CN106937959A - 一种抗肿瘤海蟑螂提取物及其制备工艺与检测方法与用途 - Google Patents

一种抗肿瘤海蟑螂提取物及其制备工艺与检测方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然药物领域，涉及一种海蟑螂提取物及其制备工艺及其检测方法与用途。该海蟑螂提取物是采用超微粉碎、仿生提取、高压脉冲电场提取以及大孔吸附树脂进行柱层析分离纯化等步骤制成的。该方法制备的海蟑螂提取物中不仅腺苷质量多，而且纯度高。本发明还提供了采用高效液相色谱仪对该海蟑螂提取物中腺苷进行含量测定的方法。本发明还提供了该海蟑螂提取物注射液以及该注射液的制备方法及其制药用途。

Description

一种抗肿瘤海蟑螂提取物及其制备工艺与检测方法与用途
技术领域：
本发明属于天然药物领域，具体涉及一种海蟑螂提取物及其制备方法与检测方法。
技术背景：
海洋生物海蟑螂Ligiaexotica(Roux)又名海蛆、海岸水虱，属节肢动物门，甲壳纲，海蟑螂科，广泛分布于我国沿海各地，是一种长年生活在海岸边的水陆两栖动物。
民间作为药物用于小儿疳积、癣、跌打损伤、疽痈初起等症。卞俊等研究，海蟑螂提取物具有一定的抗肿瘤活性。
本发明的发明人对海蟑螂已经进行了多年的研究，在对海蟑螂多年的持续研究中意外发现了一种独特的海蟑螂提取物，该提取物能够非常有效地提高海蟑螂提取物的抗肿瘤效果。
发明内容：
本发明的目的是提供一种海蟑螂提取物。
本发明的另一目的是提供该海蟑螂提取物的制备方法。
本发明的另一目的是提供该海蟑螂提取物含量测定方法。
本发明还提供了该海蟑螂提取物的注射剂药物剂型及其制备方法。
本发明还提供了该海蟑螂提取物注射液在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了该海蟑螂提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种海蟑螂提取物，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内25℃～35℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为700～900kPa，进料速度为170～190r·min-1，分级频率为35～45Hz，粉碎时间为15～25min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入25～35倍量的仿生提取溶媒，35～40℃水浴加热，搅拌提取0.5～2h，离心10～30min，离心速度2700～2900r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.1％～0.3％氯化钠、0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶及0.01mol·L-1～0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度25～35kV/cm，脉冲数35～45，温度30～40℃，料液比为1g：30～40mL，加入浓度为80～90％的乙醇作为提取液，提取40～50min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：10～12，上样体积10BV～12BV，水洗8BV～10BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：4～6的洗脱剂10BV～14BV洗脱，流速为2BV/h～4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
该海蟑螂提取物优选采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
一种海蟑螂提取物的检测方法，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
采用高效液相色谱法测定海蟑螂提取物中的腺苷含量：
(1)色谱条件：色谱柱：采用C18柱，流动相：体积比为70：20：10的2％磷酸二氢钠-乙腈-甲醇溶液，流速0.5mL/min；柱温35℃；检测波长465nm；
(2)样品溶液制备：准确称取25.00mg的海蟑螂提取物溶于50.00mL的2％盐酸甲醇溶液中，超声15min，将溶液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即得样品溶液；
(3)标准品溶液制备：将腺苷标准品1.00mg溶于1.00mL 2％盐酸甲醇溶液中，配成1mg/mL的标准品溶液；
(4)测定：精密吸取样品溶液、标准品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，进行测定。
所述的海蟑螂提取物，采用药学中常规的制药方法制备成注射剂。
所述的海蟑螂提取物注射剂的制备方法为：
(1)将海蟑螂置烘箱内25℃～35℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为700～900kPa，进料速度为170～190r·min-1，分级频率为35～45Hz，粉碎时间为15～25min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入25～35倍量的仿生提取溶媒，35～40℃水浴加热，搅拌提取0.5～2h，离心10～30min，离心速度2700～2900r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.1％～0.3％氯化钠、0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶及0.01mol·L-1～0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度25～35kV/cm，脉冲数35～45，温度30～40℃，料液比为1g：30～40mL，加入浓度为80～90％的乙醇作为提取液，提取40～50min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：10～12，上样体积10BV～12BV，水洗8BV～10BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：4～6的洗脱剂10BV～14BV洗脱，流速为2BV/h～4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
(5)取注射用水，加热至60～80℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏36～60小时，滤过，取滤液，调pH为6～7，加入活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得海蟑螂提取物注射液。
所述的海蟑螂提取物注射剂，优选的制备方法为：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
(5)取注射用水，加热至70℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得海蟑螂提取物注射液。
一种海蟑螂提取物注射剂在制备抗肿瘤药物中的应用，该海蟑螂提取物注射剂是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
(5)取注射用水，加热至70℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得海蟑螂提取物注射液。
一种海蟑螂提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
一种海蟑螂提取物在制备治疗糖尿病脑病药物中的应用，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
一种海蟑螂提取物在制备治疗抑郁症药物中的应用，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。通过如下实验研究验证本发明的技术效果：
实验一：HPLC法测定海蟑螂提取物中腺苷的含量
1 材料与方法
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂
海蟑螂：由杭州华东大药房连锁有限公司提供，地产：浙江；腺苷标准品：由上海宸功生物技术有限公司提供，批号：160213；甲醇(色谱纯)：由天津博达盛业化工产品有限公司提供，批号：151203；乙腈(色谱纯)：由南京化学试剂股份有限公司生产，批号：151123；盐酸(分析纯)：由安徽省中佳盐化科技有限公司生产，批号：151224-5；磷酸(分析纯)：由常州市川磷化工有限公司生产，批号：160114-4；无水乙醇(分析纯)：由上海东羿化工有限公司生产，批号：151124-3。
1.1.2 设备
LC-20AT高效液相色谱仪(岛津)；检测器SPD-20，VP-ODSC18柱(4.6mm×150.0mm)，UV-1700分光光度计(岛津)，电子天平，超纯水仪，真空泵，超声清洗器。
1.2 实验方法
1.2.1 海蟑螂提取物的制备
(1)将海蟑螂置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液＝1：1的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
1.2.2 海蟑螂提取物的紫外-可见光谱分析
用移液管吸取海蟑螂样品溶液0.2mL，移入10.00mL的容量瓶中，用体积比为2％盐酸甲醇稀释，用UV-1700进行紫外-可见吸收光谱分析。
1.2.3 样品溶液
准确称取25.00mg的海蟑螂提取物溶于50.00mL的2％盐酸甲醇溶液中，超声15min，将溶液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即得药品溶液。
1.2.4 标准品溶液
将腺苷标准品1.00mg溶于1.00mL 2％盐酸甲醇溶液中，配成1mg/mL的标准品溶液。
1.2.5 标准曲线的绘制
从标准品溶液中吸取一定量，用2％盐酸甲醇稀释成2、10、20、50、100μg/mL标品待测液，用0.22μm滤膜过滤，取5μL上样。以腺苷浓度为纵坐标，峰面积为横坐标进行线性回归分析，绘制标准品的标准曲线：
f(X)＝1.9684×10-5X—0.5671，r＝0.9999。
1.2.6 样品中腺苷含量的计算。
式中，X为腺苷含量；A为样品中腺苷峰面积；C为标准溶液中腺苷的浓度(μg/mL)；V为样品最终定容体积(mL)；As为标准溶液中腺苷峰面积；m为试样质量(g)；f为稀释倍数。
1.2.7 色谱条件
色谱柱：采用C18柱，流动相：体积比为70：20：10的2％磷酸二氢钠-乙腈-甲醇溶液，流速0.5mL/min；柱温35℃；检测波长465nm。
2 结果与分析
2.1 腺苷标准品色谱图
由附图1可知，腺苷保留时间为13.551min。
2.2 海蟑螂提取物中腺苷的色谱图
在附图1的实验条件下测定海蟑螂提取物4个批次产品得到的色谱图。在色谱图中，在13.551min附近均有峰检出，4个批次的保留时间分别为13.756、13.616、13.525、13.509min，平均保留时间为13.551min，与标品的保留时间比较吻合，可以断定此峰为腺苷。将腺苷的峰面积代入标准曲线，通过计算得出海蟑螂提取物中腺苷的平均含量为92.0％。
2.3 回收率实验
分别精密吸取一定量的腺苷标准品溶液，加入到已知量的腺苷浓度的样品中，按测定样品含量的方法操作、测试，测得3个浓度的腺苷的平均回收率为102.34％。
2.4 精密度实验
取同一批次的海蟑螂样品溶液，精密吸取10μL，连续进样5次，测定腺苷的峰面积，结果其峰面积的RSD＝1.02％(n＝5)。
3 结论
结果表明：本发明海蟑螂提取物的主要成分是腺苷，平均含量为94.8％。
实验二：不同提取纯化方法制备海蟑螂提取物提取的纯度与含量的比较研究
1 不同提取纯化方法制备的海蟑螂提取物
1.1 甲方法制备海蟑螂提取物
(1)将干燥海蟑螂1000g，置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物1056.12mg。
1.2 乙方法制备的海蟑螂提取物
将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏水适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液40℃低温减压浓缩，干燥，即得乙方法制备的海蟑螂提取物1229.23。
1.3 丙方法制备的海蟑螂提取物
将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏70％乙醇溶液适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，干燥，即得丙方法制备的海蟑螂提取物1527.11mg。
1.4 丁方法制备的海蟑螂提取物
(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏，干燥，即得丁方法制备的海蟑螂提取物1243.52mg。
2.测定
采用本发明实验一所提供的HPLC法测定海蟑螂提取物中腺苷的含量的方法进行测定。
3.测定结果
测定结果见表1。
表1 不同提取方法提取得到的海蟑螂提取物的质量与腺苷含量
4.结论
由表1实验结果可见，采用甲方法制备海蟑螂提取物(本发明提供的制备方法提取纯化得到的海蟑螂提取物)不仅提取得到得腺苷的质量多，而且提取物的纯度高。
实验三：抗肿瘤作用的药物筛选实验研究
1 材料和方法
1.1 样品
1.1.1 甲药物注射液：
(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液＝1：1的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
(5)取注射用水1000mL，加热至70℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得甲药物注射液。
1.1.2 乙药物注射液：
(1)将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏水适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液40℃低温减压浓缩，得海蟑螂水提取物浓缩液，备用；
(2)取注射用水1000mL，加热至70℃，加入步骤(1)所得海蟑螂水提取物浓缩液，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得乙药物注射液。
1.1.3 丙药物注射液：
(1)将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏70％乙醇溶液适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，得海蟑螂醇提取物浓缩液，备用；
(2)取注射用水1000mL，加热至70℃，加入步骤(1)所得海蟑螂醇提取物浓缩液，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得丙药物注射液。
1.1.4 丁药物注射液：
(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取注射用水1000mL，加热至70℃，加入步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得丁药物注射液。
1.1.3 环磷酰胺注射液，上海华联制药公司生产，批号20160228-5。
1.2 瘤株与实验动物
肉瘤S180、肝癌实体瘤(Heps)和艾氏腹水瘤(EAC)均由中科院上海药物研究所肿瘤研究室提供。昆明种小鼠(体重18～22g，雌雄各半)，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。
1.3 方法
1.3.1 对小鼠S180实体瘤和肝癌实体瘤(Heps)的抑制作用
取带瘤小鼠的实体肿块，无菌条件下制备细胞悬液，浓度为1×107个/mL。
每只小鼠腋窝皮下接种0.2mL，接种24h后将小鼠随机分成6组，每组10只，给药组按500mg·Kg-1的剂量每日尾静脉分别给予甲药物注射液、乙药物注射液、丙药物注射液、丁药物注射液；空白对照组(对照组)注射等量生理盐水，连续10d；环磷酰胺组按10mg·Kg-1剂量每日尾静脉注射一次，共5次。各用药组停药24h后称重，处死动物并剥离瘤块，称取瘤重，用以下公式计算抑瘤率：
1.3.2 对EAC腹水瘤的抑制作用
无菌条件下取接种后6～8d的小鼠腹水，调节细胞浓度为1×107个/mL，每只小鼠腹腔接种0.2mL。24h后小鼠分组、处理及用药同上。停药后观察并记录动物生存天数和死亡时间，计算每组小鼠生命延长率。
2 结果
2.1 对小鼠S180实体瘤和肝癌实体瘤(Heps)的作用
甲药物注射液组注射液后，小鼠的饮食正常，活动自由，皮毛光滑，结果显示，甲药物注射液、乙药物注射液组对小鼠S180实体瘤、肝癌实体瘤具有显著的治疗作用。而丙药物注射液组、丁药物注射液组、环磷酰胺用药组小鼠呈萎靡状态，饮食欠佳、皮毛稀疏、干燥、粗乱、蓬松。甲药物注射液组、乙药物注射液组小鼠瘤重明显低于空白对照组、丙药物注射液组、丁药物注射液组，体重增加明显高于丙药物注射液组、丁药物注射液组、环磷酰胺组。其中，甲药物注射液组的瘤重和抑瘤率显著高于其他各个药物组。实验结果见表2和表3。
表2 对接种S180小鼠的影响
注：与环磷酰胺组比较，**P<0.01；与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与甲药物注射液组比较，△P<0.05；
表3 对接种肝癌实体瘤小鼠的影响
注：与环磷酰胺组比较，**P<0.01；与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与甲药物注射液组比较，△P<0.05；
2.2 对小鼠EAC腹水瘤的抗肿瘤作用
尾静脉注射药物注射液后，各组腹水瘤(EAC)小鼠生活状态均好转，同空白对照组小鼠比较，甲药物注射液组、乙药物注射液组小鼠活动量增加，食量增大，腹部鼓胀减小，皮毛光滑。实验结果显示，甲药物注射液组、乙药物注射液组、环磷酰胺组能显著延长腹水瘤(EAC)小鼠的生存天数，其中，甲药物注射液对生命延长率的效果最好，明显优于乙药物注射液组和环磷酰胺组。丙药物注射液组、丁药物注射液组也能延长腹水瘤(EAC)小鼠的生存天数，但效果并不显著。见表4。
表4 对接种EAC腹水瘤小鼠的影响
注：与环磷酰胺组比较，*P<0.05，**P<0.01；与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与甲药物注射液组比较，△P<0.05；
3 结论
本实验采用静脉注射给药，观察药物注射液对小鼠S180实体瘤、EAC腹水瘤和肝癌实体瘤的抗肿瘤作用。
实验结果表明，甲药物注射液能有效对抗小鼠S180实体瘤，能明显改善小鼠生存质量，其抑瘤率显著高于其他各个药物组。实验显示，甲药物注射液组小鼠生存天数明显高于空白对照组和其他各个药物组，对EAC腹水瘤小鼠具有延长生存时间的作用。对移植性肝癌荷瘤小鼠，用甲药物注射液后生活质量好转且无一死亡，说明海蟑螂提取物注射液能安全有效地抑制小鼠肝癌实体瘤，小鼠生活状况也优于环磷酰胺组和其他各个药物组。
综上，本发明提供的在特定制备方法下制备的海蟑螂提取物注射液(甲药物注射液)是一种非常具有开发前景的抗肿瘤药物。
实验四：本发明注射液安全性实验报告
为探讨本发明注射液的安全性，本研究进行了安全性实验。
1 本发明注射液药物
处方：海蟑螂1000g。
制备方法：(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物1045.24mg；
(5)取注射用水1000mL，加热至70℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得本发明注射液药物。
2 方法
2.1 局部刺激性实验
2.1.1 实验动物
日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0～2.5Kg，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.1.2 实验方法
取健康无损伤的家兔2只，以无菌操作法分别在其左右两腿股四头肌内各注入供试品1.0mL/只，注射后48h处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位局部刺激反应，按表5换算成相应的反应级。
表5 注射肌肉刺激反应评级标准
2.1.3 实验结果
实验结果表明：两只家兔，经肌肉注射后，家兔健康正常，腿部活动正常。家兔处死取出股四头肌后，肉眼观察给药部位，给予本发明注射液的2例股四头肌刺激反应级数各为0级。提示本品对家兔股四头肌无刺激作用。
2.2 血管刺激性实验
2.2.1 实验动物
日本大耳白家兔，雌雄兼用，体重2.0～2.5Kg，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.2.2 实验方法
取健康、两耳无损伤的家兔2只。用无菌操作方法于左耳耳缘静脉注射灭菌生理盐水2.0mL/Kg，于右耳耳缘静脉注射本发明注射液的浓缩液2.0mL/Kg，1次/d，连续3d。于末次注射24h后将动物放血处死，分别距注射部位进针点2cm处向心端剪下耳缘约2cm作为标本，标本用福尔马林固定，常规组织切片，观察血管周围变化、血管壁是否损伤、内皮细胞有无脱落、有无血栓形成以及其他病理变化。
2.2.3 实验结果
实验结果表明：家兔左右耳肉眼观察注射部位均无异常，血管无充血，周围组织无水肿现象。病理切片观察结果表明，给予生理盐水的2例耳缘和给予本发明注射液的2例耳缘均未见血管扩张和炎细胞浸润，提示本品对家兔血管无刺激作用。
2.3 过敏实验
2.3.1 实验动物
健康无伤雄性豚鼠，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.3.2 实验方法
取健康无伤豚鼠6只，体重250～350g，间日腹腔注射供试品0.5mL，连续3次，然后分为两组，每组3只，分别在第1次注射后14d及21d静脉注射本品1mL进行攻击，在注射后15min内观察动物反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者，或有啰音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者为阳性。
2.3.3 实验结果
实验结果表明：本发明注射液于第1次腹腔注射后第10天和第15天进行攻击，均未发生过敏反应，表明在本次实验条件下，本发明注射液对豚鼠无全身性致敏作用结果见表6。
表6 不同时间过敏实验观察结果
“-”表示为阴性结果；“+”表示为阳性结果
2.4 溶血性实验
2.4.1 实验动物
日本大耳白家兔，雄性，体重2.3Kg，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。
2.4.2 实验方法
取健康家兔1只，从颈总动脉取血约10mL，放置于200mL三角瓶中，用玻璃棒搅动血液10min，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液，加约10倍量的生理盐水，摇匀，离心(2000r/min，5min)除去上清液，沉淀的红血球再用生理盐水如下法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。取沉淀的红细胞1mL，加生理盐水50mL，制得2％的兔红细胞混悬液。取试管7支，按表7配比量依次加入2％兔红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，置于37℃恒温水浴箱30min，然后分别加入不同量的上述药液(第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管)，摇匀，置37℃恒温水浴箱中。开始每隔15min观察1次，1h后，每隔1h观察1次，共4次。见表7。
表7 溶血实验配比量表 mL
2.4.4 溶血判定标准
全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留；部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留；无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明；凝集：虽无溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不分散。
2.4.5 实验结果
本发明注射液无溶血和凝集反应结果见表8。
表8 各种时段溶血实验结果
“-”表示无溶血或凝集反应，“+”表示有溶血或凝集反应
3 结论
本发明注射液经动物实验结果表明其安全性好。
实验五：治疗糖尿病肾病大鼠的药效筛选实验研究
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
链脲佐菌素(STZ)由北京诺博莱德科技有限公司生产，批号：20150625-9；尿液检测四联试剂带，由山西亚森实业有限公司生产，批号：050314；考马斯亮蓝试剂(CBB)，由环通生物科学有限公司生产，批号：160315-6；金属代谢笼，由北京天思亿达科技有限公司生产；755型紫外可见分光光度计，由常州市固德仪器有限公司生产，批号：160121；血糖仪，由三诺生物传感股份有限公司生产，批号：20151023-5。
1.2 受试药物
1.2.1 甲药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液＝1：1的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得甲药物。
1.2.2 乙药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏水适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液40℃低温减压浓缩，得海蟑螂水提取物浓缩液，干燥，得乙药物。
1.2.3 丙药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏70％乙醇溶液适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，得海蟑螂醇提取物浓缩液，干燥，得丙药物。
1.2.4 丁药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)将步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E，混均，干燥，得丁药物。
1.3 实验动物
成年雄性Wislar大鼠60只，SPF级，体重200±20g，购自由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。所有动物用高压饲料喂养，随意饮水，摄食，室温控制在25℃左右，自然采光。
1.4 动物模型制作与分组
将60只大鼠随机分为6组，正常组、甲药物治疗组、乙药物治疗组、丙药物治疗组、丁药物治疗组和模型非治疗组，每组10只。模型组大鼠实验前禁食12h(不禁水)。将链脲佐菌素溶于pH 4.2枸橼酸缓冲液中，按50mg/Kg一次性腹腔内注射，每日监测尿糖，3d后动物的血糖浓度大于16.7mmoL/L，尿糖阳性，确定为糖尿病模型形成。各个治疗组分别给予甲药物、乙药物、丙药物、丁药物治疗，剂量均为500mg/Kg，灌胃，每日2次，共治疗4周。糖尿病成模3周后尿蛋白明显增加，糖尿病肾病模型成立。在实验期间大鼠均表现为多饮、多食、多尿、消瘦等症状。正常组给予等体积的枸橼酸缓冲液。
1.5 标本采集与检测
将大鼠放入洗净的金属代谢笼内，于治疗前后收集各组大鼠24h尿标本，留尿期间禁食，不禁水，记录尿量后取4mL，2000r/min离心10min，去除沉渣并于－20℃冰箱保存待测。尿蛋白用考马斯亮蓝法检测。实验结束后，用乙醚麻醉大鼠，摘眼球取血，用于血糖、血肌酐、尿素氮的检测。血糖用血糖仪及血糖试纸检测，肾功能采用Beckman自动生化仪检测。
1.6 肾脏病理学检测
麻醉大鼠取血后，立即取出肾脏，去除包膜，称重，10％福尔马林固定，酒精逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚23μm，做常规HE染色与PAS染色，光镜观察。
1.7 统计学方法
应用SPSS10.0软件处理数据，所有数据以均值标准差表示，组间比较用t检验。
2 结果
2.1 在治疗前后各组大鼠尿蛋白含量的变化
糖尿病模型成立4周后，大鼠尿蛋白增加，经甲药物治疗后，尿蛋白减少，与治疗前相比较，差异有显著意义(P<0.05)。治疗组尿蛋白有增多的趋势，但差异无显著意义(P>0.05)。乙药物治疗组、丙药物治疗组、丁药物治疗组的尿蛋白也有减少，但与治疗前相比较，差异没有显著意义(P>0.05)，见表9。
表9 各组大鼠治疗前后尿蛋白的变化
注：与治疗前比较，*P<0.05；与治疗前比较，#P>0.05。
2.2 治疗后各组大鼠血清、血生化指标以及肾重/体重的变化
模型组血糖明显高于正常组(P<0.01)，但血肌酐、尿素氮差异无明显意义(P>0.05)，治疗组给予甲药物治疗后，肾重/体重指数明显低于非治疗组(P<0.05)，与正常组差异无明显意义(P>0.05)，说明甲药物可以减轻糖尿病肾病大鼠的肾脏肥大；乙药物治疗组、丙药物治疗组、丁药物治疗组的肾重/体重指数也略低于非治疗组，但与非治疗组比较，差异没有显著意义(P>0.05)；见表10。
表10 治疗后血糖、血尿素氮、肌酐以及肾重/体重变化
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。
2.3 甲药物对糖尿病肾病大鼠肾组织形态学的影响
光镜下HE染色可以见到正常组大鼠细胞外基质与系膜细胞分布正常，毛细血管腔开放，见附图2；而非治疗组的细胞外基质增多，系统细胞增生，同时毛细血管部分塌陷，见附图3；甲药物治疗组细胞外基质轻度增多，系膜细胞增生亦减轻，肾小球基底膜增厚减轻，见附图4；乙药物治疗组细胞外基质增多，系膜细胞增生，肾小球基底膜增厚略有减轻，见附图5；丙药物治疗组细胞外基质增多，系膜细胞增生，肾小球基底膜增厚略有减轻，见附图6；丁药物治疗组细胞外基质增多，系膜细胞增生，肾小球基底膜增厚略有减轻，见附图7。说明甲药物在一定程度上可以减轻肾小球肥大，从而对糖尿病肾病有一定的治疗作用。
3 结论
本实验表明，在特定的制备方法在制成的甲药物能够减少糖尿病肾病大鼠的尿蛋白排泄，降低肾重/体重指数，病理资料证实模型治疗组细胞外基质积聚减少，系膜扩张以及系膜细胞增生减轻，说明甲药物对治疗糖尿病肾病肾脏肥大有一定作用。
实验六：对糖尿病脑病大鼠的药效学实验研究
糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的终身性代谢性疾病。长期血糖增高，大血管、微血管受损并危及心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病，常见的有糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变、与糖尿病相关的葡萄膜炎、糖尿病性白内障、糖尿病足、糖尿病脑病、糖尿病心血管并发症、糖尿病性脑血管病、糖尿病神经病变等等。糖尿病死亡者有一半以上是心脑血管所致，10％是肾病变所致。因糖尿病截肢的患者是非糖尿病的10～20倍。临床数据显示，糖尿病发病后10年左右，将有30％～40％的患者至少会发生一种并发症，且并发症一旦产生，药物治疗很难逆转，因此强调尽早预防糖尿病并发症。本发明海蟑螂提取物可以治疗糖尿病肾病，那么预测其对糖尿病脑病也会有一定的治疗效果。发明人对本发明海蟑螂提取物治疗糖尿病脑病进行药效学实验研究，探究其治疗效果。
1 材料和方法
1.1 实验动物及试剂
健康雄性8周龄SD大鼠，体质量200～250g，购自由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。所有动物用高压饲料喂养，随意饮水，摄食，室温控制在25℃左右，自然采光。
水迷宫程序自动控制仪，由安徽正华生物科技专业制造生产，批号：150215；链脲佐菌素(STZ)，由上海伟进生物科技有限公司生产，批号：151214-5；
受试药物(本发明海蟑螂提取物)：(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液＝1：1的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得本发明海蟑螂提取物。
1.2 糖尿病大鼠模型的建立和分组
大鼠适应性饲养1周，禁食12h，以pH为4.5的0.1moL/L枸橼酸钠缓冲液稀释STZ后，避光并快速以60mg/Kg量一次性腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。3d后，造模大鼠隔夜禁食不禁饮8h以上，取大鼠尾静脉血检测空腹血糖值，将空腹血糖>18mmoL/L的大鼠定为糖尿病大鼠，剔除血糖未达标者。
建模成功一周后，将糖尿病大鼠随机分为糖尿病脑病组和本发明海蟑螂提取物治疗组，每组10只；正常大鼠随机分为正常对照组和本发明海蟑螂提取物对照组，每组10只。本发明海蟑螂提取物治疗组、本发明海蟑螂提取物对照组给予本发明海蟑螂提取物500mg/(Kg·d)灌胃，正常对照组给以同等剂量生理盐水灌胃，持续14周。在实验过程中，每周检测各组大鼠体质量和血糖值。
1.3 Morris水迷宫实验
第14周时，采用Morris水迷宫观察大鼠认知功能变化。Morris水迷宫为一直径200cm的圆形水池，内置有一可移动位置的圆形站台(直径15cm)，站台位于水下2cm，水温恒定在(28±2)℃。水迷宫实验一共6d，第1天为水迷宫环境适应期。第2～5天为实验训练期，记录从放入点到站台所用的时间即逃避潜伏期，每次测试时间为120s，若未找到站台将大鼠引至站台并使其停留10～15s以记忆站台位置。第6天为空间搜索实验，撤离站台，每次测试时间为60s，记录每只大鼠在站台所在位置的平台穿越次数及在目的象限内的徘徊时间。
1.4 心脏灌注及标本采集
水迷宫实验结束后，从每组随机抽取1只大鼠，用10％水合氯醒3mL/Kg腹腔注射进行麻醉，固定并剪开胸腔暴露心脏，分离心包膜后，灌注针插入左心室并固定，同时剪开右心房。先用生理盐水快速冲洗，再用4％多聚甲醛进行缓慢灌注。待大鼠体内充分固定后，剪开颅骨，将整个大脑完整移至4％多聚甲醛中浸泡3d等待包埋用于H-E染色。其余的大鼠断头取脑，置于冰上快速分离出海马，放入冻存管储存在-120C用于蛋白质印迹分析。
1.5 H-E染色
将石蜡包埋的组织以冠状位固定后行连续切片，将含有海马组织的切片粘贴到经3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(APES)处理过的载玻片上并置于60～65℃烤箱中烤片30～60min。切片脱蜡至水，苏木精溶液浸染，冲洗多余染液，而后用梯度乙醇脱水，最后封片。光学显微镜下观察大鼠海马组织CA1区神经元形态及其病理改变。
1.6 统计学处理
所有数值采用SPSS10.0软件进行统计分析，数据用(形式表示，运用多因素及单因素方差分析比较组间差异。检验水准(a)为0.05。
2 结果
2.1 各组大鼠的一般情况
糖尿病大鼠出现明显的多饮、多尿、多食症状，大鼠毛色灰黄，精神萎靡，鼠尾出现不同程度的溃烂以及断尾现象。实验2个月时，糖尿病大鼠因感染出现腹泻和皮下脓肿，经抗生素腹腔注射治疗后，感染症状得以控制。糖尿病大鼠行动迟缓，自主行动减少，出现易激惹或对外界刺激反应淡漠等行为表现。实验期间，糖尿病大鼠血糖值保持在(28±3)mmoL/L，同时正常大鼠血糖值保持在(7±4)mmoL/L。
2.2 水迷宫实验结果
大鼠血糖值持续升高3个月以后，在水迷宫实验训练期间，糖尿病脑病组和本发明海蟑螂提取物治疗组逃避潜伏期较正常对照组明显增加(P<0.01)，实验结果见表11。
水迷宫正式实验期间，糖尿病脑病组和本发明海蟑螂提取物治疗组平台穿越次数和在目的象限内的徘徊时间均较正常对照组明显减少(P<0.01)，实验结果见表12。
表11 各组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期的比较
注：与正常对照比较，**P<0.01；
表12 各组大鼠水迷宫空间搜索实验平台穿越次数和目的象限徘徊时间(n＝6，)
注：与正常对照比较，**P<0.01；
3 结论
本实验研究发现，本发明海蟑螂提取物连续给药14周后观察到本发明海蟑螂提取物治疗组大鼠认知功能障碍没有得到明显改善，表明本发明海蟑螂提取物对糖尿病大鼠都大脑没有明显的保护作用，不能有效治疗糖尿病脑病。
实验七：治疗抑郁症的药物筛选实验研究
1 材料
1.1 药物
1.2 受试药物
1.2.1 甲药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：8，上样体积7BV，水洗5BV除杂，以乙酸乙酯：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液＝1：1的洗脱剂8BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得甲药物。
1.2.2 乙药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏水适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液40℃低温减压浓缩，得海蟑螂水提取物浓缩液，干燥，得乙药物。
1.2.3 丙药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g研碎，粉末加蒸馏70％乙醇溶液适量，于37℃水浴中温浸24h，过滤，残渣加蒸馏水再温浸24h，合并两次温浸液，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，得海蟑螂醇提取物浓缩液，干燥，得丙药物。
1.2.4 丁药物：
(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内40℃烘干4h后，取干燥的海蟑螂，采用气流粉碎机进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为1100kPa，进料速度为210r·min-1，分级频率为25Hz，粉碎时间为35min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入50倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度3600r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.3％氯化钠、0.4％胃蛋白酶、0.4％胰蛋白酶及0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，提取温度45℃，超声波频率50kHz，按1g：12mL的料液比，加入浓度为65％的乙醇作为提取液，每次提取20min，共提取三次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)将步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E，混均，干燥，得丁药物。
1.2.5 阳性对照药：盐酸氟西汀胶囊，由常州华生制药有限公司生产，国药准字H19980138，规格：20mg。
1.2 动物
ICR雄性小鼠，体重18～22g，购自由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005。
实验动物均预先饲养24小时，适应实验室饲养条件。所有动物用高压饲料喂养，随意饮水，摄食，室温控制在25℃左右，自然采光。
1.3 仪器
Medlab生物信号采集系统，由创博环球(北京)生物科技有限公司生产；JZ100型100g张力换能器，由上海益联医学仪器发展有限公司生产；数码摄像机，由日本佳能(Canon)公司生产；MC-145电子体温计，欧姆龙(大连)有限公司。
2 方法
2.1 小鼠悬尾实验
正常小鼠随机区组法分为6组，即空白对照组、阳性药盐酸氟西汀组(给予盐酸氟西汀3.5mg·kg-1、甲药物组(给予甲药物500mg·kg-1)、乙药物组(给予乙药物500mg·kg-1)、丙药物组(给予丙药物500mg·kg-1)、丁药物组(给予丁药物500mg·kg-1)。各组均按0.2mL·(10g)-1体重灌胃给药。每日1次，连续给药7d，空白对照组给去离子水。于末次给药后1h进行实验。将小鼠尾端(在距尾尖2cm处)用胶布固定在100g张力换能器的连线上，使其呈倒悬状态，头部离实验台约15cm，换能器连接到Medlab生物信号采集系统，适应2min后，记录4min之内的不动时间(s)。
2.2 小鼠强迫游泳实验
动物分组及给药方式、剂量、时间同2.1，于末次给药后1h进行实验。将小鼠单个放入高20cm，直径18cm，水深10cm，水温(23±2)℃的水缸中，观察6min，适应2min，记录后4min内累计不动时间(s)。
2.3 小鼠利血平拮抗实验
体温下降的观测正常小鼠随机区组法分为7组，即空白对照组、模型组、盐酸氟西汀组(3.5mg·kg-1)、甲药物组(500mg·kg-1)、乙药物组(500mg·kg-1)、丙药物组(500mg·kg-1)、丁药物组(500mg·kg-1)。组均按0.2mL·(10g)-1体重灌胃给药。每日1次，连续给药7d，空白对照组灌胃给去离子水。于末次给药后1h，按1.6mg·kg-1剂量腹腔注射利血平，2h后测小鼠肛温(将电子体温计探头插入小鼠肛门内约1.5cm处)。
2.4 统计学处理
实验结果均采用均数±标准差表示，使用SPSS10.0软件中的方差分析(ANOVA)进行检验，P<0.05表示差异有显著性。
3 结果
3.1 对小鼠悬尾不动时间的影响
实验结果表明，甲药物组能明显缩短小鼠悬尾不动时间，与空白组比较差异显著(P<0.05)。见表13。
表13 对小鼠悬尾不动时间的影响(n＝20)
注：与空白组比较*P<0.05。
3.2 对小鼠强迫游泳不动时间的影响
实验结果表明，甲药物组能明显缩短小鼠强迫游泳不动时间，与空白组比较差异显著(P<0.05)。见表14。
表14 对小鼠强迫游泳不动时间的影响(n＝20)
注：与空白组比较*P<0.05。
3.3 对利血平所致小鼠体温下降的影响
实验结果表明，甲药物组能显著对抗利血平所致小鼠体温下降，与模型组比较差异显著(P<0.05)。见表15。
表15 对利血平所致小鼠体温下降的影响(n＝20)
注：与空白组比较*P<0.05。
4 结论
在特定制备方法下制备的甲药物具有明显的抗抑郁作用，而乙药物、丙药物、丁药物的疗效则不明显，说明甲药物各个工艺步骤的组合，产生了令人预想不到的有益效果。
附图说明：
图1：腺苷标准品色谱图
图2为正常大鼠肾脏病理切片
图3为糖尿病肾病大鼠模型组12周病理切片
图4为糖尿病肾病大鼠甲药物治疗组12周病理切片
图5为糖尿病肾病大鼠乙药物治疗组12周病理切片
图6为糖尿病肾病大鼠丙药物治疗组12周病理切片
图7为糖尿病肾病大鼠丁药物治疗组12周病理切片
具体实施方式：
实施例1：海蟑螂提取物及其制备方法与检测方法
1、海蟑螂提取物及其制备
处方：海蟑螂1000g。
制备方法：(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物1043.84mg。
2、海蟑螂提取物的含量测定
采用高效液相色谱法测定海蟑螂提取物中的海蟑螂提取物含量：
(1)色谱条件：色谱柱：采用C18柱，流动相：体积比为70：20：10的2％磷酸二氢钠-乙腈-甲醇溶液，流速0.5mL/min；柱温35℃；检测波长465nm；
(2)样品溶液制备：准确称取25.00mg的海蟑螂提取物溶于25.00mL的2％盐酸甲醇溶液中，超声20min，将溶液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即得样品溶液；
(3)标准品溶液制备：将腺苷标准品1.00mg溶于1.00mL2％盐酸甲醇溶液中，配成1mg/mL的标准品溶液；
(4)测定：精密吸取样品溶液、标准品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，进行测定；
(5)测定结果：海蟑螂提取物含腺苷1005.82g。
实施例2：海蟑螂提取物注射液及其制备
处方：海蟑螂1000g。
制备方法：(1)将干燥海蟑螂1000g置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物1048.16mg；
(5)取注射用水1000mL，加热至70℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得本发明注射液药物。
稳定性试验考察：
根据《中国药典》2010年版二部附录XIX C稳定性试验指导原则，对最优组合的实施例1制得样品进行稳定性试验考察：
加速试验：将海蟑螂提取物注射液样品，置于温度40℃、相对湿度75％的恒温恒湿箱中，放置6个月，分别于第1、2、3、6个月时取样，按照稳定性考察项目进行检测，并与0月的数据进行比较。
长期试验：将海蟑螂提取物注射液样品置于温度25℃、相对湿度60％的条件下放置，分别于第3、6、12、18个月时取样，按照考察项目进行检测，并与0月的数据进行比较。稳定性试验结果见表16。
表16 实施例2注射液稳定性考察试验结果
由上表数据可见，本发明海蟑螂提取物注射液加速试验6月与长期试验18月后，各项质量均符合规定，本发明技术方案制备的注射液质量稳定可控。

Claims (10)

1.一种海蟑螂提取物，其特征在于，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内25℃～35℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为700～900kPa，进料速度为170～190r·min-1，分级频率为35～45Hz，粉碎时间为15～25min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入25～35倍量的仿生提取溶媒，35～40℃水浴加热，搅拌提取0.5～2h，离心10～30min，离心速度2700～2900r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.1％～0.3％氯化钠、0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶及0.01mol·L-1～0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度25～35kV/cm，脉冲数35～45，温度30～40℃，料液比为1g：30～40mL，加入浓度为80～90％的乙醇作为提取液，提取40～50min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：10～12，上样体积10BV～12BV，水洗8BV～10BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：4～6的洗脱剂10BV～14BV洗脱，流速为2BV/h～4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
2.如权利要求1所述的海蟑螂提取物，其特征在于，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
3.一种海蟑螂提取物的检测方法，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
其特征在于，采用高效液相色谱法测定海蟑螂提取物中的腺苷含量：
(1)色谱条件：色谱柱：采用C18柱，流动相：体积比为70：20：10的2％磷酸二氢钠-乙腈-甲醇溶液，流速0.5mL/min；柱温35℃；检测波长465nm；
(2)样品溶液制备：准确称取25.00mg的海蟑螂提取物溶于50.00mL的2％盐酸甲醇溶液中，超声15min，将溶液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即得样品溶液；
(3)标准品溶液制备：将腺苷标准品1.00mg溶于1.00mL 2％盐酸甲醇溶液中，配成1mg/mL的标准品溶液；
(4)测定：精密吸取样品溶液、标准品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，进行测定。
4.如权利要求1～2任意一项所述的海蟑螂提取物，其特征在于，该海蟑螂提取物采用药学中常规的制药方法制备成注射剂。
5.如权利要求4所述的海蟑螂提取物注射剂，其特征在于，该海蟑螂提取物注射剂的制备方法为：
(1)将海蟑螂置烘箱内25℃～35℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为700～900kPa，进料速度为170～190r·min-1，分级频率为35～45Hz，粉碎时间为15～25min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入25～35倍量的仿生提取溶媒，35～40℃水浴加热，搅拌提取0.5～2h，离心10～30min，离心速度2700～2900r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.1％～0.3％氯化钠、0.2％～0.4％胃蛋白酶、0.2％～0.4％胰蛋白酶及0.01mol·L-1～0.03mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度25～35kV/cm，脉冲数35～45，温度30～40℃，料液比为1g：30～40mL，加入浓度为80～90％的乙醇作为提取液，提取40～50min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：10～12，上样体积10BV～12BV，水洗8BV～10BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：4～6的洗脱剂10BV～14BV洗脱，流速为2BV/h～4BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
(5)取注射用水，加热至60～80℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏36～60小时，滤过，取滤液，调pH为6～7，加入活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得海蟑螂提取物注射液。
6.如权利要求5所述的海蟑螂提取物注射剂，其特征在于，该海蟑螂提取物注射剂的制备方法为：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
(5)取注射用水，加热至70℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得海蟑螂提取物注射液。
7.一种海蟑螂提取物注射剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，该海蟑螂提取物注射剂是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
(5)取注射用水，加热至70℃，加入步骤(4)所得海蟑螂提取物，溶解，冷藏48小时，滤过，取滤液，调pH为6.5，加入0.5％的活性炭，充分搅拌，吸附后，滤过，取滤液，冷至室温，超滤，分装、灌封、灭菌、灯检，即得海蟑螂提取物注射液。
8.一种海蟑螂提取物在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用，其特征在于，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
9.一种海蟑螂提取物在制备治疗糖尿病脑病药物中的应用，其特征在于，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
10.一种海蟑螂提取物在制备治疗抑郁症药物中的应用，其特征在于，该海蟑螂提取物是采用如下方法制备的：
(1)将海蟑螂置烘箱内30℃烘干，采用气流粉碎机对干燥的海蟑螂进行超微粉碎，气流粉碎机的气流压力为800kPa，进料速度为180r·min-1，分级频率为30Hz，粉碎时间为20min，得海蟑螂超微粉A；
(2)取步骤(1)所得海蟑螂超微粉A，加入30倍量的仿生提取溶媒，37℃水浴加热，搅拌提取1h，离心20min，离心速度2800r/min，分别收集上清液B和沉淀C；上清液B浓缩，得浸膏D，备用，沉淀C备用；上述仿生提取溶媒是由0.2％氯化钠、0.3％胃蛋白酶、0.3％胰蛋白酶及0.02mol·L-1盐酸配制成溶液；
(3)取步骤(2)所得沉淀C，进行高压脉冲电场提取，工艺条件为电场强度30kV/cm，脉冲数40，温度35℃，料液比为1g：35mL，加入浓度为85％的乙醇作为提取液，提取45min，提取液滤过，滤液回收乙醇，得浸膏E，备用；
(4)取步骤(2)所得浸膏D和步骤(3)所得浸膏E合并，混匀，进行柱层析分离；选用D101B型大孔吸附树脂进行柱层析分离，树脂柱径高比为1：11，上样体积11BV，水洗9BV除杂，以苯二甲酸二丁酯：0.2mol/L磷酸溶液＝1：5的洗脱剂12BV洗脱，流速为3BV/h，收集洗脱液，洗脱液浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物。
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