CN103558166A - 贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，该方法是以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法在480～490nm波长处或采用蒽酮-硫酸法在600～625nm波长处测定贞芪扶正制剂中多糖的含量。本发明操作简便，快速重现性好，回收率高，灵敏度高，测量结果准确，可有效控制贞芪扶正制剂的质量，从而确保其临床疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，属于中药质量检测技术领域。
背景技术
贞芪制剂有补气养阴、扶正固本之功效。现代药理实验证明能提高人体免疫功能，保护骨髓和肾上腺皮质功能，促进干扰素产生；配合肿瘤患者放、化疗，减轻病人放、化疗期间的毒副作用，促进正常功能的恢复的作用。其处方由黄芪、女贞子组成。目前，贞芪制剂供临床选择的剂型有片剂、胶囊剂、颗粒剂及滴丸剂等。
黄芪是一种常用的扶正中药，素以“补气诸药之最”著称，含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、微量元素等多种生物活性物质，其中多糖是黄芪中的主要生物活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、促进骨髓造血干细胞增殖和双向调节血糖等药理作用。而女贞子有增加人体体液、细胞免疫功能，且能补阴虚、退虚热、抗炎、消肿、止痛等功效，其中女贞子多糖是调节机体免疫功能的活性成分，可显著抑制机体免疫器官退化及提高免疫功能，清除羟自由基,超氧阴离子自由基和活性氧,提高抗氧化酶活力,量效变化说明其作用呈剂量依赖性。
因此，多糖成分是贞芪扶正制剂的主要药物有效成分之一，对其含量进行测定显得尤为重要，是衡量贞芪药物质量的一个关键指标。但是，现有的贞芪扶正制剂的质量检测方法并没有对多糖成分的含量进行测定，该质量检测标准是不完善的。并且，多糖的提取主要采取水提工艺，该工艺的缺点是多糖粗品的收率低，提取成本高，势必会影响多糖的含量测定结果。如果没有严格准确的质量标准，所得到的药品质量就不能保证，必将影响该药品的临床疗效。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，能够对贞芪扶正制剂中多糖成分的含量进行快速、准确、高重现性、高回收率的测定。
本发明所述的贞芪扶正制剂是以10%～90%重量的女贞子和90%～10%重量的黄芪为原料药，按女贞子：黄芪=1：2的比例制成的。其制备方法：取女贞子10%～90%、黄芪90%～10%粉碎成粗粉，按女贞子：黄芪=1：2的比例，将黄芪饮片、女贞子饮片投入多功能提取罐内，加水煎煮三次，第一次加水量为药材的10倍量，加热至沸，煎煮2小时；第二、三次加水量均为药材的8倍量，加热至沸，分别煎煮1小时，滤过，合并滤液，真空度在-0.04～-0.075Mpa下浓缩，浓缩至相对密度为1.30～1.32(80℃的)清膏，备用；加入适量辅料，按常规方法制成相应的药物制剂。
为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：
一种贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，是以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法在480～490nm波长处或采用蒽酮-硫酸法在600～625nm波长处测定贞芪扶正制剂中多糖的含量。
前述含量测定方法具体包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备，采用下述方法a-d中的任一种：
a精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，滤液加入95%乙醇使含醇量达80%，过滤，沉淀物用95%乙醇进行洗涤，沉淀物挥干，加水溶解并转移至25mL容量瓶内，超声10～30min，定容至刻度，摇匀，即得；
b精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量；3000～5000rpm离心3min，取上清液，即得；
c精密称取贞芪扶正制剂或其内容物6.0g，置250mL烧瓶中依次用60～90℃的石油醚、乙醚和90%乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水150mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液100mL，加入活性炭，脱色，过滤，精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，过滤，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
d精密称取贞芪扶正制剂或其内容物4.0g，置250mL烧瓶中，依次用60～90℃的石油醚、乙醚和乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水100mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇量达80%，静置过夜，滤过，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，用水50mL溶解，加入适量2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置过夜，3000～5000rpm离心3min，取上清液，用2mol/L NaOH调pH至7.0，蒸干溶剂，残渣加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
（3）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于具塞试管中，并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入5%苯酚试剂1.0mL或2%蒽酮试剂0.5mL以及5.0mL浓硫酸，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，苯酚-硫酸法在480～490nm波长处测定吸光度，蒽酮-硫酸法在600～625nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（4）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次向试管中加入5%苯酚试剂1.0mL或2%蒽酮试剂0.5mL以及5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
前述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法中，5%苯酚试剂的制备方法为：取苯酚适量，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集180℃馏份，称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
前述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法中，采用苯酚-硫酸法时，步骤（3）为：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于5mL具塞试管中，并分别补蒸馏水至5mL，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，于490nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。
前述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法中，2%蒽酮试剂的制备方法为：精密称定0.1g蒽酮，置于50mL量瓶中，用乙酸乙酯定容，摇匀，即得。
前述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法中，采用蒽酮-硫酸法时，步骤（3）为：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞试管中并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。
采用本发明所述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，每克贞芪扶正制剂中多糖以葡萄糖C6H12O6计，不得少于30mg。
为确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，申请人进行了一系列试验研究和考察。
一、仪器与试药（见表1）
表1
注：水为蒸馏水，其它试剂均为分析纯。
二、方法与结果
1、提取溶剂和提取方法的选择
申请人比较了上述4种方法对贞芪扶正制剂中多糖进行提取的效果，实验结果见表2。
表2
由上表可知，前两种方法虽然操作简便，多糖提取率高，但多糖纯度很低。后两种方法步骤虽稍显繁琐，多糖提取率稍低、但纯度高，很大程度上消除了杂质对检测结果的影响。
2、对照品溶液的制备
取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得。
3、供试品溶液的制备，选择下述方法中的一种：
（1）精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，滤液加入95%乙醇使含醇量达80%，过滤，沉淀物用95%乙醇进行洗涤，沉淀物挥干，加水溶解并转移至25mL容量瓶内，超声10～30min，定容至刻度，摇匀，即得；
（2）精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量；3000～5000rpm离心3min，取上清液，即得；
（3）精密称取贞芪扶正制剂或其内容物6.0g，置250mL烧瓶中依次用60～90℃的石油醚、乙醚和90%乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水150mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液100mL，加入活性炭，脱色，过滤，精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，过滤，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
（4）精密称取贞芪扶正制剂或其内容物4.0g，置250mL烧瓶中，依次用60～90℃的石油醚、乙醚和乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水100mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇量达80%，静置过夜，滤过，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，用水50mL溶解，加入适量2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置过夜，3000～5000rpm离心3min，取上清液，用2mol/L NaOH调pH至7.0，蒸干溶剂，残渣加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得。
Ⅰ、苯酚-硫酸法
4-1、5%苯酚试剂的制备
取苯酚适量，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集180℃馏份，称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
5-1、测定波长的选择
照对照品溶液的制备项、供试品溶液的制备项下的方法，分别制备对照品溶液和供试品溶液，精密吸取对照品溶液1.0mL、2.0mL和供试品溶液1.0mL，置于具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，迅速精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在300～600nm波长处扫描，从光谱图上可以看出对照品溶液和供试品溶液均在490nm处有最大吸收峰，故以此波长为苯酚-硫酸法的检测波长。
6-1、线性关系的考察
照对照品溶液的制备项、供试品溶液的制备项下的方法，分别制备对照品溶液和供试品溶液，精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于5mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，迅速精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，于490nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程，标准曲线方程为A=5.425×C+1.58×10-3，γ=0.9993，其中A代表吸光度值，C代表葡萄糖浓度。
7-1、精密度实验
精密称取贞芪扶正制剂或其内容物，照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法在490nm波长下测定吸光度，连续测定6次，结果见表3，RSD%为5.43%。表明仪器精密度良好。
表3精密度实验测定结果
8-1、稳定性实验
精密称取贞芪扶正制剂或其内容物，照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法分别在0、5、10、15、20、30min后，精密测定吸光度，吸光度的RSD%为2.6%，结果见表4，表明在30min内样品稳定，稳定性良好。
表4稳定性实验测定结果
9-1、重现性实验
精密称取同一批次贞芪扶正制剂或其内容物，照供试品溶液的制备项下方法制得6份供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法分别在490nm波长下测定吸光度，结果见表5，计算得多糖的平均含量为33.63mg/g，RSD%为0.38%，表明该实验方法稳定可靠，重现性良好。
表5重现性实验测定结果
10-1、加样回收率实验
照对照品溶液的制备项下方法制得对照品溶液；精密称取贞芪扶正制剂或其内容物，同一批次9份，每份1.0g，3份一组，每组加入不同量的葡萄糖对照品，质量分别为样品中多糖含量的80%、100%、120%，照供试品溶液的制备项下方法制备供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法分别在490nm波长下测定吸光度，并求得其平均回收率为97.98%，RSD%为1.3%，数据见表6，表明回收率高。
表6加样回收率实验结果
11-1、样品含量测定
取4批贞芪扶正制剂或其内容物适量，精密称定，分别按供试品溶液的制备项和线性关系的考察项下方法进行制备与含量测定，计算出贞芪扶正制剂多糖的含量，结果见表7。
表7
| 样品批号 | 平均含量（mg/g） |
| 20110901 | 33.28 |
| 20110902 | 34.57 |
| 20110903 | 33.40 |
| 20110904 | 34.32 |
Ⅱ、蒽酮-硫酸法
4-2、2%蒽酮试剂的制备
精密称定0.1g蒽酮，置于50mL量瓶中，用乙酸乙酯定容，摇匀，即得。
5-2、测定波长的选择
照对照品溶液的制备项、供试品溶液的制备项下的方法，分别制备对照品溶液和供试品溶液，精密吸取对照品溶液1.0mL、2.0mL和供试品溶液1.0mL，置于具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在400～700nm波长处扫描，从光谱图上可以看出对照品溶液和供试品溶液均在625nm处有最大吸收峰，故以此波长为蒽酮-硫酸法的检测波长。
6-2、线性关系的考察
照对照品溶液的制备项、供试品溶液的制备项下的方法，分别制备对照品溶液和供试品溶液，精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于5mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，于625nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程，标准曲线方程为A=7.375×C+2.53×10-3，γ=0.9995，其中A代表吸光度值，C代表葡萄糖浓度。
7-2、精密度实验
精密称取贞芪扶正制剂或其内容物，照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法在625nm波长下测定吸光度，连续测定6次，结果见表8，RSD%为1.27%。表明仪器精密度良好。
表8精密度实验测定结果
8-2、稳定性实验
精密称取贞芪扶正制剂或其内容物，照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法分别在0、5、10、15、20、30min后，分别精密测定吸光度，吸光度的RSD%为2.6%，结果见表9。表明在30min内样品稳定，稳定性良好。
表9稳定性实验测定结果
9-2、重现性实验
精密称取同一批次贞芪扶正制剂或其内容物，照供试品溶液的制备项下方法制得6份供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法分别在625nm波长下测定吸光度，计算得多糖的平均含量为34.67mg/g，RSD%为0.16%，结果见表10，表明该实验方法稳定可靠，重现性良好。
表10重现性实验测定结果
10-2、加样回收率实验
照对照品溶液的制备项下方法制得对照品溶液；精密称取贞芪扶正制剂或其内容物，同一批次9份，每份0.5g，3份一组，每组加入不同量的葡萄糖对照品，质量分别为样品中多糖含量的80%、100%、120%，照供试品溶液的制备项下方法制备供试品溶液，并按线性关系的考察项下方法分别在625nm波长下测定吸光度，并求得其平均回收率为98.23%，RSD%为1.82%，数据见表11。表明回收率高。
表11加样回收率实验结果
11-2、样品含量测定
取4批贞芪扶正制剂或其内容物适量，精密称定，分别按供试品溶液的制备项和线性关系的考察项下方法进行制备与含量测定，计算出贞芪扶正制剂多糖的含量，结果见表12。
表12
| 样品批号 | 平均含量（mg/g） |
| 20110901 | 34.72 |
| 20110902 | 35.53 |
| 20110903 | 34.78 |
| 20110904 | 35.36 |
与现有技术相比，本发明提供了多种供试品溶液制备方法即多糖提取方法，有水提醇沉、水提+离心除蛋白等操作简便、快速,、重现性好的方法，也有水提+脱脂除杂+脱色+醇沉、水提+脱脂+脱色+醇沉+除蛋白等虽然操作稍显复杂，多糖提取率稍低，但纯度很高的方法。本发明以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法在480～490nm波长处或采用蒽酮-硫酸法在600～625nm波长处测定贞芪扶正制剂中多糖成分的含量，该方法操作简便，快速重现性好，回收率高，灵敏度高，测量结果准确，可有效控制贞芪扶正制剂的质量，从而确保其临床疗效。
具体实施方式
本发明实施例1：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（苯酚-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，滤液加入95%乙醇使含醇量达80%，过滤，沉淀物用95%乙醇进行洗涤，沉淀物挥干，加水溶解并转移至25mL容量瓶内，超声10～30min，定容至刻度，摇匀，即得；
（3）5%苯酚试剂的制备：取苯酚适量，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集180馏℃份，称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于具塞试管中，并分别补蒸馏水至10.0mL，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，于490nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次加入5%苯酚试剂1.0mL和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
本发明实施例2：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（苯酚-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量；3000～5000rpm离心3min，取上清液，即得；
（3）5%苯酚试剂的制备：取苯酚适量，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集180℃馏份，称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于具塞试管中，并分别补蒸馏水至10.0mL，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，于480nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次加入5%苯酚试剂1.0mL和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
本发明实施例3：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（苯酚-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物6.0g，置250mL烧瓶中依次用60～90℃的石油醚、乙醚和90%乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水150mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液100mL，加入活性炭，脱色，过滤，精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，过滤，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
（3）5%苯酚试剂的制备：取苯酚适量，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集180℃馏份，称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于具塞试管中，并分别补蒸馏水至10.0mL，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，于485nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次加入5%苯酚试剂1.0mL和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
本发明实施例4：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（苯酚-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物4.0g，置250mL烧瓶中，依次用60～90℃的石油醚、乙醚和乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水100mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇量达80%，静置过夜，滤过，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，用水50mL溶解，加入适量2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置过夜，3000～5000rpm离心3min，取上清液，用2mol/L NaOH调pH至7.0，蒸干溶剂，残渣加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
（3）5%苯酚试剂的制备：取苯酚适量，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集180℃馏份，称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于具塞试管中，并分别补蒸馏水至10.0mL，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，于490nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次加入5%苯酚试剂1.0mL和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
本发明实施例5：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（蒽酮-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，滤液加入95%乙醇使含醇量达80%，过滤，沉淀物用95%乙醇进行洗涤，沉淀物挥干，加水溶解并转移至25mL容量瓶内，超声10～30min，定容至刻度，摇匀，即得；
（3）2%蒽酮试剂的制备：精密称定0.1g蒽酮，置于50mL量瓶中，用乙酸乙酯定容，摇匀，即得；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞试管中并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
本发明实施例6：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（蒽酮-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量；3000～5000rpm离心3min，取上清液，即得；
（3）2%蒽酮试剂的制备：精密称定0.1g蒽酮，置于50mL量瓶中，用乙酸乙酯定容，摇匀，即得；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞试管中并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在600nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
本发明实施例7：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（蒽酮-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物6.0g，置250mL烧瓶中依次用60～90℃的石油醚、乙醚和90%乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水150mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液100mL，加入活性炭，脱色，过滤，精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，过滤，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
（3）2%蒽酮试剂的制备：精密称定0.1g蒽酮，置于50mL量瓶中，用乙酸乙酯定容，摇匀，即得；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞试管中并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在610nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
本发明实施例8：贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法（蒽酮-硫酸法）包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备：精密称取贞芪扶正制剂或其内容物4.0g，置250mL烧瓶中，依次用60～90℃的石油醚、乙醚和乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水100mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇量达80%，静置过夜，滤过，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，用水50mL溶解，加入适量2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置过夜，3000～5000rpm离心3min，取上清液，用2mol/L NaOH调pH至7.0，蒸干溶剂，残渣加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
（3）2%蒽酮试剂的制备：精密称定0.1g蒽酮，置于50mL量瓶中，用乙酸乙酯定容，摇匀，即得；
（4）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞试管中并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（5）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
上述实施例中，每克贞芪扶正制剂中多糖以葡萄糖C6H12O6计，不少于30mg。
Claims (6)
1.一种贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，其特征在于：以无水葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸法在480～490nm波长处或采用蒽酮-硫酸法在600～625nm波长处测定贞芪扶正制剂中多糖的含量。
2.根据权利要求1所述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
（1）对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成1mL含0.1mg的溶液，即得；
（2）供试品溶液的制备，采用下述方法a-d中的任一种：
a精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液25mL，滤液加入95%乙醇使含醇量达80%，过滤，沉淀物用95%乙醇进行洗涤，沉淀物挥干，加水溶解并转移至25mL容量瓶内，超声10～30min，定容至刻度，摇匀，即得；
b精密称取贞芪扶正制剂或其内容物2.0g，精密加入水50mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量；3000～5000rpm离心3min，取上清液，即得；
c精密称取贞芪扶正制剂或其内容物6.0g，置250mL烧瓶中依次用60～90℃的石油醚、乙醚和90%乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水150mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液100mL，加入活性炭，脱色，过滤，精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇80%，静置过夜，过滤，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
d精密称取贞芪扶正制剂或其内容物4.0g，置250mL烧瓶中，依次用60～90℃的石油醚、乙醚和乙醇索氏提取，残渣挥干，精密加入水100mL，称定重量，超声、回流30～60min或微波提取5～15min，补足重量，滤过；精密量取续滤液50mL，加入95%乙醇使溶液含醇量达80%，静置过夜，滤过，沉淀物用无水乙醇反复洗涤，沉淀物挥干，用水50mL溶解，加入适量2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置过夜，3000～5000rpm离心3min，取上清液，用2mol/L NaOH调pH至7.0，蒸干溶剂，残渣加水溶解后定容到50mL容量瓶中，摇匀，即得；
（3）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于具塞试管中，并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入5%苯酚试剂1.0mL或2%蒽酮试剂0.5mL以及5.0mL浓硫酸，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，苯酚-硫酸法在480～490nm波长处测定吸光度，蒽酮-硫酸法在600～625nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程；
（4）测定法：精密吸取供试品溶液1.0mL置于具塞刻度试管中，依次向试管中加入5%苯酚试剂1.0mL或2%蒽酮试剂0.5mL以及5.0mL浓硫酸，照标准曲线绘制项下的方法测定吸光度，代入回归方程，计算贞芪扶正制剂中的多糖含量。
3.根据权利要求2所述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，其特征在于，5%苯酚试剂的制备方法为：取苯酚适量，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集180℃馏份，称取7.5g，加水150mL溶解，置棕色瓶内放冰箱备用。
4.根据权利要求2或3所述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，其特征在于，采用苯酚-硫酸法时，步骤（3）为：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于具塞试管中，并分别补蒸馏水至10.0mL，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，加入5%苯酚试剂1.0mL，摇匀，精密加入5.0mL浓硫酸，立即摇匀，室温下放置25min，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，于490nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。
5.根据权利要求2所述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，其特征在于，2%蒽酮试剂的制备方法为：精密称定0.1g蒽酮，置于50mL量瓶中，用乙酸乙酯定容，摇匀，即得。
6.根据权利要求2或5所述的贞芪扶正制剂中多糖的含量测定方法，其特征在于，采用蒽酮-硫酸法时，步骤（3）为：精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于10mL具塞试管中并分别补蒸馏水至10.0mL，摇匀，配成系列标准溶液；精密移取1.0mL系列标准溶液于10mL具塞刻度试管中，依次向试管中加入0.5mL2%蒽酮试剂和5.0mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中加热10min，取出，速冷至室温后，以蒸馏水1.0mL同法作空白参照，照《中国药典》2010版一部附录VA的紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标、对照品溶液的浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。
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