CN106668058A - 一种中药成分巴戟天多糖对雄性生殖系统损伤的修复作用 - Google Patents

一种中药成分巴戟天多糖对雄性生殖系统损伤的修复作用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了巴戟天多糖在制备预防和治疗雄性生殖系统疾病的药物或保健品中的用途。巴戟天多糖的平均分子量为：1.0～1.5×104，用量为200～300 mg kg‑1；本发明将巴戟天多糖直接用于制备预防和治疗雄性生殖系统疾病的药物或保健品中，发挥对雄性生殖系统的损伤具有修复作用，促进生精功能，提高性行为能力，提高生殖能力，增加体内睾酮水平，从而避免了直接食用巴戟天生药具有肝肾毒性的技术难题。

Description

一种中药成分巴戟天多糖对雄性生殖系统损伤的修复作用
技术领域
本发明涉及多糖提取及应用技术领域，具体为一种中药成分巴戟天多糖对雄性生殖系统损伤的修复作用。
背景技术
由于环境污染和生活压力增大等因素的影响，人的生育能力日渐低下，不育症已成为一项世界性的医学和社会学问题。据世界卫生组织估计，全球有6千万～8千万对不育夫妇。近。临床上常用克罗米酚、吲哚美辛等治疗各种少、弱精子症，具有一定的疗效，但都存不同程度的毒副作用。克罗米酚可引起体重和性欲改变,轻度抑郁、恶心晕眩、视觉障碍、胃肠道反应和皮疹等副作用。吲哚美辛治疗2～4个月后，精子密度及精子运动速度有明显改观。但是有个别病例效果欠佳,主诉服药后有呕吐、头昏等不良反应,停药2个月后精液中精子又恢复至治疗前水平。因此，寻找能有效促进精子生成和减少毒副作用的新型生精药物是当前新药研发热点之一。
精索静脉曲张(VaricoceLe，VC)是指由于静脉回流受阻或瓣膜失效血液返流等因素导致精索静脉的伸长、扩张及迂曲，并伴有两侧阴囊体积不对称、阴囊重量增加及睾丸疼痛等,是男性泌尿生殖系统中常见的疾病之一。普通人群VC发病率为10％～15％,30～35％的原发性男性不育患者及69～81％的继发性男性不育患者均患有精索静脉曲张，是造成男性不育最主要的因素。WHO在男性不育研究中已把VC列入首位，然向其所致不孕的机理至令仍未完全阐明。
巴戟天是天然中草药，茜草科藤状灌木的根，主要生长在我省闽南山区、广东和广西。在闽南地区有大面积的人工栽培，是我省的特产之一。中医认为巴戟天具有壮阳补肾、固精安神功效，享有“北方高丽，南方巴戟”美称。产地民众有用巴戟天“与肉同煲”的食用习惯，以此来提高性能力，治疗阳痿等疾病。现代药理学研究认为巴戟天能提高人体免疫力、增强性欲等。巴戟天的主要化学成分为糖类、蒽醌类和氨基酸类，此外还含有挥发性成分(主要为有机酸及其酯)，环烯醚萜和苷类，甾体化合物以及含有24种微量元素。巴戟天作为我国传统常用中药之一，具有多方面的药理作用。近年来大量临床应用及动物实验也证明对雄性生殖系统的损伤具有明显的修复作用，但是巴戟天中成分复杂，直接食用生药药具有一定的肝肾毒性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的中草药巴戟天对雄性生殖系统的损伤具有明显的修复作用，但是巴戟天中成分复杂，直接食用生药具有一定的肝肾毒性的缺陷，提供一种一种中药成分巴戟天多糖对雄性生殖系统损伤的修复作用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
巴戟天多糖在在制备预防和治疗雄性生殖系统疾病的药物或保健品中的用途。
进一步的，所述的雄性生殖系统疾病为精索静脉曲张。
进一步的，所述的巴戟天多糖的平均分子量为：1.0～1.5×104。
进一步的，所述的巴戟天多糖的提取方法，包括以下步骤：
1)、将巴戟天粉末用3倍质量的95％乙醇沸水浴回流提取2h，重复一次，除去脂溶性成分以及寡糖；
2)药渣自然挥发至无醇味，用6倍质量的双蒸水沸水浴提取2h，重复两次；
3)、合并药液，使用旋转蒸发仪进行浓缩，至比重达到1.2g/mL；加入无水乙醇，使乙醇体积分数达到60％，4℃冰箱过夜，收集沉淀，得到巴戟天粗糖；
4)、加等量水溶解巴戟天粗糖，加入1/3体积的sevag试剂(氯仿：正丁醇＝1：4)，置于分液漏斗中，振摇，静置分层1h，除去下层氯仿和中间层变性蛋白质，重复两次，得脱蛋白的巴戟天总多糖；
5)、调节巴戟天总多糖的pH为9.0，采用30％质量分数的H2O260℃除色30min；加入无水乙醇，使乙醇质量分数达到60％，4℃冰箱过夜，收集沉淀；
6)、沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘箱干燥，得巴戟天多糖粉末。
优选的，所述的巴戟天多糖的用量为200～300mg kg-1。
本发明将巴戟天多糖直接用于制备预防和治疗雄性生殖系统疾病的药物或保健品中，发挥对雄性生殖系统的损伤具有修复作用，促进生精功能，提高性行为能力，提高生殖能力，增加体内睾酮水平，从而避免了直接食用巴戟天生药具有肝肾毒性的技术难题。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是空白对照组的HE染色结果；
图2是精索静脉曲张模型组的HE染色结果；
图3是300mg kg-1巴戟天多糖给药组的HE染色结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一、巴戟天多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)将巴戟天粉末用3倍质量的95％乙醇沸水浴回流提取2h，重复一次，除去脂溶性成分以及寡糖；
(2)药渣自然挥发至无醇味，用6倍质量的双蒸水沸水浴提取2h，重复两次；
(3)合并药液，使用旋转蒸发仪进行浓缩，至比重达到1.2g/mL；加入无水乙醇，使乙醇体积分数达到60％，4℃冰箱过夜，收集沉淀，得到巴戟天粗糖；
(4)加等量水溶解巴戟天粗糖，加入1/3体积的sevag试剂(氯仿：正丁醇＝1：4)，置于分液漏斗中，振摇，静置分层1h，除去下层氯仿和中间层变性蛋白质，重复两次，得脱蛋白的巴戟天总多糖；
(5)调节巴戟天总多糖的pH为9.0，采用30％质量分数的H2O260℃除色30min；加入无水乙醇，使乙醇质量分数达到60％，4℃冰箱过夜，收集沉淀；
(6)沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘箱干燥，得巴戟天多糖粉末。
二、精索静脉曲张动物模型的构建
腹部备皮，酒精消毒，腹部正中切口，显露腹腔，纱布卷将腹腔内容推向右侧，显露肾脏、结肠和下腔静脉，分离左侧肾静脉入下腔静脉入口处，紧邻入口处将肾静脉钝性分离一通道，去除周围脂肪组织，置一根直径约为0.8mm的金属杆，与左肾静脉一起结扎，结扎后将金属杆拨出，腹腔内注入青霉素后，关腹。手术后常规饲养两个月，再给予不同浓度的巴戟天多糖灌胃治疗一个月后取材。取材时采用氯胺酮腹腔注射麻醉大鼠，剖腹观察，若出现左侧精索内静脉扩(左侧精索静脉直径至少为右侧精索静脉直径的三倍)张且两个肾脏重量相似，则表明手术成功，假手术组大鼠未见扩张。
三、动物实验分组及处理
45只健康青春期雄性SD大鼠(200±20g)随机分假手术组、VC+生理盐水组、VC+巴戟天多糖给药组300mg/kg三组，每组15只：
(1)假手术组：打开腹腔，暴露左肾静脉，但不进行结扎。
(2)VC+生理盐水组：VC手术后常规饲养4周，再给予生理盐水灌胃4周后取材。
(3)VC+巴戟天多糖给药组300mg/kg：VC手术后常规饲养4周，再给予300mg/kg巴戟天多糖给灌胃治疗4周后取材。
四、HE染色及附睾精子数测定
(1)左侧睾丸组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。苏木素染色5min，自来水冲洗。盐酸乙醇分化30s(提插数下)。自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min，然后置伊红液2min，水洗5min。常规脱水，透明，封片：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固。
(2)30d后处死动物，取一侧附睾尾称量后置于37℃的2mL生理盐水中，剪碎，再加2mL生理盐水，吸管吹打30次，混匀，稍停，用4层擦镜纸过滤，再用1mL生理盐水冲平皿，过滤。移液管移取滤液1mL，另取37℃生理盐水9mL混匀，制备成10mL精子悬液(以上操作均在37℃电热恒温水温箱中进行)。
用定量移液管吸取少量精子悬液，缓慢加在血细胞计数板上，静置半分钟，按红细胞计数法计数5个中方格的精子数，高倍镜下计数精子总数为R，精子密度＝R×50×稀释倍数×106/mL，即获得每侧附睾精子悬液每毫升精子数。
五、大鼠性行为能力测定及大鼠生殖能力的测定
在安静的室内轮流将每组动物中的每只雄性大鼠放入45cm×25cm×20cm的干净的大鼠笼中适应5min,随后投入同批饲养的未经辐射的雌性大鼠形成1对1配对,观察30min。观察指标:
(1)扑捉潜伏期:(capture incubationperiod,CIP)自雌鼠投入至雄鼠第一次扑捉雌鼠的时间。
(2)扑捉次数:(capture times,CT)自雌鼠投入30min内，雄鼠扑捉雌鼠或爬背或舔阴动作次数。
(3)母鼠怀孕率：将挑选好的动物于下午5-6点，按1公1母比例放在准备好的鼠笼中，第二天早上7-8点检查阴栓，计算每组怀孕母鼠个数。
六、大鼠睾丸内睾酮水平及血清睾酮水平测定
(1)新鲜睾丸组织取材：大鼠禁食24h，称重记录后用10％水合氯醛(3～6mL/kg)腹腔注射麻醉。仰卧位固定于手术台，打开腹腔检查模型是否制作成功，制作成功的模型剪开左侧阴囊，暴露睾丸，将睾丸上部血管结扎后，取下左侧睾丸，取大约100mg睾丸组织，用1mLPBS溶液研磨睾丸组织，5000rmp离心15min，去除睾丸组织块，留上清。上清中的总蛋白浓度采用BCA试剂盒测定。
(2)取血：打开胸腔，暴露心脏，用5mL注射器自右心房进针取血3～5mL，置于冰上冷却的EP管中，冰上静置30min；经4℃离心机，2500rpm离心15min，取上清血清置于另一EP管中，-20℃保存备用。
睾丸及血清中的睾酮水平采用ELISA方法测定，具体步骤按说明书操作。
七、统计分析
各组实验数据采用SPSS version 21.0进行单因素ANOVA检验，P＜0.05视为组间差异具有统计学意义。所有数据均用均数±标准差表示。
实验结果
一、HE染色结果及附睾精子数
图1、图2和图3分别表示空白对照组、精索静脉曲张模型组、300mg kg-1巴戟天多糖给药组。H&E染色结果显示VC会造成大鼠睾丸生精上皮结构损伤，表现为生精上皮变薄、生殖细胞及成熟精子数量减少、生精小管萎缩、各级生殖细胞排列紊乱、官腔中出脱落的未成熟精子(图1)。300mg kg-1巴戟天多糖对VC引起的损伤具有修复作用(图3)，表现为生精上皮厚度增加、生殖细胞数量及成熟精子数量增加、减少未成熟生殖细胞的脱落。同时精索静脉曲张会引起左侧附睾精子计数减少，巴戟天多糖能增加精子数量。
表1各组大鼠附睾精子计数结果(n＝8)
与空白组比较(P<0.05)；#与VC模型组比较(P<0.05).
二、大鼠性行为学及生殖能力
VC引起大鼠性行为能力及生殖能力降低，表现为扑捉潜伏期增加，扑捉次数减少，怀孕母鼠个数减少。给予巴戟天多糖后，与VC模型组相比，扑捉潜伏期减少，扑捉次数增加，怀孕母鼠个数增加。
表2大鼠性行为学及生殖能力(n＝10)
*与空白组比较(P<0.05)；#与VC模型组比较(P<0.05).
三、大鼠睾丸及血清睾酮水平
精索静脉曲张会引起睾丸内及血清内睾酮浓度降低，给予巴戟天多糖之后，两项指标增加。
表3大鼠睾丸及血清睾酮水平(n＝8)
*与空白组比较(P<0.05)；#与VC模型组比较(P<0.05).
本发明将巴戟天多糖直接用于制备预防和治疗雄性生殖系统疾病的药物或保健品中，发挥对雄性生殖系统的损伤具有修复作用，促进生精功能，提高性行为能力，提高生殖能力，增加体内睾酮水平，从而避免了直接食用巴戟天生药具有肝肾毒性的技术难题。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.巴戟天多糖在在制备预防和治疗雄性生殖系统疾病的药物或保健品中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的雄性生殖系统疾病为精索静脉曲张。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的巴戟天多糖的平均分子量为：1.0～1.5×104。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的巴戟天多糖的提取方法，包括以下步骤：
1）、将巴戟天粉末用3倍质量的95％乙醇沸水浴回流提取2h，重复一次，除去脂溶性成分以及寡糖；
2）药渣自然挥发至无醇味，用6倍质量的双蒸水沸水浴提取2h，重复两次；
3）、合并药液，使用旋转蒸发仪进行浓缩，至比重达到1.2g/mL；加入无水乙醇，使乙醇体积分数达到60%，4℃冰箱过夜，收集沉淀，得到巴戟天粗糖；
4）、加等量水溶解巴戟天粗糖，加入1/3体积的sevag试剂，置于分液漏斗中，振摇，静置分层1h，除去下层氯仿和中间层变性蛋白质，重复两次，得脱蛋白的巴戟天总多糖；
5）、调节巴戟天总多糖的pH为9.0，采用30%质量分数的H2O2 60℃除色30min；加入无水乙醇，使乙醇质量分数达到60%，4℃冰箱过夜，收集沉淀；
6）、沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘箱干燥，得巴戟天多糖粉末。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的巴戟天多糖的用量为200～300 mg kg-1。
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