CN110272505A - 一种铁皮石斛粗多糖提取方法及多糖含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛粗多糖提取方法及多糖含量检测方法，包括如下步骤：取仿野生林下铁皮石斛鲜条切段，恒温烘干；粉碎成粉，加水热提，获得铁皮石斛多糖提取液，蒸发浓缩；离心机离心处理；取上清液加入乙醇静置后离心处理获取沉淀冻结；真空冷冻干燥研磨成粉状即得。本发明采用纯天然新鲜仿野生林下铁皮石斛进行粗多糖提取，采用本发明的提出方法提取多糖可以更大程度的提取铁皮石斛中的多糖，提取效率更高，纯度更高。
Description
技术领域
本发明涉及植物活性成分提取技术领域，具体为一种铁皮石斛粗多糖提取方法及多糖含量检测方法。
背景技术
铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物，其主要活性成分是石斛多糖，其具有较好的保健功能，有抗氧化、缓解疲劳，提高免疫力等功效。
目前铁皮石斛多糖的提取方法主要有：传统热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶辅助提取法、闪提法、湿法超微粉碎辅助提取法、超临界辅助提取法等。传统热水浸提法操作简单，对相关人员及设备要求不高，因此使用较为广泛。但是，传统热水浸提法多是采用干铁皮石斛，材料活性有所降低，而传统方法的料液比和提取温度不能达到最大程度的提取。
因此，提出一种能够提取多糖含量高、提取效率高、纯度高的铁皮石斛粗多糖提取方法并进行多糖含量检测的方法成为必要。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种铁皮石斛粗多糖提取方法及多糖含量检测方法。
根据本发明的一个目的，本发明提供如下技术方案：
一种铁皮石斛粗多糖提取方法，包括如下步骤：
S1，原料选择和处理：
S101，取仿野生林下铁皮石斛鲜条切段，每段长度约0.5-1.0cm；
S102，称取铁皮石斛鲜条段300.0g于60℃恒温烘干2-3天；
S103，将烘干好的铁皮石斛粉碎成粉，过100目筛子，备用；
S2，多糖提取
S201，采用分析天平准确称取制备好的铁皮石斛粉25.0000g于5000ml烧杯中，加入2000ml超纯水，95-100℃加水热提2h，获得铁皮石斛多糖提取液并采用过滤装置六层纱布进行过滤，
S202，再加入相同体积的超纯水重复提取，依次提取三次多糖提取液并进行过滤；
S3，提取液处理
S301，合并上述三次提取并经过滤的多糖提取液，在60℃旋转蒸发浓缩至500ml左右；
S302，冷却至室温，离心机4500r/min离心处理20min；
S4，多糖纯化
S401，取上清液加入4倍体积95％的乙醇，于4℃静置12h；
S402，离心机4500r/min离心处理20min，获取沉淀于-80℃冻结；
S403，已冻结沉淀真空冷冻干燥3-4天，研磨成粉状，即得。
进一步地，S4中，真空冷冻干燥工艺参数为：冻结温度-80℃，冷凝温度-51℃，真空度1.90Pa。
根据本发明的另一个目的，本发明提供如下技术方案：
一种铁皮石斛粗多糖含量检测方法，包括如下步骤：
S1，供试品溶液制备
准确称取上述制得的铁皮石斛多糖粉末0.2000g于50ml烧杯中并加入20.0ml超纯水，磁力搅拌器搅拌溶解40min使多糖全部溶解，所得多糖原液于4℃保存，吸取多糖原液稀释53倍即得供试品溶液；
按照苯酚-浓硫酸法测定多糖含量、纯度的计算公式如下所示：
根据结果计算提取率，提取率的计算公式为：
S2，标准品溶液制备
称取葡萄糖于105℃干燥至恒重，精密称取0.1000g恒重后的葡萄糖于100mL烧杯中，加超纯水溶解并转移至1000mL容量瓶中，定容至1000mL置于4℃冰箱中，制成标准品溶液备用；
S3，标准曲线制备
精密吸取标准品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL置10mL具塞试管中，加水至2.0mL，加入1mL 5％苯酚溶液，震荡摇匀，加入浓硫酸5mL，摇匀，室温放置10min后30℃水浴20min，在紫外分光光度计490nm波长处测定吸光度，以吸光度y为纵坐标，标准品溶液浓度x为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：
y＝0.8339x+0.0542，R2＝0.9991；
S4，供试品多糖含量测定
准确量取供试品溶液1mL于10mL具塞试管中，加水至2mL，按“S3”中绘制的标准曲线的制备方法，加入1mL 5％苯酚溶液，震荡摇匀，加入5mL浓硫酸，摇匀，室温放置10min后30℃水浴20min，在紫外分光光度计490nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中铁皮石斛多糖浓度，通过“S1”中多糖含量的计算方法计算出多糖含量、纯度及提取率。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明一种铁皮石斛粗多糖提取方法及多糖含量检测方法，采用纯天然新鲜仿野生林下铁皮石斛进行粗多糖提取，采用本发明的提出方法提取多糖可以更大程度的提取铁皮石斛中的多糖，提取效率更高，纯度更高。本发明铁皮石斛多糖有效的提取方法，可以更大程度获得多糖成分，以便更加明确石斛多糖的含量，为研究铁皮石斛多糖的生理功效及药理功效提供足够的多糖原料以保证实验的顺利进行，研发出人们亟需的保健品及药品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种铁皮石斛粗多糖提取方法，包括如下步骤：
取仿野生林下铁皮石斛鲜条切段，每段长度约0.5-1.0cm左右，称取铁皮石斛鲜条段300.0g于60℃恒温烘干2-3天，原料经严格温度控制，将烘干好的铁皮石斛粉碎成粉，过100目筛子，备用。
将铁皮石斛粉末25.0000g放入5000mL烧杯中，加入2000ml的超纯水，在烧炉上加热至煮沸开始计时，温度保持溶液沸腾(95-100℃)即可，煮沸2h，冷却至室温，6层纱布过滤，再加入2000ml的超纯水，重复提取三次，合并3次滤液，60℃旋转蒸发浓缩至500ml左右，放于烧杯中冷却至室温，离心(4500r/min，20min)，取上清液加入4倍体积95％的乙醇，过夜(4℃，12h)，待分层后离心(4500r/min,25min)弃上清，沉淀于-80℃冻结，真空冷冻干燥3-4天结束干燥(真空冷冻干燥工艺参数为：冻结温度-80℃，冷凝温度-51℃，真空度1.90Pa)，研磨成粉，即得。根据实验目的对干燥物进行相应保存。
实施例2
一种铁皮石斛粗多糖含量检测方法，包括如下步骤：
铁皮石斛多糖含量测定
1材料
提取物：按实施例1进行提取
仪器和试剂
葡萄糖标准品：上海国药；苯酚：阿拉丁试剂公司；浓硫酸：本校国资处提供；其余试剂均为分析纯(AR)；酶标仪：所在研究所提供。
2方法
2.1供试品溶液的制备
准确称取实施案例1中提取的铁皮石斛多糖粉末0.2000g于50mL烧杯中并加入20.0mL UP水，磁力搅拌器搅拌溶解40min使多糖全部溶解，所得10mg/mL的多糖原液于4℃保存，取多糖原液按53倍稀释，即得供试品。
2.2标准品溶液的制备
称取葡萄糖适量于105℃干燥至恒重，精密称取0.1000g恒重后的葡萄糖于100mL烧杯中，加超纯水溶解并转移至1000mL容量瓶中，定容至1000mL置于4℃冰箱中备用。
按照苯酚-浓硫酸法测定多糖含量、纯度的计算公式如下所示：
根据结果计算提取率，提取率的计算公式为：
2.3标准曲线制备
精密吸取标准品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL置10mL具塞试管中，加水至2.0mL，加入1mL5％苯酚溶液(现配现用)，震荡摇匀，加入浓硫酸5mL，摇匀，室温放置10min后30℃水浴20min，在紫外分光光度计490nm波长处测定吸光度，以吸光度y为纵坐标，浓度x(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y＝0.8339x+0.0542，R2＝0.9991。结果表明多糖在0.05-1.13mg/mL范围内线性关系良好。
测定法
准确量取供试品溶液1mL于10mL具塞试管中，加水至2mL，按绘制的标准曲线的制备项下的方法，加入1mL 5％苯酚溶液(现配现用)，震荡摇匀，加入浓硫酸5mL，摇匀，室温放置10min后30℃水浴20min，在紫外分光光度计490nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中铁皮石斛多糖浓度，计算，即得多糖含量。
实施例3
精密度实验
精确吸取铁皮石斛多糖供试品溶液5份，每份1mL，按照“2.3标准曲线制备”项下的方法测定吸光度。测定结果，RSD为4.01％，精密度良好。
实施例4
重复性实验
精确吸取铁皮石斛多糖对供试品溶液10份，每份1mL，按照“2.3标准曲线制备”项下的方法测定吸光度。测定结果，RSD为1.82％，重现性良好。
实施例5
稳定性试验
精确吸取铁皮石斛多糖对供试品溶液2份，每份1mL，按照“2.3标准曲线制备”项下的方法测定吸光度。在室温下放置0.1h、0.2h、0.3h、0.4h、0.5h、1h后按上述的方法，供试品在在1h内都处于稳定状态(未测更长时间的稳定性)。
实施例6
加样回收实验
精确吸取铁皮石斛多糖对供试品溶液3份，每份1mL，分别加入0.6mL葡萄糖标准液，加水至2mL，空白对照不加葡萄糖标准液，按照“2.3标准曲线制备”项下的方法测定吸光度，计算多糖平均回收率为157.7％。
实施例7
样品测定实验
按上述供试品溶液的制备方法和测定条件，测定3份铁皮石斛样品中多糖的含量，记录结果，结果取平均值，结果见表1。
表1多糖含量测定结果
实施例8
在不除蛋白，不使用透析膜及色谱柱纯化的情况下，经测定，水浸提仿野生林下铁皮石斛粗多糖的提取率为23.3％，多糖含量为37.1％，纯度为32.2％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种铁皮石斛粗多糖提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，原料选择和处理：
S101，取仿野生林下铁皮石斛鲜条切段，每段长度0.5-1.0cm；
S102，称取铁皮石斛鲜条段300.0g于60℃恒温烘干2-3天；
S103，将烘干好的铁皮石斛粉碎成粉，过100目筛子，备用；
S2，多糖提取
S201，采用分析天平准确称取制备好的铁皮石斛粉25.0000g于5000ml烧杯中，加入2000ml超纯水，95-100℃加水热提2h，获得铁皮石斛多糖提取液并采用过滤装置六层纱布进行过滤，
S202，再加入相同体积的超纯水重复提取，依次提取三次多糖提取液并进行过滤；
S3，提取液处理
S301，合并上述三次提取并经过滤的多糖提取液，在60℃旋转蒸发浓缩至500ml；
S302，冷却至室温，离心机4500r/min离心处理20min；
S4，多糖纯化
S401，取上清液加入4倍体积95％的乙醇，于4℃静置12h；
S402，离心机4500r/min离心处理20min，获取沉淀于-80℃冻结；
S403，已冻结沉淀真空冷冻干燥3-4天，研磨成粉状，即得。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛粗多糖提取方法，其特征在于，S4中，真空冷冻干燥工艺参数为：冻结温度-80℃，冷凝温度-51℃，真空度1.90Pa。
3.一种铁皮石斛粗多糖含量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，供试品溶液制备
准确称取铁皮石斛多糖粉末0.2000g于50ml烧杯中并加入20.0ml超纯水，磁力搅拌器搅拌溶解40min使多糖全部溶解，所得多糖原液于4℃保存，吸取多糖原液稀释53倍即得供试品溶液；
按照苯酚-浓硫酸法测定多糖含量、纯度的计算公式如下所示：
根据结果计算提取率，提取率的计算公式为：
S2，标准品溶液制备
称取葡萄糖于105℃干燥至恒重，精密称取0.1000g恒重后的葡萄糖于100mL烧杯中，加超纯水溶解并转移至1000mL容量瓶中，定容至1000mL置于4℃冰箱中，制成标准品溶液备用；
S3，标准曲线制备
精密吸取标准品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL置10mL具塞试管中，加水至2.0mL，加入1mL5％苯酚溶液，震荡摇匀，加入浓硫酸5mL，摇匀，室温放置10min后30℃水浴20min，在紫外分光光度计490nm波长处测定吸光度，以吸光度y为纵坐标，标准品溶液浓度x为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：
y＝0.8339x+0.0542，R2＝0.9991；
S4，供试品多糖含量测定
准确量取供试品溶液1mL于10mL具塞试管中，加水至2mL，按“S3”中绘制的标准曲线的制备方法，加入1mL5％苯酚溶液，震荡摇匀，加入5mL浓硫酸，摇匀，室温放置10min后30℃水浴20min，在紫外分光光度计490nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中铁皮石斛多糖浓度，通过“S1”中多糖含量的计算方法计算出多糖含量、纯度及提取率。
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