CN110028598A - 一种优化透明质酸分子量分布的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于透明质酸制备技术领域，提供了本发明提供了一种优化透明质酸分子量分布的方法，在常温下将平均分子量为Mra的透明质酸采用洗脱剂稀释形成洗脱液，并倒入已填充硅胶的填充柱中进行洗脱处理，在所述硅胶柱的尾端分别截取m(m≥3)个时间段内的流出液，分别对不同时间段的流出液，进行提纯处理并进行GPC检测，根据GPC检测结果及目标优化范围，获取一个或多个时间段的流出液并进行混合。本发明的优化透明质酸分子量分布的方法，采用硅胶层析法对透明质酸分子量进行进一步筛选，经提纯处理之后，获得的透明质酸分子量分布范围更窄，相同平均分子量批次与批次之间的粘度更稳定，作用功效更明确。

Description

一种优化透明质酸分子量分布的方法
技术领域
本发明涉及透明质酸制备技术领域，具体涉及一种优化透明质酸分子量分布的方法。
背景技术
透明质酸的基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖组成的大型多糖类，为当今所公认的最佳保湿成分，广泛的应用在化妆品中。不同分子量的透明质酸在化妆品中的功效不同。一般来说，高分子量透明质酸(＞160万Da)在皮肤表面形成致密防护膜，起到长效保湿，良好的修复作用；中分子量透明质酸(20万～160万Da)起到较好的保湿型和润滑性，缓释、稳定乳化作用；低分子量透明质酸(1万～20万Da)起到营养肌肤，持久保湿作用；超低分子量透明质酸(＜10000Da)能够透皮吸收，深层保湿，具有抗衰老、晒后修复等特性。在化妆品配制中，根据使用目的，选择不同分子量透明质酸。
透明质酸属于粘多糖聚合物，在实际生产发酵过程中得到的产物为各种分子量的混合物。虽然现有的工艺可以根据通氧量、营养基质、及后期的酸、碱、酶处理等方式得到不同平均分子量的透明质酸。由于分子量相差较大的透明质酸其粘度也有所不同，因此，分子量分布较宽的透明质酸的粘度稳定性不高。但其分子量分布范围广，导致作用功效不明确，批次之间的粘度不稳定。在化妆品生产过程中带来不稳定性以及后期用户的不同使用感。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种优化透明质酸分子量分布的方法，以获得更窄分子量分布范围的透明质酸。
本发明提供的优化透明质酸分子量分布的方法，将平均分子量为Mra的透明质酸采用洗脱剂稀释形成洗脱液，并倒入已填充硅胶的填充柱中进行洗脱处理，在所述硅胶柱的尾端分别截取m(m≥3)个时间段内的流出液，分别对不同时间段的流出液，进行提纯处理并进行GPC检测，根据GPC检测结果及目标优化范围，获取一个或多个时间段的流出液并进行混合。
可选地，所述填充柱为高2m，直径20cm的钢制填充柱。
可选地，所述硅胶的直径为5-8μm，每一硅胶的孔径为
可选地，所述洗脱液中的透明质酸浓度为0.1％～5.0％。
可选地，所述洗脱剂为0.1mol/L～0.2mol/L的氯化钠溶液。
可选地，所述洗脱处理的洗脱速度为50mL/min～100mL/min。
可选地，所述纯优化处理采用乙醇沉淀法。
本发明的有益效果：
本发明的优化透明质酸分子量分布的方法，采用硅胶层析法对透明质酸分子量进行进一步筛选，经提纯处理之后，获得的透明质酸分子量分布范围更窄，相同平均分子量批次与批次之间的粘度更稳定，作用功效更明确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1是本发明实施例1优化前的透明质酸的GPC校准曲线；
图2是本发明实施例1优化后的透明质酸的GPC校准曲线；
图3是本发明实施例2优化前的透明质酸的GPC校准曲线；
图4是本发明实施例2优化后的透明质酸的GPC校准曲线；
图5是本发明实施例3优化前的透明质酸的GPC校准曲线；
图6是本发明实施例3优化后的透明质酸的GPC校准曲线。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
本发明的技术方案所依据的技术原理如下：
一份含有各种分子量的样品溶液缓慢地流经硅胶填充的柱中，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入硅胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快；小分子物质除了可在硅胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入硅胶颗粒的微孔中，即进入硅胶相内，在向下移动的过程中，从一个硅胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一个硅胶颗粒内，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品溶液中分子大的物质先流出硅胶柱，中等分子的物质后流出，分子量小的物质最后流出。
基于此，本申请的发明人为了解决背景技术中所提及的问题，经创造性劳动，发明了本申请的技术方案，具体包括：
本发明提供了一种优化透明质酸分子量分布的方法，在常温下将平均分子量为Mra的透明质酸采用洗脱剂稀释形成洗脱液，并倒入已填充硅胶的填充柱中进行洗脱处理，在所述硅胶柱的尾端分别截取m(m≥3)个时间段内的流出液，分别对不同时间段的流出液，进行提纯处理并进行GPC检测，根据GPC检测结果及目标优化范围，获取一个或多个时间段的流出液并进行混合。
本发明的优化透明质酸分子量分布的方法，采用硅胶层析法对透明质酸分子量进行进一步筛选，经提纯处理之后，获得的透明质酸分子量分布范围更窄，相同平均分子量批次与批次之间的粘度更稳定，作用功效更明确。
其中，所述填充柱为高2m，直径20cm的钢制填充柱；所述硅胶的直径为5-8μm，每一硅胶的孔径为所述洗脱液中的透明质酸浓度为0.1％～5.0％；所述洗脱剂为0.1mol/L～0.2mol/L的氯化钠溶液；所述洗脱处理的洗脱速度为50mL/min～100mL/min；所述纯优化处理采用乙醇沉淀法。
对于提纯处理后的各时间段的透明质酸采用GPC凝胶色谱进行分子量及分子量分布进行检测。一般可以采用Mw/Mn对大分子进行分子量分布表征，其中，Mw/Mn＝1.00为单分散性聚合物；Mw/Mn＜1.20为窄分布聚合物；Mw/Mn＜1.50为较窄分布聚合物；Mw/Mn＜2.00为中等分布聚合物；Mw/Mn＞2.00为宽分布聚合物。
实施例1
实施例1针对高分子量透明质酸进行优化，以质量为10g、平均分子量为168万Da的透明质酸为原始透明质酸。
图1是本发明实施例1优化前的透明质酸的GPC校准曲线。参见图1，优化前的透明质酸的平均分子量Mw＝1683384Da，分子量分布Mw/Mn＝1.544402。
填充柱：2m×20cm特制不锈钢圆柱；
填充材料：硅胶，生产厂家为TOSOH，型号为TSK-GEL SW，直径8μm，孔径
洗脱剂：0.1mol/L的氯化钠溶液；
洗脱液中透明质酸浓度：0.2％；
流速：50mL/min。
洗脱处理过程：从将洗脱液倒入已填充硅胶的填充柱中开始计时，分别按10分钟、10分钟、30分钟、30分钟、30分钟、10分钟、10分钟收集流出液，共收集130分钟。采用乙醇沉淀每部分流出液进行提纯优化，并进行GPC分析，分析结果见表1。
表1
由表1可以看出，平均分子量为168万Da的原始透明质酸中分子量分布范围从201万Da到97万Da，分布极其广泛。而201万Da与97万Da的透明质酸分子量相差一倍之多，其功效目的也完全不同，这就给后期应用上带来功效不明确性。同时，此批次平均分子量为168万Da的透明质酸与下一批次同样分子量的透明质酸在产品中带来的粘度可能不同，导致产品具有不稳定性。
将第1时间段、第2时间段、第6时间段和第7时间段的透明质酸剔除，保留剩余时间段的透明质酸并进行混合，作为优化后的透明质酸，对其进行GPC测量。图2是本发明实施例1优化后的透明质酸的GPC校准曲线。参见图2，优化后的透明质酸的平均分子量Mw＝1742559Da，分子量分布Mw/Mn＝1.32049。
因此，经过优化后，大分子透明质酸从中等分布聚合物(Mw/Mn＝1.54)变成较窄分布聚合物(Mw/Mn＝1.32)。
针对高分子量透明质酸(＞160万Da)，可以用0.1mol/L氯化钠按流速50ml/min洗脱。剔除较大分子的透明质酸后，于洗脱处理后20分钟开始收集流出液，收集90分钟即可得到分子量分布较窄的透明质酸。在实际生产中，为了提高得率，亦可适当放宽流出液的接收时间。
实施例2
实施例2针对中分子量透明质酸进行优化，以质量为10g、平均分子量为140万Da的透明质酸为原始透明质酸。
图3是本发明实施例2优化前的透明质酸的GPC校准曲线。参见图3，优化前的透明质酸的平均分子量Mw＝1397645Da，分子量分布Mw/Mn＝2.24933。
填充柱：2m×20cm特制不锈钢圆柱；
填充材料：硅胶，生产厂家为TOSOH，型号为TSK-GEL SW，直径8μm，孔径
洗脱剂：0.1mol/L的氯化钠溶液；
洗脱液中透明质酸浓度：0.2％；
流速：50mL/min。
洗脱处理过程：从将洗脱液倒入已填充硅胶的填充柱中开始计时，分别按10分钟、10分钟、30分钟、30分钟、30分钟、10分钟、10分钟收集流出液，共收集130分钟。采用乙醇沉淀每部分流出液进行提纯优化，并进行GPC分析，分析结果见表2。
表2
由表2可以看出，平均分子量为140万Da的原始透明质酸中分子量分布范围从196万Da到85万Da，分布极其广泛。而190万Da与80万Da的透明质酸与140万Da透明质酸的功效目的完全不同，这就给后期应用上带来功效不明确性。同时，此批次平均分子量为140万Da的透明质酸与下一批次同样分子量的透明质酸在产品中带来的粘度可能不同，导致产品具有不稳定性。
将第1时间段、第2时间段、第6时间段和第7时间段的透明质酸剔除，保留剩余时间段的透明质酸并进行混合，作为优化后的透明质酸，对其进行GPC测量。图4是本发明实施例2优化后的透明质酸的GPC校准曲线。参见图4，优化后的透明质酸的平均分子量Mw＝1391806Da，分子量分布Mw/Mn＝1.93673。
因此，经过优化后，中分子透明质酸从宽分布聚合物(Mw/Mn＝2.25)变成中等分布聚合物(Mw/Mn＝1.93)。
针对中分子量透明质酸(20万Da～160万Da)，可以用0.1mol/L氯化钠按流速50ml/min洗脱。剔除较大分子的透明质酸后，于洗脱处理后20分钟开始收集流出液，收集90分钟即可得到分子量分布较窄的透明质酸。在实际生产中，为了提高得率，亦可适当放宽流出液的接受时间。
实施例3
实施例3针对低分子量透明质酸进行优化，以质量为50g、平均分子量为13万Da的透明质酸为原始透明质酸。
图5是本发明实施例3优化前的透明质酸的GPC校准曲线。参见图5，优化前的透明质酸的平均分子量Mw＝129047Da，分子量分布Mw/Mn＝1.18830。
填充柱：2m×20cm特制不锈钢圆柱；
填充材料：硅胶，生产厂家为TOSOH，型号为TSK-GEL SW，直径5μm，孔径
洗脱剂：0.1mol/L的氯化钠溶液；
洗脱液中透明质酸浓度：2％；
流速：50mL/min。
洗脱处理过程：从将洗脱液倒入已填充硅胶的填充柱中开始计时，分别按5分钟、5分钟、15分钟、15分钟、5分钟、5分钟收集流出液，共收集50分钟。采用乙醇沉淀每部分流出液进行提纯优化，并进行GPC分析，分析结果见表3。
表3
由表3可以看出，平均分子量为130000Da的原始透明质酸中分子量分布范围从17万Da到7万Da，分布较广泛。同时，此批次平均分子量为13万Da的透明质酸与下一批次同样分子量的透明质酸在产品中带来的粘度可能不同，导致产品具有不稳定性。
将第1时间段和第2时间段的透明质酸剔除，保留剩余时间段的透明质酸并进行混合，作为优化后的透明质酸，对其进行GPC测量。图6是本发明实施例3优化后的透明质酸的GPC校准曲线。参见图6，优化后的透明质酸的平均分子量Mw＝130581Da，分子量分布Mw/Mn＝1.07308。
因此，经过优化后，低分子透明质酸从窄分布聚合物(Mw/Mn＝1.19)变成窄分布聚合物(Mw/Mn＝1.07)。
针对低分子量透明质酸(1万Da～20万Da)，可以用0.1mol/L氯化钠按流速50ml/min洗脱。剔除较大分子的透明质酸后，于洗脱处理后10分钟开始收集流出液，收集30分钟即可得到分子量分布较窄的透明质酸。在实际生产中，为了提高得率，亦可适当放宽流出液的接受时间。
实施例4
实施例4针对超低分子量透明质酸进行优化，以质量为100g、平均分子量为8000Da的透明质酸为原始透明质酸。
填充柱：2m×20cm特制不锈钢圆柱；
填充材料：硅胶，生产厂家为TOSOH，型号为TSK-GEL SW，直径5μm，孔径
洗脱剂：0.1mol/L的氯化钠溶液；
洗脱液中透明质酸浓度：5％；
流速：50mL/min。
洗脱处理过程：从将洗脱液倒入已填充硅胶的填充柱中开始计时，分别按5分钟、5分钟、15分钟、15分钟、5分钟、5分钟收集流出液，共收集50分钟。采用乙醇沉淀每部分流出液进行提纯优化，并进行GPC分析，分析结果见表4。
表4
一般认为分子量小于10000Da的透明质酸可以透皮吸收，而在透明质酸分子量5万以下的透明质酸难以区别。由表2可以看出，平均分子量为8000Da的原始透明质酸中存在有超高10000Da即不能透皮吸收的分子。
因此，为了确保透明质酸产品能够全部深入皮肤角质层，将第1时间段和第2时间段的透明质酸剔除，保留剩余时间段的透明质酸并进行混合。
针对超低分子量透明质酸(＜1万Da)，可以用0.1mol/L氯化钠按流速50ml/min洗脱。剔除较大分子的透明质酸后，于洗脱处理后10分钟开始收集流出液，即可得到分子量全部低于1万Da的透明质酸。
在实际生产中，硅胶可以反复使用。被剔除的透明质酸可应用于相应分子量分布的混料。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (7)

1.一种优化透明质酸分子量分布的方法，其特征在于，将平均分子量为Mra的透明质酸采用洗脱剂稀释形成洗脱液，并倒入已填充硅胶的填充柱中进行洗脱处理，在所述硅胶柱的尾端分别截取m(m≥3)个时间段内的流出液，分别对不同时间段的流出液，进行提纯处理并进行GPC检测，根据GPC检测结果及目标优化范围，获取一个或多个时间段的流出液并进行混合。
2.根据权利要求1所述的优化透明质酸分子量分布的方法，其特征在于，所述填充柱为高2m，直径20cm的钢制填充柱。
3.根据权利要求1所述的优化透明质酸分子量分布的方法，其特征在于，所述硅胶的直径为5-8μm，每一硅胶的孔径为
4.根据权利要求1所述的优化透明质酸分子量分布的方法，其特征在于，所述洗脱液中的透明质酸浓度为0.1％～5.0％。
5.根据权利要求1所述的优化透明质酸分子量分布的方法，其特征在于，所述洗脱剂为0.1mol/L～0.2mol/L的氯化钠溶液。
6.根据权利要求1所述的优化透明质酸分子量分布的方法，其特征在于，所述洗脱处理的洗脱速度为50mL/min～100mL/min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的优化透明质酸分子量分布的方法，其特征在于，所述纯优化处理采用乙醇沉淀法。
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