CN107998143A

CN107998143A - 一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法

Info

Publication number: CN107998143A
Application number: CN201711455552.1A
Authority: CN
Inventors: 朱珠; 陈丽红; 刘景丰
Original assignee: Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Current assignee: Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-05-08

Abstract

本发明公开了一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法。其包括以下步骤：(1)、建立实验性精索静脉曲张动物模型；(2)、提取巴戟天粗多糖，初步纯化后，研究和探讨巴戟天粗多糖对实验性精索静脉曲张大鼠下丘脑‑垂体‑睾丸轴的修复作用，尤其是其在疾病早期和进展期的修复作用；(3)、结果表明：100mg/kg巴戟天粗多糖能够在精索静脉曲张早期修复双侧睾丸生精功能和附睾精子质量，其机制可能与抑制血管新生和维持间质正常代谢有关。本发明够改善亚临床或精索静脉曲张早期患者生精功能，抑制睾丸间质和血管进行性病变。

Description

一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法

技术领域

本发明涉及的是一种治疗精索静脉曲张的方法，具体涉及一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法。

背景技术

目前，全球有10％–15％不孕不育夫妇，其中男性病因的占45％–55％。男性不育症主要分为原发性不育症和继发性不育症。原发性不育是指一个男子从未使一个女子受孕，继发性不育则指一个男子曾使一个女子受孕而现在又同居一年未能使女方怀孕。精索静脉曲张占男性原发性不育病因的40％，继发性不育病因的71％，是已知的男性不育的主要病因。

精索静脉曲张是指精索静脉和蔓状静脉丛扩张，迂曲而引起的血管性疾病，好发于左侧(85％–90％)，但高达57％–85.7％患者表现为双侧睾丸病损。精索静脉曲张与少精症和性腺发育不良有关，且可能作为性腺机能减退症的危险因素之一。精索静脉曲张导致的睾丸损伤以生精上皮退行性变和生精细胞凋亡增多为特征，其机制可能与睾丸温度升高、灌注不足、缺氧、氧化应激、肾上腺代谢物逆流等有关。

发病率调查发现，10岁以下幼童无精索静脉曲张，而10-19岁青少年精索静脉曲张发病率约为16.2％，该数值与新入伍军人及接受输精管切除术的不育男性精索静脉曲张发病率接近。有报道称精索静脉曲张发病风险以每十岁上升10％的速度上升，至男性80岁时发病率接近75％以上。此外，精索静脉曲张所致生精阻滞和生精障碍的程度随疾病的持续时间而加重。

一项前瞻性队列研究还证实，青年时期的精索静脉曲张患者在老年期有更高的腹股沟直疝和慢性静脉疾患的发病率。因此，对精索静脉曲张早期患者及高危人群进行及时干预和治疗是很迫在眉睫的。

临床应用于精索静脉曲张的治疗的药物主要为改善通透性、增强精索静脉收缩的药物，如生物类黄酮和七叶皂苷素。此外，常用的还有以改善症状为主的非甾体抗炎药、改善精液质量的肉碱类(左旋肉碱或乙酰左旋肉碱)、抗氧化药物(维生素E)、人绒毛膜促性腺激素及促进GnRH释放增多的雌激素受体拮抗剂(氯米芬、他莫昔芬)。这些药物能够在一定程度上缓解睾丸水肿和疼痛，改善精液质量，但无法遏制疾病进程和转复生殖功能，且缺乏充分的循证医学证据。

曲张精索静脉切除术，因其术后患者精子质量明显改善，广泛应用于精索静脉曲张引起的男性不育。然而，其术后恢复生殖功能的效果并非十分理想，且有高达5％–14％的复发率。此外，对于性腺还在发育的青少年患者，曲张精索静脉切除术可能不利于双侧睾丸的修复和保护。

中药“巴戟天”，为茜草科植物巴戟天的根，主要产地为我国海南、福建、广东，为“四大南药”之一，有“南国人参”之称，并为《中国药典》收录22。本草正义言巴戟天“味辛，气温，专入肾家，为鼓舞阳气之用。温养元阳，则邪气自除，起阴痿，强筋骨，益精，治小腹阴中相引痛，皆温肾散寒之效”。巴戟天作为传统的“补肾要剂”，可补肾阳，强筋骨，袪风湿。现代医学研究也发现其有提高免疫功能、降低血压、抗炎、抗抑郁和类皮质激素等作用。

综上所述，本发明设计了一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法。

发明内容

针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，100mg/kg巴戟天粗多糖能够在精索静脉曲张早期修复双侧睾丸生精功能和附睾精子质量，其机制可能与抑制血管新生和维持间质正常代谢有关。因此，巴戟天粗多糖可能能够改善亚临床或精索静脉曲张早期患者生精功能，抑制睾丸间质和血管进行性病变。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，其包括以下步骤：1、建立实验性精索静脉曲张动物模型；2、提取巴戟天粗多糖，初步纯化后，研究和探讨巴戟天粗多糖对实验性精索静脉曲张大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴的修复作用，尤其是其在疾病早期和进展期的修复作用；3、结果表明：100mg/kg巴戟天粗多糖能够在精索静脉曲张早期修复双侧睾丸生精功能和附睾精子质量，其机制可能与抑制血管新生和维持间质正常代谢有关。

所述的步骤1具体包括：A动物分组和给药方法；B巴戟天粗多糖的制备和纯化；C巴戟天多糖含量测定；D巴戟天粗多糖光谱分析； E巴戟天粗多糖同质性和分子量分析；F巴戟天粗多糖的单糖成分分析；G Turner法制作实验性精索静脉曲张大鼠模型；H精索静脉曲张大鼠模型鉴定；I大鼠性行为学检测；J精子分析；K大鼠心脏灌注，取材和冰冻切片；L睾丸凋亡检测；M睾丸免疫组织荧光染色；N免疫印迹实验；O统计学方法。

本发明具有以下有益效果：巴戟天粗多糖可能能够改善亚临床或精索静脉曲张早期患者生精功能，抑制睾丸间质和血管进行性病变。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式来详细说明本发明；

图1为本发明实施例1的巴戟天粗多糖紫外(A)和红外(B)吸收光谱图；

图2为本发明实施例1的巴戟天粗多糖高效凝胶渗透色谱结果图；

图3为为本发明实施例1的各实验组双侧附睾精子伊红染色,睾丸HE染色和TUNEL凋亡染色(bar＝100μm)；

图4为本发明实施例1的各实验组双侧睾丸CD34和Cas-3免疫荧光染色(bar＝25μm)；

图5为本发明实施例1的各实验组双侧睾丸CD34，Cas-3，VEGF， p-AKT免疫荧光强度分析。^△P＜0.05：与假手术组相比；^＊P＜0.05：与曲张组相比。

图6为本发明实施例1的各实验组双侧睾丸VEGF和 phosphor-AKT免疫荧光染色(bar＝25μm)；

图7为本发明实施例1的各实验组双侧睾丸MMP-9和MMP-2免疫荧光染色(bar＝25μm)；

图8为本发明实施例1的各实验组双侧睾丸免疫印迹实验结果图。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1：A动物分组和给药方法

119只雄性SD大鼠按体重，以随机数字法，随机分为7组，每组17只，分别为假手术组，实验性精索静脉曲张模型组(以下简称曲张组)，溶剂对照组，25mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP25组)， 50mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP50组)，100mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP100组)，200mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP200组)。除假手术组外，均进行实验性精索静脉曲张手术。术后动物单笼饲养休息 3天。

于术后第4天，对实验动物给予巴戟天粗多糖药液治疗。假手术组和曲张组动物不给药；溶剂对照组动物给予双蒸水，1.5ml/天；余巴戟天粗多糖治疗组给予相应药量的巴戟天多糖药液(100mg/ml)，不足2ml的，以双蒸水补足至1.5ml。持续治疗4周，即28天。

B巴戟天粗多糖的制备和纯化

(1)巴戟天干燥根剪断，粉碎，烘干(45℃，24h)。

(2)加入3倍量95％乙醇，煮沸2h，弃上清；重复一次。

(3)自然挥发干燥，用6倍量双蒸水，煮沸2h，收集药液(上清)；重复两次。

(4)药液冷却至室温，以6层纱布过滤后，65℃旋转蒸发，得相对密度1.2g/ml的流浸膏。

(5)加入无水乙醇，使醇含量达到60％，4℃静置24h，收集沉淀。

(6)脱蛋白：沉淀以双蒸水溶解，取1/3体积Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，二者混合加入分液漏斗，颠倒混匀5-8次，静置分层 1h。去除下层的氯仿液和中层变性蛋白。重复此步骤4次。

(7)向已脱蛋白的粗多糖液中加入无水乙醇，使醇含量达到60％， 4℃静置24h，收集沉淀。

(8)沉淀以无水乙醇，丙酮，乙醚分别洗涤一次，抽滤干燥，60℃干燥24h后，得巴戟天粗多糖粉末。

C巴戟天多糖含量测定

(1)制作葡萄糖标准曲线

a，配制葡萄糖原液：

称0.1g葡萄糖，溶解于50ml左右双蒸水中，以100ml容量瓶定容，得1.0mg/ml的葡萄糖原液。

b，配制0.2％蒽酮：

称0.2g蒽酮，少量浓H2SO4溶解，以100ml容量瓶定容，得0.2％蒽酮试剂。

c，制作葡萄糖标准曲线：

葡萄糖原液分别取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.8ml、 1ml于Ep管，加双蒸水稀释至5ml。取2ml以上葡萄糖液，分别加入0.2％蒽酮试剂4ml，速浸冰水浴中冷却。各管加完后一起煮沸10min，自来水冷却，室温平衡20min。以双蒸水为空白，测定625nm处吸光度(120min内显色结果稳定)。每管测定4次取平均值，以OD值为横坐标(X)，葡萄糖液浓度为纵坐标(Y)，制作标准曲线。

(2)巴戟天粗多糖纯度(碳水化合物含量)测定：

称巴戟天粗多糖0.1g，少量双蒸水溶解，以100ml容量瓶定容，得估计浓度为1.0mg/ml的巴戟天粗多糖原液。

巴戟天粗多糖原液分别取0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml于 Ep管，加双蒸水稀释至5ml。取2ml以上巴戟天粗多糖液，分别加入 0.2％蒽酮试剂4ml，速浸冰水浴中冷却。各管加完后一起煮沸10min，自来水冷却，室温平衡20min。测定625nm处吸光度(120min内显色结果稳定)。每管测定4次取平均值，带入葡萄糖标准曲线中得巴戟天粗多糖浓度。

巴戟天粗多糖纯度＝巴戟天粗多糖浓度/估计浓度(1.0mg/ml)

D巴戟天粗多糖光谱分析

巴戟天粗多糖7mg，加7ml ddH2O充分溶解，过滤膜，进样紫外可见分光光度计分析，波长范围190nm-400nm。进样红外光谱分析仪Spectrum 65，波长范围400-4000cm-1。

E巴戟天粗多糖同质性和分子量分析

高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析巴戟天粗多糖分子量，采用 Malvern A6000M*2聚甲基丙烯酸甲酯，Gene通用型混合床柱，流动相采用0.1mol/L硝酸钠水溶液(水相)，流速0.5ml/min，柱温30℃。采用多检测器联用法，即示差检测器、直角光散射检测器、小角光散射检测器三检测器联用测量物质的绝对分子量和分子量分布。用窄分布的标样葡聚糖建立方法，然后打开样品图谱，做基线积分计算结果。

F巴戟天粗多糖的单糖成分分析

准确称量巴戟天粗多糖样品0.2g(0.0001g)，用去离子水定容到5ml。取定容后试液40μl加300μl去离子水和80μl三氟乙酸，于110℃水解5h后取出冷却，接近室温后置于-80℃冷冻30min，然后冻干。用1ml去离子水定容，过膜上Agilent1260液相色谱检测。进样量20μl，色谱柱Innoval NH2(4.6mm×250mm)，流动相为乙腈：水＝85:15，流速1.0ml/min，柱温40℃。采用Alltech 2000ES蒸发光散射检测器(ELSD)，漂移管90℃，气体流速2.0ml/min。

G Turner法制作实验性精索静脉曲张大鼠模型

SD大鼠给予3.3ml/kg体重的7％水合氯醛腹腔注射，约5min后，大鼠处于深麻状态。将动物保定于手术台，腹部备皮，碘伏消毒一次，75％酒精消毒3次。铺无菌手术巾，暴露术区(剑突下至髂前上棘平面腹中间区)。于剑突下一横指(约1.5cm)，沿腹白线纵行切开皮肤约 3cm，而后切开腹白线，钝性分离腹膜，进入腹腔。用浸过温生理盐水的纱布将左侧肠管拨至右侧，暴露腹后壁筋膜。钝性分离腹后膜，暴露下腔静脉，主动脉，肾蒂，肾上腺上静脉，精索内静脉。于肾静脉汇入下腔静脉处，放置一与肾静脉走行方向一致的探针。探针直径 0.8mm。以眼科弯镊将4号手术线绕到肾静脉后方，将肾静脉和探针一起结扎。注意结扎点需紧靠肾静脉汇入下腔静脉处，结扎点需位于精索内静脉汇入肾静脉之后。缓缓抽出探针，见肾静脉远端因血压增高而扩张。观察无活动性出血，将肠管复位，用3号手术缝线3层缝合腹前壁。术后动物单只单笼饲养三天。

H精索静脉曲张大鼠模型鉴定

SD大鼠给予3.3ml/kg体重的7％水合氯醛腹腔注射，约5min后，大鼠处于深麻状态。将动物保定于手术台，腹部备皮，碘伏消毒一次， 75％酒精消毒3次。于剑突下一横指(约1.5cm)，沿腹白线纵行切开皮肤约5cm，而后切开腹白线，钝性分离腹膜，进入腹腔。用浸过温生理盐水的纱布将肠管拨至腹腔外，钝性分离腹后膜，暴露下腔静脉，主动脉，双侧肾，肾蒂，精索内静脉。观察左右侧肾形态，大小；观察左侧精索内静脉是否存在迂曲和曲张；用游标卡尺测量左右侧精索内静脉管径。以左侧肾无萎缩，左侧精索内静脉管径大于右侧3倍视为建模成功。

I大鼠性行为学检测

实验在安静，周围物品和人员固定的房间进行。

将一只雄性大鼠放入45cm×25cm×20cm的干净鼠笼，适应环境 10min。将1只体重相当的雌性大鼠放入，开始计时，观察30min。观察指标为：

扑捉潜伏期(capture incubation period,CIP)：雄鼠第一次爬背雌鼠的时间。

扑捉次数(capture time,CT)：30min内，雄鼠爬背雌鼠的次数。

J精子分析

取大鼠双侧附睾头，在2ml预冷的0.01M PBS中剪碎，吸取0.05ml 精子悬液，以80μm尼龙膜过滤后，PBS稀释(1:40)，混匀。

精子计数：将以上稀释后的精子悬液加入血球计数器，计数8个中格(每格1mm2)内精子数量，乘以5×106，得该侧附睾精子数量。

精子畸形率：以稀释后的精子悬液制作精子涂片，室温晾干。以 1％伊红染色20min，双蒸水冲洗，干燥。高倍镜下观察1000个精子，计算形态失常精子的百分率为该侧附睾精子畸形率。

K大鼠心脏灌注，取材和冰冻切片

SD大鼠给予3.3ml/kg体重的10％水合氯醛腹腔注射，约5min后，大鼠处于深麻状态。从剑突处剪开胸腔，暴露心脏。用管径约1.6mm 的静脉穿刺针从左心室插入升主动脉，快速灌注0.01M PBS，与此同时，剪开右心耳。在10min内快速灌注500ml 0.01M PBS，见右心耳流出液变清澈。缓慢滴注300-400ml 4％多聚甲醛(0.01M PBS稀释)，约50min，直到四肢僵直。

断头取脑，取双侧睾丸、附睾。用止血钳从枕骨大孔撬开颅盖，慢慢剥出脑，小心剪开视交叉处连接的视神经。所有组织浸泡于≧10 倍体积的4％多聚甲醛中固定24h。

梯度脱水：组织浸泡于梯度浓度的蔗糖液(0.01M PBS稀释)，10％蔗糖24h→20％蔗糖24h→30％蔗糖24h。

组织修块，包埋：切除视交叉前，菱形窝后脑组织；睾丸从中间横贯一切为二。组织以O.C.T.包埋，在-20℃恒冷箱切片机中至少冷冻半小时。在-20℃切片，厚度20μm，贴片于阳离子粘附载玻片。

睾丸组织冰冻切片苏木素-伊红染色(HE染色)和评分

a，睾丸组织冰冻切片室温复温30min，浸入0.01M PBS水化5min。

b，切片入苏木素染色液，染色40s。

c，切片立即浸入1％盐酸酒精(浓盐酸：95％酒精＝3:97)分色，显微镜下观察直至胶原蛋白无着色为止。

d，切片浸入1％氨水(氨水：D.DW＝1:99)，约1min，观察组织切片变蓝为止。

e，切片浸入伊红染色液，染色2min。

f，梯度酒精脱水：70％酒精1min→70％酒精1min→80％酒精1min →80％酒精1min→95％酒精3min→95％酒精3min→100％酒精3min→ 100％酒精3min→二甲苯5min→二甲苯10min。中性树胶封片。

在高倍镜下随机选取每个动物300个生精小管进行观察，并按照 John’s score(JS)评分标准打分，具体标准如下：

10分：精子生成过程中的细胞类型完整，管腔内有成熟的精子(成熟精子定义为已形成头部的精子)。生精小管为开放的官腔，结构完整，生精上皮厚度正常。

9分：有精子生成，但生精上皮结构紊乱，有明显的细胞脱落或管腔闭合。

8分：生精上皮仅少量精子产生(＜5-10个)。

7分：无精子，但有较多精细胞。

6分：无精子，且精细胞很少(＜5-10个)。

5分：无精子，无精细胞，但有较多精母细胞。

4分：无精子，无精细胞，且仅少量精母细胞(＜5个)。

3分：生精上皮仅有精原细胞和支持细胞。

2分：仅有支持细胞。

1分：无细胞。

每个实验动物组织选取10张连续切片，每张切片于100×显微镜下随机观察3个不重叠的视野，计数微血管数量，得平均微血管密度(MVD)。微血管在此意指睾丸间质中有明显管腔的血管，新生成的单层内皮细胞围城的血管除外。

L睾丸凋亡检测

a，睾丸冰冻切片室温复温30min，1×TBS水化5min。

b，Proteinase K：D.DW＝1:100稀释，每个样本滴加50μl，室温孵育20min。

c，1×TBS洗片5min。

d，30％H2O2：甲醇＝1:9配制内源性过氧化物酶阻断剂，每个样本滴加150μl，室温孵育5min。

e，1×TBS洗片5min。

f，每个样本滴加50μl TdT Equilibration Buffer，室温孵育 30min。

g，TdT Enzyme：TdT Labeling Reaction Mix＝1:39配制TdT Labeling ReactionMix，每个样本滴加40μl，37℃孵育1.5h。

h，1×TBS洗片5min。

i，每个样本滴加100μl Stop Buffer，室温孵育5min。

j，1×TBS洗片5min。

k，每个样本滴加100μl Blocking Buffer，室温孵育10min。

l，25×Conjugate：Blocking Buffer＝1:24配制1×Conjugate，每个样本滴加100μl，室温孵育30min。

m，1×TBS洗片5min。

n，DAB Solution 1：DAB Solution 2＝1:29配制DAB工作液，每个样本滴加100μl，避光室温反应3min后，以D.DW洗片。

o，每个样本滴加100μl Methyl Green染液，室温染色3min。

p，玻片浸于100％酒精2-4次，洗净多余的染色液。

q，玻片浸于100％酒精3min。

r，玻片浸于100％二甲苯5min。

s，中性树胶封片，Nikon Ti-s倒置光学显微镜观察，拍摄。

高倍镜下，每个动物样本随机观察300个生精小管，计算平均每个生精小管中凋亡细胞数量记为凋亡系数(AI值)。

M睾丸免疫组织荧光染色

a，取冰冻切片室温平衡30min，浸入0.01M PBS水化5min。

b，加10％山羊血清(0.01M PBS稀释)，60ul/组织，室温孵育30min。

c，用一抗稀释液稀释一抗：山羊抗Cas-3(稀释度1:100)和兔抗 CD34(稀释度1:100)，60ul/组织，4℃，48h。

d，0.01M PBS洗片，3min/次，3次。

e，用0.01M PBS稀释二抗(抗体信息和稀释度见前)，60ul/组织，室温孵育1h。

f，0.01M PBS洗片，3min/次，3次。

g，DAPI染核3min，0.01M PBS洗片，3min/次，3次。

h，避光晾干，用抗荧光淬灭剂封片。-20℃避光保存染色切片。

N免疫印迹实验(Western blot)

(1)取材和蛋白提取：

大鼠称重，腹腔注射3.3ml/1kg(体重)10％水合氯醛麻醉，断头取脑，取双侧睾丸。睾丸切取中间部约100mg组织，加入1mlRIPA裂解液，研磨，冰上裂解30min，4℃离心(18000g)20min，取上清。余睾丸组织保存于-80℃。

(2)蛋白浓度测定：

蛋白浓度测定采用BCA蛋白浓度测定试剂盒。

①蛋白标准品制备：

以1ml 0.01M PBS溶解蛋白标准品(5mg)，再取10μl稀释至100μl，得终浓度0.5mg/ml的蛋白标准。

②BCA工作液配制：

根据样品数量，BCA试剂A：试剂B＝50:1配制适量BCA工作液，充分混匀。

③蛋白浓度测定：

a，将蛋白标准按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中，每个标准品孔设置三个复孔，加0.01M PBS补足到20μl。

b，加1μl样品(每个样品设置3个复孔)到样品孔中，加0.01M PBS 补足到20μl。

c，各孔加入200μl BCA工作液，37℃孵育1h。

d，用酶标仪测定A562，根据标准品浓度和OD值绘制标准曲线，再根据样品OD值带入标准曲线求出浓度值，该浓度值乘以20得样品浓度。

(3)Tricine-SDS-PAGE凝胶配制：

①缓冲液配制:

a，10×阴极缓冲液：Tris 12.114g；Tricine 17.920g；SDS 1g PH约8.25，直接双蒸水定容至100ml，无需另调PH。

b，10×阳极缓冲液：Tris 12.114g；浓HCl 1.88ml 调PH至8.9，双蒸水定容至100ml。

c，3×Gel buffer(GB3×)

Tris 36.342g；浓HCl 8.36ml；SDS 0.3g 调PH至8.45，双蒸水定容至100ml。

d，AB-3(49.5％T，3％T)

丙烯酰胺48g；甲叉双丙烯酰胺1.5g；

双蒸水定容至100ml。

e，AB-6(49.5％T，6％T)

丙烯酰胺46.5g；甲叉双丙烯酰胺3g

双蒸水定容至100ml。

②制胶

	4％积层胶(4ml)	10％分离胶(10ml)	16％分离胶(10ml)
				AB-3(ml)	0.333	2	3.333
GB3×(ml)	1	3.333	3.333
				Glycerol(ml)	0	1	1
ddH₂O(ml)	2.667	3.667	2.334
				10％APS(μl)	30	50	33.33
TEMED(μl)	3	5	3.33

(4)电泳：

采用伯乐垂直电泳仪，目的蛋白分子量1-20KD选用16％分离胶电泳，目的蛋白分子量20-100KD选用10％分离胶电泳。Tricine专用阴极电泳液加满卡槽内，阳极电泳液加入卡槽外，保证阴极电泳液不外泄且电路通畅。单孔上样30μg样本蛋白，左侧1号泳道上样蛋白分子量标准。

稳压30V电泳到积层胶和分离胶分界处，稳压80V继续电泳1h，稳压140V跑到玻板底部。

(5)转膜：

转膜缓冲液：Tris-base 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，加 D.DW至1000ml。

切取合适分子量范围的凝胶，切取与凝胶等大的PVDF膜(预先以甲醇活化)。取伯乐转膜夹，按照黑面-海绵-三层滤纸-凝胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-白面的顺序制作转膜“三明治”，尽量避免气泡。将转膜夹放入转膜槽，加满电转液，冰上电转，小分子量(1-20KD)30min，稳压100V；大分子量(20-100KD)80min，稳压100V。

(6)丽春红染色，切膜：

将PVDF膜浸没于丽春红染色液，摇床摇动3min，以丽春红染出条带和蛋白分子量标准为参考，切膜，于TBST中漂洗至无红色。

(7)封闭：

PVDF条带以5％脱脂奶粉(TBST稀释)室温摇床封闭1h。

(8)一抗孵育：

以TBST稀释一抗，PVDF膜浸没于相应的一抗，摇床孵育，4℃过夜。

(9)二抗孵育，检测：

TBST洗涤PVDF条带，10min/次，3次。

以TBST稀释HRP标记的二抗，PVDF膜浸没于相应的二抗，摇床孵育，室温，2h。

TBST洗涤PVDF条带，10min/次，3次。

向待检测的PVDF条带滴加适量ECL发光液，于生物分子成像仪检测拍照。

条带以Image J分析平均灰度值。以目的条带与内参β-actin 的比值表示该目的蛋白的含量。

O统计学方法

使用Image Pro-plus对免疫荧光图片的单位荧光强度进行分析，使用ImageJ对免疫印迹实验灰度值进行分析，使用IBM SPSS 22.0 进行统计分析。连续性计量资料使用Z检验进行正态性检验，以P＞ 0.05视为正态分布总体。使用均数±标准差描述正态分布的总体特征，以单因素方差分析进行多组正态分布总体的比较，对于存在统计学差异的，以LSD法行两两比较。以P＜0.05视为存在统计学差异。

结果：1、巴戟天粗多糖提取和鉴定

5000g巴戟天干燥根经水提醇沉和脱蛋白纯化后，得393g灰色巴戟天粗多糖粉末。以葡萄糖为标准，检定该巴戟天粗多糖中碳水化合物含量达91％。

紫外光谱显示，在260nm和280nm处无明显的蛋白和核酸的吸收峰(图1A)。红外光谱也显示，在3391(-OH),2931(C-H),1636(-OH), 1385(酰胺中的C-H),1130(环上C-O),1032(醇羟基),936,873(α -型糖苷键)and 818(甘露糖)cm-1处有多个多糖特征性吸收峰(括号中为该波数对应的常见结构)(图1-B)。

HPGPC图谱显示标准曲线稳定，巴戟天粗多糖示一高尖的主峰，数均分子量(Mn)1141Daltons，重均分子量(Mw)1648Daltons，Z均分子量(Mz)2273Daltons，峰位分子量(Mp)1753Daltons，重均数均比Mw/Mn 1.444(图2)。

巴戟天粗多糖的化学构成为葡萄糖：半乳糖：木糖：果糖：麦芽糖：蔗糖＝7.63：1.23:0.95:0.72:0.87:0.64。葡萄糖是巴戟天粗多糖经三氟乙酸水解后的主要成分。

2、性行为学

曲张组雄鼠与雌鼠合笼后20min内，扑捉潜伏期(CIP)显著较假手术组延长(P<0.05)，扑捉次数较假手术组显著减少(P<0.05)。MOP50， MOP100和MOP200组大鼠CIP较曲张组均显著缩短(P<0.05)，且 MOP100组大鼠CIP与假手术组接近。巴戟天粗多糖治疗组(4组)大鼠 CF较曲张组均有所增多，其中MOP100组大鼠CF水平显著高于曲张组(P<0.05)，且接近假手术组水平(表1)。

表1各实验组动物性行为学水平

^aP＜0.05：与假手术组相比；

^bP＜0.05：与曲张组相比。

3、精子分析

曲张组大鼠左侧(患侧)附睾精子数量较假手术组同侧附睾精子数量显著减少(P<0.05)，且精子畸形率高(P<0.05)，高倍镜视野内难见形态完整的精子。曲张组右侧(健侧)精子数量较假手术组右侧显著减少(P<0.05)，且无头畸形精子多，精子畸形率高于假手术组 (P<0.05)(图3，表2)。

巴戟天粗多糖治疗组(4组)左侧附睾精子数量均高于曲张组 (P<0.05)，其中MOP100、MOP200两组左侧附睾精子数量与假手术组左侧接近。MOP200组左侧附睾精子呈现多种畸形，其畸形率明显高于其他巴戟天粗多糖治疗组(P<0.05)(图3，表2)。

巴戟天治疗组右侧附睾精子数量较曲张组显著增多(P<0.05)，其中MOP50、MOP100、MOP200三组右侧附睾精子数量与假手术组右侧接近。MOP200组右侧附睾精子畸形率明显高于其他巴戟天粗多糖治疗组(P<0.05)。

表2各实验组双侧附睾精子计数和精子畸形率

^aP＜0.05：与假手术组相比；^bP＜0.05：与曲张组相比。

4、睾丸HE染色

假手术组左侧和右侧睾丸HE染色见结构完整的生精小管，细胞排布有序，各层生精细胞(包括精原细胞，精母细胞，精细胞)完整，管腔内有成熟精子生成。间质紧密(图3)。

曲张组左侧(患侧)睾丸HE染色见生精小管排布散乱，基膜增厚变形，生精细胞散乱，脱落和丢失严重，部分生精小管内仅见支持细胞。管腔内大量细胞碎片。间质增宽、疏松、散乱。曲张组右侧(健侧)睾丸生精小管细胞排布紊乱，管腔内较多细胞碎片。间质水肿，增宽，疏松，间质血管数量多。

巴戟天粗多糖给药的各组大鼠左侧睾丸结构明显好转：MOP25组左睾丸生精小管内可见较多生精细胞，排布紊乱，有所缺失，管腔内有碎片，部分管腔内可见成熟精子，间质水肿，疏松，血管数量多； MOP50组左睾丸生精小管细胞层次明显，缺失不明显，排列可见疏松和紊乱，管腔内精子数量多，管腔内仍有碎片，间质仍见较多血管； MOP100组左睾丸生精小管结构完整，细胞无缺失，少有脱落，管腔内可见大量精子，间质致密，血管数量无明显异常；MOP200组左睾丸生精小管结构完整，生精细胞排列可见紊乱，管腔内大量精子生成，间质血管数量多。

巴戟天粗多糖给药的各组大鼠右侧睾丸生精小管，尤其是间质转复明显：MOP25组右侧睾丸生精小管结构完整，细胞排布有一定紊乱，但管腔有精子生成，间质血管数量多，间质水肿，增宽；MOP50组右睾丸生精小管细胞层次清晰，几乎未见丢失和脱落，管腔内大量精子生成，间质仅见少量水肿，血管数量无明显增多；MOP100组右侧睾丸形态与MOP50组接近，但生精细胞排布更为紧密和有序，间质致密，血管无明显增多；MOP200组右侧睾丸生精细胞排列有部分紊乱和疏松，管腔内有较多碎片，管腔内精子数量多，间质与MOP50组情况接近。

曲张组双侧睾丸JS评分较假手术组同侧睾丸JS评分均显著降低 (P<0.05)。巴戟天粗多糖给药组左侧睾丸JS评分较曲张组均有所上升(P<0.05)，其中MOP100组左侧睾丸JS评分较假手术组无统计学差异。巴戟天多糖给药组右侧睾丸JS评分较曲张组也有所提高(P<0.05)，其中MOP50组和MOP100组右侧睾丸JS评分达到假手术组右侧水平(表3)。

曲张组双侧睾丸平均微血管密度(MVD)较假手术组同侧睾丸显著增高(P<0.05)。MOP50组和MOP100组MVD水平较曲张组显著降低 (P<0.05)。所有实验组双侧睾丸MVD水平基本一致。

表3各实验组双侧睾丸JS评分及AI值

^aP＜0.05：与假手术组相比；^bP＜0.05：与曲张组相比。

5、睾丸凋亡分析

TUNEL染色切片中棕色为凋亡细胞。假手术组双侧睾丸生精小管内可见凋亡细胞。曲张组左侧睾丸由于大部分管腔细胞缺失较多，难以观察到凋亡的生精细胞，间质可见凋亡的间质细胞和血管壁层细胞。曲张组右侧睾丸生精小管内见大量凋亡细胞，凋亡细胞主要为精原细胞，可见凋亡的间质细胞和血管内皮细胞。

巴戟天粗多糖治疗组大鼠双侧睾丸生精细胞凋亡数量明显减少，具体表现为：MOP25组双侧睾丸凋亡细胞较假手术组明显增多 (P<0.05)，凋亡的细胞主要为精原细胞；MOP50组双侧睾丸凋亡的生精细胞主要为精原细胞和精母细胞，较MOP25组同侧睾丸凋亡细胞数量有所减少(P<0.05)；MOP100组双侧睾丸凋亡细胞较MOP50组显著减少(P<0.05)，凋亡的细胞主要为精原细胞，MOP100组右侧睾丸凋亡细胞较左侧显著减少(P<0.05)；MOP200组双侧睾丸凋亡细胞数量较MOP50和MOP100组显著增多(P<0.05)，凋亡的生精细胞主要有精原细和精母细胞，MOP200组右侧睾丸生精细胞凋亡数量显著多于左侧(P<0.05)(图3，表3)。使用AI表示平均单个生精小管生精细胞凋亡数量，AI变化同“凋亡的生精细胞数量”，见前，不赘述。

6、睾丸免疫荧光染色

(1)Cas-3

如图4，假手术组双侧睾丸Cas-3阳性产物位于各级生精细胞，包括精原细胞、精母细胞和精细胞，间质血管内皮也可见Cas-3分布。曲张组左侧睾丸生精上皮，基膜见大量Cas-3阳性产物，间质血管内、外膜均可见Cas-3分布。曲张组右侧睾丸各级生精细胞Cas-3荧光强度较假手术组右侧明显增强(P<0.05)，血管内膜、外膜和间质细胞均可见Cas-3分布。

巴戟天粗多糖给药组具体表现为：MOP25组左侧睾丸Cas-3主要分布于生精细胞和血管内皮，荧光强度较曲张组同侧显著降低 (P<0.05)，右侧睾丸Cas-3荧光强度较曲张组同侧有所降低；MOP50 组和MOP100组双侧睾丸Cas-3荧光强度均显著低于曲张组同侧(P<0.05)，MOP50组左侧睾丸间质血管内皮仍有较明亮的Cas-3阳性产物，而MOP50组右侧睾丸和MOP100组双侧睾丸切片间质血管内皮均表现为较低的Cas-3荧光分布。MOP200组双侧睾丸Cas-3荧光强度较曲张组显著增高(P<0.05)，Cas-3阳性产物主要分布于各级生精细胞和血管内、外膜。

(2)CD34

如图4和5，假手术组双侧睾丸CD34阳性产物很少，在基膜和血管外膜有少量分布。曲张组双侧睾丸CD34阳性产物多，广泛分布于几乎全部基膜，血管外膜和内膜，CD34荧光强度较假手术组同侧睾丸显著增强(P<0.05)，左右侧睾丸CD34荧光强度无显著差异。

巴戟天粗多糖给药组CD34分布情况：MOP25组CD34阳性产物多，分布特点与曲张组相似，荧光强度较曲张组无统计学差异；MOP50组 CD34阳性产物仍分布于基膜和血管外膜，血管内膜也有少量分布，但荧光强度较曲张组显著下降(P<0.05)；MOP100组CD34荧光强度较曲张组大幅下调(P<0.05)，仅基膜和血管外膜有少量分布；MOP200 组CD34主要分布于基膜和血管内、外膜，荧光强度较MOP100组显著上调(P<0.05)，与曲张组相比无统计学差异。

(3)VEGF

如图5和6，假手术组VEGF少，可见于支持细胞和间质；曲张组VEGF广泛分布于基膜和间质。假手术组p-AKT分布于支持细胞，曲张组p-AKT广泛分布于基膜、生精上皮、间质和血管。

曲张组双侧睾丸VEGF和p-AKT荧光强度较假手术组显著增高 (P<0.05)，曲张组左侧VEGF和p-AKT荧光强度显著高于右侧(P<0.05)；巴戟天粗多糖给药组左侧睾丸VEGF和p-AKT荧光强度较曲张组同侧显著降低(P<0.05)，但MOP100组左侧睾丸VEGF和p-AKT荧光强度显著高于其余巴戟天粗多糖给药组(P<0.05)。MOP25组、MOP50组和 MOP200组右侧睾丸VEGF和p-AKT荧光强度较曲张组同侧显著下降(P<0.05)，但MOP100组右侧睾丸VEGF和p-AKT荧光强度显著高于其余巴戟天粗多糖给药组(P<0.05)，且与曲张组同侧水平相当。

(4)MMPs

MMP9和MMP2广泛分布于生精上皮和睾丸间质。

如图7，曲张组MMP9和MMP2荧光强度较假手术组无显著差异； MOP25、MOP50和MOP200组双侧睾丸MMP9和MMP2荧光强度较曲张组显著下降(P<0.05)；MOP100组双侧睾丸MMP9和MMP2荧光强度较其他巴戟天粗多糖给药组显著增高(P<0.05)，且与同侧曲张组水平相近。

7、睾丸组织蛋白检测

(1)Cas-3

Western blot示曲张组双侧睾丸Cas-3表达水平较假手术组同侧睾丸显著增高(P<0.05)。巴戟天粗多糖给药组MOP25、MOP50和 MOP100组双侧睾丸Cas-3表达均较曲张组同侧睾丸显著下调 (P<0.05)。MOP200组双侧睾丸Cas-3表达水平均显著高于MOP100组 (P<0.05)，且与曲张组Cas-3水平相近(图8)。

(2)CD34

曲张组双侧睾丸CD34表达水平较假手术组同侧睾丸显著增高 (P<0.05)。巴戟天粗多糖给药组MOP50和MOP100组双侧睾丸CD34表达均较曲张组同侧睾丸显著下调(P<0.05)，MOP100组CD34水平在4 个巴戟天粗多糖治疗组中最低(P<0.05)。MOP25和MOP200组双侧睾丸CD34表达水平均显著高于假手术(P<0.05)，且与曲张组CD34水平相近(图8)。

(3)VEGF&p-AKT

曲张组双侧睾丸VEGF和p-AKT水平较假手术组显著增高 (P<0.05)，曲张组左侧VEGF和p-AKT水平显著高于右侧(P<0.05)；巴戟天粗多糖给药组左侧睾丸VEGF和p-AKT水平较曲张组同侧显著降低(P<0.05)，但MOP100组左侧睾丸VEGF和p-AKT水平显著高于其余巴戟天粗多糖给药组(P<0.05)。MOP25组、MOP50组和MOP200组右侧睾丸VEGF和p-AKT水平较曲张组同侧显著下降(P<0.05)，但MOP100 组右侧睾丸VEGF和p-AKT水平显著高于其余巴戟天粗多糖给药组 (P<0.05)(图8)。

(4)MMPs

曲张组MMP9、MMP2水平较假手术组无显著差异；MOP25、MOP50 和MOP200组双侧睾丸MMP9、MMP2水平较曲张组显著下降(P<0.05)； MOP100组双侧睾丸MMP9、MMP2水平较其他巴戟天粗多糖给药组显著增高(P<0.05)(图8)。

讨论：本实施例的实验将巴戟天粗多糖治疗选择在手术后第4天，持续给药4周，旨在探讨巴戟天粗多糖在精索静脉曲张疾病进展期对生殖系统的作用和机制。本次实验采用4个巴戟天粗多糖给药剂量，即25–200mg/kg·d，主要依据国内同类中药多糖制剂给药的剂量范围和前期本实验组研究巴戟天水提物的经验。参考《中药药理实验方法学》，体表面积换算，该浓度范围相当于人剂量277.78– 2222.22mg/d。由于Turner建立的精索静脉曲张大鼠模型的形成周期约4周，即术后4周形成稳定的精索静脉曲张模型，因此给药时间设定为4周，充分含纳精索静脉曲张的形成期。

术后通过模型鉴定，排除了肾损伤或精索静脉未曲张的个体。曲张组动物表现出性行为能力低下，血清性激素和促性激素水平偏低，双侧睾丸血管增生、生精上皮和间质受损，与既往实验性精索静脉曲张动物模型的表现相似；曲张组生精细胞大量凋亡和丢失，间质水肿和增生，双侧附睾精子数量减少，碎片增多，畸形率增高，与临床精索静脉曲张患者的组织和精液研究结果一致。

细胞凋亡对正常的生精过程至关重要，并且可以影响到各个阶段的生精细胞，即精原细胞、精母细胞和精细胞。有研究在精索静脉曲张患者双侧睾丸检测到异常高水平的细胞凋亡，提示过度活跃的凋亡可能与不育有关。有研究证实左侧实验性精索静脉曲张模型建立后 28天时，生精细胞凋亡最为明显。高水平的生精细胞凋亡可能与生精障碍及双侧附睾精子数量减少有关。本实验于模型制作31天检测双侧睾丸生精细胞凋亡，正好是曲张模型大鼠生精细胞高水平凋亡的活跃期，而巴戟天粗多糖50-100mg/kg给药显著抑制了生精细胞的异常凋亡，这可能与其修复生精小管形态和提高精子质量有关。

此外，Caspase-3作为细胞凋亡的最终通路，是细胞凋亡的进程中扮演“刽子手”角色的蛋白酶。其广泛分布于实验性精索静脉曲张大鼠的生精小管内，包括生精细胞和支持细胞，也出现在间质血管的内皮细胞。巴戟天粗多糖25-100mg/kg显著下调了Caspase-3的表达水平，这再次提示巴戟天粗多糖可能在精索静脉曲张进展过程中有效抑制生精细胞凋亡，从而修复生精功能。

然而，高剂量的巴戟天粗多糖，即200mg/kg，显著增高了 Caspase-3在双侧睾丸的表达，TUNEL法也检测到生精小管内异常增多的凋亡细胞。异常活跃的细胞凋亡可能导致各级细胞分裂和成熟过程中错误率增高，可能与MOP200组附睾异常偏高的精子畸形率有关。虽然MOP200组精子数量较多，但过高的畸形率可能提示生精功能的紊乱，可能不利于改善不育的治疗。

有研究发现慢性静脉疾病的发病与精索静脉曲张正相关，这提示精索静脉曲张患者的静脉可能普遍存在某种改变。另一项研究发现青少年精索静脉曲张患者存在高发病率的大隐静脉-股静脉交界处瓣膜关闭不全。此外，人群研究还发现，腹股沟直疝与慢性血管疾病之间高度正相关。因此，精索静脉曲张发病较为年轻化，可能是一些结缔组织退行性病变的早期征兆。而慢性静脉功能障碍和灌注不足导致的组织病变，可能成为腹股沟直疝的病变基础。因此，精索静脉曲张导致的血管病变和间质病变可能广泛存在于静脉和结缔组织，本实验也以微血管密度和血管新生为切入点，观察巴戟天粗多糖对精索静脉曲张引发的睾丸间质结缔组织是否有修复作用。

本研究观察到曲张组双侧睾丸间质微血管显著增多，间质增宽、疏松和水肿，这与精索静脉曲张患者睾丸新生血管增多的结论一致。虽然血管数量的增多对精索静脉曲张造成的组织缺血缺氧有一定的保护作用，但双侧睾丸微血管数量增多可能导致血流增多和淤积，减少蔓状静脉丛逆流换热效能，造成睾丸温度升高，影响生精功能，致使精子质量下降。本实验发现中等剂量的巴戟天粗多糖(50-100mg/kg) 能够有效减少精索静脉曲张后的微血管数量，抑制新生血管生成，这提示巴戟天粗多糖对血管新生的抑制作用，可能与其维持睾丸间质稳定密切相关。而进一步的证据在于，高剂量(200mg/kg)的巴戟天粗多糖对血管新生无明显作用，同时对睾丸和生精功能的修复作用也不如其他剂量组，这可能提示抑制血管新生能够在精索静脉曲张进展期有效保护睾丸结构和功能。

本实验在曲张组双侧睾丸间质血管内皮细胞发现大量Caspase-3，提示精索静脉曲张可能增加静脉压力而损伤血管内皮细胞。100mg/kg 巴戟天粗多糖给药后，Caspase-3在血管内皮细胞的表达显著下调，提示血管内皮损伤减轻。因此，100mg/kg巴戟天多糖有效抑制血管新生可能与其改善血管内皮细胞损伤有关。此外，内皮细胞损伤和新生血管增多与精索静脉曲张导致的睾丸血管高渗透性有关，而血管渗透性直接决定着睾丸间液生成。因此，精索静脉曲张造成的间质水肿和疏松与睾丸血管病理改变密不可分。100mg/kg巴戟天粗多糖治疗组双侧睾丸间质结构致密，与假手术组结构近似，其机制可能与巴戟天粗多糖对血管的作用有关。

本实验也同期观察了在血管新生和精索静脉曲张领域均发挥作用并受到广泛关注的几个因子，包括VEGF，MMPs。VEGF是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，通过与其受体结合促进内皮细胞 (血管来源或淋巴来源)增殖，同时增加血管通透性使内皮细胞迁移，诱导血管新生，调控和启动缺血缺氧引起的血管新生。本实验发现，各剂量的巴戟天粗多糖均能有效抑制精索静脉曲张大鼠睾丸生精细胞和内皮细胞VEGF的表达，可能作为其修复精索静脉曲张早期间质损伤的机制之一。此外，25mg/kg、50mg/kg、200mg/kg巴戟天粗多糖有效抑制VEGF，而相应实验组大鼠微血管密度却不是最低，这可能提示精索静脉曲张时VEGF并不是刺激和诱导血管新生的唯一或主要因素。

在四个巴戟天粗多糖给药组中，100mg/kg给药组睾丸VEGF水平较曲张组显著下调，但较其他巴戟天多糖给药组则明显上调。虽然抑制VEGF的能力不如其他剂量组，但100mg/kg抑制睾丸血管新生、修复睾丸损伤的疗效最佳。这说明适量的VEGF对生精上皮和间质可能是有益或必要的。而100mg/kg能够适当下调睾丸VEGF的表达，使其发挥抑制生精细胞凋亡且不过度激活病理性血管新生。

VEGF与受体结合后，引起细胞内Akt磷酸化，磷酸化Akt能够抑制BAD和Caspase-9活性，抑制细胞凋亡。另一方面，磷酸化Akt 上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，促进一氧化氮(NO)合成，促进血管生成。本实验检测p-Akt水平在各实验组差异，其变化趋势与VEGF 一致，进一步印证VEGF可能是“双刃剑”：生理浓度的VEGF能维持生精细胞和内皮细胞活性，而高水平VEGF可能因其诱血管新生的能力而损害间质和生精上皮。100mg/kg巴戟天粗多糖灌胃给药对于维持和恢复VEGF生理浓度最有效。

基质金属蛋白酶是一类由成纤维细胞，成骨细胞，软骨细胞，内皮细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和各种结缔组织细胞分泌的锌蛋白酶。本次实验发现25mg/kg和50mg/kg巴戟天粗多糖显著抑制睾丸MMP-2 和MMP-9表达，这可能与较低剂量的巴戟天粗多糖显著修复睾丸间质，抑制细胞外基质退变有关。然而，100mg/kg巴戟天粗多糖给药组睾丸MMP-2和MMP-9水平与假手术组接近。正常的MMPs活性对于细胞外基质的正常代谢至关重要，这也能够解释100mg/kg巴戟天粗多糖治疗后睾丸间质几乎无病理性增生和疏松。维持MMPs活性对间质血管的正常代谢也十分重要，这可能也与100mg/kg组显著减少的微血管密度有关。

本实施例产生了以下有益效果：100mg/kg巴戟天粗多糖能在精索静脉曲张早期修复双侧睾丸生精功能和附睾精子质量，其机制可能与抑制血管新生和维持间质正常代谢有关。因此，巴戟天粗多糖能够改善亚临床或精索静脉曲张早期患者生精功能，抑制睾丸间质和血管进行性病变。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1)、建立实验性精索静脉曲张动物模型；(2)、提取巴戟天粗多糖，初步纯化后，研究和探讨巴戟天粗多糖对实验性精索静脉曲张大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴的修复作用，尤其是其在疾病早期和进展期的修复作用；(3)、结果表明：100mg/kg巴戟天粗多糖能够在精索静脉曲张早期修复双侧睾丸生精功能和附睾精子质量，其机制可能与抑制血管新生和维持间质正常代谢有关。

2.根据权利要求1所述的一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，其特征在于，所述的步骤1具体包括：(A)动物分组和给药方法；(B)巴戟天粗多糖的制备和纯化；(C)巴戟天多糖含量测定；(D)巴戟天粗多糖光谱分析；(E)巴戟天粗多糖同质性和分子量分析；(F)巴戟天粗多糖的单糖成分分析；(G) Turner法制作实验性精索静脉曲张大鼠模型；(H)精索静脉曲张大鼠模型鉴定；(I)大鼠性行为学检测；(J)精子分析；(K)大鼠心脏灌注，取材和冰冻切片；(L)睾丸凋亡检测；(M)睾丸免疫组织荧光染色；(N)免疫印迹实验；(O)统计学方法。

3.根据权利要求2所述的一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，其特征在于，所述的步骤(A)的具体方法如下：119只雄性SD大鼠按体重，以随机数字法，随机分为7组，每组17只，分别为假手术组，实验性精索静脉曲张模型组(以下简称曲张组)，溶剂对照组，25mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP25组)，50mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP50组)，100mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP100组)，200mg/kg巴戟天粗多糖治疗组(MOP200组)；除假手术组外，均进行实验性精索静脉曲张手术；术后动物单笼饲养休息3天；

于术后第4天，对实验动物给予巴戟天粗多糖药液治疗；假手术组和曲张组动物不给药；溶剂对照组动物给予双蒸水，1.5ml/天；余巴戟天粗多糖治疗组给予相应药量的巴戟天多糖药液(100mg/ml)，不足2ml的，以双蒸水补足至1.5ml；持续治疗4周，即28天。

4.根据权利要求2所述的一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，其特征在于，所述的步骤(B)的具体方法如下：

(1)巴戟天干燥根剪断，粉碎，烘干(45℃，24h)；

(2)加入3倍量95%乙醇，煮沸2h，弃上清；重复一次；

(3)自然挥发干燥，用6倍量双蒸水，煮沸2h，收集药液(上清)；重复两次；

(4)药液冷却至室温，以6层纱布过滤后，65℃旋转蒸发，得相对密度1.2g/ml的流浸膏；

(5)加入无水乙醇，使醇含量达到60%，4℃静置24h，收集沉淀；

(6)脱蛋白：沉淀以双蒸水溶解，取1/3体积Sevage试剂(氯仿：正丁醇=4:1)，二者混合加入分液漏斗，颠倒混匀5-8次，静置分层1h；去除下层的氯仿液和中层变性蛋白；重复此步骤4次；

(7)向已脱蛋白的粗多糖液中加入无水乙醇，使醇含量达到60%，4℃静置24h，收集沉淀；

5.根据权利要求2所述的一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，其特征在于，所述的步骤(G)的具体方法如下：SD大鼠给予3.3ml/kg体重的7%水合氯醛腹腔注射，约5min后，大鼠处于深麻状态；将动物保定于手术台，腹部备皮，碘伏消毒一次，75%酒精消毒3次；铺无菌手术巾，暴露术区；于剑突下一横指，沿腹白线纵行切开皮肤约3cm，而后切开腹白线，钝性分离腹膜，进入腹腔；用浸过温生理盐水的纱布将左侧肠管拨至右侧，暴露腹后壁筋膜；钝性分离腹后膜，暴露下腔静脉，主动脉，肾蒂，肾上腺上静脉，精索内静脉；于肾静脉汇入下腔静脉处，放置一与肾静脉走行方向一致的探针；探针直径0.8mm；以眼科弯镊将4号手术线绕到肾静脉后方，将肾静脉和探针一起结扎；注意结扎点需紧靠肾静脉汇入下腔静脉处，结扎点需位于精索内静脉汇入肾静脉之后；缓缓抽出探针，见肾静脉远端因血压增高而扩张；观察无活动性出血，将肠管复位，用3号手术缝线3层缝合腹前壁；术后动物单只单笼饲养三天。

6.根据权利要求2所述的一种巴戟天多糖提取物通过抑制睾丸血管生成有效治疗精索静脉曲张的方法，其特征在于，所述的步骤(H)的具体方法如下：SD大鼠给予3.3ml/kg体重的7%水合氯醛腹腔注射，约5min后，大鼠处于深麻状态；将动物保定于手术台，腹部备皮，碘伏消毒一次，75%酒精消毒3次；于剑突下一横指，沿腹白线纵行切开皮肤约5cm，而后切开腹白线，钝性分离腹膜，进入腹腔；用浸过温生理盐水的纱布将肠管拨至腹腔外，钝性分离腹后膜，暴露下腔静脉，主动脉，双侧肾，肾蒂，精索内静脉；观察左右侧肾形态，大小；观察左侧精索内静脉是否存在迂曲和曲张；用游标卡尺测量左右侧精索内静脉管径；以左侧肾无萎缩，左侧精索内静脉管径大于右侧3倍视为建模成功。