CN112778435A - 一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法 - Google Patents

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卫梦尧
丁金龙
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Abstract

本发明公开了一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，旨在提供一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，该方法不仅提取率、除蛋白率、纯度大幅度提高；其技术方案：将铁皮石斛鲜茎在烘干，粉碎；将铁皮石斛粉末按照料液质量体积比1g:15‑30ml溶解于水中，在50‑60℃，提取2次，每次1‑3h，将两次提取液合并，用过滤，以6000‑8000r/min离心10‑15min，取上清液浓缩至20‑40mL；加入95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏8‑12h后离心，收集沉淀并冷冻干燥2天，研磨得到白色粗多糖粉末，用热水溶解得到0.5‑5mg/mL的粗多糖溶液；加入乙醇‑硫酸铵混合溶液静置分层，在15‑55℃萃取，保留下相物质，在60℃下减压浓缩再加入乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。

Description

一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法
技术领域
本发明公开了一种分离纯化铁皮石斛多糖的方法，具体地说，是一种一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法；属于提取技术领域。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale)作为一种传统名贵的中药材，是一种具有高药用价值的食用植物，其主要活性成分有多糖、生物碱、类黄酮、多酚、微量元素和氨基酸等，其中多糖含量最高，2020版《中国药典》记载铁皮石斛中多糖含量不低于25％。铁皮石斛多糖具有降血糖、护肝、抑菌、抗肿瘤、抗骨质疏松、保护肠胃、抗氧化和增强免疫力等功效。目前铁皮石斛粗多糖主要以水提法提取，一般会含有蛋白质和色素等杂质。目前关于石斛多糖中水提脱蛋白的方法较多是蛋白质变性法与酶解法，但这些方法存在操作复杂、重复次数多、脱蛋白率不高、多糖损失率大等缺点。
传统石斛多糖的除去蛋白质的方法中最常使用Sevag法除去多糖中的蛋白质。该方法用到氯仿、正丁醇以4:1的体积比混合液，重复3次以上来去除多糖溶液中的蛋白质。氯仿是一种有机化合物，无色、有甜味、易挥发的液体。在医疗上用作麻醉剂，氯仿有中度毒性，可经消化道、呼吸道、皮肤进入机体。其主要急性毒性作用是对中枢神经系统有麻醉作用，对眼及皮肤有刺激作用，并能损害心脏、肝脏、肾脏，另外可脱脂。氯仿的急性中毒表现为头痛、头晕、乏力、恶心、呕吐。患者先兴奋后麻醉，出现肝肾损伤等，严重者可因呼吸麻痹、心室纤颤而死亡。皮肤若接触氯仿，可出现红斑、水肿、水疱、冻伤等。长期接触患者主要出现肝脏损害，并伴有消化不良、抑郁、失眠、共济失调等。
在动物试验发现，氯仿有高胚胎毒性和轻度致畸性，可诱导小白鼠发生肝癌。而正丁醇属低毒类。麻醉作用比丙醇要强，与皮肤多次接触可导致出血和坏死。对人的毒性较乙醇约大三倍。其蒸气刺激眼、鼻、喉部。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，该方法避免了使用有毒的氯仿纯化粗多糖，不仅提取率、除蛋白率、纯度大幅度提高，纯度可以达到90-95％。
为此本发明提供的技术方案是这样的：
一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，依次包括下述步骤：
1)将铁皮石斛鲜茎在40-50℃烘干，粉碎至100-300目；
2)将铁皮石斛粉末按照料液质量体积比1g:15-30ml溶解于去离子水中，在50-60℃，提取2次，每次1-3h，合并提取液，过滤后收集上清液，以6000-8000r/min离心10-15min，取上清液，用50-60℃浓缩至提取液总体积的0.015-0.025倍；
3)加入80-160mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏8-12h，取出后在4500-5000r/min离心，收集沉淀并冷冻干燥2天，研磨得到白色粗多糖粉末，在用55-65℃水溶解得到0.5-5mg/mL浓度的粗多糖溶液；
4)向粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵混合溶液静置分层，在15-55℃萃取，萃取结束后将两相分离，保留下相物质，即为浸提液；
5)在60℃下减压浓缩浸提液，再加入4倍体积70-90％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。
进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，所述的乙醇-硫酸铵混合溶液中乙醇的质量浓度为21-30％，硫酸铵的质量浓度为17-21％。
进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，
所述乙醇-硫酸铵混合溶液中乙醇的添加量为7.5g/30g，硫酸铵的添加量为5.64g/30g。
进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，步骤)4具体为：将步骤3)中的粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵，置于漩涡混合器上于室温下混合，静置至上下相体积不再发生变化，将双水相体系两相分离并进行透析48h。
进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，步骤5)中离心收集沉淀的方法为在浸提液中加入浓度为95％的乙醇搅拌摇匀，4℃冷藏12h，取出后5000r/min离心10min，保留沉淀。
进一步的，上述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，步骤4)所述乙醇-硫酸铵混合溶静置时间4-6min。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术效果:
1、本发明提供的技术方案乙醇-无机盐组成的双水相体系，除去石斛多糖中的蛋白质。实现了石斛多糖的高效、安全提取显著提高了多糖提取效率，为铁皮石斛多糖的纯化及其实际生产应用提供实验依据。
2、本发明提供的技术方案分离纯化铁皮石斛多糖，避免了使用有毒的氯仿纯化粗多糖，不仅提取率、除蛋白率、纯度大幅度提高，纯度可以达到90-95％。
附图说明
图1为乙醇-硫酸铵双水相相图；
图2为硫酸铵浓度、乙醇浓度交互多糖萃取率的响应面与等值线图；
图3为硫酸铵浓度、萃取温度交互多糖萃取率的响应面与等值线图；
图4为乙醇浓度、萃取温度交互多糖萃取率的响应面与等值线图；
图5为硫酸铵浓度、乙醇浓度交互除蛋白率的响应面与等值线图；
图6为硫酸铵浓度、萃取温度交互除蛋白率的响应面与等值线图；
图7为乙醇浓度、萃取温度交互除蛋白率的响应面与等值线图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的限制，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做出的的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
本发明实施例用浙江产地青源堂公司的铁皮石斛鲜条。
实施例1
(1)一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，铁皮石斛鲜茎50℃烘干，用中药粉碎机粉碎至200目；准确称取铁皮石斛粉末10.0g，按照1:25料液质量体积比加入去离子水250mL，搅拌均匀；溶液温度保持在55-60℃，提取2次，每次1h；将2次提取液合并，纱布过滤，以7500r/min离心10min，取上清液得到澄清提取液，用旋转蒸发仪60℃浓缩至30mL，再加入120mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏12h，取出后在5000r/min离心15min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行冷冻干燥2天，研磨白色固体得到粗多糖粉末。将铁皮石斛粗多糖用去离子水配制成0.5mg/mL的溶液，加热搅拌使其充分溶解，放置至室温(25℃)备用。
(2)固定乙醇-硫酸铵双水相体系质量为30.0g。在50mL离心管中分别加入5.64g的硫酸铵和7.5g乙醇溶液，加入16.86g浓度为0.5mg/mL的铁皮石斛粗多糖提取液，置于漩涡混合器上于室温下混合，静置至上下相体积不再发生变化，萃取结束后将两相分开，保留下相。
(3)用透析袋透析(1000Da)48h，以除去硫酸铵。随后在60℃下减压浓缩，加入4倍体积95％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。其中，所得铁皮石斛多糖萃取率为94.17％，除蛋白率为92.76％，粗多糖纯度为85.20％，乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后多糖纯度为95.35％。
实施例2
(1)一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，铁皮石斛鲜茎50℃烘干，用中药粉碎机粉碎至200目；准确称取铁皮石斛粉末10.0g，按照1:20料液质量体积比加入去离子水250mL，搅拌均匀；溶液温度保持在60℃，提取2次，每次1h；将2次提取液合并，纱布过滤，以7500r/min离心10min，取上清液得到澄清提取液，用旋转蒸发仪60℃浓缩至30mL，再加入120mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏12h，取出后在5000r/min离心15min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行冷冻干燥2天，研磨白色固体得到粗多糖粉末。将铁皮石斛粗多糖用去离子水配制成0.5mg/mL的溶液，加热搅拌使其充分溶解，放置至室温(25℃)备用。
(2)固定乙醇-硫酸铵双水相体系质量为30.0g。在50mL离心管中分别加入5.64g的硫酸铵和7.5g乙醇溶液，加入16.86g浓度为0.5mg/mL的铁皮石斛粗多糖提取液，置于漩涡混合器上于室温下混合，静置至上下相体积不再发生变化，萃取结束后将两相分开，保留下相。
(3)用透析袋透析(1000Da)48h，以除去硫酸铵。随后在60℃下减压浓缩，加入4倍体积95％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。其中，所得铁皮石斛多糖萃取率为93.61％，除蛋白率为91.53％，粗多糖纯度为86.09％，乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后多糖纯度为95.14％。
实施例3
(1)一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，铁皮石斛鲜茎50℃烘干，用中药粉碎机粉碎至200目；准确称取铁皮石斛粉末10.0g，按照1:30料液质量体积比加入去离子水250mL，搅拌均匀；溶液温度保持在55℃，提取2次，每次1h；将2次提取液合并，纱布过滤，以7500r/min离心10min，取上清液得到澄清提取液，用旋转蒸发仪60℃浓缩至30mL，再加入120mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏12h，取出后在5000r/min离心15min，弃上清液留沉淀，将沉淀进行冷冻干燥2天，研磨白色固体得到粗多糖粉末。将铁皮石斛粗多糖用去离子水配制成0.5mg/mL的溶液，加热搅拌使其充分溶解，放置至室温(25℃)备用。
(2)固定乙醇-硫酸铵双水相体系质量为30.0g。在50mL离心管中分别加入5.64g的硫酸铵和7.5g乙醇溶液，加入16.86g浓度为0.5mg/mL的铁皮石斛粗多糖提取液，置于漩涡混合器上于室温下混合，静置至上下相体积不再发生变化，萃取结束后将两相分开，保留下相。
(3)用透析袋透析(1000Da)48h，以除去硫酸铵。随后在60℃下减压浓缩，加入4倍体积95％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。其中，铁皮石斛多糖萃取率为93.73％，除蛋白率为91.97％，粗多糖纯度为84.28％，乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后多糖纯度为96.64％。
实施例4
实施例4与实施例1的不同之处在于铁皮石斛粗多糖浓度为1mg/mL，其余处理方式均与实施例1相同。所得铁皮石斛多糖萃取率为94.39％，除蛋白率为91.36％，粗多糖纯度为85.94％，乙醇-硫酸铵双水相体系纯化后多糖纯度为95.96％。
为了使得本领域技术人员更加了解本申请，下面给出本申请实施例1至实施例4中的萃取率以及纯度计算方法。
葡萄糖标准曲线的测定：将葡萄糖标准品放置于65℃干燥箱中烘干至恒重，精确称取葡萄糖标准品制成每1mL含90μL的溶液的葡萄糖标准溶液。分别吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于试管中，用去离子水补齐至总体积为1.0mL。向各试管中加入1.0mL的5％苯酚溶液(现配现用)，摇匀后加入5.0mL浓硫酸，置旋涡震荡器摇匀，每个样品平行测定3次，90℃下水浴加热25min，水浴后流水冷却3min，在波长490nm处测定吸光度值。以吸光值(y)对应葡萄糖含量(x)获得标准曲线线性回归方程为：y＝66.356x+0.0021(R2＝0.9995)。
多糖萃取率的测定：精确取样品1.0mL，下相溶液与铁皮石斛粗多糖溶液稀释10倍，上相无须稀释，精密加1.0mL的5％苯酚溶液，随后加入5.0mL浓硫酸，置旋涡震荡器摇匀，90℃水浴加热25min，在波长490nm处测定吸光度值。根据葡萄糖标准曲线计算出双水相体系中上下相的多糖含量，计算出双水相体系的多糖萃取率(多糖萃取率为双水相下相所得多糖的量占铁皮石斛多糖提取液中所含多糖总量的比例)，具体公式如下。
Figure BDA0002982158380000051
Figure BDA0002982158380000052
Figure BDA0002982158380000061
式中：K1为多糖在两相体系中的分配系数；R为上下两相的体积之比；Y1为多糖在下相中的质量分数；ct1为上相多糖浓度；cb1为下相多糖浓度；Vt为上相体积；Vb为下相体积。
蛋白质标准曲线的测定：精确称取牛血清白蛋白10mg，制成0.1mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液。精确称取考马斯亮蓝G-250粉末100mg，用95％乙醇50mL溶解，加入100mL85％的磷酸溶液，再转移至1000mL容量瓶中用水定容，制成考马斯亮蓝试剂。分别吸入标准牛血清白蛋白溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，用去离子水补齐至总体积为1.0mL。加考马斯亮蓝G-250试剂5.0mL摇匀，放置5min后，在波长595nm处测定吸光度值。以横坐标为蛋白含量，纵坐标为吸光度值绘制标准曲线。以吸光值(y)对应蛋白质含量(x)获得标准曲线线性回归方程为y＝20.743x+0.0025(R2＝0.9987)。
除蛋白率的测定：将双水相两相溶液透析完全，精密取双水相体系上下两相与铁皮石斛粗多糖溶液样品1.0mL，精密加考马斯亮蓝G-250试剂5.0mL，摇匀，放置5min，在波长595nm处测定吸光度值。根据蛋白质标准曲线计算出双水相体系中上下相的蛋白质含量，计算出双水相体系的除蛋白率(除蛋白率为下相蛋白质的量占粗多糖溶液中蛋白质的量的比例)。
根据蛋白质标准曲线计算出双水相体系中上下相的蛋白质含量，计算出双水相体系的除蛋白率。
Figure BDA0002982158380000062
Figure BDA0002982158380000063
Figure BDA0002982158380000064
式中：K2为蛋白质在两相体系中的分配系数；R为上下两相的体积之比；Y2为蛋白质在上相中的质量分数；ct2为上相蛋白质浓度；cb2为下相蛋白质浓度；Vt为上相体积；Vb为下相体积。
本发明通过乙醇-硫酸铵双水相体系纯化得到的铁皮石斛多糖，乙醇-硫酸铵双水相体系的建立依据见图1，在25℃时，使用浊点法得到乙醇-硫酸铵双水相体系的相图。
实验结果与方差分析
在单因素实验基础上，单因素考察如表1所述，使用软件Design-Expert8.0.6进行三因素三水平响应面试验设计，以(NH4)2SO4浓度、C2H5OH浓度和萃取温度作为自变量，多糖萃取率与除蛋白率作为响应值，共设计17组试验，如表2所示。
表1 Box-Behnken实验因素水平表
Figure BDA0002982158380000071
表2响应面试验设计及结果
Figure BDA0002982158380000072
试验结果采用Design Expert 8.0.6软件进行统计分析，对表2的数据进行二次多项式拟合，得到二次多元回归模型为：
多糖萃取率：Y＝94.75-1.91A+1.07B+2.34C+0.16AB-2.21AC-2.26BC-5.05A2-5.94B2-3.68C2
除蛋白率：Y＝91.76-5.16A-1.90B-4.51C+3.67AB+4.95AC+0.79BC-9.19A2-9.35B2-12.02C2
得到多糖萃取率和除蛋白率的方差分析结果见表3和表4。
表3多糖萃取率方差分析结果
Figure BDA0002982158380000081
注：表示不显著(P＞0.05)；“*”表示显著(P＜0.05)；“**”表示极显著(P＜0.01)。
从表3可以看出，回归模型的P-Value＜0.0001，表明该模型极显著。模型失拟项的P-Prob＞F值＝0.1407＞0.05，失拟项不显著，说明残差都是由随机误差引起的。模型确定系数R2＝0.9895，R2 Adj＝0.9761，说明该模型可以解释97.61％响应值的变化，模型与试验的拟合程度较好。由方差分析表可以看出，硫酸铵浓度(A)、乙醇浓度(B)及萃取温度(C)对多糖萃取率都有极显著性影响。根据F值可知，影响多糖萃取率的三个因素大小顺序为C＞A＞B，即萃取温度＞硫酸铵浓度＞乙醇浓度。交互项AB不显著，AC、BC交互作用极显著。
表4除蛋白率方差分析结果
Figure BDA0002982158380000091
注：表示不显著(P>0.05)；“*”表示显著(P＜0.05)；“**”表示极显著(P＜0.01)。
从表4可以看出，回归模型的P-Value＜0.0001，表明该模型极显著。模型失拟项的P-Prob＞F值＝0.0516＞0.05，失拟项不显著，说明残差都是由随机误差引起的。模型确定系数R2＝0.9894，R2 Adj＝0.9759，说明该模型可以解释97.59％响应值的变化，模型与试验的拟合程度较好。由方差分析表可以看出，硫酸铵浓度(A)、乙醇浓度(B)及萃取温度(C)对除蛋白率都有极显著性影响。根据F值可知，影响除蛋白率的三个因素大小顺序为C>A>B，即萃取温度>硫酸铵浓度>乙醇浓度。交互项BC不显著，AB、AC交互作用极显著。
各因素相互作用对多糖萃取率和除蛋白率的影响，各个因素之间相互作用如下。根据试验拟合得到的回归方程，得出响应面图，图中等高线和三维图的陡峭度反映出每个因素的相互联系。若等高线图中心是圆形就表明影响多糖萃取率的两个因素之间交互作用是不显著的，椭圆形则表明是显著的；三维立体图的曲面越陡，就说明两因素之间交互作用为显著。
由图2、3、4的响应面图可知，随着各个因素的增大，多糖萃取率逐渐增大，增加至一定程度时，多糖萃取率达到最大值，但随着各个因素继续增加，多糖萃取率逐渐降低。等高线图可看出乙醇浓度(B)与萃取温度(C)的响应曲面走势最陡峭，其等高线中心呈椭圆形，BC项(P＝0.0010)对多糖萃取率有极其显著影响。硫酸铵浓度(A)与萃取温度(C)的响应曲面走势陡峭，AC项(P＝0.0012)对多糖萃取率也有极其显著影响。硫酸铵浓度(A)与乙醇浓度(B)的等高线中心趋近于圆形，AB项(P＝0.7154)交互作用不显著。
由图5、6、7的响应面图可知，随着各个因素的增大，除蛋白率逐渐增大，增加至一定程度时，除蛋白率达到最大值，但随着各个因素继续增加，除蛋白率逐渐降低。等高线图可看出硫酸铵浓度(A)与萃取温度(C)的响应曲面走势最陡峭，AC项(P＝0.0008)对除蛋白率有极显著影响。硫酸铵浓度(A)与乙醇浓度(B)的响应曲面走势陡峭，AB项(P＝0.0043)对除蛋白率也有极显著影响。乙醇浓度(B)与萃取温度(C)的等高线中心趋近于圆形，BC项(P＝0.4019)交互作用不显著。
2.3.3响应面优选条件验证响应面优化结果得知，乙醇-硫酸铵双水相体系萃取纯化铁皮石斛多糖的最佳工艺条件为：硫酸铵浓度为18.76％，乙醇浓度为24.95％，温度为24.92℃，在此条件下铁皮石斛多糖萃取率与除蛋白率分别为94.85％和92.62％。根据实际情况进行调整，双水相体系在30.0g情况下，硫酸铵浓度为18.80％，乙醇浓度为25.00％，萃取温度为25℃，在该条件下得到的多糖萃取率与除蛋白率94.39±0.58％和91.36±0.70％，与模型预测值基本符合，表明所选模型合理，能够模拟和预测该双水相体系对铁皮石斛多糖萃取率与除蛋白率的影响。实验中粗多糖纯度为85.20±0.74％，双水相纯化后多糖的纯度为95.96±0.61％，多糖纯度明显提高。

Claims (6)

1.一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：依次包括下述步骤：
1)将铁皮石斛鲜茎在40-50℃烘干，粉碎至100-300目；
2)将铁皮石斛粉末按照料液质量体积比1g:15-30ml溶解于去离子水中，在50-60℃，提取2次，每次1-3h，合并提取液，过滤后收集上清液，以6000-8000r/min离心10-15min，取上清液，用50-60℃浓缩至提取液总体积的0.015-0.025倍；
3)加入80-160mL的95％乙醇，摇匀，4℃下冷藏8-12h，取出后在4500-5000r/min离心，收集沉淀并冷冻干燥2天，研磨得到白色粗多糖粉末，在用55-65℃水溶解得到0.5-5mg/mL浓度的粗多糖溶液；
4)向粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵混合溶液静置分层，在15-55℃萃取，萃取结束后将两相分离，保留下相物质，即为浸提液；
5)在60℃下减压浓缩浸提液，再加入4倍体积70-90％乙醇过夜，离心收集沉淀进行冷冻干燥，得到铁皮石斛纯多糖。
2.根据权利要求1所述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：所述的乙醇-硫酸铵混合溶液中乙醇的质量浓度为21-30％，硫酸铵的质量浓度为17-21％。
3.根据权利要求2所述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：所述乙醇-硫酸铵混合溶液中乙醇的添加量为7.5g/30g，硫酸铵的添加量为5.64g/30g。
4.根据权利要求1所述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：步骤4)具体为：将步骤3)中的粗多糖溶液加入乙醇-硫酸铵，置于漩涡混合器上于室温下混合，静置至上下相体积不再发生变化，将双水相体系两相分离并进行透析48h。
5.根据权利要求1所述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：步骤5)中离心收集沉淀的方法为在浸提液中加入浓度为95％的乙醇搅拌摇匀，4℃冷藏12h，取出后5000r/min离心10min，保留沉淀。
6.根据权利要求3所述的双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法，其特征在于：步骤4)所述乙醇-硫酸铵混合溶静置时间4-6min。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113501968A (zh) * 2021-08-11 2021-10-15 梅州绿盛林业科技有限公司 基于锌的金属有机骨架材料及其应用
CN113512129A (zh) * 2021-08-23 2021-10-19 石河子大学 一种植物中多糖的提取方法
CN113817172A (zh) * 2021-08-11 2021-12-21 梅州绿盛林业科技有限公司 用于纯化铁皮石斛多糖类化合物的金属有机骨架材料及纯化方法
CN113845603A (zh) * 2021-10-19 2021-12-28 上海交通大学 醇溶性均一多糖及其抗抑郁用途
CN114478578A (zh) * 2021-12-24 2022-05-13 上海中医药大学 测定羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物及其制备方法和应用
CN114853824A (zh) * 2022-04-29 2022-08-05 上海中医药大学 一种石斛寡糖的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130310554A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Hong Kong Baptist University Aqueous Diphase Solvent System for Preparing High-Purity Polysaccharides
CN104829738A (zh) * 2015-05-12 2015-08-12 上海海洋大学 草叶马尾藻多糖提取物在改善肠道菌群防治糖尿病中的应用
CN108840956A (zh) * 2018-05-04 2018-11-20 山西大学 一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法
CN111978424A (zh) * 2020-08-27 2020-11-24 上海应用技术大学 一种一步纯化铁皮石斛水溶性多糖的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130310554A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 Hong Kong Baptist University Aqueous Diphase Solvent System for Preparing High-Purity Polysaccharides
CN104829738A (zh) * 2015-05-12 2015-08-12 上海海洋大学 草叶马尾藻多糖提取物在改善肠道菌群防治糖尿病中的应用
CN108840956A (zh) * 2018-05-04 2018-11-20 山西大学 一种双水相萃取分离纯化铁皮石斛多糖的方法
CN111978424A (zh) * 2020-08-27 2020-11-24 上海应用技术大学 一种一步纯化铁皮石斛水溶性多糖的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
党金宁等: "乙醇/硫酸铵双水相体系提取蕨麻多糖及其抑菌抗氧化活性", 《食品工业科技》 *
张鉥孟等: ""乙醇-硫酸铵双水相体系萃取坛紫菜多糖"", 《食品科技》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113501968A (zh) * 2021-08-11 2021-10-15 梅州绿盛林业科技有限公司 基于锌的金属有机骨架材料及其应用
CN113817172A (zh) * 2021-08-11 2021-12-21 梅州绿盛林业科技有限公司 用于纯化铁皮石斛多糖类化合物的金属有机骨架材料及纯化方法
CN113817172B (zh) * 2021-08-11 2023-03-17 梅州绿盛林业科技有限公司 用于纯化铁皮石斛多糖类化合物的金属有机骨架材料及纯化方法
CN113512129A (zh) * 2021-08-23 2021-10-19 石河子大学 一种植物中多糖的提取方法
CN113845603A (zh) * 2021-10-19 2021-12-28 上海交通大学 醇溶性均一多糖及其抗抑郁用途
CN114478578A (zh) * 2021-12-24 2022-05-13 上海中医药大学 测定羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物及其制备方法和应用
CN114478578B (zh) * 2021-12-24 2024-03-29 上海中医药大学 测定羧酸酯酶1的特异性生物发光探针底物及其制备方法和应用
CN114853824A (zh) * 2022-04-29 2022-08-05 上海中医药大学 一种石斛寡糖的制备方法

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