CN103054849A - 治疗心脑血管疾病的组合物及其制备与检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗心血管疾病和脑血管疾病的组合物及其制备与检验方法，该组合物是通过在干重的基础上，按照1:6～10重量比的牡荆素和甘露醇来制备的。本发明治疗心脑血管疾病的牡荆素和甘露醇的混合组合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流动力学以及抗脑缺血等方面，疗效确切显著，作用速度快，质量稳定可控，无不良反应，毒副作用低，成本较低，能更好的满足广大患者需要，解决患者身心痛苦，具有良好的社会效益和经济效益。

Description

治疗心脑血管疾病的组合物及其制备与检验方法

技术领域

本发明涉及一种用于治疗心血管疾病和脑血管疾病的组合物及其制备与检验方法，具体的说涉及包含牡荆素和甘露醇的混合组合物，该组合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流动力学以及抗脑缺血等方面，效果显著。

背景技术

根据最近的世界卫生报告，冠心病发病及死亡率近年呈快速增长的趋势，据统计全球因病死亡中每3个中就有1个死于心血管疾病，预计到2020年心血管死亡率将增加50%，悉尼大学的流行病学专家MacMahon教授指出，2020年心肌梗死与脑卒中将从目前死因的第5与第6位上升至第1和第4位。在我国，12个城市的统计，本病人口死亡率为29.6/10万，其中以北京、天津两市最高。20世纪80年代中期，北京、上海、广州三市本病人口死亡率分别为21.7/10万、15.7/10万、4.1/10万，20世纪90年代中期分别增至62.0/10万、37.4/10万、19.8/10万，其趋势北方高于南方。动脉硬化、血栓、冠心病、心绞痛是高发性、高病死率、高残障性疾病，给一个人、家庭和社会造成沉重负担，是全球卫生保健和卫生资源的巨大负担。

据WHO预计，心脑血管疾病每年至少造成全球1200万人死亡，已成为人类健康的头号敌人。在2005年全球10大畅销药物中，心脑血管类药物占到了4个。2004年，全球心脑血管药物销售额为608亿美元，预计2008年将上升至912亿美元，而2010年这一数字将有可能窜升为1044亿美元。  据有关部门统计，我国心脑血管病药物市场的规模约有160亿～180亿元人民币，其中西药与中药制剂各占半壁江山。在过去10年内，抗心脑血管病中药 （尤以中药注射剂为主）早已成为国内医院的常用临床治疗剂。预计2020年随着人口老龄化到来，我国和其他发展中国家将会迎来冠心病流行高峰，此类药物将继续显示强劲的增长势头。

临床实践证明，中药注射剂治疗心脑血管疾病具有化学药产品不可替代的独特功效，也有中药其他剂型难以具备的优势，市场前景广阔，有望成为未来中药生产企业研发的热点和市场竞争最为激烈的领域，也是中药产业发展和现代化可能的重要方向。不得不承认的是，尽管国内每年都有一些新的治疗冠心病中药应用于临床，但除极少数药物外，大多数中药始终未能踏进国际市场的大门，其原因除药理学研究、有效药物成分、药代过程并不十分明确外，更主要是因为没有充分采用国际统一的疗效标准，很难证明中药在治疗冠心病方面的疗效和安全性优势。无论是最佳剂量还是给药途径，或是药效物质基础、体内过程，目前的研究还不能给出最具说服力的解释。目前临床使用频率较高的中成药品种包括丹参注射液、川芎嗪注射液、生脉注射液、灯盏花素注射液、黄芪注射液、参脉注射液、参附注射液、葛根素注射液等。

山楂叶制剂无论在国内还是在国外，在心血管疾病治疗上都有着广范应用。据了解，在欧洲，山楂果、叶和花的混合提取物用于稳定性心绞痛患者取得了肯定疗效，山楂叶制剂对早期老年慢性心力衰竭的治疗也取得显著疗效。在国内，山楂叶现已收载于《中国药典》2005年及2010年一部，山楂叶提取物及制剂益心酮片也已均收载于《中国药典》2005年及2010年一部。益心酮片作为药品上市最早收载中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第六册151页。功能主治：活血化瘀，宣通血脉。用于瘀血阻脉所致的胸痹，症见胸闷憋气、心前取刺痛、心悸健忘、眩晕耳鸣；冠心病心绞痛、高脂血症、脑动脉供血不足见上述症候着。现代研究表明山楂叶提取物具有降血压、降低外周血管阻力、扩张冠状动脉、增加冠脉流量、降低心肌耗氧量、强心、增加心输出量、抗心肌缺血，抗血小板聚集、改善血液流变性，消除氧自由基、降胆固醇和甘油三脂、增强耐缺氧能力和利尿等药理作用。临床应用于冠心病心绞痛及各种原因引起的早搏有明显疗效，有效地缓解心绞痛及心悸、胸闷等症状，改善心电图，降低血脂，提高HDL，改善微循环和血流变，增加脑血流量，抗脂质过氧化，且安全，未见毒副作用。

牡荆素为黄酮类化合物C苷，口服制剂，其生物利用度低，不利于本品临床疗效发挥，故我们将牡荆素制与甘露醇成冻干粉针组合物。即利于临床疗效最大发挥，又利于运输、贮藏，方便临床用药。

社会人口老龄化即将到来，冠心病、心绞痛、脑中风患者日益增多，且有年轻化的趋势，对此类药物需求日益增大，已上市临床运用药物随着患者使用增多，各种不良反应也随着增加。临床费用居高不下，市场急需疗效确切不良反应少，毒副作用低，价格相对便宜的药物。牡荆素、甘露醇组合物，质量稳定可控，疗效确切体内作用清楚，不良反应少，毒副作用低，物美价廉是普通百姓都能用得起的药。本品开发上市将能更好的满足广大患者需要，解决患者身心痛苦，具有良好的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供了一种新的临床用于治疗心脑血管疾病的药物，该药物效果确切，作用速度快，毒副作用低。本发明还提供了牡荆素和甘露醇的混合组合物的制备方法、检验方法。

本发明目的是通过以下技术方案实现：

治疗心脑血管疾病的组合物，其活性成分为治疗有效量的牡荆素和甘露醇的混合组合物。

治疗心脑血管疾病的组合物是通过在干重的基础上，按照1:6～10重量比的牡荆素和甘露醇来制备的，具体步骤如下：

a、称取处方量甘露醇、牡荆素原料混合，加注射用水，搅拌均匀，再加0.1mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌溶解，再用1mol/L的盐酸溶液调至PH在8.5±0.5左右，加0.04-0.05%的针用活性炭，搅拌10-15分钟，微孔钛过滤器减压粗滤，脱炭，检查含量、pH合格后，再经0.2-0.25μm微孔滤膜终端过滤后，分装于西林瓶中，低温冷冻干燥；

b、预冻：把分装好的药品放入冻干箱内隔板上预冻开始至+25℃～-40℃；

c、升华干燥：将冷凝器温度下降至-45℃以下，启动真空泵，待真空度达到一定数值后，缓缓打开蝶阀，当干燥箱内的真空度达13.33Pa即0.1mmHg以下关闭冷冻机，通过隔板下的加热系统缓缓加热，使冻结产品的温度逐渐升高至22-25℃；

d、再干燥：在25-30℃下干燥，干燥失重符合规定,在无菌条件下加盖胶塞，轧盖，包装，检验，入库。

治疗心脑血管疾病的组合物的检验方法，包括以下过程：

（1）取本品适量，加乙醇制成每1ml含主药20μg溶液，作为供试品溶液，另取牡荆素对照品同法制成对照品溶液，按照2010年版中国药典一部附录薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺膜上，以36%醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝溶液，热风吹干，置紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（2）取本品适量，加乙醇制成每1ml含主药10μg的溶液，按照2010年版中国药典一部附录紫外-可见分光光度法测定，在270nm波长处有最大吸收；

（3）有关物质：取本品内容物，混合均匀，精密称取约相当于牡荆素25mg的样品，置50ml量瓶中，加60%乙醇10ml使溶解后用流动相稀释制成每1ml中含500μg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相稀释制成每1 ml中含10μg的溶液，作为对照溶液；另精密称取荭草素对照品适量，用流动相使溶解并定量稀释制成每1ml中含3μg的溶液作为杂质对照品溶液，按照（5）含量测定项下的色谱条件，精密量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间4倍，供试品溶液色谱图中如显杂质峰，含杂质荭草素按外标法以峰面积计算，不得过0.6%，在供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积0.01倍的峰可忽略不计的情况下，所有各杂质量的总和不得过2.0%；

（4）甘露醇：取本品适量，约相当于甘露醇0.2g，精密称定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸钠溶液[取硫酸溶液（1→20）90ml与高碘酸钠溶液（2.3→1000）110ml混合制成]50ml，置水浴上加热15分钟，放冷，加碘化钾试液10ml，密塞，放置5分钟，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时，加淀粉指示液1ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫代硫酸钠滴定液相当于0.9109mg的C₆H₁₄O₆，含甘露醇应为标示量的90.0～110.0%；

（5）牡荆素含量测定：按照2010年版中国药典一部附录高效液相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-冰醋酸为18：82：1为流动相；检测波长为270nm。理论板数按牡荆素峰计算应不低于2500，牡荆素峰与杂质峰的分离度均应符合要求；

测定法：取本品内容物，混合均匀，精密称取约相当于牡荆素25mg的样品，置50ml量瓶中，加60%乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取1ml置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取牡荆素对照品适量，精密称定，同法测定，按外标法以峰面积计算，含牡荆素（C₂₁H₂₀O₁₀）应为标示量的90.0～110.0%。

本发明治疗心脑血管疾病的牡荆素和甘露醇的混合组合物在抗心肌缺血、降低心肌耗氧量、改善血流动力学以及抗脑缺血等方面，疗效确切显著，作用速度快，质量稳定可控，无不良反应，毒副作用低，成本较低，能更好的满足广大患者需要，解决患者身心痛苦，具有良好的社会效益和经济效益。

具体实施方式

以下通过具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1：注射用牡荆素甘露醇的制备

a、称取牡荆素30g、甘露醇180g原料均匀混合，加600ml注射用水，搅拌均匀，再加0.1mol/L的氢氧化钠溶液1500ml，搅拌溶解，再用1mol/L的盐酸溶液调至PH在8.5左右，加注射用水至3000ml，加0.05%的针用活性炭，搅拌10分钟，微孔钛过滤器减压粗滤，脱炭，检查含量、pH合格后，再经0.22μm微孔滤膜终端过滤后，分装于10ml西林瓶中，每瓶装3ml，低温冷冻干燥。

b、预冻：把分装好的药品放入冻干箱内隔板上预冻开始至+25℃～-40℃，2小时；-40℃，3小时。

c、升华干燥：将冷凝器温度下降至-45℃以下，启动真空泵，待真空度达到一定数值后，缓缓打开蝶阀，当干燥箱内的真空度达13.33Pa（0.1mmHg）以下关闭冷冻机，通过隔板下的加热系统缓缓加热，使冻结产品的温度逐渐升高至-20℃，再由-20℃逐渐升高至25℃。整个升华干燥过程约26小时。

d、再干燥：在25℃下干燥约5小时，干燥失重符合规定,在无菌条件下加盖胶塞，轧盖，包装，检验，入库。

实施例2：注射用牡荆素甘露醇的检验

（1）取本品14.0mg，加乙醇制成每1ml含牡荆素20μg溶液，作为供试品溶液；另取牡荆素对照品同法制成对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺膜上，以36%醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝溶液，热风吹干，置紫外灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（2）取本品7.0mg，加乙醇制成每1ml含主药10μg的溶液，照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版一部附录ⅤA）测定，在270nm波长处有最大吸收；

（3）有关物质：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取适量（约相当于牡荆素25mg），置50ml量瓶中，加60%乙醇10ml使溶解后用流动相稀释制成每1ml中含500μg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相稀释制成每1 ml中含10μg的溶液，作为对照溶液。另精密称取荭草素对照品适量，用流动相使溶解并定量稀释制成每1ml中含3μg的溶液作为杂质对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，精密量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间4倍，供试品溶液色谱图中如显杂质峰，含杂质荭草素按外标法以峰面积计算，不得过0.6%，所有各杂质量的总和不得过2.0%。（供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积0.01倍的峰可忽略不计）；

（4）甘露醇：取本品233.3mg，约相当于甘露醇0.2g，精密称定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸钠溶液[取硫酸溶液（1→20）90ml与高碘酸钠溶液（2.3→1000）110ml混合制成]50ml，置水浴上加热15分钟，放冷，加碘化钾试液10ml，密塞，放置5分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.05mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液1ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫代硫酸钠滴定液（0.05mol/L）相当于0.9109mg的C₆H₁₄O₆，含甘露醇应为标示量的100.1%。

（5）牡荆素含量测定：按照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录Ⅵ D） 测定；

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-冰醋酸（18：82：1）为流动相；检测波长为270nm。理论板数按牡荆素峰计算应不低于2500，牡荆素峰与杂质峰的分离度均应符合要求；

测定法：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取适量（约相当于牡荆素25mg），置50ml量瓶中，加60%乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取1ml置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取牡荆素对照品适量，精密称定，同法测定，按外标法以峰面积计算，含牡荆素（C₂₁H₂₀O₁₀）应为标示量的90.0～110.0%。

实施例3：注射用牡荆素甘露醇的临床使用

静脉滴注，一次1瓶，一日1次；用150ml生理盐水溶解后使用。具体用法是取无菌注射针管吸取3～5ml注射用水，注入装有牡荆素、甘露醇组合物的西林瓶中，摇匀使溶解，再用无菌针管吸取注入150ml生理盐水中，摇匀后，用静脉滴注的方法，滴入患者静脉血管内。

实施例4：注射用牡荆素甘露醇的临床使用

静脉滴注，一次2瓶，一日1次；用150ml生理盐水溶解后使用。具体用法是取无菌注射针管吸取3～5ml注射用水，注入装有牡荆素、甘露醇组合物的西林瓶中，摇匀使溶解，再用无菌针管吸取注入150ml生理盐水中，摇匀后，用静脉滴注的方法，滴入患者静脉血管内。

实施例5：注射用牡荆素甘露醇的临床使用

静脉滴注，一次2瓶，一日1次；用250ml生理盐水溶解后使用。具体用法是取无菌注射针管吸取3～5ml注射用水，注入装有牡荆素、甘露醇组合物的西林瓶中，摇匀使溶解，再用无菌针管吸取注入250ml生理盐水中，摇匀后，用静脉滴注的方法，滴入患者静脉血管内。

本发明药物组合物具有活血化瘀，宣通血脉。用于瘀血阻脉所致的胸闷胸痛、肢体麻木、中风偏瘫；脑中风、冠心病、心绞痛见上述症候者。本发明药效、药理、毒理等试验详见下述：

试验例1：动物心血管药效研究

1、动物心血管药效学研究结果

（1）试验材料

牡荆素、甘露醇混合组合物：由合肥七星医药科技有限公司提供，批号：101109（冻干粉针，为淡黄色疏松块状物，规格：30mg/每瓶），临用前用生理盐水（NS）溶解至所需浓度；

昆明种小白鼠（体重18－24g）及Wistar大鼠（体重200 ～ 320g），由安徽医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：皖医实动准第01号，实验室饲养温度：22±2℃；家兔（体重2.0 ～ 2.5 kg）和杂种狗（体重7.5～ 12.0 kg）：安徽医科大学实验动物中心提供。

（2）试验方法：

小鼠气管夹闭心肌缺氧模型  昆明种小鼠50只，体重18 ～ 24g。随机分为5组：NS对照组、牡荆素、甘露醇混合组合物 （12，6，3mg·kg^-1）3个剂量组以及葛根素 （60 mg·kg^-1）阳性药对照组，每组10只，♀♂各半。小鼠尾静脉注射给予（iv）受试药物后背位固定于蛙板上，做颈部正中切口，分离气管，并连接ECG。给药后20min夹闭气管，同时开始记时，以ECGⅡ导联持续出现一平直线（即心电消失）作为小鼠死亡的标志。记录小鼠夹闭气管后Ⅱ导联心电持续的时间（min）。

大鼠急性心肌缺血模型  大鼠60只随机分为6组：假手术（Sham）组；NS模型对照组；牡荆素、甘露醇混合组合物（6，3，1.5 mg·kg^-1）3个剂量组以及葛根素 （30 mg·kg^-1）阳性药对照组，每组10只，♀♂各半。大鼠以10% 水合氯醛（0.3ml·100g^－1）腹腔注射（ip）麻醉，仰卧位固定，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉（CCA），行气管插管，接人工呼吸机（呼吸时比为1.5∶1，60次·min^－1，潮气量70次·min^－1），于胸骨左缘3～5肋打开胸腔，暴露心脏，在肺动脉圆锥左缘与左心耳下缘2mm处经浅层心肌穿一3/8丝线。结扎冠状动脉左前降支，造成心肌缺血。其中，Sham组及模型组舌下静脉注射（iv）NS，且Sham组只穿线不结扎，其它各受试药组大鼠于冠脉结扎前20miniv相应的受试药物。实验过程中，定期监测Ⅱ导联ECG，30min后经右侧CCA插管取血，3000rpm离心10min，取上清液待测LDH和CK活力；实验结束后立即摘取心脏，留取左心室称重，并将其横切成6～8片，置入0.2％ NBT染液中，37℃染色20min后，分离梗死心肌并称重，以计算梗死心肌占左心室肌湿重的百分比。

Iso诱发大鼠急性心肌缺血模型  50只大鼠（体重220 ～ 240g）随机分为模型组（iv NS + sc Iso）、牡荆素、甘露醇混合组合物（6，3，1.5 mg·kg^-1）3个剂量组（iv牡荆素、甘露醇混合组合物+ sc Iso）及葛根素30 mg·kg^-1组（iv 葛根素 + sc Iso），共5组，每组10只，♀♂各半。其中，Iso （注射剂量为5 mg·kg^-1）于各组受试药物iv给药后20min时于背部皮下注射给予，以诱发出现急性心肌缺血，并产生缺血ECG波形（Ⅱ导联，ST段抬高或压低）。各组于注射Iso前及注射后30’,1’,2’,5’,10’, 20’分别记录一次ECG（Ⅱ导联），以ST段偏移基线的高度的总和ΣST的mv数以及ST段偏移的平均值作为心肌缺血损伤程度的指标。20min后处死大鼠，迅速摘取完整心肌组织，剪取心尖部固定部位心肌组织称湿重；80℃烘烤15小时后，再称其干重。计算心肌含水量（MWC）。MWC = （湿重 - 干重）/ 湿重 × 100%。

犬急性实验性心肌梗塞实验  健康成年杂种犬36只，体重7.5～12.0kg。随机分成6组：Sham组、NS模型组、牡荆素、甘露醇混合组合物（4，2，1mg·kg^-1）3个剂量组及葛根素15mg·kg^-1组，每组6只，♀♂兼用，♀未孕。将犬以3％戊巴比妥钠静脉麻醉后，右侧位固定于手术台上，行气管插管并连接人工呼吸机维持呼吸。左侧第四肋间开胸，暴露心脏，分离冠状动脉左前降支中下1/3处，穿线以备结扎。按梗死区、梗死周围及正常组织部位固定30个心外膜电图电极，于冠脉结扎后即刻，5，15，30，45，60，90，120min等时刻描记心电图，以ST段升高总电压数表示心肌缺血程度(ΣST)，以ST段升高大于2mv的导联数，计算心肌缺血范围(N-ST)。结扎前20min用药组经股静脉注入所试药物（给药容积为1ml/kg）。结扎2h时取血待测CK，LDH活性，并迅速于左心室注入碳素墨水后处死，取出心脏，生理盐水洗净瘀血，剪下左心室，滤纸吸干后称重。分离缺血区（白色）与非缺血区（黑色），称取缺血心肌重量。再将缺血心肌切成等厚的几片，置于0.2 %NBT中，37℃染色20min，剪下梗死心肌(不染色或灰黄色)称重。以缺血心肌重/左室重×100％代表缺血范围；以梗死心肌重/缺血心肌重×100％代表梗塞范围。并计算心梗指数，心梗指数 = 梗死区重量 / 左室重×100％。

杂种犬血流动力学实验  选用健康杂种犬30只，体重7.5 ～ 12.0kg。随机分成5组：NS对照组、牡荆素、甘露醇混合组合物（4，2，1mg·kg^-1）3个剂量组及葛根素15mg·kg^-1组，每组6只，♀♂兼用，雌性未孕。以3%戊巴比妥钠静脉麻醉，取仰卧位固定。颈部正中切口，暴露并切开气管，接气管插管；分离右侧颈静脉以备冠状静脉窦插管进行血氧含量测定用；分离左下肢股动脉，接BL-420E生物机能实验系统描记血压；分离右下肢股动脉以备采血进行动脉血氧含量测定；分离左下肢股静脉，缓慢恒速输入生理盐水（约1ml/min）以补充丢失的体液；四肢皮下固定针式电极，描记标准肢体Ⅱ导联ECG，以计算心率；然后动物取前肢右卧位，胸前区去毛，于左四、五肋间，沿第四肋下缘切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露胸膜后，接人工呼吸机，充分止血后切开胸膜，提起心包膜切开并作心包床，小心分离冠状动脉左旋支和主动脉根部后留预置线，根据冠状动脉和主动脉的粗细，选择并连接合适的多普勒超声血流仪MP100探头（2mm，12mm）；左心室插管（管内充满肝素生理盐水）经左心室心尖部插入左心室内，接BL-420E生物机能实验系统测量左室内压、左室舒张末期压；从右颈静脉插管至冠状静脉窦（心导管内注入肝素生理盐水抗凝）；上述操作结束后，静脉注射肝素进行全身肝素化（5mg/kg）。待动物稳定30分钟后，观察并记录血压、ECG、冠状动脉流量和主动脉流量，并从股动脉和冠状静脉窦取血进行血氧含量测定，作为给药前的正常值。然后根据不同组别和剂量静脉注射给药（给药容积为1ml/kg），于给药后5，15，30，45，60，90和120 min时分别测定冠状动脉和主动脉血流量、血压以及ECG等，并于给药后30min，60min分别采血测冠状静脉窦和股动脉血氧含量。实验结束后，取出心脏称重。根据结果，将血压、心率、左室内压、冠状动脉血流量、主动脉血流量及血氧含量进行统计学处理，并根据公式计算出心搏出量、心脏指数、心搏指数、左室作功、每分钟100克心肌血流量、冠脉阻力、总外周阻力、心肌耗氧量、心肌氧利用率及心肌耗氧指数等。

二级指标计算公式如下：

⑴ 体表面积=（体重kg）^2/3×0.11

⑵ 心搏出量= 心输出量（ml/min）÷心率（beat/min）

⑶ 心脏指数= 心输出量（ml/min）÷体表面积（m²）

⑷ 心搏指数= 心脏指数（L/min/m²）÷心率（beat/min）×10³

⑸ 左室作功= 心脏指数×1.052×（血压-5）×13.6÷10³

⑹ 每分钟每100g心肌血流量= 冠脉血流量（ml/min）÷1/3心脏重量×100

⑺ 冠脉阻力= 血压（mmHg）÷每分钟每100g心肌血流量

⑻ 总外周阻力= 血压（mmHg）×79.92÷心输出量（L/min）

⑼ 心肌耗氧量=（动脉血氧量-冠状窦静脉血氧量）×冠脉血流量（ml/min）×10^-2

⑽ 心肌氧利用率=（动脉血氧量-冠状窦静脉血氧量）÷ 动脉血氧量×100

⑾ 心肌耗氧指数= 心率（beat/min）×血压（mmHg）×10^-2

⑿ 血流量=流速(cm/sec)×3.14×半径(cm)²×60（sec）

（3）试验结果：

牡荆素、甘露醇混合组合物对气管夹闭小鼠心电持续时间的影响结果如表1所示，气管夹闭后，NS对照组小鼠在9.26±1.14min时相继死亡，而牡荆素、甘露醇混合组合物 12，6，3 mg·kg^-1 3个剂量组小鼠心电消失的时间均显著长于NS对照组，最多可延长约32.94%，差异具有高显著性（P<0.01），效果优于阳性药。提示牡荆素、甘露醇混合组合物可显著提高小鼠心脏耐缺氧的能力。

表1  牡荆素、甘露醇混合组合物对气管夹闭小鼠心电持续时间的影响（

，n=10）

与NS对照组比较，^*P<0.05， ^**P<0.01

牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎大鼠心肌缺血损伤的影响

 对心肌梗死范围的影响  用NBT染色法显示心肌梗死范围的大小，结果如表2所示，模型组大鼠冠脉结扎30min，其心肌梗死范围可达54.02％±14.32％，而牡荆素、甘露醇混合组合物3个剂量组均可不同程度减小心肌的梗死范围，其中6mg·kg^-1组大鼠心肌梗死范围仅为33.47％±6.30％，较模型组降低了38.04％，差异具有高显著性。疗效优于阳性药。提示，牡荆素、甘露醇混合组合物具有减小急性心肌缺血大鼠心肌梗死范围的作用。

表2  牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎大鼠梗死心肌重量的影响（

，n=10）

与Sham组比较，^△△P<0.001；与模型组比较，^**P<0.01

对血浆中LDH及CK活力的影响  结果如表3所示，与Sham组比较，模型组大鼠血浆中LDH及CK的活力均显著升高，表明冠脉结扎损伤了大鼠的心肌细胞膜， LDH及CK从细胞中外漏，使其在细胞中活性降低，而在血浆中活性明显升高。牡荆素、甘露醇混合组合物 6，3 mg·kg^-1 剂量组可抑制大鼠血浆中LDH活力的异常增高，同时，牡荆素 6mg·kg^-1 剂量组对CK活力的异常升高也有显著抑制作用。

表3  牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎大鼠血浆中LDH及CK活力的影响（

，n=10）

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

牡荆素、甘露醇混合组合物对Iso诱发心肌缺血大鼠心肌缺血损伤的影响

对缺血时异常ECG(ST段)的影响  结果如下表所示，模型组大鼠ECGST段在sc Iso后2min即开始明显抬高，5min时抬高更为显著，并一直持续至20min。牡荆素、甘露醇混合组合物 6，3，1.5 mg·kg^-13个剂量组均可明显延长ST段异常抬高开始出现的时间，且与模型组比较，可显著降低ST段异常抬高的严重程度。提示，牡荆素、甘露醇混合组合物可明显改善sc Iso所致的异常ECG变化。

表4  牡荆素、甘露醇混合组合物对Iso诱发大鼠急性心肌缺血异常ECG（ST段）的影响

(

, n=10)

与用药前比较，^#P<0.05, ^##P<0.01，与模型组比较，*P<0.05, **P<0.01

对心肌含水量的影响  从表5中可以看出，牡荆素、甘露醇混合组合物 6mg·kg^-1剂量组可显著降低心肌含水量，抑制心肌水肿。

表5  牡荆素、甘露醇混合组合物对Iso诱发心肌缺血大鼠心肌含水量的影响

（，n=10）

与模型组组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎犬急性心肌缺血损伤的影响

对心肌缺血及梗死严重程度的影响  结果如表6－8 所示，用NBT染色法显示心肌梗死范围的大小，结果发现，模型组犬冠脉结扎120min后，其心肌缺血范围可达56.50％±4.70％，梗死范围达20.18％±12.17％。而牡荆素、甘露醇混合组合物4，2，1 mg·kg^-1 3个剂量组可不同程度地减小心肌的缺血范围和梗死范围，其中牡荆素、甘露醇混合组合物大剂量组心肌缺血范围为41.29％±6.44％，抑制率达26.92％；心肌梗死范围为7.17％±3.51％，抑制率达64.47％；与模型组比较，差异均具有显著性（^**P<0.01，^*P<0.05）。同时，牡荆素 4，2，1 mg·kg^-1 3个剂量组还不同程度地降低了心梗指数，最大降低百分率达74.53%。提示，牡荆素、甘露醇混合组合物可明显减轻冠脉结扎致犬急性心肌缺血时的缺血严重程度。

表6  牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎犬心肌缺血范围的影响（

，n=6）

与Sham组比较，^△△P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

表7  牡荆素对冠脉结扎犬心肌梗死范围的影响（

，n=6）

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

表8  牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎犬心梗指数的影响（

，n=6）

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

对心肌缺血程度（Σ-ST）和心肌缺血范围（N-ST）的影响  结果如表9，10 所示，采用心外膜电极在梗死区、缺血区及正常区放置30个电极，测得模型组犬冠脉结扎即刻直至120min，其心肌缺血程度严重，Σ-ST值均显著高于Sham组(p<0.01)；心肌缺血范围N-ST也较Sham组显著增大(p<0.01)，表明冠脉结扎使犬出现了严重心肌缺血情况。而牡荆素、甘露醇混合组合物4，2 mg·kg^-1剂量组可明显减小心肌缺血范围，并可降低冠脉结扎后45min及60min时的心肌缺血程度，差异具有显著性，疗效与葛根素相当。在其他时间点，牡荆素、甘露醇混合组合物4，2 mg·kg^-1剂量组与模型组相比，差异虽无统计学意义，但对心肌缺血程度也已表现出降低趋势。提示，牡荆素、甘露醇混合组合物可明显减轻急性心肌缺血时的心肌缺血程度和范围。

表9  牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎犬心肌缺血程度（Σ-ST）的影响

（

, n=6)

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

表10  牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎犬心肌缺血范围（N-ST）的影响 (

)

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

对血浆中LDH及CK活力的影响  结果如表11所示，模型组犬血浆中LDH及CK的活力均显著升高，牡荆素、甘露醇混合组合物4，2，1 mg·kg^-1 3个剂量组与之相比，可显著抑制血浆中LDH活力的增高，同时，牡荆素、甘露醇混合组合物4，2 mg·kg^-1 剂量组还可降低血浆中CK的活力水平。

表11  牡荆素、甘露醇混合组合物对冠脉结扎犬血浆中LDH及CK活力的影响（

，n=6）

与Sham组比较，^△△P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01

牡荆素、甘露醇混合组合物对犬心脏血流动力学及心肌耗氧量的影响

对血压、心率的影响  与给药前及NS对照组比较，牡荆素、甘露醇混合组合物各剂量组对麻醉犬血压、心率无明显影响（P>0.05）。

对犬左室内压的影响  与给药前比较，牡荆素、甘露醇混合组合物4，2mg·kg^-1剂量组大鼠左室内压有下降趋势，但尚无统计学差异；而与NS对照组比较，牡荆素 2mg·kg^-1剂量组在给药后15～45min时段内能明显降低犬左室内压，且疗效优于阳性对照药。

对犬冠脉流量、心输出量的影响  牡荆素、甘露醇混合组合物4mg·kg^-1剂量组犬冠脉流量与心输出量较用药前及NS对照组均明显增加，牡荆素、甘露醇混合组合物2mg·kg^-1剂量组冠脉流量在给药后15min时较NS对照组明显增加，并一直持续至45min，其心输出量与用药前比较明显增加。提示，牡荆素、甘露醇混合组合物可增加犬冠脉流量及心输出量。

犬冠脉阻力、总外周阻力的影响  牡荆素、甘露醇混合组合物4mg·kg^-1剂量组给药后45min时即可明显降低冠脉阻力，并一直持续至90min，总外周阻力在用药后60min时亦出现明显下降，并一直持续至120min；与NS对照组比较，牡荆素 4，2，1mg·kg^-13个剂量组均可不同程度地降低冠脉阻力，牡荆素、甘露醇混合组合物4，2mg·kg^-1剂量组还可在用药后120min时降低总外周阻力，差异均具有显著性。

对犬心搏出量、心搏指数的影响  牡荆素、甘露醇混合组合物4mg·kg^-1剂量组给药后120min时可明显增加犬心搏出量和心搏指数，与用药前和NS对照组比较，均具有显著差异；牡荆素、甘露醇混合组合物2mg·kg^-1剂量组给药后60min时心搏出量和心搏指数均较用药前明显增加，并一直持续至120min时。

对犬心脏指数、左室作功的影响  牡荆素、甘露醇混合组合物2mg·kg^-1剂量组给药后使心脏指数持续升高，且在45～60min时间段使左室作功有明显增加，而牡荆素、甘露醇混合组合物4mg·kg^-1剂量组心脏指数较用药前及NS对照组比较均有升高，但对左室作功无明显影响（P>0.05）。

对犬每分钟百克心肌血流量、心肌耗氧指数的影响  与NS对照组比较，牡荆素、甘露醇混合组合物4，2，1mg·kg^-13个剂量组给药后均能不同程度地增加每100克心肌血流量，但对心肌耗氧指数无明显影响（P>0.05）。

对犬心肌耗氧量、心肌氧利用率的影响  除牡荆素、甘露醇混合组合物1mg·kg^-1剂量组心肌氧利用率较NS对照组有所降低外，其余各剂量组对麻醉犬心肌耗氧量、心肌氧利用率均无明显影响（P>0.05）。

试验例2：动物脑血管药效研究

（1）试验材料

牡荆素、甘露醇混合组合物：由合肥七星医药科技有限公司提供，批号：101109（冻干粉针，为淡黄色疏松块状物，规格：30mg/每瓶），临用前用生理盐水（NS）溶解至所需浓度；  昆明种小鼠和ICR种小鼠，分别由安徽省实验动物中心（清洁级，体重18~22 g，动物合格证号：scxk（皖）2005-001）和浙江省实验动物中心（清洁级，体重18~22 g，动物合格证号：scxk（浙）2003-001）提供；SD大鼠和Wistar大鼠，分别由浙江省实验动物中心（清洁级，体重180~250 g，动物合格证号：scxk（浙）2003-001）和中国军事医学科学院实验动物中心（清洁级，体重240~280 g，动物合格证号：scxk（军）2002-001）提供。

（2）试验方法

小鼠断头致脑缺氧模型：昆明种小鼠，随机分成NS对照组、受试药牡荆素、甘露醇混合组合物3个剂量组及阳性对照药尼莫地平（Nim）和银杏叶提取物（EGB）各一组，每组小鼠♀♂各半。各组小鼠分别灌胃（ig）NS或相应的受试药（0.1ml/10g体重），一天一次，连续给药5天，末次给药2 h在小鼠二耳连线处快速断头，记录各小鼠断头后张口喘气动作的次数和持续时间（sec）。

夹闭气管致小鼠缺氧模型：ICR种小鼠，分组和给药同上，末次给药2h后，10%水合氯醛300 mg.kg^-1腹腔注射（ip）麻醉，正中切口，分离气管，连接心电监护仪监测心电图（ECG），然后夹闭气管，立即记录小鼠ECG持续时间，以ECG消失为心脏停搏指标。

大鼠大脑中动脉栓塞模型：采用线栓改良法制造大脑中动脉闭塞（MCAO）的局灶性脑缺血再灌模型。大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg，ip）麻醉后，将一长5 cm，直径约250 μm左右的尼龙线经左侧颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18 ~ 20 mm感到轻微阻力时，即可阻断大脑中动脉。阻断2 h后，拔出尼龙线，进行缺血再灌注24 h。手术操作及麻醉过程中，大鼠用白炽灯加热维持体温，肛温维持在36.5 ~ 37.5°C。Sham组除不插线外，其余手术过程同模型组。

Wistar大鼠，随机分成假手术（Sham）组、模型（NS对照）组、受试药牡荆素、甘露醇混合组合物3个剂量组及阳性对照药Nim和EGB各一组，每组♀♂各半。各组大鼠分别ig NS或相应的药物（1.0 ml/100g体重），一天一次，连续给药5天，末次ig给药2 h行上述MCAO实验。MCAO再灌后22 h给药1次，2 h后，进行异常神经症状的评分(0分，无神经缺损症状；1分，右前肢不能完全伸直；2分，向右旋转；3分，向右侧倾倒；4分，无自发活动或昏迷)。然后断头取血，快速取脑，称重后，冠状切分脑组织成5片，放入2%TTC溶液中于37°C避光染色（正常组织染成红色，没有活性的梗死组织拒染呈白色）30 min后，用数码相机拍照脑片并输入计算机中，用图象分析软件(Image J) 分别测量计算各鼠5个脑片的数码图片截面上的白色梗死组织面积和完整脑片面积后，再乘以脑片厚度，计算脑梗死体积占整个脑组织体积的百分比。

然后将各鼠的5片脑片在100℃烘箱烘至恒重（即干重），计算其脑组织含水量。        脑组织含水量 =（湿重－干重）/ 湿重× 100%

将所取的血液离心后，分别按试剂盒说明书方法在490 nm处测定血清LDH活性，按硫代巴比妥酸法，以TMP为标准品在535 nm处测定血清丙二醛（MDA）含量。

大鼠全脑缺血再灌模型：采用改良的Pulsinell-Brierley四血管阻断(4-VO)法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。SD大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg，ip）麻醉，俯卧位固定，拉直颈椎，将头颈处于水平位置，在枕骨下至第二颈椎处行正中切口，钝性分离肌肉，暴露第一颈椎两侧的横突孔，将直径为0.5 mm的电凝针分别插入两侧的翼孔中，烧灼两侧椎动脉，使其永久性闭合，缝合切口。再经颈前部正中切口，分离双侧颈总动脉，在颈总动脉分叉前l cm处的下方放置手术线，线端置于体外，缝合切口，待大鼠清醒后回笼饲养。24 h 后，大鼠再次麻醉，测定脑电图后，拆除颈部的缝合线，提起预置的手术线，拉出两侧分离的颈总动脉，用微动脉夹迅速夹闭双侧颈总动脉，以脑电波变平为模型成功标志。阻断颈总动脉30 min，然后同时松开双侧动脉夹，抽掉手术线，进行脑血管血流再灌120 min。Sham组动物的手术操作步骤与缺血组相同，但不电凝双侧椎动脉，不夹闭双侧颈总动脉，其余处理同脑缺血组动物。

脑电图（EEG）测定方法：大鼠两侧椎动脉阻断24 h后，再次麻醉，于前囟后l mm，矢状缝左侧2mm处用颅骨钻在颅骨上钻一直径约为2mm的小孔，将单个针形电极经颅骨小孔置于硬膜外，参考电极置耳部皮下，电极引出的屏蔽导线与BE Light脑电图仪相连，记录缺血前、缺血时、再灌5min、l5 min、30 min、60 min及120 min的EEG。按下列公式计算全脑缺血再灌大鼠EEG电位幅度的变化百分率。

EEG电位幅度变化百分率=再灌注后EEG幅度/缺血前EEG幅度×100%

实验结束后，大鼠断头取血后，快速取出全脑，一分为二，左半脑称重后置电热恒温烘箱（100 ^oC）烤干，直至恒重后计算脑含水量。

右半脑置10%甲醛溶液中固定，HE染色后行病理组织学检查并进行评分（无、无~轻度、轻度、中度及重度病理形态学变化分别记0、0.5、1、2和3分）。

将所取血液离心后，按照前述方法检测血清LDH活性和MDA含量。

大鼠分组和给药同大鼠大脑中动脉结扎实验。

大鼠颈总动脉-静脉旁路血栓实验：SD大鼠，随机分成NS对照组、受试药牡荆素、甘露醇混合组合物3个剂量组及阳性对照药Nim和EGB各一组，每组10只，♀♂各半。大鼠10%水合氯醛麻醉，颈部正中切口，分离左颈总动脉和右颈外静脉。在一长15 cm、外径为2 mm的聚乙烯管中置入一根5 cm长的丝线并充满50 U/ml肝素生理盐水溶液，将该聚乙烯管一段插入右颈外静脉中，结扎固定后，另一段插入左颈总动脉中并扎紧，然后打开动脉夹开通血流15 min后，取出下聚乙烯管内的血栓称其湿重后放入85 ^oC烤箱中6 h再称其干重，减去丝线重量分别得血栓湿重和干重。

各组大鼠分别ig NS或相应的受试药(1.0 ml/100g体重)，一天一次，连续给药5天，末次给药2 h后进行上述实验。

大鼠血小板聚集实验：72只大鼠随机分成NS对照组、受试药牡荆素、甘露醇混合组合物3个剂量组及阳性对照药Nim和EGB各一组，每组8只，♀♂各半。各组大鼠分别ig NS或相应的受试药(1.0 ml/100g体重)，一天一次，连续给药5天，末次给药2 h后进行下述血小板聚集实验。

大鼠戊巴比妥钠ip麻醉后，打开腹腔，分离腹主动脉取血，用3.8%枸橼酸钠进行抗凝处理，取血量与抗凝剂比例为9∶1，1 000 r/min离心5 min，吸出上层富含血小板血浆（PRP），余下的血液3 000 r/min离心15 min，制备贫血小板血浆（PPP）。计数PRP中血小板，用PPP调其血小板数在2.5×10⁸个.ml^-1。

将PRP移入硅化比色杯中，37°C温浴5 min，测其在600 nm处吸光度（A），用PPP调PRP的A值在0.6～0.7之间，将调好的PRP移入另一硅化比色杯中，按Born法在600 nm处测加入ADP前的A值，随后加入100μl ADP（终浓度4 μmol/ml），再分别测定加入ADP后30 sec、1、2 min和5 min时的A值，计算血小板聚集率。

血小板聚集率=(加入ADP前A值-加入ADP后A值) ∕ 加入ADP前A值×100%。

统计学处理：实验结果以均数±标准差（

）表示，采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理，单因素方差分析，组间比较用t检验。

（3）试验结果

牡荆素、甘露醇混合组合物对缺血性脑损伤的影响

对小鼠断头后张口喘气的影响  牡荆素、甘露醇混合组合物可明显延长小鼠断头后张口喘气时间。

对气管夹闭小鼠ECG时间的影响  牡荆素、甘露醇混合组合物对夹闭气管致小鼠ECG时间有明显的延长作用；Nim和EGB一样，有延长的趋势，但无明显差异。

牡荆素、甘露醇混合组合物对大鼠局灶性脑缺血再灌损伤的影响

对异常神经症状的影响  MCAO再灌大鼠出现了明显的异常神经症状，与EGB一样，牡荆素、甘露醇混合组合物可显著降低异常神经症状的评分。

对脑水肿和脑组织梗塞体积百分比的影响  MCAO再灌大鼠发生明显的脑水肿和脑梗塞，与EGB或Nim一样，牡荆素、甘露醇混合组合物可显著减轻脑水肿和降低脑组织梗塞体积的百分比，并呈一定的量效关系。

对MCAO再灌大鼠血清LDH活性和MDA含量的影响  大鼠MCAO再灌可使血清中LDH活性和MDA含量明显升高。与EGB及Nim一样，牡荆素、甘露醇混合组合物可明显抑制MCAO再灌大鼠血清中LDH活性和MDA含量的升高；

牡荆素、甘露醇混合组合物对大鼠全脑缺血再灌损伤的影响

对EEG的影响  四血管结扎所致的全脑缺血可使大鼠EEG压低变平，再灌注可使大鼠EEG有所恢复，但与Sham比较，再灌120 min 时仍没有完全恢复。与EGB和Nim一样，牡荆素、甘露醇混合组合物对全脑缺血再灌大鼠EEG恢复有明显的促进作用。

对脑含水量的影响  全脑缺血再灌大鼠发生了明显的脑水肿，与EGB和Nim一样，牡荆素、甘露醇混合组合物可明显降低全脑缺血再灌大鼠的脑含水量。

对血清LDH和MDA的影响  与Sham比较，NS对照组大鼠血清LDH活性及MDA含量有明显的升高，与EGB和Nim一样，牡荆素、甘露醇混合组合物可显著抑制血清LDH活性和MDA含量的升高。

病理组织学检查结果  Sham组大鼠脑组织神经细胞正常，核膜清楚，核仁明显；神经胶质细胞形态正常，胞浆淡染，细胞膜及核膜清楚。毛细血管和小血管管腔较窄或呈一实性条索。NS模型组大鼠脑组织发生明显的病理性改变，神经细胞胞浆和胞核浓缩，染色加深，细胞体积缩小，轴突和树突形状不规则，神经细胞及毛细血管、小血管周围的间隙增宽，间质疏松水肿，神经胶质细胞肿胀。牡荆素、甘露醇混合组合物各剂量组的脑组织神经细胞浓缩及深染较NS模型组均有不同程度减轻，神经胶质细胞肿胀及间质疏松程度均也轻于NS模型组。

牡荆素、甘露醇混合组合物对大鼠血栓形成的影响：

大鼠颈总动脉-静脉环路可致血栓的形成，与EGB一样，牡荆素、甘露醇混合组合物可明显降低血栓的湿重。

牡荆素、甘露醇混合组合物对ADP诱导的血小板聚集的影响

与正常对照组比较，100 mg.kg^-1 EGB可显著地抑制加入ADP后2 min和5 min时血小板聚集，5 mg.kg^-1 Nim 对加入ADP后5 min时血小板聚集也有显著的抑制。牡荆素、甘露醇混合组合物对2 min和5 min时血小板聚集有明显的抑制作用。

试验例3：动物急性毒性试验研究

（1）试验材料

牡荆素、甘露醇混合组合物：由合肥七星医药科技有限公司提供，批号：101109（冻干粉针，为淡黄色疏松块状物，规格：30mg/每瓶），临用前用生理盐水（NS）溶解至所需浓度；Beagle犬，普通级，由成都达硕生物科技有限公司提供。许可证号：SCXK（川）2006-24，由四川省实验动物管理委员会签发，

（2）试验方法

将供试品配成30mg/ml的溶液给药，按照50%递增法给药体积依次设计为2.0、3.0、4.5、6.8、10.1、15.2ml/kg一系列剂量组，给药时1号犬给予4.5ml/kg剂量，按照动物的反应确定2号犬的给药剂量，然后按照2号犬的反应确定三号犬的给药剂量，依次类推，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高致死剂量，然后用两者之间的剂量再给一只动物，此剂量即为近似致死量，未发现中毒症状的剂量为最大耐受量。最大可给予20ml/kg，如仍未死亡，则20ml/kg为最大给药量。

（3）试验结果

1号动物（7.6kg）：给予牡荆素溶液4.5ml（135mg）/kg，给药过程及给药结束后动物未见任何异常反应。

2号动物（7.5kg）：给予牡荆素溶液10.1ml（303mg）/kg，给药结束后3min动物呕吐一次，未见其它异常反应。

3号动物（6.7kg）：给予牡荆素溶液6.8ml（204mg）/kg，给药过程及给药结束后未出现任何的异常反应；

4号动物（6.6kg）：给予牡荆素溶液20ml（600mg）/kg，给药结束后动物立即出现呕吐反应，随后间歇性呕吐，24h后恢复正常。

所有动物14天观察期内未出现任何的异常反应，观察结束后剖检，心、肝、脾、肺、肾等主要脏器未见肉眼可见异常。

试验例4：动物长期毒性试验研究

本研究通过连续6个月静脉给药及停药恢复观察15天，就牡荆素、甘露醇混合组合物对比格犬长期毒性作用进行了观察。结果表明在给药6个月过程中无动物死亡，给药组在给药后5～30分钟动物活动量减少，部分静卧，以大剂量组动物为甚。空白对照组动物各给予生理盐水后活动自如。各给药组和对照组比格犬除上述症状外，在体征外观、行为活动及饮食等方面无明显异常，大小便正常，毛发有光泽，一般情况良好，体重自然增加。各组动物均未见眼、耳及口腔等处有异常分泌物。

血液学检查结果表明：给药前、给药2个月、4个月、6个月及停药恢复期时各剂量组的血液学指标与NS对照组比较无显著性差异。这提示用药期间及停药恢复期间牡荆素、甘露醇混合组合物对血液学各项指标无明显不利的影响发生。

血液生化学检查结果表明：用药2个月时牡荆素、甘露醇混合组合物大剂量组的总蛋白值及6个月时牡荆素、甘露醇混合组合物大、中剂量组的总蛋白值较对照组显著降低，但同期的肝功能其它指标与对照组比较无显著性差异，这提示牡荆素、甘露醇混合组合物长期给药对比格犬的肝功能各参数基本无明显的影响。

用药2个月时，小剂量组尿素氮值较NS对照组明显升高，但用药4个月及6个月时用药各剂量组尿素氮值与对照组无差异，这提示2个月时小剂量组尿素氮值的变化与药物无关，属一过性的变化。用药4个月、6个月时牡荆素、甘露醇混合组合物大剂量组比格犬肌酐（CREA）值较对照组明显升高，而肌酐（CREA）是反映肾功能的一个主要参考指标指标之一，因此提示牡荆素、甘露醇混合组合物大剂量对比格犬肾功能有一定的影响。其余各给药组犬的血液生化学指标与NS对照组比较均无显著性差异。综合所有血液生化学指标可看出，各剂量组的牡荆素、甘露醇混合组合物长期给药对比格犬的肝功能无明显的影响，但长期给药可能对肾功能有一定的影响，建议临床试验时注意观察肾功能的变化。

尿常规检查表明：给药4个月、6个月及恢复期时各给药组尿常规与NS对照组相比组间无显著性差异，这提示牡荆素、甘露醇混合组合物给予比格犬6个月后对动物的尿常规无明显影响。

ECG检查表明：给药前、给药2个月、4个月、6个月及恢复期时各给药组的ECG各项指标与NS对照组比较均无显著性差异。这提示ECG检查结果表明大、中、小剂量的牡荆素、甘露醇混合组合物长期用药对比格犬的ECG未产生明显的不利影响。

动物尸解未见明显异常；脏器系数检查结果表明用药4个月、6个月及恢复期时各剂量组比格犬脏器系数与NS对照组比较无显著性差异。

病理组织学检查主要从脏器的实质细胞变性、细胞坏死、炎症、出血及血管充血扩张、水肿等组织病理学指标方面进行了观察。结果显示：给药4、6个月及停药恢复期15天时，牡荆素、甘露醇混合组合物大、中、小各剂量组的比格犬心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、甲状腺、脑（大脑、小脑、脑干）脊髓、食管、胃、十二指肠、胆囊、唾液腺、胰腺、甲状旁腺、乳腺、胸骨骨髓、睾丸（和附睾）、前列腺、子宫、卵巢、脑、垂体、视神经、坐骨淋巴结、给药局部等均未见明显的病变。用药各组与NS对照组之间均无显著差异（P＞0.05）。

综上所述，牡荆素、甘露醇混合组合物大、中、小剂量静脉给药6个月对比格狗一般行为学、体重、摄食量等无明显影响，牡荆素、甘露醇混合组合物大、中、小剂量组血液学各项指标无明显异常变化，血液生化学检查提示牡荆素、甘露醇混合组合物大剂量可能对比格犬的肾功能有一定的影响，尿常规检查无异常发现，脏器系数检查均未见明显的影响，病理组织学检查未见有明显的病理学损害改变，ECG检查未产生明显的不利影响；牡荆素、甘露醇混合组合物各剂量组在停药恢复期观察时未见明显毒性作用的发生，也未见新的毒性反应的产生。这提示牡荆素、甘露醇混合组合物临床长期用药是比较安全的。

试验例5：动物过敏性、刺激性、溶血性试验研究

动物过敏性试验结果

（1）样品及来源

牡荆素、甘露醇混合组合物：由合肥七星医药科技有限公司提供，批号：101109（冻干粉针，为淡黄色疏松块状物，规格：30mg/每瓶），临用前用生理盐水（NS）溶解至所需浓度；0.9%生理盐水（NS）：由上海华源制药股份有限公司生产，批号：100705076；5%新鲜蛋清：用新鲜的鸡蛋制备。

（2）动物

豚鼠，32只，体重300-350g，♂性，由安徽医科大学实验动物中心提供，实验室饲养温度：23±3℃,空调控制，相对湿度：50～70％。

（3）方法

豚鼠32只，体重300-350g，♂性，随机分成四组，NS对照组、阳性对照组（蛋清）和牡荆素、甘露醇混合组合物高、低剂量组（低剂量为临床人拟用剂量0.5mg/kg：致敏0.5mg/kg, 攻击1.0mg/kg；高剂量为低剂量的5倍：致敏2.5mg/kg,攻击5.0mg/kg），每组8只豚鼠，各组按无菌操作，分别隔日腹腔注射灭菌注射用生理盐水、牡荆素、甘露醇混合组合物高、低剂量和5％新鲜蛋清0.5ml/只，共5次。于末次致敏注射后的第14天，由前肢外侧静脉皮肤切开，注射生理盐水注射液、牡荆素、甘露醇混合组合物高、低剂量和5％新鲜蛋清溶液1.0ml/只，注射时间为1min，进行攻击，根据表12观察过敏反应症状，仔细观察30分钟，然后继续饲养观察3小时。

表12  过敏反应症状

0：正常	7：呼吸急促	14：步态不稳
			1：不安宁	8：排尿	15：跳跃
2：立毛	9：排粪	16：喘息
			3：发抖	10：流泪	17：痉挛
4：搔鼻	11：呼吸困难	18：横转
			5：喷嚏	12：罗音	19：潮式呼吸
6：咳嗽	13：紫癜	20：死亡

结果判断标准：根据表13评价标准判断过敏反应强弱。“—”为无症状；“＋”为不安、哆嗦、搔鼻、排尿、呼吸急促等；“＋＋”为除上述症状外，呼吸困难和运动障碍；“＋＋＋”除上述症状外，呼吸衰竭直至痉挛，但可恢复；“＋＋＋＋”为死亡。

表13   豚鼠过敏反应级数

（4）试验结果

从表14试验结果可以看出，牡荆素、甘露醇混合组合物给豚鼠腹腔注射致敏，静脉注射攻击，对豚鼠无过敏反应。牡荆素、甘露醇混合组合物全身主动过敏试验合格。

表14  第14天豚鼠激发后产生的症状

（5）结论

豚鼠在第14天激发iv牡荆素、甘露醇混合组合物时均无过敏症状，试验结果表明牡荆素、甘露醇混合组合物静脉给药未见明显的致敏作用。

动物刺激性试验结果

（1）试验动物

健康家兔2.2～2.5 kg，♀♂各半，由安徽医科大学实验动物中心提供，实验室饲养温度：23±3℃,空调控制，相对湿度：50％～70％。

（2）试验方法

取健康家兔8只，♀♂各半，称重后，随机分成二组，每组4只，分别在固定的耳缘静脉滴注牡荆素、甘露醇混合组合物 (浓度为30mg·100ml^-1；5 ml.kg^-1)和等量NS（5.0ml·kg^-1）静脉滴注速度为1ml.min^-1,每日同部位静脉注射1次，剂量相同（注射时均要局部去毛和消毒），连续4天，停药第2天，处死动物，立即取兔耳标本置10%甲醛溶液中固定后行组织病理组织学检查，记录耳缘静脉进针点处向近心端间隔1.0、2.0、3.0和4.0cm处组织损害情况（先肉眼观察有无充血、水肿和坏死，再进行病理学检查）。

（3）试验结果

静脉滴注牡荆素、甘露醇混合组合物和NS后，家兔活动自如，进食及大小便正常，毛发有光泽，未见明显的异常反应；注射部位皮肤见点状结痂外，未见红、肿、热、痛及局部增厚、溃烂、结节等异常反应。

病理学结果如下表所示，牡荆素、甘露醇混合组合物用药组及NS对照组家兔耳缘静脉血管管壁完整，管腔内无血栓形成，血管周围间质未见出血、水肿及炎细胞浸润（见表15）。

表15  牡荆素、甘露醇混合组合物 (30mg·100ml^-1)静脉滴注对家兔静脉的刺激作用

注：–：正常。

（4） 结论

家兔静脉滴注牡荆素、甘露醇混合组合物未见明显的静脉刺激性反应。

动物过敏性试验结果

（1）试验动物

健康家兔2.3 kg，♂，由安徽医科大学实验动物中心提供，实验室饲养温度：23±3℃，空调控制；相对湿度：50％～70％。

（2）试验方法

2%家兔红细胞悬液制备：取健康雄性家兔一只，心脏取血10ml，置于烧杯内，放入玻璃珠轻轻摇动，数分钟后除出纤维蛋白，取出已去纤维蛋白血液，加等量生理盐水（2000rpm, 5min）离心，除去上清夜，沉淀的血球再加生理盐水，清洗，再离心，如此反复三次，按血球的容量，用生理盐水配成2%的混悬液。

取干净试管7只编号后，分别加入2.5ml 2%兔红细胞悬液，按下表所示分别加入相应体积的牡荆素、甘露醇混合组合物 (30mg.100ml^-1)和NS或双馏水，置37℃培养箱中，分别观察0.5、1、2、3h溶血反应情况。

（3）试验结果

结果如下表16所示，在2%兔红细胞悬液中加入不同体积的牡荆素、甘露醇混合组合物后0.5、1、2、3h均无溶血反应的发生。

表16  牡荆素、甘露醇混合组合物（30mg.100ml^-1)生理盐水溶液溶血试验

注：+：溶血和/或凝集反应，-：不溶血也不凝集

（4）结论

牡荆素、甘露醇混合组合物未见明显溶血反应。

Claims (4)

1.一种治疗心脑血管疾病的组合物，其特征在于，其活性成分为治疗有效量的牡荆素和甘露醇的混合组合物。

2.根据权利要求1所述的治疗心脑血管疾病的组合物，其特征在于，所述的牡荆素和甘露醇的重量比为1:6～10。

3.一种如权利要求1所述的治疗心脑血管疾病的组合物的制备方法，其特征在于，所述的药物组合物是通过在干重的基础上，按照1:6～10重量比的牡荆素和甘露醇来制备的，具体步骤如下：

a、称取处方量甘露醇、牡荆素原料混合，加注射用水，搅拌均匀，再加0.1mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌溶解，再用1mol/L的盐酸溶液调至PH在8.5±0.5左右，加0.04-0.05%的针用活性炭，搅拌10-15分钟，微孔钛过滤器减压粗滤，脱炭，检查含量、pH合格后，再经0.2-0.25μm微孔滤膜终端过滤后，分装于西林瓶中，低温冷冻干燥；

b、预冻：把分装好的药品放入冻干箱内隔板上预冻开始至+25℃～-40℃；

c、升华干燥：将冷凝器温度下降至-45℃以下，启动真空泵，待真空度达到一定数值后，缓缓打开蝶阀，当干燥箱内的真空度达13.33Pa即0.1mmHg以下关闭冷冻机，通过隔板下的加热系统缓缓加热，使冻结产品的温度逐渐升高至22-25℃；

d、再干燥：在25-30℃下干燥，干燥失重符合规定,在无菌条件下加盖胶塞，轧盖，包装，检验，入库。

4.一种如权利要求1所述的治疗心脑血管疾病的组合物的检验方法，其特征在于包括以下过程：

（1）取本品适量，加乙醇制成每1ml含主药20μg溶液，作为供试品溶液，另取牡荆素对照品同法制成对照品溶液，按照2010年版中国药典一部附录薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺膜上，以36%醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝溶液，热风吹干，置紫外灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

（2）取本品适量，加乙醇制成每1ml含主药10μg的溶液，按照2010年版中国药典一部附录紫外-可见分光光度法测定，在270nm波长处有最大吸收；

（3）有关物质：取本品内容物，混合均匀，精密称取约相当于牡荆素25mg的样品，置50ml量瓶中，加60%乙醇10ml使溶解后用流动相稀释制成每1ml中含500μg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相稀释制成每1 ml中含10μg的溶液，作为对照溶液；另精密称取荭草素对照品适量，用流动相使溶解并定量稀释制成每1ml中含3μg的溶液作为杂质对照品溶液，按照（5）含量测定项下的色谱条件，精密量取对照品溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%；再精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间4倍，供试品溶液色谱图中如显杂质峰，含杂质荭草素按外标法以峰面积计算，不得过0.6%，在供试品溶液中任何小于对照溶液主峰面积0.01倍的峰可忽略不计的情况下，所有各杂质量的总和不得过2.0%；

（4）甘露醇：取本品适量，约相当于甘露醇0.2g，精密称定，置250ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10ml，置碘瓶中，精密加高碘酸钠溶液[取硫酸溶液（1→20）90ml与高碘酸钠溶液（2.3→1000）110ml混合制成]50ml，置水浴上加热15分钟，放冷，加碘化钾试液10ml，密塞，放置5分钟，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定，至近终点时，加淀粉指示液1ml，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正；每1ml硫代硫酸钠滴定液相当于0.9109mg的C₆H₁₄O₆，含甘露醇应为标示量的90.0～110.0%；

（5）牡荆素含量测定：按照2010年版中国药典一部附录高效液相色谱法测定；

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-冰醋酸为18：82：1为流动相；检测波长为270nm；理论板数按牡荆素峰计算应不低于2500，牡荆素峰与杂质峰的分离度均应符合要求；

测定法：取本品内容物，混合均匀，精密称取约相当于牡荆素25mg的样品，置50ml量瓶中，加60%乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取1ml置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取牡荆素对照品适量，精密称定，同法测定，按外标法以峰面积计算，含牡荆素（C₂₁H₂₀O₁₀）应为标示量的90.0～110.0%。