (sirt1 enzyme activity) in the cell lysate was measured.
  • a human sirtuin recombinant protein prepared by a genetic recombination technique was used as a substance for verifying the measurement system.
  • the sirtuin enzyme activity was measured by subjecting the crude cell extract to “CycLex SIRT1 / Sir2 Deacetylase Fluorometric Assay Kit” (trade name, Cyclex), according to the protocol of the kit. The result is shown in FIG.
  • the measured value of the tetrasaccharide-sized hyaluronic acid fragment (4mer) was about three times that of the negative control.
  • Resveratrol known as a sirtuin activator, did not change even when the same amount was added, so the effect of inducing sirtuin enzyme activity by a tetrasaccharide-sized hyaluronic acid fragment (4mer) is remarkable. I understand.
  • FIG. 4 shows a photograph of a stained image of cells stained with anti-human SIRT1 antibody.
  • FIG. 4 (a) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution to which no hyaluronic acid fragment has been added.
  • FIG. 4 (b) shows the state of human epidermal keratinocytes cultured in a culture solution containing 10 ng / ml hyaluronic acid fragment (4mer).
  • FIG. 4 in the negative control of FIG. 4 (a), expression of sirtuin protein was observed mainly in round and small cells (indicated by arrows in the figure). In addition, there were many immature cells with relatively small cell bodies.
  • FIG. 4 (b) by treatment with the hyaluronic acid fragment, a larger number of cells, that is, mature cells appeared, and the expression of sirtuin protein was observed in the cells (in the figure, with an arrow). Showing the cells).
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Table 2.
  • the pixel number of this result has shown the area on the image of one cell, and it can be said that a cell is so large that the value is high.
  • FIG. 6 shows a photograph of a stained image of cells stained with anti-human SIRT1 antibody.
  • FIG. 6 shows the state of human epidermal keratinocytes cultured for 24 hours in a culture solution containing 10 ng / ml hyaluronic acid fragment (4mer).
  • the dividing cells indicated by arrows in FIG. 6 were smaller than others, and the sirtuin protein was highly expressed in such cells.
  • tissue stem cells are known to have a higher proliferation ability (dividing ability) than mature cells, and are smaller in size than mature cells.
  • sirtuin protein is highly expressed in stem cells. Therefore, it can be seen that the dividing cells in which the sirtuin protein is highly expressed as indicated by arrows in FIG. 6 are stem cells of human epidermal keratinocytes.
  • FIG. 7 summarizes the number of cells that are dividing cells similar to the cells indicated by the arrows in FIG. 6, whose morphology is smaller than other cells, and in which the sirtuin protein is highly expressed. Results are shown. The results are shown as the average number in the observed image field.
  • TLR4 is a receptor for the hyaluronic acid fragment, and the hyaluronic acid fragment causes sirtuin induction of stem cells of human epidermal keratinocytes due to the action mediated by TLR4, and thus causes proliferation of the stem cells.
  • TLR4 of the stem cells of human epidermal keratinocytes is a receptor for the hyaluronic acid fragment, and that mediated sirtuin is caused by the action through the receptor, which in turn causes proliferation of the stem cells.
  • the culture solution of each well is added to a medium “Neurobasal Media” (trade name, manufactured by Gibco) without adding a hyaluronic acid fragment or a hyaluronic acid fragment (L3mer) to a final concentration of 10 ng / ml.
  • the culture medium was changed to the added medium and cultured for 12 days.
  • FIG. 10 shows a photograph of the stained image.
  • FIG. 10 (a) shows a stained image of human neural stem cells (Neurospher) cultured in a culture solution to which no hyaluronic acid fragment is added with an anti-human Nestin antibody.
  • FIG. 10 (b) shows a stained image of an anti-human tubulin antibody of human neural stem cells (Neurospher) cultured in a culture solution to which no hyaluronic acid fragment is added.
  • FIG. 10 (c) shows a staining image of human neural stem cells (Neurosphere) cultured with a culture solution containing 10 ng / ml hyaluronic acid fragment (L3mer) with an anti-human Nestin antibody.
  • FIG. 10 (d) shows a staining image of human neural stem cells (Neurospher) cultured with a culture solution containing 10 ng / ml hyaluronic acid fragment (L3mer) with an anti-human tubulin antibody.
  • ⁇ Test Example 8> (Sirtuin induction in human colonic epithelial cells) Human colonic epithelial cells (HT29 cells) were cultured using a DMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. and 5% CO 2 according to a conventional method.
  • DMEM medium manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the culture solution was added to a DMEM medium to which a hyaluronic acid fragment was not added, a DMEM medium to which a hyaluronic acid fragment (4mer) was added to a final concentration of 100 ng / ml, or its hyaluronic acid fragment (4mer), and further added to TLR4 /
  • the medium was replaced with DMEM medium supplemented with MD2 to a final concentration of 10 ⁇ g / ml and cultured for 24 hours.
  • sirtuin induction was also induced in human colon epithelial cells (HT29 cells) by treatment with hyaluronic acid fragments. And it was almost completely inhibited by the addition of TLR4 / MD2. Therefore, in human large intestine epithelial cells (HT29 cells), it was revealed that TLR4 is a receptor for the hyaluronic acid fragment, and sirtuin induction is caused by the action via the receptor.
  • NF-kappaB is a transcription factor involved in inflammation, tissue destruction and the like.
  • a DMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in which a hyaluronic acid fragment was added to TNF- ⁇ and a DMEM medium not added were prepared, and human colon epithelial cells were treated with this medium for 24 hours. Then, it was stained with an antibody that recognizes activated (phosphorylated) NFkappaB.
  • FIG. 12 is a photograph of human colon epithelial cells stained with NF-kappaB by fluorescence staining.
  • FIG. 12 (a) shows the state of human colonic epithelial cells cultured in a culture solution to which a hyaluronic acid fragment and TNF- ⁇ are not added.
  • FIG. 12 (b) shows the state of human colonic epithelial cells cultured in a culture solution treated only with TNF- ⁇ and not added with a hyaluronic acid fragment.
  • FIG. 12 (c) shows the state of human colonic epithelial cells cultured in a culture solution supplemented with TNF- ⁇ and 10 ng / ml tetrasaccharide hyaluronic acid fragment (4mer).
  • FIG. 12 (a) shows the state of human colonic epithelial cells cultured in a culture solution to which a hyaluronic acid fragment and TNF- ⁇ are not added.
  • FIG. 12 (b) shows the state of human colon
  • FIG. 12 (d) shows the state of human large intestine epithelial cells cultured in a culture solution to which TNF- ⁇ and 10 ng / ml tetrasaccharide and hexasaccharide hyaluronic acid fragments (4 mer and 6 mer are each 5 ng / ml) were added. It is a thing.
  • FIG. 12 (e) shows the state of human colonic epithelial cells cultured in a culture solution supplemented with TNF- ⁇ and 10 ng / ml hexasaccharide hyaluronic acid fragment (6mer).
  • FIG. 12 (e) shows the state of human colonic epithelial cells cultured in a culture solution supplemented with TNF- ⁇ and 10 ng / ml hexasaccharide hyaluronic acid fragment (6mer).
  • FIG. 12 (f) shows the state of human colonic epithelial cells cultured in a culture medium supplemented with TNF- ⁇ and 10 ng / ml octasaccharide hyaluronic acid fragment (8mer).
  • FIG. 12 (g) shows the state of human colonic epithelial cells treated with TNF- ⁇ and cultured in a culture solution supplemented with 10 ng / ml of 900 kDa hyaluronic acid.
  • FIG. 12 (a) and FIG. 12 (b) show that the expression level of NF-kappaB increases when human colonic epithelial cells are treated with TNF- ⁇ . Since NF-kappaB is a protein whose expression level increases with aging, it becomes an index protein for aging (Salminen A, Kaarniranta K. Genetics vs. entropy: longevity factors suppress the NF-kappaB-driven entropic aging process. Ageing Res Rev. 2010 Jul; 9 (3): 298-314). That is, in FIG. 12 (b), it can be seen that aging of the cells is progressing by TNF- ⁇ treatment. On the other hand, in FIGS.
  • FIG. 13 is a graph showing the fluorescence intensity of NF-kappaB stained with fluorescence.
  • the vertical axis of the graph indicates the fluorescence intensity. It can be seen that the expression level of NF-kappaB is significantly decreased in the cells to which the 4- to 8-saccharide hyaluronic acid fragment was added. Furthermore, it was found that the hyaluronic acid fragment having tetrasaccharide can most suppress the increase in the expression level of NF-kappaB.
  • ⁇ Test Example 10> (Action on NF-kappaB expression in human large intestine epithelial cells, part 2) Human colonic epithelial cells (HT29 cells) were cultured using a DMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. and 5% CO 2 according to a conventional method. The culture solution was added to the DMEM medium to which the hyaluronic acid fragment was not added, the DMEM medium to which TNF- ⁇ was added to a final concentration of 100 ng / ml, and the TNF- ⁇ was further added to the final concentration of the hyaluronic acid fragment (4mer).
  • DMEM medium manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • TLR4 of human colon epithelial cells is a receptor for the hyaluronic acid fragment, and suppression of NF-kappaB expression is caused by the action via the receptor.
  • Hyaluronic acid fragment (L3mer and 4mer mixed at the same concentration) dissolved in physiological saline so that the final concentration is 0.1 w / v% ⁇ Effective for hyaluronic acid with an average molecular weight of 500,000 to 1,200,000 Ophthalmic solution containing 0.1 w / v% as ingredient
  • the cornea of the rabbit eye was photographed 24 hours and 48 hours after the cornea was damaged using a Nikon camera. Utilizing the fact that the fluorescent agent (FITC) adheres to the wound site, this was instilled into a rabbit, and the wound site area of the cornea was measured with image analysis software (“NIH image”).
  • FITC fluorescent agent
  • FIG. 15 is a photograph of the cornea of the rabbit eye 24 hours after the cornea was damaged.
  • the cornea wound site of the rabbit eye is indicated by a broken line.
  • FIG. 15 (a) shows the appearance of the cornea of the rabbit eye 24 hours after the physiological saline was dropped. The wound site was larger than the rabbit's black eye and spread throughout.
  • FIG. 15 (b) shows the appearance of the cornea of the rabbit eye after 24 hours when an ophthalmic solution containing a hyaluronic acid fragment was dropped. The wound site was smaller than the rabbit's black eye. Therefore, it can be seen that the cornea wound site of the rabbit eye after 24 hours is smaller when the eye drop containing the hyaluronic acid fragment is dropped than when the physiological saline is dropped.
  • FIG. 15 (a) shows the appearance of the cornea of the rabbit eye 24 hours after the physiological saline was dropped. The wound site was larger than the rabbit's black eye and spread throughout.
  • FIG. 15 (b) shows the appearance of the cornea of the rabbit eye
  • FIG. 16 is a graph showing the area of the wound site 24 hours after the cornea was damaged.
  • the average area of the wound site when saline is dropped is 14000 pixels, whereas the average area of the wound site when eye drops containing a hyaluronic acid fragment is dropped is 11000 pixels. You can see that it is getting smaller.
  • the average area is 13500 pixels, and it is understood that the decrease in the value is not significant.
  • FIG. 17 is an image of the cornea of the rabbit eye 48 hours after the cornea was damaged.
  • the cornea wound site of the rabbit eye is indicated by a broken line.
  • FIG. 17 (a) shows the state of the cornea of the rabbit eye 48 hours after the physiological saline was dropped. The area of the wound site was reduced compared to after 24 hours, but the wound site remained.
  • FIG. 17 (b) shows the appearance of the cornea of the rabbit eye after 48 hours when an ophthalmic solution containing a hyaluronic acid fragment was dropped. When an ophthalmic solution containing a hyaluronic acid fragment was dropped, the wound site had completely disappeared after 48 hours.
  • FIG. 17 (c) shows the appearance of the cornea of the rabbit eye after 48 hours when an ophthalmic solution containing hyaluronic acid having an average molecular weight of 500,000 to 1,200,000 was dropped. Although the area was small compared with the case where physiological saline was dripped, the wound site remained.
  • FIG. 18 is a graph showing the area of the wound site 48 hours after the cornea was damaged.
  • the average area of the wound site when saline is dropped is 950 pixels, whereas the average area of the wound site when eye drops containing a hyaluronic acid fragment is dropped is 0 pixel and the wound site. It can be seen that disappeared.
  • the ophthalmic solution containing hyaluronic acid having an average molecular weight of 500,000 to 1,200,000 is dropped, the average area is 520 pixels, and it is understood that the decrease in the value is not so remarkable.
  • ⁇ Test Example 12> (Operational effect 2 on corneal damage)
  • the rabbit cornea was damaged, the test solution was instilled after the damage, and the corneal tissue of the rabbit eye was collected 33 hours after the damage.
  • a paraffin-embedded specimen and a frozen-embedded specimen were prepared.
  • Thin slices were prepared from the paraffin-embedded specimen, and the thin slices were stained with hematoxylin and eosin.
  • the stained corneal tissue was observed with an Olympus microscope and the appearance of the corneal epithelium of the corneal tissue was recorded.
  • FIG. 19 shows the corneal tissue of a rabbit eye stained with hematoxylin and eosin.
  • FIG. 19 (a) shows a state in which the corneal tissue of the rabbit eye after elapse of 33 hours is stained with hematoxylin and eosin when physiological saline is dropped. The dark portion indicates the corneal epithelium, indicating that the corneal epithelium is very thin.
  • FIG. 19 (b) shows a state in which the corneal tissue of the rabbit eye after elapse of 33 hours was stained with hematoxylin and eosin when an ophthalmic solution containing a hyaluronic acid fragment was dropped. In this case, it was found that the corneal epithelium was thickly formed over a wide range. It was also found that a plurality of cell layers were formed in the corneal epithelium.
  • FIG. 19 (c) shows a state in which the corneal tissue of the eye of a rabbit after 33 hours has been stained with hematoxylin and eosin when an ophthalmic solution containing hyaluronic acid having an average molecular weight of 500,000 to 1,200,000 is dropped. Show. In this case, activation of vacuoles (indicated by arrows in the figure) and keratocytos (usually flat but spindle-shaped) was observed in the corneal epithelium (others in the figure). Indicated by an arrow). This result indicated that the high molecular weight hyaluronic acid caused some damage to the tissue. With the hyaluronic acid fragment, such tissue damage was not observed, and it became clear that it was more excellent as a tissue repair agent for treating corneal damage.
  • the hyaluronic acid fragment promotes cell growth at the wound site and the surrounding site. It was also found that when an ophthalmic solution containing a hyaluronic acid fragment was dropped, corneal epithelium formation progressed and a plurality of cell layers were formed. Thereby, when the ophthalmic solution containing a hyaluronic acid fragment was dropped, it was found that cell differentiation was induced at the wound site. That is, the hyaluronic acid fragment was found to be able to induce cell differentiation and tissue repair in addition to promoting cell proliferation.
  • Human epidermal keratinocytes (normal human keratinocytes (derived from an Asian woman (27 years old)) were prepared by adding a medium containing 10 ng / ml of a tetrasaccharide hyaluronic acid fragment (4mer) and a medium containing no (no) Culturing for 24 hours.
  • the medium used was a serum-free medium for normal human epidermal keratinocytes from DS Pharma Biomedical. After culturing, the cells were collected and analyzed with a DNA microarray (DNA chip).
  • Table 3 shows the intensity of fluorescence (Cy5) of normal human keratinocytes cultured in a cell culture solution added with a hyaluronic acid fragment or a cell culture solution not added with a hyaluronic acid fragment.
  • test solution was injected from the liver portal vein of SD rat 24 months old (old), 7.5 ml was perfused, and then stored at 37 ° C. for 6 hours with the same solution.
  • a section was prepared from a block prepared by embedding the liver in an OCT compound and frozen, and this was subjected to microscopic observation.
  • FIG. 20 shows a photograph of the microscopic image.
  • FIG. 20A shows a state of a tissue section of an untreated liver before storage. The sinusoids were clearly observed before storage.
  • FIG. 20 (b) shows the state of the liver tissue section after storage without adding anything to the organ preservation solution. When preserved with an organ preservation solution, the sinusoids became unclear (similar stenosis) and many blebs (foams) appeared (cell damage).
  • the bleb (foam) appearing in the ischemic liver tissue is a decrease in ATP level due to ischemia ⁇ Ca ion efflux from mitochondria to the cytoplasm ⁇ activation of Ca ion-dependent proteolytic enzyme and cytoskeletal damage The result is triggered. This change leads to hepatocyte death. Such changes are also observed in various pathologies such as drug injury and aging, and Concanavalin A-induced liver injury.
  • FIG. 20 (c) shows a state of a liver tissue section after the preservation by adding a hyaluronic acid fragment (4mer) to an organ preservation solution.
  • a hyaluronic acid fragment (4mer) When stored in an organ preservation solution containing a hyaluronic acid fragment (4mer), similar stenosis and bleb appearance were suppressed.
  • FIG. 20 (d) shows a state of a liver woven slice after the hyaluronic acid fragment (L3mer) was added to the organ preservation solution and preserved.
  • L3mer hyaluronic acid fragment
  • FIG. 20 (e) shows the state of the liver tissue section after the preservation by adding the hyaluronic acid fragment (L3mer) and TLR4 / MD2 to the organ preservation solution.
  • the sinusoid became unclear (similar stenosis), and many blebs (foams) appeared.
  • FIG. 21 simply summarizes the number of blebs per area.
  • the effect of suppressing the appearance of bleb was higher in the L3mer process than in the 4mer process. This was thought to be because the L3mer having a lower molecular weight was superior in tissue permeability to the 4mer, and thus the bleb appearance could be more effectively suppressed.
  • the effect of suppressing the appearance of bleb by L3mer was reduced by the addition of TLR4 / MD2.
  • TLR4 also acts via TLR4 also in the inhibitory effect of the disorder
  • Example 15 (Operational effect on the liver of old rats, part 2) The effect of hyaluronic acid fragment on aged rat liver was investigated. Specifically, Concanavalin A (20 mg / kg body weight) is intravenously injected once into the 20-month-old (old) female Balb / c mouse from the tail vein to form a liver injury model, and immediately after the administration of Concanavalin A, hyaluron An acid fragment (4mer or L3mer) was orally administered and the effect was examined. Liver dysfunction was evaluated by collecting blood after 24 hours and measuring blood GOT and GPT values. FIG. 22 shows the results of blood GOT values.
  • administration of the hyaluronic acid fragment improved liver dysfunction due to Concanavalin A administration.
  • the effect was significantly better with L3mer than with 4mer. This is thought to be because L3mer having a lower molecular weight is superior in tissue permeability than 4mer, and thus can more effectively suppress liver dysfunction due to Concanavalin A administration.
  • the GPT value was the result of the same tendency.
  • ⁇ Test Example 16> (Action on aging-induced human colonic epithelial cells, part 1) Treatment of human colonic epithelial cells (HT29 cells) with hydrogen peroxide treatment causes aging of cells by stimulation with hydrogen peroxide (mitochondrial activity decreases due to injury or MTS value decreases when cell death occurs), but treatment with hyaluronic acid fragments It was investigated whether it was influenced by. Specifically, the test was conducted as follows.
  • HT29 cells Human colonic epithelial cells (HT29 cells) were cultured using a DMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. and 5% CO 2 according to a conventional method.
  • DMEM with final concentration of 10 ⁇ M added to the medium and stimulated for 15 minutes, then DMEM medium without hyaluronic acid fragment added, DMEM with hyaluronic acid fragment (4mer) added to a final concentration of 100 ng / ml
  • TLR4 / MD2 was added to a DMEM medium added to a final concentration of 10 ⁇ g / ml, followed by culturing for 3 hours.
  • MTS measures mitochondrial function by measuring OD490nm based on the action of changing to formazan by dehydrogenation in mitochondria in cells.
  • the hyaluronic acid fragment (4mer) suppressed cell aging by stimulation with hydrogen peroxide (mitochondrial activity decreased due to injury or MTS value decreased when cell death occurred). Since this effect was inhibited by adding TLR4 / MD2 to the medium, it was found that the hyaluronic acid fragment was brought about by binding to TLR4 on the cell surface. Therefore, it has been clarified that TLR4 of human colon epithelial cells (HT29 cells) is a hyaluronic acid fragment receptor, and its action through the receptor has an effect of suppressing cell aging.
  • TLR4 of human colon epithelial cells HT29 cells
  • Test example 17> (Action on aging-induced human colonic epithelial cells, part 2) Test example, except that the test substance was hyaluronic acid fragment (4mer), hyaluronic acid fragment (L4mer), hyaluronic acid fragment (L3mer) and the culture time after changing to the medium containing the test substance was changed to 1 hour The same test as in No. 16 was performed. The result is shown in FIG.
  • L4mer and L3mer which are chemically synthesized products, showed an inhibitory effect on cell aging as well as 4mer.
  • Test Example 18> (Action on aging-induced human colonic epithelial cells, part 3) A test was conducted in the same manner as in Test Example 16 except that the test substance was a hyaluronic acid fragment (L4mer) and a hyaluronic acid fragment (L3mer). The result is shown in FIG.
  • L4mer and L3mer which are chemically synthesized products, showed an inhibitory effect on cell aging as well as 4mer. Since this action was inhibited by adding TLR4 / MD2 to the medium, it was found that the antiaging effect by L4mer and L3mer is also brought about through TLR4.
  • Example 19 (Action on aging-induced human oral epithelial cells) It was examined whether mitochondrial function when human oral cavity-derived epithelial cells (Ca9-22 cells) were treated with hydrogen peroxide was affected by the treatment with hyaluronic acid fragments. Specifically, the test was conducted as follows.
  • Human oral epithelial cells (Ca9-22 cells) were cultured using a DMEM medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. and 5% CO 2 according to a conventional method. The final concentration of 1 ⁇ M hydrogen peroxide was added to the medium and stimulated for 15 minutes, and then the DMEM medium to which the hyaluronic acid fragment (L3mer) had not been added, and the final concentration of 100 ng / ml was added.
  • the medium was replaced with a DMEM medium to which a hyaluronic acid fragment (4mer) was added to a final concentration of 100 ng / ml, or a DMEM medium to which 900 kDa hyaluronic acid was added to a final concentration of 100 ng / ml, and cultured for 3 hours.
  • MTS measures mitochondrial function by measuring OD490nm based on the action of changing to formazan by dehydrogenation in mitochondria in cells.
  • ⁇ Test Example 20> (Action on aging-induced human neural stem cells) It was examined whether cell senescence (vacuum degeneration and hypertrophy) when human neural stem cells (Neurospher) were treated with hydrogen peroxide was affected by treatment with hyaluronic acid fragments. Specifically, the test was conducted as follows.
  • Neurosphere Human neural stem cells (Neurosphere) (trade name “Gibco Human Neural Stem Cells (H9-Derived)” manufactured by Gibco) were used at 37 ° C., 5% CO 2 using medium “Neurobasal Media” (trade name, manufactured by Gibco). Cultured under. Hydrogen peroxide with a final concentration of 10 ⁇ M was added to the medium and stimulated for 15 minutes, and then the medium “Neurobasal Media” (trade name, manufactured by Gibco) without adding the hyaluronic acid fragment and the hyaluronic acid fragment (L3mer) were finally added.
  • FIG. 27 shows a photograph of the microscopic image.
  • the hyaluronic acid fragment suppressed cell aging (vacuum degeneration and hypertrophy) by hydrogen peroxide. Since this effect was inhibited by adding TLR4 / MD2 to the medium, it was found that the hyaluronic acid fragment was brought about by binding to TLR4 on the cell surface. Therefore, it has been clarified that TLR4 is also a receptor for hyaluronic acid fragment in human neural stem cells (Neurospher), and that the action through the receptor has an effect of suppressing cell aging.
  • ⁇ Test Example 21> (Action on senescence induced rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells) It was examined whether cell senescence (increase in dead cells) when rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells were treated with hydrogen peroxide was affected by treatment with hyaluronic acid fragments. Specifically, the test was conducted as follows.
  • Rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells were cultured according to a conventional method using a DMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the final concentration of 1 ⁇ M hydrogen peroxide was added to the medium and stimulated for 15 minutes, and then the DMEM medium to which the hyaluronic acid fragment (L3mer) had not been added, and the final concentration of 100 ng / ml was added.
  • the medium or its hyaluronic acid fragment (L3mer) and further DLR medium added with TLR4 / MD2 to a final concentration of 10 ⁇ g / ml in addition to the medium were cultured for 2 hours.
  • FIG. 28 shows the average number of dead cells in the unit visual field.
  • the hyaluronic acid fragment suppressed cell aging (increase in dead cells) by hydrogen peroxide. Since this effect was inhibited by adding TLR4 / MD2 to the medium, it was found that the hyaluronic acid fragment was brought about by binding to TLR4 on the cell surface. Therefore, it was clarified that TLR4 is a receptor for hyaluronic acid fragment in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and the effect of cell aging is brought about by the action through the receptor.
  • ⁇ Test Example 22> (Detection of keratinocyte marker in human keratinocytes 1) Human epidermal keratinocytes were stimulated in the same manner as in Test Example 1 except that a 4mer or L3mer was used as a hyaluronic acid fragment, and a test group to which TLR4 / MD2 having a final concentration of 1 ⁇ g / ml was further added was added thereto.
  • Keratin K14 is a marker of basal layer keratinocytes. The result is shown in FIG.
  • ⁇ Test Example 23> (Detection of keratinocyte marker in human epidermal keratinocytes, part 2) Human epidermal keratinocytes were stimulated in the same manner as in Test Example 1 except that a 4mer or L3mer was used as a hyaluronic acid fragment, and a test group to which TLR4 / MD2 having a final concentration of 1 ⁇ g / ml was further added was added thereto.

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Abstract

　ヒアルロン酸フラグメントを利用した、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤を提供する。　２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤の有効成分として用いる。前記ヒアルロン酸フラグメントは、３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントであることが好ましく、３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントであることがより好ましい。

Description

ヒアルロン酸フラグメントを有効成分とするサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、及びＴＬＲ４作用剤
　本発明は、ヒアルロン酸フラグメントを有効成分とするサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、及びＴＬＲ４作用剤に関する。
　ヒアルロン酸は、関節、皮膚、脳などの細胞外マトリックスを構成する天然高分子として知られ、従来から、医薬品や化粧料に保湿成分として用いられている。
　ヒアルロン酸は、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの二糖単位が連結した多糖類であり、その分子量によって、高分子量ヒアルロン酸、低分子量ヒアルロン酸、又はヒアルロン酸フラグメントに分類される。高分子量ヒアルロン酸の分子量は一般的に１０万から１００万程度である。低分子量ヒアルロン酸の分子量は１万から１０万程度である。ヒアルロン酸フラグメントの分子量は、４００から１万程度である（非特許文献１）。そして、ヒアルロン酸は、生体内でも様々な生理活性を有しており、その生理活性は分子量によって大きく異なる（非特許文献２）。
Ｓｃｉｅｎｃｅ、　第２２８巻第１３２４～１３２６頁（１９８５年） Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、Ａｋｉｒａ　Ａｓａｒｉ．Ｃｈａｐｔｅｒ　２１、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｅｄ：Ｇａｒｇ、ＨＧ　ａｎｄ　Ｈａｌｅｓ　ＣＡ、４５７～４７３頁（２００４年）
　特に、ヒアルロン酸フラグメントの生理活性は、高分子量のヒアルロン酸や低分子量のヒアルロン酸とは非常に異なると考えられている。しかしながら、その機能や効用などは未だ明らかではなかった。
　本発明の目的は、ヒアルロン酸フラグメントを利用した、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤を提供することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするサーチュイン誘導剤。
［２］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［１］記載のサーチュイン誘導剤。
［３］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［１］記載のサーチュイン誘導剤。
［４］心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために用いられる、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
［５］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［１］～［３］のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
［６］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織修復剤。
［７］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［６］記載の組織修復剤。
［８］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［６］記載の組織修復剤。
［９］角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復に用いられる、上記［６］～［８］のいずれか１つに記載の組織修復剤。
［１０］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［６］～［８］のいずれか１つに記載の組織修復剤。
［１１］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする肝細胞増殖因子誘導剤。
［１２］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［１１］記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１３］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［１１］記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１４］肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために用いられる、上記［１１］～［１３］のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１５］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［１１］～［１３］のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
［１６］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織恒常性維持剤。
［１７］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［１６］記載の組織恒常性維持剤。
［１８］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［１６］記載の組織恒常性維持剤。
［１９］組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導するために用いられる、上記［１６］～［１８］のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
［２０］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［１６］～［１８］のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
［２１］２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＴＬＲ４作用剤。
［２２］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、上記［２１］記載のＴＬＲ４作用剤。
［２３］前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、上記［２１］記載のＴＬＲ４作用剤。
［２４］角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、又は血管における疾患の治療及び／又は予防のために用いられる、上記［２１］～［２３］のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
［２５］医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、上記［２１］～［２３］のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
　本発明のサーチュイン誘導剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これによりサーチュイン蛋白質の発現を促進することができる。よって、例えば、心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために有効に用いられる。
　本発明の組織修復剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これにより組織を修復することができる。よって、例えば、角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復のために有効に用いられる。
　本発明の肝細胞増殖因子誘導剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これにより肝細胞増殖因子の発現を促進することができる。よって、例えば、肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために有効に用いられる。
　本発明の組織恒常性維持剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これにより組織の恒常性を維持することができる。よって、例えば、組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導するために有効に用いられる。
　本発明のＴＬＲ４作用剤によれば、２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有するので、これによりＴＬＲ４を介する作用を発揮できる。よって、例えば、角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、又は血管における疾患の治療及び／又は予防のために有効に用いられる。
試験例１においてヒト表皮角化細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した染色像を示す写真である。 試験例１におけるサーチュイン蛋白質の発現量の結果を示す図表である。 試験例２における細胞溶解液におけるサーチュイン酵素活性（ｓｉｒｔ１酵素活性）の結果を示す図表である。 試験例３においてヒト表皮角化細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した染色像を示す写真である。 試験例３におけるヒト表皮角化細胞の大きさの変化の結果を示す図表である。 試験例４においてヒト表皮角化細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した染色像を示す写真である。 試験例４において分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の単位視野面積当りの細胞数の結果を示す図表である。 試験例５において分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の単位視野面積当りの細胞数の結果を示す図表である。 試験例６において分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の単位視野面積当りの細胞数の結果を示す図表である。 試験例７においてヒト神経幹細胞（Gibco human neural stem cells (H9-Derived)）を抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体及び抗ヒトチューブリン抗体で二重染色した染色像を示す写真である。 試験例８におけるサーチュイン蛋白質の発現量の結果を示す図表である。 試験例９においてヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を抗ＮＦ－ｋａｐｐａＢ抗体で染色した染色像を示す写真である。 試験例９におけるＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量の結果を示す図表である。 試験例１０におけるＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量の結果を示す図表である。 試験例１１において角膜に損傷を与えてから２４時間経過時のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。 試験例１１において角膜に損傷を与えてから２４時間経過時の創傷部位の面積をグラフで示したものである。 試験例１１において角膜に損傷を与えてから４８時間経過時のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。 試験例１１において角膜に損傷を与えてから４８時間経過時の創傷部位の面積をグラフで示したものである。 試験例１２において角膜に損傷を与えてから３３時間経過時ウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色したものである。 試験例１４において保存前の無処置の肝臓又は臓器保存液で保存した後の肝臓の織切片の顕微鏡写真である。 試験例１４における単位視野面積当りのｂｌｅｂ（泡沫）数の結果を示す図表である。 試験例１５における血中ＧＯＴ値の結果を示す図表である。 試験例１６において老化誘導したヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。 試験例１７において老化誘導したヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。 試験例１８において老化誘導したヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。 試験例１９において老化誘導したヒト口腔由来上皮細胞（Ｃａ９－２２細胞）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。 試験例２０において老化誘導したヒト神経幹細胞（Gibco human neural stem cells (H9-Derived)）に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。 試験例２１において老化誘導したラット骨髄由来間葉系幹細胞に対するヒアルロン酸フラグメントの老化抑制効果の結果を示す図表である。 試験例２２において角化細胞マーカーＫｅｒａｔｉｎ Ｋ１４をヒト表皮角化細胞において検出した結果を示す図表である。 試験例２３において角化細胞マーカーＦｉｌａｇｇｒｉｎをヒト表皮角化細胞において検出した結果を示す図表である。
　（ヒアルロン酸フラグメント）
　本発明で使用するヒアルロン酸フラグメントは、ヒアルロン酸の構成単位である、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとがグリコシド結合してなる二糖単位を少なくとも含み、２糖以上２０糖以下のサイズのものを意味する。具体的には、下記式（１）、式（２）、式（３）又は式（４）で表わされる構造を有するヒアルロン酸フラグメントである。
ＧｌｃＡ（－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＡ）ｎ－ＧｌｃＮＡｃ　　（１）
（式（１）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン残基を、－はグリコシド結合を、ｎは０～９の整数を示す。）
ＧｌｃＡ（－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＡ）ｎ　　（２）
（式（２）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン残基を、－はグリコシド結合を、ｎは０～９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＡｃ）ｎ－ＧｌｃＡ　　（３）
（式（３）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン残基を、－はグリコシド結合を、ｎは０～９の整数を示す。）
ＧｌｃＮＡｃ（－ＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＡｃ）ｎ　　（４）
（式（４）中、ＧｌｃＡはグルクロン酸残基を、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン残基を、－はグリコシド結合を、ｎは０～９の整数を示す。）
　なお、上記式中のＧｌｃＡ－ＧｌｃＮＡｃにおけるグリコシド結合はβ１→３結合であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＡにおけるグリコシド結合はβ１→４結合であることが好ましい。
　本発明で使用するヒアルロン酸フラグメントは、上記基本構造を有すればよく、その糖部分が修飾されていることに、特に制限はない。例えば、糖の水酸基の一部またはすべては、エステル化、エーテル化等を受けていてもよい。グルクロン酸のカルボキシル基の一部またはすべては、エステル化、アミド化等を受けていてもよい。非還元末端に位置する糖は、飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよい。
　上記ヒアルロン酸フラグメントは、そのサイズが２糖以上２０糖以下であるので、組織・細胞内に浸透しやすい。また、低粘度のため効率よく塗布するのにも適している。そのサイズは、３糖以上１０糖以下であることがより好ましい。これによれば、組織・細胞内に更により浸透しやすい。また、低粘度のため効率よく塗布するのにも更により適している。そのサイズは３糖又は４糖であることが最も好ましい。これによれば、前記効果とともに、組織・細胞に対する効果が、他のサイズのものに比べ顕著に優れている。
　本発明においては、ヒアルロン酸フラグメントの薬学的に許容される塩を用いることもできる。その塩としては、アルカリ金属塩であるナトリウム塩やカリウム塩などが挙げられる。また、無水塩のみならず含水塩が含まれてもよい。その塩は、原料に由来するものであったり、また、ヒアルロン酸フラグメントの調製時に持ち込まれたりする場合もある。これらの塩は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸フラグメントと同様に機能する。
　本発明においては、ヒアルロン酸フラグメントの薬学的に許容される溶媒和物を用いることもできる。溶媒和物としては、水和物が挙げられる。例えば、大気中に放置したり、再結晶することにより、水分を吸収したり、吸着水が付いたりして、水和物となる場合がある。また、ヒアルロン酸フラグメントの調製時に持ち込まれる場合もある。これらの溶媒和物は、例えば、溶液内や生体内などで電離してヒアルロン酸フラグメントと同様に機能する。
　上記ヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物は、その１種類のみを用いてもよく、その２種以上の複数を用いてもよい。すなわち、ヒアルロン酸フラグメントのサイズや分子構造が単一であってもよく、それらの異なるヒアルロン酸フラグメントを併用し、又はそれらの異なるヒアルロン酸フラグメントの複数を含有する複合物を用いてもよい。更に、塩や溶媒和物についても、単一種であってもよく、それらの異なる複数種を併用し、又はそれらの異なる複数種を含有する複合物を用いてもよい。
　（ヒアルロン酸フラグメントの製造方法）
　本発明で使用するヒアルロン酸フラグメントは、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたものであってよく、また、化学的もしくは酵素的に合成されたものを使用してもよい。好ましくは、例えば鶏冠、臍体、皮膚、関節液などの生体組織から公知の抽出法によって得ることができるヒアルロン酸を酵素分解、酸分解、塩基分解、加熱処理、超音波処理などの分解処理した後、公知の精製法によってヒアルロン酸フラグメントを精製することにより製造することができる。また、乳酸菌やストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法によって生成されるヒアルロン酸を出発原料として同様に製造することができる。更には、市販の高分子量のヒアルロン酸を出発原料としてもよい。
　酵素分解の方法によりヒアルロン酸フラグメントを製造する場合、国際公開第２００２／４４７１号パンフレットや、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、第１２巻、第７号、第４２１－４２６頁に開示される方法に準じて製造することができる。高分子量ヒアルロン酸塩を、溶液のｐＨが５付近になるように緩衝液（例えば、０．１Ｍリン酸緩衝液）に溶解し、ヒアルロニダーゼを添加して加水分解を行う。加水分解の温度は、３７℃付近が好ましく、１～２４時間程度反応させる。反応後、１０、０００ｒｐｍ程度で遠心分離して上清を回収し、この上清をイオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸フラグメントを得ることができる。
　酸加水分解によりヒアルロン酸フラグメントを製造する場合、高分子量ヒアルロン酸塩を、濃塩酸の５０％水溶液中において、４０℃～還流温度で１～５時間程度反応させる。反応後、イオン交換カラムなどにより分画することにより特定のサイズのヒアルロン酸フラグメントを得ることができる。また、ＤＭＳＯの溶媒中に０．０５～１Ｍ程度の塩酸を用いて加熱することにより、より緩和な条件下で加水分解を行うこともできる。
　一方、Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779には、固相合成法によって、下記のようなヒアルロン酸フラグメントを、その糖サイズごとに効率よく製造する方法が開示されているので、そのような方法によって製造することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　なお、上記のうち（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｆ）の基本的糖構成を有するヒアルロン酸フラグメントは、ヒアルロン酸を出発原料にしてそれを分解処理することによっては、ほとんど得られないか、あるいは非常に収率の悪いヒアルロン酸フラグメントである。
　（剤形等）
　本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤は、上記に説明したヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物（以下、単に「ヒアルロン酸フラグメント」という。）を、その有効成分として含有するものである。
　ヒアルロン酸フラグメントの含有量は、本発明の効果を発揮すれば特に限定されるものではないが、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤の総質量に対して、０．０００１質量％以上１００質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以上２０質量％以下であることがより好ましく、０．５質量％以上５質量％以下であることが最も好ましい。
　本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤は、例えば、医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いることができる。
　医薬品の形態としては、例えば、錠剤、液剤、乾燥粉末剤、注射剤、点滴剤、外用剤、貼付剤、気化投与用の液剤、挿入剤などが挙げられる。この場合、１種又は２種以上の薬学的に許容される成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、添加剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、アルコール、水、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料などを加えることができる。また、外用の形態で用いる場合には、例えば、ステアリン酸カルシウムや乳化剤といった滑沢剤、イオン交換水などの角質層へ水分を供給するための精製水、グリセリン、ＰＥＧといった角質層の保湿のための保湿剤、エステル油、植物油といった保湿性や使用感の向上のためのエモリエント剤（水分が蒸発することを防ぐ油成分）、原料成分を可溶化するための可溶化剤、ｐＨを調整するための緩衝剤、微生物を抑制し、腐敗を防止するための防腐剤、着色するための着色剤、紫外線吸収剤といった退色や変色を防止するための退色防止剤、収れん剤、殺菌剤、賦活剤、消炎剤などを加えることができる。
　機能性食品の形態としては、例えば、液状食品、錠剤食品、粉末状食品、顆粒状食品などが挙げられる。この場合、食用として許容される１種又は２種以上の成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ナイアシン、ビタミンＥといったビタミン類、油脂類、増粘剤、防腐剤、着色料、並びに酸化防止剤、調味料、酸味料、甘味料などを加えることができる。
　化粧料の形態としては、例えば、点眼剤、ゲル、クリーム、スプレー液剤、噴霧液剤、泡状エアゾール製剤、ゲル状やシート状のフェイスマスクなどが挙げられる。この場合、１種又は２種以上の化粧料製剤的に許容される成分又は担体と組み合わせて調製してもよい。例えば、ステアリン酸カルシウムや乳化剤といった滑沢剤、イオン交換水などの角質層へ水分を供給するための精製水、グリセリン、ＰＥＧといった角質層の保湿のための保湿剤、エステル油、植物油といった保湿性や使用感の向上のためのエモリエント剤（水分が蒸発することを防ぐ油成分）、原料成分を可溶化するための可溶化剤、ｐＨを調整するための緩衝剤、微生物を抑制し、腐敗を防止するための防腐剤、着色するための着色剤、紫外線吸収剤といった退色や変色を防止するための退色防止剤、収れん剤、殺菌剤、賦活剤、消炎剤などを加えることができる。
　本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤を、医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いる場合、ヒアルロン酸フラグメントの含有量は、その医薬品、機能性食品、又は化粧料の総質量に対して、０．０００１質量％以上１００質量％以下であることが好ましく、０．０１質量％以上２０質量％以下であることがより好ましく、０．５質量％以上５質量％以下であることが最も好ましい。
　本発明に係るサーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤の投与形態としては、経口的に摂取したり、注射剤や点滴剤の形態にて静脈注射や灌流することにより投与したりすることができる。あるいは皮膚に塗布したり、呼吸器系から吸引したりして吸収させてもよく、それらの局所に適用してもよい。点眼投与であってもよい。いずれにしてもこれらの投与形態に特に制限されるものではない。また、ヒトだけでなく動物にも適用できる。
　ヒアルロン酸フラグメントの１回あたりの投与量、投与間隔等は、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、経口摂取する場合には、成人１人１回当り１ｍｇ～７５００ｍｇが例示される。また、皮膚に塗布する場合には、単位面積あたり一回およそ０．０１μｇ～１０００μｇ／ｃｍ２の量が例示される。また、点眼投与する場合には、１回当り０．０１μｇ～１０００μｇの適用量が例示される。
　なお、ヒアルロン酸フラグメントは毒性や抗原性がほとんどないことから、副作用のおそれの極めて少ない、サーチュイン誘導剤、組織修復剤、肝細胞増殖因子誘導剤、組織恒常性維持剤、又はＴＬＲ４作用剤として有効に作用する。
　（サーチュイン誘導剤）
　サーチュイン蛋白質は、ＳＩＲＴ１遺伝子の翻訳産物であり、ヒストンを脱アセチル化する酵素である。サーチュイン蛋白質が発現した細胞では、ヒストンからアセチル基が外れ、ＤＮＡがヒストンに巻き付く力が強くなる。ＤＮＡがヒストンに強く巻き付いた結果、その領域の遺伝子の発現は低下し、これにより特定の遺伝子や転写因子の発現が調節される。また、ＤＮＡの損傷も減少する。サーチュイン蛋白質は、また、ストレス抵抗性、脂肪・グルコース代謝、神経細胞の分化など、さまざまな細胞機能の調節作用を担うことで細胞、組織又は生物個体の寿命の決定に関与している。
　よって、本発明に係るサーチュイン誘導剤は、サーチュイン蛋白質の発現を促進することによって、細胞、組織、生物個体等の老化を抑制することができる。そして、生物個体を健康にたもち、その寿命を長くすることができる。また、細胞、生体組織レベルにおいても、その老化を抑制して、例えば、その活性維持や生存期間の延長を図ることができる。
　更に、例えば、遺伝子操作でサーチュイン発現を高めてやると癌形成が抑制され、逆にサーチュイン遺伝子（ＳＩＲＴ１遺伝子）をノックダウンすると癌形成が促進されることが報告されている（Kabra N, Li Z, Chen L, Li B, Zhang X, Wang C, Yeatman T, Coppola D, Chen J「SirT1 is an inhibitor of proliferation and tumor formation in colon cancer.」J Biol. Chem. 2009 Jul 3;284(27):18210-7.）。
　また、サーチュイン誘導により心筋梗塞を治療できるという報告もある（Samuel SM, Thirunavukkarasu M, Penumathsa SV, Paul D, Maulik N「Akt/FOXO3a/SIRT1-mediated cardioprotection by n-tyrosol against ischemic stress in rat in vivo model of myocardial infarction: switching gears toward survival and longevity.」J Agric Food Chem. 2008 Oct 22;56(20):9692-8.）。
　また、サーチュイン誘導により、血管内皮細胞の老化を抑制して、動脈硬化を防ぐという報告もある（Ota H, Eto M, Ogawa S, Iijima K, Akishita M, Ouchi Y「SIRT1/eNOS axis as a potential target against vascular senescence, dysfunction and atherosclerosis.」Journal of Atherosclerosis and Thrombosis Vol. 17 (2010) No. 5 p431-435.)。
　また、サーチュイン誘導により、動脈狭窄・動脈硬化をもたらす因子であるレジスチン（resistin）が抑制されるという報告もある（Carter S, Miard S, Roy-Bellavance C, Boivin L, Li Z, Pibarot P, Mathieu P, Picard F「Sirt1 inhibits resistin expression in aortic stenosis.」PLoS One. 2012;7(4):e35110.)。
　また、サーチュイン誘導により、骨破壊をもたらす破骨細胞におけるNF-kappaB活性化を抑制して、骨粗鬆症を防ぐという報告もある（Shakibaei M, Buhrmann C, Mobasheri A「Resveratrol-mediated SIRT-1 interactions with p300 modulate receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) activation of NF-kappaB signaling and inhibit osteoclastogenesis in bone-derived cells.」J Biol Chem. 2011 Apr 1;286(13):11492-505.)。
　また、サーチュイン誘導により、炎症を増悪させる因子NF-kappaBの抑止し、炎症性腸炎の症状を軽減できるという報告もある（Singh UP, Singh NP, Singh B, Hofseth LJ, Price RL, Nagarkatti M, Nagarkatti PS「Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) induces silent mating type information regulation-1 and down-regulates nuclear transcription factor-kappaB activation to abrogate dextran sulfate sodium-induced colitis.」J Pharmacol Exp Ther. 2010 Mar;332(3):829-39.)。
　また、サーチュイン蛋白質は、認知症（アルツハイマー病）の原因となっているアミロイドβ産生を抑制するという報告もある（Donmez G, Wang D, Cohen DE, Guarente L「SIRT1 suppresses beta-amyloid production by activating the alpha-secretase gene ADAM10.」Cell 2010 Jul 23;142(2):320-32.)。
　また、種々のアルツハイマー病動物モデルにおいて、サーチュイン誘導により、治療効果が認められたという報告もある（Donmez G「The Effects of SIRT1 on Alzheimer's Disease Models.」Int J Alzheimers Dis. 2012;2012:509529.)。
　また、脳卒中（脳虚血）モデルにおいて、ニコチンアミドリボースリン酸転移酵素（Nicotinamide phosphoribosyltransferase）よる脳障害の抑制作用には、サーチュイン蛋白質が関与しているという報告もある（Wang P, Xu TY, Guan YF, Tian WW, Viollet B, Rui YC, Zhai QW, Su DF, Miao CY「Nicotinamide phosphoribosyltransferase protects against ischemic stroke through SIRT1-dependent adenosine monophosphate-activated kinase pathway.」Ann Neurol. 2011 Feb;69(2):360-74.）。
　また、サーチュイン蛋白質高発現モデル（遺伝子操作による）において、通常の動物に比べて、メタボリックシンドロームによる障害とそれに関連するがん化が抑制されたという報告もある（Herranz D, Munoz-Martin M, Canamero M, Mulero F, Martinez-Pastor B, Fernandez-Capetillo O, Serrano M「Sirt1 improves healthy ageing and protects from metabolic syndrome-associated cancer.」Nat Commun. 2010 Apr 12;1:3.）。
　また、遺伝子操作でサーチュイン蛋白質発現を高めると癌形成が抑制され、逆にサーチュイン蛋白質発現を弱めると癌形成が促進されたという報告もある（Kabra N, Li Z, Chen L, Li B, Zhang X, Wang C, Yeatman T, Coppola D, Chen J「SirT1 is an inhibitor of proliferation and tumor formation in colon cancer.」J Biol Chem. 2009 Jul 3;284(27):18210-7.）。
　また、大気微粒子に起因する肺の炎症や血栓に関し、サーチュイン蛋白質がその作用の抑制性因子であるという報告もある（Wu Z, Liu MC, Liang M, Fu J「Sirt1 protects against thrombomodulin down-regulation and lung coagulation after particulate matter exposure.」Blood. 2012 Mar 8;119(10):2422-9.）。
　また、喫煙は、サーチュイン蛋白質を介した作用により肺の細胞にオートファジーをもたらし、これがＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）の要因であり、サーチュイン誘導により、そのオートファジーが抑制されたという報告もある（Hwang JW, Chung S, Sundar IK, Yao H, Arunachalam G, McBurney MW, Rahman I「Cigarette smoke-induced autophagy is regulated by SIRT1-PARP-1-dependent mechanism: implication in pathogenesis of COPD.」Arch Biochem Biophys. 2010 Aug 15;500(2):203-9.)。
　また、腎臓の虚血再還流障害モデルにサーチュイン活性化剤を投与すると、腎臓における細胞死が抑制されて、腎障害が低減化されたという報告もある（Fan H, Yang HC, You L, Wang YY, He WJ, Hao CM「The histone deacetylase, SIRT1, contributes to the resistance of young mice to ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury.」Kidney Int. 2013 Jan 9.)。
　また、サーチュイン誘導により、シスプラチンが誘導する腎臓の尿細管に対する毒性およびNF-kappaB活性化が低減化されたという報告もある（Jung YJ, Lee JE, Lee AS, Kang KP, Lee S, Park SK, Lee SY, Han MK, Kim DH, Kim W「SIRT1 overexpression decreases cisplatin-induced acetylation of NF-κB p65 subunit and cytotoxicity in renal proximal tubule cells.」Biochem Biophys Res Commun. 2012 Mar 9;419(2):206-10.)。
　また、インスリン抵抗性の発生機序には、サーチュイン蛋白質が関与するという報告もある（Chen YR, Lai YL, Lin SD, Li XT, Fu YC, Xu WC「SIRT1 interacts with metabolic transcriptional factors in the pancreas of insulin-resistant and calorie-restricted rats.」Mol Biol Rep. 2013 Jan 6.)。
　また、降圧薬テルミサルタンによる、インスリン感受性の向上の作用機序には、サーチュイン蛋白質が関与するという報告もある（Shiota A, Shimabukuro M, Fukuda D, Soeki T, Sato H, Uematsu E, Hirata Y, Kurobe H, Maeda N, Sakaue H, Masuzaki H, Shimomura I, Sata M「Telmisartan ameliorates insulin sensitivity by activating the AMPK/SIRT1 pathway in skeletal muscle of obese db/db mice.」Cardiovasc Diabetol. 2012 Nov 8;11:139.）。
　また、サーチュイン蛋白質は、ヒト軟骨細胞においてＴＮＦαが誘導する炎症を制御するという報告もある（Moon MH, Jeong JK, Lee YJ, Seol JW, Jackson CJ, Park SY「SIRT1, a class III histone deacetylase, regulates TNF-α-induced inflammation in human chondrocytes.」Osteoarthritis Cartilage. 2013 Mar;21(3):470-80.)。
　また、ヒトの軟骨細胞では、サーチュイン蛋白質を過剰発現させると、ＩＬ－１ｂｅｔａ処理しても変形性関節因子の発現が抑制されるという報告もある（Matsushita T, Sasaki H, Takayama K, Ishida K, Matsumoto T, Kubo S, Matsuzaki T, Nishida K, Kurosaka M, Kuroda R「The overexpression of SIRT1 inhibited osteoarthritic gene expression changes induced by interleukin-1β in human chondrocytes.」J Orthop Res. 2012 Nov 9.）。
　また、サーチュイン蛋白質は、リウマチの増悪因子の作用に関与しているという報告もある。（Kok SH, Lin LD, Hou KL, Hong CY, Chang CC, Hsiao M, Wang JH, Lai EH, Lin SK「Simvastatin inhibits Cyr61 expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through the regulation of SIRT1/FoxO3a signaling.」Arthritis Rheum. 2012 Dec 12.)。
　また、サーチュイン活性化剤により、プロジェリア（Progeria）モデル動物の疾患改善効果が示されたという報告もある。（Liu B, Ghosh S, Yang X, Zheng H, Liu X, Wang Z, Jin G, Zheng B, Kennedy BK, Suh Y, Kaeberlein M, Tryggvason K, Zhou Z「Resveratrol rescues SIRT1-dependent adult stem cell decline and alleviates progeroid features in laminopathy-based progeria.」Cell Metab. 2012 Dec 5;16(6):738-50.)。
　また、放射線障害は、GAPDHの細胞質から核への移行により細胞死が誘導されることによりもたらされ、サーチュイン蛋白質はそのGAPDHの核移行を抑制し、細胞死を抑制したという報告もある。（Joo HY, Woo SR, Shen YN, Yun MY, Shin HJ, Park ER, Kim SH, Park JE, Ju YJ, Hong SH, Hwang SG, Cho MH, Kim J, Lee KH「SIRT1 interacts with and protects glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from nuclear translocation: implications for cell survival after irradiation.」Biochem Biophys Res Commun. 2012 Aug 10;424(4):681-6.)。
　また、サーチュイン蛋白質には、筋線維を強化するだけでなく、筋肉を種々の疾患から保護する作用があるという報告もある。（Tonkin J, Villarroya F, Puri PL, Vinciguerra M「SIRT1 signaling as potential modulator of skeletal muscle diseases.」Curr Opin Pharmacol. 2012 Jun;12(3):372-6.)。
　また、サーチュイン蛋白質を高発現させると海馬神経細胞の樹状突起形成が促進され、逆にサーチュイン阻害剤を作用させると、樹状突起は萎縮し、更に、サーチュイン蛋白質を高発現させると、アミロイドβ処理による樹状突起萎縮も抑制するので、これは、サーチュイン蛋白質が海馬などの脳神経組織の発達および維持をもたらしていることを意味するという報告もある。（Codocedo JF, Allard C, Godoy JA, Varela-Nallar L, Inestrosa NC「SIRT1 regulates dendritic development in hippocampal neurons.」PLoS One. 2012;7(10):e47073.)。
　また、サーチュイン蛋白質は、高血圧を誘導する因子であるアンジオテンシンＩＩ（angiotensinII）を抑制するという報告もある（Li L, Gao P, Zhang H, Chen H, Zheng W, Lv X, Xu T, Wei Y, Liu D, Liang C「SIRT1 inhibits angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy.」Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2011 Feb;43(2):103-9.)。
　また、サーチュイン誘導により、インシュリン抵抗性や肥満が抑制されるという報告もある（Li H, Xu M, Lee J, He C, Xie Z「Leucine supplementation increases SIRT1 expression and prevents mitochondrial dysfunction and metabolic disorders in high-fat diet-induced obese mice.」Am J Physiol Endocrinol Metab. 2012 Nov 15;303(10):E1234-44.)。
　よって、本発明に係るサーチュイン誘導剤は、特に、心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために、好ましく用いられる。
　（組織修復剤）
　本発明に係る組織修復剤は、生体組織の創傷部位や、欠損部位の組織の修復を促進するものである。より具体的には、生体組織の創傷部位や欠損部位の細胞増殖を促進し、又は細胞の分化を誘導することで、生体組織の創傷部位や、欠損部位の組織の修復を促進することができる。
　例えば、褥瘡傷（床ずれ）、栄養性潰瘍、火傷、無痛性潰瘍、外傷後潰瘍、静脈および静脈炎後の静脈血腫による潰腫、皮膚病巣、皮膚移植および単純ヘルペスに由来する皮膚病変を含む種々の傷の処置に有用である。また、例えば、角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復に、好ましく用いられる。
　（肝細胞増殖因子誘導剤）
　肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、分子量約６万の重鎖と約３．５万の軽鎖がジスルフィド結合したヘテロダイマーの構造を有するタンパク質である。肝細胞増殖因子は生体内において合成された後、Ｎ末端シグナルペプチドの除去、細胞外への分泌を経て、ＨＧＦアクチベーター又はウロキナーゼ（ｕ－ＰＡ）などにより２本鎖に切断され活性型となる。
　肝細胞増殖因子は、肝細胞の増殖を促進するだけでなく、主臓器由来の上皮細胞を中心に、血管内皮細胞、造血系細胞及び神経系細胞に働き、様々な細胞を活性化し、増殖を促す。また、皮膚等の賦活化にも関与している。例えば、肝細胞増殖因子は、上皮細胞である角化細胞、毛母、毛包細胞及び直下の血管内皮細胞に作用し、細胞を活性化する。更に、肝細胞増殖因子は、細胞運動性亢進作用、管腔形成などの形態形成誘導作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用および免疫応答調節作用なども有する。このように、肝細胞増殖因子は、生体内のおいて重要な役割を担っている。
　よって、本発明に係る肝細胞増殖因子誘導剤は、肝細胞増殖因子の発現を促進することにより、肝臓、心臓、胃腸、血管、皮膚を含む各種の臓器や組織の細胞を活性化し、又はその活性を維持し、それらを炎症、細菌、ウイルス等の疾病因子や、経時的あるいは外的な損傷から保護することができる。特に、肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために、好ましく用いられる。
　本発明に係る肝細胞増殖因子誘導剤の他の側面は、ＨＧＦの形態形成誘導作用や血管新生作用である。例えば、血管，皮膚や胃腸などの創傷治癒の効果を期待できる。また、肝炎などの肝障害、腎炎などの腎障害、肺炎などの肺障害などの各種炎症に対して著しい防止作用の効果を期待できる。
　本発明に係る肝細胞増殖因子誘導剤の更に他の側面は、化粧料の形態で用いることに関する。本発明に係る化粧料は、ヒアルロン酸フラグメントを有することで、肝細胞増殖因子の発現を促進する効果を有する。このため、例えば皮膚の炎症を抑えることができる。また、生体表面の細胞を活性化することで、生体表面の細胞増殖を促進し、抗老化作用発揮できる。例えば、特開平５－２１３７３３号公報には、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を有効成分とする日焼けによる肌荒れを改善し、皮膚の小ジワを改善する美肌効果に優れた皮膚化粧料が開示されている。本発明に係る化粧料も、この公報に開示された化粧料と同様、日焼けによる肌荒れを改善し、皮膚の小ジワを改善する美肌効果に優れた皮膚化粧料としても機能する。
（組織恒常性維持剤）
　組織老化は、組織幹細胞の枯渇によることが報告されている(Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE「Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche.」Science. 2005 Feb 4;307(5710):720-4)。すなわち、組織老化は、組織において細胞が新生増殖しないことと、構成細胞が機能不全になることにより起こる。したがって、組織老化を防ぐには、＜1＞組織幹細胞の維持・増殖と＜2＞機能する細胞である成熟・分化した細胞の誘導ならびに＜3＞成熟・分化した細胞をなるべく機能するように保つことが必要である。
　後述する実施例のヒト角化細胞とヒトneurosphereの例により、ヒアルロン酸フラグメントは、組織幹細胞の維持と分化誘導の両方をもたらすことが判明した。
　よって、本発明に係る組織恒常性維持剤によれば、特に、組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導することにより、生体組織レベルにおいて、その老化を抑制して、例えば、その活性維持や生存期間の延長を図ることができる。
　（ＴＬＲ４作用剤）
　後述する実施例により、ヒアルロン酸フラグメントは、サーチュイン蛋白質の発現を促進し、その発現誘導はＴＬＲ４（ｔｏｌｌ様レセプター４）を介する作用によりもたらされることが判明した。また、ヒアルロン酸フラグメントは、ＴＮＦ－α処理によって引き起こされるＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量の増加を抑制し、その抑制もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。更に、ヒアルロン酸フラグメントは、種々の原因に起因する細胞老化を抑制する作用効果を有し、その抑制もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。更にまた、ヒアルロン酸フラグメントは、組織保存液に保存した後の組織の障害を軽減する作用効果を有し、その軽減もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。更にまた、ヒアルロン酸フラグメントは、細胞分化を誘導し、その誘導もＴＬＲ４を介する作用によりもたらされることが判明した。
　ＴＬＲ４（ｔｏｌｌ様レセプター４）は、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）を認識する受容体として見出され、例えば、炎症をもたらすＮＦ－ｋａｐｐａＢを活性化させる受容体であることが知られている。また、ＮＦ－ｋａｐｐａＢの活性化以外にも、ＴＬＲ４は、以下の文献に示すように、角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、血管など各臓器・細胞に発現し、様々な生理機能に関与していることが知られている。よって、そのＴＬＲ４を利用して、下記記載の種々の疾患の治療・予防に応用できる。
・角膜（角膜上皮、ケラトサイト）
　角膜疾患：ドライアイ、角膜上皮障害、角膜上皮剥離、炎症による角膜組織破壊など
Johnson AC, Heinzel FP, Diaconu E, Sun Y, Hise AG, Golenbock D, Lass JH, Pearlman E「Activation of toll-like receptor (TLR)2, TLR4, and TLR9 in the mammalian corneainduces MyD88-dependent corneal inflammation.」Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Feb;46(2):589-95.
・皮膚（keratinocytes、ラングハンス細胞、線維芽細胞）
　皮膚疾患：褥瘡，皮膚潰瘍、感染・炎症による皮膚組織破壊など
1. Tuon FF, Fernandes ER, Duarte MI, Amato VS「The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 in the epidermisof patients with cutaneous leishmaniasis.」J Dermatol Sci. 2010 Jul;59(1):55-7.
2. Yuan ZQ, Bennett L, Campo MS, Nasir L「Bovine papillomavirus type 1 E2 and E7 proteins down-regulate Toll Like Receptor 4 (TLR4) expression in equine fibroblasts.」Virus Res. 2010 Apr;149(1):124-7.
3. Wang X, Bi Z, Wang Y, Wang Y「Increased MAPK and NF-κB expression of Langerhans cells is dependent on TLR2 and TLR4, and increased IRF-3 expression is partially dependent on TLR4following UV exposure.」Mol Med Report. 2011 May-Jun;4(3):541-6.
・肝臓（肝実質細胞、クッパー細胞）
　急性肝炎、慢性肝炎、肝移植障害など
1. Sahin H, Borkham-Kamphorst E, do O NT, Berres ML, Kaldenbach M, Schmitz P, Weiskirchen R, Liedtke C, Streetz KL, Maedler K, Trautwein C, Wasmuth HE「Proapoptotic effects of the chemokine, CXCL 10 are mediated by the noncognate receptor TLR4 in hepatocytes.」Hepatology. 2012 Sep 19. doi: 10.1002/hep.26069.
2. Bai T, Lian LH, Wu YL, Wan Y, Nan JX「Thymoquinone attenuates liver fibrosis via PI3K and TLR4 signaling pathways in activated hepatic stellate cells.」Int Immunopharmacol. 2013 Jan 12;15(2):275-281.
・神経組織（神経細胞、マイクログリア細胞）
　神経障害：認知症、神経発達障害、神経組織変性、神経分化阻害など
1. Capiralla H, Vingtdeux V, Zhao H, Sankowski R, Al-Abed Y, Davies P, Marambaud P「Resveratrol mitigates lipopolysaccharide- and Aβ-mediated microglial inflammation by inhibiting the TLR4/NF-κB/STAT signaling cascade.」J Neurochem. 2012 Feb;120(3):461-72.
2. Okun E, Barak B, Saada-Madar R, Rothman SM, Griffioen KJ, Roberts N, Castro K, Mughal MR, Pita MA, Stranahan AM, Arumugam TV, Mattson MP「Evidence for a developmental role for TLR4 in learning and memory.」PLoS One. 2012;7(10):e47522.
3. Hutchinson MR, Zhang Y, Brown K, Coats BD, Shridhar M, Sholar PW, Patel SJ, Crysdale NY, Harrison JA, Maier SF, Rice KC, Watkins LR「Non-stereoselective reversal of neuropathic pain by naloxone and naltrexone: involvement of toll-like receptor 4 (TLR4).」Eur J Neurosci. 2008 Jul;28(1):20-9.
・腎臓（メザンギウム細胞、腎上皮細胞）
　腎炎、腎症など
1. Lee IT, Shih RH, Lin CC, Chen JT, Yang CM「Role of TLR4/NADPH oxidase/ROS-activated p38 MAPK in VCAM-1 expression induced by lipopolysaccharide in human renalmesangial cells.」Cell Commun Signal. 2012 Nov 15;10(1):33.
2. Good DW, George T, Watts BA 3rd「Lipopolysaccharide directly alters renal tubule transport through distinct TLR4-dependent pathways in basolateral and apical membranes.」Am J Physiol Renal Physiol. 2009 Oct;297(4):F866-74.
・肺（上皮細胞、stromal cell、平滑筋）
　肺炎、ＣＯＰＤ、虚血再環流障害など
1. Perros F, Lambrecht BN, Hammad H「TLR4signalling in pulmonary stromal cells is critical for inflammation and immunity in the airways.」Respir Res. 2011 Sep 24;12:125.
2. Su HY, Mo BW, Wei JH, Huang JW, Wang CM, Zeng JR, Xu Q, Lin Y「Effect of TLR4 on the migration of asthmatic airway smooth muscle cells induced by airway epithelial cells.」Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2012 Mar;28(2):103-6.
・心臓（心筋）
　心筋梗塞、狭心症など
Frantz S, Kobzik L, Kim YD, Fukazawa R, Medzhitov R, Lee RT, Kelly RA「Toll4 (TLR4) expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium.」J Clin Invest. 1999 Aug;104(3):271-80.
・骨格筋（骨格筋細胞）
　筋萎縮、多発筋炎、重症筋無力症、筋ジストロフィーなど
Zbinden-Foncea H, Raymackers JM, Deldicque L, Renard P, Francaux M「TLR2 and TLR4 activate p38 MAPK and JNK during endurance exercise in skeletal muscle.」Med Sci Sports Exerc. 2012 Aug;44(8):1463-72.
・膵臓
　膵炎
1. Akbarshahi H, Axelsson JB, Said K, Malmstrom A, Fischer H, Andersson R「TLR4 dependent heparan sulphate-induced pancreatic inflammatory response is IRF3-mediated.」J Transl Med. 2011 Dec 21;9:219.
2. Awla D, Abdulla A, Regner S, Thorlacius H「TLR4 but not TLR2 regulates inflammation and tissue damage in acute pancreatitis induced by retrograde infusion of taurocholate.」Inflamm Res. 2011 Dec;60(12):1093-8.
・動脈（平滑筋）
　動脈硬化など
Li H, Xu H, Sun B「Lipopolysaccharide regulates MMP-9 expression through TLR4/NF-κB signaling in human arterial smooth muscle cells.」Mol Med Report. 2012 Oct;6(4):774-8.
　よって、本発明に係るＴＬＲ４作用剤によれば、そのＴＬＲ４を介する作用によって、各種の疾患を治療及び／又は予防することができる。例えば、ドライアイ、角膜上皮障害、角膜上皮剥離、炎症による角膜組織破壊などの角膜疾患；褥瘡，皮膚潰瘍、感染・炎症による皮膚組織破壊などの皮膚疾患；急性肝炎、慢性肝炎、肝移植障害などの肝臓疾患；認知症、神経発達障害、神経組織変性、神経分化阻害などの神経組織疾患；腎炎、腎症などの腎臓疾患；肺炎、ＣＯＰＤ、虚血再環流障害などの肺疾患；心筋梗塞、狭心症などの心臓疾患；筋萎縮、多発筋炎、重症筋無力症、筋ジストロフィーなどの骨格筋疾患；膵炎などの膵臓疾患；動脈硬化などの血管疾患などにおける疾患の治療及び／又は予防のために、好適に用いられる。
　以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　下記に試験例において用いたヒアルロン酸フラグメントをまとめて示す。
　（１）４ｍｅｒ
・「ＨＹＡ－ＯＬＩＧＯ４ＥＦ－５」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
　これは、ＧｌｃＡ（－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＡ）１－ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた４糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。
　（２）６ｍｅｒ
・「ＨＹＡ－ＯＬＩＧＯ６ＥＦ－１」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
　これは、ＧｌｃＡ（－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＡ）２－ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた６糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。
　（３）８ｍｅｒ
・「ＨＹＡ－ＯＬＩＧＯ８ＥＦ－１」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
　これは、ＧｌｃＡ（－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＡ）３－ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた８糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。
　（４）１０ｍｅｒ
・「ＨＹＡ－ＯＬＩＧＯ１０ＥＦ－１」（商品名、Ｈｙａｌｏｓｅ社製）
　これは、ＧｌｃＡ（－ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＡ）４－ＧｌｃＮＡｃの構造を有する、ヒアルロン酸を酵素分解して精製して得られた８糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。
　（５）Ｌ３ｍｅｒ
・下記（ａ）の構造を有するヒアルロン酸フラグメント
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　これは、固相合成法（Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779）により化学合成して精製して得られた３糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。
　（６）Ｌ４ｍｅｒ
・下記（ｅ）の構造を有するヒアルロン酸フラグメント
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　これは、固相合成法（Walvoort MT, Volbeda AG, Reintjens NR, van den Elst H, Plante OJ, Overkleeft HS, van der Marel GA, Codee JD「Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides.」Org. Lett., 2012, 14 (14), p3776-3779）により化学合成して精製して得られた４糖サイズのヒアルロン酸フラグメントである。
　＜試験例１＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導　その１）
　ヒト表皮角化細胞（正常ヒト角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、アジア人女性（２７歳）由来））を培養し、準備した。ヒト表皮角化細胞は、長期培養用増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅ－ＫＧ２）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。その後、細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌの培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培地（Ｇｉｂｃｏ社製「ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　ＳＦＭ」）、又はこれにヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した各濃度の同培地に替え、２４時間培養した。
　２４時間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色した。抗ヒトＳＩＲＴ１抗体は、ヒトのサーチュイン蛋白質を認識し、染色する抗体である。染色した細胞を、ニコン社製の顕微鏡を用いて観察し、細胞の形状及び細胞の染色像を撮影した。
　図１にはその染色像の写真を示す。図１（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｂ）は、０．０１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｃ）は、０．１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｄ）は、１．０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図１（ｅ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。
　図１（ａ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞では、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の数は少なく、染色された細胞では、細胞全体が薄く染色された。
　一方、図１（ｂ）～（ｅ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞では、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の数が増加し、細胞の核が特に濃く染色された。これらの結果から、ヒト表皮角化細胞でのサーチュイン蛋白質の発現が、ヒアルロン酸フラグメントにより促進されていることがわかる。
　上記の染色像を、画像解析ソフト（フリーソフト「Ｉｍａｇｅ Ｊ」）を用いて解析した結果を表１示す。また、図２には、表１の結果をグラフで示す。なお、この結果の染色強度は、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体による染色の程度を示しており、その値が高いほど、サーチュイン蛋白質の発現量が多いといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１又は図２に示されるように、０．０１ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌの濃度のヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞では、サーチュイン蛋白質の発現量が、ヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の発現量に比べて有意に増加していることがわかる。
　＜試験例２＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導　その２）
　ヒアルロン酸フラグメントの最終濃度を１０ｎｇ／ｍｌとし、そのサイズを４糖（４ｍｅｒ）、６糖（６ｍｅｒ）、１０糖（１０ｍｅｒ）と替えて行なった以外は、試験例１と同様にしてヒト表皮角化細胞を処理し、その細胞溶解液におけるサーチュイン酵素活性（ｓｉｒｔ１酵素活性）を測定した。比較のため、１０ｋＤａ又は９００ｋＤａのヒアルロン酸や、サーチュイン活性化剤であることが知られているレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）についても、同じく１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。また、遺伝子組み換え手法により作成されたヒトサーチュイン組み換え蛋白質（recombinant human sirt 1）を測定系を検証する物質として用いた。なお、サーチュイン酵素活性は、細胞の粗抽出液を「CycLex SIRT1/Sir2 Deacetylase Fluorometric Assay Kit」（商品名、サイクレックス社）に供し、キットのプロトコルに従い測定した。その結果を図３に示す。
　図３に示されるように、４糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）では、その測定値が陰性対照に比べ約３倍となった。サーチュイン活性化剤として知られているレスベラトロールは同じ量を添加しても変化を示さなかったことから、４糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）によるサーチュイン酵素活性の誘導効果が顕著であることが分かる。
　＜試験例３＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導　その３）
　試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞のサーチュイン誘導試験を行なった。
　図４には、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の染色像の写真を示す。図４（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。図４（ｂ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。
　図４に示されるように、図４（ａ）の陰性対照においては、主として丸く小さな細胞にサーチュイン蛋白質の発現が見られた（図中、矢印をもってその細胞を示す。）。また、細胞体が比較的小さな未熟細胞が多かった。一方、図４（ｂ）に示すように、ヒアルロン酸フラグメントの処理により、より大きなサイズの細胞すなわち成熟した細胞が多く出現し、その細胞にサーチュイン蛋白質の発現が見られた（図中、矢印をもってその細胞を示す。）。
　細胞の大きさの変化について、画像解析ソフト（「Ｉｍａｇｅ Ｊ」）を用いて解析した。その結果を表２示す。また、図５には、表２の結果をグラフで示す。なお、この結果のピクセル数は、１つ細胞の画像上での面積を示しており、その値が高いほど、細胞が大きいといえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表２又は図５に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントによる２４時間の処理で、より大きな細胞が出現したことがわかる。別途、Alcian blue染色により細胞外基質分泌が通常どおりであることが確認されたことから、細胞の活性（vaibility）は衰えておらす、このような形態変化は細胞の老化を示す肥大ではなく、分化によるものと考えられた。なお、ここには最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）で処理したときの結果を示したが、４糖サイズ（４ｍｅｒ）、６糖サイズ（６ｍｅｒ）、８糖サイズ（８ｍｅｒ）のいずれのヒアルロン酸フラグメントを使用した場合も、また最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌのいずれの処理においても、同様の形態変化が認められた。
　＜試験例４＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導　その４）
　試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞のサーチュイン誘導試験を行なった。
　図６には、抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色された細胞の染色像の写真を示す。この図６は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有した培養液で２４時間培養したヒト表皮角化細胞の様子を示したものである。
　図６に矢印で示した分裂中の細胞は、他に比べて小さく、そのような細胞においてサーチュイン蛋白質が高発現していた。一般的に、組織幹細胞は成熟した細胞に比べ高い増殖能（分裂能）を有しており、その形態上も、成熟した細胞に比べて小さいことが知られている。また、サーチュイン蛋白質は幹細胞において高発現していることが報告されている。よって、図６に矢印で示した、サーチュイン蛋白質が高発現している分裂中の細胞は、ヒト表皮角化細胞の幹細胞であることがわかる。
　図７には、図６に矢印で示した細胞と同様な、分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞の細胞数についてまとめた結果を示す。結果は、観察した画像視野中での平均数で示す。
　図７に示されるように、最終濃度０．０１ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）、又は最終濃度１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）で処理したときのいずれの場合も、陰性対照に比べて、ヒト表皮角化細胞の幹細胞におけるサーチュイン蛋白質の発現が顕著に促進されていた。
　＜試験例５＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導　その５）
　試験例４と同様にして、分裂中の細胞であって、その形態が他の細胞より小さく、且つサーチュイン蛋白質が高発現している細胞を観察した。また、その際、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて１μｇ／ｍｌのＴＬＲ４／ＭＤ２（遺伝子組み換え手法により作成されたＴＬＲ４（ｔｏｌｌ様レセプター４）蛋白質、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社製）を加えた培養液で培養したヒト表皮角化細胞についても、同様に観察した。図８にその結果を示す。
　図８に示されるように、ヒト表皮角化細胞の幹細胞でのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）によるサーチュイン誘導は、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によって完全に阻害された。このことは、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）は、細胞表面のＴＬＲ４受容体に結合することによって、サーチュイン誘導を引き起こしていることを意味していた。よって、ＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、ヒアルロン酸フラグメントは、ＴＬＲ４を介する作用により、ヒト表皮角化細胞の幹細胞のサーチュイン誘導が起こし、ひいては幹細胞の増殖を引き起こすことが明らかとなった。
　＜試験例６＞（ヒト表皮角化細胞におけるサーチュイン誘導　その６）
　ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に替えて、化学合成品である３糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を用いて、試験例５と同様の試験を行なった。その結果を図９に示す。
　図９に示されるように、化学合成品である３糖サイズのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）によっても、ヒト表皮角化細胞の幹細胞でのヒサーチュイン誘導がもたらされた。そして、それが、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によってほぼ完全に阻害された。このことは、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）は、細胞表面のＴＬＲ４受容体に結合することによって、サーチュイン誘導を引き起こしていることを意味している。よって、ヒト表皮角化細胞の幹細胞のＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、サーチュイン誘導が起こり、ひいては幹細胞の増殖が引き起こされることが、更に確認できた。
　＜試験例７＞（ヒト神経幹細胞に対するＬ３ｍｅｒの作用）
　ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）（商品名「Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （Ｈ９-Ｄｅｒｉｖｅｄ）」Ｇｉｂｃｏ社製）を、培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。その後、細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌの培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）、又はヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した同培地に替え、１２日間培養した。
　１２日間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体及び抗ヒトチューブリン抗体で二重染色した。なお、Ｎｅｓｔｉｎは、神経幹細胞に特異的に発現している蛋白質であり、神経幹細胞マーカーである。染色した細胞を、ニコン社製の顕微鏡を用いて観察し、細胞の形状及び細胞の染色像を撮影した。
　図１０にはその染色像の写真を示す。図１０（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体による染色像を示したものである。図１０（ｂ）は、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトチューブリン抗体による染色像を示したものである。図１０（ｃ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトＮｅｓｔｉｎ抗体による染色像を示したものである。図１０（ｄ）は、１０ｎｇ／ｍｌのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の抗ヒトチューブリン抗体による染色像を示したものである。
　図１０（ａ）、（ｂ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントを加えていない培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）では、神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎの発現が確認できたが、細胞分化の指標であるチューブリンの発現が弱く、その形態上、突起形成も認められなかった。
　一方、図１０（ｃ）、（ｄ）に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有した培養液で培養したヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）では、Ｎｅｓｔｉｎとチューブリンの発現がともに確認でき、その形態上の突起形成も認められた。これらの結果から、ヒアルロン酸フラグメントは、ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）の幹細胞性を維持（Ｎｅｓｔｉｎ発現）しながら、神経細胞分化（突起形成およびチューブリン発現）を誘導していることがわかる。
　＜試験例８＞（ヒト大腸上皮細胞におけるサーチュイン誘導）
　ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、２４時間培養した。
　２４時間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗ヒトＳＩＲＴ１抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。その結果を図１１に示す。
　図１１に示されるように、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）においても、ヒアルロン酸フラグメントの処理によりサーチュイン誘導がもたらされた。そして、それが、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によってほぼ完全に阻害された。よって、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）においても、ＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、サーチュイン誘導が引き起こされることが明らかとなった。
　＜試験例９＞（ヒト大腸上皮細胞におけるＮＦ－ｋａｐｐａＢ発現に対する作用　その１）
　ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）をＴＮＦ－α処理したときのＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。なお、ＮＦ－ｋａｐｐａＢは、炎症、組織破壊などに関与する転写因子である。
　ＴＮＦ－αにヒアルロン酸フラグメントを添加したＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）と添加しないＤＭＥＭ培地を用意し、この培地でヒト大腸上皮細胞を２４時間処理した。その後、活性化した（リン酸化した）ＮＦｋａｐｐａＢを認識する抗体で染色した。
　図１２は、ＮＦ－ｋａｐｐａＢを蛍光染色したヒト大腸上皮細胞の様子を撮影したものである。図１２（ａ）は、ヒアルロン酸フラグメント及びＴＮＦ－αを添加していない培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｂ）は、ＴＮＦ－α処理のみをし、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｃ）は、ＴＮＦ－αおよび１０ｎｇ／ｍｌの４糖ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｄ）は、ＴＮＦ－αおよび１０ｎｇ／ｍｌの４糖及び６糖のヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒと６ｍｅｒを各５ｎｇ／ｍｌ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｅ）は、ＴＮＦ－αおよび１０ｎｇ／ｍｌの６糖のヒアルロン酸フラグメント（６ｍｅｒ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｆ）は、ＴＮＦ－αおよび１０ｎｇ／ｍｌの８糖のヒアルロン酸フラグメント（８ｍｅｒ）を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。図１２（ｇ）は、ＴＮＦ－α処理をし、１０ｎｇ／ｍｌの９００ｋＤａのヒアルロン酸を添加した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞の様子を示したものである。
　図１２（ａ）及び図１２（ｂ）を比較すると、ヒト大腸上皮細胞をＴＮＦ－α処理すると、ＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量が増加しているのがわかる。ＮＦ－ｋａｐｐａＢは老化により発現量が増えるタンパク質であるため、老化の指標タンパク質となるものであ（Salminen A、 Kaarniranta K. Genetics vs. entropy: longevity factors suppress the NF-kappaB-driven entropic aging process. Ageing Res Rev. 2010 Jul; 9(3): 298-314）。つまり、図１２（ｂ）では、ＴＮＦ－α処理によって、細胞の老化が進行していることがわかる。一方、図１２（ｃ）～図１２（ｆ）では、ヒアルロン酸フラグメントを添加することにより、ＴＮＦ－α処理をしたにも関わらず、ＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現が抑えられていることがわかる。図１２（ｇ）では、９００ｋＤａの高分子量のヒアルロン酸を添加した。図１２（ｇ）においても、ＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量の減少は見られるが、ヒアルロン酸フラグメントを添加した場合ほどの減少は見られなかった。これらの結果から、ヒアルロン酸フラグメントを含有した培養液で培養したヒト大腸上皮細胞では、ＴＮＦ－α処理によって引き起こされるＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量の増加を抑制することがわかった。
　図１３は、蛍光染色したＮＦ－ｋａｐｐａＢの蛍光強度をグラフで示したものである。グラフの縦軸は、蛍光強度を示す。４～８糖のヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞では、ＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量が有意に減少していることがわかる。さらに、ヒアルロン酸フラグメントは４糖のものが、最もＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現量の増加を抑制することができることがわかった。
　以上の結果より、ヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞培養液で細胞を培養した場合、細胞の老化を抑制することがわかった。
　＜試験例１０＞（ヒト大腸上皮細胞におけるＮＦ－ｋａｐｐａＢ発現に対する作用　その２）
　ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養液を、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ＴＮＦ－αを最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、そのＴＮＦ－αに加えて更にヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのＴＮＦ－αとヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、２４時間培養した。
　２４時間経過後に、各ｗｅｌｌの細胞を抗リン酸化ＮＦ－ｋａｐｐａＢ抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。その結果を図１４に示す。
　図１４に示されるように、この試験例においても、ＴＮＦ－α処理によるヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）のＮＦ－ｋａｐｐａＢの発現が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により抑制された。そして、それが、ＴＬＲ４／ＭＤ２の添加によって完全に阻害された。よって、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）のＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、ＮＦ－ｋａｐｐａＢ発現の抑制が引き起こされることが明らかとなった。
　＜試験例１１＞（角膜損傷に対する作用効果　その１）
　角膜損傷に対するヒアルロン酸フラグメントの作用効果を調べた。被検点眼液としては以下のものを準備した。
　（被検点眼液）
・ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒと４ｍｅｒを同濃度で混合したもの）を最終濃度が０．１ｗ/ｖ％となるように生理食塩水に溶解したもの
・平均分子量５０万～１２０万のヒアルロン酸を有効成分として０．１ｗ/ｖ％含有する点眼液
・生理食塩水
　試験には２２～２４ヶ月齢のウサギ（体重３～４ｋｇ）を６頭使用した。６頭のウサギの両眼にｎ－ヘプタノール０．０５ｍｌを浸したろ紙（直径１ｃｍの円）を置き、ウサギ眼に角膜に創傷を与えた。その後、２時間、６時間、２４時間、２７時間、３０時間後に、ウサギの１眼に被検点眼液を０．０５ｍｌ滴下した。これと同時に、ウサギの他の１眼には、生理食塩水を０．０５ｍｌ滴下し、これをコントロールとした。
　角膜に損傷を与えてから２４時間後及び４８時間後に、ニコン社製のカメラを用いて、ウサギの眼の角膜を撮影した。蛍光剤（ＦＩＴＣ）は創傷部位に接着することを利用して、ウサギにこれを点眼し、角膜の創傷部位面積を、画像解析ソフト（「ＮＩＨイメージ」）にて測定した。
　図１５は、角膜に損傷を与えてから２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。ウサギの眼の角膜の創傷部位は、破線で示している。図１５（ａ）には、生理食塩水を滴下した場合の、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位は、ウサギの黒目部分よりも大きく、全体に広がっていた。図１５（ｂ）には、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位は、ウサギの黒目部分よりも小さい範囲に収まっていた。よって、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の創傷部位は、生理食塩水を滴下した場合に比べ、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の方が小さくなっていることがわかる。一方、図１５（ｃ）には、平均分子量５０万～１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の、２４時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位は、生理食塩水を滴下した場合に比べて若干小さくなったが、その縮小はあまり顕著ではなかった。
　図１６は、角膜に損傷を与えてから２４時間経過後の創傷部位の面積をグラフで示したものである。生理食塩水を滴下した場合の創傷部位の面積の平均が、１４０００ピクセルであるのに対し、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の創傷部位の面積の平均は、１１０００ピクセルと値が小さくなっているのがわかる。一方、平均分子量５０万～１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の面積の平均は１３５００ピクセルとなり、その値の減少は有意ではないことがわかる。
　図１７は、角膜に損傷を与えてから４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を撮影したものである。ウサギの眼の角膜の創傷部位は、破線で示している。図１７（ａ）には、生理食塩水を滴下した場合の、４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。創傷部位の面積は、２４時間経過後と比較して小さくなっているが、創傷部位は、残ったままであった。図１７（ｂ）には、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の、４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合は、４８時間経過後には、創傷部位は完全に消失していた。よって、生理食塩水を滴下した場合は、４８時間経過後でも創傷部位が残ったままであるが、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合は、創傷部位が完全に治癒していることがわかる。一方、図１７（ｃ）には、平均分子量５０万～１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の、４８時間経過後のウサギの眼の角膜の様子を示した。生理食塩水を滴下した場合に比べて面積は小さいが、創傷部位が残存していた。
　図１８は、角膜に損傷を与えてから４８時間経過後の創傷部位の面積をグラフで示したものである。生理食塩水を滴下した場合の創傷部位の面積の平均が、９５０ピクセルであるのに対し、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の創傷部位の面積の平均は、０ピクセルと創傷部位が消失していることがわかる。一方、平均分子量５０万～１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の面積の平均は５２０ピクセルとなり、その値の減少があまり顕著ではないことがわかる。
　以上の結果より、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合、傷つけらえた眼の角膜に治癒時間が短縮されるとういことがわかった。つまり、ヒアルロン酸フラグメントは組織を修復させるということがわかった。
　＜試験例１２＞（角膜損傷に対する作用効果　その２）
　試験例１１と同様に、ウサギ角膜に損傷を与えて、損傷後に被検液を点眼し、その損傷を与えてから３３時間後に、ウサギの眼の角膜組織を採取した。角膜組織をパラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋した標本及び凍結包埋した標本を作製した。このパラフィン包埋した標本から薄切切片を作製し、薄切切片にヘマトキシリン・エオシン染色を施した。染色した、角膜組織を、オリンパス社製の顕微鏡によって観察し、角膜組織の角膜上皮の様子を記録した。
　図１９は、ウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色したものである。図１９（ａ）には、生理食塩水を滴下した場合の、３３時間経過後のウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色した様子を示す。色が濃い部分が角膜上皮を示しており、角膜上皮が非常に薄い状態であることがわった。図１９（ｂ）には、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合の、３３時間経過後のウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色した様子を示す。この場合、広範囲に渡り、角膜上皮が厚く形成されていることがわった。また、角膜上皮に複数の細胞の層が形成されていることがわかった。
　一方、図１９（ｃ）には、平均分子量５０万～１２０万のヒアルロン酸を含有する点眼液を滴下した場合の、３３時間経過後のウサギの眼の角膜組織をヘマトキシリン・エオシン染色した様子を示す。この場合、角膜上皮において空胞（図中、矢印で示す。）、ならび角膜実質細胞（ｋｅｒａｔｏｃｙｔｅｓ）の活性化（通常は扁平であるが紡錘形を呈した）が認められた（図中、他の矢印で示す。）。この結果は、高分子量のヒアルロン酸が、組織に対するなんらかのダメージを与えていることを示していた。ヒアルロン酸フラグメントでは、このような組織のダメージは観察されず、角膜損傷を治療するための組織修復剤として、より優れていることが明らかとなった。
　以上の結果より、ヒアルロン酸フラグメントは、創傷部位やその周辺部位の細胞増殖を促進させることがわかった。また、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合においては、角膜上皮の形成が進み、複数の細胞層が形成されることがわかった。これにより、ヒアルロン酸フラグメントを含有する点眼液を滴下した場合には、創傷部位で、細胞の分化が誘導されていることがわかった。つまり、ヒアルロン酸フラグメントは、細胞増殖を促進することに加え、細胞分化の誘導及び組織修復も行うことができることがわかった。
　＜試験例１３＞（ヒト表皮角化細胞における肝細胞増殖因子誘導）
　ヒト表皮角化細胞（正常ヒト角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、アジア人女性（２７歳）由来））を、それぞれ、４糖のヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）１０ｎｇ／ｍｌを含んだ培地と含まない培地（無処置）で２４時間培養した。培地は、ＤＳファーマバイオメディカル社の正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地を用いた。培養後に細胞を回収し、これをＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）で解析した。
　表３は、ヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞培養液又はヒアルロン酸フラグメントを添加していない細胞培養液で培養した正常ヒト角化細胞の蛍光（Ｃｙ５）の強度を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表３の結果より、ヒアルロン酸フラグメントを添加した細胞培養液で細胞を培養した場合、肝細胞増殖因子の発現量が２倍に増加することがわかった。
　＜試験例１４＞（老齢ラット肝臓に対する作用効果　その１）
　老齢ラット肝臓に対するヒアルロン酸フラグメントの作用効果を調べた。試験液としては以下のものを準備した。
　（試験液）
・臓器保存液（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ液：臓器保存に使用されているスタンダードな液）
・ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解したもの
・ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解したもの
・ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解し、且つＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように上記臓器保存液に溶解したもの
　ＳＤ系ラット２４ヶ月齢（老齢）の肝門脈から各試験液を注入し、７．５ｍｌを灌流させた後、同じ液で３７℃で６時間保存した。肝臓をＯＣＴコンパウンドに包埋し凍結して作製したブロックから切片を作製し、これを顕微鏡観察に供した。
　図２０にはその顕微鏡像の写真を示す。図２０（ａ）は、保存前の無処置の肝臓の組織切片の様子を示したものである。保存前では類洞が明確に観察できた。図２０（ｂ）は、臓器保存液に何も添加しないで保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。臓器保存液で保存すると、類洞が不明確になり（類同狭窄）、ｂｌｅｂ（泡沫）が多数出現した（細胞障害）。なお、虚血肝臓組織に出現するｂｌｅｂ（泡沫）は、虚血によるＡＴＰレベルの低下→ミトコンドリアから細胞質へのＣａイオンの流出→Ｃａイオン依存性蛋白分解酵素の活性化と細胞骨格系の障害の結果惹起される。この変化を経て肝細胞は細胞死にいたる。また、このような変化は、薬物傷害や老化などの様々の病態、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ誘導肝障害においても認められる。
　図２０（ｃ）は、臓器保存液にヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を添加して保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を含有する臓器保存液で保存すると、類同狭窄とｂｌｅｂ出現が抑制された。図２０（ｄ）は、臓器保存液にヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を添加して保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を含有する臓器保存液で保存すると、類同狭窄とＢｌｅｂ出現が抑制された。図２０（ｅ）は、臓器保存液にヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）とＴＬＲ４／ＭＤ２とを添加して保存した後の肝臓の織切片の様子を示したものである。この場合には、類洞が不明確になり（類同狭窄）、ｂｌｅｂ（泡沫）が多数出現した。
　図２１は、単に面積当りのｂｌｅｂ（泡沫）の数をまとめたものである。図２１に示されるように、４ｍｅｒ処理よりＬ３ｍｅｒ処理の方がｂｌｅｂ出現を抑制する効果が高かった。これは、分子量が小さいＬ３ｍｅｒの方が４ｍｅｒより組織浸透性に優れているため、より効果的にｂｌｅｂ出現を抑制できたことによると考えられた。また、Ｌ３ｍｅｒによるｂｌｅｂ出現抑制の効果はＴＬＲ４／ＭＤ２の添加により減じた。これにより、肝臓の保存時の障害の抑制作用においても、アルロン酸フラグメントはＴＬＲ４を介して作用していることが明らかとなった。
　＜試験例１５＞（老齢ラット肝臓に対する作用効果　その２）
　老齢ラット肝臓に対するヒアルロン酸フラグメントの作用効果を調べた。具体的には、２０ヶ月齢(老齢)の雌性Ｂａｌｂ/ｃマウスにＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ(２０ｍｇ/ｋｇ体重)を尾静脈より１回静注して、肝障害モデルとし、そのＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａの投与直後にヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒあるいはＬ３ｍｅｒ）を経口投与し、その効果を調べた。肝機能障害は、２４時間後に血液を採取し、血中ＧＯＴおよびＧＰＴ値を測定することにより評価した。図２２には血中ＧＯＴ値の結果を示す。
　図２２に示されるように、ヒアルロン酸フラグメントの投与によりＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ投与による肝機能障害が改善された。その効果は、４ｍｅｒよりＬ３ｍｅｒの方が顕著に優れていた。これは、分子量が小さいＬ３ｍｅｒの方が４ｍｅｒより組織浸透性に優れているため、より効果的にＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ投与による肝機能障害を抑制できたことによると考えられた。なお、ＧＰＴ値についても同様の傾向の結果であった。
　＜試験例１６＞（老化誘導したヒト大腸上皮細胞に対する作用　その１）
　ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を過酸化水素処理したときの過酸化水素刺激による細胞老化（傷害によってミトコンドリア活性が下がる、あるいは細胞死がおきるとＭＴＳの値は下がる）が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。
　ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１０μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、３時間培養した。
　３時間経過後に、ＭＴＳアッセイに供した。なお、ＭＴＳは、細胞内のミトコンドリアにある脱水素によってホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に変化する作用に基づき、ＯＤ４９０ｎｍを測定することによりミトコンドリア機能を測定するものである。
　図２３に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）は、過酸化水素刺激による細胞老化（傷害によってミトコンドリア活性が下がる、あるいは細胞死がおきるとＭＴＳの値は下がる）を抑制した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、ヒアルロン酸フラグメントが細胞表面のＴＬＲ４に結合することによってもたらされることが判明した。よって、ヒト大腸上皮細胞（ＨＴ２９細胞）のＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、細胞老化の抑制効果がもたらされることが明らかとなった。
　＜試験例１７＞（老化誘導したヒト大腸上皮細胞に対する作用　その２）
　被検物質をヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ４ｍｅｒ）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）とし、被検物質を含む培地に交換してからの培養時間を１時間にした以外は、試験例１６と同様の試験を行なった。その結果を図２４に示す。
　図２４に示されるように、化学合成品であるＬ４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒでも、４ｍｅｒ同様に、細胞老化に対する抑制効果を示した。
　＜試験例１８＞（老化誘導したヒト大腸上皮細胞に対する作用　その３）
　被検物質をヒアルロン酸フラグメント（Ｌ４ｍｅｒ）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）とした以外は、試験例１６と同様の試験を行なった。その結果を図２５に示す。
　図２５に示されるように、化学合成品であるＬ４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒでも、４ｍｅｒ同様に、細胞老化に対する抑制効果を示した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、Ｌ４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒによる老化抑制効果も、ＴＬＲ４を介してもたらされることが判明した。
　＜試験例１９＞（老化誘導したヒト口腔由来上皮細胞に対する作用）
　ヒト口腔由来上皮細胞（Ｃａ９－２２細胞）を過酸化水素処理したときのミトコンドリア機能が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。
　ヒト口腔由来上皮細胞（Ｃａ９－２２細胞）を常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又は９００ｋＤａヒアルロン酸を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、３時間培養した。
　３時間経過後に、ＭＴＳアッセイに供した。なお、ＭＴＳは、細胞内のミトコンドリアにある脱水素によってホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に変化する作用に基づき、ＯＤ４９０ｎｍを測定することによりミトコンドリア機能を測定するものである。
　図２６に示されるように、ヒト口腔由来上皮細胞でも、過酸化水素刺激による細胞老化がヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒあるいは４ｍｅｒ）により抑制されることが明らかとなった。一方、９００ｋＤａヒアルロン酸では、その老化抑制の効果は得られなかった。
　＜試験例２０＞（老化誘導したヒト神経幹細胞に対する作用）
　ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）を過酸化水素処理したときの細胞老化（空胞変性および肥大化）が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。
　ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）（商品名「Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ （Ｈ９-Ｄｅｒｉｖｅｄ）」Ｇｉｂｃｏ社製）を、培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１０μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していない培地「Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ」（商品名、Ｇｉｂｃｏ社製）、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加した同培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した同培地に替え、２４時間培養した。
　２４時間経過後に、倒立顕微鏡により細胞を観察した。図２７にその顕微鏡像の写真を示す。
　図２７に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）は、過酸化水素による細胞老化（空胞変性および肥大化）を抑制した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、ヒアルロン酸フラグメントが細胞表面のＴＬＲ４に結合することによってもたらされることが判明した。よって、ヒト神経幹細胞（Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）でもＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、細胞老化の抑制効果がもたらされることが明らかとなった。
　＜試験例２１＞（老化誘導したラット骨髄由来間葉系幹細胞に対する作用）
　ラット骨髄由来間葉系幹細胞を過酸化水素処理したときの細胞老化（死細胞の増加）が、ヒアルロン酸フラグメントの処理により影響を受けるかどうか調べた。具体的には以下のように試験を行なった。
　ラット骨髄由来間葉系幹細胞を常法に従い常法に従いＤＭＥＭ培地（和光純薬社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培地に終濃度１μＭの過酸化水素を添加して１５分間刺激し、次いで、ヒアルロン酸フラグメントを添加していないＤＭＥＭ培地、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）を最終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地、又はそのヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）に加えて更にＴＬＲ４／ＭＤ２を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加したＤＭＥＭ培地に替え、２時間培養した。
　２時間経過後に、死細胞に取り込まれて赤い蛍光を発するＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）を終濃度５μg／ｍｌで培地に加えて１５分インキュベートし、死細胞の出現の様子を蛍光顕微鏡にて観察した。図２８には単位視野内の死細胞の平均数を示す。
　図２８に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（Ｌ３ｍｅｒ）は、過酸化水素による細胞老化（死細胞の増加）を抑制した。この作用は、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、ヒアルロン酸フラグメントが細胞表面のＴＬＲ４に結合することによってもたらされることが判明した。よって、ラット骨髄由来間葉系幹細胞でもＴＬＲ４がヒアルロン酸フラグメントの受容体であり、その受容体を介する作用により、細胞老化の抑制効果がもたらされることが明らかとなった。
　＜試験例２２＞（ヒト表皮角化細胞における角化細胞マーカーの検出　その１）
　ヒアルロン酸フラグメントとして４ｍｅｒ又はＬ３ｍｅｒを用い、更にそれに最終濃度１μｇ／ｍｌのＴＬＲ４／ＭＤ２を添加した試験群を加えた以外は、試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞を刺激した。
　各ｗｅｌｌの細胞を抗Ｋｅｒａｔｉｎ Ｋ１４抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。なお、Ｋｅｒａｔｉｎ Ｋ１４は基底層角化細胞のマーカーである。その結果を図２９に示す。
　図２９に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒあるいはＬ３ｍｅｒ）の処理により、Ｋｅｒａｔｉｎ Ｋ１４の高発現細胞が増加した。これは、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒが細胞分化を誘導したことを示している。この作用も、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒによる角化細胞誘導効果も、ＴＬＲ４を介してもたらされることが判明した。
　＜試験例２３＞（ヒト表皮角化細胞における角化細胞マーカーの検出　その２）
　ヒアルロン酸フラグメントとして４ｍｅｒ又はＬ３ｍｅｒを用い、更にそれに最終濃度１μｇ／ｍｌのＴＬＲ４／ＭＤ２を添加した試験群を加えた以外は、試験例１と同様にして、ヒト表皮角化細胞を刺激した。
　各ｗｅｌｌの細胞を抗Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ抗体で染色し、その免疫染色の強度を、読み取り装置「ＡｒｒａｙＳｃａｎ」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により測定した。なお、顆粒層角化細胞が産生するＦｉｌａｇｇｒｉｎは成熟した角化細胞のマーカーである。その結果を図３０に示す。
　図３０に示されるように、ヒアルロン酸フラグメント（４ｍｅｒあるいはＬ３ｍｅｒ）の処理により、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ高発現細胞が増加した。これは、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒが細胞分化を誘導したことを示している。この作用も、培地にＴＬＲ４／ＭＤ２を添加することにより阻害されたことから、４ｍｅｒやＬ３ｍｅｒによる角化細胞誘導効果も、ＴＬＲ４を介してもたらされることが、更に確認された。

Claims (25)

  1. 　２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするサーチュイン誘導剤。
  2. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項１記載のサーチュイン誘導剤。
  3. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項１記載のサーチュイン誘導剤。
  4. 　心臓疾患、動脈硬化、骨粗鬆症、炎症性腸炎、認知症、脳卒中、メタボリックシンドローム、癌、肺疾患、腎疾患、糖尿病、変形性関節症、リウマチ、プロジェリア、放射線障害、筋疾患、脳発達障害、神経疾患、高血圧、又は肥満の治療及び／又は予防、又は老化抑制のために用いられる、請求項１～３のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
  5. 　医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１～３のいずれか１つに記載のサーチュイン誘導剤。
  6. 　２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織修復剤。
  7. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項６記載の組織修復剤。
  8. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項６記載の組織修復剤。
  9. 　角膜、皮膚、上皮組織、神経組織、又は心筋組織の修復に用いられる、請求項６～８のいずれか１つに記載の組織修復剤。
  10. 　医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項６～８のいずれか１つに記載の組織修復剤。
  11. 　２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする肝細胞増殖因子誘導剤。
  12. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項１１記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
  13. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項１１記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
  14. 　肝臓障害の治療及び／又は予防、又は臓器保存のために用いられる、請求項１１～１３のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
  15. 　医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１１～１３のいずれか１つに記載の肝細胞増殖因子誘導剤。
  16. 　２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする組織恒常性維持剤。
  17. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項１６記載の組織恒常性維持剤。
  18. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項１６記載の組織恒常性維持剤。
  19. 　組織中の細胞の幹細胞性を維持しかつ分化を誘導するために用いられる、請求項１６～１８のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
  20. 　医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項１６～１８のいずれか１つに記載の組織恒常性維持剤。
  21. 　２糖以上２０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメント、その薬学的に許容される塩又はその薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とするＴＬＲ４作用剤。
  22. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖以上１０糖以下のサイズから選択されるヒアルロン酸フラグメントである、請求項２１記載のＴＬＲ４作用剤。
  23. 　前記ヒアルロン酸フラグメントが３糖又は４糖のヒアルロン酸フラグメントである、請求項２１記載のＴＬＲ４作用剤。
  24. 　角膜、皮膚、肝臓、神経組織、腎臓、肺、心臓、骨格筋、膵臓、又は血管における疾患の治療及び／又は予防のために用いられる、請求項２１～２３のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
  25. 　医薬品、機能性食品、又は化粧料の形態で用いられる、請求項２１～２３のいずれか１つに記載のＴＬＲ４作用剤。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015096493A (ja) * 2013-10-08 2015-05-21 日本新薬株式会社 アクアポリン機能亢進剤
JP2017141207A (ja) * 2016-02-12 2017-08-17 株式会社らいむ 神経伸長促進剤、内服剤、培地用添加剤、細胞希釈液用添加剤、培地および細胞希釈液
KR20190008013A (ko) * 2017-07-14 2019-01-23 서울대학교산학협력단 신규 알츠하이머병 치료용 약학적 조성물
US10973858B2 (en) 2016-02-12 2021-04-13 Laimu Corporation Nerve growth promoter and method for producing same, internal preparation, medium additive, cell dilution additive, medium, cell dilution, antioxidant and method for producing same, external preparation, and wound treatment agent and method for producing same
WO2022044781A1 (ja) * 2020-08-28 2022-03-03 日本コルマー株式会社 ゲル状組成物

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9492474B2 (en) 2013-07-10 2016-11-15 Matrix Biology Institute Compositions of hyaluronan with high elasticity and uses thereof
PT3352766T (pt) 2015-09-24 2022-03-22 Matrix Biology Inst Composições de hialuronano de elevada elasticidade e processos para o seu uso
US11439659B2 (en) * 2018-12-03 2022-09-13 The Regents Of The University Of California Methods and compositions to prevent and treat inflammation and allergic reactions
FR3118415A1 (fr) * 2020-12-30 2022-07-01 Universite De Picardie Jules Verne Composition pharmaceutique contenant en tant qu’ingrédient actif au moins un composé de type disaccharide capable d’augmenter la production de calcium des cellules pré-ostéoblastiques –kit et composés associés

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5213733A (en) 1975-07-24 1977-02-02 Tech Res & Dev Inst Of Japan Def Agency Pattern characteristic sampling method
JPS6413008A (en) * 1987-06-12 1989-01-17 Unilever Nv Skin treatment composition
JPH09227386A (ja) * 1996-02-16 1997-09-02 Seikagaku Kogyo Co Ltd ストレス蛋白質発現増強剤
WO2002004471A1 (fr) 2000-07-07 2002-01-17 Seikagaku Corporation Fractions oligosaccharidiques d'acide hyaluronique et medicament les contenant
WO2002074318A1 (fr) * 2001-03-15 2002-09-26 Seikagaku Corporation Agents de regulation d'expression d'il-12
WO2004084912A1 (ja) * 2003-03-25 2004-10-07 Seikagaku Corporation 神経障害処置剤
JP2006327958A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 自己免疫疾患、炎症及び神経疾患の治療剤及び予防剤
JP2006327959A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 内分泌性疾患及び代謝性疾患の治療剤
JP2006335694A (ja) * 2005-06-02 2006-12-14 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 変形性関節症の治療剤
JP2007084509A (ja) * 2005-09-26 2007-04-05 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 細胞賦活剤
JP2007126453A (ja) * 2005-10-07 2007-05-24 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk ヒアルロナン産生促進剤及びヒアルロナン分解抑制剤
JP2007153766A (ja) * 2005-12-01 2007-06-21 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk Ｍａｐキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子の発現増強剤
JP2007153761A (ja) * 2005-12-01 2007-06-21 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk シナプス伝達促進剤及びシナプス保護剤
JP2007291133A (ja) * 2007-07-09 2007-11-08 Seikagaku Kogyo Co Ltd ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分とする治療剤
JP2008266171A (ja) * 2007-04-18 2008-11-06 Q P Corp 自己免疫疾患緩和剤ならびにこれを含有する医薬品および食品
JP2009292767A (ja) * 2008-06-05 2009-12-17 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 神経細胞分化誘導剤
JP2010059084A (ja) * 2008-09-03 2010-03-18 Q P Corp 機能性食品及び医薬

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05213733A (ja) 1992-02-05 1993-08-24 Sansho Seiyaku Co Ltd 皮膚化粧料
DE10196413T1 (de) * 2000-07-07 2003-11-20 Southco Elektrisch betätigtes Sperrklinkenschloß mit Ratschenmechanismus
US8263756B2 (en) * 2001-04-06 2012-09-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of gene transfer via vascular system or ureter
US20070032451A1 (en) * 2005-02-28 2007-02-08 Kipling Thacker Blood soluble drag reducing hyaluronic acid
RU2342148C2 (ru) * 2005-09-26 2008-12-27 Гликосайенс Лабораториз, Инк. Фармацевтическое средство, содержащее гиалуронан в качестве активного ингредиента
EP1994934A4 (en) * 2006-12-05 2010-03-10 Glycoscience Lab Inc THERAPEUTIC AGENT AGAINST DEGENERATIVE ARTHRITIS
JP2008201749A (ja) * 2007-02-21 2008-09-04 Okayama Univ 肝細胞増殖因子産生誘導剤及びその医薬品組成物
JP2013125634A (ja) * 2011-12-14 2013-06-24 Toshiba Lighting & Technology Corp 調光器及び調光システム

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5213733A (en) 1975-07-24 1977-02-02 Tech Res & Dev Inst Of Japan Def Agency Pattern characteristic sampling method
JPS6413008A (en) * 1987-06-12 1989-01-17 Unilever Nv Skin treatment composition
JPH09227386A (ja) * 1996-02-16 1997-09-02 Seikagaku Kogyo Co Ltd ストレス蛋白質発現増強剤
WO2002004471A1 (fr) 2000-07-07 2002-01-17 Seikagaku Corporation Fractions oligosaccharidiques d'acide hyaluronique et medicament les contenant
WO2002074318A1 (fr) * 2001-03-15 2002-09-26 Seikagaku Corporation Agents de regulation d'expression d'il-12
WO2004084912A1 (ja) * 2003-03-25 2004-10-07 Seikagaku Corporation 神経障害処置剤
JP2006327958A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 自己免疫疾患、炎症及び神経疾患の治療剤及び予防剤
JP2006327959A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 内分泌性疾患及び代謝性疾患の治療剤
JP2006335694A (ja) * 2005-06-02 2006-12-14 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 変形性関節症の治療剤
JP2007084509A (ja) * 2005-09-26 2007-04-05 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 細胞賦活剤
JP2007126453A (ja) * 2005-10-07 2007-05-24 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk ヒアルロナン産生促進剤及びヒアルロナン分解抑制剤
JP2007153766A (ja) * 2005-12-01 2007-06-21 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk Ｍａｐキナーゼキナーゼキナーゼ遺伝子の発現増強剤
JP2007153761A (ja) * 2005-12-01 2007-06-21 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk シナプス伝達促進剤及びシナプス保護剤
JP2008266171A (ja) * 2007-04-18 2008-11-06 Q P Corp 自己免疫疾患緩和剤ならびにこれを含有する医薬品および食品
JP2007291133A (ja) * 2007-07-09 2007-11-08 Seikagaku Kogyo Co Ltd ヒアルロン酸オリゴ糖を有効成分とする治療剤
JP2009292767A (ja) * 2008-06-05 2009-12-17 Toshitsu Kagaku Kenkyusho:Kk 神経細胞分化誘導剤
JP2010059084A (ja) * 2008-09-03 2010-03-18 Q P Corp 機能性食品及び医薬

Non-Patent Citations (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"ANGIOGENESIS INDUCED BY DEGRADATION PRODUCTS OF HYALURONIC ACID", SCIENCE, vol. 228, 1985, pages 1324 - 1326, XP008020551 *
AKBARSHAHI H; AXELSSON JB; SAID K; MALMSTROM A; FISCHER H; ANDERSSON R: "TLR4 dependent heparan sulphate-induced pancreatic inflammatory response is IRF3-mediated", J. TRANSL. MED., vol. 9, 21 December 2011 (2011-12-21), pages 219, XP021130935, DOI: doi:10.1186/1479-5876-9-219
AKIRA ASARI: "Medical Application of Hyaluronan", 2004, ELSEVIER, article "Chemistry and Biology of Hyaluronan", pages: 457 - 473
AWLA D; ABDULLA A; REGNÉR S; THORLACIUS H: "TLR4 but not TLR2 regulates inflammation and tissue damage in acute pancreatitis induced by retrograde infusion of taurocholate", INFLAMM. RES., vol. 60, no. 12, December 2011 (2011-12-01), pages 1093 - 8
BAI T; LIAN LH; WU YL; WAN Y; NAN JX: "Thymoquinone attenuates liver fibrosis via PI3K and TLR4 signaling pathways in activated hepatic stellate cells", INT. IMMUNOPHARMACOL., vol. 15, no. 2, 12 January 2013 (2013-01-12), pages 275 - 281, XP028989532, DOI: doi:10.1016/j.intimp.2012.12.020
CAPIRALLA H; VINGTDEUX V; ZHAO H; SANKOWSKI R; AL-ABED Y; DAVIES P; MARAMBAUD P: "Resveratrol mitigates lipopolysaccharide- and A?-mediated microglial inflammation by inhibiting the TLR4/NF- B/STAT signaling cascade", J. NEUROCHEM., vol. 120, no. 3, February 2012 (2012-02-01), pages 461 - 72
CARTER S; MIARD S; ROY-BELLAVANCE C; BOIVIN L; LI Z; PIBAROT P; MATHIEU P; PICARD: "Sirt1 inhibits resistin expression in aortic stenosis", PLOS ONE, vol. 7, no. 4, 2012, pages E35110
CHEN YR; LAI YL; LIN SD; LI XT; FU YC; XU WC: "SIRT1 interacts with metabolic transcriptional factors in the pancreas of insulin-resistant and calorie-restricted rats", MOL. BIOL. REP., 6 January 2013 (2013-01-06)
CHUNXUN ZENG, ET AL.: "INHIBITION OF TUMOR GROWTH IN VIVO BY HYALURONAN OLIGOMERS", INT. J. CANCER, vol. 77, 1998, pages 396 - 401, XP002523574 *
CODOCEDO JF; ALLARD C; GODOY JA; VARELA-NALLAR L; INESTROSA NC: "SIRT1 regulates dendritic development in hippocampal neurons", PLOS ONE, vol. 7, no. 10, 2012, pages E47073
DONMEZ G: "The Effects of SIRT1 on Alzheimer's Disease Models", INT. J. ALZHEIMERS DIS. 2012, 2012, pages 509529
DONMEZ G; WANG D; COHEN DE; GUARENTE L: "SIRT1 suppresses beta-amyloid production by activating the alpha-secretase gene ADAM10", CELL, vol. 142, no. 2, 23 July 2010 (2010-07-23), pages 320 - 32, XP028931126, DOI: doi:10.1016/j.cell.2010.06.020
FAN H; YANG HC; YOU L; WANG YY; HE WJ; HAO CM: "The histone deacetylase, SIRT1, contributes to the resistance of young mice to ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury", KIDNEY INT., 9 January 2013 (2013-01-09)
FRANTZ S; KOBZIK L; KIM YD; FUKAZAWA R; MEDZHITOV R; LEE RT; KELLY RA: "Toll4 (TLR4) expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium", J. CLIN. INVEST., vol. 104, no. 3, August 1999 (1999-08-01), pages 271 - 80
GHATAK S, ET AL.: "Hyaluronan Oligosaccharides Inhibit Anchorage-independent Growth of Tumor Cells by Suppressing the Phosphoinositide 3-Kinase/Akt Cell Survival Pathway", J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 41, 2002, pages 38013 - 38020, XP055010454 *
GIUSEPPE M. CAMPO ET AL.: "Hyaluronan differently modulates TLR-4 and the inflammatory response in mouse chondrocytes", BIOFACTORS, vol. 38, no. 1, 30 January 2012 (2012-01-30), pages 69 - 76, XP055082074, Retrieved from the Internet <URL:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biof.202/ful> [retrieved on 20130517] *
GLYCOBIOLOGY, vol. 12, no. 7, 2002, pages 421 - 426
GOOD DW; GEORGE T; WATTS BA: "3rd ''Lipopolysaccharide directly alters renal tubule transport through distinct TLR4-dependent pathways in basolateral and apical membranes", AM. J. PHYSIOL. RENAL PHYSIOL., vol. 297, no. 4, October 2009 (2009-10-01), pages F866 - 74
HEPING XU, ET AL.: "Effect of Hyaluronan Oligosaccharides on the Expression of Heat Shock Protein 72", J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 19, 2002, pages 17308 - 17314, XP055082071 *
HERRANZ D; MUNOZ-MARTIN M; CANAMERO M; MULERO F; MARTINEZ-PASTOR B; FERNANDEZ-CAPETILLO 0; SERRANO M: "Sirt1 improves healthy ageing and protects from metabolic syndrome-associated cancer", NAT. COMMUN., vol. 1, 12 April 2010 (2010-04-12), pages 3
HUTCHINSON MR; ZHANG Y; BROWN K; COATS BD; SHRIDHAR M; SHOLAR PW; PATEL SJ; CRYSDALE NY; HARRISON JA; MAIER SF: "Non-stereoselective reversal of neuropathic pain by naloxone and naltrexone: involvement of toll-like receptor 4 (TLR4", EUR. J. NEUROSCI., vol. 28, no. 1, July 2008 (2008-07-01), pages 20 - 9, XP002606196, DOI: doi:10.1111/J.1460-9568.2008.06321.X
HWANG JW; CHUNG S; SUNDAR IK; YAO H; ARUNACHALAM G; MCBURNEY MW; RAHMAN I: "Cigarette smoke-induced autophagy is regulated by SIRT1-PARP-1-dependent mechanism: implication in pathogenesis of COPD", ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 500, no. 2, 15 August 2010 (2010-08-15), pages 203 - 9, XP027136703
JACK FORD ET AL.: "JNK2-dependent regulation of SIRT1 protein stability", CELL CYCLE, vol. 7, no. 19, 2008, pages 3091 - 3097, XP003032409 *
JO MILNER: "Cellular Regulation of SIRT1", CURR. PHARM. DES., vol. 15, no. 1, January 2009 (2009-01-01), pages 39 - 44, XP008162710 *
JOHNSON AC; HEINZEL FP; DIACONU E; SUN Y; HISE AG; GOLENBOCK D; LASS JH; PEARLMAN E: "Activation of toll-like receptor (TLR)2, TLR4, and TLR9 in the mammalian cornea induces MyD88-dependent corneal inflammation", INVEST. OPHTHALMOL. VIS. SCI., vol. 46, no. 2, February 2005 (2005-02-01), pages 589 - 95
JOO HY; WOO SR; SHEN YN; YUN MY; SHIN HJ; PARK ER; KIM SH; PARK JE; JU YJ; HONG SH: "SIRT1 interacts with and protects glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from nuclear translocation: implications for cell survival after irradiation", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 424, no. 4, 10 August 2012 (2012-08-10), pages 681 - 6
JUNG YJ; LEE JE; LEE AS; KANG KP; LEE S; PARK SK; LEE SY; HAN MK; KIM DH; KIM W: "SIRT1 overexpression decreases cisplatin-induced acetylation of NF- B p65 subunit and cytotoxicity in renal proximal tubule cells", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 419, no. 2, 9 March 2012 (2012-03-09), pages 206 - 10, XP028466222, DOI: doi:10.1016/j.bbrc.2012.01.148
KABRA N; LI Z; CHEN L; LI B; ZHANG X; WANG C; YEATMAN T; COPPOLA D; CHEN J: "SirT1 is an inhibitor of proliferation and tumor formation in colon cancer", J BIOL. CHEM., vol. 284, no. 27, 3 July 2009 (2009-07-03), pages 18210 - 7
KABRA N; LI Z; CHEN L; LI B; ZHANG X; WANG C; YEATMAN T; COPPOLA D; CHEN J: "SirT1 is an inhibitor of proliferation and tumor formation in colon cancer", J. BIOL. CHEM., vol. 284, no. 27, 3 July 2009 (2009-07-03), pages 18210 - 7
KOK SH; LIN LD; HOU KL; HONG CY; CHANG CC; HSIAO M; WANG JH; LAI EH; LIN SK: "Simvastatin inhibits Cyr61 expression in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through the regulation of SIRT1/Fox03a signaling", ARTHRITIS RHEUM., 12 December 2012 (2012-12-12)
LEE IT; SHIH RH; LIN CC; CHEN JT; YANG CM: "Role of TLR4/NADPH oxidase/ROS-activated p38 MAPK in VCAM-1 expression induced by lipopolysaccharide in human renal mesangial cells", CELL COMMUN. SIGNAL., vol. 10, no. 1, 15 November 2012 (2012-11-15), pages 33, XP021121773, DOI: doi:10.1186/1478-811X-10-33
LI H; XU H; SUN B: "Lipopolysaccharide regulates MMP-9 expression through TLR4/NF- B signaling in human arterial smooth muscle cells", MOL MED REPORT, vol. 6, no. 4, October 2012 (2012-10-01), pages 774 - 8
LI H; XU M; LEE J; HE C; XIE Z: "Leucine supplementation increases SIRT1 expression and prevents mitochondrial dysfunction and metabolic disorders in high-fat diet-induced obese mice", AM. J. PHYSIOL. ENDOCRINOL. METAB., vol. 303, no. 10, 15 November 2012 (2012-11-15), pages E1234 - 44
LI L; GAO P; ZHANG H; CHEN H; ZHENG W; LV X; XU T; WEI Y; LIU D; LIANG C: "SIRT1 inhibits angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy", ACTA BIOCHIM. BIOPHYS. SIN. (SHANGHAI, vol. 43, no. 2, February 2011 (2011-02-01), pages 103 - 9
LIU B; GHOSH S; YANG X; ZHENG H; LIU X; WANG Z; JIN G; ZHENG B; KENNEDY BK; SUH Y: "Resveratrol rescues SIRT1-dependent adult stem cell decline and alleviates progeroid features in laminopathy-based progeria", CELL METAB., vol. 16, no. 6, 5 December 2012 (2012-12-05), pages 738 - 50
MATSUSHITA T; SASAKI H; TAKAYAMA K; ISHIDA K; MATSUMOTO T; KUBO S; MATSUZAKI T; NISHIDA K; KUROSAKA M; KURODA R: "The overexpression of SIRT1 inhibited osteoarthritic gene expression changes induced by interleukin-1? in human chondrocytes", J ORTHOP. RES., 9 November 2012 (2012-11-09)
MOON MH; JEONG JK; LEE YJ; SEOL JW; JACKSON CJ; PARK SY: "SIRT1, a class III histone deacetylase, regulates TNF-a-induced inflammation in human chondrocytes", OSTEOARTHRITIS CARTILAGE, vol. 21, no. 3, March 2013 (2013-03-01), pages 470 - 80
NISHIMURA EK; GRANTER SR; FISHER DE: "Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche", SCIENCE, vol. 307, no. 5710, 4 February 2005 (2005-02-04), pages 720 - 4, XP002456150, DOI: doi:10.1126/science.1099593
OKUN E; BARAK B; SAADA-MADAR R; ROTHMAN SM; GRIFFIOEN KJ; ROBERTS N; CASTRO K; MUGHAL MR; PITA MA; STRANAHAN AM: "Evidence for a developmental role for TLR4 in learning and memory", PLOS ONE, vol. 7, no. 10, 2012, pages E47522
OTA H; ETO M; OGAWA S; IIJIMA K; AKISHITA M; OUCHI Y: "SIRT1/eNOS axis as a potential target against vascular senescence, dysfunction and atherosclerosis", JOURNAL OF ATHEROSCLEROSIS AND THROMBOSIS, vol. 17, no. 5, 2010, pages 431 - 435
PERROS F; LAMBRECHT BN; HAMMAD H: "TLR4 signalling in pulmonary stromal cells is critical for inflammation and immunity in the airways", RESPIR. RES., vol. 12, 24 September 2011 (2011-09-24), pages 125, XP021109851, DOI: doi:10.1186/1465-9921-12-125
SAHIN H; BORKHAM-KAMPHORST E; DO 0 NT; BERRES ML; KALDENBACH M; SCHMITZ P; WEISKIRCHEN R; LIEDTKE C; STREETZ KL; MAEDLER K: "Proapoptotic effects of the chemokine, CXCL 10 are mediated by the noncognate receptor TLR4 in hepatocytes", HEPATOLOGY, 19 September 2012 (2012-09-19)
SALMINEN A; KAARNIRANTA K.: "Genetics vs. entropy: longevity factors suppress the NF-kappaB-driven entropic aging process", AGEING RES. REV., vol. 9, no. 3, July 2010 (2010-07-01), pages 298 - 314
SAMUEL SM; THIRUNAVUKKARASU M; PENUMATHSA SV; PAUL D; MAULIK N: "Akt/FOX03a/SIRT1-mediated cardioprotection by n-tyrosol against ischemic stress in rat in vivo model of myocardial infarction: switching gears toward survival and longevity", J AGRIC. FOOD CHEM., vol. 56, no. 20, 22 October 2008 (2008-10-22), pages 9692 - 8
SCIENCE, vol. 228, 1985, pages 1324 - 1326
SHAKIBAEI M; BUHRMANN C; MOBASHERI A: "Resveratrol-mediated SIRT-1 interactions with p300 modulate receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) activation of NF-kappaB signaling and inhibit osteoclastogenesis in bone-derived cells", J BIOL CHEM., vol. 286, no. 13, 1 April 2011 (2011-04-01), pages 11492 - 505
SHIOTA A; SHIMABUKURO M; FUKUDA D; SOEKI T; SATO H; UEMATSU E; HIRATA Y; KUROBE H; MAEDA N; SAKAUE H: "Telmisartan ameliorates insulin sensitivity by activating the AMPK/SIRT1 pathway in skeletal muscle of obese db/db mice", CARDIOVASC, DIABETOL., vol. 11, 8 November 2012 (2012-11-08), pages 139, XP021128998, DOI: doi:10.1186/1475-2840-11-139
SINGH UP; SINGH NP; SINGH B; HOFSETH LJ; PRICE RL; NAGARKATTI M; NAGARKATTI PS: "Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) induces silent mating type information regulation-1 and down-regulates nuclear transcription factor-kappaB activation to abrogate dextran sulfate sodium-induced colitis", J PHARMACOL. EXP. THER., vol. 332, no. 3, March 2010 (2010-03-01), pages 829 - 39
SU HY; MO BW; WEI JH; HUANG JW; WANG CM; ZENG JR; XU Q; LIN Y: "Effect of TLR4 on the migration of asthmatic airway smooth muscle cells induced by airway epithelial cells", ZHONGGUO YING YONG SHENG LI XUE ZA ZHI, vol. 28, no. 2, March 2012 (2012-03-01), pages 103 - 6
TONKIN J; VILLARROYA F; PURI PL; VINCIGUERRA M: "SIRT1 signaling as potential modulator of skeletal muscle diseases", CURR. OPIN. PHARMACOL., vol. 12, no. 3, June 2012 (2012-06-01), pages 372 - 6
TUON FF; FERNANDES ER; DUARTE MI; AMATO VS: "The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 in the epidermis of patients with cutaneous leishmaniasis", J. DERMATOL. SCI., vol. 59, no. 1, July 2010 (2010-07-01), pages 55 - 7, XP027074841, DOI: doi:10.1016/j.jdermsci.2010.04.009
WALVOORT MT; VOLBEDA AG; REINTJENS NR; VAN DEN ELST H; PLANTE OJ; OVERKLEEFT HS; VAN DER MAREL GA; COD6E JD: "Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides", ORG. LETT., vol. 14, no. 14, 2012, pages 3776 - 3779
WALVOORT MT; VOLBEDA AG; REINTJENS NR; VAN DEN ELST H; PLANTE OJ; OVERKLEEFT HS; VAN DER MAREL GA; CODÉE JD: "Automated Solid-Phase Synthesis of Hyaluronan Oligosaccharides", ORG. LETT., vol. 14, no. 14, 2012, pages 3776 - 3779
WANG P; XU TY; GUAN YF; TIAN WW; VIOLLET B; RUI YC; ZHAI QW; SU DF; MIAO CY: "Nicotinamide phosphoribosyltransferase protects against ischemic stroke through SIRT1-dependent adenosine monophosphate-activated kinase pathway", ANN. NEUROL., vol. 69, no. 2, February 2011 (2011-02-01), pages 360 - 74
WANG X; BI Z; WANG Y; WANG Y: "Increased MAPK and NF- B expression of Langerhans cells is dependent on TLR2 and TLR4, and increased IRF-3 expression is partially dependent on TLR4 following UV exposure", MOL. MED. REPORT, vol. 4, no. 3, May 2011 (2011-05-01), pages 541 - 6
WU Z; LIU MC; LIANG M; FU J: "Sirt1 protects against thrombomodulin down-regulation and lung coagulation after particulate matter exposure", BLOOD, vol. 119, no. 10, 8 March 2012 (2012-03-08), pages 2422 - 9
YUAN ZQ; BENNETT L; CAMPO MS; NASIR L: "Bovine papillomavirus type 1 E2 and E7 proteins down-regulate Toll Like Receptor 4 (TLR4) expression in equine fibroblasts", VIRUS RES., vol. 149, no. 1, April 2010 (2010-04-01), pages 124 - 7, XP026934664, DOI: doi:10.1016/j.virusres.2010.01.008
ZBINDEN-FONCEA H; RAYMACKERS JM; DELDICQUE L; RENARD P; FRANCAUX M: "TLR2 and TLR4 activate p38 MAPK and JNK during endurance exercise in skeletal muscle", MED. SCI. SPORTS EXERC., vol. 44, no. 8, August 2012 (2012-08-01), pages 1463 - 72

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015096493A (ja) * 2013-10-08 2015-05-21 日本新薬株式会社 アクアポリン機能亢進剤
JP2017141207A (ja) * 2016-02-12 2017-08-17 株式会社らいむ 神経伸長促進剤、内服剤、培地用添加剤、細胞希釈液用添加剤、培地および細胞希釈液
US10973858B2 (en) 2016-02-12 2021-04-13 Laimu Corporation Nerve growth promoter and method for producing same, internal preparation, medium additive, cell dilution additive, medium, cell dilution, antioxidant and method for producing same, external preparation, and wound treatment agent and method for producing same
US11911417B2 (en) 2016-02-12 2024-02-27 Laimu Corporation Nerve growth promoter and method for producing same, internal preparation, medium additive, cell dilution additive, medium, cell dilution, antioxidant and method for producing same, external preparation, and wound treatment agent and method for producing same
KR20190008013A (ko) * 2017-07-14 2019-01-23 서울대학교산학협력단 신규 알츠하이머병 치료용 약학적 조성물
KR101976480B1 (ko) * 2017-07-14 2019-05-10 서울대학교 산학협력단 신규 알츠하이머병 치료용 약학적 조성물
WO2022044781A1 (ja) * 2020-08-28 2022-03-03 日本コルマー株式会社 ゲル状組成物
JP2022039549A (ja) * 2020-08-28 2022-03-10 日本コルマー株式会社 ゲル状組成物
JP7104942B2 (ja) 2020-08-28 2022-07-22 日本コルマー株式会社 ゲル状組成物

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