CN1081465C

CN1081465C - 一种治疗冠心病心绞痛的红景天注射剂的制备方法

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Publication number: CN1081465C
Application number: CN99102847A
Authority: CN
Inventors: 张早华; 储戟农
Original assignee: 张早华; 储戟农
Current assignee: TONGHUA YUSHENG PHARMACEUTICAL CO., LTD.
Priority date: 1999-03-08
Filing date: 1999-03-08
Publication date: 2002-03-27
Anticipated expiration: 2019-03-08
Also published as: CN1265905A

Abstract

一种治疗冠心病心绞痛的红景天注射剂的制备方法，其原料是由中药红景天中分离提取，主要有效成分为红景天甙和酪醇。药理实验表明具有明显改善犬急性心肌缺血和心肌梗塞的作用，减轻心肌损伤程度，明显降低血清磷酸肌酸激酶(CK)含量，可明显扩张冠脉血管，降低冠脉阻力。经静脉给药或口服给药对心血瘀阻引起的胸痹心痛(冠心病心绞痛)起效快、效果明显、作用持久。

Description

一种治疗冠心病心绞痛的红景天注射剂的制备方法

本发明属于以特殊工艺制成为特征的中药新药技术领域，涉及一种用于治疗冠心病心绞痛有突出疗效的药物，更具体地说涉及一种以中药红景天为原料制成的注射剂的制备方法。

冠心病是一种常见的心血管疾病，早在50年代，其发病率在西方一些国家就不断增高，并成为人类死亡之首。例如，只有两亿人口的美国，每年死于冠心病的约有70万人，占死亡人数的1/3，被称为“第一杀手”上海第一医学院《实用内科学》编辑委员会，实用内科学，人民卫生出版社1983年(第7版)P1286)，在我国随着人民生活水平的不断提高，人口日益老龄化和预防保健工作的相对滞后，冠心病的患病率、发病率和死亡率也都持续上升，据1973年的全国普查资料表明，冠心病平均发病率仅6.46％，到1997年对北京、上海、广州、四川等七个地区的人群普查显示，60岁以上人群的发病率已达到8.65～24.3％(陈灏株等，内科学，人民卫生出版社，1993年第3版P124)，近年来，发病率又进一步明显升高，防治任务十分沉重，应该引起人们的关注。

随着近代科学技术的飞速发展，人们对冠心病的诊断和防治也取得了一些进展，如在检查方面，由原来的常规心电图，负荷心电图(活动平板和踏车试验)检查，更新到动态心电图检查、超声心动检查术、心电图的计算机及核素心肌扫描、冠脉造影、电子束CT机的应用，生化检查和心功能测定方法也在不断改进，为早期诊断提供了良好手段。在防治方面，包括CCV的建立、冠脉搭桥、再通术的建立等。药物治疗方面，在扩张冠脉的基础上，出现了钙离子拮抗剂、β-受体阻滞剂、溶栓药物的应用，为治疗冠心病提供了多种手段。然而临床实践证实，单纯的西药治疗往往还不尽人意，尤其是药物的副反应，使患者难以接受和长期服用。当代人类“回归自然”的愿望及呼声日益强烈，普遍希望天然无公害植物药治疗，从而给中医药防治冠心病提供了良好的契机。冠心病心绞痛中医称胸痹心痛，开发一种高效、低毒、质量稳定的治疗冠心病的纯中药产品是本发明的目的，静脉给药较口服给药使用更直接，起效更快、更明显、更持久。

《药典》记载，红景天又名大株红景天(Rhodiola Kirilowii(Regel)Regel)，功能与主治为：解毒，燥湿。用于肺热，脉热，瘟病，四肢肿胀。大株红景天又称狭叶红景天，据《藏药标准》记载，该药功能为：清热解毒，消肿燥湿，主治温病、肺热、脉热、中毒及四肢肿胀等症。现代实验表明：大株红景天能有效抑制高原低氧环境对人体甲皱微循环及动物血浆，组织TXB2、6-Keto-PGF1α含量的影响，改善高源人群血液流变学状态，降低高原反应患者血小板粘附功能和VIII：Ag水平。说明大株红景天具有活血化瘀和抗缺氧作用。有关红景天医疗作用的已有报导如《中国中药杂志》14卷11期(1989.11)张早华等所写：“藏药狭叶红景天预防高原反应的效果分析——不同海拔人体心、肺功能的分组比较”，指出生脉饮予防高原低氧环境对人体心、肺功能的影响较丹参川芎合剂效果好，藏药狭叶红景天预防作用则与生脉饮相类似；《中药材》第12卷11期(89年11月)张早华等所写“狭叶红景天预防高原反应的研究”指出该药既能降低氧耗速度，又能加大动、静脉血的氧压差，增加供氧，从而增强动物对缺氧的耐力；《中国中药杂志》1998年23卷第2期，张早华等所写“红景天胶囊对犬心肌耗氧量及冠脉血流量的影响”一文指出“红景天胶囊是降低心肌氧耗，维持心肌对能量的需求，由于并不减少冠脉血流量，因此提高了心脏的泵功效率。以上报导的医疗范围虽属心血管疾病，但并不涉及胸痹心痛，因心绞痛发病急、症状严重、危及生命，以上药材或制剂远不能满足和适应。

本发明的目的在于提供一种用中药植物红景天单味药材制备的红景天注射液剂的制备方法，用于治疗冠心病心绞痛(胸痹心痛)，以适应该病的特性，起效快，利于临床抢救，并且效果明显，作用持久。

制法：取红景天煎煮成药液，滤过，薄膜浓缩成相对密度在50℃温度下为1.15～1.20成的浓缩液；在该浓缩液中加乙醇使含醇量达70％，搅匀在5-10℃温度下，冷藏24小时，滤过沉淀以5-10℃的70％乙醇洗涤一次，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度在50℃下为1.15～1.20的清膏，再加乙醇使含醇量达85％，搅匀，(5-10℃)冷藏24小时，滤过，沉淀以5-10℃的85％乙醇洗涤一次，滤过，合并滤液，调PH值至8.0，(5-10℃)冷藏12小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度在(50℃)1.20～1.30的清膏，加入注射用水，在5-10℃温度条件下冷藏12小时，滤过，滤液调PH＝7.0，加热煮沸30分钟，冷藏72小时，温度同上，滤过，滤液以截留分子量为10000的超滤柱超滤，超滤液浓缩冷冻干燥得干粉状药物，其冷冻温度为-5至-10℃。

此干粉状物按照常规加注射用水至每ml含固体量为40-60mg即为红景天注射剂。

(一)制备工艺实施例：

实施例1

取红景天1670g，加水煎煮三次，每次加水6倍，煎煮2小时，合并三次药液，滤过，薄膜浓缩成相对密度为1.15～1.20(50℃)的浓缩液，加乙醇使含醇量达70％，搅匀，冷藏24小时(5-10℃)，滤过，沉淀以5-10℃的少量70％乙醇洗涤一次，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为1.15～1.20(50℃)的清膏，再加乙醇使含醇量达85％，搅匀，冷藏24小时(5-10℃)，滤过，沉淀以5-10℃的少量85％乙醇洗涤一次，滤过，合并滤液，调PH值至8.0，冷藏12小时(5～10℃)，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度1.20～1.30(50℃)的清膏，加入注射用水1000ml，冷藏12小时(5～10℃)，滤过，滤液调PH＝7.0，加热煮沸30分钟，冷藏72小时(5～10℃)，滤过，滤液以截留分子量为10000的超滤柱超滤，超滤液浓缩冷冻干燥得干粉，加注射用水配制成1000ml，微孔膜滤过，灌封，灭菌，即得。

实施例2：乙醇回流提取法

取风干的红景天根茎，磨成粗粉在恒温水浴(80℃)上用40～80％乙醇回流提取，提取液减压浓缩回收乙醇，所得浓缩液用蒸馏水处理，除去不溶性沉淀物，滤液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂后分别得到乙酸乙酯部位的残渣A(酪醇粗品)和正丁醇部位的残渣B(红景天甙粗品)，将残渣B以少量无水乙醇溶解，取残渣B以甲醇—水(1∶1)溶解后搅拌于900g硅胶，水浴蒸干后进行硅胶层析，氯仿—甲醇系统梯度洗脱，得含红景天甙的膏状物，进一步经硅胶柱层析，乙酸乙酯—无水乙醇系统梯度洗脱，得红景天甙单体结晶，即红景天甙(C₁₄H₂₀O₇)。MW：300.mp：160～162℃(无水乙醇)，另取残渣A，经聚酰胺柱层析(40目，粒450×2cm)，以氯仿—乙醇(8∶2)洗脱，洗脱液回收溶媒得残渣，于氯仿中结晶、重结晶得酪醇结晶，即酪醇(C₈H₁₀O₂)。

红景天甙为无色透明针状结晶，溶于水、乙醇、正丁醇，微溶于丙酮、乙醚。

3、除杂质的方法选择：采用二次醇沉可除去多糖等高分子杂质，保留有效成分，但发现二次醇沉后的滤液中仍有鞣质存在，故进一步采用明胶沉淀法，聚酰胺吸附法和醇液碱沉淀法进行了除鞣质实验比较，结果显示，以乙醇溶液碱沉淀法较好，制得的原料具有良好的水溶性，制得的注射液澄明度好，且红景天甙、酪醇损失较少。

4、制剂工艺研究：以澄明度、色泽及红景天甙、酪醇的含量等为指标，进行了PH值的优选、干粉配液和浓缩液直接配液的比较、过滤方法的比较、中空纤维截留分子大小的选择、灭菌温度对制剂稳定性影响的研究和稳定性考察等。结果表明PH值应选定在5.5～6.5之间；以干粉配液较好；采用截留分子量为10000的中空纤维超滤无混浊、沉淀出现；在105-120℃温度下，灭菌30分钟对制剂的稳定性影响不大；在常温20-25℃、自然光照下，灭菌30分钟对制剂的稳定性影响不大；在常温20-25℃，自然光照下，对样品连续考察三个月，注射液的澄明度、色泽，红景天甙和酪醇的含量基本无变化。

(二)成品和原料药材的质量标准

1、性状：成品为淡黄色的澄明液体、三批样品均一致。

2、鉴别：按照薄层色谱法(中国药典1995年版一部附录VIB)试验，在与对照品色谱相应的位置上，成品和药材的三批样品均显示相同的兰色斑点。另外，对鉴别对象的选择依据、鉴别方法的原理、实验条件的选定进行了研究。

3、检查：按《中国药典》、《中药注射剂研制指导原则及有关规定汇编》中有关方法试验。

(1)色泽：溶液颜色深于橙黄色7号比色液，浅于8号比色液。三批样品均符合规定。

(2)pH值：应为5.5～6.5。三批样品均符合规定。

(3)炽灼残渣：应不得超过1.0％(g/ml)。三批样品均符合规定。

(4)重金属：含重金属不得过百万分之二十。三批样品均符合规定。

(5)砷盐：含砷量不得过百万分之二。三批样品均符合规定。

(6)蛋白质：不得出现混浊。三批样品均符合规定。

(7)鞣质：不得出现混浊或沉淀。三批样品均符合规定。

(8)草酸盐：不得出混浊或沉淀。三批样品均符合规定。

(9)树脂：应无树脂状物析出。三批样品均符合规定。

(10)钾离子：供试液管所得浊度与标准钾离子对照管的浊度进行目测比较，不得更浊(0.05％)。三批样品均符合规定。

(11)热源：应符合《中国药典》1995年版一部附录VIIA中注射剂项下有关规定。三批样品均符合规定。

4、含量测定：测定了三批样品，阐明了含量测定对象和测定成分选择的依据，进行了色谱条件分析、检测波长和流动相的选择、线性关系考察、稳定性试验、精密度试验、重现性试验、回收率试验、样品测定，结果证明，本法对成品和原料药材的含量测定灵敏、专属、可靠。

(1)总固体：暂定成品每1ml含总固体量不得少于40mg。

(2)红景天甙和酪醇含量测定：药材中含红景天甙不得少于3mg，酪醇不得少于0.2mg。

(3)多糖：药材中暂定多糖不得低于6％，成品每1ml含多糖以无水葡萄糖计不得少于20mg。

(4)半成品(干粉)：每1g干粉(半成品)中的红景天甙的含量不≥47mg，酪醇的含量≥3.0mg，多糖的含量不得低于≥340mg。

(三)初步稳定性试验

按照红景天注射剂质量标准所列各项并结合新药审批方法《有关中药部分的修订和补充规定》附件八中药新药稳定性试验要求，对临床试验用红景天注射剂的性状、鉴别、检查、含量测定、卫生学检查等进行考察，批号为：970812、970815、970818三个批号。试验于常温(15～25℃)下连续考察三个月。

结论：本品置常温条件下连续考察三个月，经检测各项指标准均未见明显变化，符合该产品质量标准的各项规定；卫生学检查无菌。

(四)药效学研究

1、对犬心肌缺血心肌梗塞及相关血液生化指标的影响

实验采用心外膜电图标测心肌缺血范围及程度，定量组织学(N-BT染色法)测定心肌梗塞范围，同时测定血清CK、LDH及血浆ET、TXB2、6-Keto～PGF1a活性的变化，研究了红景天注射液静脉输注对实验性犬急性心肌缺血、心肌梗塞及血液流变学的影响。实验结果表明，红景天注射液具有明显改善犬急性心肌缺血和心肌梗塞的作用，减轻由心外膜电图标测的心肌缺血程序(∑-ST)及心肌缺血范围(N-ST)；明显减小经N-BT染色所显示的梗塞区；显著抑制心肌缺血及心肌梗塞引起的血清肌酸激酶(CK)活性升高，并对乳酸脱氢酶(LDH)的释放有抑制作用；降低血浆ET和TXB2水平，提高6-Keto～PGF1a活性，增加6-Keto～PGF1a/TXB2的比值。

2、对缺血再灌注大鼠心肌损伤的影响

以大鼠心肌缺血再灌注损伤模型观察到，红景天注射液能够减轻心肌损伤程度，使心肌梗塞面积明显缩小、梗塞区重量明显减轻；并能降低血清磷酸肌酸激酶(CK)含量，明显增加血清超氧化歧化酶(SOD)活性，明显降低血清丙二醛(MDA)含量，对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。

3、对犬心脏血流动力学及心肌耗氧量的影响

为了进一步研究红景天注射液的药理作用及作用机制，观察了本品对麻醉开胸犬心脏血液动力学及心肌耗氧量的影响。实验结果显示：红景天注射液静脉注射后，即刻可明显扩张冠脉血管，降低冠脉阻力，使冠脉血流量及冠状静脉窦血氧含量显著增加，心肌耗氧指数降低；给药后期可降低心肌耗氧量，药后45分钟心肌耗氧量可减少31.37％，与生理盐水对照组比较，差异显著(P＜0.01)；同时，降低动脉血压，减慢心率，减低总外周阻力，从而有效的降低心脏后负荷，在不明显增加心肌收缩力和左心室压力的情况下，心输出量和每博出量均明显增加，心脏有效作功得到加强。从而改善心肌的供血供氧，调整心脏血管的顺应性，对心血管系统起到调整和改善作用。

4、对大鼠体外血栓形成及血液流变学的影响

采用Born氏比浊法，观察红景天注射液对家兔血小板聚集的影响。结果表明：连续3天尾静脉注射给药，红景天注射液能明显降低花生四烯酸(AA)和胶原诱导的家兔血小板聚集率(P＜0.05)，对二磷酸腺苷(ADP)诱导的家兔血小板聚集率有降低趋势。提示红景天注射液具有抑制血小板聚集的作用。

5、对大鼠体外血栓形成及血液流变学的影响

实验结构表明：连续3天尾静脉注射给药，红景天注射液可缩短血栓长度(P＜0.05)、减轻血栓湿重及干重(P＜0.05-0.01)；降低中切速30S^-1及低切速5S-1下的全血粘度(P＜0.05)，降低血浆粘度。提示红景天注射液具有抑制血栓形成、降低血液粘度的作用。

(五)一般药理试验

1、协同或拮抗戊巴比妥钠的作用本试验观察红景天注射液静脉给药后，对戊巴比妥钠催眠作用的影响，结果表明：红景天注射液对戊巴比妥钠阈剂量小鼠入睡时间和睡眠维持时间均无明显影响，提示红景天注射液无协同或拮抗戊巴比妥钠的作用。

2、对小鼠自主活动和协调运动的影响

本试验观察红景天注射液静脉给药后，对小鼠的一般状态、自主活动和协调运动的影响，结果表明：给药一次和给药三次后，红景天注射液三个剂量组小鼠一般状态无明显异常，10min内的运动次数、起立次数及1min内的转棒坠落率与正常对照组比较及给药前后自身比较均无明显差异。提示红景天注射液对小鼠的一般状态、自主活动和协调运动均无明显影响。

3、对麻醉犬呼吸、血压、心率及心电图的影响

本实验观察了红景天注射液对正常麻醉犬呼吸频率、呼吸幅度、动脉血压、心率及心电图的影响。实验结果显示，红景天注射液480mg/kg(8g生药/kg)剂量组药后60min，动物呼吸频率有所增加，而对犬呼吸幅度、动脉血压、心率及心电图无明显改变。

(六)急性毒性试验

1、小鼠静脉注射给药急性毒性试验

昆明种小鼠，每组10只。药物经生理盐水稀释后，尾静脉缓慢注射给药，连续观察10天，其LD₅₀及95％可信限为152.54(137.39～169.36)g/kg。

2、小鼠腹腔注射给药急性毒性试验

昆明种小鼠一次腹腔注射给药，连续观察10天。其LD₅₀及95％可信限为271.24(253.76～289.93)g/kg。

(七)安全性试验

1、家兔静脉注射给药血管刺激性试验

新西兰种白色家兔2只，由兔耳静脉缓慢注射给予红景天注射剂，每日一次，连续3次。其局部血管肉眼未见明显变化，病理组织学未见血管存在刺激反应。

2、豚鼠静脉注射给药的过敏试验

DHP种白色豚鼠，共分为3组，每组10只。在红景天注射剂致敏给药后的第14日和第21日静脉攻击给药观察，未见豚鼠出现过敏性反应。

3、溶血试验

红景天注射剂在体外与家兔红血球接触4小时后，未发现溶血和凝聚反应。

(八)长期毒性试验

1、对犬连续给药5周的长期毒性试验

采用Beagle犬，每组5条，雌雄兼有，试验共分2个给药组(12g/kg和3g/kg)和1个溶剂对照组，连续静脉注射给药5周，各组2条犬停药后再观察2周，试验结果显示：除给药期高剂量组脾脏脏器系数数值有一定升高、注射局部出现轻微肿胀外，其它检测指标无异常发现。动物的一般状态状况良好，体重各周增长正常，血液学10项指标、血清生化学10项指标、心电图5项指标、尿液常规检查10项指标、以及22种病理组织学检查等未见明显毒性反应。

2、对大鼠连续给药五周的长期毒性试验采用Wistar种大鼠，每组20只，雌雄各半，试验共分2个给药组(30g/kg和10g/kg)和1个溶剂对照组，连续腹腔注射给药5周，各组1/3大鼠停药后再观察2周。试验结果显示：给药期高、低剂量组凝血时间(CT)明显延长，停药两周后重复检查该指标恢复正常。存活动物的一般状态尚好，体重各周增长基本正常，血清生化学、脏器系数以及病理组织学检查等未见明显毒性反应。

(九)临床背景资料

由于红景天注射剂尚未获得进行临床试验的批文，因此无前期临床资料。但作为本项目的研究基础，红景天胶囊经卫生部药政局批准[(96)ZL-10号文件]，由天津中医学院第一附属医院、北京中医药大学东直门医院、北京中医医院、天津中医学院第二附属医院等四家医院开展了红景天胶囊治疗胸痹(冠心病心绞痛)II期临床试验。共收治患者401例，随机设治疗组301例，对照组100例(口服百路达胶囊)。临床试验结果：治疗组胸痹心痛显效率为45.18％，总有效率为87.37％；心电图显效率为26.25％，总有效率为60.13％。对照组胸痹心痛显效率为27.00％，总有效率为72.00％；心电图显效率为11.00％，总有效率为40.00％。治疗组疗效显著优于对照组(P＜0.05)。两组治疗胸痹起效时间分别为5.71±2.35天和8.72±2.85天，治疗组早于对照组(P＜0.01)；两组硝酸甘油停减率分别为90.19％和66.67％，治疗组明显高于对照组(P＜0.05)。治疗组对胸部疼痛、心悸、气短等症状有效率皆显著高于对照组(P＜0.01或0.05)。红景天胶囊能明显改善患者血液流变状态，降低血小板聚集和血浆粘度，使异常升高的血脂、胆固醇含量下降。效果优于对照组。Holter检查，两组总有效率分别为56.67％和31.70％，治疗组优于对照组(P＜0.05)。治疗组未发现明显的毒副作用，对患者血、尿、便常规和肝、肾功能检查均未见异常改变。红景天注射剂要比口服胶囊剂更具有起效快，疗效更明显的优点。由于心绞痛发病急，症状重，危及生命。发病时往往处于急救状态。因此起效快极为重要。重症者难以服药，由它人注射能及时得到治疗。因此本注射剂是最适应该病症的药剂。

Claims

1、一种治疗冠心病心绞痛的药物的制备方法，其特征在于：该药物以植物红景天为原料，经提取干燥、加注射用水制成，其工艺如下：取红景天中药材进行溶液提取，滤过，薄膜浓缩成相对密度为在50℃温度下1.15～1.20的浓缩液；在该浓缩液中加乙醇使含醇量达70％，搅匀，在5-10℃温度下，冷藏24小时，滤过，沉淀以5-10℃的70％乙醇洗涤一次，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩至相对密度为在50℃为1.15～1.20的清膏，再加乙醇使含醇量达85％，搅匀，5-10℃冷藏24小时，滤过，沉淀以5-10℃的85％乙醇洗涤一次，滤过，合并滤液，调PH值至8.0，5-10℃冷藏12小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至相对密度在50℃为1.20～1.30的清膏，加入注射用水，在5-10℃温度条件下冷藏12小时，滤过，滤液调PH＝7.0，加热煮沸30分钟，冷藏72小时，温度同上，滤过，滤液以截留分子量为10000的超滤柱超滤，超滤液浓缩冷冻干燥得干粉状药物，其冷冻温度为-5至-10℃，得干粉状药物，经加注射用水即成注射剂，其浓度为每1毫升固体含量为40-60mg，每1g干粉药物中的红景天甙的含量≥4mg，酪醇的含量≥3.0mg，多糖的含量≥340mg。

2、根据权利要求1所述的一种治疗冠心病心绞痛的药物的制备方法，其特征在于：采用40-80％的乙醇回流提取红景天甙。

3、根据权利要求1所述的一种治疗冠心病心绞痛的药物的制备方法，其特征在于：提取时采用加水煎煮三次，每次加水6倍每次煎煮2小时。

4、根据权利要求1所述的一种治疗冠心病心绞痛的药物的制备方法，其特征在于：除杂质的方法为二次醇沉淀法，除鞣质的方法采用乙醇溶液碱沉淀法。