CN114853824A - 一种石斛寡糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石斛总寡糖和/或石斛寡糖的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)称取适量的石斛药材，加入水在一定温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，减压浓缩至一定体积并离心，弃去药渣，上清液加入乙醇沉淀，充分搅拌均匀后静置过夜，离心，收集上清液合并后减压浓缩至无乙醇，冷冻干燥得到石斛总寡糖；以及可选地(2)对该石斛总寡糖通过活性炭‑硅藻土柱进行柱层析以及通过ODS‑AQ制备柱进行柱层析从而分离纯化得到该石斛寡糖。该工艺简单、方便、无污染、且石斛总寡糖和/或石斛寡糖得率和纯度高。

Description

一种石斛寡糖的制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种石斛寡糖的制备方法。
背景技术
关于石斛多糖的提取方法，目前已经有诸多报道提高多糖得率，并有研究比较了相同条件下不同提取方法对多糖得率、化学结构和抗氧化活性的影响。然而，到目前为止，还没有石斛寡糖提取方法的相关报道。并且在前期实验摸索中发现，常规提取药材采用的沸水提取条件得到的石斛寡糖得率并不理想，且不同的提取条件可能会产生不同的物质成分且含量差异较大，因此亟需建立一种标准化的高效的提取方法，从而使石斛寡糖得以最大化利用。
发明内容
基于此，本发明提供了一种石斛总寡糖和/或石斛寡糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)称取适量的石斛药材，加入水在一定温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，减压浓缩至一定体积并离心，弃去药渣，上清液加入乙醇沉淀，充分搅拌均匀后静置过夜，离心，收集上清液合并后减压浓缩至无乙醇，冷冻干燥得到石斛总寡糖；以及
可选地(2)对该石斛总寡糖通过活性炭-硅藻土柱进行柱层析以及通过ODS-AQ制备柱进行柱层析从而分离纯化得到该石斛寡糖。
进一步地，该石斛选自以下的一种或多种：金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、美花石斛、铁皮石斛、束花石斛和马鞭石斛的新鲜或干燥茎。
进一步地，该石斛为铁皮石斛的新鲜或干燥茎。
进一步地，该石斛寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成。进一步地，该石斛寡糖由2～7个单糖单元通过糖苷键结合而成。进一步地，该石斛寡糖由葡萄糖、果糖和/或甘露糖通过糖苷键结合而成。进一步地，该石斛寡糖选自以下的一种或多种：蔗糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、甘露六糖和麦芽七糖。
进一步地，该方法的步骤(1)包括如下的[1]～[11]项中的任意一项或者多项：
[1]将该石斛药材进行粉碎；[2]将粉碎后的该石斛药材过60～100目筛，例如80目筛；[3]该水为蒸馏水或去离子水；[4]该温度为50℃～100℃，优选为60℃～80℃，例如约70℃；[5]该加热提取的操作重复2～4次，例如2次；[6]该水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为20～70倍量，更优选为40～60倍量，例如约60倍量；[7]该加热提取的时间为1～10小时，优选为2～8小时，更优选为2～5小时，例如约2小时；[8]该一定体积为加入的该水的体积的1/10～1/2，优选为1/6；[9]该离心的条件为在2000rpm～6000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在3000rpm～5000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约3600rpm转速下离心约10分钟；[10]该无水乙醇的量为该上清液的1～5倍体积，例如约4倍体积；[11]该乙醇沉淀所用的该乙醇的浓度为60％～100％，优选为70％～90％，例如约80％。
进一步地，该方法的步骤(2)中所使用的活性炭-硅藻土柱通过以下方法制备：
称取适量的颗粒活性炭用10％～30％乙酸煮沸10min～60min，然后水洗至中性，再与等重的硅藻土用水调匀至成浆状，倾入层析柱中，待其自然沉降，在炭面上覆盖一片滤纸，蒸馏水淋洗至炭面不再下降，待炭面上的水减少到1μm～10μm时，得到该活性炭-硅藻土柱。
进一步地，称取适量的颗粒活性炭用约20％乙酸煮沸约30min。
进一步地，该方法的步骤(2)进一步包括如下步骤：
(a)称取适量的该石斛总寡糖，加入水充分溶解后离心，上清液加入该活性炭-硅藻土柱内，待其自然沉降后，依次用不同的流动相进行梯度洗脱，苯酚硫酸法检测无糖分流出后，更换至下一梯度，各部位洗脱液在水浴下减压浓缩后冻干，得到石斛粗寡糖；以及
(b)采用CAPCELL PAK C18-AQ(250×10mm，5μm)制备柱，以超纯水作为流动相，对该石斛粗寡糖进行纯化并在线检测，根据出峰结果进行收集并冻干，得到该石斛寡糖。
进一步地，该方法的步骤(a)和(b)分别包括如下的[1]～[8]项中的任意一项或者多项：
[1]该水为蒸馏水或去离子水；
[2]该水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为10～50倍量，例如约20倍量；
[3]该离心的条件为在6000rpm～20000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在8000rpm～15000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约12000rpm转速下离心约15分钟；
[4]该不同的流动相分别为蒸馏水、15％～25％乙醇溶液和45％～55％乙醇溶液，优选地蒸馏水、约20％乙醇溶液和约50％乙醇溶液；
[5]该水浴的温度为40℃～100℃，优选为50℃～80℃，例如约60℃；
[6]该石斛粗寡糖为约20％乙醇溶液洗脱部位；
[7]该CAPCELL PAK C18-AQ制备柱的流速为1～3mL/min，柱温箱温度为25±0.1℃至35±0.1℃，进样体积为45～55μL，样品浓度为15～25mg/mL，优选地约2mL/min，柱温箱温度为30±0.1℃，进样体积为约50μL，样品浓度为约20mg/mL；
[8]该在线检测所使用的仪器为Agilent 1100高效液相色谱仪和RID示差检测器。
根据本发明的另一个方面，提供了一种通过上述方法制备得到的石斛总寡糖和/或石斛寡糖。
本发明的有益效果：
本发明所采用的响应面法(RSM)是一种数理统计模型，可用于改进和优化多因素过程，并确定单个因素对结果的影响。响应面法的主要优点是减少了评估单个参数及其相互作用所需的实验次数。Box-Behnken设计(BBD)是一种响应面模型。相较于其他方法，BBD具有更有效、更易于组织的特点。因此本发明在单因素实验的基础上，应用响应面法结合Box-Behnken设计，对铁皮石斛寡糖的提取工艺进行优化，该工艺简单、方便、无污染、且石斛总寡糖和/或石斛寡糖得率和纯度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为D-葡萄糖(a)、蔗糖(b)、麦芽三糖(c)、麦芽五糖(d)以及葡聚糖标准品P-5(e)的HPLC图谱。
图2为D-葡萄糖(a)、蔗糖(b)、麦芽三糖(c)、麦芽五糖(d)以及葡聚糖标准品P-5(e)的HPGPC标准曲线图。
图3为蔗糖标准曲线图。
图4为乙醇沉淀浓度对铁皮石斛寡糖得率的影响结果示意图。
图5为提取次数对铁皮石斛寡糖得率的影响结果示意图。
图6为提取温度对铁皮石斛寡糖得率的影响结果示意图。
图7为提取时间对铁皮石斛寡糖得率的影响结果示意图。
图8为料液比对铁皮石斛寡糖得率的影响结果示意图。
图9为利用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行统计和方差分析结果示意图，(a)残差正态概率分布；(b)残差与方程预测值对应关系；(c)预测值与实验值对应关系。
图10为交互作用对铁皮石斛寡糖提取率的影响结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
正如背景技术部分所描述的，现有技术未见有石斛寡糖分离纯化方法的相关报道且存在分离纯化条件难以掌握的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种石斛总寡糖和/或石斛寡糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)称取适量的石斛药材，加入水在一定温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，减压浓缩至一定体积并离心，弃去药渣，上清液加入乙醇沉淀，充分搅拌均匀后静置过夜，离心，收集上清液合并后减压浓缩至无乙醇，冷冻干燥得到石斛总寡糖；以及
可选地(2)对该石斛总寡糖通过活性炭-硅藻土柱进行柱层析以及通过ODS-AQ制备柱进行柱层析从而分离纯化得到该石斛寡糖。
在一种优选的实施方式中，该石斛选自以下的一种或多种：金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、美花石斛、铁皮石斛、束花石斛和马鞭石斛的新鲜或干燥茎。
本发明的“石斛”包含但不限于兰科植物中上述石斛品种的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎。石斛品种之间相互近似，均可适用于本发明的技术方案。
在一种优选的实施方式中，该石斛为铁皮石斛的新鲜或干燥茎。
在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成。
在本发明中，个数、目数、温度、次数、倍数、时间、体积、转速、浓度或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“2～10”，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数例如2、3、4、5、6、7、8、9和10，且在上述数值范围内均能实现本发明的技术效果。
在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖由2～7个单糖单元通过糖苷键结合而成。
在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖由葡萄糖、果糖和/或甘露糖通过糖苷键结合而成。
在一种优选的实施方式中，该石斛寡糖选自以下的一种或多种：蔗糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、甘露六糖和麦芽七糖。
在一种优选的实施方式中，该方法的步骤(1)包括如下的[1]～[11]项中的任意一项或者多项：
[1]将该石斛药材进行粉碎；[2]将粉碎后的该石斛药材过60～100目筛，例如80目筛；[3]该水为蒸馏水或去离子水；[4]该温度为50℃～100℃，优选为60℃～80℃，例如约70℃(约70℃能够提高寡糖的扩散和溶解度，流动性增强)；[5]该加热提取的操作重复2～4次，例如2次；[6]该水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为20～70倍量，更优选为40～60倍量，例如约60倍量(约60倍量，既能有利于寡糖成分的溶出，获得更高的寡糖得率，又减少过高的料液比带来的后续浓缩等过程带来的额外的压力以及物质人力的投入)；[7]该加热提取的时间为1～10小时，优选为2～8小时，更优选为2～5小时，例如约2小时；[8]该一定体积为加入的该水的体积的1/10～1/2，优选为1/6；[9]该离心的条件为在2000rpm～6000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在3000rpm～5000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约3600rpm转速下离心约10分钟；[10]该无水乙醇的量为该上清液的1～5倍体积，例如约4倍体积；[11]该乙醇沉淀所用的该乙醇的浓度为60％～100％，优选为70％～90％，例如约80％。
用于本文时，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约70”包括70的±5％，或从66.5到73.5，包含66.5和73.5。
在一种优选的实施方式中，该方法的步骤(2)中所使用的活性炭-硅藻土柱通过以下方法制备：
称取适量的颗粒活性炭用10％～30％乙酸煮沸10min～60min，然后水洗至中性，再与等重的硅藻土用水调匀至成浆状，倾入层析柱中，待其自然沉降，在炭面上覆盖一片滤纸，蒸馏水淋洗至炭面不再下降，待炭面上的水减少到1μm～10μm时，得到该活性炭-硅藻土柱。
在一种优选的实施方式中，称取适量的颗粒活性炭用约20％乙酸煮沸约30min。
在一种优选的实施方式中，该方法的步骤(2)进一步包括如下步骤：
(a)称取适量的该石斛总寡糖，加入水充分溶解后离心，上清液加入该活性炭-硅藻土柱内，待其自然沉降后，依次用不同的流动相进行梯度洗脱，苯酚硫酸法检测无糖分流出后，更换至下一梯度，各部位洗脱液在水浴下减压浓缩后冻干，得到石斛粗寡糖；以及
(b)采用CAPCELL PAK C18-AQ(250×10mm，5μm)制备柱，以超纯水作为流动相，对该石斛粗寡糖进行纯化并在线检测，根据出峰结果进行收集并冻干，得到该石斛寡糖。
在一种优选的实施方式中，该方法的步骤(a)和(b)分别包括如下的[1]～[8]项中的任意一项或者多项：
[1]该水为蒸馏水或去离子水；[2]该水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为10～50倍量，例如约20倍量；[3]该离心的条件为在6000rpm～20000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在8000rpm～15000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约12000rpm转速下离心约15分钟；[4]该不同的流动相分别为蒸馏水、15％～25％乙醇溶液和45％～55％乙醇溶液，优选地蒸馏水、约20％乙醇溶液和约50％乙醇溶液；[5]该水浴的温度为40℃～100℃，优选为50℃～80℃，例如约60℃；[6]该石斛粗寡糖为约20％乙醇溶液洗脱部位；[7]该CAPCELL PAKC18-AQ制备柱的流速为1～3mL/min，柱温箱温度为25±0.1℃至35±0.1℃，进样体积为45～55μL，样品浓度为15～25mg/mL，优选地约2mL/min，柱温箱温度为30±0.1℃，进样体积为约50μL，样品浓度为约20mg/mL；[8]该在线检测所使用的仪器为Agilent 1100高效液相色谱仪和RID示差检测器。
根据本发明的另一个方面，提供了一种通过上述方法制备得到的石斛总寡糖和/或石斛寡糖。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例
1响应面法优化铁皮石斛寡糖提取工艺
本发明主要通过采用响应面法和Box-Behnken设计相结合的方法对铁皮石斛寡糖的提取工艺进行优化。热水提取法是中药材最常用的提取方法，通过收集水提醇沉上清液，可实现铁皮石斛总寡糖的初步富集。通过分子排阻色谱法确定寡糖出峰时间范围，并对总寡糖进行在线分离，可对寡糖部位总体含量进行测定。在本发明中，采用单因素考察确定乙醇沉淀浓度、提取次数以及提取温度、提取时间、料液比的考察范围，并通过三因素三水平的响应面法对铁皮石斛寡糖含量的影响进行进一步的优化，建立最佳提取方案。
1.1实验仪器与材料
1.1.1试剂与材料
无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，中国)；纯净水(上海市娃哈哈饮用水有限公司，中国)；SUGAR KS-802糖分析柱(昭和，Shodex，日本)；D-葡萄糖(西格玛奥德里奇，Sigma-Aldrich，美国)；蔗糖(阿拉丁试剂(上海)有限公司，中国)；麦芽三糖(成都普思生物科技股份有限公司，中国)；麦芽五糖(成都普思生物科技股份有限公司，中国)；普鲁兰多糖标准品(Shodex，日本)；铁皮石斛(中国云南西双版纳)；重水(西格玛奥德里奇，美国)；D-阿拉伯糖(西格玛奥德里奇，美国)；L-岩藻糖(西格玛奥德里奇，美国)；L-鼠李糖(西格玛奥德里奇，美国)；D-木糖(西格玛奥德里奇，美国)；D-甘露糖(西格玛奥德里奇，美国)；D-半乳糖(西格玛奥德里奇，美国)；麦芽寡糖(DP3-8)(成都普思生物科技股份有限公司，中国)；甘露寡糖(DP2-6)(成都普思生物科技股份有限公司，中国)；乙腈(费希尔，Fisher，美国)；甲酸铵(奥德里奇，Aldrich，美国)；甲酸(吉至试剂，J.T.Baker，美国)；1-甲基咪唑(西格玛奥德里奇，美国)；二甲亚砜(西格玛奥德里奇，美国)；硼氢化钠(国药集团化学试剂有限公司，中国)；冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司，中国)；三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司，中国)；乙酸酐(国药集团化学试剂有限公司，中国)；三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司，中国)；无水硫酸钠(国药集团化学试剂有限公司，中国)；颗粒活性炭(国药集团化学试剂有限公司，中国)；硅藻土(国药集团化学试剂有限公司，中国)Prevail Carbohydrate ES5u(格蕾丝，GRACE，美国)；CAPCELL PAK C18-AQ(资生堂，日本)。
1.1.2仪器与设备
电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，中国)；台式离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司，中国)；HWS24型恒温水浴锅(上海诚献仪器设备有限公司，中国)；MILLI-Q超纯水制备仪(默克密理博，MERCK MILLIPORE，美国)；多样品自动氮吹浓缩仪(ATRTechnology Inc，美国)；高效液相色谱仪(安捷伦，Aglient，美国)；移液枪(艾本德，Eppendorf，美国)；标准检验筛(80目)(浙江上虞市华丰五金仪器有限公司，中国)；高速粉碎机(浙江屹立工贸有限公司，中国)；涡旋振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司，中国)；冷冻干燥机(Labconco，美国)；LC-6M离心机(上海离心机械研究所，中国)；N-1100旋转蒸发仪(瑞徽电子有限公司，中国)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司，中国)；Thermo Trace DSQ气质联用色谱仪(安捷伦，美国)；AM-600和AM-400型核磁共振仪(布鲁克，Bruker，美国)；安捷伦1290Infinity LC/6546Q-TOF(安捷伦，美国)；HPLC U3000-
Figure BDA0003623311710000091
电喷雾检测器(赛默飞，Thermo，德国)。
1.2实验方法
1.2.1寡糖含量测定方法建立
(1)出峰时间考察
采用高效液相凝胶色谱法(HPGPC)测定不同分子量标准品的出峰时间，确定寡糖的出峰时间统计范围。色谱条件如下：Agilent 1100高效液相色谱仪，检测器使用RID示差检测器，色谱柱选择SUGAR KS-802，柱温箱温度为40±0.1℃，超纯水作为流动相，流速为0.8mL/min，进样体积为10μL。分别称取2mg D-葡萄糖、蔗糖、麦芽三糖、麦芽五糖以及分子量已知的Dextran P系列葡聚糖标准品P-5，用0.5mL超纯水溶解，12000rpm离心10min，小心吸取上清液于液相小瓶中液相检测，以标准品分子量的对数为纵坐标，以流动相洗脱体积为横坐标绘制标准曲线。根据寡糖的分子量范围，得出寡糖出峰时间范围。
(2)标准曲线的测定
标准溶液的制备：精密称定蔗糖标准品21.0mg，在其中加入适量超纯水使其充分溶解，转移至5mL容量瓶中，加入超纯水稀释至刻度线，上下摇匀，即可得到4.2mg/mL的标准品溶液。
样品溶液的制备：分别吸取标准品溶液800μL、400μL、200μL、160μL、80μL、40μL、20μL，加入超纯水稀释至800μL，一式三份，配成一系列浓度的蔗糖溶液，充分混匀，12000rpm离心10min，小心吸取上清液于液相小瓶中液相检测。以蔗糖标准液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立蔗糖浓度与峰面积标准曲线，建立回归方程，根据信噪比为3和10的峰值响应计算检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
(3)供试品溶液的制备
精密称定铁皮石斛样品0.5g(过80目筛)，置于圆底烧瓶中，加入纯净水15mL，70℃水浴加热回流1.5h，冷却后过滤，药渣加入15mL纯净水，重复提取两次，然后将两次滤液合并至50mL容量瓶中，加适量纯净水定容至刻度线，上下颠倒摇匀。精密移取2mL滤液，50℃水浴氮吹吹干。干燥样品加入1mL配置好的80％乙醇溶液，充分涡旋混匀后，12000rpm离心10min，小心吸取上清液800μL，50℃水浴氮吹吹干后，样品加入500μL超纯水复溶，涡旋混匀，即得。
1.2.2方法学考察
(1)精密度考察
精密称定铁皮石斛粉末0.5g(过80目筛)，按照1.2.1-(3)项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照1.2.1-(1)项下寡糖含量测定方法中的色谱条件，连续进样6次，考察精密度，并计算RSD。
(2)重复性考察
精密称定铁皮石斛粉末0.5g(过80目筛)，平行6份，按照1.2.1-3项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照1.2.1-(1)项下寡糖含量测定方法中的色谱条件进行测定。考察样品的重复性，并计算RSD。
(3)稳定性考察
精密称定铁皮石斛粉末0.5g(过80目筛)，按照2.1.2.1-3项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照1.2.1-(1)项下寡糖含量测定方法中的色谱条件，在0、3、6、9、12、24h进行测定，考察样品的稳定性，并计算RSD。
(4)加样回收率考察
样品含量测定：精密称定铁皮石斛粉末0.5g，平行3份，按照2.1.2.1-3项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照1.2.1-(1)项下寡糖含量测定方法中的色谱条件进行测定。
加样回收率考察：精密称定铁皮石斛粉末0.5g，平行9份，分别加入50％、100％、150％蔗糖对照品，每组平行3份，按照1.2.1-(3)项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照1.2.1-1项下寡糖含量测定方法中的色谱条件进行含量测定，计算回收率及RSD。
1.2.3单因素实验考察
精密称定铁皮石斛粉末0.5g，置于圆底烧瓶中，以蒸馏水作为提取溶剂，水浴加热回流提取，考察乙醇沉淀浓度、提取次数、提取温度、提取时间以及料液比对提取铁皮石斛寡糖得率的影响。
(1)乙醇沉淀浓度对铁皮石斛寡糖得率的影响
精密称定铁皮石斛样品0.5g(过80目筛)，置于圆底烧瓶中，在料液比30mL/g，70℃水浴加热回流1.5h的条件下，提取2次，按照1.2.1-(3)项下的方法处理样品，分别选择65％、70％、75％、80％、85％、90％乙醇浓度进行醇沉，HPLC-RID液相检测，分析乙醇沉淀浓度对铁皮石斛寡糖得率的影响。
(2)提取次数对铁皮石斛寡糖得率的影响
精密称定铁皮石斛样品0.5g(过80目筛)，置于圆底烧瓶中，在料液比30mL/g，70℃水浴加热回流1.5h的条件下，分别提取1次、2次、3次，按照1.2.1-(3)项下的方法处理样品，HPLC-RID液相检测，分析提取次数对铁皮石斛寡糖得率的影响。
(3)提取温度对铁皮石斛寡糖得率的影响
精密称定铁皮石斛样品0.5g(过80目筛)，置于圆底烧瓶中，在料液比30mL/g，分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴加热回流1.5h的条件下，提取2次，按照1.2.1-(3)项下的方法处理样品，HPLC-RID液相检测，分析提取温度对铁皮石斛寡糖得率的影响。
(4)提取时间对铁皮石斛寡糖得率的影响
精密称定铁皮石斛样品0.5g(过80目筛)，置于圆底烧瓶中，料液比30mL/g，70℃水浴加热回流0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h，提取2次，按照1.2.1-(3)项下的方法处理样品，HPLC-RID液相检测，分析提取时间对铁皮石斛寡糖得率的影响。
(5)料液比对铁皮石斛寡糖得率的影响
精密称定铁皮石斛样品0.5g(过80目筛)，置于圆底烧瓶中，分别在料液比10mL/g、20mL/g、30mL/g、40mL/g、50mL/g、60mL/g条件下，70℃水浴加热回流1.5h，提取2次，按照1.2.1-(3)项下的方法处理样品，HPLC-RID液相检测，分析料液比对铁皮石斛寡糖得率的影响。
1.2.4响应面优化铁皮石斛寡糖的提取
根据以上单因素实验结果，选择提取温度、提取时间、料液比三个因素，选择铁皮石斛寡糖得率最高的三个水平，利用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平响应面实验考察三个因素对铁皮石斛寡糖得率的影响，响应面因素与水平设计如表1所示。通过二次多项式预测相应如下：
Figure BDA0003623311710000121
其中Y为响应值(即铁皮石斛寡糖提取率)，a0为系数常数，ai，aii及aij分别为一次项、二次项及交互项的系数，Xi和Xj分别代表两个不同的变量(i≠j)
表1铁皮石斛寡糖提取响应面实验设计因素水平表
Figure BDA0003623311710000122
1.3实验结果
1.3.1方法学考察及含量测定
苯酚硫酸法是测定糖含量的经典方法，其原理为多糖在浓硫酸条件下水解生成单糖并立刻脱水形成糠醛或糠醛衍生物，与苯酚缩合成橙黄色络合物，并在490nm处有最大吸收。由于其简单、快速、灵敏，因此在多糖含量测定得到广泛应用。但对于本实验而言，由于样品经过水提醇沉后上清液存在的游离单糖的含量会影响寡糖的定量，苯酚硫酸法对于检测寡糖含量并不适用，因此本实验建立分子排阻色潽法对寡糖进行定量，根据分子量对目标化合物进行在线分离，通过计算对应时间范围的峰面积，检测寡糖部位的含量。示差检测器是一种质量型检测器，且对没有紫外吸收的糖类物质具有较高的灵敏度，因此可对醇沉上清液中的寡糖与单糖进行在线分析并含量测定。
1.3.2寡糖出峰时间考察
采用HPLC-RID法对不同分子量的糖标准品进行液相检测，结果如图1所示。利用GPC软件进行分析，可得到标准品分子量对数与出峰时间的标准曲线如图2所示，确定寡糖峰面积的计算时间在8.10min-10.40min范围内。
1.3.3标准曲线的测定
通过对不同浓度的蔗糖标准溶液进行HPLC-RID液相分析，建立蔗糖标准溶液浓度与峰面积关系的标准曲线如图3所示。蔗糖标准品浓度与峰面积的线性回归方程为：y＝119414x+2559.6，R2＝0.9999。线性范围在0.11-4.20mg/mL，LOD和LOQ分别为8.23μg/mL和18.89μg/mL。
1.3.4方法学考察
(1)精密度考察
将制备好的铁皮石斛寡糖样品连续进样6次，计算8.10min-10.40min峰面积之和，结果如表2所示。RSD值0.22％＜3％，表明仪器精密度良好。
表2精密度试验
Figure BDA0003623311710000131
Figure BDA0003623311710000141
(2)重复性考察
平行制备6份铁皮石斛寡糖样品，液相分析，计算8.10min-10.40min峰面积之和，结果如表3所示。RSD值1.55％＜3％，表明该方法具有良好的重现性。
表3重复性试验
Figure BDA0003623311710000142
(3)稳定性考察
将制备好的铁皮石斛寡糖样品分别在0、3、6、9、12、24h进行测定，液相分析，计算8.10min-10.40min峰面积之和，结果如表4所示。RSD值1.44％＜3％，表明该方法提取的供试品在24h内稳定。
表4稳定性试验
Figure BDA0003623311710000143
Figure BDA0003623311710000151
(4)加样回收率考察
平行制备3份铁皮石斛寡糖样品，液相分析，计算8.10min-10.40min峰面积之和，计算样品含量约为2.11mg，精密称定铁皮石斛粉末0.5g，平行9份，分别加入50％、100％、150％蔗糖对照品，每组平行3份，液相分析，计算8.10min-10.40min峰面积之和，计算回收率及RSD，结果如表5所示。加样回收率均在95％-105％之间，RSD＝2.57％＜3％，表明方法精确度良好。
表5加样回收率试验
Figure BDA0003623311710000152
Figure BDA0003623311710000161
1.3.5单因素实验考察
(1)乙醇沉淀浓度对铁皮石斛寡糖得率的影响
由于铁皮石斛药材粉末水提液较为粘稠，且寡糖含量较低，对水提液直接进行液相分析时，寡糖峰较为不明显，因此考虑选择醇沉法尽可能除去水提液中多糖成分，较多富集寡糖成分，以便于后续液相检测。本实验选择65％-90％共6个乙醇浓度梯度对铁皮石斛水提液进行醇沉，结果如图4表示。由图4可知，65％-80％乙醇浓度醇沉，铁皮石斛寡糖得率仅下降约0.3％，85％、90％乙醇浓度时，铁皮石斛寡糖得率明显大幅度下降，因此选择80％乙醇浓度对水提液进行醇沉。
(2)提取次数对铁皮石斛寡糖得率的影响
提高提取次数是提高提取得率的常用方法，但无限制的增加提取次数也会增加人力、物力的投入和资源的浪费。本实验考察了在同等条件下分别提取铁皮石斛粉末1次、2次、3次的寡糖得率，结果如图5所示。由图5可知，提取2次的铁皮石斛寡糖得率6.47％相比较于提取1次得率4.96％大幅增加，提取3次得率6.89％相较于提取2次，得率增加不明显，综合考虑后，选择提取2次作为后续考察条件。
(3)提取温度对铁皮石斛寡糖得率的影响
提取温度对溶质的传输和溶解度有潜在影响，合适的提取温度会促进溶质的释放，增加溶质在溶剂中的溶解度。本实验考察了50℃-100℃之间6个温度梯度对铁皮石斛寡糖得率的影响。结果如图6所示，由图6可知，50℃-70℃铁皮石斛寡糖得率上升，在70℃时达到最高，70℃时铁皮石斛寡糖得率达到6.57％，随着温度继续升高，铁皮石斛寡糖得率开始下降，但仍高于60℃时铁皮石斛寡糖得率，表明铁皮石斛寡糖可能随着温度的升高而发生降解，使铁皮石斛寡糖得率下降。因此，选择提取得率最高的70℃-90℃作为后续响应面考察因素水平。
(4)提取时间对铁皮石斛寡糖得率的影响
合适的提取时间可以促进药材与溶剂有充分接触。本实验考察了0.5h-3h之间6个时间梯度对铁皮石斛寡糖得率的影响。结果如图7所示，由图7可知，随着提取时间的增加，铁皮石斛寡糖得率上升，在提取时间2h时达到最高点后，随着时间的继续增加，出现略微下降趋势。这可能是由于铁皮石斛寡糖需要足够长的时间扩散到溶剂中，然而过长的时间可能会导致寡糖的降解。因此，选择提取得率最高的2h-3h作为后续响应面考察因素水平。
(5)料液比对铁皮石斛寡糖得率的影响
在一定范围内，提高料液比有利于提取溶剂完全浸润药材，使药材充分溶胀，有利于增加药材与提取溶剂的接触面积，从而提高产率。本实验考察了10mL/g-60mL/g之间6个料液比梯度对铁皮石斛寡糖得率的影响。结果如图8所示，由图8可知，随着料液比的增加，铁皮石斛寡糖得率逐渐上升。推测可能是由于铁皮石斛药材水提液黏度较大，增大料液比有助于降低水提液黏度，促进目标产物的溶出。从提取得率的趋势结果可以看出，继续增大料液比，铁皮石斛寡糖得率可能会继续上升，但是过高的料液比意味着需要投入更多的人力、物力，以及更大的浓缩压力，因此，选择提取得率最高的40mL/g-60mL/g作为后续响应面考察因素水平。
1.3.6响应面优化铁皮石斛寡糖的提取
(1)回归方程的建立与分析
在单因素实验结果基础上，以提取温度、提取时间、料液比三个因素作为自变量，以铁皮石斛寡糖得率为标准筛选自变量的取值范围，以铁皮石斛寡糖得率作为响应值，采用Box-Behnken析因设计(BBD)，利用Design-Expert 8.0.6软件进行三因素三水平的试验设计，包括17组试验方案。按照实验方案对铁皮石斛粉末进行提取，液相检测，计算铁皮石斛寡糖得率，实验结果如表6所示。
利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行分析，得到铁皮石斛寡糖得率(Y)对提取温度(X1)、提取时间(X2)、料液比(X3)的二次多项回归模型：
Y＝6.91-0.15X1-0.016X2+0.061X3+0.013X1X2-0.037X1X3+0.075X2X3+0.22X1 2+0.059X2 2+0.041X3 2 (2)
表6自变量响应的实验设计
Figure BDA0003623311710000181
Figure BDA0003623311710000191
(2)响应面方差分析
利用Design-Expert 8.0.6软件对实验数据进行统计和方差分析，结果如表7和图9所示。由图9(a)可知，残差正态概率分布接近一条直线，满足正态假设，说明回归模型拟合程度较好，由图9(b)可知，残差随机分布，由图9(c)可知，预测值与实验值相关性良好。由表格可知，模型F值59.28，P＜0.01，差异显著，表明回归模型拟合程度良好，具有很高的显著性，受噪声影响的概率小于0.01％。回归模型的失拟项F值为4.17，P＝0.1008＞0.05，失拟项不显著，说明相对于纯误差而言，缺少拟合并不显著，回归模型足够用于预测变异。模型相关系数R2＝0.9870，校正相关系数Radj 2＝0.9704，表明实验值与模型预测值之间具有良好的相关性。变异系数CV值为0.42％，表明回归模型具有较高的精密度和良好的可靠性。
回归方程中不同变量对响应值影响的显著程度与F值的大小有关，即F值越大，影响程度越强。由表7可知，三个因素对铁皮石斛寡糖得率的影响依次为：X1＞X3＞X2，即提取温度＞料液比＞提取时间。交互项X1X3和X2 X3之间有显著性，说明提取温度和提取时间分别与料液比有统计学意义，二者的交互作用对铁皮石斛寡糖提取得率有显著影响。
表7铁皮石斛寡糖产率的二次多项式拟合方差分析结果
Figure BDA0003623311710000192
Figure BDA0003623311710000201
注：**代表差异高度显著(P<0.01)，*代表显著(P<0.05)。
(3)交互因素对铁皮石斛寡糖得率的影响
为了研究提取温度、提取时间、料液比及其交互作用对铁皮石斛寡糖得率的影响，利用Design-Expert 8.0.6软件绘制3D响应面图和等高线图显示铁皮石斛寡糖得率和任意两个独立变量之间的关系，从图10中更直观的观察变量之间的交互作用。在控制第三个因素为0水平的条件下绘制三维响应面图和二维等高线图，结合表7可知，提取温度与料液比、提取时间与料液比之间的相互作用对铁皮石斛寡糖的提取得率影响显著。
(4)响应面实验模型验证
通过对回归方程以及响应面的综合分析，可得到优化铁皮石斛寡糖最佳提取条件为：提取温度70℃，提取时间2h，料液比60mL/g。以此条件对铁皮石斛寡糖的提取工艺进行验证，重复实验三次，得到铁皮石斛寡糖的提取得率为7.32±0.03％，与预测值7.50％接近。说明模型预测较为准确。
2铁皮石斛寡糖提取、分离纯化和结构鉴定
明确铁皮石斛中所含寡糖成分的结构信息，是药材质量控制以及药理活性研究的基础。本节内容主要应用响应面法优化的提取方法对铁皮石斛寡糖进行提取，并通过活性炭柱层析以及CAPCELL PAK C18-AQ制备柱进一步分离纯化得到寡糖纯品，通过HPLC-QTOF-MS、单糖组成分析以及NMR分析确定寡糖结构。并将其与标准品HPLC-CAD液相结果对照，确定寡糖特征图谱共有峰归属。
2.1实验方法
2.1.1铁皮石斛总寡糖的提取
称取S13(浙江雁荡山)批次铁皮石斛药材800g(过80目筛)，以响应面优化的提取方法对铁皮石斛药材进行提取，即加入48L水，70℃回流提取2h，重复提取2次，将过滤后的提取液合并，减压浓缩至约8L，大型离心机3600rpm离心10min，弃去药渣，上清液加入4倍体积无水乙醇，充分搅拌均匀后静置过夜，大型离心机3600rpm离心10min，收集上清液合并后减压浓缩至无乙醇，冷冻干燥得到铁皮石斛总寡糖。
2.1.2铁皮石斛寡糖的分离与纯化
颗粒活性炭200g用20％乙酸煮沸半小时，然后水洗至中性，再与等重的硅藻土用水调匀至成浆状，倾入层析柱中，待其自然沉降，在炭面上覆盖一片滤纸，蒸馏水淋洗至炭面不再下降，待炭面上的水减少到一薄层时，即可上样。
称取铁皮石斛总寡糖样品5g，加入100mL蒸馏水充分溶解，12000rpm离心15min，上清液轻轻加入柱内。待其自然沉降后，依次用蒸馏水、20％乙醇溶液、50％乙醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，苯酚硫酸法检测无糖分流出后，更换至下一梯度，各部位洗脱液60℃水浴减压浓缩后冻干。其中寡糖成分主要集中于20％乙醇洗脱部位，命名为DOOS-20。
对DOOS-20进一步纯化，采用CAPCELL PAK C18-AQ(250×10mm，5μm)制备柱，以超纯水作为流动相，流速为2mL/min，柱温箱温度为30±0.1℃，进样体积为50μL，样品浓度为20mg/mL。Agilent 1100高效液相色谱仪，以RID示差检测器在线检测，根据出峰结果进行收集并冻干。
2.1.3铁皮石斛寡糖单糖组成分析
寡糖经过三氟乙酸、盐酸或硫酸等完全水解成单糖后，经过硼氢化钠等还原剂可还原为糖醇，再经由乙酸酐乙酰化为糖醇乙酸酯，氯仿萃取后用GC-MS分析，并与单糖标准品色谱峰相对照即可测得寡糖的单糖组成。
取约1mg样品置于5mL安瓿瓶中，加入2M三氟乙酸(TFA)溶液1mL溶解；熔封，放入120℃烘箱中水解2h；取出，放冷至室温后，吸取200μL水解液于15mL试管中，加入2M NaOH溶液200μL中和，再加入1mL新配置的0.5M NaBH4-DMSO溶液，涡旋混匀，40℃水浴还原反应90min；取出，逐滴加入100μL冰醋酸，边加边震荡至不冒气泡，加入1-甲基咪唑200μL和1mL乙酸酐，涡旋混匀，40℃水浴乙酰化反应10min；加2mL蒸馏水涡旋混匀以终止反应；取出，待冷却至室温后，加入1.5mL氯仿，涡旋混匀以萃取乙酰化产物，待分层后，小心将上层水液吸去，下层溶液加2～3mL蒸馏水继续洗涤3次；吸取下层溶液，经无水硫酸钠干燥后，置于样品瓶中，进行GC-MS检测分析。
GC-MS分析条件：
气相部分：色谱柱安捷伦DM-5MS(60m×0.25mm×0.25μm)；载气为氦气，流速1mL/min；进样体积1μL；进样口离子源温度为250℃；柱温箱程序升温：起始温度140℃，4℃/min升温至192℃，1℃/min升温至204℃，保温4min，1℃/min升温至215℃，保温4min，5℃/min升温至250℃，保持温度9min，共60min。
质谱部分：EI源，70eV；离子源温度230℃；四极杆150℃；扫描范围：m/z＝40～500；质谱开启时间：8～60min。
2.1.4铁皮石斛寡糖HPLC-QTOF-MS分析
对DOOS-20各纯化部位进行HPLC-QTOF-MS分析，可以得到各纯化部位分子量，从而计算得到各纯化部位的聚合度。色谱柱：Prevail Carbohydrate ES(250×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-30mM甲酸铵(+0.3％甲酸)水溶液；流速：0.8mL/min；柱温：45℃，梯度洗脱程序如表8所示。在负离子模式下，毛细管电压：3.5kV，喷嘴电压1kV，干燥气温度320℃，干燥气流速8L/min，喷雾器压力：35psi，碎裂电压175V，扫描范围m/z 50-1700Da，参比离子m/z：112.9855、1033.9881。
表8梯度洗脱程序
Figure BDA0003623311710000231
2.1.5铁皮石斛寡糖核磁共振波谱测定
取DOOS-20各纯化部位样品约20mg左右，加入500μL重水溶解，10000rpm离心10min，吸取上清液至5mm核磁管中，进行1H、13C、13C DEPT 135NMR检测。
2.2实验结果
2.2.1铁皮石斛总寡糖的提取
800g铁皮石斛中药材经过响应面优化的提取方法进行水提、醇沉、浓缩冻干后，得到铁皮石斛总寡糖76.8g，得率为9.6％。铁皮石斛总寡糖呈浅黄色粉末，溶解后呈浅黄色透明液体。
2.2.2铁皮石斛寡糖的分离纯化
铁皮石斛总寡糖首先采用活性炭-硅藻土柱层析法分离，通过不同浓度乙醇溶液洗脱将铁皮石斛总寡糖进行初步分级，得到3组级分分别为：DOOS-W、DOOS-20和DOOS-50。得率分别为2.73％、1.72％和0.69％。其中DOOS-W包含绝大部分单糖组分以及无机盐等杂质，DOOS-20为不同聚合度寡糖，DOOS-50为糖苷等糖的衍生物。根据实验目的，将DOOS-20作为后续纯化的主要对象。
采用CAPCELL PAK C18-AQ(250×10mm，5μm)制备柱，以超纯水作为流动相，以RID示差检测器进行在线检测，对DOOS-20进行进一步纯化，分别收集后冻干，并与标准品进行比对，其中STD-Mal包含葡萄糖、蔗糖、麦芽寡糖DP3-8，STD-Man包含甘露寡糖DP2-6，其中1号峰出峰时间与葡萄糖标准品出峰时间一致，推断为单糖。
2.2.3铁皮石斛寡糖单糖组成分析
将纯化得到的一系列寡糖纯品完全酸水解后进行单糖组成分析，与标准品出峰时间对照可知，DOOS-20-2由甘露糖和葡萄糖组成，DOOS-20-3、DOOS-20-4、DOOS-20-5、DOOS-20-6和DOOS-20-8由葡萄糖组成，DOOS-20-7由甘露糖组成。
2.2.4铁皮石斛寡糖HPLC-QTOF-MS分析+核磁共振波谱分析
将DOOS-20各纯化部位进行HPLC-QTOF-MS检测分析，得到各部位准分子离子峰[M-H]-并通过分子式推算出各纯化部位聚合度。对DOOS-20各纯化部位进行1H、13C、13C DEPT135NMR分析，综合单糖组成分析结果以及QTOF-MS分析得到的分子量和聚合度信息可对各纯化部位进行结构解析以及共有峰归属，结果如表9所示。
表9DOOS-20各纯化部位样品信息
Figure BDA0003623311710000251
结合现有技术文献，其中DOOS-20-2为蔗糖；DOOS-20-3为麦芽三糖；DOOS-20-4为麦芽四糖；DOOS-20-5为麦芽五糖；DOOS-20-6为麦芽六糖；DOOS-20-7为甘露六糖；DOOS-20-8为麦芽七糖。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种石斛总寡糖和/或石斛寡糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)称取适量的石斛药材，加入水在一定温度下加热回流提取，将过滤后的提取液合并，减压浓缩至一定体积并离心，弃去药渣，上清液加入乙醇沉淀，充分搅拌均匀后静置过夜，离心，收集上清液合并后减压浓缩至无乙醇，冷冻干燥得到石斛总寡糖；以及
可选地(2)对所述石斛总寡糖通过活性炭-硅藻土柱进行柱层析以及通过ODS-AQ制备柱进行柱层析从而分离纯化得到所述石斛寡糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述石斛选自以下的一种或多种：金钗石斛、霍山石斛、鼓槌石斛、流苏石斛、美花石斛、铁皮石斛、束花石斛和马鞭石斛的新鲜或干燥茎。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述石斛为铁皮石斛的新鲜或干燥茎。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述石斛寡糖由2～10个单糖单元通过糖苷键结合而成；
优选地，所述石斛寡糖由2～7个单糖单元通过糖苷键结合而成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述石斛寡糖由葡萄糖、果糖和/或甘露糖通过糖苷键结合而成。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述石斛寡糖选自以下的一种或多种：蔗糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、甘露六糖和麦芽七糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(1)包括如下的[1]～[11]项中的任意一项或者多项：
[1]将所述石斛药材进行粉碎；
[2]将粉碎后的所述石斛药材过60～100目筛，例如80目筛；
[3]所述水为蒸馏水或去离子水；
[4]所述温度为50℃～100℃，优选为60℃～80℃，例如约70℃；
[5]所述加热提取的操作重复2～4次，例如2次；
[6]所述水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为20～70倍量，更优选为40～60倍量，例如约60倍量；
[7]所述加热提取的时间为1～10小时，优选为2～8小时，更优选为2～5小时，例如约2小时；
[8]所述一定体积为加入的所述水的体积的1/10～1/2，优选为1/6；
[9]所述离心的条件为在2000rpm～6000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在3000rpm～5000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约3600rpm转速下离心约10分钟；
[10]所述无水乙醇的量为所述上清液的1～5倍体积，例如约4倍体积；
[11]所述乙醇沉淀所用的所述乙醇的浓度为60％～100％，优选为70％～90％，例如约80％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(2)中所使用的活性炭-硅藻土柱通过以下方法制备：
称取适量的颗粒活性炭用10％～30％乙酸煮沸10min～60min，然后水洗至中性，再与等重的硅藻土用水调匀至成浆状，倾入层析柱中，待其自然沉降，在炭面上覆盖一片滤纸，蒸馏水淋洗至炭面不再下降，待炭面上的水减少到1μm～10μm时，得到所述活性炭-硅藻土柱；
优选地，称取适量的颗粒活性炭用约20％乙酸煮沸约30min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(2)进一步包括如下步骤：
(a)称取适量的所述石斛总寡糖，加入水充分溶解后离心，上清液加入所述活性炭-硅藻土柱内，待其自然沉降后，依次用不同的流动相进行梯度洗脱，苯酚硫酸法检测无糖分流出后，更换至下一梯度，各部位洗脱液在水浴下减压浓缩后冻干，得到石斛粗寡糖；以及
(b)采用CAPCELL PAK C18-AQ(250×10mm，5μm)制备柱，以超纯水作为流动相，对所述石斛粗寡糖进行纯化并在线检测，根据出峰结果进行收集并冻干，得到所述石斛寡糖；
优选地，所述方法的步骤(a)和(b)分别包括如下的[1]～[8]项中的任意一项或者多项：
[1]所述水为蒸馏水或去离子水；
[2]所述水的用量为1～80倍量(L/kg)，优选为10～50倍量，例如约20倍量；
[3]所述离心的条件为在6000rpm～20000rpm转速下离心5～30分钟，优选为在8000rpm～15000rpm转速下离心8～20分钟，例如在约12000rpm转速下离心约15分钟；
[4]所述不同的流动相分别为蒸馏水、15％～25％乙醇溶液和45％～55％乙醇溶液，优选地蒸馏水、约20％乙醇溶液和约50％乙醇溶液；
[5]所述水浴的温度为40℃～100℃，优选为50℃～80℃，例如约60℃；
[6]所述石斛粗寡糖为约20％乙醇溶液洗脱部位；
[7]所述CAPCELL PAK C18-AQ制备柱的流速为1～3mL/min，柱温箱温度为25±0.1℃至35±0.1℃，进样体积为45～55μL，样品浓度为15～25mg/mL，优选地约2mL/min，柱温箱温度为30±0.1℃，进样体积为约50μL，样品浓度为约20mg/mL；
[8]所述在线检测所使用的仪器为Agilent 1100高效液相色谱仪和RID示差检测器。
10.一种通过权利要求1至9中任一项所述的方法制备得到的石斛总寡糖和/或石斛寡糖。
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