CN104693121A - 一类具有抗老年痴呆活性的吡唑类化合物、制备方法与应用 - Google Patents

一类具有抗老年痴呆活性的吡唑类化合物、制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体公开了一类具有抗老年痴呆活性的吡唑类化合物、制备方法与应用。本发明通过化学修饰中药粗提物再分离，得到4种新结构的化合物。这4种化合物对Aβ42蛋白聚集均显示良好的抑制作用，且毒副作用低，因此，这4种化合物在制备防治抗老年痴呆的药物中具有很大的应用前景。

Description

一类具有抗老年痴呆活性的吡唑类化合物、制备方法与应用
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体地，涉及一类具有抗老年痴呆活性的吡唑类化合物、制备方法与应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer's disease,AD)是以进行性记忆和认知功能退化为特征的一种神经退行性疾病。随着世界人口趋向老龄化，该病的发病率越来越多。据报道，2009年全球已有1700万阿尔茨海默病病人，如果没有有效的治疗或预防措施，这一数量到2050年将达到7000万。然而到目前为止，AD的发病病因和机制尚未完全阐明，研究认为AD的发生是由于遗传、代谢和环境等因素综合作用所致，目前得到普遍接受的发病机制是β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)学说，该学说的核心是Aβ在脑内聚集，会形成老年斑，从而进一步引起一系列病理症状的产生，Aβ是形成老年痴呆症的主要原因。Aβ是一个聚集性很高的多肽，在正常状态下，Aβ可稳定地被分解、去除，仅以可溶性状态微量存在于脑组织中。1994年，从AD病人大脑皮层提取的水溶性片段被命名为水溶性的Aβ。在早期的生理状态中，Aβ聚集物也是一种可溶性的Aβ。水溶性的Aβ存在于正常人的脑脊液和血浆中，但是在正常的脑中却难以检测到，表明存在着一种快速降解Aβ的机制，这种降解机制一旦被破坏，就会进一步的聚集，导致AD的发生。正常人体内也存在浓度非常低的Aβ，但它们在脑内沉积需要很长的时间，并且脑内有抑制Aβ聚集的因子，如卟啉、谷氨酰胺合成酶、载脂蛋白等。在AD患者脑中，由于某种原因Aβ代谢平衡被破坏，即变成高度不溶性的Aβ沉着在细胞间，与变性的神经突起、反应性神经胶质细胞一起形成老年斑。而AD患者由于Aβ浓度升高或抑制Aβ聚集的物质缺乏等原因，Aβ聚集沉积，导致神经元坏死缺失、激活补体、使胶质细胞活性增加、细胞的骨架蛋白tau蛋白过度磷酸化等，最终引起痴呆。
目前临床上使用的药物只能用于缓解AD症状，并不能从根本上改善疾病状态和终止疾病进程。严重影响患者的工作能力和生活质量，也为家庭和社会带来沉重的负担。故研究和开发新的治疗药物有重要的临床和社会意义。而天然产物中多酚类化合物已被报道具有抗老年痴呆的活性。黄酮因为其具有的抗纤维化和细胞保护等特点而成为这一类化合物的代表。然而，它们在脑中的吸收和生物利用度低又使得其在制备抗AD药物中具有一定限制。因此，改造该类化合物可以作为发现抗AD先导化合物的一种方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中缺乏从根本上改善老年痴呆症的药物的缺陷，提供一类吡唑类化合物。
本发明的另一个目的是提供一类吡唑类化合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一类吡唑类化合物在制备抗老年痴呆的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明的另一目的提供所述的吡唑类化合物的制备方法。
一类吡唑类化合物，具有如下式(Ⅰ)所示结构：
其中，R1、R5、R7、R8、R9为H；R2为H、OH或OCH3；R3、R6、R10为OH；R4为H或OCH3。
本发明通过研究发现，不是所有具有与式(Ⅰ)所述吡唑化合物相同母核的化合物都具有抗老年痴呆的作用，而且，母核上相同位置上取代基的不同，很大程度上决定了其活性的不同。优选地，本发明发现结构式如式(Ⅱ)至(Ⅳ)所示的化合物的抗老年痴呆效果最好。
式(Ⅰ)所示吡唑类化合物的制备方法，具体为：先从野菊花的丙酮提取物中富集黄酮得黄酮粗提物，再将黄酮粗提物溶解于有机溶剂中，加入氨解试剂，控制反应温度，反应一定时间，反应结束后处理并分离反应液得到吡唑类化合物。
优选地，所述有机溶剂为乙醇。
优选地，所述氨解试剂为水合肼。
优选地，所述反应温度为70～120℃；更优选地，所述反应温度为85℃。
优选地，所述反应时间为8～20小时；更优选地，所述反应时间为14小时。
作为优选实施方式，式(Ⅰ)所示吡唑类化合物的制备方法，具体为：将野菊花根茎，晒干，粉碎，用80％丙酮室温浸提三次，每次一天，合并浓缩液，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部分，乙酸乙酯部分先过大孔树脂(D101)，以乙醇/水梯度洗脱，收集40～70％乙醇/水馏分，浓缩。浓缩液经过凝胶，以甲醇/水70％洗脱，得到黄酮粗提物。将黄酮粗提物以2％wt/vol的比例用乙醇溶解，按1％wt/vol加入80％水合肼，搅拌，加热回流，反应14小时后停止。将反应物经过硅胶柱，制备液相等反复分离得到各吡唑化合物。
所述的乙醇/水体系中的乙醇和水的体积比为：0:100、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20:、95:5、100:0。
如上式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述吡唑类化合物在制备抗老年痴呆药物中的应用。
如上式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述吡唑类化合物在制备Aβ42蛋白聚集抑制剂中的应用。
一种治疗老年痴呆的药物，含有有效量如上式(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所示的吡唑类化合物中的一种或多种，和/或药学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将中草药的黄酮提取物经过特定方法的修饰处理后，分离得到4种新结构的吡唑类化合物，这4种新结构吡唑类化合物具有显著抑制Aβ42聚集的作用，4种新结构吡唑类化合物的细胞毒性小，安全有效。
附图说明
图1为化合物1-4及阳性对照药姜黄素对Aβ42聚集抑制活性的数据。
图2为10μM下化合物1、3、4及阳性对照药姜黄素的细胞存活率数据。
图3为不同浓度化合物3细胞存活率数据。
图4为不同浓度化合物4作用下细胞存活率数据。
图5为不同浓度化合物3对β-淀粉粒蛋白诱导细胞毒性的保护作用。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明，但是实施例并不能对本发明的保护范围做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
实施例1
从野菊花(Chrysanthemum indicum L)中制备式(Ⅰ)所示化合物的方法：
野菊花(Chrysanthemum indicum L)全株(3.9Kg)，晒干，粉碎，用80％丙酮室温浸提3次，每次1天，合并浓缩液，得粗提物(300g)，分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯层(120g)直接经大孔树脂(D101)，用乙醇/水(0:100、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、95:5，V/V)梯度洗脱，收集40～70％乙醇/水馏分，浓缩。浓缩液经过凝胶，以甲醇/水70％洗脱，得到黄酮粗提物。将黄酮粗提物以2％wt/vol的比例用乙醇溶解，按1％wt/vol加入80％水合肼，搅拌，加热回流，反应14h后停止。将反应物经过硅胶柱，制备液相等反复分离得到4个吡唑类化合物。
化合物1(新化合物)：
化合物1:棕色无定型粉末；UV(MeOH)λmax(logε):218(4.25),263(4.19)nm；IR(KBr)υmax3311,1703,1595,1511,1465,1364,1265,1117,1011,961,813,787,736cm-1；1H NMR(acetone-d6,400MHz)data and13C NMR(acetone-d6,100MHz),see Table1；HREIMS m/z298.0948.
化合物2(新化合物)：
化合物2:棕色无定型粉末；UV(MeOH)λmax(logε):213(4.05)，262(4.11)；IR(KBr)υmax3293,1705,1619,1507,1454,1367,1226,1010,971,814,735,531cm-1；1H NMR(acetone-d6,400MHz)data and13C NMR(acetone-d6,100MHz),seeTable1；HREIMS m/z268.0842.
化合物3(新化合物)：
化合物3:棕色无定型粉末；UV(MeOH)λmax(logε):220(4.12),261(4.10)；IR(KBr)υmax3403,1703,1626,1517,1461,1366,1231,1119,1015,962,812,736cm-1；1H NMR(acetone-d6,400MHz)data and13C NMR(acetone-d6,100MHz),seeTable1；HREIMS m/z284.0792.
化合物4(新化合物)：
化合物4:棕色无定型粉末；UV(MeOH)λmax(logε):224(4.30),276(4.25)nm；IR(KBr)υmax3853,3743,1694,1648,1516,1463,1098cm-1；1H NMR(acetone-d6,400MHz)data and13C NMR(acetone-d6,100MHz),see Table1；HRESIMS m/z329.1132[M+H]+(calcd for C17H16O5N2,329.1148).
其中化合物1-4的氢谱和碳谱如表1所示。
表1.化合物1-4的氢谱和碳谱数据
实施例2 实施例1所得的4个化合物的药效相关实验
本发明化合物1-4对Aβ42聚集抑制活性测定。
(1)药物干预：将储存于1％的氨水中的Aβ42蛋白(440μM)，用PBS稀释成浓度100μM，化合物1-4用DMSO溶解后用PBS配成不同浓度(50，25，10，5，1μM)。取10μL Aβ42蛋白与等体积的不同浓度的1-4混匀置于37℃培养箱共孵育48h。
(2)测试方法：孵育完成后，将样品加入到96孔板中，同时加入含有5μMThT(硫磺素T)的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(50mM,pH8.5)至200μL。每个浓度设3个平行复孔，并设不经化合物处理的对照组进行比较。用Therme多功能酶标仪测试样品在450nm和485nm下的吸收值。
(3)结果处理。按照公式：Aβ42聚集相对抑制数＝1-实验组荧光值/对照组荧光值。计算各化合物在不同浓度下的Aβ42聚集相对抑制数。以Aβ42聚集相对抑制数为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制各化合物对Aβ42聚集的抑制曲线图，并计算各药物的半数抑制剂量(IC50)以评价各化合物对Aβ42聚集相对抑制活性。结果见图1和表2所示；以上结果表明化合物1-4能有效抑制Aβ42聚集。
表2化合物1-4及阳性对照药姜黄素对抑制Aβ42聚集活性
实施例3本发明化合物1、3、4对宿主毒性测试
(1)细胞培养：体外培养SH-SY5Y细胞，使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
(2)测试方法：将传代后的细胞以1x105细胞/每孔的密度铺于96孔板中，孵育24h后分别加入10μM的化合物1、3、4，对照组只加细胞和培养基，空白组只加培养基。继续孵育48h后每孔加入10μL MTT(5mg/mL)再孵育。4h后取出，将孔液吸出后每孔加入100μL DMSO，摇匀后，用Therme多功能酶标仪测试样品在450nm和492nm下的吸收值，结果见图2，说明化合物1，3和4在浓度为10μM对神经细胞无毒性。
实施例4本发明中化合物3对SH-SY5Y细胞的神经保护作用测试
(1)细胞培养：体外培养SH-SY5Y细胞，使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5％二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和传代。
(2)药物干预：使用10mM的PBS将化合物3稀释成不同浓度(80,40,20,10,5μM)，将等体积不同浓度的样品与50μL20μM的Aβ42混匀于37℃共孵育48h，然后将混合物加96孔板内已生长24h的细胞中，共同孵育24h。每个浓度设三个复孔，对照组加入混匀的等体积培养基与50μL20μM的Aβ42，空白组只加培养基。
(3)测试方法：孵育完成后取出96孔板，每孔加入10μL MTT(5mg/ml)再孵育。4h后取出，将孔液吸出后每孔加入100μL DMSO，摇匀后，用Therme多功能酶标仪测试样品在450nm和485nm下的吸收值。
(4)结果处理。按照公式：化合物减弱蛋白对细胞损伤值＝1-实验组荧光值/对照组荧光值。计算各化合物在不同浓度下减弱因Aβ42造成的细胞损伤活性。以此衡量化合物对神经细胞的保护活性，结果见图5。说明化合物3对β-淀粉粒蛋白诱导的神经细胞毒性具有保护作用。

Claims (10)

1.一类吡唑化合物，其特征在于，具有式（Ⅰ）所示结构：
其中，R1、R5、R7、R8、R9为H；R2为H、OH或OCH3；R3、R6、R10为OH；R4为H或OCH3。
2.根据权利要求1所述的吡唑化合物，其特征在于，所述吡唑化合物的结构式如式（Ⅱ）至（Ⅳ）所示：
。
3.权利要求1或2所述吡唑类化合物的制备方法，其特征在于，先从野菊花的丙酮提取物中富集黄酮得黄酮粗提物，再将黄酮粗提物溶解于有机溶剂中，加入氨解试剂，控制反应温度，反应一定时间，反应结束后处理并分离反应液得到吡唑类化合物。
4.根据权利要求3所述吡唑类化合物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。
5.根据权利要求3所述吡唑类化合物的制备方法，其特征在于，所述氨解试剂为水合肼。
6.根据权利要求3所述吡唑类化合物的制备方法，其特征在于，所述反应温度为70~120℃。
7.根据权利要求3所述吡唑类化合物的制备方法，其特征在于，所述反应时间为8~20小时。
8.权利要求1或2所述吡唑类化合物在制备抗老年痴呆药物中的应用。
9.权利要求1或2所述吡唑类化合物在制备Aβ42蛋白聚集抑制剂中的应用。
10.一种治疗老年痴呆的药物，其特征在于，含有有效量权利要求1或2所示的吡唑类化合物中的一种或多种，和/或药学上可接受的载体。
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