CN102056903A - 抑制与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病中涉及的蛋白聚集的新药 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由式(E)表示的化合物。本发明还涉及由式(E)表示的化合物用于治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病。而且，本发明涉及包含本发明化合物的药物组合物和诊断组合物以及涉及药盒。此外，本发明涉及成像聚集蛋白的沉着物的方法。还公开了用于制备可检测地标记的本发明的化合物的药盒。式(E)，其中X、Y和L独立地不定向地选自-C(R¹)(R²)-、-C(R³)＝、-N(R⁴)-、-N＝、-N⁺(R⁵)＝、-O-和-S-；M和Z独立地不定向地选自式(I)和式(II)。

Description

抑制与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病中涉及的蛋白聚集的新药

发明概述

本发明涉及由式(E)表示的化合物。本发明还涉及由式(E)表示的化合物用于治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病。而且，本发明涉及包含本发明的化合物的药物组合物和诊断组合物以及涉及药盒。此外，本发明涉及成像聚集蛋白的沉着物的方法。还公开了用于制备可检测地标记的本发明的化合物的药盒。

贯穿本说明书全文引用了几篇文献。本文引用的文献的公开内容(包括任何制造商的说明，说明书等)通过引用并入本文。

发明背景

M.Ono等(Bioorganic & Medicinal Chemistry 16(2008)6867-6872)描述了某些基于3，5-二苯基-1，2，4-噁二唑的β淀粉样蛋白探针。

US 2007/0276034公开了某些双-和三-二羟基芳基化合物以及它们的亚甲基二氧基类似物和药学上可接受的酯，据说其适合治疗共核蛋白病(synucleinopathies)。

WO 2008/131148描述了特定的二苯基-杂芳基衍生物和它们用于结合和成像淀粉样蛋白斑的用途。

WO 2004/072050中公开了用作NURR-1活化剂的杂环化合物。

在WO 2007/002540中放射标记的乙二醇或聚乙二醇被用作标记用于成像组织的化合物上的基团。

WO 98/17652描述了某些噁二唑衍生物，其被说明适合治疗神经变性病症和大脑局部缺血。

大量的神经学疾病和神经变性疾病是已知的，其中许多目前是不能治愈的。这些疾病包括医学疾患如帕金森病、亨廷顿舞蹈病、哈斯二氏病(Hallervorden-Spatz disease)、阿尔茨海默病、老年痴呆、克洛伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)、动脉粥样硬化痴呆、大脑血栓闭塞性脉管炎(thrombangitis obliterans)、路易体痴呆(DLB)、多系统萎缩(MSA)和许多其它疾病。

朊病毒病，其包括疾病如克罗茨费尔特-雅各布病(CJD)、瘙痒病和牛海绵样脑病(BSE)，在病理上以脑的海绵状退化为特征。朊病毒病由非传统的感染剂引起，其主要由膜糖蛋白PrPC的错折叠的、聚集的(aggregated)、富含β折叠的PrPSc亚型组成。

朊病毒病已经引起关于起因于BSE出现的公共健康的主要关注。科学证据表明BSE已经被传递到人引起克洛伊茨费尔特-雅各布病的新的变型(vCJD)(Will等1996，Bruce等1997)。未知的是：现在多少人正潜伏该疾病且将在未来被vCJD感染。可获得的证据不排除感染大量患者的即将来临的流行(Andrews等，2000)。除了实施预防疾病进一步传播的措施，这增加了开发有效的治疗剂的需要。另外，最近的证据表明通过输血的继发性传播可能发生(LLewelyn等，2004)。

朊病毒病的发病中的中心事件是细胞朊病毒蛋白PrPC向病理性PrPSc亚型的转化，病理性PrPSc亚型聚集成大的蛋白聚集体。这一PrPSc聚集体的形成是朊病毒病的发病标志。可获得的证据表明PrPSc不仅担任这一转化的模板而且担任引起神经功能障碍和细胞死亡的神经毒剂(Prusiner1998，Giese和Kretzschmar 2001)。因此，对于朊病毒病最有前景的治疗方法是干扰PrPSc扩增。来自细胞培养物和体内研究的证据表明在抑制形成PrPSc之后，PrPSc的清除可以发生(Mallucci 2003)。因此，这一治疗策略在潜伏期晚期和甚至在显示疾病的临床征兆之后也可以是有效的，这对于用于解决人朊病毒病是必需的。

存在多个已经被显示在体外干扰PrPSc扩增中有效的化合物，如吖啶衍生物、刚果红、卟啉/酞菁、Cp-60、β-折叠裂解肽和PrP的变体(Caughey等1998，Chabry等1998，Demaimay等2000，Horiuchi等2000，Perrier等2000，Rudyk等2000，Soto等2000)。然而，这些化合物迄今都未成功地用于疾病治疗或用作开发具有提高的治疗效价和药理性质的化合物的先导化合物。

迄今鉴定为潜在治疗剂的物质主要通过偶然发现。迄今已经为潜在的抗朊病毒药物建立了适合大的化合物库的高通量筛选的几个体外测定。对于系统筛选的两种不同方法已经在最近公开的研究中提出：一种是基于酵母的(Bach等2003)且另一种使用感染的ScN2a细胞培养物(Kocisko等2004，Kocisko等2003)。然而，这些方法分别允许限于2500种和2000种化合物的库的筛选，且结果是耗时的。

除了低分子量物质，目前测试了进一步的潜在的三个方法。首先，对抗PrP的抗体被用于抑制PrPSc的形成。这一方法已经成功地用于细胞培养物以及用于腹腔内注射的小鼠(Enari等，2001；White等，2003)。另一方法是CpG寡核苷酸的应用，其被发现在瘙痒病感染的小鼠中增长潜伏期(Sethi等2002)。然而，这一方法的作用机制迄今尚未阐明。最后，通过siRNA抑制感染的动物或人的神经元中PrPC的表达处于讨论中。这一方法已经显示在细胞培养物中抑制PrPSc的形成(Daude等2003)。三种方法全部面临相同的问题，即分子通过血脑屏障的通道。由于这一障碍，这些方法仅适合外周器官中的暴露后预防但不适合在中枢神经中治疗疾病。

另一类的神经变性疾病，所谓的共核蛋白病以细胞内蛋白聚集体、寡聚体、初原纤维和原纤维的积累为特征，所述初原纤维和原纤维主要包含α-共核蛋白。在共核蛋白病的情况下，据认为对神经细胞的病理效果由形成α-共核蛋白的寡聚聚集体和随后形成膜孔诱导。共核蛋白病的实例是帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩症(MSA)。迄今，对于抑制α-共核蛋白的聚集没有治疗策略是可获得的。

因此，存在对鉴定适合治疗与聚集蛋白有关的疾病如朊病毒病和共核蛋白病的新的化合物的需要。

因此，本发明的潜在的技术问题是提供治疗以聚集蛋白为特征的朊病毒病、共核蛋白病和其它疾病尤其是帕金森病的化合物。此外，存在提供在上面提到的病症中用于成像聚集蛋白的沉着物的合适的探针的化合物的需要。

附图说明

图1：通过2D-SIFT和在细胞培养物中筛选的为DIVERSet 1和2产生的SAR-地图。地图显示结构上相似的化合物聚类(由星形或方框表示)，其建自DIVERSet 1和2的初步细胞培养物筛选的837个击中化合物。依次排列聚类使得相似的聚类相互靠近。表示聚类的符号分别根据它们的大小和SIFT-活性物和细胞培养物活性物的比例被确定比例、形状和颜色，如图例中说明。因此较大的聚类，包括大比例的SIFT和细胞培养物活性物，用大的红色星形表示。五个聚类，命名为DPP_1到DPP_5被选择且显示了代表这些聚类的原型化合物。

图2：分类到鉴定的聚类(图1)的所有化合物与它们在各种测定中的活性在图A至F中显示。它们都属于3，5-二苯基-吡唑(DPP)衍生物的化合物类(参见图1中显示的DPP基序)。在图2F中显示了进一步的聚类DPP_6，其未包含在图1中的SAR-地图中且包含具有N-原子连接到吡唑环的单个细胞培养物活性的化合物。在图2F中显示了来自DIVERSet 1和2中的33种DPP化合物的另外那4个，其被发现在细胞培养物中无效的且DM程序判断其与所述六个DPP类不相似。我们已经通过DPP基序的库搜索鉴定这些化合物。

图3：基于初期筛选的结果和药用化学考虑根据实施例2中描述的方法合成的化合物的列表。使用各种试验测定法(即，SIFT、朊病毒病的细胞培养物模型中的测定、体内动物试验或α-共核蛋白聚集的生化测定法)分析这些化合物。

图4：治疗对大脑感染RML瘙痒病后小鼠的存活时间的作用。从感染后的第80天每天施用化合物持续14天(50μL 10mM化合物)。(A)用化合物10353_F11治疗延长大脑内感染的小鼠的存活(p＜0,05)。在(B)中显示用不同化合物治疗之后的平均存活时间。在用RML瘙痒病攻击之后每天腹腔内注射化合物anle138b和sery149显著地延长存活时间(anle138b：p＜0,01；sery149：p＜0,05)。平均存活时间以天±标准偏差表示。

图5：治疗对腹腔内感染RML瘙痒病的小鼠的脾脏PrPSc水平的影响。(A)在接种瘙痒病朊病毒之后一天一次用化合物治疗小鼠(腹腔内施用25μL 100mM化合物和口服施用50mg/kg)。(B)斑点印迹测定中脾脏PrPSc水平的密度计分析(Densitometric analysis)。用anle138b治疗诱导PrPSc水平相对于对照较强的减少(p＝0,001)。(C)瘙痒病感染的小鼠的脾脏的免疫组织学分析。用anle138b治疗之后具有低PrPSc沉着物的脾脏的百分比增加(级别+)和强PrPSc沉着物被消除(级别+++)。(D)显示了脾脏中PrPSc染色的沉着物(箭头)的两个实例。左图显示强PrPSc染色(级别+++)，而右图显示低PrPSc染色(级别+)。条显示平均PrPSc水平±标准误差。

图6：小鼠脑部的免疫印迹和组织学分析。(A)小鼠大脑内接种RML瘙痒病之后，对小鼠的治疗在感染后第80天开始。在标明的时间点给予化合物(腹腔内应用25μL 100mM化合物和口服施用50mg/kg)。(B)在不同时间点定量朊病毒接种的小鼠脑匀浆中的PrPSc水平。用anle138b治疗完全阻断脑内PrPSc积累。在第106天PrPSc的量仍然在第80天的水平。用anle186b治疗导致小鼠脑内PrPSc积累的降低。(C)与第80天未治疗的对照相比用化合物治疗之后相对的PrPSc水平的变化。(D)在标明的时间点H&E染色脑片中凋亡细胞((E)中的箭头)的组织学检查。线图(line plot)显示凋亡细胞的平均数±标准误差。(E)显示具有凋亡细胞(箭头)的H&E染色切片。

图7：通过每天施用本发明的化合物延长存活时间。已经大脑内感染RML瘙痒病毒株的小鼠，显示了延长的存活时间直到到达瘙痒病感染的终末期。

图8：通过本发明的化合物抑制α-共核蛋白聚集。(A)DPP-化合物351F11能够以剂量依赖的方式抑制多聚α-共核蛋白复合物的形成。(B)(C)检测的其它DPP-相关的化合物对α-共核蛋白聚集的剂量依赖的抑制效果。

图9：用本发明的DPP-相关的化合物治疗的朊病毒感染的细胞培养物。DPP-相关的化合物在低的微摩尔浓度和甚至在亚微摩尔浓度在细胞培养物中显示了强的PrPSc的减少。

图10：在感染RML瘙痒病的小鼠中用anle138b每天治疗对PrP^Sc积累和朊病毒病理的影响。(A)与DMSO治疗的动物相比，PrP^Sc染色的脑切片(上行：皮层和海马，下行：小脑)显示anle138b治疗减少PrP^Sc积累。(B)在标明的时间点对朊病毒接种的小鼠的脑匀浆中PrP^Sc水平的定量显示anle138b-治疗的小鼠中PrP^Sc积累是强烈减少的，甚至是在疾病晚期(120dpi)开始治疗之后也是如此。(C)H&E染色的脑片中小脑中的凋亡细胞的组织学定量显示PrP^Sc积累的抑制引起神经细胞死亡的抑制。(D)用不含化合物的DMSO+花生酱治疗的对照小鼠显示递增的重量减轻。从80dpi向前用anle138b治疗防止体重减轻持续～100天。从120dpi治疗抑制体重减轻持续～70天。B和C中的误差条显示标准误差(n＝4只小鼠)。图B中显示的图例也适用于图C和D。

图11：不同治疗方案的比较。以图中显示的不同时间和方案用anle138b治疗显著地延长了RML瘙痒病攻击之后的存活时间(p＜0,01)。平均存活时间以天±标准偏差表示。

图12：anle138b施用对脑内PrPSc水平的剂量依赖的效果。将C57BL/6小鼠大脑内(i.c.)接种30μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。在感染后第80天用不同量的anle138b(如图中显示)与DMSO+花生酱混合口服应用开始治疗。在感染后第120天，将动物处死并与在感染后第80天处死的动物比较，定量脑内的PrP^Sc量。误差条显示标准误差(n＝4只小鼠)。

图13：通过对每天用1mg anle138b与DMSO+花生酱混合持续1周的治疗未感染的小鼠的脑组织的免疫印迹定量PrP^C。各条表示各组中四只小鼠。

图14：Anle138b的药物代谢动力学分析。如显示将单剂量的anle138b应用到未感染的C57BL/6小鼠。在应用之后的不同时间点，通过LC-MS以每时间点和实验组2只动物测量脑和血清中化合物的量。

图15：不同化合物抑制α-共核蛋白聚集体的形成。显示了在表2中测试的化合物的结构。

图16：与无MPTP处理的小鼠相比定量MPTP-处理的小鼠中神经元丧失，如通过在用抗-TH-抗体免疫染色的50μm切片中确定酪氨酸羟化酶(TH)-阳性黑质密部(SNpc)细胞所评价的。使用Stereo investigator软件(MicroBrightfield，Colchester，VT，USA)分析通过SNpc的每第二个切片。免疫染色细胞通过使用20x物镜的光学分馏方法(optical fractionator method)计数。由两个独立的研究者盲目地进行立体计数(stereological count)。

图17：anle138C对ABeta聚集的效果。由动态光散射分析ABeta聚集。在不存在(上部图(top panel))和存在anle138C(中部(middle panel))下的单体Abeta40和寡聚体Abeta40。下部图显示在离心样品之后测定的Abeta40的淀粉样蛋白原纤维状态的大小分布。

发明详述

通过权利要求中列出的实施方式概括本发明。应当理解：下文和权利要求中列出的所有优选的实施方式的组合被认为属于本发明的范围。

本发明涉及由通式(E)表示的化合物：

在环D中X、Y和L独立地不定向地选自：-C(R¹)(R²)-、-C(R³)＝、-N(R⁴)-、-N＝、-N⁺(R⁵)＝、-O-和-S-；

M和Z独立地不定向地选自：

----表示任选的双键。

不证自明的是：将根据价态和稳定性的允许选择X、Y、Z、L和M。

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立地选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；-C(O)-C_1-4烷基；和C_6-10芳基，其中芳基环可任选地用C_1-4烷基或卤素取代。C_6-10芳基不是具体限制的且可以是，例如，选自苯基和萘基。卤素原子可以是F、Cl、Br或I且通常是F或Cl。

优选地R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立地选自：氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；和-C(O)-C_1-4烷基。更优选地R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷选自氢；C_1-4烷基；和-C_1-4亚烷基-卤素。

取代基的选择可以取决于式(E)的化合的期望用途。在一种优选的实施方式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷中的至少一个(更优选地R⁴、R⁵和R⁷中的至少一个)是-C_1-4亚烷基-卤素。如果化合物被用作用于成像聚合蛋白沉着物的探针这是特别有用的，因为然后可能用可检测的标记，如可检测的卤素同位素，快速且有效地标记它们。可检测的卤素同位素的实例包括¹⁸F、¹²⁵I、¹²³I、¹³¹I、⁷⁷Br和⁷⁶Br，特别是¹⁸F。当然可能使用可检测的卤素同位素作为本发明的化合物中存在的任何其它卤素原子，如连接到苯基环的卤素原子。

可选地¹¹C可以被用于可检测地标记本发明的化合物。¹¹C可以存在于R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷中的至少一个(更优选地R⁴、R⁵和R⁷中的至少一个)或本发明的化合物的任何其它部分。

在可选的优选的实施方式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立地选自氢和C_1-4烷基，优选地氢。

环D不受特别地限制。其通常的实例包括：

环D的具体优选的实例是：

在上面的式中，R⁸选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；-C(O)-C_1-4烷基；和C_6-10芳基，其中芳基环可用C_1-4烷基或卤素任选地取代。优选地R⁸选自：氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；和-C(O)-C_1-4烷基。更优选地R⁸选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素。在一种实施方式中R⁸选自氢；和C_1-4烷基，更优选地氢。在可选的实施方式中R⁸是-C_1-4亚烷基-卤素。如上面所说明，如果需要R⁸可以是可检测地标记的。

在上面的式中，R⁹选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；-C(O)-C_1-4烷基；和C_6-10芳基，其中芳基环可用C_1-4烷基或卤素任选地取代。优选地R⁹选自：氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；和-C(O)-C_1-4烷基。更优选地R⁹选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素。在一种实施方式中R⁹选自氢；和C_1-4烷基，更优选地氢。在可选的实施方式中R⁹是-C_1-4亚烷基-卤素。如上面所说明，如果需要R⁹可以是可检测地标记的。

在进一步的实施方式中R⁸和R⁹是氢。在又一实施方式中，R⁸是-C_1-4亚烷基-卤素且R⁹是氢。

Hal选自F、Cl、Br和I且优选地是F、Cl或Br，更优选地是Cl或Br，最优选地是Br。

R^E1选自羟基、C_1-6烷氧基和-NR^E5R^E6。

R^E2选自氢、卤素、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^E5R^E6，优选地R^E2选自氢、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^E5R^E6。

在可选的实施方式中，如果R^E1和R^E2连接到邻接的碳原子，那么他们一起可以不定向地形成结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-以及其中存在双键的相应的结构。在这一结构中T选自CR^E9R^E10、NH和O且V选自CR^E9R^E10、NH和O。优选地T和V中的至少一个是NH或O。这样结构的实例包括-O-(CH₂)_n-O-、-O-(CF₂)_n-O-、-O-(CH₂)_n-CH₂-、-NH-(CH₂)_n-NH-、-NH-(CF₂)_n-NH-、-NH-(CH₂)_n-CH₂-或其中存在双键的相应的结构。例如，如果n＝1那么-N＝CH-NH-是其中存在双键且与-NH-CH₂-NH-相应的结构。优选地R^E1和R^E2一起形成结构-O-(CH₂)_n-O-。假定这一基团也可以在体内水解成相应的羟基。

n是1至3；优选地n是1或2，更优选地n是1。

R^E5和R^E6独立地选自氢和C_1-6烷基；优选地R^E5和R^E6独立地选自氢和C_1-4烷基。

R^E7和R^E8独立地是H或F，且优选地是H。

R^E9和R^E10独立地是H或F，且优选地是H。

R^E1和R^E2连接到苯环的位置可以变化。

在一种实施方式中R^E1和R^E2独立地是羟基或烷氧基，在相对于将苯环结合到环D的碳原子的间位和对位被连接。

在第二种实施方式中R^E1和R^E2是结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-或其中存在双键的相应的结构，且在相对于将苯基环结合到环D的碳原子的间位和对位被连接。对于结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-上面优选的定义类似地应用于这一实施方式。

在第三种实施方式中R^E1是-NR^E5R^E6且在相对于将苯基环结合到环D的碳原子的对位被连接。

除了R^E1和R^E2，进一步的取代基R^E3还可以任选地存在于苯基环上。R^E3可以是C_1-6烷基或C_5-10芳基(诸如苯基或萘基)，优选地C_1-6烷基，更优选地C_1-4烷基。取代基的数目m，不受特别的限制且通常在0至2的范围内，优选地0或1，通常是0。

也可以存在进一步的取代基R^E4。它们通常是卤素原子、C_1-6烷基或C_5-10芳基(如苯基或萘基)，优选地卤素原子或C_1-6烷基，更优选地C_1-6烷基，最优选地C_1-4烷基。取代基的数目p，不受特别的限制且通常在0至2的范围内，优选地0或1，通常是0。

在一些实施方式中排除以下化合物：

3(5)-(2-羟基-5-甲基苯基)-5(3)-(4-氯苯基)吡唑(DE 41 26 543：表1中化合物26)；

邻羟基苯基-5二氯-3′-4′苯基-3甲基-2吡唑(FR 2.104.932：实施例IV)；

邻羟基苯基-5二氯-3′-4′苯基-3苯基-2吡唑(FR 2.104.932：实施例IV)；

在WO 2004/080972中这些化合物被公开为化合物IA-44、IA-47、IA-81、IA-106和IA-115。

在本发明的其它实施方式中不排除这些化合物。

由式(E)表示的化合物的优选的实例包括由式(A)表示的化合物

关于式(E)的上面给出的X、Y、Z、M、L、环D、m、p和Hal的定义类似地应用于式(A)。

R^A1和R^A2各自独立地选自氢、卤素、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^A5R^A6，条件是R^A1和R^A2中的至少一个是羟基、C_1-6烷氧基或-NR^A5R^A6。优选地R^A1和R^A2独立地选自氢、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^A5R^A6。

可选地R^A1和R^A2一起可以不定向地形成结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-。在上面给出的关于R^E1和R^E2形成这样的结构的说明，特别是上面的R^E7、R^E8、T、n和V的定义类似地应用于R^A1和R^A2形成这一结构。

在一种实施方式中R^A1和R^A2独立地是羟基或烷氧基。

在第二种实施方式中R^A1和R^A2是结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-或其中存在双键的相应的结构。对于结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-上面优选的定义类似地应用于这一实施方式。

在第三种实施方式中R^A1是-NR^A5R^A6且R^A2是氢。

除了R^A1和R^A2，进一步的取代基R^A3还可以任选地存在于苯基环上。R^A3可以是C_1-6烷基或C_5-10芳基(诸如苯基或萘基)，优选地C_1-6烷基，更优选地C_1-4烷基。

也可以存在进一步的取代基R^A4。它们通常是卤素原子、C_1-6烷基或C_5-10芳基(如苯基或萘基)，优选地卤素原子或C_1-6烷基，更优选地C_1-6烷基，最优选地C_1-4烷基。

R^A5和R^A6独立地选自氢和C_1-6烷基；优选地R^A5和R^A6独立地选自氢和C_1-4烷基。

由式(E)表示的化合物的优选的实例包括由式(B)表示的化合物

关于式(E)的上面给出的X、Y、Z、M、L、环D、m、p和Hal的定义类似地应用于式(B)。

R^B1选自羟基、C_1-6烷氧基和-NR^B5R^B6。优选地R^B1是羟基或C_1-6烷氧基。

R^B2选自氢、卤素、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^B5R^B6，优选地R^B2选自氢、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^B5R^B6。

在一种实施方式中R^B1是羟基或C_1-6烷氧基且R^B2是氢。

R^B5和R^B6独立地选自氢和C_1-6烷基；优选地R^B5和R^B6独立地选自氢和C_1-4烷基。

除了R^B1和R^B2，进一步的取代基R^B3还可以任选地存在于苯基环上。R^B3可以是C_1-6烷基或C_5-10芳基(诸如苯基或萘基)，优选地C_1-6烷基，更优选地C_1-4烷基。

也可以存在进一步的取代基R^B4。它们通常是卤素原子、C_1-6烷基或C_5-10芳基(如苯基或萘基)，优选地卤素原子或C_1-6烷基，更优选地C_1-6烷基，最优选地C_1-4烷基。

本发明的优选的化合物包括

上面给出的关于R^E7、R^E8和Hal的定义类似地应用于这些化合物。

R选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；和C_6-10芳基(如苯基和萘基)，其中芳基环可以用C_1-4烷基或卤素任选地取代。优选地R选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素。在一种实施方式中R选自氢；和C_1-4烷基，更优选地氢。在可选的实施方式中R是-C_1-4亚烷基-卤素。如上面所说明，如果需要R可以是可检测地标记的。

R^A7是H或C_1-6烷基，优选地H或C_1-4烷基。

R^A8是H或C_1-6烷基，优选地H或C_1-4烷基。

R^A9是H或C_1-6烷基，优选地H或C_1-4烷基。

R^A10是H或C_1-6烷基，优选地H或C_1-4烷基。

R^B7是H或C_1-6烷基，优选地H或C_1-4烷基。

下面的化合物是特别地优选的，因为已经发现它们在抑制蛋白聚集中或在成像聚集蛋白中具有高功效：

其中，Hal是Cl或Br，优选地Hal是Br。

目前最优选的是下面的化合物

本发明的化合物也可以以其前药、酯、溶剂合物或盐的形式存在。

本发明的化合物形成也属于本发明的范围的盐。除非另外表明否则本文引用本发明的化合物被理解为包括引用其盐。术语“盐”，如本文所用，表示与无机酸及碱和/或有机酸及碱形成的酸式盐和/或碱式盐。另外，当化合物包括碱式部分和酸式部分二者时，两性离子(内盐)可以被形成且被包括在本文使用的术语“盐”的范围内。药学上可接受的(即，无毒的、生理学上可接受的)的盐是优选的，尽管例如在制备过程中使用的分离或纯化步骤中其它盐也是有用的。可以形成本发明的化合物的盐，例如，通过使化合物与一定量的酸或碱，如等量的，在介质如盐在其中沉淀的介质或在含水介质(随后冻干)中反应。

包含碱式部分的化合物可以与各种有机酸和无机酸形成盐。示例性酸加成盐包括乙酸盐(如与乙酸或三卤乙酸例如三氯乙酸形成的那些)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟基乙磺酸盐(例如2-羟基乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(例如2-萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐(3-苯基丙酸盐)、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(例如，与硫酸形成的那些)、磺酸盐(例如，本文提到的那些)、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐如甲苯磺酸盐(tosylate)、十一酸盐以及类似的盐。

包含酸式部分的化合物可以与各种有机碱和无机碱形成盐。示例性碱式盐包括铵盐，碱金属盐如钠盐、锂盐和钾盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，与有机碱(例如，有机胺)的盐，如与苄星(benzathine)、二环己胺、哈胺(hydrabamine)(与N，N-双(去氢枞酸基)亚乙基二胺形成)、N-甲基-D-葡萄糖胺、N-甲基-D-咪唑双酰胺(glycamide)、叔丁胺的盐，和与氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸的盐以及类似的盐。碱性含氮基团可以用剂如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)，二烷基硫酸酯(例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯)、长链卤化物(例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基氯化物、溴化物和碘化物)，芳烷基卤化物(例如苄基和苯乙基溴化物)以及其它剂而季铵化。

本发明的化合物的前药和溶剂合物也在本文被考虑。如本文所用术语“前药”表示这样的化合物：其在向受治疗者施用之后通过代谢过程或化学过程进行化学转化以产生本发明的化合物或其盐和/或溶剂合物。

本发明的化合物的溶剂合物包括例如水合物。

本发明的化合物的酯包括C_1-6烷基酯，优选地C_1-4烷基酯。

本发明的化合物可以以它们的互变异构形式存在(例如，为酰胺或亚胺基醚)。所有的这些互变异构体形式作为本发明的部分在本文被考虑。

本发明的化合物的所有立体异构体(例如，由于各种取代基上的不对称碳可能存在的那些)，包括对映形式和非对映形式，在本发明的范围之内被考虑。本发明的化合物的个别立体异构体可以，例如，实际上无其他异构体(例如，为具有特定活性的纯的或基本上纯的光学异构体)，或可以是例如消旋体或与所有其它或其它选择的立体异构体混合的。本发明的化合物的手性中心可以具有由IUPAC 1974推荐定义的S或R构型。

消旋形式可以通过物理方法拆分，如分部结晶、分离或非对映异构衍生物的结晶或通过手性柱色谱法分离。单个光学异构体可以通过任何合适的方法，包括但不限于与光学活性的酸形成盐之后结晶，获自消旋体。

本发明的化合物的所有构型异构体或以混合物形式或以纯的或基本上纯的形式被考虑。本发明的化合物的定义包括顺式(Z)和反式(E)烯烃异构体，以及环状烃或杂环的顺式或反式异构体。

贯穿本说明书，可以选择基团及其取代基以提供稳定的部分和化合物。

可以以任选地包括药学上可接受的载体的药物组合物或诊断组合物的形式提供式(E)的化合物。

应用基于“强荧光靶扫描(SIFT)”技术的生物化学测定结合朊病毒疾病的细胞培养物模型中的细胞测定，发明人已经体外筛选了大的合成化合物库中对伴随神经变性疾病和特别是朊病毒病和共核蛋白病的聚集过程的分子水平的抑制剂。这样的抑制剂具有成为这些疾病的新的治疗剂的潜力。

迄今为止这一测定系统在自动程度、测定速度(每样品75秒)、化合物的量(每初步测定仅200皮摩尔)以及使用的剂(例如，需要仅每测定来自CJD-病例的0.2mg脑的等量)方面，优于用于研究抑制蛋白聚集的新药物的使用中的所有测定系统。仅仅对资源和时间的这些相当低的要求允许筛选这样高数目(即，20,000)的化合物。此外，将所有的筛选数据标测到集中的数据库上和它们的自动分析允许结构-活性关系的有效评估和分析。与本发明中包括的细胞培养物筛选过程的组合允许将鉴定在生物化学以及基于细胞的测定中都是活性的化合物。因此，鉴定不仅体外有活性，而且在细胞环境中有活性的化合物，例如保证鉴定的化合物的适当的稳定性和反应性以被进一步开发用于体内应用。

因此，发明人在这一初步筛选中鉴定了许多活性化合物，其随后在稀释系列中被验证以鉴定甚至在非常低的浓度下有活性的化合物。使初步筛选中表征为″活性的″化合物接受聚类分析，其显示了五个邻近聚类的组(DPP_1至DPP_5；图1)，包括高度活性的化合物，属于3，5-二苯基-吡唑(DPP)衍生物的化合物类(参见图1中显示的DPP基序)。

发明人进一步取代鉴定的化合物类的各种取代基以鉴定适合作为伴随神经变性疾病和特别是朊病毒病以及共核蛋白病的聚集过程的分子水平的抑制剂的相关化合物。使用这一药物化学方法，合成许多其它化合物。这些化合物，与初始筛选选择的物质一起，接受进一步的测试，包括SIFT测定，基于细胞培养物测定，对小鼠的体内实验以及涉及α-共核蛋白聚集的生物化学测定(参见实施例)。因此，这些化合物在体外以及体内的活性是经过证实的。以下发现，这些化合物在用于共核蛋白病中发现的这一病理蛋白聚集的体外模型中在较低的微摩尔浓度也能够有效地抑制α-共核蛋白的多聚体形成，清楚地显示：通过在分子水平靶向病理机制，鉴定的化合物不仅可用作抗朊病毒化合物，而且也对共核蛋白病像帕金森病、DLB和MSA具有治疗潜力。此外，这些化合物在体外对朊病毒蛋白聚集和α-共核蛋白聚集的抑制活性可以反映它们对更宽范围的蛋白聚集疾病的普遍的抗聚集活性，其中蛋白主要错折叠成β-折叠构型形成随后的蛋白聚集成淀粉样蛋白原纤维的基础。因此，这些化合物和与DPP类物质的成员相关的化合物具有成为用作全部(whole panel)(神经变性)蛋白聚集疾病的成因治疗的治疗剂的潜力，所述蛋白聚集疾病包括但不限于：帕金森病、朊病毒病、阿尔茨海默病、多系统萎缩、弥漫性路易体病、额颞痴呆(frontotemporal dementia)、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和其它Poly-Q病、遗传性大脑淀粉样血管病、家族性淀粉样多神经病、原发性全身性淀粉样变性(AL淀粉样变性)、反应性全身性淀粉样变性(AA淀粉样变性)、II型糖尿病、注射局限性淀粉样变性、β-2微球蛋白淀粉样变性、遗传性非神经病性淀粉样变性和芬兰型遗传性全身性淀粉样变性。

本发明进一步涉及本发明的化合物以及其前药、酯、溶剂合物或盐用于治疗或预防与蛋白聚集相关的疾病和/或神经变性疾病。进一步的实施方式是本发明的化合物用于制备治疗或预防与蛋白聚集相关的疾病和/或神经变性疾病的药物组合物，以及治疗或预防与蛋白聚集相关的疾病和/或神经变性疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的化合物。

术语“聚集”，根据本发明，指通常一种或多种类型的蛋白的寡聚体或多聚体复合物的形成，其可以伴随将其它生物分子，像碳水化合物、核苷酸和脂类整合进入复合物。

如本文所用，术语“与蛋白聚集相关的疾病和/或神经变性疾病中牵涉的蛋白”指以聚集蛋白的存在为特征的那些疾病。这样的聚集蛋白可以在特定的组织，更优选地在神经组织或脑组织中形成沉着物。聚集程度取决于具体的疾病。

本发明进一步涉及上面定义的本发明的化合物用于制备治疗或预防与蛋白聚集相关的疾病和/或神经变性疾病的药物组合物的用途。

根据本发明，术语“药物组合物”涉及向患者，优选地人患者施用的组合物。本发明的药物组合物包括上面提到的化合物和任选地，能够通过例如稳定、调节和/或活化它们的功能改变本发明的化合物的特征的进一步的分子。组合物可以是固体、液体或气体形式且可以尤其是处于粉剂、片剂、溶液或气雾剂的形式。本发明的药物组合物可以，任选地或附加地包含药学上可接受的载体。合适的药物载体的实例是本领域熟知的且包括磷酸盐缓冲的盐水溶液、水、诸如油/水乳剂之类的乳剂、各种类型的湿润剂、灭菌溶液、包括DMSO在内的有机溶剂等。包含这些载体的组合物可以由熟知的传统方法配制。

药物组合物将被配制和分配成符合良好的医疗实践的形式，考虑个体患者的临床病况、药物组合物的递送位点、施用方法、施用时间表以及实践者已知的其它因素。因此通过这些考虑确定用于本文目的的药物组合物的“有效量”。技术人员已知向个体施用的药物组合物的有效量将尤其取决于化合物的性质。

本发明的药物组合物可以被口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹腔内、局部地(如通过粉末、软膏、滴剂或透皮贴剂)、口腔地或作为口腔喷雾或鼻腔喷雾施用。通过“药学上可接受的载体”意指无毒的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。如本文所用术语“肠胃外”指包括静脉内、肌内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用模式。

药物组合物也适合通过缓释系统施用。缓释组合物的合适的实例包括处于成形的物品形式的半渗透的聚合物基质，例如膜或微囊。缓释基质包括多乳酸化合物(美国专利第3,773,919号、EP 58 481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman，U.等，Biopolymers 22：547-556(1983))、聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)(R.Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)，和R.Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))，乙烯醋酸乙烯酯(R.Langer等，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133 988)。缓释药物组合物还包括脂质体包裹的化合物。包含药物组合物的脂质体本身由已知方法制备：DE 32 18 121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82：3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)77：4030-4034(1980)；EP 52 322；EP36 676；EP 88 046；EP 143 949；EP 142 641；日本专利申请第83-118008号；美国专利申请第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102324。通常，脂质体是小的(约200-800埃)单层类型，其中类脂含量大于约30mol％胆固醇，调节选择的比例以用于最佳治疗。

对于肠胃外施用，药物组合物一般通过将其在期望程度的纯度与药学上可接受的载体以单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)混合而配制，药学上可接受的载体即在使用的剂量和浓度对于接受者是无毒的且与制剂的其它成分相容。

通常，通过将药物组合物的组分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀地且亲密地接触制备制剂。然后，如果需要，将产物成型为期望的制剂。优选地载体是肠胃外载体，更优选地与接受者的血液等渗的溶液。这些载体媒介物的实例包括水、盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。无水媒介物如不挥发性油和油酸乙酯以及脂质体在本文也是有用的。载体适当地包含小量的添加剂如提高等渗度和化学稳定性的物质。这些物质在使用的剂量和浓度对于接受者是无毒的，且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或它们的盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(小于约十个残基)(多)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括纤维素或其衍生物，葡萄糖、甘露糖(manose)或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如聚山梨醇、泊洛沙姆或PEG。

用于治疗施用的药物组合物的组分必须是无菌的。通过滤过无菌滤膜(例如，0.2μm膜)容易地达到无菌。一般将药物组合物的治疗组分放置进入具有无菌接口的容器，例如，具有可被皮下注射针头刺穿的塞的静脉溶液袋或小瓶。

药物组合物的组分通常将储存在单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿或小瓶，作为水溶液或作为用于重建的冻干制剂。作为冻干制剂的实例，将10-ml小瓶装有5ml的无菌过滤的1％(w/v)水溶液且将产生的混合物冻干。输注溶液通过使用抑菌性注射用水重建冻干的化合物制备。

本发明进一步涉及治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病的方法，其包括向需要其的患者施用治疗有效量的本发明的化合物。

如本文所用术语“治疗有效量”指足以引起期望的生物反应的量。在本发明中期望的生物反应是抑制蛋白聚集。

本发明进一步涉及鉴定具有提高的抑制与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病中涉及的蛋白的聚集的功效的化合物的方法，包括以下步骤：(a)在聚集的候选抑制剂的(1)存在和/或(2)不存下使标记的单体蛋白和不同地标记的所述蛋白的聚集体接触，所述抑制剂是上面定义的化合物的衍生物；(b)确定共定位的标记的量，其表示单体蛋白与所述蛋白的聚集体的结合程度；和(c)比较在所述化合物的存在和不存在下获得的结果；其中在所述化合物的存在下共定位的标记的减少是化合物抑制所述蛋白聚集的能力的显示。

如本文所用，术语“单体蛋白”指主要由具有对于各具体蛋白特异的三维构象的一个单一(多)肽链组成的分子单元，其优选地溶于水溶液通常达纳摩尔、微摩尔或毫摩尔浓度且可以通过一个或多个碳水化合物、碳水化合物衍生物、类脂、磷酸盐、硫酸盐、脂肪酸和核苷酸与链中的单个氨基酸的共价键修饰。优选地，所述修饰是磷酸化、糖基化、蛋白酶解加工、糖化、氧化和硝化。如本文所用术语“(多)肽”描述了包括由多至30个氨基酸组成的肽组，以及由多于30个氨基酸组成的多肽组的分子组。如贯穿本发明所用，术语“蛋白”也指(多)肽。

术语“聚集蛋白”指非共价连接的一种或多种类型的“单体蛋白或多肽”的寡聚体或多聚体，如上面所定义，其以相对单体蛋白单元的复合蛋白单元的改变的三维构象和复合物在水溶液中的通常低的溶解度为特征。

术语“抑制蛋白聚集的化合物”指能够防止蛋白聚集体形成和/或能够分解(disintegrating)或分裂(breaking down)存在的蛋白聚集体的化合物，其中所述化合物来自通过衍生化的本发明的化合物。优选地，所述化合物通过计算机建模设计，其中计算机建模意指使用虚拟的筛选工具用于搜索结合蛋白的单体形式或聚集形式或两者的化合物。通常，这些方法依赖蛋白的三维结构，优选地与底物一起结晶的蛋白的三维结构。更优选地，底物用候选的调节剂或抑制剂代替。

术语“标记的...蛋白”指附着标记的蛋白。所述标记可以被直接或间接附着。间接标记具体指标记的(多)肽，更具体地标记的抗体。附着标记可以通过本领域技术人员已知的和标准教科书中描述的许多方法进行(参见例如Harlow和Lane″Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1998)。

术语“不同地标记的蛋白”指不同的标记被附着到蛋白的聚集亚型和单体亚型上。通常的实例是附着“FITC”到聚集蛋白上和附着“德克萨斯红(Texas red)”到单体蛋白上。因为这些标记在不同的光波长处是可检测的，所以确定蛋白的亚型的量和/或位置是可能的。更具体地，使用不同的标记允许定量共定位的标记的存在，即，被发现相互靠近的标记的存在。

可以这样进行“确定共定位的标记的量”，例如，通过在通常小于100μs的非常短的时间期间内单独地测量(即，波长特定的)来自通常小于1飞升的相同样品的小体积的元素的至少两种不同波长的单光子的数目随后由计算机比较各自的光子数目，其可以以具有一个轴用于一种具体波长的光子数的多维矩形图图解表示。在两种波长的情况下具体时间期间的光子数目可以因此被表示为二维荧光强度矩形图中的单个点。

术语“比较在所述化合物的存在和不存在下获得的结果”指评价化合物对蛋白聚集的形成和/或量的影响。如本文所用，在聚集的候选抑制剂化合物的存在下，共定位的标记下降多于10％，更优选地多于25％，甚至更优选地多于50％和最优选地多于95％，是化合物的抑制蛋白聚集的能力的显示。术语“不存在所述化合物”指没有抑制剂或候选抑制剂被添加或已经被添加到聚集蛋白中。在具体情况中加入阴性对照，即，对蛋白聚集没有影响的化合物可以是有用的。术语“不存在所述化合物”也指这些情况。同样，抑制蛋白聚集的本申请的任何化合物可以在用于鉴定新的抑制剂化合物的测定中被用作阳性对照。显然的是术语“存在”也指量。出于显然的理由，本发明中提及的化合物具有不同的有效浓度。优选地有效的浓度是低于100μM，更优选地低于10μM和甚至更优选地低于1μM。

本发明的方法具体地用于鉴定能够以增强的功效干扰蛋白聚集的新的化合物。其允许筛选衍生化合物的大的库并允许鉴定具有高置信度的抑制性化合物。在本发明的一个方面，该方法基于荧光相关光谱。在最近几年，荧光相关光谱(FCS)已经被认为是允许在分子水平高度敏感分析神经变性疾病如朊病毒病中的蛋白聚集的方法(Bieschke和Schwille 1997，Bieschke等2000，Giese等2000，Post等1998)。此外，FCS借助其本身微型化和自动化并成为用于制药工业中高通量筛选的确定的方法(Koltermann等1998)。荧光相关光谱(FCS)以其目前的共焦形式分析通过开放体积的元素的单一荧光标记的分子的扩散引起的信号波动，所述开放体积的元素由通过大孔径(high aperture)显微镜物镜聚焦和在单光子计数检测器上共焦成像的激发激光束定义(Schwille等1997)。在其最优选的实施方式中，本发明的方法基于这一技术。这一方法适合基于抑制，例如，PrPC结合到PrPSc的聚集体或形成α-共核蛋白的寡聚体或初原纤维(protofibril)或原纤维(fibril)的高通量筛选。

用于检测蛋白聚集的抑制剂的这一测定系统可以被用于搜索用于任何神经变性疾病的新的治疗剂，所述神经变性疾病与特定的蛋白聚集有关如阿尔茨海默病和帕金森病。此外，应当可能的是为其中多聚体形成在发病中起关键作用的所有疾病探索潜在的治疗剂，不论它们的组分的化学性质。

在本发明优选的实施方式中所述标记是荧光标记。

优选地，该标记选自由以下组成的组：荧光染料例如荧光素异硫氰酸酯(FITC)、若丹明、德克萨斯红、Alexa 488、Alexa 647、藻红蛋白、别藻蓝素、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)，放射性标记，例如³²P、³⁵S、³H；等。该标记也可以是两阶段系统，其中例如将蛋白或(多)肽或本发明的化合物轭合到生物素、半抗原等，其具有高亲和性结合配体例如亲和素、特异抗体等，其中所述结合配体被轭合到可检测的标记上。

在本发明另一优选的实施方式中，所述标记连接到特异地结合所述蛋白的抗体或者抗体片段。

术语抗体的“特异结合”可以，例如，以它们的交叉反应性的方式被描述。优选地，“特异结合到...的抗体”指不结合与由聚集蛋白编码的(多)肽具有少于98％、少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％和少于65％同一性(使用本领域已知的方法计算)的(多)肽的抗体。然而抗体也可以在它们的结合亲和性的方面被描述或指定。优选的结合亲和性包括具有小于5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^-7M、5×10^-8M、10^-8M、5×10^-9M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M和10^-15M的解离常数或K_d的那些。

术语“抗体”指多克隆的、单克隆的、嵌合的、人源化抗体，单链、单链Fv抗体或抗体片段，像，尤其是Fab片段。抗体片段或衍生物进一步包括F(ab′)₂、Fv或scFv片段；参见，例如，Harlow和Lane(1988)和(1999)，loc.cit。各种过程是本领域已知的且可以用于这些抗体和/或片段的制备。因此，(抗体)衍生物可以通过肽模拟物被制备。此外，为制备单链抗体描述的方法(参见，尤其是US专利4,946,778)可以被适用于产生这一发明的多肽和融合蛋白特异的单链抗体。同样，转基因动物可以被用于表达对这一发明的多肽和融合蛋白特异的人源化抗体。最优选地，这一发明的抗体是单克隆抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用提供通过连续细胞系产生的抗体的任何技术。这些技术的实例包括：杂交瘤技术(

和Milstein Nature 256(1975)，495-497)，三元杂交瘤技术、人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor，Immunology Today 4(1983)，72)和EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss，Inc.(1985)，77-96)。BIAcore系统中使用的表面等离子体共振可以被用于提高与本发明的多肽的表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，Human Antibodies Hybridomas(人抗体和杂交瘤)7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。在本发明的上下文中还考虑：术语“抗体”包括可以在细胞中表达的抗体构建体，例如可以经病毒或质粒载体以及其它转染和/或转导的抗体构建体。本领域技术人员已知在许多情况中抗体可以用其它特异结合的化合物如暴露在噬菌体表面的肽(噬菌体展示)代替或用分离的(多)肽代替。抗体或(多)肽可以是未标记的或用本发明描述的任何标记标记的。优选地，抗体可获自人、小鼠、大鼠、山羊或兔。

在本发明更优选的实施方式中，所述抗体能够区别聚集蛋白和单体蛋白。

术语“能够区别”指对于蛋白的单体亚型或聚集亚型中的一种特异的抗体。优选地，所述抗体对蛋白的一种亚型具有5倍减少的K_d，更优选地K_d是10倍减少的。结果是，所述抗体能够结合蛋白的一种亚型，而其基本上不能结合另一亚型。

在本发明的另一优选的实施方式中，共定位的标记的量通过使用“强荧光靶扫描(SIFT)”(Bieschke等2000)、FRET或高分辨率共焦成像的方法确定。

优选地，用共焦激光扫描显微镜或用旋转碟片(spinning disc)技术的显微镜进行所述高分辨率共焦成像。

在本发明的另一优选的实施方式中，所述单体蛋白和聚集蛋白选自由以下组成的组：朊病毒蛋白、淀粉样前蛋白(APP)、α-共核蛋白、超氧化物歧化酶、tau、免疫球蛋白、淀粉样蛋白-A、转甲状腺素蛋白、β2-微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、载脂蛋白A1、TDP-43、胰岛淀粉样多肽、ANF、凝溶胶蛋白、胰岛素、溶菌酶、纤维蛋白原、亨廷顿蛋白(huntingtin)和共济失调蛋白(ataxin)以及具有Poly-Q段(stretch)的其它蛋白，以及所述蛋白的片段或衍生物。在优选的实施方式中，单体蛋白和聚集蛋白选自由淀粉样前蛋白(APP)和α-共核蛋白组成的组。在更优选的实施方式中，单体蛋白和聚集蛋白是α-共核蛋白。

优选地，具有Poly-Q段的所述蛋白是具有至少36个连续的谷氨酰胺残基的蛋白。更优选地，具有Poly-Q段的所述蛋白选自由亨廷顿蛋白和共济失调蛋白组成的组。

优选地，所述片段或衍生物选自通过磷酸化、糖基化、蛋白酶解加工、糖化、氧化和硝化修饰的组。本发明中提到的(多)肽包含与链中个体氨基酸连接的一种或多种碳水化合物、碳水化合物衍生物、类脂、磷酸盐、硫酸盐、脂肪酸和核苷酸。优选地，所述修饰是磷酸化、糖基化、蛋白酶解加工、糖化、氧化和硝化。

蛋白可以是脊椎动物或无脊椎动物蛋白。优选地，蛋白是哺乳动物或鸟类蛋白。更优选地，哺乳动物蛋白选自灵长类、人类、小鼠、大鼠、牛属(bos)(牛)、猪属(sus)(猪)和绵羊。在具体的情况中使用混合的亚型是优选的，即，例如来自人的聚集形式的PrPSc和来自小鼠的单体形式。

蛋白可以是从动物或从组织培养物中分离的或可以重组地被制备。发明人考虑：蛋白可以是化学修饰的或由酶如蛋白酶或糖苷酶处理的以改善测定系统中的操作。

在本发明另一更优选的实施方式中，单体蛋白是朊病毒蛋白且聚集蛋白是PrPSc(Prusiner，1998)。

在本发明的另一更优选的实施方式中，单体蛋白是α-共核蛋白且所述聚集蛋白选自由α-共核蛋白的寡聚体或初原纤维或原纤维组成的组。

本发明也涉及选择在治疗与蛋白聚集相关的疾病和/或神经变性疾病中具有提高的体内功效的化合物的方法，包括(a)将是本发明定义的化合物的衍生物的候选化合物施用到具有本发明中定义的蛋白聚集亚型的细胞培养物或动物；(b)定量可观测的聚集体的量；和(c)鉴定和选择能够减少所述蛋白的聚集体或聚集体的形成的化合物。

本发明的方法允许在体内，即在活体之内或之外的细胞内测试候选化合物。在体内测试候选化合物例如显示在实施例中(参见下文)。在体内测试候选化合物给出重要的附加信息，其包括在复杂的化学环境下关于毒性、稳定性的数据，和到达获得期望的分子效果的位置的能力。

优选地，将化合物以各种浓度施用以确定可观测到对蛋白聚集的作用的浓度并计算EC₅₀，其中术语EC₅₀指对于那种化合物产生50％的最大可能的反应的化合物的(摩尔)浓度。

本发明也涉及上面定义的化合物用于在动物中、在体外或离体抑制蛋白聚集的用途。

在优选的实施方式中动物是非人动物。

本发明进一步涉及药物组合物或诊断组合物，包括本发明的化合物和任选地药学上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明，术语“诊断组合物”涉及用于诊断个体患者他们对本发明的药物组合物的可能的反应或被本发明的药物组合物的治愈性的组合物。术语“诊断组合物”也涉及用于确定上面列举的疾病中聚集蛋白的存在的组合物。本发明的诊断组合物包括上面列举的化合物。诊断组合物可以进一步包括适当的缓冲液和酶如逆转录酶、热稳定的聚合酶等。诊断组合物可以被包装在一个容器中或多个容器中。

在本发明更优选的实施方式中，所述化合物的功效通过衍生化被进一步提高。

根据本发明术语“衍生化”指产生在分子的至少一个位置具有修饰的化学相关的化合物。

在本发明的优选的实施方式中，所述化合物是可检测的或可检测地标记的。根据本发明应当理解：如果化合物的存在可以被传统的方法监测那么其是可检测的或可检测地标记的，传统方法如NMR光谱法、光学检测、正电子发射断层摄影(PET)、电子显微镜法、磁共振成像(MRI)、光谱测定法、色谱法、ELISA测定、放射性发射的检测，优选地通过闪烁计数或γ计数，优选地PET。

当本发明的化合物被用作成像聚集蛋白具体是淀粉样沉着物的探针时，它们必须是标记的。标记的特定的性质将取决于用于成像的方法。通常使用发射正电子(PET)的和具有较短的半衰期的放射性标记如¹⁸F、¹¹C、¹²⁵I、¹²³I、¹³¹I、⁷⁷Br和⁷⁶Br，特别是¹⁸F和¹¹C。由于它们的较短的半衰期本发明的标记的化合物将在它们被用于测试之前不久被制备。因此，本发明的诊断组合物也可以药盒的形式被提供，其由反应形成期望的化合物的本发明的化合物的前体组成。这样的药盒是特别方便的，如果本发明的化合物包含至少一个部分，其是为-N(R⁴)-的X、Y或L且R⁴包含可检测的标记。

在本发明优选的实施方式中用于成像的化合物具有部分-N(R⁴)-作为X、Y或L，其中R⁴是-C_1-4亚烷基-卤素，其中卤素原子是放射性的。在本发明另一优选的实施方式中用于成像的化合物具有部分-N(R⁴)-作为X、Y或L，其中R⁴是-C_1-4烷基，其包含至少一个¹¹C同位素。

本领域技术人员将能够设计用其将可检测的标记附加到本发明的化合物上的方法。下面的路线可以用作说明性实例。

2-[¹⁸F]氟乙基甲苯磺酸酯2是用于通过含氧、硫和氮亲核物质的化合物的氟乙基化或通过各种金属介导的甲基化掺入¹⁸F(半衰期109.8min)的有用的前体(R.Schirrmacher等，J.Label.Compd.Radiopharm.2002，45，763-774)。2-[¹⁸F]氟乙基甲苯磺酸酯可以两步合成法合成，通过用K[¹⁸F]/Kryptofix 2.2.2直接亲核取代乙二醇-1，2-二甲苯磺酸酯1的直接亲核取代得到¹⁸F-氟乙基化剂2。根据路线A非放射性试剂2被用于合成非放射性sery 363A、sery 363B、和sery 388B。相同的条件可以被用于合成这些化合物的放射性类似物。

路线A

通过[¹¹C]甲基碘化物(J.Eriksson等，J.Label.Compd.Radiopharm.2006，49，1177-1186)用相同类型的亲核取代可以引入进一步有用的正电子发射体¹¹C(半衰期20.38min)。根据路线B非放射性甲基碘化物被用于合成非放射性sery 392A和sery 392B。相同的条件可以被用于合成这些化合物的放射性类似物。

方案B

虽然将可检测的部分附加到环D上是优选的，因为这些化合物是特别易于合成的，但是这不是必需的。同样可能提供其中可检测的部分在分子中不同的位置的本发明的化合物。

本发明提供成像聚集蛋白的沉着物的方法，其包括以下步骤：

(i)向受试者引入包含可检测地标记的本发明的化合物的可检测的量的组合物；

(ii)允许足够的时间让化合物与聚集蛋白缔合；和

(iii)检测与聚集蛋白缔合的化合物。

在成像方法的优选的实施方式中，聚集蛋白选自由淀粉样前蛋白(APP)和α-共核蛋白组成的组。在更优选的实施方式中，聚集蛋白是α-共核蛋白。

包含可检测地标记的化合物的组合物可以通过任何上面描述的施用被引入到受试者，如例如口服或肠胃外。可将标记的化合物引入到受试者中并在足以使化合物与聚集蛋白缔合的足够的时间跨度之后，将标记的化合物在受试者体内非侵袭性地检测。可选地，可将标记的化合物引入到受试者，允许足够的时间使化合物与聚集蛋白缔合，且然后采用来自受试者的组织样品并在离开受试者的组织中检测标记的化合物。组织样品也可以在引入标记的化合物到组织样品之前被从受试者取出。允许足够量的时间使化合物结合到聚集蛋白之后，可以检测化合物。

与聚集蛋白缔合的标记的化合物的检测方法是本领域熟知的且包括，但不限于磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算体层摄影(SPECT)用于放射标记的化合物的检测。被引入到化合物的标记取决于使用的检测方法。因此，例如，如果PET选作检测方法，化合物必须具有正电子发射原子如¹¹C或¹⁸F。

聚集蛋白的成像也可以定量进行以致聚集蛋白的量可以被确定。

在本发明优选的实施方式中，所述与蛋白聚集有关的疾病以存在至少一种蛋白或其片段或其衍生物的聚集形式为特征，其中所述蛋白选自由以下组成的组：朊病毒蛋白、淀粉样前蛋白(APP)、α-共核蛋白、超氧化物歧化酶、tau、免疫球蛋白、淀粉样蛋白-A、转甲状腺素蛋白、β2-微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、载脂蛋白A1、TDP-43、胰岛淀粉样多肽、ANF、凝溶胶蛋白、胰岛素、溶菌酶、纤维蛋白原、亨廷顿蛋白和共济失调蛋白以及具有Poly-Q段的其它蛋白。在优选的实施方式中，蛋白选自由淀粉样前蛋白(APP)和α-共核蛋白组成的组。在更优选的实施方式中，蛋白是α-共核蛋白。

优选地，具有Poly-Q段的所述蛋白是具有至少36个连续的谷氨酰胺残基的蛋白。更优选地，具有Poly-Q段的所述蛋白选自由亨廷顿蛋白和共济失调蛋白组成的组。

技术人员已知所述蛋白可以以各种亚型存在，包括由磷酸化、糖基化、蛋白酶解加工和类似方法修饰的蛋白。术语“至少一种...”指技术人员已知的事实：疾病可以与多于一种蛋白的聚集形式的存在有关。例如，在阿尔茨海默病中淀粉样前蛋白(APP)的片段的聚集体和tau的聚集体通常是可检测的。

如本文所用，术语“神经变性疾病”包括疾病如帕金森病、朊病毒病、阿尔茨海默病、多系统萎缩症、弥漫性路易体病、额颞痴呆、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑共济失调和其它Poly-Q病，遗传性大脑淀粉样血管病、家族性淀粉样多神经病。此外，如本文所用，术语“蛋白聚集病”指主要显示在神经系统之外的疾病且包括疾病如原发性全身性淀粉样变性(AL淀粉样变性)、反应性全身性淀粉样变性(AA淀粉样变性)、II型糖尿病、注射局限性淀粉样变性、β-2微球蛋白淀粉样变性、遗传性非神经病淀粉样变性和芬兰型遗传性全身性淀粉样变性。

在本发明另一优选的实施方式中，疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、朊病毒病、帕金森病、多系统萎缩、弥漫性路易体病、额颞痴呆、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和其它Poly-Q病、遗传性大脑淀粉样血管病、家族性淀粉样多神经病、原发性全身性淀粉样变性(AL淀粉样变性)、反应性全身性淀粉样变性(AA淀粉样变性)、II型糖尿病、注射局限性淀粉样变性、β-2微球蛋白淀粉样变性、遗传性非神经病性淀粉样变性和芬兰型遗传性全身性淀粉样变性。在更优选的实施方式中，疾病是帕金森病。

在本发明优选的实施方式中，所述朊病毒病选自：克洛伊茨费尔特-雅各布病、变异型克洛伊茨费尔特-雅各布病、遗传的人朊病毒病、牛海绵样脑病(BSE)和瘙痒病。

最后，本发明涉及药盒，其包括在一个或多个容器中的本发明中定义的化合物和另外特异结合到所述化合物的抗体或抗体片段；和/或本发明中定义的单体蛋白或聚集蛋白；和/或任选地与所述化合物复合的本发明中定义的单体蛋白或聚集蛋白，和使用说明书。

通用实验过程

本发明的化合物可以通过任何适用的有机合成方法制备。许多这种方法被阐述在L.F.Tietze，Th.Eicher“Reaktionen und Synthesen″，2.Auflage(Georg Thieme Verlag，Stuttgart，NY，1991)，T.W.Greene，P.G.M.Wuts”Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)″，第三版(John Wiley & Sons，NY，1999)，以及J.March“Advanced OrganicChemistry(高等有机化学)″，第三版(John Wiley & Sons，NY，1985)中。

在下面提供用于制备本发明的化合物的许多示例性方法。这些方法意欲说明这些制备的性质且不意欲限制适用的方法的范围。

通常，对于进行的具体反应反应条件如温度、反应时间、溶剂、后处理(workup)过程以及类似条件将是本领域通用的。引用的文献材料，与其中引用的材料一起包括这些条件的详细说明。通常温度将是-80℃至150℃，溶剂将是非质子的或质子的，且反应时间将是10秒至10天。后处理通常由猝灭任何未反应的试剂接着在水/有机层系统中分配(萃取)和分离包含产物的层组成。

标准的合成方法如使用无水反应条件(例如，惰性气体环境)在本领域是通用的且当适用时被应用。

各个下面的路线的修饰导致下面产生的特定的示例性物质的各种类似物。下面给出的描述合适的有机合成方法的引用适用于这些修饰。

在各个下面的示例性的式中将反应产物彼此分离和/或与起始原料分离可能是有优势的。通过本领域通用的方法将各步骤的期望的产物分离和/或纯化(下文简称分离的)到期望的均匀度。通常这些制备包括多相萃取，从溶剂或溶剂混合物结晶，蒸馏、升华或色谱法。色谱法可以包括任何数目的方法，其包括例如，体积排阻或离子交换色谱法，高、中或低压色谱法，小规模和制备型薄或厚层色谱法以及小规模薄层方法和快速色谱法。

另一类分离方法包括用选择为结合或否则致使可分离的期望的产物，未反应的起始物质，反应副产物或类似物的试剂处理混合物。所述试剂包括吸附剂如活性碳、分子筛、离子交换介质或类似物。可选地，在碱性物质的情况下试剂可以是酸，在酸性物质的情况下试剂可以是碱，试剂可以是结合试剂如抗体，结合蛋白，选择性螯合剂如冠醚，液/液离子萃取或类似。

合适的分离方法的选择取决于涉及的物质的性质。例如，蒸馏和升华中的沸点和分子量，色谱法中存在或不存在极性官能团，多相萃取中物质在酸性和碱性介质中的稳定性，以及类似性质。本领域技术人员将应用尽可能的方法以获得期望的分离。

具体地，本发明的化合物可以这样的方式被制备：其类似于例如在M.Ono等(Bioorganic & Medicinal Chemistry 16(2008)6867-6872)，WO2008/131148、WO 2004/080972、WO 2004/072050和WO 98/17652中公开的过程。在本发明的实施例部分也举例说明了可选的路径。

下面的实施例意欲说明本发明。然而，它们不被解释为限制。

实施例

实施例1：用于抑制蛋白聚集的新类型的化合物的鉴定

商业化合物库DIVERSet(ChemBridge Corp.，San Diego，CA，USA)的两个子集，各包含10,000种化合物且被我们称作DIVERSet 1和2，已经使用2D-SIFT抗朊病毒测定被筛选用于朊病毒繁殖的抑制剂(Bertsch等2005)和朊病毒病的细胞培养物模型。在两种测定中初步击中通过在单一浓度测试化合物被获得并随后在稀释系列中被证实。另外，使用另一细胞系测试细胞培养物击中。

2DSIFT筛选

在高通量和高含量筛选测定中为了测试药物对PrPC和PrPSc之间的缔合的抑制效果，我们应用了“强荧光靶扫描”(Scanning for IntenselyFluorescent Targets，SIFT-)方法，其使用了设置有用于荧光灯的两种颜色的单光子检测器的倒置的双色共焦显微镜。在具有盖玻片底的96-或384-孔微量滴定板中制备样品。测定混合物由重组体小鼠PrP(rPrP)，单克隆抗体(mAb)L42，其不识别小鼠PrP但识别人PrP，和从人CJD脑制备的PrPSc聚集体。rPrP和mAb分子分别用绿色和红色荧光团标记。几个rPrP和mAb分子结合到PrPSc聚集体将导致形成显示许多红色的和绿色的附加荧光团的三元复合物。这些聚集体可以通过SIFT方法被鉴定并分析，因为它们同时在两个荧光通道引起高强度。红色和绿色荧光强度的分布可以通过二维荧光强度矩形图评估。无论何时测定中包含rPrP和PrPSc之间缔合的抑制剂，三元聚集体的绿色荧光强度应当降低。然后2D矩形图中聚集体的颜色分布将变换到那个矩形图的“红色”部分。

20,000种化合物的初步SIFT筛选

将上面描述的测定系统应用到两个库，各包含10,000种不同的药物类化合物(ChemBridge；″DIVERSet1″和″DIVERSet2″)，在96-孔微量滴定板中用于初步筛选，其包括无任何附加化合物的阴性对照和包含17μM DOSPA的阳性对照以及无CJD-杆和化合物的对照(起到检查在抗体和rPrP混合物中不存在聚集体的作用)。

包含DOSPA的样品在监测主要用绿色rPrP标记的聚集体的信号的这些扇区显示减少的SIFT信号。这显示在这些对照中较少的rPrP结合到CJD朊病毒杆上。因为朊病毒杆由红色抗体标记标定，它们的荧光仍在“红色”扇区产生SIFT信号。化合物中的大多数不影响SIFT信号的分布。但是DIVERSet化合物中的一些降低了“绿色”扇区中检测到的聚集体的数目。将这些样品的SIFT曲线向DOSPA对照转移。因此，相应的化合物可以被认作潜在的抗朊病毒药物的初步击中。偶尔一些技术问题产生假象，其使整个显微滴定板的整体测量难以理解。除了这个，仅约7％的未受干扰的测量被处理为逸出值而不适合用于自动的SIFT分析，主要因为测试的化合物的内荧光。这种由SIFT测定不可处理的相当低的百分比的化合物是非预期的，且强调了测定的多样性和稳固性。问题测量和化合物的鉴别通过高含量性质的SIFT测定数据促进。对于各样品同时记录几个荧光参数，像例如各颜色通道的平均荧光强度。在颜色分布的矩形图的各扇区中这些与高强度事件的总数一起被显示。因此具有高内荧光的样品可以容易地被分类。

SIFT初步击中和通过稀释系列确认

对于分类为初步击中的化合物，我们分析了“绿色”扇区1至5中的恒定长度时间间隔(bins)总数并与未处理的对照相比定义了约50％的DOSPA效果的甄别值作为必需的最低效果。DIVERSet化合物被指定来自SIFT筛选数据的标量SIFT-活性值(tp1_sift)，其表征它们对朊病毒聚集的抑制效果，如Bertsch等2005所描述。小于零的活性值反映无抑制效果，而大于零的值反映抑制效果。在此，约一的值表示与给定的板上的阳性对照测量一样大的抑制效果。

在SIFT测定中使用各化合物的双重六点稀释系列(0.1-100μM)检查初步击中对PrPC-PrPSc缔合的剂量依赖抑制。剂量反应曲线证实了这些化合物的浓度依赖抑制活性。与17μM DOSPA的效果相比，在0.3至60μM的范围内的EC50值观测到rPrP与朊病毒杆的结合的半最大抑制。

细胞培养物初步击中和通过稀释系列确认

除了SIFT测定，DIVERSet库也在朊病毒疾病的细胞培养物模型中被筛选。在这些测定中，DIVERSet化合物的抗朊病毒活性开始在20μM的浓度被测试。通过二进制变量(tp3_reduktion)将初步细胞培养物筛选的结果(在20μM对SMB细胞)编码，其中″1.0″值编码为″活性的″且″0.0″编码为″无活性的″。验证在初步筛选中鉴定的活性化合物，其中目标是鉴定甚至在非常低的浓度为活性的化合物。对于DIVERSet 1初步细胞培养物击中的验证在四种浓度(1μM、4μM、10μM、40μM)的稀释系列中进行且对于DIVERSet 2仅在两种浓度(0.2μM、2μM)中进行。通过″1.0″为在1μM(DS1)或在0.2μM(DS2)活性的和通过″0.5″为在2μM(DS2)活性的表示结果(tp3_reduktion_mue)。在高于20μM的浓度无活性的化合物通过″0.0″(DS1+2)表示。另外，初步SMB细胞培养物击中在ScN2a细胞上以单个浓度(tp3_scn2a)被验证，其中再次″0.0″和″1.0″分别表示无活性的和活性的化合物。

作为新的抗朊病毒化合物的二苯基吡唑(DPP)和相关的化合物

SAR-地图的产生

使用软件包Benchware HTS DataMiner(DM；Tripos Inc.，St.Louis，MO，USA)使在初步细胞培养物筛选中表征为″活性″DIVERSet化合物接受聚类分析，产生图1中显示的SAR-地图。因为对于使用DataMiner聚类分析两个库中包含的化合物的大数量(20,000)作为起始点太大，该分析开始限于DIVERSet 1和2的细胞培养物筛选的初步击中(837种化合物)。因此，仅对活性化合物确定聚类。此处，DM程序将结构上相似和活性的化合物分成聚类，并因此适合鉴定潜在的相关的新的先导结构。在第二步骤中，将由此建立的分类应用到包括在细胞培养物中无活性的化合物的剩余的库。在这里，如果使用的测量显示高的结构相似性，DM程序添加进一步的(无活性的)化合物到产生的聚类中。

聚类分析的结果由DateMiner以SAR-地图的形式被图形显示，其中物质聚类S由符号表示。DM排列符号以致如果表示的聚类是结构类似的，它们在位置上更接近。符号的大小、形式和颜色基于聚类特异的性质被分配，其可以由使用者选择。

因此，选择的是：符号的大小与聚类/S/的大小即与其中包含的化合物C的数目相称。基于那些物质C在相应的聚类S中的部分

$P_{\mathrm{SIFT}}\left(S\right)=\frac{\left|\right\{C\∈S|a\left(C\right)\≥a_{\min }\}|}{\left|S\right|}$

确定符号的形式，SIFT筛选中确定的其初步活性a(C)高于选择的阈值a_min＝0.25。因此，部分P_SIFT(S)高于50％的聚类被显示为星形，其中剩余的主要无活性的聚类被显示为方形。类似地，符号的颜色根据细胞培养物筛选的初步击中编码聚类的部分

其中具有多于50％的活性物质的聚类的符号是红色且剩余是灰色。图1显示由上面描述的聚类聚类分析产生的SAR-地图。大的红色星形象征具有高比例的SIFT-和细胞培养物阳性物质的聚类。这些聚类表示潜在的先导结构。使用DataMiner，将受关注的聚类进一步分析且五个相邻聚类的组被鉴定(称为DPP_1至DPP_5)，其在图1中以粗体显示。分成这些聚类的所有化合物与它们在各种测定中的活性一起在图2中被显示。这些聚类位于相互靠近关系的事实显示它们包含在结构上相似的物质，即它们全属于3，5-二苯基-吡唑(DPP)衍生物的化学化合物类(参见图1中显示的DPP基序)。

实施例2：在药物化学方面用于抑制聚集的新药的合成

基于上面描述的新的先导结构的开发，如以下概述，许多进一步的物质通过不同取代基的选择性取代被合成。

方案1异噁唑的合成

(E)-1-(3，4-二甲氧基苯)-3-(3-氟苯基)-2-2-丙烯基-1-酮(1)[Nam等，2004]

将3，4-二甲氧基苯乙酮(1.8g，10mmol)、3-氟苯甲醛(1.24g，10mmol)、氢氧化钠(50mg，1.25mmol)和八水氢氧化钡(100mg，0.32mmol)在甲醇(10ml)中的溶液在室温搅拌24小时。将反应冷却至4℃，将产生的沉淀通过过滤收集，从甲醇中重结晶并干燥得到黄色粉末状1(1.65g，58％)。

2，3二溴-1-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(3-氟苯基)-丙-1-酮(2)[Harris等，1977]

在0℃向1(715mg，2.5mmol)在氯仿(11ml)中的溶液滴加溴(400mg，2.5mmol)在氯仿(4ml)中的溶液。在0℃搅拌2小时后，将反应用石油醚(20ml)稀释并将混合物冷冻(-24℃)10小时，将产生的沉淀通过过滤收集，使用正己烷(10ml)洗涤并干燥得到白色粉末状2(780mg，70％)。

3-(3，4-二氧苯基)-5-(3-氟苯基)异噁唑(3)[Harris等，1977]

将2(450mg，1mmol)在乙醇(6ml)中的溶液用羟基胺盐酸盐(306mg，4.4mmol)处理随后用氢氧化钠(460mg，11.5mmol)在水(1.5ml)中的溶液处理。将混合物加热回流2小时，冷却，用水(3ml)处理。冷冻(4℃)过夜之后，通过过滤收集产物，用水(5ml)洗涤并干燥得到白色粉末状3(180mg，60％)。

3-(3，4-二羟基苯基)-5-(3-氟苯基)异噁唑(4)[Vanelle等，2000]

将3(100mg，0.33mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液冷却至-78℃，用三溴化硼(0.16ml，1.7mmol)处理，在-78℃搅拌3小时然后在室温过夜。将混合物冷却至-78℃并用甲醇(5ml)猝灭。室温搅拌3小时后，将溶剂在减压下蒸发，将残余物与甲醇(10ml)共蒸发4次。将产生的沉淀在5ml氯仿中回流，冷却后，将产物通过过滤收集并干燥得到白色粉末状4(60mg，67％)。

方案2：吡唑的合成

1，3-双(3，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二酮(5)[Anselme，1967]

将60％的氢化钠在矿物油中的悬浮液(0.4g，10mmol)用石油醚(20ml)洗涤2次，加入无水DMSO(10ml)。在氩气下在室温搅拌30分钟后，加入THF(5ml)，将烧瓶冷却至15℃并加入3，4-二甲氧基苯甲酸乙酯(2.1g，10mmol)。允许温度下降至10℃并将3，4-二甲氧基苯乙酮(1.08g，6mmol)在DMSO(4ml)中的溶液以使温度不上升至高于15℃的速度加入。滴加完毕将反应混合物在室温搅拌72小时，然后缓慢地倒入含有85％磷酸(1ml)的碎冰(250g)中。将产生的沉淀通过过滤收集，用水(50ml)洗涤并干燥得到黄色粉末状5(2.1g，99％)。

3，5-双(3，4-二甲氧基苯基)吡唑(6)[Hauser等，1957]

将5(1.0g，2.9mmol)和水合肼(218mg，4.4mmol)在乙醇(15ml)中的溶液伴随搅拌加热回流3小时。在减压下将澄清的黄色溶液蒸发，加水并将产生的沉淀通过过滤收集，用水洗并干燥得到黄色粉末状6(960mg，97％)。

3，5-双(3，4-二羟基苯基)吡唑溴化氢(7)[Vanelle等，2000]

将6(120mg，0.35mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液冷却至-78℃，用三溴化硼(0.34ml，3.5mmol)处理，在-78℃搅拌3小时然后在室温过夜。将混合物冷却至-78℃并用甲醇(5ml)猝灭。在室温下搅拌3小时后，在减压下蒸发溶剂，将残余物用甲醇(10ml)共蒸发4次。将产生的沉淀用5ml氯仿回流，冷却后，将产物通过过滤收集并干燥得到黄色粉末状7(108mg，85％)。

1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(3-溴苯基)-丙-1，3-二酮(21)[Anselme，1967]

1.过程

在一个干燥的500ml三颈烧瓶中安装

涂层的磁力搅拌棒、橡胶隔片、温度计和其上附加与纯氮气源连接的T型管的回流冷凝管。T型管另一接口连接鼓泡装置以致观察通过反应的氮气流速。排列装置以致烧瓶可以间歇地用水浴冷却。在反应容器中充满氮气后，在反应容器中保持静态的氮气气氛用于剩余的反应。向烧瓶充入约60％的氢化钠(5g，0.125mmol)在矿物油中的悬浮液(见注释1)。将矿物油用40/60的石油醚(3×40ml)从氢化物洗去(注释2)。使用鲁尔锁皮下注射器以及不锈钢针头穿过橡胶隔片插入，将上层石油醚移除。将残余的氢化钠与80ml的二甲亚砜混合(注释3)，用恒压滴液漏斗替代橡胶隔层。将16.4g(0.1摩尔)的1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)乙酮(注释4)和26.9g(0.125摩尔)的3-溴苯甲酸甲酯(注释5)在60ml的二甲亚砜中的溶液放入滴液漏斗。将漏斗塞住，开始搅拌，将烧瓶内容物在水浴中冷却至15℃。缓慢滴加1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)乙酮和3-溴苯甲酸甲酯溶液，以保证氢气放出维持在可控的速率，并且温度经60分钟期间不上升至高于20℃(注释6)。滴加完毕后，移去水浴并将反应在室温下(23℃)搅拌15小时。搅拌下，将产生的红棕色均相反应混合物缓慢地倒入含有5ml的85％正磷酸(注释7)的500ml冰水混合物中。搅拌1小时后，通过过滤除去产物(注释8)，用水(2×100ml)抽滤洗涤，在40度真空干燥6小时至恒重，得到33.4g粗产物(注释9)。用200ml的99.9％的乙醇和200ml乙酸乙酯重结晶(注释10)，在40度真空干燥6小时至恒重，得到28.5g(82％)纯的(注释11)1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(3-溴苯基)-丙-1，3-二酮，熔点：136-137℃。将滤液在减压下浓缩至约30ml体积，在滤器上收集分离的结晶状固体，通过抽滤用乙醇(2×10ml)洗涤，在40度真空干燥6小时至恒重，得到另外的收获3.15g粗产品。将粗产品从20ml的99.9％的乙醇和20ml的乙酸乙酯重结晶，在40度真空干燥6小时至恒重，得到另外的收获1.8g(5％收率)纯的1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(3-溴苯基)-丙-1，3-二酮(注释12)。产物总收率是30.3g(87％)。

2.注释

1.使用氢化钠，57-63％的油悬浮液，订单号13431，获自Alfa AesarGmbH & Co KG，Karlsruhe。

2.使用分析用优级纯(GR for analysis)石油醚，沸程40-60℃，订单号101775，来自Merck KGaA，Darmstadt。

3.使用分析用优级纯二甲亚砜，订单号102952，来自Merck KGaA，Darmstadt，未经纯化。

4.使用1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)乙酮，98％，订单号A13597获自Alfa Aesar GmbH & Co KG，Karlsruhe。

5.使用3-溴苯甲酸甲酯，98％+，订单号A16174获自Alfa AesarGmbH & Co KG，Karlsruhe。

6.在滴加溶液过程中观察到发泡。在放大时可能需要机械搅拌器或阻泡剂如聚乙二醇二甲醚。

7.使用正磷酸85％(w/w)水溶液，分析用优级纯，订单号100573，获自Merck KGaA，Darmstadt。

8.反应混合物pH值为pH＝7。通过用另外的15ml正磷酸酸化至pH＝2，可以获得1.3g的3-溴苯甲酸。

9.通过HPLC确定的产品纯度为96.3％。

10.使用无水乙醇，99.9％，分析用优级纯，订单号100983，乙酸乙酯，分析用优级纯，订单号109623，获自Merck KGaA，Darmstadt。

11.通过HPLC确定的产品纯度为99.3％。分析型HPLC通过使用具有Waters 996光电二极管阵列检测器的Waters HPLC系统进行。所有的分离涉及0.1％v/v的三氟乙酸(TFA)在水(溶剂A)中的溶液和0.1％v/v TFA在乙腈(溶剂B)中的溶液的流动相，通过使用反相(RP)柱，Eurospher RP18,100

5微米，250×4.6毫米，流速1ml/分钟。化合物以1mg/ml的浓度溶于HPLC用优级纯(GR for HPLC)乙腈。保留时间(RT)20.9和10.3分的峰分别是ANLE 138A的烯醇和酮形式。将分别收集的峰20.9或10.3分再注入再次得到同样RT的两个峰。

12.通过HPLC确定的产品纯度为98.4％。

3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑(22)[Hauser等，1957]

1.过程

在安装涂层的磁力搅拌棒、回流冷凝管、和电加热套的500ml圆底烧瓶内加入28.4g(81.8mmol)1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(3-溴苯基)丙-1，3-二酮(注释1)和200ml的正丁醇(注释2)混合物。开始搅拌并加热，在固体溶解后加入6ml(6.2g，123.4mmol)的一水合肼(注释3)，并在搅拌下将反应混合物加热回流4小时。将反应混合物冷却至20℃，在0℃保存1小时，然后通过抽滤收集分离的产物。用水(100ml)洗涤并在40℃在真空中干燥36小时至恒重，得到26.8g(95％)的3-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基-5-(3-溴苯基)-1H-吡唑(注释4)熔点195-197℃。

2.注释

1.1-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-3-(3-溴苯基)丙-1，3-二酮是按照用于ANLE 138A的实验方案制备的。

2.使用正丁醇，99.4％GR“贝克分析”，订单号8017，获自J.T.Baker B.V.，Deventer，Holland。

3.使用一水合肼GR purum，订单号53850，获自Sigma-Aldrich ChemieGmbH，Taufkirchen。

4.通过HPLC确定的产品纯度是99.3％。分析型HPLC通过使用带有Waters 996光电二极管阵列检测器的Waters HPLC系统进行。所有的分离涉及0.1％v/v的三氟乙酸(TFA)在水(溶剂A)中的溶液和0.1％v/v TFA在乙腈(溶剂B)中的溶液的流动相，通过使用反相(RP)柱，Eurospher RP18,100

5微米，250×4.6毫米，流速1ml/分钟。化合物以1mg/ml的浓度溶于HPLC用优级纯(GR for HPLC)乙腈。

方案3：咪唑的合成

4-(3，4-二甲氧基苯基)-2-苯基咪唑(8)[Li等，2000]

将苄脒盐酸盐(313mg，2mmol)和碳酸氢钠(672mg，8mmol)在THF(6ml)和水(1.5ml)中的混合物在回流下加热。将α-溴-3，4-二甲氧基苯乙酮(518mg，2mmol)在THF(1.5ml)中的溶液在30分钟期间内加入同时将反应保持在回流下。加入之后，将反应加热回流2小时，在减压下蒸发THF。向混合物加入乙酸乙酯(20ml)，分离有机相，用盐水(5ml)洗涤，用硫酸钠干燥并在减压下蒸发，将产生的粗产物在硅胶上通过柱色谱法纯化(氯仿/甲醇100∶1)得到固体状8(470mg，84％)。

4-(3，4-二羟基苯基)-2-苯基咪唑溴化氢(9)[Vanelle等，2000]

将8(190mg，0.68mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液冷却至-78℃，用三溴化硼(0.32ml，3.4mmol)处理，在-78℃搅拌3小时，然后在室温过夜。将混合物冷却至-78℃并用甲醇(5ml)猝灭。在室温下搅拌3h后在减压下蒸发溶剂，将残余物用甲醇(10ml)共蒸发4次。将产生的沉淀在5ml氯仿中回流，冷却后，通过过滤收集产物并干燥得到粉末状9(192mg，85％)。

方案4：吡咯的合成

(E)-1-苯基-3-(3，4-二甲氧基苯基)-2-丙烯基-1-酮(10)

化合物10按照制备1的所述的过程制备得到，收率90％。

3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-硝基-1-苯基丁-1-酮(11)[Hall等，2005]

将10(774mg，2.9mmol)在甲醇(30ml)中的溶液用二乙胺(1.55ml，15mmol)和硝基甲烷(0.81ml，15mmol)处理，并在回流下加热24小时。将溶液冷却，在二氯甲烷(60ml)和水(50ml)之间分配并用1M的盐酸酸化。分离有机层，水相用二氯甲烷(20ml)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水(50ml)洗涤，用硫酸钠干燥。将溶剂在减压下除去，并将产生的油状物在硅胶上通过柱色谱法纯化(正己烷/乙酸乙酯3∶2)得到固体状11(780mg，82％)。

4-(3，4-二甲氧基苯基)-1-苯基吡咯(12)[Hall等，2005]

将11(400mg，1.22mmol)在甲醇(13ml)和THF(26ml)中的搅拌溶液在室温用氢氧化钾(343mg，6.1mmol)处理。1h之后，在0℃将反应混合物滴加到硫酸(2.44ml)在甲醇(13ml)中的溶液并在室温搅拌1h。加入水(20ml)和冰(20ml)，且将混合物用含水的1M氢氧化钠中和并用二氯甲烷(2×50ml)萃取。将合并的有机部分用盐水(25ml)洗涤，在硫酸钠上干燥并在减压下蒸发。将产生的油用乙酸(8ml)和氯化铵(470mg)处理，并将溶液在100℃加热1h。将反应混合物冷却，加入冰(50ml)，并将混合物用1M氢氧化钠中和。将溶液用二氯甲烷(2×50ml)萃取。将合并的有机部分用盐水(25ml)洗涤，在硫酸钠上干燥并在减压下蒸发。通过柱色谱法在硅胶上纯化产物(正己烷/乙酸乙酯3∶1)且然后从正己烷/乙酸乙酯(2∶1)的混合物重结晶得到固体状12(150mg，44％)。

4-(3，4-二羟基苯基)-1-苯基吡咯(13)[Vanelle等，2000]

将12(80mg，0.29mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液冷却至-78℃，用三溴化硼(0.13ml，1.4mmol)处理，在-78℃搅拌3h且然后在室温过夜。将混合物冷却至-78℃并用甲醇(5ml)猝灭。在室温搅拌3h之后在减压下蒸发溶剂，将残余物用甲醇(10ml)共蒸发四次。将产生的粗产物通过柱色谱法在硅胶上纯化(氯仿/甲醇95∶5)且然后用几滴乙腈从氯仿中重结晶以得到固体状13(36mg，50％)。

方案5：吡唑啉的合成

3-(3，4-二甲氧基苯基)-5-(3-氟苯基)-4，5-二氢-1H-吡唑(14)

伴随搅拌将1(57mg，0.2mmol)和水合肼(0.5ml，10mmol)在水(0.14ml)中的悬浮液加热至100℃持续1.5小时。将反应混合物冷却，加入水(0.2ml)并通过过滤收集产生的沉淀，用水洗涤并干燥得到得到白色固体状14(37mg，62％)。

方案6：N-乙酰基吡唑啉的合成

(E)-1-(3，4-亚甲基二氧基苯基)-3-苯基-2-丙烯基-1-酮(15)

化合物15按照制备1的过程制备得到。产率64％。

1-乙酰基-3-(3，4-亚甲基二氧基苯基)-5-苯基-4，5-二氢吡唑(16)[Chimenti等，2004]

伴随搅拌将15(504mg，2mmol)和无水肼(250mg，5mmol)在乙酸(12ml)中的溶液在120℃加热24小时。将反应混合物冷却，加入冷水(40ml)并将产生的沉淀通过过滤收集，从乙醇重结晶并干燥得到白色固体状16(458mg，74％)。

1-乙酰基-3-(3，4-二羟基苯基)-5-苯基-4，5-二氢吡唑(17)[Vanelle等，2000]

将17(70mg，0.23mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液冷却至-78℃，用三溴化硼(0.11ml，1.16mmol)处理，在-78℃搅拌3小时，然后室温过夜。将混合物冷却至-78℃并加入甲醇(5ml)猝灭。室温下搅拌3小时后，将溶剂在减压下蒸发，将残余物用甲醇(10ml)共蒸发4次。将产生的粗产物在硅胶上通过柱色谱法纯化(正己烷/乙酸乙酯1∶1)以得到固体状17(25mg，37％)。

方案7：1，2，4-噁二唑的合成

3，4-二甲氧基二甲氧基苯甲酰胺肟(18)[Chalquest，2001]

将3，4-二甲氧基苄腈(4.0g，24.5mmol)、羟基胺盐酸盐(2.0g，28.8mmol)、N，N-二异丙基乙胺(5.0ml，29.2mmol)在乙醇(70ml)中的溶液在室温下搅拌48小时。在减压下将乙醇蒸发，加入冷水(60ml)并通过过滤收集产生的沉淀并干燥得到白色粉末状18(3.4g，71％)。

3，5-双(3，4-二甲氧基苯基)-1，2，4-噁二唑(19)[Korbonits，1982]

向18(700mg，3.57mmol)和3，4-二甲氧基苯甲酸乙酯(834mg，3.97mmol)在乙醇(12ml)中的溶液加入叔丁醇钾(425mg，3.79mmol)并将反应混合物在回流下加热12h。将混合物冷却并将沉淀通过过滤收集，用热乙醇洗涤并干燥得到白色粉末状19(540mg，44％)。

3，5-双(3，4-二羟基苯基)-1，2，4-噁二唑溴化氢(20)[Vanelle等，2000]

将19(220mg，0.64mmol)在二氯甲烷(6ml)中的溶液冷却至-78℃，用三溴化硼处理(0.59ml，6.1mmol)，在-78℃搅拌3h且然后在室温过夜。将混合物冷却至-78℃并用甲醇(5ml)猝灭。在室温搅拌3h之后在减压下蒸发溶剂，将残余物用甲醇(10ml)共蒸发四次。将产生的沉淀在5ml氯仿中回流，冷却之后将产物通过过滤收集并干燥得到粉末状20(190mg，81％)。

上面的实施例代表如何合成或衍生化期望的化合物的实例。相应地合成图3中显示的剩余化合物。这些化学合成的物质，与初始筛选选择的物质一起，接受进一步的测试，包括SIFT测定，基于细胞培养物的测定，小鼠体内实验以及涉及α-共核蛋白聚集的生物化学测定(参见以下)。图3中提供了测试的物质的列表。

实施例3：使用的材料和方法

化合物库

筛选的库各包含10,000种化合物且被我们称作DIVERSet1和DIVERSet2，因为它们仅涵盖更大的DIVERSet库的一部分(ChemBridgeCorp.，San Diego，CA)。DIVERSet是合理地选择的、多样的、药物类小分子的集合。在二甲亚砜(DMSO)溶液中和96-孔微量滴定板上提供化合物。包含各化合物的分子结构和一些物理化学数据的数据库在www.chembridge.com是可获得的。

重组体小鼠PrP 23-231的产生

基本上如Liemann等(1998)描述产生并纯化重组体PrP 23-231，除了对于小鼠PrP23-231，对细菌表达，BL21DE3 RIL大肠杆菌(E.coli)细胞(Novagen)用质粒pET17b-MmPrP23-231WT31转化。同样，将细菌培养到0.5的光密度，之后通过加入1mM IPTG诱导蛋白产生且两小时后收获细胞。通过加入0.5％Triton X-100到裂解缓冲液中并在37℃孵育30min而不是使用费氏细胞压碎器(French press)将细菌裂解。此外，将凝胶过滤用镍螯合亲和色谱法步骤代替。重折叠之后的最后的阳离子交换色谱法步骤也被省略。

具体地，由离子交换色谱法的重提纯的PrP遭受描述的氧化且氧化通过加入0.1mM EDTA并调节pH至约6终止。加入0.1mM NiCl2之后，根据生产商的建议将多达50mg的PrP应用到2mL的预装有NiCl2的螯合琼脂糖凝胶(Pharmacia)上，并用缓冲液A(8M尿素，10mM MOPS pH7.0)预平衡。通过连续地颠倒混合物，将PrP结合到Ni螯合基质上在室温进行至少3h。将基质转移到polyprep-柱(BioRad)并从溢流道(flow through)排出。将柱用5mL缓冲液B(8M尿素，10mM MOPS pH7.0，500mM NaCl)洗涤两次且然后连续地用6次5mL缓冲液D(7.2M尿素，10mM MOPS pH 7.0，150mM NaCl，50mM咪唑)洗脱。将含有纯化的PrP的级分汇集，用centriprep装置浓缩并最后稀释1∶50用于重折叠至10mM MES pH 6.0中。

抗体和重组体PrP的荧光标记

根据制造商的手册，将L42单克隆抗体(r-biopharm，Darmstadt，Germany)用Alexa Fluor 647(Alexa-647；Invitrogen，Eugene)标记。将重组体小鼠PrP 23，231用Alexa Fluor 488(Alexa-488；Invitrogen，Eugene)在20mM磷酸钾缓冲液，pH 6，0.1％Nonidet P40，40mM碳酸氢钠缓冲液，pH 8,3中标记。未结合的荧光团通过在PD10柱上(GE Healthcare，Freiburg，Germany)凝胶过滤分离，所述PD10柱用20mM磷酸钾缓冲液，pH 6，0.1％Nonidet P40平衡。标记反应的质量控制和比率通过荧光相关光谱(fluorescence correlation spectroscopy，FCS)测量方法在Insight Reader(Evotec Technologies，Hamburg，Germany)上进行。标记比率是约1,3荧光团每rPrP分子。

PrPC-PrPSc缔合的测定

从CJD患者的脑根据Safar等(Safar等(1998))制备PrPSc且将再悬浮在1xPBS+0.1％十二烷基肌氨酸钠溶液的最终片状沉淀物的等份稀释五倍至缓冲液A(20mM磷酸钾缓冲液pH 6.0，0.1％Nonidet P40)中并在水浴超声仪中超声处理60s。在1000rpm离心1min之后，将上清液在缓冲液A中稀释100倍用于测定。

标记的小鼠rPrP和标记的L42单克隆抗体的混合物在20mM磷酸钾缓冲液，pH 6，0.1％Nonidet P40中被制备以致标记的分子以2-6nM约同样地丰富。在20μL的测定容积中混合8μL的rPrP/抗体混合物、2μL化合物和10μL的稀释的PrPSc制品。将样品装载到具有盖玻片底的96-孔板上(Evotec-Technologies，Hamburg，Germany)且在Insight Reader上测量。

单粒子测量和分析

对于488nm激光在200μW的激发能量和对于633nm激光在300μW的激发能量进行FIDA测量。将扫描参数设置在100μm扫描径长，50Hz的束扫描器频率和2000μm的定位台运动(positioning table movement)。测量时间是10s。来自两个荧光团的荧光用单光子检测器单独记录且经恒定长度时间间隔(bins)使用40μs的时仓长度(bin length)总计光子。将红色和绿色荧光光子计数的数目测定并在二维强度分布矩形图中分析，如前面所述(Bieschke等，2000)。

通过概括扇区中高强度恒定长度时间间隔(bins)，使用2D-SIFT软件模块(Evotec-Technologies，Hamburg，Germany)评价荧光强度数据。对于各测量系列时仓强度(bin intensities)的甄别阈根据对照测量被手动调节。

实施例4：新的潜在的抗朊病毒化合物在感染后第80天在瘙痒病感染的小鼠中的治疗应用为了证明那些新的潜在的抗朊病毒化合物在对抗可传染的海绵状脑病(TSE)或朊病毒病中的效果进行动物实验，其中在SIFT和/或瘙痒病细胞培养物测定中具有抗朊病毒活性的化合物被用于治疗在潜伏期的晚期的感染瘙痒病的RML毒株的小鼠。我们选择在感染后第80天以14天时间间隔腹腔内应用化合物，因为这通常是当最初的亚临床症状出现在感染这一朊病毒毒株的动物中的时间。这将对应于显示疾病的最初症状的TSE感染的人类将实际上接受治疗性治疗的最早时间。通过选择这种用于治疗的非常严格的条件，我们期望评价测试的化合物作为实际环境中朊病毒治疗剂的功能性。通常，TSE治疗剂迄今为止仅被用于在动物实验中测试接触后的预防，其中它们在大约感染朊病毒的时间被应用。在真实生活中存在仅非常罕见的其中这种治疗方案可行的用于TSE感染的个体的机会。对于家族性性病例和散布病例(其是绝大多数)大多数TSE患者感染时间或潜伏时间的开始是未知的且不能被认识到。因此TSE患者的大多数将仅能够在TSE的最初症状发生之后接受治疗。

实验过程：

通过脑内注射在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的来自末期患有RML瘙痒病-毒株的小鼠的30μL的1％无菌脑匀浆，将6-7周龄、雌性C57B16小鼠接种RML瘙痒病。在感染后第80天，这些小鼠用选择的新的潜在的抗朊病毒-化合物治疗或用媒介物二甲亚砜(DMSO)水溶液治疗。根据它们在细胞培养物模型中用于这一治疗的抗朊病毒活性已经选择了五种潜在的抗朊病毒-化合物，其根据在Diverset化合物库(Chembridge Corp.，San Diego，USA)中板位置被指定为10353F11和anle138b、anle143b、sery106以及sery149。每天通过腹腔内注射50μL在媒介物(DMSO)中的化合物10353F11稀释、在媒介物(DMSO)中的其它化合物各25μL，用这些化合物的治疗被进行14个连续天。化合物10353F11以10mM的浓度被使用且对于化合物anle138b、anle143b、sery106和sery149 100mM贯穿整个期间被注射。从感染后的第80天由训练动物的管理人每天监测动物的病征。当它们已经到达由临床症状表示的疾病的终末期将动物处死，所述症状是运动失调、震颤、从平躺位置立起(righting up)困难和尾部僵硬且是垂死的。通常疾病进展至疾病的终末期将导致一天或两天之内动物死亡。来自被处死的动物的一个半球和一半脾脏在-80℃被新鲜冷冻用于蛋白印迹分析，而第二个半球和第二半脾脏以及所有内部器官被固定在4％的甲醛溶液中用于(免疫)组织学。

结果

如图4所示，对于10353F11(图4A)与anle138b和sery149(图4B)，已经被脑内感染RML瘙痒病毒株的小鼠在潜伏期的晚期(感染后第80天)通过每天腹腔内应用选择的潜在的抗朊病毒药物的治疗致成潜伏期延长，直到到达瘙痒病感染的终末期。与接受仅媒介物100％DMSO的十二只动物的组相比，化合物anle138b和sery149用于各七只和八只动物的组确定的平均存活时间分别被延长14.9和11.5天。与相同的DMSO-对照组相比，化合物sery106和anle143b在八只受治疗的动物的组中存活时间的延长低于统计显著性水平。与对照组相比，为八只动物组确定的化合物10353F11的存活时间各被延长11天。实验中观测的存活时间延长大致符合治疗持续时间。这可能意味着只要施用药物，用这些药物的治疗停止疾病进展。在这种情况下用这些药物治疗将导致TSE感染的个体的生命的延长且通过停止疾病进展导致它们的健康状况的稳定保护其远离进一步的恶化。

实施例5：腹腔内注射之后潜在的抗朊病毒-化合物在瘙痒病感染的小鼠中的治疗性应用

为了证明这些新的抗朊病毒-化合物在瘙痒病中对抗可传染的海绵状脑病(TSE)或朊病毒疾病的效果进行其他动物实验。对于这种实验小鼠被腹腔内感染RML瘙痒病且用化合物anle138b治疗，其已经在用于朊病毒疾病的晚期的动物模型中证明其抗朊病毒活性(实施例4)。我们选择了组合腹腔内应用和口服应用化合物且在感染后开始治疗。

实验过程：

小鼠的瘙痒病感染和治疗

通过腹腔内接种在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的来自末期患有RML瘙痒病-毒株的小鼠的100μL的1％无菌脑匀浆，将6-7周龄、雌性C57B16小鼠接种RML瘙痒病。刚感染后开始将这些小鼠用化合物anle138b或用媒介物二甲亚砜(DMSO)水溶液治疗。通过每天腹腔内注射25μL在媒介物(DMSO)中稀释的化合物，经口服强饲法随后4和5天每天口服施用在植物油/DMSO混合物中的50μL化合物(图5A)，用这一化合物治疗被进行14个连续天。在100mM的浓度使用化合物anle138b用于腹腔内应用，对于口服施用，使用50mg/kg。在感染后第35天，当在腹腔内感染的小鼠的脾脏中PrPSc是可清楚地检测的时候，将动物处死。来自被处死的动物的一半脾脏在-80℃被新鲜冷冻用于蛋白印迹分析，而第二半脾脏以及所有内部器官被固定在4％的甲醛溶液中用于免疫组织学。

PET印迹

按照Brown等1990的实验设计，将甲醛固定的脑组织切成2-mm厚的组织块，在浓甲酸中去污1小时，在4％磷酸盐缓冲的盐水缓冲的甲醛中后固定48小时，并在石蜡中包埋。将切片(5-7μm)在切片机上切割，放置进入水浴(55℃)中，在预湿的0.45μm孔硝基纤维素膜(Bio-Rad，Richmond，CA)上收集并在55℃干燥至少30分钟。将硝基纤维素膜用二甲苯去石蜡。用异丙醇代替二甲苯，之后逐步再水合。在0.1％的最终浓度在蒸馏H₂O中将吐温20加到最后的再水合步骤中。将膜干燥并贮存在室温数月而无随后PrPSc染色的质量损失。

用TBST(10mmol/L Tris-HCl，pH 7.8；100mmol/L NaCl；0.05％吐温20)预湿之后，在55℃用250μg/ml蛋白酶K(Boehringer)在PK-缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH 7.8；100mmol/L NaCl；0.1％Brij 35)中进行消化持续8小时。用这一步骤膜粘附蛋白被固定到膜上。用TBST洗涤三次之后，用3mol/L异硫氰酸胍在10mmol/L Tris-HCl(pH 7.8)中持续10分钟使膜上的蛋白变性。将胍用TBST洗去三次。在封闭溶液(在TBST中的0.2％酪蛋白)中预孵化持续30分钟之后进行免疫检测。作为初级抗体，抗重组体小鼠PrP的多克隆兔抗体，指定为CDC1，在抗体稀释剂溶液(Ventana)中以1∶500的稀释被使用。孵育持续至少1小时。在TBST中洗涤三次之后，用碱性磷酸酶偶合的兔抗小鼠抗体(Dako，Hamburg)在1∶500的稀释度进行孵育至少1小时。在TBST持续10分钟五次洗涤之后，通过在NTM(100mmol/L Tris-HCl，pH 9.5；100mmol/L NaCl；50mmol/L MgCl₂)中持续5分钟孵化两次将膜调节成碱性pH。使用NBT/BCIP通过甲月替(formazan)反应提供抗体反应的目测法。用奥林巴斯解剖显微镜评价印迹。

结果

在药物治疗的小鼠和媒介物治疗的小鼠死亡之后提取的脾脏组织被免疫组织化学染色用于PrPSc沉着物的存在和用于以免疫印迹分析脾的PrPSc水平。如图5B中显示与媒介物治疗的小鼠相比，治疗的动物的脾的PrPSc水平显著下降。来自感染的小鼠的脾脏组织的检测显示用化合物anle138b治疗之后PrPSc沉着物被减少。具有较低的PrPSc沉着物的脾脏百分比增加且较强的PrPSc沉着物减少(图5C)。在(图5D)中显示的是两个PET印迹、PrPSc沉着物的实例。通过选择的实验设置和治疗方案，结果显示这一化合物在外周组织中的清楚的抗朊病毒功效。

实施例6：新的抗朊病毒化合物在感染后第80天在瘙痒病感染的小鼠中的治疗应用

为了证明来自实施例4的观察结果：存活时间延迟符合治疗持续时间，进行动物实验，其中以更高的剂量和更长的持续时间施用化合物以治疗在潜伏期晚期的感染瘙痒病的RML毒株的小鼠。我们选择在感染后第80天组合腹腔内应用和口服应用化合物，因为这通常是当最初的亚临床症状出现在感染这一朊病毒毒株的动物中的时间。

实验过程：

通过脑内注射在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的来自末期患有RML瘙痒病-毒株的小鼠的30μL的1％无菌脑匀浆，将6-7周龄、雌性C57Bl6小鼠接种RML瘙痒病。这些小鼠在感染后第80天用新的抗朊病毒-化合物或用媒介物DMSO治疗。使用两种潜在的抗朊病毒-化合物anle138b和anle186b。通过每天腹腔内注射25μL在媒介物DMSO中稀释的化合物，随后经口服强饲法持续5天每天两次口服施用在植物油/DMSO混合物中的50μL化合物(图6A)，用这些化合物治疗被进行14个连续天。在3只对照小鼠和2只用anle138b治疗的小鼠中，从第109天至第136天通过提供混合有DMSO/化合物原液的花生酱食物丸另外口服给予化合物。在100mM的浓度使用化合物用于腹腔内应用，对于口服施用，使用50mg/kg。在显示的时间点各治疗组四只动物被处死(图6A)。从感染后的第80天由训练动物的管理人每天监测各治疗组八只动物的病征。当它们已经到达由临床症状表示的疾病的终末期将动物处死，所述症状是运动失调、震颤、从平躺位置立起困难和尾部僵硬且是垂死的。通常疾病进展至疾病的终末期将导致一天或两天之内动物死亡。来自被处死的动物的一个半球和一半脾脏在-80℃被新鲜冷冻用于蛋白印迹分析，而第二个半球和第二半脾脏以及所有内部器官被固定在4％的甲醛溶液中用于组织学。

结果

感染后脑匀浆中PrPSc水平和凋亡细胞死亡

通过免疫印迹分析，药物治疗的和媒介物处理的小鼠的脑匀浆被分析PrPSc水平。如图6B中所示在显示的时间点检测的来自anle138b组的所有动物的脑内PrPSc水平可被保持在在第80天的未治疗的小鼠的水平，而对照组中PrPSc水平增加。anle186b的结果在对照组和anle138b之间。PrPSc的增加将被减慢(图6B)。图6C显示与在第80天未治疗的对照相比用化合物治疗后的相对PrPSc水平的变化。用anle138b治疗之后脑内PrPSc水平稍微下降。在显示的时间点的H&E染色脑片的组织学检测之后anle138b和anle186b治疗的小鼠显示病理变化的减少。与对照组相比，来自治疗组的感染的小鼠的小脑粒细胞层中凋亡细胞的数目降低(图6D)。这些结果显示两种化合物都能穿过血脑屏障。因此治疗能够防止在治疗期间动物的脑内进一步的PrPSc沉着和疾病进展。这些结果意味着只要施用药物用化合物anle138b治疗停止疾病进展。这些结果显示通过使用干扰PrPSc形成的这一化合物的治疗改进疾病进展可以是可能的。在这种情况下治疗将导致TSE感染的个体的生命的延长且通过停止疾病进展导致稳定或可能改善它们的健康状况保护其远离进一步的恶化。

孵育时间延长

如图7所示已经脑内感染RML瘙痒病毒株的小鼠在潜伏时间晚期(感染后第80天)通过每天施用化合物的治疗导致存活时间的延长，直到到达瘙痒病感染的终末期(图7)。此外，两只小鼠较长的存活时间，其从第109天至第136天通过喂养混合有花生酱的anle138b接受附加治疗，显示i)存活与治疗持续时间相关，ii)当口服给予时化合物是有效的，且iii)该化合物穿过血脑屏障。

实施例7：体外α-共核蛋白聚集的抑制

共核蛋白病是以主要由蛋白α-共核蛋白组成的聚集体和原纤维的细胞内聚集为特征的(神经变性)疾病(对于综述参见Goedert，2001)。最显著的神经变性共核蛋白病是帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统萎缩症(MSA)。

体外α-共核蛋白的聚集已经被证明发生在物质如有机溶剂的存在下，其模拟它们天然存在的生物膜的邻近的电解质条件(Munishkina等，2003)。体外聚集测定已经被发展，其提供模型系统用于研究疾病过程中α-共核蛋白错折叠和聚集的中心方面和用于毒性聚集体种类的形成(Kostka等2008)。

为了测试选择的化合物的它们抑制α-共核蛋白聚集的潜能，我们已经使用了体外系统，其中较低浓度(＜3％)的有机溶剂二甲亚砜(DMSO)和，在一些实施例中三价铁被用于诱导体外α-共核蛋白聚集。使用单个粒子荧光相关装置通过交互相关分析监测多聚体形成且SIFT-分析适用于分别用绿色Alexa488-或红色Alexa647-荧光团标记的α-共核蛋白单体的混合物。这些α-共核蛋白混合物被聚集在平行于其中将化合物添加到反应中的样品。

实验过程：

α-共核蛋白的荧光标记

将重组体α-共核蛋白分别用氨基反应性荧光染料或用AlexaFluor-488-O-琥珀酰亚胺基酯或用Alexa Fluor-647-O-琥珀酰亚胺基酯(Molecular Probes，USA)标记。反应完成之后，经两个连续的PD10柱(Amersham Bioscience，Germany)根据制造商的说明书将未结合的染料分子通过反应混合物的体积排阻色谱法分离。标记效率和未结合的染料的除去通过FCS测量确定，其具有含有标记的α-共核蛋白单体的级分合适的稀释。

单个粒子荧光相关测量

在装有用于荧光相关测量(Evotec-Technologies，Germany)的玻璃盖玻片底的特定的微量滴定板的孔的20μl容积中，在含有pH 7.0的50mM Tris和分别标记有Alexa488-或Alexa647-荧光团的α-共核蛋白单体混合物的缓冲液中，在每种α-共核蛋白种类约5-10nM的最后的浓度下进行α-共核蛋白聚集。在Insight荧光相关仪器(Evotec-Technologies，Germany)上进行测量，其使用具有FIDA光学设置的1.2NA(Olympus，Japan)40x显微镜物镜，70μm的针孔直径和用488nm激光200μW激发以及用633nm激光300μW激发。测量时间是10s，其间通过使用100μm扫描径长在50Hz的扫描频率和2000μm的定位台运动的束扫描设备使激光焦点移动通过孔。这相当于约10mm/s扫描速度。使用2-D SIFT软件(Evotec OAI，Germany)产生并分析二维强度分布矩形图。

结果：化合物对α-共核蛋白聚集的抑制

由DMSO和DMSO/Fe³⁺引起的α-共核蛋白的聚集通过较高的数目的包含红色和绿色标记的α-共核蛋白单元二者的多聚体的α-共核蛋白复合物形成被反映。因此，无加入的抑制性化合物的对照反应显示存在大量的发射高数目的光子的复合物。将DPP-化合物351F11添加到测定溶液中能够以剂量依赖的方式抑制多聚体α-共核蛋白复合物的形成到较广的程度，如图8A中所见。因此，化合物351F11能够在用于共核蛋白病中发现的病理性蛋白聚集的此体外模型中在较低的微摩尔浓度有效地抑制α-共核蛋白的多聚体形成。这清楚地显示：化合物351F11不仅可以用作抗朊病毒化合物，而且具有潜力成为治疗性化合物用于共核蛋白病，像帕金森病、DLB和MSA，其在分子水平干扰病理机制。对于研究的其他DPP-相关的化合物也可以检测α-共核蛋白聚集的剂量依赖的抑制效果(图8B，C)。因此这些化合物代表具有被证实的在体外抑制α-共核蛋白聚集的能力的新的物质组，其将允许针对帕金森疾病和其它共核蛋白病的成因治疗的发展。

此外，这些化合物在体外对朊病毒蛋白聚集和α-共核蛋白聚集二者的抑制活性可以反映其针对更宽范围的蛋白聚集疾病的普遍的抗聚集活性，其中蛋白错折叠成主要的β-折叠构象形成随后的蛋白聚集成淀粉样原纤维的基础。因此，这些化合物和DPP类物质的进一步的成员具有成为用作全部(神经变性)蛋白聚集疾病的成因治疗的治疗剂的潜力，所述白聚集疾病包括例如：阿尔茨海默病、朊病毒病、帕金森病、多系统萎缩、弥漫性路易体病、额颞痴呆、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和其它Poly-Q病、遗传性大脑淀粉样血管病、家族性淀粉样多神经病、原发性全身性淀粉样变性(AL淀粉样变性)、反应性全身性淀粉样变性(AA淀粉样变性)、II型糖尿病、注射局限性淀粉样变性、β-2微球蛋白淀粉样变性、遗传性非神经病性淀粉样变性和芬兰型遗传性全身性淀粉样变性。

实施例8：细胞培养物中PrPSc的抑制

实验过程：

将朊病毒感染的细胞培养物用新合成的化合物治疗，如为上面描述的初步筛选所描述。以图9中显示的浓度加入化合物。化合物的结构被显示在以下和图3中。

5-(3，5-二溴苯基)-3-(3，4，5-三羟基苯基)吡唑(anle145d)

5-(3-溴苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)吡唑(sery255b)

结果：

非常高的比例的DPP-相关的化合物在低的微摩尔浓度和甚至在亚微摩尔浓度在细胞培养物中显示了强的PrPSc的减少。这显示这些化合物表示具有抗朊病毒活性的相关的化合物组。

实施例9：不同的DPP-衍生物对脑和脾脏中PrP^Sc积累的抑制效果

通过三种实验设计测试化合物在体内对PrP^Sc积累的抑制效果：

a)将C57BL/6小鼠大脑内(i.c.)接种30μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。在感染后第80天每天口服应用混合有DMSO+花生酱的1mg化合物开始治疗。在感染后第120天通过免疫印迹分析测定脑内PrP^Sc水平。

b)将C57BL/6小鼠大脑内(i.c.)接种30μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。在感染后第80天用0.84mg化合物(在DMSO中)每天通过腹腔内注射应用持续14天随后的2×5天(两者之间2天无治疗)通过强饲法口服应用1mg化合物(在DMSO+植物油中)，开始治疗。在感染后第106天测定脑内PrP^Sc水平。

a)将C57BL/6小鼠腹腔内(i.p.)接种100μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。在感染后第35天测定脾脏中PrP^Sc水平接着34天每天用混合有DMSO+花生酱的1mg化合物治疗。

在表1中显示与DMSO-治疗组相比的PrP^Sc积累的相对抑制(在治疗期末期DMSO-治疗的动物的平均值被定义为0％抑制，在治疗期开始的对照动物的平均值被定义为100％抑制)。

表1：不同DPP-衍生物对脑内和脾脏内PrP^Sc积累的抑制效果(^a，b，c显示使用的实验设计(如上面所描述))。

这些实验结果显示：在这些实验条件下i)化合物anle138b和化学上相关的化合物在体内提供朊病毒扩增的强抑制，ii)存在以下结构-活性关系：显示对于此应用，在这些实验条件下anle138b表示活性的一种相对优化。

实施例10：可以穿过血脑屏障且观测到与病理性蛋白聚集体的相互作。

将C57BL/6小鼠大脑内(i.c.)接种30μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。在感染后第80天每天口服应用混合有DMSO+花生酱的1mg化合物(sery383)或3mg化合物(sery363a)开始治疗。在感染后第120天通过免疫印迹分析测定脑内PrP^Sc水平。

与DMSO-治疗的对照相比，sery363a导致PrP^Sc积累减少35％，sery383导致PrP^Sc积累减少30％。

在这些实验中合成并检测Sery363a，因为其提供非常适合同位素标记的anle138b的修饰，需要同位素标记用作PET成像的诊断示踪剂。

在这一测定中测试Sery383，因为这一化合物以及含有-NH2基团和卤素原子的结构上相似的化合物被发现对α-共核蛋白聚集的抑制是高度有效的(参见实施例16，“用不同化合物抑制α-共核蛋白聚集体的形成”)。

这些实验的结果显示两种化合物可以穿过血脑屏障且病理性蛋白聚集体相互作用，其显示这些化合物具有被开发用作治疗性化合物以及诊断性化合物的性质。

实施例11：在感染RML瘙痒病的小鼠中用anle138b每天治疗对PrP^Sc积累和朊病毒病理的影响。

将C57BL/6小鼠大脑内(i.c.)接种30μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。分别在感染后第80天或第120天每天口服应用混合有DMSO+花生酱的5mg化合物开始治疗(图10)。

为PrP^Sc染色的脑切片(图10A)显示与DMSO-治疗的动物相比anle138b治疗减少PrP^Sc积累。对在不同的时间点朊病毒接种的小鼠的脑匀浆中PrP^Sc水平的定量显示anle138b-治疗的小鼠中PrP^Sc积累是强烈减少的，甚至是在疾病晚期开始治疗之后(120dpi；图10B)。H&E染色的脑片中小脑中的凋亡细胞的组织学定量显示PrP^Sc积累的抑制引起神经细胞死亡的抑制(图10C)。用不含化合物的DMSO+花生酱治疗的对照小鼠显示递增的重量减轻(图10D)。从80dpi向前用anle138b治疗防止体重减轻持续～100天。从120dpi治疗抑制体重减轻持续～70天。

这些实验发现显示化合物治疗抑制PrP^Sc积累，神经细胞死亡和疾病临床征兆的进展，甚至当在明显的病征出现之后很晚开始治疗也是如此。

实施例12：不同治疗方案的比较

将C57BL/6小鼠大脑内(i.c.)接种30μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。不同时间和不同方案的anle138b治疗(如图11的图例中显示)显著地延长了用RML瘙痒病攻击之后的存活时间(p＜0,01)。平均存活时间以天±标准偏差表示。

如图11所示，这些实验发现显示i)在口服应用化合物之后化合物治疗也是有效的，ii)当在疾病的临床阶段很晚开始时治疗也是有效的，且iii)较长的治疗产生较长的存活。

实施例13：anle138b施用对脑内PrPSc水平的剂量依赖的效果。

将C57BL/6小鼠大脑内(i.c.)接种30μL的1％脑匀浆(RML瘙痒病)。在感染后第80天用不同量的anle138b(如图12中显示)与DMSO+花生酱混合口服应用开始治疗。在感染后120天，将动物处死并定量脑内的PrP^Sc量与在感染后第80天处死的动物比较。

图12中提供的数据显示anle138b以剂量依赖的方式减少了脑内PrP^Sc积累。

实施例14：通过对来自每天用1mg anle138b与DMSO+花生酱混合治疗持续1星期的未感染小鼠的脑组织的免疫印迹定量PrP^C。如图13显示，当与对照小鼠相比时，观测到用anle138b治疗的小鼠中PrP^C水平未下降。

这些实验发现显示瘙痒病-感染的小鼠中的治疗效果不归因于PrP^C减少的表达而归因于对病理性聚集的蛋白种类的形成的抑制。

实施例15：anle138b的药物代谢动力学分析。

如图14中显示将单剂量的anle138b应用到未感染的C57BL/6小鼠。在应用之后的不同时间点，通过LC-MS以每时间点和实验组2只动物测量脑和血清中化合物的量。

这些实验发现显示存在良好的口服生物利用度和良好的脑渗透。在小鼠的血液中检测到anle138c，以致其被认为是anle138b的代谢物。

实施例16：不同化合物抑制α-共核蛋白聚集体的形成。

α-共核蛋白的聚集用DMSO和10μM FeCl₃诱导且通过共焦的单个分子光谱法分析，如Kostka等(J Biol Chem(2008)283：10992-11003)描述。与无化合物的对照相比，研究在10μM浓度加入的不同化合物对中间体II寡聚体形成的影响，如表2中所示。图15中显示各化合物的结构。

表2：不同化合物抑制α-共核蛋白聚集体的形成。

这些实验发现显示这些化合物抑制毒性α-共核蛋白聚集体的形成，其显示这些结构上相关的化合物具有潜力被用于具有蛋白聚集的蛋白疾病的治疗，且特别是也用于其中可观测到α-共核蛋白聚集的疾病的治疗。

实施例16：化合物在帕金森病的体内小鼠模型中的作用

实验证据表明在帕金森病的实验模型中使用合适的浓度的线粒体毒素如MPTP和鱼藤酮，聚集的α-共核蛋白的形成可以被观测到且促成神经细胞死亡。在第1-5天用MPTP(每天30mg/kg体重)通过腹腔内注射处理小鼠以诱导黑质中多巴胺能神经元变性。将动物(每实验组3-10只)用不同的化合物或媒介物(每天250mg/kg体重，口服应用(管饲在混合有487,5μl橄榄油的12,5μl DMSO中的化合物)，在第0-12天)治疗。在第12天定量与无-MPTP-处理的小鼠(对照，定义为0％细胞死亡)和仅用媒介物治疗的MPTP-处理小鼠(DMSO；定义为100％细胞死亡)相比，神经元的丧失。对于酪氨酸羟化酶(TH)-阳性黑质密部(SNpc)细胞的定量，将50μm切片用抗-TH-抗体免疫染色。使用Stereo investigator软件(MicroBrightfield，Colchester，VT，USA)分析通过SNpc的每第二个切片。免疫染色细胞通过使用20x物镜的光学分馏方法计数。由两个独立的研究者盲目地进行立体计数。

图16中所示的实验发现显示测试的化合物在帕金森病的体内模型中减少细胞死亡。

实施例17：anle138c对ABeta聚集的作用

将50μM浓度的Abeta40在以下条件孵育30小时：50mM磷酸二氢钠、50mM氯化钠、0.01％叠氮化钠，pH 7.4，37℃，用细的磁力搅拌棒，存在或不存在50μM anle138c。在与测试样品相等的浓度将DMSO加入到对照样品中。DMSO浓度是2％(vol/vol)，且anle138C原液是3mM。在DLS实验之前将肽溶液在16000g离心15分钟。

单体Abeta40中最大的峰与约1.5nm的流体动力学半径和在约30nm的寡聚体峰相应(上部图)，在anle138C的存在下Abeta40聚集体状态(中部图)显示除单体峰之外的约20nm的寡聚体峰。底部图显示Abeta40的淀粉样蛋白原纤维状态的大小分布，在离心样品之后测定。由动态光散射分析ABeta聚集。在25℃在DynaPro Titan(Wyatt Technology Corp.，CA)仪器上用827.08nm的激光，以两个重复进行DLS测量。散射角是90°。DLS测量由二十个10-s长的采集组成。在589nm和0℃将溶液的折射率(RI)设置在1.333，且通过Cauchy方程以3119nm²的系数获得研究的波长的RI。在20℃粘度是1.019cp且温度依赖的变化通过水模型计算。通过约束正则化方法确定大小分布。

图17所示的实验发现显示anle138c抑制大的Abeta40寡聚体的形成，其显示anle138c和相关的化合物也可以干扰ABeta聚集，其可以在神经病理学上以聚集的ABeta的沉着为特征的疾病如阿尔茨海默病中被用于治疗性的和诊断性的目的。

本发明的化合物的可选实施方式被概括在以下项目中。这些化合物可以与上面提到的本发明的化合物相同的方式使用。

1.一种由式(I)表示的化合物及其前药、酯、溶剂合物或盐：

其中

X、Y和L独立地不定向地选自：-C(R11)(R12)-、-C(R13)＝、-N(R14)-、-N＝、-N⁺(R17)＝、-O-和-S-；

M和Z独立地不定向地选自：

----表示任选的双键；

R1至R15或R17或R18独立地选自氢、卤代、氰基、羟基、硝基、氨基、叠氮基、磺酰基、硫代、膦酰基、羧基、羰基氨基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、酰基、酰氧基、酰基氨基、碳环基、碳环氧基、碳环烷基、碳环烯基、芳基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳氧基、芳基烷氧基、杂环基、杂环氧基、杂环烷基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳基烷基、杂芳基烯基和杂芳基烷氧基，或两个邻接基团可以被连接形成具有1至6个碳原子的桥连基团，其中一个或两个碳原子可用-O-、-S-或-N(R′)-取代，其中R′选自H和C_1-4烷基；其各自是任选地取代的；

条件是所述化合物不是以下化合物(a)、(b)或(c)中之一

2.根据项目1所述的化合物，其中环A定向地选自以下结构：

3.根据项目1或2所述的化合物，其中R7是卤代、氰基、羟基、硝基、叠氮基、烷氧基、硫代、烷基硫代、氨基、卤代烷氧基、烷基或卤代烷基。

4.根据项目1至3的任一项所述的化合物，其中R2和R3各自独立地选自羟基和C_1-6烷氧基；或R2和R3一起形成结构-O-(CH₂)_n-O-，其中n是1至3，优选地n是1。

5.一种由式(I)表示的化合物及其前药、酯、溶剂合物或盐：

其中

X、Y和L独立地不定向地选自：-C(R11)(R12)-、-C(R13)＝、-N(R14)-、-N＝、-N⁺(R17)＝、-O-和-S-；

M和Z独立地不定向地选自：

----表示任选的双键；

R1至R15或R17或R18独立地选自氢、卤代、氰基、羟基、硝基、氨基、叠氮基、磺酰基、硫代、膦酰基、羧基、羰基氨基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、酰基、酰氧基、酰基氨基、碳环基、碳环氧基、碳环烷基、碳环烯基、芳基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、芳氧基、芳基烷氧基、杂环基、杂环氧基、杂环烷基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳基烷基、杂芳基烯基和杂芳基烷氧基，或两个邻接基团可以被连接形成具有1至6个碳原子的桥连基团，其中一个或两个碳原子可用-O-、-S-或-N(R′)-取代，其中R′选自H和C_1-4烷基；其各自是任选地取代的；

用于治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病。

6.项目5中定义的由式(I)表示的化合物在制备治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病的药物组合物中的用途。

7.一种治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的项目5中定义的由式(I)表示的化合物。

8.一种鉴定用于抑制与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病中牵涉的蛋白的聚集的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

在聚集的候选抑制剂的(1)存在和/或(2)不存下，使标记的单体蛋白和不同地标记的所述蛋白的聚集体接触，所述聚集的候选抑制剂是如项目5中定义的化合物；

确定共定位的标记的量，其表示所述单体蛋白与所述蛋白的聚集体的结合程度；和

比较在所述化合物的存在和不存在下获得的结果，

其中，在所述化合物的存在下共定位的标记的减少指示化合物抑制所述蛋白的聚集的能力。

9.根据项目8所述的方法，其中所述标记是荧光标记。

10.根据项目8或9所述的方法，其中所述标记连接至特异地结合所述蛋白的抗体或者抗体片段。

11.根据项目10所述的方法，其中所述抗体或抗体片段能够辨别聚集蛋白和单体蛋白。

12.根据项目8至11的任一项所述的方法，其中所述共定位的标记的量是通过使用“强荧光靶扫描(SIFT)”或荧光共振能量转移(FRET)或高分辨率共焦成像的方法来确定的。

13.根据项目8至12的任一项所述的方法，其中所述单体蛋白和聚集蛋白选自由以下组成的组：朊病毒蛋白、淀粉样前蛋白(APP)、α-共核蛋白、超氧化物歧化酶、tau、免疫球蛋白、淀粉样蛋白-A、转甲状腺素蛋白、β2-微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、载脂蛋白A1、TDP-43、胰岛淀粉样多肽、ANF、凝溶胶蛋白、胰岛素、溶菌酶、纤维蛋白原、亨廷顿蛋白和共济失调蛋白以及具有Poly-Q段的其它蛋白，以及所述蛋白的片段或衍生物。

14.根据项目13所述的方法，其中所述单体蛋白是朊病毒蛋白且所述聚集蛋白是PrPsc。

15.根据项目13所述的方法，其中所述单体蛋白是α-共核蛋白且所述聚集蛋白选自由α-共核蛋白的寡聚体或初原纤维或原纤维组成的组。

16.一种选择在治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病中具有体内功效的化合物的方法，所述方法包括：

(a)将项目5中定义的候选化合物施用到具有如项目13至15中任一项中定义的蛋白的可聚集亚型的细胞培养物或非人动物；

(b)定量可观测的聚集体的量；和

(c)鉴别和选择能够减少所述蛋白的聚集体或所述蛋白的聚集体的形成、或者能够增加所述细胞培养物或非人动物的存活时间的化合物。

17.如项目5中定义的化合物用于抑制体外、动物内或离体蛋白聚集的用途。

18.一种药物组合物或诊断组合物，包含项目5中定义的化合物和任选地药学上可接受的载体。

19.根据项目1或5任一项所述的化合物或项目6所述的用途或根据项目7至16任一项所述的方法或根据项目17所述的用途或根据项目18所述的组合物，其中所述化合物选自由以下组成的组的化合物及其前药、酯、溶剂合物或盐：

其中，每个R16独立地选自H和C_1-4烷基；或两个邻接的R16基团可被连接以形成具有1至3个碳原子的桥连基团。

20.根据项目16或19的任一项所述的方法或根据项目17或19的任一项所述的用途、根据项目18或19的任一项所述的诊断组合物，其中所述化合物是可检测地标记的。

21.根据项目16、19至20的任一项所述的方法或根据项目17、19至20的任一项所述的用途，其中所述化合物的两种或多种被同时使用。

22.根据项目5或19任一项所述的化合物，其中所述与蛋白聚集有关的疾病以存在至少一种蛋白或其片段或其衍生物的聚集形式为特征，其中所述蛋白选自由以下组成的组：朊病毒蛋白、淀粉样前蛋白(APP)、α-共核蛋白、超氧化物歧化酶、tau、免疫球蛋白、淀粉样蛋白-A、转甲状腺素蛋白、β2-微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、载脂蛋白A1、TDP-43、胰岛淀粉样多肽、ANF、凝溶胶蛋白、胰岛素、溶菌酶、纤维蛋白原、亨廷顿蛋白和共济失调蛋白以及具有Poly-Q段的其它蛋白。

23.根据权利要求5、19或22所述的化合物，其中所述疾病选自由以下组成的组：帕金森病、朊病毒病、阿尔茨海默病、多系统萎缩、弥漫性路易体病、额颞痴呆、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和其它Poly-Q病、遗传性大脑淀粉样血管病、家族性淀粉样多神经病、原发性全身性淀粉样变性(AL淀粉样变性)、反应性全身性淀粉样变性(AA淀粉样变性)、II型糖尿病、注射局限性淀粉样变性、β-2微球蛋白淀粉样变性、遗传性非神经病性淀粉样变性和芬兰型遗传性全身性淀粉样变性。

24.根据项目23所述的化合物，其中所述朊病毒病选自：克洛伊茨费尔特-雅各布病、变异型克洛伊茨费尔特-雅各布病、遗传的人朊病毒病、牛海绵样脑病(BSE)和瘙痒病。

25.一种药盒，其包括在一个或多个容器中的如项目5和18至24中任一项中定义的化合物和，另外，特异结合所述化合物的抗体或抗体片段；和/或项目13至15中定义的单体或聚集蛋白；和/或任选地与所述化合物复合的项目13至15中定义的单体或聚集蛋白；以及使用说明。

如本文所用术语“卤代”指选自氟、氯、溴和碘的卤素原子，优选地溴。

如本文所用术语“羧基”指基团-COOH。

术语“烷基(alkyl)”和“烷基(alk)”指直链或支链烷(烃)基团，其包含1至12个碳原子，优选地1至6个碳原子，更优选地1至4个碳原子。示例性的这样的基团包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、异己基、庚基。

术语“烯基”指直链或支链烃基团，包含2至12个碳原子，优选地2至6个碳原子以及至少一个碳碳双键。示例性的这样的基团包括乙烯基或烯丙基。

术语“炔基”指直链或支链烃基团，包含2至12个碳原子，优选地2至6个碳原子以及至少一个碳碳三键。示例性的这样的基团包括乙炔基。

术语“烷氧基”指通过氧键(-O-)连接的上面描述的烷基。

根据本发明的“酰基”是其中烷基、芳基、杂环基或杂芳基连接到羰基的官能团。酰基的实例是甲酰基、C_1-6烷基-羰基如乙酰基、丙酰基、丁酰基和特戊酰基；C_2-6烯基-羰基如乙烯酰基、丙烯酰基和丁烯酰基；芳酰基如苯甲酰基以及类似基团，优选地乙酰基。

如本文所述术语“酰氧基”指与-O-连接的酰基。类似地，“酰基氨基”是与-N(R″)-连接的酰基，其中R″是H或C1-6烷基。

术语“碳环基”指全饱和的环状烃基团，包含1至4个环，优选地1个环，且每个环3至8个碳。示例性的这样的基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。

术语“碳环氧基”指通过氧键(-O-)连接的上面描述的碳环基团。

术语“碳环烷基”指用碳环基取代的烷基，其中碳环基和烷基如上面概括被定义。

术语“碳环烯基”指用碳环基取代的烯基，其中碳环基和烯基如上面概括被定义。

术语“芳基”指环状、芳族烃基团，其具有6至20、优选地6至10个主链碳原子且具有1至3个芳族环，尤其是单环或双环基团如苯基、联苯基或萘基。在包含两个或多个芳族环(双环等)之处，芳基的芳族环可以在单个点连接(例如联苯基)或是稠合的(例如萘基、菲基以及类似基团)。

术语“芳基烷基”指用芳基取代的烷基，其中芳基和烷基如上面概括被定义。

术语“芳基烯基”指用芳基取代的烯基，其中芳基和烯基如上面概括被定义。

术语“芳基炔基”指用芳基取代的炔基，其中芳基和炔基如上面概括被定义。

术语“芳氧基”指通过氧键(-O-)连接的如上面描述的芳基，例如苯氧基、蒽氧基、联苯基氧基以及类似基团，优选地苯氧基。

术语“芳基烷氧基”指用芳基取代的烷氧基，其中芳基和烷氧基如上面概括被定义。

术语“杂环基”指完全饱和的或部分不饱和的或完全不饱和的环状基团(例如，3至7元单环、7至11元双环或10至16元三环体系)，其在至少一个含碳原子环中具有至少一个杂原子。含杂原子的杂环基的各环可以具有选自氮原子、氧原子和/或硫原子的1、2、3或4个杂原子，其中氮杂原子和硫杂原子可任选地被氧化且氮杂原子可任选地被季铵化。(术语“杂芳鎓”指带有季氮原子且因此带正电荷的杂芳基。)杂环基可在环或环体系的任何杂原子或碳原子处连接到分子的剩余部分。示例性单环杂环基包括氧化乙烯、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吡咯基、吡唑基、氧杂环丁基(oxetanyl)、吡唑啉基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑啉基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、噻唑烷基、异噻唑基、异噻唑烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、噁二唑基、哌啶基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、2-氧代氮杂卓基、氮杂卓基(azepinyl)、六氢二氮杂卓基、4-哌啶酮基(piperidonyl)、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三嗪基、三唑基、四唑基、四氢吡喃基、吗啉基、硫吗啉基、硫吗啉基亚砜、硫吗啉基砜、1，3-二氧戊烷和四氢-1，1-二氧代噻吩基以及类似基团。示例性双环杂环基包括吲哚基、异吲哚基、苯并噻唑基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻吩基、奎宁环基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲嗪基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、色酮基、香豆素基、苯并吡喃基、噌啉基、喹喔啉基、吲唑基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基(如呋喃并[2，3-c]吡啶基、呋喃并[3，2-b]吡啶基]或呋喃并[2，3-b]吡啶基)、二氢苯并二噁英基、二氢二氧化苯并噻吩基、二氢异吲哚基、二氢吲哚基、二氢喹啉基、二氢喹唑啉基(如3，4-二氢-4-氧代喹唑啉基)、三嗪基氮杂卓基、四氢喹啉基以及类似基团。示例性三环杂环基包括：咔唑基、benzidolyl、二氮杂菲基(phenanthrolinyl)、二苯并呋喃基、吖啶基、菲啶基(phenanthridinyl)、呫吨基以及类似基团。

术语“杂环氧基”指通过氧键(-O-)连接的上面描述的杂环基。

术语“杂环烷基”指用杂环基取代的烷基，其中杂环基和烷基如上面概括被定义。

如本文所用术语“杂芳基”指5-至6-元的芳族环，其可以包括作为杂原子的氧、硫和/或氮且进一步的芳族环可以被稠合到其上。杂芳基的非限制性的实例不限于：苯并呋喃基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、噻唑基、咪唑基、噁唑基、噁二唑基、噻二唑基、苯并噻唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、异噻唑基、吡咯基、吡喃基、四氢吡喃基、吡唑基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、嘌呤基、咔唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吡嗪基、二嗪基、吡嗪、三嗪基三嗪、四嗪基、四唑基、苯并苯硫基、苯并吡啶基和苯并咪唑基。

术语″杂芳氧基″指通过氧键(-O-)连接的上面描述的杂芳基团。

术语″杂芳基烷基″、″杂芳基烯基″和″杂芳基炔基″指其中烷基、烯基或炔基用杂芳基取代的基团，其中杂芳基和烷基、烯基和炔基如上面概括被定义。

术语“杂芳基烷氧基”指用杂芳基取代的烷氧基，其中杂芳基和烷氧基如上面概括被定义。

如本文所用，“取代的”指在任何可获得的连接点处用一个或多个取代基(优选地1至4个取代基)取代的基团。示例性取代基包括但不限于以下基团中的一个或多个：烷基、烷氧基、卤代、羟基、羧基(即，-COOH)、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、氨基(即，-NH₂)、硫代和硝基。

在优选的可选的实施方式中，R1选自由氢和烷基组成的组，更优选地氢。

在优选的可选的实施方式中，R2选自由羟基和烷氧基组成的组。

在优选的可选的实施方式中，R3选自由羟基和烷氧基组成的组。

在进一步优选的可选的实施方式中，R2和R3被连接在一起并形成结构-O(CH₂)_nO-，其中n是1至3，优选地n是1。

在优选的可选的实施方式中，R4选自由氢、羟基和烷氧基组成的组，更优选地氢。

在优选的可选的实施方式中，R5选自由氢和烷基组成的组，更优选地氢。

在优选的可选的实施方式中，R6选自由氢和烷基组成的组，更优选地氢。

在优选的可选的实施方式中，R7选自由以下组成的组：氢、卤代、氰基、硝基、羟基和烷氧基，更优选地R7是氢、卤代、羟基或烷氧基，甚至更优选地R⁷是卤代。

在优选的可选的实施方式中，R8选自由氢、羟基和烷氧基组成的组。

在优选的可选的实施方式中，R9选自由氢、卤代、羟基和烷氧基组成的组。

在优选的可选的实施方式中，R10选自由氢和烷基组成的组，更优选地氢。

在优选的可选的实施方式中，R11选自由氢和烷基组成的组。

在优选的可选的实施方式中，R12选自由氢和烷基组成的组。

在优选的可选的实施方式中，R13选自由氢和烷基组成的组。

在优选的可选的实施方式中，R14选自由氢和烷基组成的组。

在优选的可选的实施方式中，R15选自由氢和烷基组成的组。

在本发明的化合物的另一优选的可选的实施方式中，R7是卤代、氰基、羟基或硝基、叠氮基、烷氧基、硫代、烷基硫代、氨基、卤代烷氧基、烷基或卤代烷基。

在优选的可选的实施方式中，R7是卤代、氰基、羟基或硝基，更优选地卤代。

在进一步优选的可选的实施方式中，R2和R3各自独立地选自羟基和C_1-6烷氧基；或R2和R3一起形成结构-O-(CH₂)_n-O-，其中n是1至3，优选地n是1。

在优选的可选的实施方式中，化合物选自由以下组成的组的化合物及其前药、酯、溶剂合物或盐：

其中，每个R16独立地选自H和C_1-4烷基；或两个邻接的R16基团可被连接以形成具有1至3个碳原子的桥连基团。

在更优选的可选的实施方式中，化合物选自由以下组成的组：

3-(4-羟基苯基)-5-(3，4-二羟基苯基)异噁唑

3，5-双(3，4-二甲氧基苯基)吡唑

5-(3-溴苯基)-3-(3，4-亚甲基二氧基苯基)吡唑

5-(3-氟苯基)-3-(3，4-亚甲基二氧基苯基)吡唑

3-(3，4-二羟基苯基)-5-(3-氟苯基)吡唑

2，4-双(3，4-二羟基苯基)咪唑氢溴化物

3-(3，4-二甲氧基苯基)-5-(3，4，5-三甲氧基苯基)吡唑

5-(3，5-二溴苯基)-3-(3，4，5-三羟基苯基)吡唑氢溴化物

5-(3-溴苯基)-3-(2-羟基苯基)吡唑(10353_F11)

可选的实施方式的化合物可以是可检测地标记的。

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Claims (19)

1.一种由式(E)表示的化合物以及由式(E)表示的化合物的前药、酯、溶剂合物或盐：

其中

X、Y和L独立地不定向地选自：-C(R¹)(R²)-、-C(R³)＝、-N(R⁴)-、-N＝、-N⁺(R⁵)＝、-O-和-S-；

M和Z独立地不定向地选自：

----表示任选的双键；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立地选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；-C(O)-C_1-4烷基；和C_6-10芳基，其中芳基环可任选地用C_1-4烷基或卤素取代；

Hal选自F、Cl、Br和I；

R^E1选自羟基、C_1-6烷氧基和-NR^E5R^E6；

R^E2选自氢、卤素、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^E5R^E6；或

如果R^E1和R^E2被连接到邻接的碳原子，那么R^E1和R^E2一起可以可选地不定向地形成结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-以及其中存在双键的相应的结构，其中T选自CR^E9R^E10、NH和O且V选自CR^E9R^E10、NH和O；

R^E5和R^E6独立地选自氢和C_1-6烷基；

R^E7和R^E8独立地是H或F；

R^E9和R^E10独立地是H或F；

n是1至3；

R^E3是C_1-6烷基或C_5-10芳基；

m是0至2；

R^E4是卤素原子、C_1-6烷基或C_5-10芳基；

p是0至2；

条件是排除以下化合物：

3(5)-(2-羟基-5-甲基苯基)-5(3)-(4-氯苯基)吡唑；

邻羟基苯基-5二氯-3′-4′苯基-3甲基-2吡唑；

邻羟基苯基-5二氯-3′-4′苯基-3苯基-2吡唑；

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述由式(E)表示的化合物是由式(A)或(B)表示的化合物以及由式(A)或(B)表示的化合物的前药、酯、溶剂合物或盐：

其中

m、n、p、T、V、X、Y、L、M、Z、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R^E7、R^E8和Hal如在权利要求1中所定义；

其中在式(A)中：

R^A1和R^A2各自独立地选自氢、卤素、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^A5R^A6；或

条件是R^A1和R^A2的至少一个是羟基、C_1-6烷氧基或-NR^A5R^A6；

可选地R^A1和R^A2可以一起不定向地形成结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-；

R^A3是C_1-6烷基或C_5-10芳基；

R^A4是卤素原子、C_1-6烷基或C_5-10芳基；且

R^A5和R^A6独立地选自氢和C_1-6烷基；

其中在式(B)中：

R^B1选自羟基、C_1-6烷氧基和-NR^B5R^B6；且

R^B2选自氢、卤素、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^B5R^B6；

R^B3是C_1-6烷基或C_5-10芳基；

R^B4是卤素原子、C_1-6烷基或C_5-10芳基；且

R^B5和R^B6独立地选自氢和C_1-6烷基。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中环D定向地选自以下结构：

其中

R⁸和R⁹选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；和C_6-10芳基，其中芳基环可用C_1-4烷基或卤素任选地取代。

4.根据权利要求3所述的化合物，其中环D定向地选自以下结构：

其中：

R⁸如权利要求3中所定义；且

R⁹是H。

5.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组的化合物以及这些化合物的前药、酯、溶剂合物或盐：

其中：

R选自氢；C_1-4烷基；和-C_1-4亚烷基-卤素；且

Hal选自F、Cl、Br和I；

R^E7和R^E8独立地是H或F；

R^A7是H或C_1-4烷基；

R^A8是H或C_1-4烷基；

R^A9是H或C_1-4烷基；

R^A10是H或C_1-4烷基；且

R^B7是H或C_1-4烷基。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组的化合物以及这些化合物的前药、酯、溶剂合物或盐：

其中Hal是Cl或Br。

7.根据权利要求1至6的任一项所述的化合物，其中所述化合物是可检测地标记的。

8.一种药物组合物或诊断组合物，其包含权利要求1至7的任一项中定义的化合物和任选地药学上可接受的载体。

9.一种由式(E)表示的化合物以及由式(E)表示的化合物的前药、酯、溶剂合物或盐：

其中

X、Y和L独立地不定向地选自：-C(R¹)(R²)-、-C(R³)＝、-N(R⁴)-、-N＝、-N⁺(R⁵)＝、-O-和-S-；

M和Z独立地不定向地选自：

----表示任选的双键；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷独立地选自氢；C_1-4烷基；-C_1-4亚烷基-卤素；-C_1-4亚烷基-OH；-C_1-4亚烷基-C_1-4烷氧基；-C(O)-C_1-4烷基；和C_6-10芳基，其中芳基环可任选地用C_1-4烷基或卤素取代；

Hal选自F、Cl、Br和I；

R^E1选自羟基、C_1-6烷氧基和-NR^E5R^E6；

R^E2选自氢、卤素、羟基、C_1-6烷氧基和-NR^E5R^E6；或

如果R^E1和R^E2被连接到邻接的碳原子，那么R^E1和R^E2一起可以可选地不定向地形成结构-T-(CR^E7R^E8)_n-V-以及其中存在双键的相应的结构，其中T选自CR^E9R^E10、NH和O且V选自CR^E9R^E10、NH和O；

R^E5和R^E6独立地选自氢和C_1-6烷基；

R^E7和R^E8独立地是H或F；

R^E9和R^E10独立地是H或F；

n是1至3；

R^E3是C_1-6烷基或C_5-10芳基；

m是0至2；

R^E4是卤素原子、C_1-6烷基或C_5-10芳基；

p是0至2；

用于治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病。

10.权利要求9中定义的化合物用于制备治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病的药物组合物的用途。

11.一种治疗或预防与蛋白聚集有关的疾病和/或神经变性疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的权利要求9中定义的化合物。

12.根据权利要求9所述的化合物、根据权利要求10所述的用途或根据权利要求11所述的方法，其中所述与蛋白聚集有关的疾病以存在至少一种蛋白或其片段或其衍生物的聚集形式为特征，其中所述蛋白选自由以下组成的组：朊病毒蛋白、淀粉样前蛋白(APP)、α-共核蛋白、超氧化物歧化酶、tau、免疫球蛋白、淀粉样蛋白-A、转甲状腺素蛋白、β2-微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、载脂蛋白A1、TDP-43、胰岛淀粉样多肽、ANF、凝溶胶蛋白、胰岛素、溶菌酶、纤维蛋白原、亨廷顿蛋白和共济失调蛋白以及具有Poly-Q段的其它蛋白。

13.根据权利要求9所述的化合物、根据权利要求10所述的用途或根据权利要求11所述的方法，其中所述疾病选自由以下组成的组：帕金森病、朊病毒病、阿尔茨海默病、多系统萎缩、弥漫性路易体病、额颞痴呆、肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调和其它Poly-Q病、遗传性大脑淀粉样血管病、家族性淀粉样多神经病、原发性全身性淀粉样变性(AL淀粉样变性)、反应性全身性淀粉样变性(AA淀粉样变性)、II型糖尿病、注射局限性淀粉样变性、β-2微球蛋白淀粉样变性、遗传性非神经病性淀粉样变性和芬兰型遗传性全身性淀粉样变性。

14.根据权利要求9所述的化合物、根据权利要求10所述的用途或根据权利要求11所述的方法，其中所述朊病毒病选自：克洛伊茨费尔特-雅各布病、变异型克洛伊茨费尔特-雅各布病、遗传的人朊病毒病、牛海绵样脑病(BSE)和瘙痒病。

15.如权利要求1至6的任一项所定义的化合物用于抑制体外、动物内或离体的蛋白聚集的用途。

16.一种药盒，其包括在一个或多个容器中的如权利要求9中定义的化合物和，另外，特异结合所述化合物的抗体或抗体片段；和/或权利要求12中定义的单体或聚集蛋白；和/或任选地与所述化合物复合的权利要求12中定义的单体或聚集蛋白；以及使用说明。

17.一种成像聚集蛋白沉着物的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)向受试者引入可检测量的组合物，所述组合物包含可检测地标记的如权利要求9中定义的化合物；

(ii)允许足够的时间让所述化合物与所述聚集蛋白缔合；和

(iii)检测与所述聚集蛋白缔合的所述化合物。

18.一种药盒，其中所述药盒包括在反应时形成如权利要求9中定义的化合物的至少两种前体化合物，其中X、Y和L中的至少一个是-N(R⁴)-且R⁴包括可检测的标记，所述药盒用于制备可检测地标记的如权利要求9中定义的化合物。

19.根据权利要求17所述的方法或根据权利要求18所述的药盒，其中所述可检测的标记选自：¹⁸F、¹¹C、¹²⁵I、¹²³I、¹³¹I、⁷⁷Br和⁷⁶Br，特别是¹⁸F和¹¹C。

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